專利名稱：一種基于單域抗體的抗原表位展示方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領域，具體涉及一種利用單域抗體展示外源抗原表位的方法及應用。
背景技術(shù)：
表位是蛋白質(zhì)抗原的一部分，是蛋白質(zhì)抗原性的基礎，抗體的特異性是針對表位的。由于表位一般僅由幾個到十幾個氨基酸組成，合成單獨的抗原表位肽由于其分子較小，一般沒有或僅有極微弱的免疫原性。為增強抗原表位肽的免疫原性，一般是 將表位肽與載體蛋白如牛血清白蛋白、匙孔血藍蛋白、破傷風類毒素等相偶聯(lián)，或者與具有佐劑活性的脂質(zhì)分子共價連接，形成脂肽，也可將抗原表位肽連接于分支狀的多聚賴氨酸骨架上，形成一種具有獨特三維空間結(jié)構(gòu)的大分子，用以誘導針對表位的免疫應答。這些方法的不足之處是，偶聯(lián)過程復雜，需要化學合成和純化，脂肽和多聚賴氨酸骨架制備困難，并且費用較高，所以，其應用受到限制。另外，對于一些空間表位，合成的表位肽幾乎不能模擬其在蛋白質(zhì)抗原分子中的天然構(gòu)象。因此，建立合適的抗原表位展示方法，有效展示外源抗原的表位肽對于復雜抗原的抗體制備和表位疫苗的設計具有重要意義。對于一般抗體而言，其結(jié)合抗原表位的部位由抗體的重鏈可變區(qū)(variabledomain of heavy chain, VH)和輕鏈可變區(qū)(variable domain of light chain, VL)共同構(gòu)成，但二者對抗原結(jié)合的貢獻是不同的。一般情況下，VH發(fā)揮主要作用，單獨的VH仍具有抗原結(jié)合能力，但是VL的缺乏將使VH對抗原的親和力降低，并且易于積聚和沉淀。1989 年，Ward 等(Nature 1989，341 :544-546)首次制備了僅由抗體的 VH 區(qū)構(gòu)成的基因工程抗體，因為僅由一個結(jié)構(gòu)域組成，故稱之為單域抗體(single domainantibody)。之后,通過克隆一般抗體的可變區(qū)而構(gòu)建的單域抗體在親和力和穩(wěn)定性等方面有了很大提高，但是這類抗體的工程化改造不具有普遍性。因此，分子較小的單域抗體的應用前景受到人們的懷疑。1993 年，Hamers-Casterman 等(Nature 1993,363 :446-448)報道了在胳5它血清中大量存在一種天然缺失輕鏈的抗體，即重鏈抗體(heavy chain antibody)。重鏈抗體在駱駝的體液免疫中發(fā)揮著重要的作用。與一般抗體相比，重鏈抗體除了缺少輕鏈之外，重鏈抗體的重鏈可變區(qū)(variable domain of heavy chain of heavy chain antibody,VHH)還具有不同于一般抗體可變區(qū)(variable domain of heavy chain of conventionalantibody, VH)的特征，駱駝的VHH基因通過在幾個重要功能位點的選擇性進化維持了重鏈抗體的正常功能，也就是說重鏈抗體的VHH可以在缺少輕鏈可變區(qū)的情況下單獨折疊成穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，并保持其抗原結(jié)合活性。構(gòu)建自駱駝、鯊魚等重鏈抗體的單域抗體具有熱穩(wěn)定性好、可溶性好、親和力高等特點，并且由于其分子較小，僅為12-15kD左右，因此，其在腫瘤成像、親和純化等方面具有較好的應用前景。對于單域抗體，人們更多的還是將其作為一種小分子量的抗體去應用。單域抗體分子雖小，但結(jié)構(gòu)相對穩(wěn)定，特別是構(gòu)建自駱駝、鯊魚等重鏈抗體的單域抗體具有較好的熱穩(wěn)定性和可溶解性。在單域抗體的三個抗原互補決定區(qū)(complementarity-determining region, Q)R)中，抗原互補決定區(qū) 3 (Q)R3)在與抗原的結(jié)合中發(fā)揮主要作用，CDR3的長度變化范圍較大，能夠形成豐富的構(gòu)象以參與結(jié)合抗原，換一種角度看，也就是說CDR3區(qū)能夠展示不同長度的肽段，形成各種不同的構(gòu)象，因此，單域抗體的CDR3應該是一種理想的抗原表位展示部位?；谝陨峡紤]，本發(fā)明建立了基于單域抗體骨架的抗原表位展示方法，利用單域抗體的CDR3區(qū)展示外源抗原表位，使抗原表位形成穩(wěn)定的、更接近于其在天然抗原中的構(gòu)象。利用該抗原表位展示方法，可以制備復雜抗原的替代抗原，用于制備針對復雜抗原的抗體。另外，如果用該方法有效展示來源于病原微生物抗原、腫瘤抗原等的特定表位，則這些重組小蛋白可直接作為疫苗，用于疾病的預防和治療。