本發(fā)明涉及改善的與ccr6結(jié)合的抗體或其片段。更具體地，本發(fā)明涉及與ccr6結(jié)合的抗體或其片段，所述抗體或其片段包含了含有seqidno:31的氨基酸序列的重鏈cdr1；和/或含有seqidno:32、seqidno:190、seqidno:239、seqidno:240、seqidno:241、seqidno:242、seqidno:254或seqidno:255的氨基酸序列的重鏈cdr2和/或含有seqidno:33的氨基酸序列的重鏈cdr3；和/或包含了含有seqidno:34、seqidno:191、seqidno:244、seqidno:245、seqidno:246或seqidno:256的氨基酸序列的輕鏈cdr1，和/或含有seqidno:35、seqidno:247、seqidno:248或seqidno:257的氨基酸序列的輕鏈cdr2和/或含有seqidno:36或seqidno:192或seqidno:193的氨基酸序列的輕鏈cdr3。本發(fā)明還涉及包含所述抗ccr6抗體的藥物和相關(guān)物質(zhì)及其治療疾病的用途。

背景技術(shù)：

趨化因子是對免疫系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)和活化必需的趨化性促炎細胞因子家族。它們指導(dǎo)免疫細胞移行入炎癥部位和感染部位。趨化因子與屬于g蛋白偶聯(lián)受體(gpcr)的7次跨膜結(jié)構(gòu)域家族的特定細胞表面受體結(jié)合。

ccr6是屬于gpcr超家族a類的趨化因子受體并且它表達在人樹狀細胞、記憶t細胞和b細胞上(zaballos等人,(1996)biochem&biophysrescom,227:846-853；greaves等人,(1997)jexpmed,186:837-844；power等人,(1997)jexpmed186:825-835；liao等人,(1999)jimmunol162:186-94)。ccr6的唯一已知配體是趨化因子ccl20，也稱作mip-3α、larc或exodus(rossi等人,(1997)jimmunol158:1033-1036)。ccr6受體首先作為孤兒受體克隆自人類基因組dna(zaballos等人，上文)。rna印跡分析已經(jīng)揭示在多種人組織中ccr6主要在脾、淋巴結(jié)、胸腺、闌尾和pbmc表達(baba等人,(1997)jbiolchem,272:14893-14898)。在各種白細胞亞群當中，ccr6mrna已經(jīng)在淋巴細胞(cd4⁺t細胞和cd8⁺t細胞及b細胞)中檢出，但是未在天然殺傷細胞、單核細胞或粒細胞中檢出(baba等人，上文)。匹配ccl20/ccr6的趨化因子配體/受體是有意義的，因為這些分子顯示體內(nèi)穩(wěn)態(tài)功能和活化功能的特征并且這些雙重特征提示了ccr6在免疫應(yīng)答的引發(fā)階段和效應(yīng)階段的作用。

由于ccr6表達在th17細胞上(romagnanis等人,(2009)molimmunol47:3-7)，ccr6參與多種自身免疫性疾病和炎性疾病，例如，特應(yīng)性皮炎、接觸性皮炎、蕈樣霉菌病、銀屑病、慢性肝炎、牙周病、hpv、ibd、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、過敏性哮喘、copd、遲發(fā)型超敏反應(yīng)、b細胞惡性腫瘤、乳腺腺癌、肝細胞癌、胰腺腺癌、甲狀腺乳頭狀癌和膠質(zhì)母細胞瘤。

研究人員已經(jīng)使用多種方法例如使用噬菌體展示法生成了針對ccr6的抗體wo2013184218(msmproteintechnologies)。也已經(jīng)使用常規(guī)免疫方法生成抗ccr6抗體wo2001017558a3(scheringcorporation)。這類現(xiàn)有抗體均不具有適合作為治療性抗體必需的特性。即，雖然一些或全部的這些抗體對人ccr6具有結(jié)合親和力，但是它們不具有調(diào)節(jié)人ccr6受體活性的能力(例如防止ccr6依賴性細胞移行的能力)或尚未展示出具有這種能力。這類現(xiàn)有抗體也尚未顯示適合用作診斷性抗體，因為它們沒有ccr6特異性。

因此本領(lǐng)域仍需要可以在治療及診斷多種免疫和炎性疾病和病癥中使用的組合物。

發(fā)明概述

本公開總體上涉及與ccr6結(jié)合的抗體或其片段、其制備及使用方法，包括用于治療ccr6介導(dǎo)的疾病的方法。與ccr6結(jié)合的本發(fā)明抗體或其片段顯示出多種合乎需要的特性并且可以用于治療多種疾病，包括但不限于炎性疾病和/或自身免疫性疾病。

在一個方面，本公開提供一種與ccr6結(jié)合的抗體或其片段，所述抗體或其片段包含了含有seqidno:31的氨基酸序列的重鏈cdr1；和/或含有seqidno:32、seqidno:190、seqidno:239、seqidno:240、seqidno:241或seqidno:242的氨基酸序列的重鏈cdr2和/或含有seqidno:33的氨基酸序列的重鏈cdr3；和/或包含了含有seqidno:34、seqidno:191、seqidno:244、seqidno:245或seqidno:246的氨基酸序列的輕鏈cdr1，和/或含有seqidno:35、seqidno:247、seqidno:248或seqidno:257的氨基酸序列的輕鏈cdr2，和/或含有seqidno:36或seqidno:192或seqidno:193的氨基酸序列的輕鏈cdr3。

根據(jù)本公開的另一個方面，提供一種與ccr6結(jié)合的抗體或其片段，所述抗體或其片段包含了含有seqidno:31的氨基酸序列的重鏈cdr1；和/或含有seqidno:241的氨基酸序列的重鏈cdr2和/或含有seqidno:33的氨基酸序列的重鏈cdr3；和/或包含了含有seqidno:245的氨基酸序列的輕鏈cdr1，和/或含有seqidno:191的氨基酸序列的輕鏈cdr2，和/或含有seqidno:192的氨基酸序列的輕鏈cdr3。

在又一個方面，本發(fā)明提供一種與ccr6結(jié)合的抗體或其片段，所述抗體或其片段包含了含有seqidno:7、37、39、40、41、42、75、177、178、179、249的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)序列。

優(yōu)選地，與ccr6結(jié)合的抗體或其片段包含了含有seqidno:7、37、75、177、178和179和最優(yōu)選地seqidno:7、37或249的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)序列。

