專(zhuān)利名稱(chēng)：外周血sparc 結(jié)合抗體及其用途的制作方法
外周血SPARC結(jié)合 幾體及其用途
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發(fā)明背景
酸性的富含半胱氨酸的分泌蛋白(SPARC)(也被稱(chēng)作骨粘連蛋白(osteonectin))是281個(gè)氨基酸的糖蛋白。SPARC具有對(duì)于多種配體、包括陽(yáng)離子(例如，Ca2+、Cu2+、Fe2+)、生長(zhǎng)因了(例如，血小板衍生生長(zhǎng)因子(TOGF)和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF))、細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)蛋白(例如，膠原1-V和膠原IX、玻連蛋白和凝血酶敏感蛋白-1)、內(nèi)皮細(xì)胞、血小板、白蛋白和羥基磷灰石的親和力。SPARC的表達(dá)在發(fā)育上受到調(diào)控，主要在正常發(fā)育或響應(yīng)于損傷的過(guò)程中在正在發(fā)生重塑的組織中表達(dá)(參見(jiàn)，例如，Lane等人，F(xiàn)ASEBJ.，8，163-173 (1994))。高水平的SPARC蛋白在正在發(fā)育的骨和牙齒中表達(dá)。
SPARC為在幾種侵襲性癌癥中被上調(diào)的基質(zhì)細(xì)胞蛋白(matricellular protein),但在絕大部分正常組織中不存在(Porter等人,J.Histochem.Cytochem., 43, 791 (1995)和參見(jiàn)下文)。事實(shí)上，SPARC的表達(dá)在多種腫瘤(例如，膀胱、肝、卵巢、腎、腸和乳腺)中被誘導(dǎo)。在膀胱癌中，例如，SPARC表達(dá)與晚期癌相關(guān)聯(lián)。已顯示T2期或更晚期的侵襲性膀胱腫瘤相對(duì)于Tl期的膀胱腫瘤(或不那么淺表性的腫瘤)表達(dá)更高水的SPARC并且具有更差的預(yù)后(參見(jiàn)，例如，Yamanaka等人，J.Urology, 166，2495-2499 (2001))。在腦膜瘤中，SPARC的表達(dá)只與侵襲性腫瘤關(guān)聯(lián)(參見(jiàn)，例如，Rempel等人，ClincalCancer Res.，5，237-241 (1999))。還已在74.5%的原位侵襲性乳腺癌損傷(參見(jiàn)，例如，Bellahcene,等人,Am.J.Pathol., 146, 95-100 (1995))和 54.2% 的乳腺的浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌(參見(jiàn)，例如，Kim 等人，J.Korean Med.Sc1.，13,652-657(1998))中檢測(cè)到 SPARC 的表達(dá)。SPARC表達(dá)還與乳腺癌的頻繁微鈣化關(guān)聯(lián)(參見(jiàn)，例如，Bellahcene等人，同上)，這表明SPARC表達(dá)可負(fù)責(zé)乳腺轉(zhuǎn)移對(duì)骨的親和力。還已知SPARC結(jié)合白蛋白(參見(jiàn)，例如，Schnitzer, J.Biol.Chem.，269，6072 (1994))。
因此，存在對(duì)利用SPARC在疾病中的作用，特別地SPARC在一些癌癥中的作用的組合物和方法的需要。
發(fā)明概述
在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了包含SPARC結(jié)合抗體的組合物，其中所述SPARC結(jié)合抗體包括1_12、Imml4、hHTI或其組合。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了診斷或治療動(dòng)物的疾病例如癌癥的方法，包括施用診斷上或治療上有效的量的包含SPARC結(jié)合抗體的組合物，其中所述SPARC結(jié)合抗體包括Tmml 2.Tmml 4.hHTI 或其組合。
本發(fā)明還提供了利用一種或多種抗癌劑和SPARC結(jié)合抗體治療動(dòng)物的腫瘤的方法，包括:從動(dòng)物分離生物樣品，檢測(cè)所述生物樣品中的SPARC蛋白的表達(dá)，定量所述生物樣品中SPARC蛋白的量，如果生物樣品中的SPARC蛋白高于閾值水平，則施用治療有效量的抗癌劑和治療有效量的抗SPARC抗體，或如果SPARC蛋白低于閾值水平，則施用治療有效量的抗癌劑并且不施用SPARC結(jié)合抗體。按照本發(fā)明使用的用于定量SPARC表達(dá)的量的適當(dāng)?shù)纳飿悠钒ɡ缪?、血清和血漿。根據(jù)本發(fā)明的用于治療腫瘤的適當(dāng)?shù)腟PARC結(jié)合抗體包括基于例如Imml2、Imml4、hHTI等的人源化SPARC結(jié)合抗體。適用于SPARC結(jié)合抗體的用途的生物樣品中的SPARC的閾值水平可以為至少約4.3ng/ml，至少約43ng/ml或優(yōu)選，至少約430ng/ml。
在本發(fā)明的所有方法和組合物中，可將SPARC結(jié)合抗體綴合至治療或診斷活性試齊U。適合施用本發(fā)明提供的組合物和應(yīng)用本發(fā)明的方法的適當(dāng)動(dòng)物包括但不限于人患者。
附圖的幾個(gè)視圖的概述


圖1為用于克隆和表達(dá)Imml至Imml2的Fab區(qū)域的pASK84的限制性圖譜。
圖2提供了兩個(gè)人SPARC結(jié)合Fab克隆Fab6和Fabl6的氨基酸序列(SEQ IDN015-16)。
圖3為用于克隆和表達(dá)Fabl6的pBAD載體的限制性圖譜。
圖4提供了 pBad中的Fab16的氨基酸序列(SEQ ID NO: 17)。
圖5 為用于從 Fab6(SEQ ID NO: 15) Fab16 (SEQ ID NO: 16)克隆和表達(dá)完全人抗體Imml3和Imml4的pcDNA3002NE0載體的限制性圖譜。
圖 6 提供了 Imml (SEQ ID NOl 和 8)、Imm2 (SEQ ID N02 和 9)、Imm3 (SEQ ID N03和 10)、Imm4 (SEQ ID N04 和 11)、Imm6 (SEQ ID N05 和 12)、ImmlO (SEQ ID N06 和 13)和Imml2(SEQ ID N07和14)的構(gòu)架區(qū)(FffR)和互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)的氨基酸序列。
圖7提供了針對(duì)人SPARC的Imml至Imm6和Imm8至Imml2上清液的1: 1、1:10和1:100稀釋物以及對(duì)照mAb的定量ELISA結(jié)果。
圖8 提供了濃度為 0.04 μ g/mL、0.2 μ g/mL、I μ g/mL 和 5 μ g/mL 的純化的 Imml 至Imml2抗人SPARC抗體以及陽(yáng)性和陰性對(duì)照的定量ELISA結(jié)果。
圖 9 提供了比較 Imml、Imm3、Imm4、Imm7、Imm9 和 ImmlO 抗體對(duì) HTI_SPARC(血小板SPARC)的結(jié)合以及ImmlO、Immll、Imml2和對(duì)照抗體對(duì)Biol-SPARC的結(jié)合的定量ELISA結(jié)果。
圖10提供了在不同濃度上Fabl6對(duì)HT1-SPARC (血小板SPARC)和Biol-SPARC的結(jié)合的定量ELISA結(jié)果。
圖11為使用表面等離子體共振技術(shù)產(chǎn)生的Fabl6對(duì)人HTI SPARC的結(jié)合的傳感圖。
圖12為使用表面等離子體共振技術(shù)產(chǎn)生的Fabl6對(duì)人B101SPARC的結(jié)合的傳感圖。
圖13提供了 Immll、Tmml 2.1mml3和Imml4在不同濃度上結(jié)合人SPARC的定量ELISA結(jié)果。
圖14為抗變性的人SPARC的Imm系列抗體的Western印跡。
圖15為描述SPARC結(jié)合抗體mHTI (稱(chēng)為Imml7)、Imml2和Imml4以及對(duì)照mlgG對(duì)荷有LL/2Lewis肺癌的動(dòng)物的存活的影響的曲線(xiàn)。
圖16提供了 I mml2、Imml4和mHTI (稱(chēng)為1_17)結(jié)合人和鼠SPARC的定量ELISA結(jié)果。
圖17A為描述對(duì)于高SPARC和低SPARC，組群I (已接受先前化學(xué)療法的患者(PC))的總存活的曲線(xiàn)。
圖17B為對(duì)于高SPARC和低SPARC，組群2 (未接受先前化學(xué)療法的患者(NPC))的總存活的曲線(xiàn)。
圖18為描述在治療之前和之后，組群I (先前化學(xué)療法)和組群2 (無(wú)先前化學(xué)療法)與正常對(duì)照相比較的SPARC水平的點(diǎn)圖。
圖19為描述治療后血漿SPARC的百分比變化的條形圖。
圖20A為描述高風(fēng)險(xiǎn)群(群集I)和低風(fēng)險(xiǎn)群(群集2)中的患者的無(wú)進(jìn)展存活(PFS)的曲線(xiàn)。
圖20B為描述高風(fēng)險(xiǎn)群(群集I)和低風(fēng)險(xiǎn)群(群集2)中的患者的總存活(OS)的曲線(xiàn)。
圖21為描述對(duì)于高風(fēng)險(xiǎn)(HR)和低風(fēng)險(xiǎn)(LR)群集，組群I (先前化學(xué)療法)和組群2 (無(wú)先前化學(xué)療法)的SPARC水平的點(diǎn)圖。
圖22A為描述與高風(fēng)險(xiǎn)(HR)群集中的所有患者相比較處于為0、1或2的風(fēng)險(xiǎn)水平的患者的無(wú)進(jìn)展存活(PFS)的曲線(xiàn)。
圖22B為描述與高風(fēng)險(xiǎn)(HR)群集中的所有患者相比較處于為0、1或2的風(fēng)險(xiǎn)水平的患者的總存活(OS)的曲線(xiàn)。
圖23A為描述在 利用25mg/kg的5_氟尿嘧啶(5-FU)和0.lmg、0.15mg或0.20mg的SPARC治療后與鹽水或單獨(dú)的5-FU相比較的腫瘤體積的曲線(xiàn)。
圖23B為描述在利用多西他賽(10mg/kg)和0.2mg的SPARC治療后與鹽水、單獨(dú)的多西他賽或單獨(dú)的SPARC相比較的腫瘤體積的曲線(xiàn)。