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是建立一種新的抗原表位展示方法，實現(xiàn)抗原表位的有效展示， 以解決目前化學合成的表位肽免疫原性差，以及通過化學偶聯(lián)法制備表位肽免疫原技術(shù)復雜、成本高的問題。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明實施了以下技術(shù)方案本發(fā)明提供了一種基于單域抗體的抗原表位展示方法，即為利用單域抗體為分子骨架，利用單域抗體的互補決定區(qū)3即CDR3為外源目標抗原表位展示部位。本發(fā)明還提供了一種基于單域抗體的抗原表位展示方法，即為利用單域抗體為分子骨架，利用單域抗體的CDR3為外源目標抗原表位展示部位，用外源目標抗原表位序列替換⑶R3區(qū)序列。所述單域抗體構(gòu)建自重鏈抗體的重鏈可變區(qū)。所述單域抗體構(gòu)建自駱駝類或鯊魚類重鏈抗體的重鏈可變區(qū)。所述單域抗體包含SEQ ID NO :1或SEQ ID NO : 7所示的單域抗體骨架序列。所述單域抗體構(gòu)建自含輕鏈和重鏈的常規(guī)抗體的重鏈可變區(qū)。所述單域抗體構(gòu)建自人或鼠抗體的重鏈可變區(qū)。所述單域抗體包含SEQ ID NO 4或SEQ ID NO 10所示的單域抗體骨架序列。所述外源抗原表位為肽類表位。所述外源抗原表位為包含或“EQKLISEEDL”或“YPDEIEHFKP”或“ ATLRETYGE ”氨基酸序列的肽類表位。本發(fā)明提供了一種基于單域抗體的抗原表位展示方法，具體包括如下步驟(I)確定一種重鏈抗體的重鏈可變區(qū)的完整的氨基酸序列，以此序列作為單域抗體的氨基酸序列，并分析出其CDR3區(qū)的序列；(2)用外源抗原表位氨基酸序列替換單域抗體的CDR3區(qū)氨基酸序列，并將替換后的全長氨基酸序列轉(zhuǎn)換為其基因編碼序列，合成全長基因序列，并將其克隆到表達載體中，得到重組質(zhì)粒；(3)將得到的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至相應的宿主細胞內(nèi)，篩選得到陽性克隆，此陽性克隆表達的重組蛋白就展示有外源抗原表位。本發(fā)明還提供了一種基于單域抗體的抗原表位展示方法，具體包括如下步驟
(I)確定含輕鏈和重鏈的常規(guī)抗體的重鏈可變區(qū)的完整氨基酸序列，此序列即為單域抗體的基礎氨基酸序列，分析出其框架區(qū)2 (FR2)和CDR3區(qū)的序列；(2)將FR2區(qū)的第9、10和12位的氨基酸分別替換為谷氨酸、精氨酸和甘氨酸，并用外源抗原表位氨基酸序列替換單域抗體的CDR3區(qū)氨基酸序列，并將替換后的全長氨基酸序列轉(zhuǎn)換為其基因編碼序列，合成全長基因序列，并將其克隆到表達載體中，得到重組質(zhì)粒;(3)將得到的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至相應的宿主細胞內(nèi)，篩選得到陽性克隆，此陽性克隆表達的重組蛋白就展示有外源抗原表位。本發(fā)明還提供了根據(jù)上述的基于單域抗體的抗原表位展示方法得到的包含有外源抗原表位的蛋白。 本發(fā)明還提供了上述蛋白在制備單克隆抗體領域中的用途。本發(fā)明還提供了上述蛋白在制備疫苗領域中的用途。本發(fā)明還提供了一種單域抗體在展示外源抗原表位中的用途。本發(fā)明所述的上述技術(shù)方案與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點1、所述基于單域抗體骨架的抗原表位展示方法，可用于展示某一小肽分子，這種展示有外源小肽的重組蛋白可替代小肽作為免疫原免疫動物，制備針對小肽的抗體，克服了小肽直接作為免疫原存在的免疫原性差的問題；2、利用本發(fā)明所述的基于單域抗體骨架的抗原表位展示方法制備表位肽免疫原，避免了通過化學偶聯(lián)技術(shù)制備表位肽免疫原存在的技術(shù)復雜、成本高的問題。本發(fā)明所述的抗原表位展示方法還具有廣泛的潛在應用領域，如可用于展示某抗原分子上的某一表位，這種展示有外源抗原表位的重組蛋白，可作為某抗原的替代抗原直接用于免疫動物，制備針對該表位的抗體，如果制備的抗體能特異性識別相應的抗原，則通過這種技術(shù)就實現(xiàn)了在無相應抗原的情況下制備了該抗原的抗體。本發(fā)明所述的抗原表位展示方法也可用于蛋白質(zhì)表位疫苗的制備。例如，利用該表位展示方法展示病原微生物或腫瘤抗原的中和性抗原表位，這種展示有中和性抗原表位的重組蛋白可直接作為疫苗，用于免疫動物，讓動物產(chǎn)生針對中和性表位的抗體，從而在體內(nèi)清除相應的病原微生物或抑制腫瘤的生長。