在又一個方面，本發(fā)明提供一種與ccr6結(jié)合的抗體或其片段，所述抗體或其片段包含作為選自以下的人基因的產(chǎn)物或衍生自所述人基因的重鏈可變構(gòu)架區(qū)：ighv3-11*04(seqidno:77)、ighv3-11*01(seqidno:78)、ighv3-48*03(seqidno:79)、ighv3-23*04(seqidno:80)和ighv3-66*04(seqidno:81)。最優(yōu)選地，人基因是ighv3-23*04(seqidno:80)并且其中與相應(yīng)的鼠或中間抗體序列的重鏈可變區(qū)的相應(yīng)構(gòu)架區(qū)相比，重鏈可變構(gòu)架區(qū)包含至少一個氨基酸修飾。

根據(jù)本發(fā)明，中間抗體意指起始抗體的任何形式，其至少一個殘基異于原始抗體并且特別指根據(jù)本發(fā)明通過人化或改善鼠抗體所生成的一種或多種抗體。

在又一個方面，本發(fā)明提供一種包含輕鏈可變序列的抗體或其片段，所述輕鏈可變序列包含seqidno:8、38、43、44、45、46、181、182、250、251、252或253的氨基酸序列。

優(yōu)選地，與ccr6結(jié)合的抗體或其片段包含了含有seqidno:8、38、181、182、250、251、252或253和最優(yōu)選地seqidno:8、38、251或253的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)序列。

在又一個方面，本發(fā)明提供一種與ccr6結(jié)合的抗體或其片段，所述抗體或其片段包含作為選自以下的人基因的產(chǎn)物或衍生自所述人基因的輕鏈可變構(gòu)架區(qū)：種系fw區(qū)igkv2-30*02(seqidno:82)、igkv2-30*01(seqidno:83)igkv2d-30*01(seqidno:84)、igkv2-29*02(seqidno:85)和igkv2-29*03(seqidno:86)。

在又一個方面，本發(fā)明提供一種抗體或其片段，所述抗體或其片段包含作為人基因igkv2-30*02(seqidno:82)的產(chǎn)物或衍生自所述人基因的輕鏈可變構(gòu)架區(qū)并且其中輕鏈可變構(gòu)架區(qū)包含來自相應(yīng)鼠抗體的或中間抗體序列的輕鏈可變區(qū)的相應(yīng)構(gòu)架區(qū)中的至少一個氨基酸修飾。

在又一個方面，本發(fā)明提供一種與ccr6結(jié)合的抗體或其片段，所述抗體或其片段包含選自seqidno:10、19、20、21、22、23、24、173、175、183、184、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、221、224、227、230、233和235的重鏈序列。在又一個方面，本發(fā)明提供一種與ccr6結(jié)合的抗體或其片段，所述抗體或其片段包含選自seqidno:25、26、27、28、29、30、176、186、187、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、222、225、228、231和236的輕鏈序列。

在又一個方面，本發(fā)明提供一種與ccr6結(jié)合的抗體或其片段，所述抗體或其片段包含了：

(a)含有seqidno:19、24、214或216的氨基酸序列的重鏈序列；和

(b)含有seqidno:25、30、215或217的氨基酸序列的輕鏈序列。

在又一個方面，本發(fā)明提供一種與ccr6結(jié)合的抗體或其片段，其中抗體包含人igg4fc區(qū)，其中抗體沒有fc介導(dǎo)的細胞毒活性。在又一個方面，本發(fā)明提供一種與ccr6結(jié)合的抗體或其片段，其中抗體包含人ighg1fc區(qū)，其中抗體有能力執(zhí)行細胞毒性機制如抗體依賴性細胞毒作用(adcc)。在一個優(yōu)選的方面，與ccr6結(jié)合的抗體或其片段具有非巖藻糖基化的ighg1fc區(qū)并且顯示增強的fc介導(dǎo)的細胞毒性機制如adcc。

在另一個方面，本發(fā)明提供與人ccr6結(jié)合并且還與食蟹猴ccr6結(jié)合的交叉反應(yīng)性抗體或其片段?！敖徊娣磻?yīng)性抗體”意指與來自一個物種(例如，人)的抗原結(jié)合并且還與不同物種(例如，獼猴(macacamulata)和食蟹猴(macaccafascicularis))中相應(yīng)抗原結(jié)合的抗體。

在另一個方面，本發(fā)明的公開內(nèi)容還描述了人源化抗體或其片段，所述人源化抗體或其片段以類似于相應(yīng)嵌合抗體的親和力與ccr6結(jié)合，例如，保留相應(yīng)嵌合抗體的至少85％的ccr6結(jié)合親和力(kd)或與相應(yīng)嵌合抗體相比時具有至少等同或更高的ccr6結(jié)合親和力(kd)。

在另一個方面，本發(fā)明還涉及抗ccr6抗體或其片段，所述抗ccr6抗體或其片段可以抑制ccl20介導(dǎo)的表達ccr6的細胞群體移行。發(fā)明人已經(jīng)令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的抗體具有意料之外的特性，即抑制ccl20介導(dǎo)的表達ccr6的細胞趨化和在一些情況下完全消除這種趨化。

在另一個方面，本發(fā)明還涉及在體內(nèi)影響ccl20與ccr6結(jié)合的抗ccr6抗體或其片段。發(fā)明人已經(jīng)令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的抗體在ccr6與其配體ccl20的結(jié)合中相互作用，從而減少配體受體結(jié)合作用和在一些情況下完全阻止這種結(jié)合作用。

在另一個方面，本發(fā)明還涉及在體內(nèi)充當ccr6拮抗劑的抗ccr6抗體或其片段。

在另一個方面，本發(fā)明還涉及顯示熱穩(wěn)定性增強的抗ccr6抗體或其片段。

本發(fā)明的公開內(nèi)容還提供了編碼與ccr6結(jié)合的抗體及其片段的分離核酸、包含該核酸的載體和包含該核酸或載體的宿主細胞。還提供了包含抗ccr6抗體或其片段和可藥用載體的組合物和包含與治療劑連接的抗體或其片段的免疫綴合物。

本公開還提供用于治療ccr6介導(dǎo)的疾病的方法。在一個方面，在ccl20誘導(dǎo)細胞移行的體外模型中，響應(yīng)于ccl20，抗ccr6抗體或其片段有效抑制表達ccr6的細胞移行。

本公開還提供了包含抗ccr6抗體或其片段和載體如稀釋劑或賦形劑的藥物組合物。

本公開還提供試劑盒和制造品，其包含用于治療ccr6介導(dǎo)的疾病的抗體或其片段、組合物或免疫綴合物。

附圖簡述

圖1：候選雜交瘤的流式細胞分析。柱狀圖顯示熒光強度的幾何平均值(y-軸)和克隆id(x-軸)。在人ccr6轉(zhuǎn)染的baf細胞(圖1a)或表達無關(guān)蛋白質(zhì)的baf(圖1b)上評價候選雜交瘤的結(jié)合作用。