圖24A為描述在利用舒尼替尼(SUT) (30mg/kg) ,SPARC(BIOl) (0.2mg)和白蛋白結(jié)合型紫杉醇(nab-paclitaxel) (ABX) (15mg/kg)治療后與陰性對(duì)照、單獨(dú)的SPARC、單獨(dú)的白蛋白結(jié)合型紫杉醇、白蛋白結(jié)合型紫杉醇+舒尼替尼以及白蛋白合型紫杉醇+SPARC相比較的HT29腫瘤體積的曲線(xiàn)。
圖24B為描述在利用貝伐單抗(AVS) (0.2mg) ,SPARC(BIOl) (0.2mg)和白蛋白結(jié)合型紫杉醇(ABX) (15mg/kg)治療后與陰性對(duì)照、單獨(dú)的SPARC、單獨(dú)的白蛋白結(jié)合型紫杉醇、白蛋白結(jié)合型紫杉醇+貝伐單抗以及白蛋白結(jié)合型紫杉醇+SPARC相比較的HT29腫瘤體積的曲線(xiàn)。
圖24C為描述在利用舒尼替尼(SUT) (30mg/kg) ,SPARC(BIOl) (0.2mg)和白蛋白結(jié)合型紫杉醇(ABX) (10mg/kg)治療后與單獨(dú)的白蛋白結(jié)合型紫杉醇以及白蛋白結(jié)合型紫杉醇+舒尼替尼相比較的MDA-MB-231腫瘤體積的曲線(xiàn)。
圖24D為描述在利用貝伐單抗(AVS) (0.2mg) ,SPARC(BIOl) (0.2mg)和白蛋白結(jié)合型紫杉醇(ABX) (10mg/kg)治療后與鹽水、單獨(dú)的SPARC、單獨(dú)的白蛋白結(jié)合型紫杉醇、白蛋白結(jié)合型紫杉醇+貝伐單抗以及白蛋白結(jié)合型紫杉醇+SPARC相比較的PC3腫瘤體積的曲線(xiàn)。
圖25為描述在施用Ομ g/mL、10 μ g/mL和100 μ g/mL的重組野生型人SPARC(BIOl)后與陰性對(duì)照DPBS相比較的每珠粒芽數(shù)的條形圖。
圖26A 描述了在 O μ g/mL、10 μ g/mL 和 100 μ g/mL 的重組野生型人 SPARC(BIOl)下的管形成。
圖26B為描述在濃度為O μ g/mL、10 μ g/mL和100 μ g/mL的重組野生型人SPARC(BIOl)存在的情況下與陽(yáng)性對(duì)照VEGF和未處理的管相比較的管長(zhǎng)度的點(diǎn)圖。
圖27為描述與鹽水、單獨(dú)的SPARC和單獨(dú)的白蛋白結(jié)合型紫杉醇相比較，利用SPARC(4mg/kg)和白蛋白結(jié)合型紫杉醇(10mg/kg)處理的MDA-MB-435-Luc+轉(zhuǎn)移模型中的蛋白質(zhì)水平表征的肺轉(zhuǎn)移的點(diǎn)圖。
圖28 提供了包括 SPARC(10mg/mL)和 Imml2、SPARC 和 Imml4、SPARC 和 mHTI (鑒定為Imml7)、mIgG(陰性對(duì)照)、無(wú)抗體(陰性對(duì)照)以及在不存在SPARC或抗體的情況下的LL2轉(zhuǎn)移組織樣品中管形成的照片。
圖29 提供了多種抗體包括 mHTI (稱(chēng)為 “HTI”)、Imm-12 和 Imm_14 與 Imm_2 和 Imm_3相比較的腫瘤定位的定量熒光結(jié)果。
發(fā)明詳述
本發(fā)明涉及某些SPARC結(jié)合抗體，已分析了所述抗體的對(duì)人和鼠SPARC的結(jié)合特異性以及抑制血管生成和轉(zhuǎn)移的能力。令人驚訝地，分析顯示雖然三種抗體在篩選ELISA中結(jié)合天然和變性人SPARC，但僅有一種抗體也結(jié)合鼠SPARC。還令人驚訝地發(fā)現(xiàn)這三種抗體Imml2、Imml4和mHTI具有抗血管生成(即，抗腫瘤)和抗轉(zhuǎn)移性質(zhì)。
定義
〃肽〃和“多肽”在本文中可互換使用并且是指由通過(guò)肽鍵連接的氨基酸殘基的鏈組成的化合物。多肽的"活性部分"意指比全長(zhǎng)多肽短，但保持可測(cè)量的生物活性和保持生物檢測(cè)的肽。
如本文中所用，術(shù)語(yǔ)“腫瘤”是指任何贅生性生長(zhǎng)、增殖或細(xì)胞團(tuán)，無(wú)論是良性的還是惡性的(癌性的)，無(wú)論是原發(fā)性位點(diǎn)損傷還是轉(zhuǎn)移灶。
如本文中所用，術(shù)語(yǔ)“癌癥”是指由已喪失對(duì)正常生長(zhǎng)控制的易感性的細(xì)胞的增殖引起或表征的增殖性病癥。相同組織類(lèi)型的癌癥通常始于相同組織，并且可基于它們的生物特征被分成不同亞型。癌癥的4個(gè)一般種類(lèi)是癌(上皮細(xì)胞衍生的)、肉瘤(結(jié)締組織或中胚層衍生的)、白血病(形成血液的組織衍生的)和淋巴瘤(淋巴組織衍生的)。已知有200多種不同類(lèi)型的癌癥，并且可影響身體的每一個(gè)器官和組織。不限制癌癥的定義的癌癥的具體實(shí)例可包括黑素瘤、白血病、星形細(xì)胞瘤、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤、淋巴瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、何杰金淋巴瘤和慢性淋巴細(xì)胞白血病。可受不同癌癥影響的器官和組織的實(shí)例包括胰腺、乳腺、 甲狀腺、卵巢、子宮、睪丸、前列腺、腦垂體、腎上腺、腎、胃、食管、直腸、小腸、結(jié)腸、肝、膽囊、頭與頸、舌、嘴、眼和眼眶、骨、關(guān)節(jié)、腦、神經(jīng)系統(tǒng)、皮膚、血液、鼻咽組織、肺、喉、尿道、宮頸、陰道、外分泌腺、和內(nèi)分泌腺?？蛇x擇地，癌癥可以是多中心的或可以是原發(fā)部位不明(CUPS)的。
如本文中所用，“適當(dāng)?shù)腟PARC結(jié)合抗體”或“SPARC結(jié)合抗體”是能夠特異性結(jié)合SPARC的抗體。
如本文中所用，“腫瘤靶向抗體”是指其中疾病為腫瘤、癌癥、贅生物(neoplasm)等的疾病靶向抗體。
如本文中所用，“SPARC結(jié)合抗體”是指對(duì)于循環(huán)SPARC具有親和力的抗體，其Kd在I或10或100或IOOOnM的范圍內(nèi)-優(yōu)選小于或等于ΙΟηΜ。
如本文中所用，“治療有效量”是指緩解(至一定程度，如由熟練醫(yī)生判斷的)哺乳動(dòng)物的疾病或病況的一種或多種癥狀的組合物的量。此外，組合物的“治療上有效的量”意指部分或完全回復(fù)至與疾病或病況相關(guān)或誘發(fā)疾病或病況的正常生理或生化參數(shù)的量。本領(lǐng)域臨床醫(yī)生可確定當(dāng)例如靜脈內(nèi)、皮下、腹膜內(nèi)、口服或通過(guò)吸入施用時(shí)為了治療或預(yù)防特定疾病病況或病癥的組合物的治療有效量。為了在治療上有效所需的組合物的精確量，除了許多患者特異性考慮外，將取決于許多因素例如活性試劑的比活性、使用的遞送設(shè)備、試劑的物理特征、施用目的。但在理解本文中所示的公開(kāi)內(nèi)容后，治療有效量的確定在本領(lǐng)域臨床醫(yī)生的能力之內(nèi)。
如本文中所用，術(shù)語(yǔ)〃治療”、〃處理〃、〃療法〃和〃治療性處理〃是指治愈性治療、預(yù)防性治療或防治性治療。"預(yù)防療法”的實(shí)例是靶向疾病(例如，癌癥或其他增殖性疾病)或與其相關(guān)的病況的可能性的預(yù)防或減少。需要治療的人包括已患有疾病或病況的人以及易于患有待預(yù)防的疾病或病況的人。如本文中所使用的術(shù)語(yǔ)“治療”、“處理”、“療法”和“治療性處理”也描述了目的在于抵抗疾病或相關(guān)病況的哺乳動(dòng)物的管理和護(hù)理，并且包括施用組合物以緩解疾病、病況的癥狀、副作用或其他并發(fā)癥。癌癥的治療性處理包括但不限于手術(shù)、化學(xué)療法、放射療法、基因療法和免疫療法。
如本文中所用，術(shù)語(yǔ)“試劑”或“藥物”或“治療劑”是指懷疑具有治療性質(zhì)的化合物、化合物的混合物、生物大分子或從生物材料例如細(xì)菌、植物、真菌或動(dòng)物(特別地哺乳動(dòng)物)細(xì)胞或組織制備的提取物?？杉兓?、大體上純化或部分純化試劑或藥物。根據(jù)本發(fā)明的“試劑”還包括放射治療劑或“化學(xué)治療劑”。
如本文中所用，術(shù)語(yǔ)“診斷劑”是指允許利用方法例如ELISA定量血漿/循環(huán)SPARC的試劑。
如本文中所用，術(shù)語(yǔ)“化學(xué)治療劑”是指具有抗癌、贅生物和/或增殖性疾病的活性的試劑。
如本文中所用，術(shù)語(yǔ)"放射治療方案"或"放射療法”是指施用輻射以殺傷癌細(xì)胞。輻射與細(xì)胞內(nèi)的不同分子相互作用，但導(dǎo)致細(xì)胞死亡的主要靶是脫氧核糖核酸(DNA)。然而，放射療法通常也導(dǎo)致對(duì)細(xì)胞和細(xì)胞核膜和其他細(xì)胞器的損傷。DNA損傷通常包括糖-磷酸酯主鏈的單鏈和雙鏈斷裂。此外，可存在能破壞細(xì)胞功能的DNA和蛋白質(zhì)的交聯(lián)。取決于輻射類(lèi)型，DNA損傷的機(jī)制可變化，相對(duì)生物有效性亦變化。例如，重粒子(即，質(zhì)子、中子)直接破壞DNA并且具有更大的相對(duì)生物有效性。然而，電磁輻射通過(guò)主要由細(xì)胞的水的電離產(chǎn)生的壽命短暫的羥基自由基導(dǎo)致間接的離子化作用。輻射的臨床應(yīng)用由外線(xiàn)束放射(來(lái)自外部來(lái)源)和短距離放射治療(使用植入或插入患者的輻射源)組成。外線(xiàn)束輻射由X射線(xiàn)和/或Y射線(xiàn)組成，而短距離放射治療使用衰變并且發(fā)射α粒子或β粒子連同Y射線(xiàn)的放射性核。
如本文中所用，術(shù)語(yǔ)〃備選治療方案〃或〃備選療法〃(非上述一線(xiàn)化學(xué)治療方案)可包括例如受體酪氨酸激酶抑制劑(例如IreSSa (吉非替尼)、TarCevaTM(埃羅替尼)、ErbitUX (西妥昔單抗)、伊馬替尼甲磺酸(Gleevec ));蛋白體抑制劑(例如硼替佐米(Velcade )) ;VEGFR2抑制劑例如PTK787 (ZK222584)、aurora激酶抑制劑(例如ZM447439);雷帕霉素的哺乳動(dòng)物靶(mTOR)抑制劑、環(huán)加氧酶-2 (C0X-2)抑制劑、雷帕霉素抑制劑(例如西羅莫司、(Rapamune ));法呢?；D(zhuǎn)移酶抑制劑(例如替匹法尼(Zarnestra ));基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑(例如BAY12-9566 ;硫酸多糖tecogalan);血管生成抑制劑(例如阿瓦斯丁(Avastin )(貝伐單抗)；夫馬潔林的類(lèi)似物例如TNP-4 ;羧胺三唑；BB-94和BB-2516 ;沙利度胺；白細(xì)胞介素_12 ;三羧氨基喹啉(Iinomide);肽片段；和抗血管生長(zhǎng)因子和血管生長(zhǎng)因子受體的抗體)；血小板衍生生長(zhǎng)因子受體抑制劑、蛋白激酶C抑制劑、有絲分裂原激活的激酶抑制劑、有絲分裂原激活的蛋白激酶激酶抑制劑、勞斯肉瘤病毒轉(zhuǎn)化癌基因(SRC)抑制劑、組蛋白去乙?；敢种苿⑿∪毖跽T導(dǎo)因子抑制劑、hedgehog抑制劑和TGF-β信號(hào)傳導(dǎo)抑制劑。此外，免疫治療劑也可被認(rèn)為是備選治療方案。例如，血清或含Y球蛋白的形成的抗體；非特異性免疫刺激佐劑；活性特異性免疫療法；和過(guò)繼免疫療法。此外，備選療法可包括其他基于生物學(xué)的化學(xué)實(shí)體例如多核苷酸，包括反義分子、多肽、抗體、基因療法載體等?？蓡为?dú)或組合地或與本文中描述的其他治療方案組合地施用此類(lèi)備選治療劑。組合治療中備選治療方案中使用的化學(xué)治療劑和其他試劑的使用方法(包括給藥和施用方案)對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)也是已知的。