為了使本發(fā)明的內(nèi)容更容易被理解，下面根據(jù)本發(fā)明的具體實施例并結(jié)合附圖，對本發(fā)明作進一步詳細的說明，其中圖I為實施例I所述的駱駝重鏈抗體的重鏈可變區(qū)(VHH)的氨基酸序列；* :雙劃線部分為CDR3區(qū)；圖2為實施例I所述展示(His)6表位的駱駝單域抗體骨架的氨基酸序列；* :雙劃線部分為(His)6表位；圖3為實施例I所述展示(His)6表位的駱駝抗體骨架基因編碼序列；* :雙劃線部分為限制性核酸內(nèi)切酶酶切位點；傾斜部分為終止碼序列；圖4為實施例I中應用ELISA法檢測基于駱駝單域抗體骨架展示的(His)6表位的小鼠免疫效果；
圖5為實施例2所述一種人抗體重鏈可變區(qū)(VH)的氨基酸序列；* :雙劃線部分為框架區(qū)2 (FR2)；單下劃線部分為⑶R3區(qū)；圖6為實施例2所述展示c-myc表位的人源單域抗體骨架的氨基酸序列；* :雙劃線部分為框架區(qū)2 (FR2)；加框部分為人工改變的氨基酸殘基；單下劃線部分為c-myc表位序列；圖7為實施例2所述展示c-myc表位的人單域抗體骨架的基因編碼序列；* :雙劃線部分為限制性核酸內(nèi)切酶酶切位點；圖8為實施例2所述應用ELISA法檢測人源單域抗體骨架展示的c-myc表位對家兔的免疫效果。圖9為實施例3所述的一種鯊魚的單域抗體的氨基酸序列* :單下劃線部分為⑶R3區(qū)；圖10為實施例3所述的展示人血管內(nèi)皮生長因子抗原表位的鯊魚單域抗體的氨基酸序列* :單下劃線部分為人血管內(nèi)皮生長因子抗原表位序列；圖11為實施例3所述的展示人血管內(nèi)皮生長因子抗原表位的鯊魚單域抗體的編碼基因序列* :單下劃線部分為酶切位點；圖12為實施例3所述的展示人血管內(nèi)皮生長因子抗原表位的鯊魚單域抗體的免疫原性檢測圖13為實施例4所述的一種小鼠抗體的氨基酸序列* :雙下劃線部分為⑶R3區(qū)，單下劃線部分位FR2區(qū)；圖14為實施例4所述的展示人白蛋白抗原表位的小鼠單域抗體的氨基酸序列* :雙下劃線部分為人白蛋白抗原表位序列，斜體部分為改變后的氨基酸殘基；圖15為實施例4所述的展示人白蛋白抗原表位的小鼠單域抗體的編碼基因序列* :雙下劃線部分為酶切位點；圖16為實施例4所述的展示人白蛋白抗原表位的小鼠單域抗體的免疫原性檢測。
具體實施例方式實施例I基于駱駝重鏈抗體的單域抗體骨架展示(His)6表位進入PDB 數(shù)據(jù)庫(http: //www. pdb. org/pdb/home/home. do),在搜索框中輸入“camel antibody”，從搜索框中的結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)中找到一種駱駝抗體與溶菌酶復合物的結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)(IBZQ)，從中得到一種駱駝的單域抗體的氨基酸序列如SEQ ID NO :1所示(如圖I所示，其中雙劃線部分為CDR3區(qū))。將圖I中所示的CDR3區(qū)的氨基酸序列替換為“HHHHHH”表位即(His) 6表位，替換后的序列如SEQ ID NO 2所不(見附圖2)。然后，按照大腸桿菌密碼子使用偏性將上述SEQ ID NO :2所示的序列轉(zhuǎn)換為其編碼基因序列(http://www. bioinformatics, org/sms2/rev_trans. html),同時在其上游添加BamH I酶切位點，在其下游添加終止密碼子及Xho I酶切位點序列，得到全長序列如SEQID NO :3所示(見附圖3)。此全長序列由北京英茂盛業(yè)生物科技有限公司進行全基因合成并連接到PUCE載體中，命名為pUCE-His。將合成后的全長序列用BamH I (Takara)和Xho I (Takara)進行雙酶切,酶切體系為
權(quán)利要求