圖2：ccr6生物測定法中測試嵌合4h11的阻斷作用。

(a)在discoverx生物測定法中測試嵌合4h11的阻斷潛力。

本圖顯示來自使用嵌合4h11的功能性discoverxccr6生物測定法的結(jié)果。在這個測定法中，在含有pathhunter組分的細胞上在按照五個不同濃度(20、6.7、2、0.7和0.2μg/ml)所用的嵌合4h11存在下測量ccl20誘導(dǎo)的化學(xué)發(fā)光活性。在使用嵌合igg1同種型對照作為100％發(fā)光活性的條件下，考慮化學(xué)發(fā)光信號計算相對發(fā)光單位百分數(shù)(rlu)。

(b)在ccl20誘導(dǎo)的趨化性測定法中測試嵌合4h11的阻斷潛力。

本圖顯示來自使用嵌合4h11的功能性ccr6依賴性移行測定法的結(jié)果。使用6.5mmtranswell平板的移行測定法，其中在按照三個不同濃度(10、2和0.4μg/ml)使用的嵌合4h11存在下，評價全長人ccr6轉(zhuǎn)染的baf細胞響應(yīng)于重組人ccl20的移行。作為陽性對照，按照10μg/ml使用一種商業(yè)抗ccl20抗體。通過使用流式細胞儀計數(shù)transwell的上室和下室中的細胞，評價移行過程。

圖3：嵌合4h11抗體的流式細胞分析。

(a)活化的人外周血單個核細胞(pbmc)上的染色。

柱狀圖顯示與(x-軸中)每種受檢抗體相對應(yīng)的熒光強度的幾何平均值(y-軸上的幾何平均數(shù))。用抗人igg-pe檢測嵌合4h11與人ccr6的結(jié)合。為了檢測商業(yè)抗體與人ccr6的結(jié)合，使用抗小鼠-pe第二抗體。

(b)食蟹猴外周血單個核細胞(pbmc)上的染色。

通過流式細胞術(shù)評價嵌合4h11抗體與食蟹猴ccr6的結(jié)合。外周血單個核細胞(pbmc)從采集自食蟹猴的全血分離并且將2x10⁵個細胞與10μg/ml對照抗體或嵌合4h11抗體溫育。用抗人igg-pe檢測4h11與食蟹猴ccr6的結(jié)合。為了檢測商業(yè)抗體與食蟹猴ccr6的結(jié)合，使用抗小鼠-pe第二抗體。

圖4：使用人/小鼠ccr6雜合轉(zhuǎn)染子評價嵌合4h11抗體的結(jié)合區(qū)。

通過流式細胞術(shù)評價嵌合4h11抗體與人/小鼠ccr6雜合構(gòu)建體的結(jié)合。計數(shù)人/小鼠ccr6轉(zhuǎn)染子并將2x10⁵個細胞與10μg/ml嵌合4h11抗體溫育。用抗人igg-pe檢測4h11的結(jié)合活性。為了評價人/小鼠嵌合體在細胞上的良好表達，使用針對人ccr6和小鼠ccr6的兩種商業(yè)抗體。柱狀圖顯示通過流式細胞術(shù)測量的熒光強度的幾何平均值(y-軸)。

圖5：評價嵌合4h11抗體在ccr6n端區(qū)域內(nèi)部的表位

通過流式細胞術(shù)評價嵌合4h11抗體與ccr6n端區(qū)域的人/小鼠雜合分子的結(jié)合，如圖4中所述。

圖6：通過細胞-elisa測試人源化抗人ccr6候選物。

使用人ccr6轉(zhuǎn)染的cho細胞評價人源化4h11候選物的結(jié)合作用。在這個實驗中，96孔板用100μl在pbs中按1μg/ml稀釋的poly-d預(yù)包被。次日，將細胞洗滌，以1x10⁶個細胞/孔鋪種并且與各種濃度的(范圍從10至0.0137μg/ml)人源化4h11候選物溫育并在4％pfa中固定。使用辣根過氧化物酶(hrp)標記的山羊抗人igfc片段特異性hrp作為第二抗體。tmb底物用來揭示抗體結(jié)合活性并通過添加h2so4終止反應(yīng)，并且在450nm讀取光密度(od450nm)。

圖7：在功能性abhunterccr6生物測定法中測試人源化4h11抗人ccr6候選物。將含有pathhunter組分的細胞與各種濃度(10、3、1和0.3μg/ml)的具有兩種不同人igg主鏈的人源化4h11候選物溫育。在用ccl20活化細胞并添加pathhunter檢測試劑后測量化學(xué)發(fā)光活性。通過計算最大相對發(fā)光單位(rlu)百分數(shù)評價人源化4h11候選物的中和活性，其中rlumax是最大刺激時的光發(fā)射。

圖8：在固定化重組人n端ccr6fc上的直接結(jié)合elisa。通過直接elisa測量人源化4h11h5l1抗體在ccr6人n端片段上的結(jié)合作用。將各種濃度(范圍從10至0.00006μg/ml)的具有igg1主鏈和igg4hs主鏈的人源化4h11h5l1與96孔板中在4℃包被過夜的2μg/ml重組人n端ccr6-fc標簽的蛋白質(zhì)(圖8a)或重組食蟹猴n端肽fc(圖8b)溫育。通過辣根過氧化物酶(hrp)綴合的抗人(fab)’2-特異性抗體檢測人源化4h11h5l1抗體與n端ccr6-fc蛋白的結(jié)合。

圖9：4h11vh5/vl1igg4hs抗體的表面等離子體共振測量。本圖顯示使用人源化4h11(vh5/vl1)fab抗體作為分析物時，在人(圖9a)和食蟹猴(圖9b)ccr6n端肽fc融合物上測量的動力學(xué)結(jié)合親和力常數(shù)(kd)。數(shù)據(jù)表示為響應(yīng)數(shù)(縮寫ru；y軸)與時間(x軸)。

圖10:使用人-小鼠雜合ccr6轉(zhuǎn)染子在移行測定法中測試4h11vh5/vl1igg4hs抗體。本圖顯示了來自使用6.5mmtranswell平板的移行測定法的結(jié)果，其中在以10μg/ml使用的4h11vh5/vl1igg4hs存在下，評價人-小鼠嵌合體ccr6轉(zhuǎn)染的baf細胞響應(yīng)于重組人ccl20(圖形的左側(cè)部分)或小鼠ccl20(圖形的右側(cè)部分)的移行。作為對照抗體，商業(yè)抗小鼠ccl20抗體以10μg/ml使用。通過使用流式細胞儀計數(shù)transwell的上室和下室中的細胞，評價移行過程。