如本文中所用，術(shù)語(yǔ)“腫瘤定位”意指在注射入荷瘤動(dòng)物后，SPARC結(jié)合抗體在表達(dá)SPARC的腫瘤中所聚集的程度。腫瘤定位可通過(guò)任何適當(dāng)?shù)姆椒▉?lái)測(cè)量，包括但不限于利用熒光染料標(biāo)記抗體，將現(xiàn)有熒光抗體注射入具有腫瘤的動(dòng)物，測(cè)定腫瘤熒光相對(duì)于來(lái)自遠(yuǎn)離任何肉眼可見(jiàn)腫瘤(gross tumor)的皮膚的突光的比率，其中如果所述比率>20,優(yōu)選> 10，更優(yōu)選>5，則 定位存在。
抗體
本發(fā)明提供了 SPARC結(jié)合抗體。具體地，SPARC結(jié)合抗體可以為Imml2、Imml4、mHT1、hHTI (mHTI的人源化形式)或其組合。
此外，本發(fā)明提供了能夠結(jié)合血液中發(fā)現(xiàn)的SPARC例如HTI (血小板)SPARC和腫瘤部位發(fā)現(xiàn)的SPARC例如Biol-SPARC的SPARC結(jié)合抗體。各種測(cè)定抗體結(jié)合強(qiáng)度的方法對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是已知的。
對(duì)于人用途，為了避免免疫原性和免疫應(yīng)答，優(yōu)選使用人源化SPARC結(jié)合抗體或適當(dāng)?shù)钠卫鏔ab’、Fab或Fab2。人源化抗體或其片段可以例如使用下列已建立的方法之一來(lái)產(chǎn)生:1)可使用人IgG骨架并以抗SPARC抗體的可變⑶R區(qū)替代其可變⑶R區(qū)來(lái)構(gòu)建人源化抗體，其中重鏈和輕鏈獨(dú)立地在分開(kāi)的啟動(dòng)子下表達(dá)或在一個(gè)啟動(dòng)子下與IRES序列一起共表達(dá)；2)可使用經(jīng)工程改造具有人免疫系統(tǒng)的小鼠產(chǎn)生針對(duì)SPARC的人源化單克隆抗體；3)可使用噬菌粒(M13、λ大腸桿菌噬菌體或能夠表面呈遞的任何噬菌體系統(tǒng))產(chǎn)生針對(duì)SPARC的人源化抗體。為了構(gòu)建全長(zhǎng)抗體，可將可變區(qū)轉(zhuǎn)移至重鏈和輕鏈的⑶R上。重鏈和輕鏈在哺乳動(dòng)物細(xì)胞例如CH0、293或人髓樣細(xì)胞中的共表達(dá)可提供全長(zhǎng)抗體。類(lèi)似地，可使用良好建立的方法制備Fab’、Fab或Fab2片段和單鏈抗體。
本發(fā)明還提供了特異性識(shí)別獨(dú)特于血漿SPARC的表位的人源化抗體。人源化抗體通常為其中來(lái)自CDR的殘基被來(lái)自非人物種例如小鼠、大鼠或兔子CDR的殘基替代的具有期望的特異性、親和力和能力的人抗體。在一些情況下，人抗體的Fv構(gòu)架殘基被相應(yīng)的非人殘基替代。任何適當(dāng)?shù)膯慰寺】贵w可用作CDR的來(lái)源，例如，結(jié)合人和鼠SPARC，特別是結(jié)合循環(huán)人SPARC，在體外測(cè)定中顯示良好的抗血管生成活性，以及在動(dòng)物模型中具有前景的結(jié)果(例如，在異種移植模型系統(tǒng)中減少轉(zhuǎn)移)的抗SPARC抗體。
人源化單克隆抗體存在4個(gè)一般步驟。這些步驟為:(I)確定起始抗體輕鏈和重鏈可變結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列和預(yù)測(cè)的氨基酸序列，(2)設(shè)計(jì)人源化抗體，即決定在人源化過(guò)程中將使用哪一個(gè)抗體構(gòu)架區(qū)，(3)實(shí)際的人源化方法/技術(shù)和(4)轉(zhuǎn)染和表達(dá)人源化抗體。參見(jiàn)，例如，美國(guó)專(zhuān)利 N0.4，816，567; 5, 807，715; 5，866，692; 6, 331，415; 5，530，101; 5，693，761; 5, 693，762; 5，585，089; 6，180，370 和 6，548，640 (將其通過(guò)引用并入本文)。例如，可將恒定區(qū)工程改造成更相似于人的恒定區(qū)，以在抗體被用于臨床試驗(yàn)和人的治療時(shí)避免免疫應(yīng)答。參見(jiàn)，例如，美國(guó)專(zhuān)利N0.5，997，867和5，866，692 (將其通過(guò)引用并入本文)。
重要地，抗體被人源化保持對(duì)抗原的高親和力和其它有利的生物性質(zhì)。為了實(shí)現(xiàn)該目的，可通過(guò)使用親代和人源化序列的三維模型分析親代序列和各種概念上的人源化產(chǎn)品的方法來(lái)制備人源化抗體。三維免疫球蛋白模型通常是可獲得的并且對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是熟悉的。例示和展示選擇的候選免疫球蛋白序列的可能的三維構(gòu)象結(jié)構(gòu)的計(jì)算機(jī)程序是可獲得的。此類(lèi)展示的檢查允許分析殘基在行使候選免疫球蛋白序列的功能中的作用，即分析影響候選免疫球蛋白結(jié)合其抗原的能力的殘基。這樣，可從共有序列和輸入序列選擇和組合構(gòu)架殘基以便獲得期望的抗體特征，例如增加的對(duì)靶抗原的親和力。一般而言，CDR殘基直接和最實(shí)質(zhì)性地參與影響抗原結(jié)合。人源化抗體還可在鉸鏈區(qū)包含修飾以改進(jìn)抗體的一個(gè)或多個(gè)特征。
或者，可利用噬菌體展示技術(shù)篩選和重組地制造抗體。參見(jiàn)，例如，美國(guó)專(zhuān)利N0.5，565，332; 5, 580，717; 5，733，743和6，265，150 (將其通過(guò)引用并入本文)?；蛘?，可將噬菌體展示技術(shù)(McCafferty等人，Nature348:552-553 (1990))用于從來(lái)自未免疫的供體的免疫球蛋白可變(V)結(jié)構(gòu)域基因庫(kù)體外產(chǎn)生人抗體和抗體片段。
在天然免疫應(yīng)答中，抗體基因以高速率積累突變(體細(xì)胞高度突變)。引入的一些改變將賦予更高的親和力，顯示高親和力表面免疫球蛋白的B細(xì)胞在隨后抗原攻擊過(guò)程中優(yōu)先復(fù)制和分化。該天然過(guò)程可通過(guò)應(yīng)用稱(chēng)為“鏈改組”的技術(shù)來(lái)模擬。Marks，等人，Bio/Technol.10:779-783 (1992))。在該方法中，通過(guò)噬菌體展示獲得的“初級(jí)”人抗體的親和力可通過(guò)利用獲自未免疫的供體的V結(jié)構(gòu)域基因的天然存在的變體的文庫(kù)(文庫(kù))連續(xù)替代重鏈和輕鏈V區(qū)域基因來(lái)增強(qiáng)。該技術(shù)使得能夠產(chǎn)生具有在pM-nM范圍內(nèi)的親和力的抗體和抗體片段。
基因改組還可用于從嚙齒目動(dòng)物抗體衍生人抗體，其中人抗體具有與起始嚙齒目動(dòng)物抗體相似的親和力和特異性。根據(jù)該方法(其也被稱(chēng)為“表位印跡(epitopeimprinting) ”)，利用一個(gè)文庫(kù)的人V結(jié)構(gòu)域基因替代通過(guò)噬菌體展示技術(shù)獲得的嚙齒目動(dòng)物抗體的重鏈或輕鏈 V結(jié)構(gòu)域基因，從而產(chǎn)生嚙齒目動(dòng)物-人嵌合體。針對(duì)抗原的選擇導(dǎo)致能夠恢復(fù)功能性抗原-結(jié)合位點(diǎn)的人可變區(qū)的分離，即表位控制(印跡)伴侶的選擇。當(dāng)重復(fù)該方法以替代剩余的嚙齒目動(dòng)物V結(jié)構(gòu)域時(shí)，獲得人抗體(參見(jiàn)PCT公布號(hào)W093/06213，1993年4月I日公布)。與通過(guò)⑶R移植進(jìn)行的嚙齒目動(dòng)物抗體的常規(guī)人源化不同，該技術(shù)提供了不具有嚙齒目動(dòng)物來(lái)源的構(gòu)架或CDR殘基的完全人抗體。很明顯雖然上文中的論述涉及人源化抗體，但所述的一般原理適用于定制用于例如狗、貓、靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物、馬和牛的抗體。
本發(fā)明的SPARC結(jié)合抗體包括完全抗體以及保留針對(duì)SPARC的結(jié)合位點(diǎn)的抗體的片段(例如，F(xiàn)ab’、Fab和Fab2)?？贵w可以是任何種類(lèi)的抗體例如IgM、IgA、IgG、IgE、IgD和IgY?？贵w可以是例如二價(jià)、單價(jià)或嵌合抗體(一個(gè)針對(duì)SPARC的效價(jià)和另一個(gè)針對(duì)活性試劑(例如tTF或篦麻毒素A，或本文中描述的另一種活性試劑)的效價(jià))。人源化抗體不限于IgG。相同的技術(shù)可用于產(chǎn)生所有其它種類(lèi)的抗體例如IgE、IgA、IgD、IgM，每一種抗體具有不同的適當(dāng)?shù)蒯槍?duì)特定疾病靶的抗體-依賴(lài)性細(xì)胞的細(xì)胞毒性(ADCC)和補(bǔ)體依賴(lài)性細(xì)胞毒性(CDC)活性。抗體的功能性片段可通過(guò)限制性蛋白水解來(lái)產(chǎn)生。此類(lèi)片段可以是單價(jià)的(例如Fab’ )或雙價(jià)的(例如Fab2)。還可在大腸桿菌(E.coli)中將片段合成為單鏈scfv或微型雙功能抗體(diabody)。
組合物