1.一種基于單域抗體的抗原表位展示方法，其特征在于以單域抗體為分子骨架，利用單域抗體的CDR3區(qū)為外源目標抗原表位展示部位。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的基于單域抗體的抗原表位展示方法，其特征在于所述單域抗體的CDR3區(qū)被外源目標抗原表位序列替換。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的基于單域抗體的抗原表位展示方法，其特征在于所述單域抗體構(gòu)建自重鏈抗體的重鏈可變區(qū)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的基于單域抗體的抗原表位展示方法，其特征在于所述單域抗體構(gòu)建自駱駝類或鯊魚類重鏈抗體的重鏈可變區(qū)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的基于單域抗體的抗原表位展示方法，其特征在于所述單域抗體包含SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :7所示的單域抗體骨架序列。
6.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的基于單域抗體的抗原表位展示方法，其特征在于所述單域抗體構(gòu)建自含輕鏈和重鏈的常規(guī)抗體的重鏈可變區(qū)。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的基于單域抗體的抗原表位展示方法，其特征在于所述單域抗體構(gòu)建自人或鼠抗體的重鏈可變區(qū)。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的基于單域抗體的抗原表位展示方法，其特征在于所述單域抗體包含SEQ ID NO :4或SEQ ID NO : 10所示的單域抗體骨架序列。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-8任一所述的基于單域抗體的抗原表位展示方法，其特征在于所述外源抗原表位為肽類表位。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的基于單域抗體的抗原表位展示方法，其特征在于所述外源抗原表位為包含或“EQKLISEEDL”或“YPDEIEHFKP”或“ATLRETYGE”氨基酸序列的肽類表位。
11.根據(jù)權(quán)利要求3-5任一所述的基于單域抗體的抗原表位展示方法，其特征在于，包括如下步驟 (1)確定一種重鏈抗體的重鏈可變區(qū)的完整的氨基酸序列，以此序列作為單域抗體的氨基酸序列，并分析出其CDR3區(qū)的序列； (2)用外源抗原表位氨基酸序列替換單域抗體的CDR3區(qū)氨基酸序列，并將替換后的全長氨基酸序列轉(zhuǎn)換為其基因編碼序列，合成全長基因序列，并將其克隆到表達載體中，得到重組質(zhì)粒； (3)將得到的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至相應的宿主細胞內(nèi)，篩選得到陽性克隆，此陽性克隆表達的重組蛋白就展示有外源抗原表位。
12.根據(jù)權(quán)利要求6-8任一所述的基于單域抗體的抗原表位展示方法，其特征在于，包括如下步驟 (1)確定含輕鏈和重鏈的常規(guī)抗體的重鏈可變區(qū)的完整氨基酸序列，此序列即為單域抗體的基礎氨基酸序列，分析出其框架區(qū)2 (FR2)和CDR3區(qū)的序列； (2)將？1 2區(qū)的第9、10和12位的氨基酸分別替換為谷氨酸、精氨酸和甘氨酸，并用外源抗原表位氨基酸序列替換單域抗體的CDR3區(qū)氨基酸序列，將替換后的全長氨基酸序列轉(zhuǎn)換為其基因編碼序列，合成全長基因序列，并將其克隆到表達載體中，得到重組質(zhì)粒； (3)將得到的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至相應的宿主細胞內(nèi)，篩選得到陽性克隆，此陽性克隆表達的重組蛋白就展示有外源抗原表位。
13.根據(jù)權(quán)利要求1-12任一所述的基于單域抗體的抗原表位展示方法得到的包含有外源抗原表位的蛋白?！?br> 全文摘要
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領域，具體涉及一種基于單域抗體的抗原表位展示方法。具體地講，本發(fā)明利用單域抗體的CDR3區(qū)展示外源抗原表位，這種在其分子表面展示外源抗原表位的單域抗體骨架蛋白可用于制備針對表位小肽的抗體，也可作為外源抗原之替代抗原，用于免疫動物、制備針對外源抗原的抗體。此外，基于單域抗體骨架的抗原表位展示方法還可用于制備表位疫苗。
文檔編號C12N15/70GK102952193SQ20111045257
公開日2013年3月6日 申請日期2011年12月29日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月29日
發(fā)明者高建恩, 羅時偉, 錢軍 申請人:北京五康新興科技有限公司