圖11：使用ccr6轉(zhuǎn)染的細胞，通過流式細胞術(shù)測試4h11vh5/vl1igg4hs抗體的中和潛力。

將ccr6轉(zhuǎn)染的細胞在4℃與含有0.1％疊氮化物的facs緩沖液中系列稀釋(從100至0.00001μg/ml)的人源化4h11-vh5/vl1溫育20分鐘。將細胞離心并且在4℃與0.5μg/ml重組人ccl20溫育20分鐘。為了檢測與ccr6結(jié)合的ccl20，將細胞與生物素?；纳窖蚩谷薱cl20溫育，隨后與按1/100在含有0.1％疊氮化物的facs緩沖液中稀釋的別藻藍蛋白(apc)標記的鏈霉親和素溫育。為了評價人源化4h11vh5/vl1igg4hs的阻斷潛力，在每種抗體濃度測量ccl20百分數(shù)。將ccl20與ccr6的最大結(jié)合活性計算為對同種型對照所觀察到的結(jié)合活性的百分數(shù)。

圖12：使用人ccr6轉(zhuǎn)染的細胞，通過流式細胞術(shù)測試單價樣式和雙價樣式的4h11vh5/vl1抗體。

通過流式細胞術(shù)評價單價和雙價4h11vh5/vl1抗體與人ccr6轉(zhuǎn)染的baf細胞的結(jié)合活性。計數(shù)表達人ccr6的baf細胞并且將2x10⁵個細胞與多種濃度(范圍從3至0.01μg/ml)的單價或雙價4h11vh5/vl1抗體溫育。使用抗人igg-pe檢測兩種抗體的結(jié)合活性。作為對照，無關(guān)的人igg抗體以3μg/ml使用。柱狀圖顯示通過流式細胞術(shù)測量的熒光強度的幾何平均值(y-軸)。

圖13：使用人ccr6轉(zhuǎn)染的細胞，在移行測定法中測試單價樣式和雙價樣式的4h11vh5/vl1抗體。

在使用6.5mmtranswell平板的移行測定法中評價雙價和單價4h11vh5/vl1抗體的阻斷潛力。在這個測定法中，計數(shù)人ccr6轉(zhuǎn)染的baf細胞并且在多種濃度(范圍從50至0.4μg/ml)的單價或雙價4h11vh5/vl1抗體存在下，將1x10⁵個細胞與重組人ccl20溫育。作為對照抗體，無關(guān)的人igg抗體以50μg/ml使用。通過使用流式細胞儀計數(shù)transwell的上室和下室中的細胞，評價移行過程。

圖14：來自噬菌體展示文庫的vh5/vl1scfv變體的解離速率分析。

圖14a：從cdr-h2文庫分離的scfv片段。圖14b：從cdr-l3文庫分離的scfv片段。

圖15：位置cdr-l128和29處vh5/vl1fab變體的表面等離子體共振測量。

本圖顯示使用fab變體作為分析物時，對人ccr6n端肽fc融合物測量的spr數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)表示為響應(yīng)數(shù)(縮寫ru；y軸)與時間(x軸)。

圖16：使用差示掃描量熱法的vh5/vl1l1-g29afab熱穩(wěn)定性測量。

數(shù)據(jù)表示為過量摩爾熱容(縮寫為cp[kcal/mol/℃]；y軸)與溫度(℃；x軸)。

圖17：用于親和力和功能性測試的工程化vh5/vl1fab片段和抗體樣式的序列詳情。

圖18：通過spr對工程化vh5/vl1fab測量的結(jié)合常數(shù)。

圖18a：人和食蟹猴ccr6融合蛋白的結(jié)合常數(shù)總結(jié)。圖18b：四種不同的工程化vh5/vl1fab片段之間的解離速率比較。

圖19.在ccl20誘導(dǎo)的趨化測定法中測試親和力成熟的雙價和單價4h11-vh5/vl1候選物的阻斷潛力。

本圖顯示了來自移行測定法的結(jié)果，所述移行測定法使用以四個不同濃度(20、6.67、2.2和0.75μg/ml)測試的各種親和力成熟的vh5/vl1變體。在這個測定法中，在雙價igg或單價fab親和力成熟的vh5/vl1候選物存在下，評價全長人ccr6轉(zhuǎn)染的baf細胞響應(yīng)于添加至下室的ccl20穿過hts-96可透過性支持物的移行過程。作為對照，非親和力成熟的4h11vh5/vl1igg1mab以20μg/ml使用。在測定法中人igg1同種型對照以20μg/ml使用。

通過使用流式細胞儀計數(shù)transwell的上室和下室中的細胞，評價移行過程。

發(fā)明詳述

本公開涉及與ccr6結(jié)合的適合用作治療劑或用作診斷試劑組成部分的新抗體及其片段。

如本文所用的術(shù)語“ccr6”包括ccr6的變體、同工型和物種同源物。因此，本公開的抗體可以與人ccr6結(jié)合并且可以與來自人之外物種(例如小鼠、大鼠或食蟹猴)的ccr6交叉反應(yīng)。在某些實施方案中，抗體可以完全對一種或多種人ccr6蛋白特異并且可以不顯示出物種型或其他類型的非人類交叉反應(yīng)性。一種示例性人ccr6的完整氨基酸序列具有swiss-prot登錄號p51684(ccr6_human；seqidno:71)。ccr6又稱作c-cckr-6、cc-ckr-6、ccr-6、larc受體、gpr-cy4、gprcy4、趨化因子受體樣3、ckr-l3、dry6或gpcr29。ccr6最近還命名為cd196(分化抗原簇196)。人ccr6由entrezgene命名為geneid:1235并且由hgnc命名為hgnc:1607。ccr6可以由命名為ccr6基因的基因編碼。一種示例性鼠ccr6的完整氨基酸序列具有swiss-prot登錄號o54689(ccr6_mouse；seqidno:72)。鼠ccr6由entrezgene命名為geneid:12458。一種示例性大鼠ccr6的完整氨基酸序列具有swiss-prot登錄號q5bk58(q5bk58_rat；seqidno:73)。大鼠ccr6由entrezgene命名為geneid:308163。一種示例性恒河猴ccr6(獼猴)的完整氨基酸序列具有swiss-prot登錄號q8hzr7(q8hzr7_macmu；seqidno:74)。恒河猴ccr6由entrezgene命名為geneid:574335。swiss-prot數(shù)據(jù)庫在http://swissmodel.expasy.org,arnoldk等人,(2006)bioinformatics,22(2):195-201可獲得。