本發(fā)明提供了包含上述SPARC結(jié)合抗體的組合物。在一些實(shí)施方案中，組合物包含Imml2、Imml4、mHTI或hHTI連同適當(dāng)?shù)妮d體。在其它實(shí)施方案中，組合物包含Imml2、Imml4、mHTI或hHTI的組合以及適當(dāng)載體。在優(yōu)選實(shí)施方案中，組合物是包含SPARC結(jié)合抗體和藥學(xué)上可接受的載體的藥學(xué)上可接受的組合物。
本發(fā)明的組合物還可包含活性試劑。在一些實(shí)施方案中，活性試劑為能夠直接產(chǎn)生其藥理學(xué)效應(yīng)的藥學(xué)活性治療劑。在其它實(shí)施方案中，活性試劑為診斷劑。在優(yōu)選實(shí)施方案中，活性試劑為綴合有SPARC結(jié)合抗體或與其一起施用的診斷性或治療性活性試劑。應(yīng)理解一些活性試劑可用作診斷和治療劑，因此此類(lèi)術(shù)語(yǔ)不是相互排斥的。
本發(fā)明的組合物可用于相對(duì)于單獨(dú)的活性試劑的遞送增強(qiáng)活性試劑至患病部位的遞送，或增強(qiáng)SPARC的清除，從而導(dǎo)致SPARC的血液水平的降低。在優(yōu)選實(shí)施方案中，SPARC的血液水平的降低為 至少約10%。在更優(yōu)選實(shí)施方案中，SPARC的血液水平的降低為至少約 15%、20%、25%、30%、35%、40%、45% 或最優(yōu)選至少約 50%。
活性試劑可以是任何適當(dāng)?shù)闹委焺┗蛟\斷劑例如化學(xué)治療劑或抗癌劑。適當(dāng)?shù)脑\斷劑包括熒光染料、放射性試劑、MRI造影劑、X射線(xiàn)造影劑、超聲造影劑和PET造影齊U。根據(jù)本發(fā)明使用的適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)治療劑或其他抗癌劑包括但不限于酪氨酸激酶抑制劑(genistein)、生物活性試劑(TNF、tTF)、放射性核素(1311、90Y、lllIn、211At、32P 和其他已知的治療性放射性核素)、阿霉素、安莎霉素類(lèi)抗生素、天冬酰胺酶、博來(lái)霉素、白消安、順鉬、卡鉬、卡莫司汀、卡培他濱、苯丁酸氮芥、阿糖胞苷、環(huán)磷酰胺、喜樹(shù)堿、達(dá)卡巴嗪、放線(xiàn)菌素D、柔紅霉素、右雷佐生、多西他賽、多柔比星、依托泊苷、埃博霉素、氟尿苷、氟達(dá)拉濱、氟尿嘧啶、吉西他濱、羥基脲、伊達(dá)比星、異環(huán)磷酰胺、伊立替康、洛莫司汀、氮芥、巰嘌呤、美法侖、甲氨蝶呤、雷帕霉素(西羅莫司)及衍生物、絲裂霉素、米托坦、米托蒽醌、亞硝基脲、紫杉醇、帕米膦酸鈉、噴司他丁、普卡霉素、丙卡巴肼、利妥昔單抗、鏈佐星、替尼泊苷、硫鳥(niǎo)嘌呤、塞替派、紫杉燒、長(zhǎng)春堿、長(zhǎng)春新堿、長(zhǎng)春瑞濱、泰素、考布他汀、discodermolide和反鉬。
根據(jù)本發(fā)明使用的其他適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)治療劑包括但不限于抗代謝藥例如，天冬酰胺酶)、抗有絲分裂物質(zhì)(例如，長(zhǎng)春花生物堿)、DNA損傷劑(例如，順鉬)、促細(xì)胞凋亡劑(誘導(dǎo)程序化細(xì)胞死亡或細(xì)胞凋亡的試劑)(例如，epipodophylotoxins)、分化誘導(dǎo)劑(例如，維生素A酸類(lèi)(retinoids))、抗生素(例如，博來(lái)霉素)和激素(例如，他莫昔芬、己烯雌酚(diethylstilbestrol))。此外,根據(jù)本發(fā)明使用的適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)治療劑包括抗血管生成試劑(血管生成抑制劑)例如，IFN-α、夫馬潔林、血管他丁、內(nèi)皮他丁、沙立度胺等。許多其它抗血管生成試劑已被鑒定并且在本領(lǐng)域是已知的,包括由Carmeliet和Jain (2000)列出的那些?？寡苌稍噭┛梢允翘烊淮嬖诘幕蚍翘烊淮嬖诘?。在一些實(shí)施方案中，化學(xué)治療劑為合成抗血管生成肽。例如，先前已報(bào)告小的合成的促細(xì)胞凋亡肽的抗血管生成活性包括兩個(gè)功能結(jié)構(gòu)域，一個(gè)靶向腫瘤微血管上的CD13受體(氨肽酶N)并且另一個(gè)在內(nèi)化后破壞線(xiàn)粒體膜。Nat.Med.1999，5 (9):1032-8。在其它實(shí)施方案中，抗血管生成試劑為第二代二聚肽 CNGRC-GG-d(KLAKLAK)2，稱(chēng)為 HKP (獵人殺手肽(Hunter KillerP印tide))，經(jīng)發(fā)現(xiàn)具有提高的抗腫瘤活性。在某些實(shí)施方案中，抗血管生成試劑不是抗-VEGF抗體(例如貝伐單抗)，雖然本領(lǐng)域普通技術(shù)人員也理解可根據(jù)本發(fā)明使用貝伐單抗。

優(yōu)選化學(xué)治療劑包括多西他賽、紫杉醇及其組合?！捌浣M合”是指包含超過(guò)I種藥物劑型的施用，例如多西他賽和紫杉醇，以及多西他賽與紫杉醇的連續(xù)地但時(shí)間上不同的施用(例如，在一個(gè)周期中使用多西他賽但在下一周期中使用紫杉醇)。特別優(yōu)選的化學(xué)治療劑包含蛋白質(zhì)結(jié)合藥物的顆粒，包括但不限于，其中組成蛋白質(zhì)結(jié)合的藥物顆粒的蛋白質(zhì)包括白蛋白，包括其中超過(guò)50%的化學(xué)治療劑以納米顆粒形式存在。最優(yōu)選，化學(xué)治療劑包含白蛋白結(jié)合的紫杉醇的顆粒例如Abraxane 。可按照本發(fā)明使用此類(lèi)白蛋白結(jié)合的紫杉醇制劑(稱(chēng)為“白蛋白結(jié)合型紫杉醇”)，其中施用的紫杉醇劑量為約30mg/m2至約1000mg/m2，約3周的給藥周期(即，約每3周一次施用紫杉醇的劑量)。此外，理想地，施用的紫杉醇的劑量為約50mg/m2至約800mg/m2,優(yōu)選約80mg/m2至約700mg/m2,最優(yōu)選約250mg/m2至約300mg/m2，約3周的給藥周期。其他治療劑還包括但不限于生物活性多肽、抗體和其片段、外源凝集素和毒素(例如篦麻毒素A)或放射性核素。用作根據(jù)本發(fā)明的活性試劑的適當(dāng)抗體包括但不限于綴合(偶聯(lián)的)或未綴合的(未偶聯(lián)的)抗體、單克隆或多克隆抗體、人源化或非人源化的抗體以及Fab'、Fab或Fab2片段、單鏈抗體等。涉及的抗體或抗體片段可以是IgG、IgA、IgD、IgE或IgM的Fe片段。在不同優(yōu)選實(shí)施方案中，活性試劑是抗體本身的Fe片段、單鏈抗體、Fab片段、微型雙功能抗體(diabody)等。在更優(yōu)選實(shí)施方案中,抗體或抗體片段介導(dǎo)補(bǔ)體激活、細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性、調(diào)理作用、肥大細(xì)胞活化和/或其它免疫應(yīng)答。此外，藥學(xué)活性試劑可以是siRNA。在優(yōu)選實(shí)施方案中，SiRNA分子抑制與腫瘤相關(guān)的基因(例如c-Sis和其他生長(zhǎng)因子、EGFR、PDGFR, VEGFR、HER2、其他受體酪氨酸激酶、Src-家族基因、Syk-ZAP-70家族基因、BTK家族基因、其他細(xì)胞質(zhì)酪氨酸激酶、Raf激酶、細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶、其他細(xì)胞質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸激酶、Ras蛋白和其他調(diào)節(jié)性GTP酶)的表達(dá)。還可將SPARC結(jié)合抗體綴合于聚乙二醇(PEG)。PEG綴合能夠增加蛋白質(zhì)的循環(huán)半衰期，降低蛋白質(zhì)的免疫原性和抗原性，并改善其生物活性?？梢允褂萌我夂线m的綴合方法，包括但不限于:例如，使甲氧基-PEG與SPARC結(jié)合抗體的可供利用的氨基或其它活性反應(yīng)位點(diǎn)例如組氨酸或半胱氨酸反應(yīng)。此外，可以使用重組DNA法將具有PEG反應(yīng)活性基團(tuán)的氨基酸添加到本發(fā)明的SPARC結(jié)合抗體中?？稍趯EG與SPARC結(jié)合抗體反應(yīng)之前加工PEG，例如，可將接頭基團(tuán)添加到PEG。此外，本發(fā)明可以使用可釋放的和雜合的PEG化策略，例如SPARC結(jié)合抗體的PEG化，以便添加到SPARC結(jié)合抗體中的某些位點(diǎn)的PEG分子在體內(nèi)被釋放。此類(lèi)PEG綴合方法是本領(lǐng)域已知的(參見(jiàn),例如，Greenwald等人，Adv.DrugDelivery Rev.55:217-250(2003)。涉及的SPARC結(jié)合抗體和其綴合物，可以配制成中性或鹽形式的組合物。藥學(xué)上可接受的鹽包括酸加成鹽(與蛋白質(zhì)的游離氨基形成)以及與無(wú)機(jī)酸例如鹽酸或磷酸形成的鹽，或與有機(jī)酸例如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等形成的鹽。與游離羧基形成的鹽也可以衍生自無(wú)機(jī)堿，例如氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化銨、氫氧化鈣或氫氧化鐵，以及有機(jī)堿例如異丙胺、三甲基胺、組氨酸、普魯卡因等。
通常在包含載體例如藥學(xué)上可接受的載體的制劑中提供本發(fā)明的組合物。載體通常是液體，但也可以是固體，或液體與固體成分的組合。載體優(yōu)選為生理上可接受的(例如藥學(xué)上可接受的或藥理學(xué)上可接受的)載體(例如賦形劑或稀釋劑)。適當(dāng)?shù)乃幬镔x形劑包括穩(wěn)定劑、抗氧化劑、重量克分子滲透壓濃度調(diào)節(jié)劑、緩沖劑和PH調(diào)節(jié)劑。適當(dāng)?shù)奶砑觿┌ㄉ砩仙锵嗳菪跃彌_劑、螯合劑或鈣螯絡(luò)合物的添加或任選地，鈣或鈉鹽的添加?？砂b藥物組合物以以液體形式使用，或可進(jìn)行冷凍干燥。優(yōu)選生理上可接受的載體介質(zhì)是水、緩沖的水、生理鹽水、0.4%的鹽水、0.3%的甘氨酸、透明質(zhì)酸等。生理上可接受的載體是本領(lǐng)域公知的并且是可以容易獲得的。載體的選擇可至少部分地通過(guò)靶組織和/或細(xì)胞的位置和用于施用組合物的具體方法來(lái)確定。