本文中使用“ccr6”時涵蓋ccr6、優(yōu)選地人ccr6的全部已知或尚未發(fā)現(xiàn)的等位基因和多態(tài)性形式。術(shù)語“人ccr6”或“ccr6”在本文中等同地使用并且如果不另外特別指出，則意指“人ccr6”。

術(shù)語“ccr6配體”或“ccl20”本文中等同使用并且特別地包括人ccr6的配體。ccl20是屬于cc趨化因子家族的小細胞因子并且又稱作mip-3α、larc或exodus。ccl20具有swiss-prot登錄號p78556(ccl20_human；seqidno:76)并由entrezgene命名為geneid:6364。ccl20在幾種組織中表達，其中在外周血淋巴細胞、淋巴結(jié)、肝、闌尾和胎兒肺中觀察到最高表達并且在胸腺、睪丸、前列腺和消化道中觀察到較低水平。

如本文所用的術(shù)語“與ccr6結(jié)合的抗體或其片段”包括以(kd)850pm或更小、優(yōu)選地700nm或更小、更優(yōu)選地300nm或更小、更優(yōu)選地260nm或更小、甚至更優(yōu)選地250nm或更小的親和力與ccr6(例如，分離形式的人ccr6)結(jié)合的抗體或其片段。

術(shù)語“與ccr6結(jié)合的抗體或其片段”包括抗體或其抗原性結(jié)合片段。術(shù)語“拮抗性抗體”或“拮抗抗體”在本文中同等使用并且包括能夠例如通過阻斷ccr6與其配體的結(jié)合或?qū)嵸|(zhì)地減少這種結(jié)合并且因此抑制或減少ccr6觸發(fā)的信號作用途徑和/或抑制或減少ccr6介導(dǎo)的細胞反應(yīng)如b譜系成熟、抗原驅(qū)動的b細胞分化和/或?qū)ρ仔苑磻?yīng)和免疫應(yīng)答期間樹狀細胞和t細胞移行和招募的調(diào)節(jié)，抑制和/或抵消ccr6的生物學(xué)信號傳導(dǎo)活性的抗體。

如本文提到的術(shù)語“抗體”包括完整抗體和其任何抗原結(jié)合片段或單鏈。“抗體”指包含由二硫鍵鏈間連接的至少兩條重鏈(h)和兩條輕鏈(l)的糖蛋白或其抗原結(jié)合片段。每條重鏈包含重鏈可變區(qū)(本文中縮寫為vh)和重鏈恒定區(qū)。重鏈恒定區(qū)包含三個結(jié)構(gòu)域ch1、ch2和ch3。每條輕鏈包含輕鏈可變區(qū)(本文中縮寫為vl)和輕鏈恒定區(qū)。輕鏈恒定結(jié)域包含一個結(jié)構(gòu)域cl。vh區(qū)和vl區(qū)可以再劃分為超變區(qū)域，稱作“互補決定區(qū)”(cdr)，所述超變區(qū)域在序列上高變和/或參與抗原識別和/或通常形成在結(jié)構(gòu)上確定的環(huán)，間插有更保守的區(qū)域，稱作“構(gòu)架區(qū)”(fr或fw)。每個vh和vl包含三個cdr和四個fw，從氨基端到羧基端以如下順序排列：fw1、cdr1、fw2、cdr2、fw3、cdr3、fw4。fw1、fw2、fw3和fw4的氨基酸序列共同構(gòu)成如本文提到的vh或vl的“非cdr區(qū)”或“非延長的cdr區(qū)”。

如本文中提到的術(shù)語“重鏈可變構(gòu)架區(qū)”可以包含一個或多個(例如，一個、二個、三個和/或四個)重鏈構(gòu)架區(qū)序列(例如，構(gòu)架1(fw1)、構(gòu)架2(fw2)、構(gòu)架3(fw3)和/或構(gòu)架4(fw4))。優(yōu)選地，重鏈可變區(qū)構(gòu)架包含fw1、fw2和/或fw3、更優(yōu)選地fw1、fw2和fw3。如本文中提到的術(shù)語“輕鏈可變構(gòu)架區(qū)”可以包含一個或多個(例如，一個、二個、三個和/或四個)輕鏈構(gòu)架區(qū)序列(例如，構(gòu)架1(fw1)、構(gòu)架2(fw2)、構(gòu)架3(fw3)和/或構(gòu)架4(fw4))。優(yōu)選地，輕鏈可變區(qū)構(gòu)架包含fw1、fw2和/或fw3、更優(yōu)選地fw1、fw2和fw3。

重鏈和輕鏈的可變區(qū)含有與抗原相互作用的結(jié)合結(jié)構(gòu)域?？贵w的恒定區(qū)可以介導(dǎo)免疫球蛋白與宿主組織或因子(包括免疫系統(tǒng)的各種細胞(例如，效應(yīng)細胞)和經(jīng)典補體系統(tǒng)的第一組分(c1q))結(jié)合。

抗體劃分成類，也稱作同種型，這在遺傳上由恒定區(qū)決定。人恒定輕鏈分為κ輕鏈(ck)和λ輕鏈(cλ)。重鏈劃分為μ(μ)、δ(δ)、γ(γ)、α(α)或ε(ε)，并且將抗體的同種型分別定義為igm、igd、igg、iga和ige。因此，如本文所用的“同種型”意指免疫球蛋白的由其恒定區(qū)的化學(xué)特征和抗原性特征確定的任何類和/或亞類。已知的人免疫球蛋白同種型是igg1(ighg1)、igg2(ighg2)、igg3(ighg3)、igg4(ighg4)、iga1(igha1)、iga2(igha2)、igm(ighm)、igd(ighd)和ige(ighe)。所謂的人免疫球蛋白假γighgp基因表示一種額外的人免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)基因，所述基因已經(jīng)測序，但因開關(guān)區(qū)改變而不編碼蛋白質(zhì)(bensmanam等人,(1988)nucleicacidsres.16(7):3108)。盡管具有改變的開關(guān)區(qū)域，人免疫球蛋白假γighgp基因具有用于全部重鏈恒定結(jié)構(gòu)域(ch1-ch3)和鉸鏈區(qū)的可讀框。其重鏈恒定結(jié)構(gòu)域的全部可讀框均編碼與全部人免疫球蛋白恒定結(jié)構(gòu)域良好相符的具有預(yù)測結(jié)構(gòu)特征的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域。這種額外的假γ同種型在本文中稱作iggp或ighgp。已經(jīng)報道了其他的假免疫球蛋白基因，如人免疫球蛋白重鏈恒定結(jié)構(gòu)域εp1假基因和p2假基因(ighep1和ighep2)。igg類最常出于治療目的使用。在人類中，這個類別包括亞類igg1、igg2、igg3和igg4。在小鼠中，這個類別包括亞類igg1、igg2a、igg2b、igg2c和igg3。