可配制用于通過(guò)途徑包括靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、鞘內(nèi)、腦硬膜上、表面、經(jīng)皮、皮下、經(jīng)粘膜(包括例如肺)、鼻內(nèi)、經(jīng)直腸、經(jīng)陰道或口服途徑施用的組合物。所述組合物還可包含另外的成分例如稀釋劑、佐劑、賦形劑、防腐劑和pH調(diào)節(jié)劑等。
適合用于注射施用的制劑包括水性和非水性等滲無(wú)菌注射溶液，其可以包含抗氧化劑、緩沖劑、抑菌劑和使制劑與目標(biāo)接受體的血液等滲的溶質(zhì)；水性和非水性的無(wú)菌懸浮液，其可以包含懸浮劑、增溶劑、增稠劑、穩(wěn)定劑、冷凍保護(hù)劑和防腐劑。制劑的形式可以是單元?jiǎng)┝炕蚨鄤┑拿芊獾娜萜?，例如安瓿和小瓶，并且可以?xún)?chǔ)存在冷凍干燥(凍干)的條件下，在臨使用前，僅需要添加無(wú)菌的液體載體例如用于注射的水?？梢詮臒o(wú)菌粉末、顆?；蚱瑒﹣?lái)制備即用型的注射溶液和懸浮液。
可通過(guò)以所需的量將活性試劑與一種上面例舉的成分或其組合(根據(jù)需要)一起摻入適當(dāng)?shù)娜軇?，然后過(guò)濾滅菌來(lái)制備無(wú)菌注射液。優(yōu)選地用于注射的溶液不含內(nèi)毒素。通常，通過(guò)將活性化合物摻入包含基本分散介質(zhì)和來(lái)自上面列舉的成分的所需其他成分的無(wú)菌媒介物來(lái)制備分散體。在用于制備無(wú)菌注射液的無(wú)菌粉末的情況下，優(yōu)選制備方法是真空干燥和冷凍干燥，其產(chǎn)生活性成分+來(lái)自其先前無(wú)菌過(guò)濾的液體的任何另外理想的成分的粉末。在所有情況下，制劑必須是無(wú)菌的并且其流動(dòng)性必須達(dá)到容易注射的程度。其在生產(chǎn)和儲(chǔ)存的條件下必須是穩(wěn)定的，并且必須能抗微生物例如細(xì)菌和真菌的污染作用而保存?？梢栽谒型ㄟ^(guò)適宜地與表面活性試劑例如羥基纖維素混合來(lái)制備游離堿或藥學(xué)上可接受鹽形式的活性化合物的溶液。也可以在甘油、液體聚乙二醇及其混合物以及在油中制備分散液。在通常的 儲(chǔ)存和使用條件下，這些制備物含有防腐劑以阻止微生物的生長(zhǎng)。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，可以將活性成分捕獲在例如通過(guò)凝聚技術(shù)或通過(guò)界面聚合法制備的微膠囊中，例如，分別在膠體藥物遞送系統(tǒng)(例如，脂質(zhì)體、白蛋白微球體、微乳劑、納米顆粒和納米膠囊)或粗乳劑中的聚羥甲基纖維素或明膠-微膠囊和聚_(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊。此類(lèi)技術(shù)公開(kāi)于Remington’s Pharmaceutical Sciences第16版，Osol, A.Ed.(1980)。具體地，可通過(guò)這樣的方法如Rezler等人，J.Am.Chem.Soc.129(16):4961-72(2007) ; Samad 等人，Curr.Drug Deliv.4(4):297-305(2007);以及美國(guó)專(zhuān)利4，485，045和4，544，545中描述的方法來(lái)制備包含SPARC結(jié)合抗體的脂質(zhì)體。具有增加的循環(huán)時(shí)間的脂質(zhì)體公開(kāi)于美國(guó)專(zhuān)利5，013，556中。
特別有用的脂質(zhì)體可通過(guò)例如反相蒸發(fā)法利用包含磷脂酰膽堿、膽固醇和PEG衍生的磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂組合物產(chǎn)生?？赏ㄟ^(guò)確定孔徑的過(guò)濾器擠出脂質(zhì)體以產(chǎn)生具有理想的直徑的脂質(zhì)體?？扇鏦erle等人，Int.J.Pharm.370(1-2):26-32(2009)中所述，將本發(fā)明的多肽綴合至脂質(zhì)體。
在其他實(shí)施方案中，可使用天然病毒或病毒樣顆粒、樹(shù)枝狀大分子、碳納米裝配物、聚合物載體、順磁顆粒、磁鐵顆粒、聚合物小體(polymersome)、filomicelle、膠束或脂蛋白遞送組合物。
至氣道內(nèi)的施用可提供全身性或局部施用，例如至氣管和/或肺。此類(lèi)施用可使用氣霧劑、溶液和設(shè)備例如支氣管鏡通過(guò)吸入或通過(guò)身體敷用來(lái)進(jìn)行。對(duì)于吸入，本文中的組合物可方便地利用吹入器、噴霧器、泵、加壓封裝裝置(pressurized pack)或用于遞送氣霧劑的其他方便的方法、粉末的非氣霧噴霧器或液體的非氣霧噴霧器遞送。加壓封裝裝置可包括適當(dāng)?shù)耐七M(jìn)劑例如液化氣體或壓縮氣體。液化氣體包括例如氟化氯化烴類(lèi)、氯氟烴、hydrochlorocarbon,烴類(lèi)和烴醚類(lèi)。壓縮氣體包括例如氮?dú)?、氧化亞氮和二氧化碳。具體地，包括二氟二氯甲烷、三氯 氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他適當(dāng)?shù)臍怏w的使用。在加壓氣霧劑的情況下，可通過(guò)提供閥門(mén)以遞送控制的量來(lái)確定劑量單位。在施用干燥粉末組合物中，粉末混合物可包括適當(dāng)?shù)姆勰┗桌缛樘腔虻矸?。粉末組合物可以以單位劑型例如膠囊、藥筒或可借助于吸入器或吹入器從其施用粉末的泡罩包裝(blister pack)提供。
還可通過(guò)經(jīng)粘膜或經(jīng)皮膚方法進(jìn)行全身性施用。對(duì)于經(jīng)粘膜或經(jīng)皮膚施用，將適合于待穿過(guò)的屏障的滲透劑用于制劑中。此類(lèi)滲透劑在本領(lǐng)域內(nèi)通常是已知的，并且對(duì)于經(jīng)粘膜施用，包括例如去垢劑、膽汁鹽和夫西地酸衍生物。經(jīng)粘膜施用可通過(guò)使用鼻腔噴霧、吸入的氣霧劑、直腸或陰道栓劑、漱口藥、速溶片劑或錠劑來(lái)實(shí)現(xiàn)。對(duì)于經(jīng)皮膚施用，將活性成分配制于軟膏、藥膏、凝膠、泡沫或乳膏劑中，如本領(lǐng)域內(nèi)通常已知的。
可使用藥物遞送系統(tǒng)遞送藥物組合物。此類(lèi)遞送系統(tǒng)包括透明質(zhì)酸溶液或膠原片段的懸液?？蓪⑺幬锱渲圃谖⒛z囊中，利用適當(dāng)?shù)木酆喜牧显O(shè)計(jì)以用于控制釋放，例如聚乳酸、乙輕纖維素、聚已酸內(nèi)酯、聚已酸內(nèi)酯二醇(polycaprolactone diol)、多聚賴(lài)氨酸、聚乙醇酸、聚馬來(lái)酸、聚[N-(2-羥丙基)甲基丙烯酰胺]等。使用藥物遞送系統(tǒng)的特定制劑可以以液體懸液、軟膏、復(fù)合至繃帶、膠原罩(collagen shield)等的形式存在。
組合物還可包含任何其他適當(dāng)?shù)某煞郑貏e地用于增強(qiáng)組合物的穩(wěn)定性和/或其最終用途。因此，存在多種本發(fā)明的組合物的制劑。
持續(xù)釋放的組合物還可用于本發(fā)明的組合物，例如在例如美國(guó)專(zhuān)利5，672，659和5，595，760中描述的組合物。立即或持續(xù)釋放組合物的使用取決于待治療的病況的性質(zhì)。如果病況由急性或超急性的障礙組成，則利用立即釋放的治療優(yōu)于延長(zhǎng)釋放組合物?；蛘撸瑢?duì)于某些預(yù)防性或長(zhǎng)期治療，持續(xù)釋放組合物可以是適當(dāng)?shù)摹?br> 此外，組合物可包含額外的治療或生物活性試劑。例如，可存在在特定適應(yīng)癥的治療中有用的治療因子。控制炎癥的因子例如布洛芬或留類(lèi)可以是減小與藥物組合物的體內(nèi)施用和生理壓力相關(guān)的腫脹和炎癥的組合物的部分。
由本發(fā)明提供的組合物可包括例如約0.5mL至約4mL的具有偶聯(lián)至SPARC結(jié)合抗體的活性試劑的水性或有機(jī)液體，活性試劑的濃度為約10mg/mL至約100mg/mL,優(yōu)選約lmg/mL至約10mg/mL,更優(yōu)選約0.lmg/mL至約lmg/mL?；钚栽噭┛梢砸匀魏芜m當(dāng)?shù)暮椭委熒嫌行У臐舛却嬖冢?，濃度為約10mg/mL至約50mg/mL的貝伐單抗。
方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供了通過(guò)施用診斷或治療有效量的包含SPARC結(jié)合抗體的組合物來(lái)診斷或治療動(dòng)物的疾病的方法，所述SPARC結(jié)合抗體包括Imml2、Imml4、mHT1、hHTI或其組合。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了通過(guò)施用有效量的Imml2、Imml4、mHT1、hHTI或其組合來(lái)診斷動(dòng)物的疾病的方法。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了通過(guò)施用有效量的Imml2、Imml4、mHT1、hHTI或其組合來(lái)治療動(dòng)物的疾病的方法。上述任何組合物可用于本發(fā)明的方法。
根據(jù)本發(fā)明的方法，可給哺乳動(dòng)物施用治療有效量的組合物以相對(duì)于單獨(dú)的活性試劑的遞送增加活性試劑至疾病部位的遞送，或增加清除，從而導(dǎo)致SPARC的血液水平下降。在優(yōu)選實(shí)施方案中，SPARC的血液水平的下降為至少約10%。在更優(yōu)選實(shí)施方案中，SPARC的血液水平的下降為至少約15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%或最優(yōu)選至少約50%。
本發(fā)明還提供了診斷動(dòng)物的疾病或病況的方法，包括(a)給動(dòng)物施用診斷有效量的SPARC結(jié)合抗體，所述SPARC結(jié)合抗體包括Imml2、Imml4、mHT1、hHTI或其組合；(b)檢測(cè)存在于動(dòng)物的特定部位或組織中的SPARC結(jié)合抗體的量；和(c)如果存在的SPARC結(jié)合抗體的量顯示顯著高于正常水平的SPARC存在于特定部位或組織中，則疾病或病況存在。
同樣的，本 發(fā)明還提供了利用一種或多種抗癌劑和SPARC結(jié)合抗體治療動(dòng)物的腫瘤的方法，包括:從動(dòng)物分離生物樣品，檢測(cè)所述生物樣品中的SPARC蛋白的表達(dá)，定量生物樣品中的SPARC蛋白的量，如果存在于生物樣品中的SPARC蛋白顯示高于閾值水平，則施用治療有效量的抗癌劑和治療有效量的抗-SPARC抗體，或者如果SPARC蛋白低于閾值水平，則施用治療有效量的抗癌劑并且不施用SPARC結(jié)合抗體。