如本文所用的術(shù)語“鼠抗體”包括其中可變區(qū)序列和恒定區(qū)序列衍生自小鼠的抗體。

如本文所用的術(shù)語“嵌合抗體”包括其中可變區(qū)序列源自一個物種并且恒定區(qū)序列源自另一個物種的抗體，如其中可變區(qū)序列源自小鼠抗體并且恒定區(qū)序列源自人抗體的抗體。

如本文所用的術(shù)語“人源化抗體”或“人源化抗ccr6抗體”包括其中從另一個哺乳動物物種(如小鼠)的種系所衍生的cdr序列已經(jīng)移植到人構(gòu)架序列上的抗體?？梢栽谌祟悩?gòu)架序列內(nèi)部以及從另一個哺乳動物物種的種系衍生的cdr序列內(nèi)部產(chǎn)生額外的構(gòu)架區(qū)修飾。

如本文所用的術(shù)語“fab”或“fab區(qū)域”包括這樣的多肽，所述多肽包含vh、ch1、vl和cl免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域。fab可以指處于分離狀態(tài)的這種區(qū)域，或在全長抗體或抗體片段背景下的這個區(qū)域。

如本文所用，術(shù)語“fc”或“fc區(qū)”包括這樣的多肽，所述多肽包含抗體的恒定區(qū)，不包括第一恒定區(qū)免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域。因此，fc指iga、igd和igg的最后兩個恒定區(qū)免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域和ige和igm的最后三個恒定區(qū)免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域以及這些結(jié)構(gòu)域n端的柔性鉸鏈區(qū)。對于iga和igm，fc可以包括j鏈。對于igg，fc包含免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域cγ2和cγ3(cγ2和cγ3)和cγl(cγl)和cγ2(cγ2)之間的鉸鏈區(qū)。盡管fc區(qū)的邊界可以變動，但通常確定人igg重鏈fc區(qū)包含殘基c226或p230至其羧基端，其中編號根據(jù)eu編號體系進行。對于人igg1，fc區(qū)在本文中定義為包含殘基p232至其羧基端，其中編號根據(jù)eu編號體系進行(edelmangm等人,(1969)procnatlacadsciusa,63(1):78-85)。fc可以指處于分離狀態(tài)的這種區(qū)域，或在fc多肽(例如抗體)背景下的這個區(qū)域。

本文中的術(shù)語“鉸鏈”或“鉸鏈區(qū)”或“抗體鉸鏈區(qū)”包括這樣的柔性多肽，所述柔性多肽包含抗體的第一和第二恒定結(jié)構(gòu)域之間的氨基酸。如本文提到的“鉸鏈區(qū)”是僅存在于iga、igd和igg中的長度6-62個氨基酸的序列區(qū)域，所述序列區(qū)域涵蓋橋接兩條重鏈的半胱氨酸殘基。在結(jié)構(gòu)上，iggch1結(jié)構(gòu)域止于eu位置220，并且iggch2結(jié)構(gòu)域始于殘基eu位置237。因此對于igg，抗體鉸鏈區(qū)在本文中定義為包括位置221(igg1中的d221)至231(igg1中的a231)，其中根據(jù)eu編號體系進行編號(edelmangm等人,上文)。

如本文所用的術(shù)語“親本抗體”或“親本免疫球蛋白”包括未修飾的抗體，所述抗體隨后經(jīng)修飾以產(chǎn)生變體。所述親本抗體可以是天然存在的抗體、或天然存在抗體的變體或工程化形式。親本抗體可以指抗體本身、包含親本抗體的組合物或編碼它的氨基酸序列。如本文所用的“親本抗ccr6抗體”意指結(jié)合配體ccl20并且經(jīng)修飾以產(chǎn)生變體的抗體或免疫球蛋白。如本文所用的“相應(yīng)鼠抗體”意指與ccr6結(jié)合并且可以是經(jīng)修飾以產(chǎn)生變體的鼠抗體或免疫球蛋白，尤其如本文中公開的鼠抗體4h11。如本文所用的“相應(yīng)嵌合抗體”意指與ccr6結(jié)合并且可以經(jīng)修飾以產(chǎn)生變體的嵌合抗體或免疫球蛋白。

如本文所用的術(shù)語“變體抗體”或“抗體變體”包含與親本相比，因至少一個氨基酸修飾而異于親本抗體序列的抗體序列。本文中的變體抗體序列將優(yōu)選地與親本抗體序列具有至少約80％、最優(yōu)選地至少約90％、更優(yōu)選地至少約95％氨基酸序列同一性。抗體變體可以指抗體本身、包含抗體變體的組合物或編碼它的氨基酸序列。

術(shù)語“同一性”或“實質(zhì)同一性”或“基本上同一的”，當指核酸或其片段時，表示在適當插入或缺失核苷酸的情況下與另一個核酸(或其互補鏈)最佳比對時，在至少約80％和更優(yōu)選地至少約90％、95％、96％、97％、98％或99％的核苷酸堿基存在核苷酸序列同一性，如通過如下文討論的任何熟知的序列同一性算法(如fasta、blast或gap)所測量。

當應(yīng)用于多肽時，術(shù)語“實質(zhì)相似性”或“基本上相似的”意指(如通過使用默認空位權(quán)重的程序gap或bestfit)最佳比對時，兩個肽序列共有至少80％序列同一性、甚至更優(yōu)選地至少90％、95％、98％或99％序列同一性。優(yōu)選地，不相同的殘基位置因保守性氨基酸置換而不同。

本文中的術(shù)語“氨基酸修飾”包括多肽序列中的氨基酸置換、插入和/或缺失。本文中的“氨基酸置換”或“置換”意指將親本多肽序列中特定位置處的氨基酸替換為另一種氨基酸。例如，置換r94k指一種變體多肽，在這種情況下是重鏈可變構(gòu)架區(qū)變體，其中位置94處的精氨酸由賴氨酸替換。對于前述例子，94k表示位置94以賴氨酸置換。出于本文目的，多個置換一般用斜線分隔。例如，r94k/l78v指包含置換r94k和l78v的雙變體。如本文所用的“氨基酸插入”或“插入”意指在親本多肽序列中特定位置處添加氨基酸。例如，插入-94指在位置94插入。如本文所用的“氨基酸缺失”或“缺失”意指在親本多肽序列中特定位置處移除氨基酸。例如，r94-指缺失位置94處的精氨酸。

如本文所用，術(shù)語“保守性修飾”或“保守性序列修飾”意指氨基酸修飾不顯著地影響或改變含有氨基酸序列的抗體的結(jié)合特征。這類保守性修飾包括氨基酸置換、插入和缺失?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域已知的標準技術(shù)，如位點定向誘變和pcr介導(dǎo)的誘變向本發(fā)明的抗體引入修飾。保守性氨基酸置換是氨基酸殘基被具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基替換的氨基酸置換。已經(jīng)在本領(lǐng)域中定義了具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基的家族。這些家族包括具有堿性側(cè)鏈(例如，賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、酸性側(cè)鏈(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不帶電荷極性側(cè)鏈(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非極性側(cè)鏈(例如，丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸)、β-分支的側(cè)鏈(例如，蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和芳族側(cè)鏈(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)的氨基酸。因而，可以將本發(fā)明抗體的cdr區(qū)內(nèi)部或其構(gòu)架區(qū)內(nèi)部的一個或多個氨基酸殘基替換為來自相同側(cè)鏈家族的其他氨基酸殘基，并且可以對改變的抗體(變體抗體)測試保留的功能。

術(shù)語“表位”指由抗體結(jié)合的抗原中的區(qū)域。表位可以定義為結(jié)構(gòu)表位或功能表位。功能表位通常是結(jié)構(gòu)表位的子集并且具有直接有助于相互作用的親和力的那些殘基。表位也可以是構(gòu)象的，即，由非線性氨基酸組成。在某些實施方案中，表位可以包括決定簇，所述決定簇是化學(xué)活躍的分子表面基團，如氨基酸、糖側(cè)鏈、磷酰基或磺?；?，并且在某些實施方案中，可以具有特定的三維結(jié)構(gòu)特征，和/或特定的電荷特征。

對于全部人免疫球蛋白重鏈恒定結(jié)構(gòu)域，編號根據(jù)“eu編號體系”進行(edelmangm等人,(1969)procnatlacadsciusa,63(1):78-85)。對于人κ免疫球蛋白輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域(igkc)，編號根據(jù)“eu編號體系”進行(edelmangm等人,上文)。

對于人λ免疫球蛋白輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域(iglc1、iglc2、iglc3、iglc6和iglc7)，編號根據(jù)如dariavachp等人,(1987)procnatlacadsciusa,84(24):9074-8和frangioneb等人,(1985)procnatlacadsciusa,82(10):3415-9所描述的“kabat編號體系”進行(kabatea等人,(1991)sequencesofproteinsofimmunologicalinterest第5版-usdepartmentofhealthandhumanservices,nih出版號91-3242)。

術(shù)語“可變結(jié)構(gòu)域”指介導(dǎo)抗原結(jié)合并且定義特定抗體針對特定抗原的特異性的結(jié)構(gòu)域。在天然存在的抗體中，抗原結(jié)合位點由兩個定義特異性的可變結(jié)構(gòu)域組成：一個位于重鏈(vh)和另一個位于輕鏈(vl)。在一些情況下，特異性可以完全位于兩個結(jié)構(gòu)域僅之一中，如來自駝類中存在的重鏈抗體的單結(jié)構(gòu)域抗體中那樣。v區(qū)通常長約110氨基酸并且由具有極端變動性的稱作“高變區(qū)”的長9-12個氨基酸的較短區(qū)域分隔開的15-30個氨基酸的稱作構(gòu)架區(qū)(fr)的相對不變動的氨基酸序列區(qū)段組成。天然重鏈和輕鏈的可變結(jié)構(gòu)域包括形成環(huán)的由三個高變區(qū)連接的四個fr，所述fr大體上采取β折疊構(gòu)型。每條鏈中的高變區(qū)由fr密切接近地固定在一起，并且與來自另一鏈的高變區(qū)對形成抗體的抗原-結(jié)合位點作出貢獻(參見kabatea等人,上文)。如本文所用的術(shù)語“高變區(qū)”指抗體中負責抗原結(jié)合的氨基酸殘基。高變區(qū)通常包含來自“互補決定區(qū)”或“cdr”的氨基酸殘基，后者具有最高的序列變異性和/或參與抗原識別。對于全部可變結(jié)構(gòu)域，根據(jù)kabat進行編號(kabatea等人,上文)。

本文中使用并涵蓋多種cdr定義。kabat定義基于序列變異性并且最常使用(kabatea等人,上文)。取而代之的是，chothia轉(zhuǎn)而指結(jié)構(gòu)性環(huán)的位置(chothiac&leskam(1987)j.mol.biol.196:901-917)。abm定義是kabat定義和chothia定義之間的折衷并且由oxfordmolecular'sabm抗體建模軟件使用(martinacr等人,(1989)proc.natlacad.sci.usa,86:9268–72；martinacr等人,(1991)methodsenzymol.203:121–153；pedersenjt等人,(1992)immunomethods,1:126–136；reesar等人,(1996)引自sternbergm.j.e.(編著),proteinstructureprediction.oxforduniversitypress,oxford,141–172)。最近已經(jīng)引入觸點定義(maccallumrm等人,(1996)j.mol.biol.262:732-745)并且以分析proteindatabank中可獲得的復(fù)合物結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)。(()(http://www.imgt.org)的cdr定義基于全部物種的全部免疫球蛋白和t細胞受體v-region的imgt編號(國際免疫遺傳學(xué)信息系統(tǒng)；；lefrancmp等人,(1991)nucleicacidsres.27(1):209-12；ruizm等人,(2000)nucleicacidsres.28(1):219-21；lefrancmp(2001)nucleicacidsres.29(1):207-9；lefrancmp(2003)nucleicacidsres.31(1):307-10；lefrancmp等人,(2005)dev.comp.immunol.29(3):185-203；kaasq等人,(2007)briefingsinfunctionalgenomics&proteomics,6(4):253-64)。

本發(fā)明中討論的全部互補決定區(qū)(cdr)均優(yōu)選地根據(jù)確定。這些cdr中每者的可變結(jié)構(gòu)域殘基如下(根據(jù)上文kabatea等人編號)：lcdr1：27-32，lcdr2：50-52，lcdr3：89-97，hcdr1：26-35，hcdr2：51-57和hcdr3：93-102。如本文所用的vl區(qū)的“非cdr區(qū)”包含以下氨基酸序列：1-26(fr1)、33-49(fr2)、53-88(fr3)和98-大約107(fr4)。如本文所用的vh區(qū)的“非cdr區(qū)”包含以下氨基酸序列：1-25(fr1)、36-50(fr2)、58-92(fr3)和103-大約113(fr4)。