通常使用抗-SPARC抗體檢測(cè)存在于樣品中的SPARC蛋白的水平。然而，在一些實(shí)施方案中，可僅使用抗體的一部分，使用不為抗體的SPARC結(jié)合分子或使用一些檢測(cè)SPARC表達(dá)、不需要抗體或SPARC結(jié)合分子的其它方法來(lái)測(cè)定SPARC蛋白的表達(dá)。
本方法可用于特征在于SPARC的過(guò)表達(dá)的任何病況。本發(fā)明對(duì)于其是有用的示例性疾病包括任意身體組織包括軟組織、結(jié)締組織、骨、實(shí)體器官、血管等中的異常增殖的病況、組織重構(gòu)、增生、擴(kuò)大的傷口愈合?？墒褂帽景l(fā)明的方法和組合物治療或診斷的疾病的實(shí)例包括癌癥、糖尿病或其它腎病、炎癥、纖維化、關(guān)節(jié)炎、血管或人工血管移植物或血管內(nèi)裝置的再狹窄等。
本發(fā)明的方法的范圍內(nèi)的其它疾病包括但不限于癌癥、再狹窄或其他增殖性疾病、纖維化、骨質(zhì)疏松癥或擴(kuò)大的傷口愈合。具體，此類(lèi)適當(dāng)?shù)募膊“ǖ幌抻?，其?(a)癌癥可以是例如原位癌、非典型增生、癌、肉瘤、癌肉瘤、肺癌、胰腺癌、皮膚癌、血液腫瘤、乳腺癌、腦癌、結(jié)腸癌、膀胱癌、宮頸癌、子宮內(nèi)膜癌、食管癌、胃癌、頭頸癌、多發(fā)性骨髓瘤、肝癌、白血病、淋巴瘤、口癌、骨肉瘤、卵巢癌、前列腺癌、睪丸癌、和甲狀腺癌，(b)再狹窄可以是例如冠狀動(dòng)脈再狹窄、腦動(dòng)脈再狹窄、頸動(dòng)脈再狹窄、腎動(dòng)脈再狹窄、股動(dòng)脈再狹窄、周?chē)鷦?dòng)脈再狹窄或其組合，(C)其他增殖性疾病可以是例如超常增生(hyperplasias)、子宮內(nèi)膜異位癥、肥大性癥痕(hypertrophic scars)和癥痕挖瘡(keloid)、增生性糖尿病視網(wǎng)膜病、腎小球腎炎、增生性肺動(dòng)脈高壓、類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、動(dòng)靜脈畸形、粥樣硬化斑塊、冠狀動(dòng)脈疾病、延遲傷口愈合、血友病性關(guān)節(jié)(hemophilic joints)、不連接骨折(nonunionfractures)、郎-奧韋綜合征(Osler-Weber syndrome)、銀屑病、化膿性肉芽腫、硬皮病、tracoma、月經(jīng)過(guò)多、血管粘附和乳頭狀瘤和(d)纖維化疾病可以是例如肝纖維化、肺纖維化和腹膜后纖維化。動(dòng)物可以是需要治療或診斷的任何患者或受試者。在優(yōu)選實(shí)施方案中，動(dòng)物是哺乳動(dòng)物。在特別優(yōu)選實(shí)施方案中，動(dòng)物是人。在其它實(shí)施方案中，動(dòng)物可以是小鼠、大鼠、兔、貓、狗、豬、綿羊、馬、?；蚍侨遂`長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物。本發(fā)明還提供了使用抗SPARC中和抗體例如適當(dāng)?shù)腟PARC結(jié)合抗體抑制SPARC活性的方法。中和抗體具有在體內(nèi)阻斷SPARC與其效應(yīng)物的相互作用，例如SPARC與細(xì)胞表面組分的相互作用或SPARC對(duì)其天然配體例如白蛋白、生長(zhǎng)因子和Ca2+的結(jié)合的能力。本發(fā)明提供了用于將化學(xué)治療劑遞送至動(dòng)物的腫瘤的方法。該方法包括給人或其它動(dòng)物施用治療有效量的藥物組合物，其中藥物組合物包含偶聯(lián)至適當(dāng)?shù)腟PARC結(jié)合抗體的化學(xué)治療劑和藥學(xué)上可接受的載體。結(jié)合本發(fā)明的其它實(shí)施方案的本文中所示的化學(xué)治療劑、動(dòng)物及其組分的描述也適用于將化學(xué)治療劑遞送至腫瘤的上述方法的相同方面。其對(duì)化學(xué)療法的應(yīng)答可被預(yù)測(cè)或測(cè)定，可按照本發(fā)明進(jìn)行治療的待檢測(cè)的腫瘤的類(lèi)型通常是在人和其它哺乳動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)的那些腫瘤類(lèi)型。腫瘤同樣地也可以是接種(例如在實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物中)的結(jié)果。許多類(lèi)型和形式的腫瘤可在人和其它動(dòng)物病況中遇到，并且無(wú)意將本發(fā)明的方法的應(yīng)用限定于任何特定腫瘤類(lèi)型或種類(lèi)。正如已知的，腫瘤包括因不受控制的和進(jìn)行性細(xì)胞分裂而產(chǎn)生的并且通常也稱(chēng)為“贅生物(neoplasm) ”的異常組織團(tuán)塊。本發(fā)明的方法對(duì)于例如人的腫瘤細(xì)胞和結(jié)合的間質(zhì)細(xì)胞、實(shí)體瘤和與軟組織結(jié)合的腫瘤例如軟組織肉瘤是有用的。腫瘤或癌可位于口腔和咽、消化系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、骨和關(guān)節(jié)(例如，骨轉(zhuǎn)移)、軟組織、皮膚(例如，黑素瘤)、乳腺、生殖系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)、眼和眼眶、腦和中樞神經(jīng)系統(tǒng)(例如，神經(jīng)膠質(zhì)瘤)或內(nèi)分泌系統(tǒng)(例如，甲狀腺)，并且不一定限定于原發(fā)性腫瘤或癌癥。與口腔相關(guān)的組織包括但不限于舌和嘴的組織。癌癥可在消化系統(tǒng)的組織中產(chǎn)生，例如食道、胃、小腸、結(jié)腸、直腸、肛門(mén)、肝、膽囊和胰腺。呼吸系統(tǒng)的癌可影響喉、肺和支氣管并且包括例如小細(xì)胞和非小細(xì) 胞肺癌。腫瘤可產(chǎn)生于組成男性和女性生殖系統(tǒng)的子宮頸、子宮體、卵巢外陰、陰道、前列腺、睪丸和陰莖，以及構(gòu)成泌尿系統(tǒng)的膀胱、腎、腎盂和輸尿管。腫瘤或癌可位于頭和/或頸(例如，喉癌和甲狀旁腺癌)。腫瘤或癌還可位于造血系統(tǒng)或淋巴系統(tǒng)，包括例如，淋巴瘤(例如，何杰金病和非何杰金淋巴瘤)、多發(fā)性骨髓瘤或白血病(例如，急性淋巴細(xì)胞白血病、慢性淋巴細(xì)胞白血病、急性髓性白血病、慢性髓性白血病等)。優(yōu)選地，腫瘤位于膀胱、肝、卵巢、腎、腸、腦或乳腺。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于通過(guò)SPARC結(jié)合抗體將藥學(xué)活性試劑遞送至特征在于SPARC的過(guò)表達(dá)的疾病的部位的方法。此類(lèi)疾病包括異常增殖狀況、組織重塑、超常增生和身體組織(例如，軟組織、結(jié)締組織、骨、實(shí)體器官、血管等)的擴(kuò)大的傷口愈合?？赏ㄟ^(guò)施用包含偶聯(lián)至適當(dāng)?shù)腟PARC抗體的治療劑的藥物組合物治療或診斷的疾病的實(shí)例包括癌癥、糖尿病或其它視網(wǎng)膜病變、炎癥、關(guān)節(jié)炎、血管的再狹窄、人造血管移植或血管內(nèi)裝置等。與本發(fā)明的其它實(shí)施方案結(jié)合的本文中所示的化學(xué)治療劑、腫瘤、動(dòng)物和其組分的描述也適用于遞送藥物活性試劑的上述方法的相同方面。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法包括給哺乳動(dòng)物施用治療有效量的包含脂質(zhì)體結(jié)合的或白蛋白結(jié)合的化學(xué)治療劑的藥物組合物，其中脂質(zhì)體或白蛋白被偶連至適當(dāng)?shù)募膊“邢騍PARC結(jié)合抗體?？墒褂萌魏芜m當(dāng)?shù)姆椒▽⒒瘜W(xué)治療劑偶連至SPARC結(jié)合抗體。優(yōu)選地，通過(guò)共價(jià)鍵包括例如二硫鍵將化學(xué)治療劑化學(xué)地偶連至化合物。也可按照本發(fā)明的方法施用一個(gè)或多個(gè)劑量的一種或多種化學(xué)治療劑例如上述化學(xué)治療劑。本發(fā)明方法中使用的化學(xué)治療劑的類(lèi)型和數(shù)目將取決于用于特定腫瘤類(lèi)型的標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)治療方案。換句話(huà)說(shuō)，雖然可利用單一化學(xué)治療劑常規(guī)地治療特定癌癥，但也可用化學(xué)治療劑的組合常規(guī)地治療另一種特定癌癥。用于將適當(dāng)?shù)闹委焺?、化學(xué)治療劑、放射性核素等偶聯(lián)或綴合至抗體或其片段的方法在本領(lǐng)域已進(jìn)行了詳盡說(shuō)明。下列實(shí)例進(jìn)一步舉例說(shuō)明了本發(fā)明，但當(dāng)然，不應(yīng)當(dāng)解釋為以任何方式限制其范圍。根據(jù)本發(fā)明的方法包括例如組合治療，其中動(dòng)物也正在經(jīng)歷一個(gè)或多個(gè)選自手術(shù)、化學(xué)療法、放射療法、熱療法(thermotherapy)、免疫療法、激素療法和激光療法的癌癥治療法。術(shù)語(yǔ)“共施用”和“組合治療”是指給受試者施用兩種或更多種治療活性試劑。可將試劑包含在單一藥物組合物中并且同時(shí)施用，或可將試劑包含在分開(kāi)的制劑中，并且相繼地給受試者施用。只要可在受試者中同時(shí)檢測(cè)到兩種試劑，兩種試劑就被認(rèn)為是共施用的。本發(fā)明中涉及的組合治療可包括但不限于抗體施用、疫苗施用、細(xì)胞毒性試劑、天然氨基酸多肽、核酸、 核苷酸類(lèi)似物和生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑的施用?？梢黄鸹蛳嗬^使用兩種或更多種組合的化合物?；瘜W(xué)治療劑的實(shí)例包括烷基化試劑、抗代謝藥、天然產(chǎn)物、激素和拮抗劑以及雜類(lèi)。烷基化試劑的實(shí)例包括氮芥例如氮芥、環(huán)磷酰胺、異環(huán)磷酰胺、美法侖(L-sarcolysin)和苯丁酸氮芥；乙烯亞胺和甲基三聚氰胺例如六甲三聚氰胺和塞替派；烷基磺酸鹽例如白消安；亞硝基脲例如卡莫司汀(BCNU)、司莫司汀(甲基-CCNU)、洛莫司汀(CCNU)和鏈佐星(鏈脲佐菌素)；DNA合成拮抗劑例如磷酸雌莫司?。缓腿豪邕_(dá)卡巴嗪(DTIC、二甲基-三嗪咪唑羧酰胺)和替莫唑胺。抗代謝物的實(shí)例包括葉酸類(lèi)似物例如甲氨蝶呤(amethopterin);喃唳類(lèi)似物例如氟尿喃唳(5-氟尿喃唳、5-FU、5FU)、氟尿苷(氟脫氧尿苷、FUdR)、阿糖胞苷(cytosine arabinoside)和吉西他濱；嘌呤類(lèi)似物例如巰嘌呤(6-niercaptopurine、6_MP)、硫鳥(niǎo)嘌呤(6-硫鳥(niǎo)嘌呤，TG)和噴司他丁(2’-deoxycoformycin、deoxycoformycin)、克拉屈濱和氟達(dá)拉濱；和拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑例如安吖啶。天然產(chǎn)物的實(shí)例包括長(zhǎng)春堿例如長(zhǎng)春堿(VLB)和長(zhǎng)春新堿；紫杉烷例如紫杉醇(Abraxane )和多西他賽(Taxotere );表鬼日毒素例如依托泊苷和替尼泊苷；喜樹(shù)堿例如托泊替康和伊立替康；抗生素類(lèi)例如放線(xiàn)菌素D(actinomycin D)、柔紅霉素(daunomycin、正定霉素)、多柔比星、博來(lái)霉素、絲裂霉素(絲裂霉素C)、伊達(dá)比星、表柔比星；酶例如L-天冬酰胺酶；和生物應(yīng)答調(diào)節(jié)劑例如干擾素-α和白細(xì)胞介素2。激素和拮抗劑的實(shí)例包括促黃體釋放激素激動(dòng)劑例如例如布舍瑞林；腎上腺皮質(zhì)激素例如潑尼松和相關(guān)制劑；孕激素例如己酸羥孕酮、醋酸甲羥孕酮和醋酸甲地孕酮；雌激素例如己烯雌酚和炔雌醇和相關(guān)制劑；雌激素拮抗劑例如他莫昔芬和阿那曲唑；雄激素例如丙酸睪酮和氟甲睪酮和相關(guān)制劑；雄激素拮抗藥例如氟他胺和比卡魯胺；和促性腺素釋放激素類(lèi)似物例如亮丙瑞林。雜類(lèi)的實(shí)例包括沙利度胺；鉬的配合物例如順鉬(czs-DDP)、奧沙利鉬和卡鉬；蒽二酮(例如米托蒽醌)；取代的脲例如羥基脲；丙卡巴肼衍生物例如丙卡巴肼(N-丙卡巴肼、MIH);腎上腺皮質(zhì)抑制劑例如米托坦(鄰、對(duì)’-DDD)和氨魯米特；RXR激動(dòng)劑例如貝沙羅汀(bexarotene);和酪氨酸激酶抑制劑例如伊馬替尼。
本發(fā)明的方法中表征的藥物組合物可以以單次劑量或以多劑量施用。當(dāng)通過(guò)輸注施用抗體時(shí)，輸注可是單次持續(xù)給藥或可以通過(guò)多次輸注遞送?？蓪⒃噭┲苯幼⑸溥M(jìn)入異常靶基因表達(dá)的位置上或附近的組織?？蓪⒃噭┒啻巫⑸溥M(jìn)入所述位置上或附近的組織。
為約lug/kg至100mg/kg的體重/施用的量級(jí)的劑量水平在疾病的治療中是有用的。關(guān)于劑量，抗體可以以小于約75mg/kg的體重或小于約70、60、50、40、30、20、10、5、2、1,0.5,0.1,0.05,0.01,0.005,0.001 或 0.0005mg/kg 的體重和小于 200nmol 的抗體 /kg 的體重或小于 1500、750、300、150、75、15、7.5,1.5,0.75,0.15,0.075,0.015,0.0075,0.0015、0.00075,0.00015nmol的抗體/kg的體重的單位劑量施用?？梢岳缤ㄟ^(guò)注射(例如，靜脈內(nèi)或肌內(nèi)、鞘內(nèi)或直接至器官內(nèi))、吸入或表面施用來(lái)施用單位劑量。
本領(lǐng)域普通技術(shù)人員也可容易地確定用于向給定的受試者施用本發(fā)明的抗體的適當(dāng)?shù)膭┝糠桨?。例如，可在SPARC表達(dá)的部位上或其附近以單次注射或沉積的方式給受試者施用SPARC-結(jié)合抗體組合物一次。可每天一次、每半周一次、每周一次、每二周一次、每半月一次、每月一次、每?jī)稍乱淮位蛟卺t(yī)生的指導(dǎo)下施用本發(fā)明的組合物。在一些實(shí)施方案中，可每天一次或二次給受試者施用組合物，進(jìn)行約3至約28天，更優(yōu)選約7至約10天的時(shí)期。在其他實(shí)施方案中，以低于每天一次，例如低于每2、4、8或30天一次的頻率施用單位劑量。在其他實(shí)施方案中，不定期(例如，無(wú)規(guī)律的頻率)施用單位劑量。
當(dāng)給藥方案包括多個(gè)施用時(shí)，應(yīng)理解給受試者施用的有效量的SPARC-結(jié)合抗體組合物可包括在整個(gè)給藥方案期間施用的抗體的總量。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)理解，確切的單個(gè)劑量可取決于多個(gè)因素而作稍微調(diào)整，包括待施用的具體SPARC結(jié)合抗體組合物、施用時(shí)間、施用途徑、制劑的性質(zhì)、排泄速度、待治療的具體病癥、病癥的嚴(yán)重度、寡核苷酸試劑的藥代動(dòng)力學(xué)以及患者的年齡、性別、體重和一般健康狀況。鑒于不同施用途徑的不同功效，預(yù)期存在必需劑量水平的廣泛變化。
可在單 次劑量或在兩次或更多次劑量中施用有效劑量，如在特定情況下需要或考慮的。如果需要促進(jìn)重復(fù)或經(jīng)常性輸注，遞送設(shè)備例如泵、半永久性支架(例如，靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、腦池內(nèi)或囊內(nèi))或儲(chǔ)池(reservoir)的植入可以是理想的。在成功的治療后，可能需要使患者經(jīng)歷維持治療以預(yù)防疾病狀態(tài)的復(fù)發(fā)?？贵w組合物的濃度是足以有效地治療或預(yù)防病癥或調(diào)節(jié)人的生理?xiàng)l件的量。施用的抗體的濃度或數(shù)量將取決于就施用的試劑和施用方法測(cè)定的參數(shù)。
某些因素可影響有效地治療受試者所需的劑量，包括但不限于疾病或病癥的嚴(yán)重度、先前的治療、受試者的一般身體狀況和/或年齡和其他現(xiàn)有疾病。還應(yīng)理解，用于治療的抗體的有效劑量可在整個(gè)特定治療的過(guò)程中增加或減少。劑量的變化可產(chǎn)生于并且根據(jù)診斷測(cè)定的結(jié)果而變得顯然。例如，可在施用抗體組合物后監(jiān)控受試者?；趤?lái)自監(jiān)控的信息，可施用額外量的抗體組合物。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可容易地確定最佳劑量、給藥方案和重復(fù)率。
實(shí)施例1
本實(shí)施例顯示一系列能夠結(jié)合人SPARC的抗體的制備。
使用小鼠品系RBF/DnJ，利用常規(guī)雜交瘤法在商業(yè)上產(chǎn)生12種小鼠來(lái)源的抗人SPARC抗體。
將pASK84表達(dá)載體(圖1)用于表達(dá)命名為Imml至Imml2的所得抗體的Fab區(qū)域。Fab區(qū)域被靶向外周，在外周中收集它們，隨后在蛋白A瓊脂糖柱上通過(guò)活動(dòng)層析(activity chromatography)進(jìn)行純化。利用Western印跡驗(yàn)證身份，利用ELISA驗(yàn)證SPARC結(jié)合活性。
Imml3和Imml4是使用人噬菌體展示文庫(kù)產(chǎn)生的完全人抗-人SPARC抗體。針對(duì)商業(yè)人 Fab 噬菌體展示文庫(kù)HuFabL (CreativeBiolabs, Shirley, NY)淘選 SPARC。鑒定了兩個(gè)目標(biāo)Fab序列:Fab6 (SEQ ID NO 15) Fab 16 (SEQ ID N016)，如圖2中顯示的。通過(guò)ELISA驗(yàn)證這兩個(gè)Fab分子的SPARC結(jié)合活性。
將這些Fab區(qū)域克隆入pBAD載體(圖3)，將其在細(xì)菌中進(jìn)行表達(dá)和純化。從裂解的細(xì)菌的周質(zhì)級(jí)分分離由PBAD載體表達(dá)的Fab蛋白，序列提供于圖4中。通過(guò)SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳驗(yàn)證從周質(zhì)級(jí)分獲得的Fab區(qū)域的身份。將Fab蛋白在蛋白A瓊脂糖柱上通過(guò)活動(dòng)層析純化至均質(zhì)。
為了產(chǎn)生完全人SPARC結(jié)合抗體，通過(guò)pcDNA3002Neo載體(Invitrogen, Carlsbad, CA)(圖5)克隆和表達(dá)Fab6和Fabl6的基因。純化所得的抗體，通過(guò)凝膠電脈和N-末端分析驗(yàn)證其身份。將從Fab6產(chǎn)生的完全人抗體命名為Imml3,將從Fabl6產(chǎn)生的完全人抗體命名為Imml4。
在按照上述方法產(chǎn)生它們后，通過(guò)利用商業(yè)小鼠同種型分型測(cè)試試劑盒(AbDSerotec, Raleigh, NC)按照同種型表征Imml至Imml4抗體。結(jié)果示于表I中。
表權(quán)利要求
1.一種包含SPARC結(jié)合抗體的組合物，其中所述SPARC結(jié)合抗體包括Imml2、Imml4、hHTI或其組合。
2.權(quán)利要求1的組合物，其中所述SPARC結(jié)合抗體包括hHTI。
3.權(quán)利要求1的組合物，其中所述SPARC結(jié)合抗體包括Imml2。
4.權(quán)利要求1的組合物,其中所述SPARC結(jié)合抗體包括Imml4。
5.權(quán)利要求1至4的任一項(xiàng)的組合物，其還包括綴合至SPARC結(jié)合抗體的活性試劑。
6.權(quán)利要求5的組合物，其中所述活性試劑包括治療劑或診斷劑。
7.權(quán)利要求6的組合物，其中治療劑或診斷劑為選自如下試劑的治療劑:酪氨酸激酶抑制劑、激酶抑制劑、生物活性試劑、生物分子、放射性核素、阿霉素、安莎霉素類(lèi)抗生素、天冬酰胺酶、博來(lái)霉素、白消安、順鉬、卡鉬、卡莫司汀、卡培他濱、苯丁酸氮芥、阿糖胞苷、環(huán)磷酰胺、喜樹(shù)堿、達(dá)卡巴嗪、放線(xiàn)菌素D、柔紅霉素、右雷佐生、多西他賽、多柔比星、依托泊苷、埃博霉素、氟尿苷、氟達(dá)拉濱、氟尿嘧啶、吉西他濱、羥基脲、伊達(dá)比星、異環(huán)磷酰胺、伊立替康、洛莫司汀、氮芥、巰嘌呤、美法侖、甲氨蝶呤、雷帕霉素(西羅莫司)、絲裂霉素、米托坦、米托蒽醌、亞硝基脲、紫杉醇、帕米膦酸鈉、噴司他丁、普卡霉素、丙卡巴肼、利妥昔單抗、鏈佐星、替尼泊苷、硫鳥(niǎo)嘌呤、塞替派、紫杉烷、長(zhǎng)春堿、長(zhǎng)春新堿、長(zhǎng)春瑞濱、泰素、考布他汀、discodermolide、反鉬、抗-血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子化合物(“抗-VEGF”)、抗-表皮生長(zhǎng)因子受體化合物(“抗-EGFR”)、5_氟尿嘧啶及衍生物、放射性核素、多肽毒素、細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑、治療增敏劑、酶或其活性片段，及其組合。
8.權(quán)利要求6的組合物，其中所述治療劑或診斷劑為包含抗體或抗體片段的治療劑。
9.權(quán)利要求8的組合物，其中所述抗體或抗體片段為IgG或IgA或IgD或IgE或IgM的Fe片段。
10.權(quán)利要求8或9的組合物，其中所述抗體或抗體片段介導(dǎo)補(bǔ)體活化、細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性或調(diào)理作用、或肥大細(xì)胞活化或其它免疫應(yīng)答中的一種或多種。
11.權(quán)利要求6的組合物，其中所述治療劑或診斷劑為選自熒光染料、放射性試劑、MRI造影劑、X射線(xiàn)造影劑、超聲造影劑和PET造影劑的診斷劑。
12.權(quán)利要求1-11的任一項(xiàng)的組合物，其中所述組合物包含在脂質(zhì)體中。
13.權(quán)利要求1-11的任一項(xiàng)的組合物，其中所述組合物包含在白蛋白納米顆粒中。
14.權(quán)利要求1-13的 任一項(xiàng)的組合物，其中所述組合物還包含適當(dāng)?shù)乃帉W(xué)載體。
15.權(quán)利要求1-16的任一項(xiàng)的組合物，其中通過(guò)靜脈內(nèi)，通過(guò)表面，通過(guò)注射，通過(guò)吸入，鼻內(nèi)，經(jīng)直腸或口服途徑給患者施用所述組合物。
16.一種用于診斷或治療動(dòng)物的疾病的方法，包括施用診斷或治療有效量的包含SPARC結(jié)合抗體的組合物，其中所述SPARC結(jié)合抗體包括Imml2、Imml4、hHTI或其組合。
17.權(quán)利要求16的方法，其中所述SPARC結(jié)合抗體包括hHTI。
18.權(quán)利要求16的方法，其中所述SPARC結(jié)合抗體包括Imml2。
19.權(quán)利要求16的方法，其中所述SPARC結(jié)合抗體包括Imml4。
20.權(quán)利要求16-19的任一項(xiàng)的方法，其中所述組合物還包含綴合至SPARC結(jié)合抗體的活性試劑。
21.權(quán)利要求20的方法，其中所述活性試劑包含治療劑或診斷劑。
22.權(quán)利要求21的方法，其中所述治療劑或診斷劑為選自下列試劑的治療劑:酪氨酸激酶抑制劑、激酶抑制劑、生物活性試劑、生物分子、放射性核素、阿霉素、安莎霉素類(lèi)抗生素、天冬酰胺酶、博來(lái)霉素、白消安、順鉬、卡鉬、卡莫司汀、卡培他濱、苯丁酸氮芥、阿糖胞苷、環(huán)磷酰胺、喜樹(shù)堿、達(dá)卡巴嗪、放線(xiàn)菌素D、柔紅霉素、右雷佐生、多西他賽、多柔比星、依托泊苷、埃博霉素、氟尿苷、氟達(dá)拉濱、氟尿嘧啶、吉西他濱、羥基脲、伊達(dá)比星、異環(huán)磷酰胺、伊立替康、洛莫司汀、氮芥、巰嘌呤、美法侖、甲氨蝶呤、雷帕霉素(西羅莫司)、絲裂霉素、米托坦、米托蒽醌、亞硝基脲、紫杉醇、帕米膦酸鈉、噴司他丁、普卡霉素、丙卡巴肼、利妥昔單抗、鏈佐星、替尼泊苷、硫鳥(niǎo)嘌呤、塞替派、紫杉烷、長(zhǎng)春堿、長(zhǎng)春新堿、長(zhǎng)春瑞濱、泰素、考布他汀、discodermolide、反鉬、抗-血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子化合物(“抗-VEGF”)、抗-表皮生長(zhǎng)因子受體化合物(“抗-EGFRs”)、5-氟尿嘧啶及衍生物、放射性核素、多肽毒素、細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑、治療增敏劑、和酶或其活性片段。
23.權(quán)利要求21的方法，其中所述治療劑或診斷劑為包含抗體或抗體片段的治療劑。
24.權(quán)利要求23的方法，其中所述抗體或抗體片段為IgG、或IgA、或IgD、或IgE或IgM的Fe片段。
25.權(quán)利要求23或24的方法，其中所述抗體或抗體片段介導(dǎo)補(bǔ)體活化、細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性或調(diào)理作用、或肥大細(xì)胞活化或其它免疫應(yīng)答中的一種或多種。
26.權(quán)利要求21的方法，其中所述治療劑或診斷劑為選自熒光染料、放射性試劑、MRI造影劑、X射線(xiàn)造影劑、超聲造影劑和PET造影劑的診斷劑。
27.權(quán)利要求16-26的任一項(xiàng)的方法，其中所述組合物還包含適當(dāng)?shù)乃帉W(xué)載體。
28.權(quán)利要求16-27的任一項(xiàng)的方法，其中通過(guò)靜脈內(nèi)，通過(guò)表面，通過(guò)注射，通過(guò)吸入，鼻內(nèi)，經(jīng)直腸或口服途徑給患者施用治療有效量的所述組合物。
29.權(quán)利要求16-28的任一項(xiàng)的方法，還包括施用治療有效量的白蛋白結(jié)合的納米顆粒紫杉醇。
30.權(quán)利要求16的方法，其中所述腫瘤選自:口腔腫瘤、咽腫瘤、消化系統(tǒng)腫瘤、呼吸系統(tǒng)腫瘤、骨腫瘤、軟骨腫瘤、骨轉(zhuǎn)移、肉瘤、皮膚腫瘤、黑素瘤、乳腺腫瘤、生殖系統(tǒng)腫瘤、尿道腫瘤、眼眶腫瘤、腦和中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、內(nèi)分泌系統(tǒng)腫瘤、甲狀腺腫瘤、食管腫瘤、胃腫瘤、小腸腫瘤、結(jié)腸腫瘤、直腸腫瘤、肛門(mén)腫瘤、肝腫瘤、膽囊腫瘤、胰腺腫瘤、喉腫瘤、肺腫瘤、支氣管腫瘤、非小細(xì)胞肺癌、小細(xì)胞肺癌、宮頸腫瘤、宮體腫瘤、卵巢腫瘤、外陰腫瘤、陰道腫瘤、前列腺腫瘤、前列腺癌、睪丸腫瘤、陰莖腫瘤、膀胱腫瘤、腎腫瘤、腎盂腫瘤、輸尿管腫瘤、頭頸腫瘤、甲狀旁腺癌、何杰金病、非何杰金淋巴瘤、多發(fā)性骨髓瘤、白血病、急性淋巴細(xì)胞白血病、慢性淋巴細(xì)胞性白血病、急性髓樣白血病、慢性髓樣白血病。
31.權(quán)利要求16-30的任一項(xiàng)的方法，其中所述動(dòng)物為人。
32.—種利用抗癌試劑和SPARC結(jié)合抗體治療動(dòng)物的腫瘤的方法，包括: (a)從所述動(dòng)物分離生物樣品； (b)檢測(cè)所述生物樣品中的SPARC蛋白的表達(dá)；和 (c)定量所述生物樣品中SPARC蛋白的量； 其中如果SPARC蛋白高于閾值水平，則施用治療有效量的抗癌劑和治療有效量的抗SPARC結(jié)合抗體；或 如果SPARC蛋白低于閾值水平，則施用治療有效量的抗癌劑并且不施用SPARC結(jié)合抗體。
33.權(quán)利要求32的方法，其中所述SPARC結(jié)合抗體包括Imml2、Imml4、hHTI或其組合。
34.權(quán)利要求32的方法，其中從體液分離所述生物樣品。
35.權(quán)利要求34的方法，其中所述體液選自腦脊髓液、血液、血漿、血清和尿液。
36.權(quán)利要求32-35的任一項(xiàng)的方法，其中所述動(dòng)物為人。
37.權(quán)利要求32的方法，其中所述腫瘤選自:口腔腫瘤、咽腫瘤、消化系統(tǒng)腫瘤、呼吸系統(tǒng)腫瘤、骨腫瘤、軟骨腫瘤、骨轉(zhuǎn)移、肉瘤、皮膚腫瘤、黑素瘤、乳腺腫瘤、生殖系統(tǒng)腫瘤、尿道腫瘤、眼眶腫瘤、腦和中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、內(nèi)分泌系統(tǒng)腫瘤、甲狀腺腫瘤、食管腫瘤、胃腫瘤、小腸腫瘤、結(jié)腸腫瘤、直腸腫瘤、肛門(mén)腫瘤、肝腫瘤、膽囊腫瘤、胰腺腫瘤、喉腫瘤、肺腫瘤、支氣管腫瘤、非小細(xì)胞肺癌、小細(xì)胞肺癌、宮頸腫瘤、宮體腫瘤、卵巢腫瘤、外陰腫瘤、陰道腫瘤、前列腺腫瘤、前列腺癌、睪丸腫瘤、陰莖腫瘤、膀胱腫瘤、腎腫瘤、腎盂腫瘤、輸尿管腫瘤、頭頸腫瘤、甲狀旁腺癌、何杰金病、非何杰金淋巴瘤、多發(fā)性骨髓瘤、白血病、急性淋巴細(xì)胞白血病、慢性淋巴細(xì)胞性白血病、急性髓樣白血病、慢性髓樣白血病。
38.權(quán)利要求32的方法，其中所述治療劑或抗癌試劑選自多西他賽、紫杉醇、紫杉烷、鉬化合物、抗葉酸、抗代謝藥、抗有絲分裂劑、DNA損傷劑、促細(xì)胞凋亡劑、分化誘導(dǎo)劑、抗血管生成試劑、抗生素、激素、肽、抗體及其組合。
39.權(quán)利要求32的方法，其中治療所述動(dòng)物還包括施用治療有效量的血管生成抑制劑。
40.權(quán)利要求39的方法，其中所述血管生成抑制劑選自貝伐單抗、舒尼替尼、HKP、IFN-α、夫馬潔林、血管他丁、內(nèi)皮他丁、沙立度胺及其組合。
41.權(quán)利要求32的方法，其中所述化學(xué)治療劑包含蛋白質(zhì)結(jié)合的藥物的顆粒。
42.權(quán)利要求40的方法，其中所述蛋白質(zhì)結(jié)合的藥物顆粒的蛋白質(zhì)組分包括白蛋白。
43.權(quán)利要求41的方法，其中所述化學(xué)治療劑包括白蛋白結(jié)合的紫杉醇的顆粒。
44.權(quán)利要求32-43的任一項(xiàng)的方法，其中利用抗體檢測(cè)SPARC蛋白的表達(dá)。
45.權(quán)利要求32-43 的任一項(xiàng)的方法，其中不利用抗體檢測(cè)SPARC蛋白的表達(dá)。
46.權(quán)利要求32-43的任一項(xiàng)的方法，其中利用非抗體SPARC結(jié)合分子來(lái)檢測(cè)SPARC蛋白的表達(dá)。
47.權(quán)利要求32-43的任一項(xiàng)的方法，其中不使用SPARC結(jié)合分子檢測(cè)SPARC蛋白的表達(dá)。
全文摘要
本發(fā)明提供了具有對(duì)于SPARC，特別地血漿SPARC的高親和力的SPARC結(jié)合抗體，以及使用此類(lèi)抗體治療病況包括癌癥的方法。
文檔編號(hào)A61K39/00GK103221062SQ201180034977
公開(kāi)日2013年7月24日 申請(qǐng)日期2011年6月3日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月3日
發(fā)明者V·特里魯, 劉西平, B·德塞 申請(qǐng)人:阿布拉西斯生物科學(xué)有限責(zé)任公司