本發(fā)明的cdr可以包含“延長的cdr”，其基于前述的定義并且具有如下的可變結(jié)構(gòu)域殘基：lcdr1：24-36，lcdr2：46-56，lcdr3：89-97，hcdr1：26-36，hcdr2：47-65，hcdr3：93-102。如本文所用的這些延長的cdr也根據(jù)上文kabat等人編號。如本文所用的vl區(qū)的“非延長的cdr區(qū)”包含以下氨基酸序列：1-23(fr1)、37-45(fr2)、57-88(fr3)和98-大約107(fr4)。如本文所用的vh區(qū)的“非延長的cdr區(qū)”包含以下氨基酸序列：1-25(fr1)、37-46(fr2)、66-92(fr3)和103-大約113(fr4)。

如本文所用的術(shù)語“全長抗體”包含構(gòu)成抗體的天然生物學(xué)形式的結(jié)構(gòu)，包括可變區(qū)和恒定區(qū)。例如，在大部分哺乳動物(包括人和小鼠)中，全長igg類抗體是四聚體并且由二對相同的兩條免疫球蛋白鏈組成，每對具有一條輕鏈和一條重鏈，每條輕鏈包含免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域vl和cl，并且每條重鏈包含免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域vh、ch1(cγ1)、ch2(cγ2)和ch3(cγ3)。在一些哺乳動物中，例如在駱駝和美洲駝(llamas)中，igg抗體可以僅由兩條重鏈組成，每條重鏈包含與fc區(qū)連接的可變結(jié)構(gòu)域。

抗體片段包括但不限于(i)由vl、vh、cl和ch1結(jié)構(gòu)域組成的fab片段，包括fab'和fab'-sh；(ii)由vh和ch1結(jié)構(gòu)域組成的fd片段；(iii)由單一抗體的vl結(jié)構(gòu)域和vh結(jié)構(gòu)域組成的fv片段；(iv)由單個可變結(jié)構(gòu)域組成的dab片段(wardes等人,(1989)nature,341:544-546)；(v)f(ab')2片段，一種包含兩個連接的fab片段的雙價片段；(vi)單鏈fv分子(scfv)，其中vh結(jié)構(gòu)域和vl結(jié)構(gòu)域由允許這兩個結(jié)構(gòu)域締合以形成抗原結(jié)合位點的肽接頭連接(birdre等人,(1988)science242:423-426；hustonjs等人,(1988)proc.natl.acad.sci.usa,85:5879-83)；(vii)雙特異性單鏈fv二聚體(pct/us92/09965)；(viii)通過基因融合所構(gòu)建的“雙體抗體”或“三體抗體”、多價或多特異性片段(tomlinsoni和hollingerp(2000)methodsenzymol.326:461-79；wo94/13804；holligerp等人,(1993)proc.natl.acad.sci.usa,90:6444-48)和(ix)與相同或不同抗體遺傳融合的scfv(colomamj和morrisonsl(1997)naturebiotechnology,15(2):159-163)。

如本文所用的術(shù)語“效應(yīng)子功能”包括因抗體fc區(qū)與fc受體或配體相互作用產(chǎn)生的生物化學(xué)事件。效應(yīng)子功能包括fcγr介導(dǎo)的效應(yīng)子功能如adcc(抗體依賴的細胞介導(dǎo)的細胞毒性)和adcp(抗體依賴性細胞介導(dǎo)的吞噬)和補體介導(dǎo)的效應(yīng)子功能如cdc(補體依賴的細胞毒性)。可以通過改變即增強或減少、優(yōu)選地增強抗體對效應(yīng)分子如fc受體或補體組分的親和力，改變抗體的效應(yīng)子功能?？梢允褂靡环N或多種基于細胞或體內(nèi)測定法確定效應(yīng)子功能。此類測定法經(jīng)常涉及監(jiān)測細胞對抗體的反應(yīng)，例如細胞存活、細胞死亡、細胞形態(tài)變化或轉(zhuǎn)錄激活如細胞表達天然基因或報道基因。例如，此類測定法可以測量抗體激發(fā)adcc、adcp或cdc的能力。對于一些測定法，可能還需要添加除靶細胞之外的額外細胞或組分，例如血清補體或效應(yīng)細胞如外周血單個核細胞(pbmc)、nk細胞、巨噬細胞等?？梢酝ㄟ^以下方式確定增強的效應(yīng)子功能：將改變的抗體與對照抗體比較效應(yīng)子功能并且檢測例如通過多種前述測定法之一測量的adcc、adcp或cdc的增加。結(jié)合親和力通常通過修飾效應(yīng)分子結(jié)合位點予以變動，并且在這種情況下，適宜的是定位目的位點并且以適宜方式修飾該位點的至少部分。還構(gòu)思了，改變針對效應(yīng)分子的抗體上的結(jié)合位點不需要顯著地改變總體結(jié)合親和力，但是可以改變相互作用的幾何學(xué)，從而使得效應(yīng)子機制無效，如非生產(chǎn)性結(jié)合中那樣。進一步構(gòu)思了，也可以通過修飾不直接參與效應(yīng)分子結(jié)合、但參與效應(yīng)子功能執(zhí)行的位點，來改變效應(yīng)子功能。通過改變抗體的效應(yīng)子功能，可能控制免疫應(yīng)答的多個方面，例如，增強或抑制免疫系統(tǒng)的多種反應(yīng)，在診斷和治療中可能帶來有益作用。

如本文所用，術(shù)語“ccr6介導(dǎo)的疾病”包括多種疾病，如癌癥和炎性疾病和/或自身免疫性疾病、尤其包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化(ms)、銀屑病、移植物抗宿主病(gvhd)、狼瘡、慢性阻塞性肺病(copd)、視神經(jīng)炎、年齡相關(guān)性黃斑變性、sle、舍格倫綜合征、硬皮病、全身性硬化癥、慢性腎臟疾病、肝纖維化、結(jié)核病、特發(fā)性肺纖維化、結(jié)核病誘導(dǎo)的肺纖維化、腹膜后纖維變性、肺纖維化、囊性纖維化、心內(nèi)膜心肌纖維化、心房纖維化、縱膈纖維化、骨髓纖維變性(骨髓)、腹膜后纖維化、進行性大塊性纖維化、腎源性系統(tǒng)性纖維化、關(guān)節(jié)纖維化、炎性腸病(例如，潰瘍性結(jié)腸炎和節(jié)段性回腸炎)、動脈粥樣硬化、移植排斥、中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷、銀屑癬、白血病或淋巴瘤(例如，慢性淋巴細胞白血病(cll))、動脈粥樣硬化和肺癌及結(jié)腸癌。

如本文所用，術(shù)語“受試者”包括任何人或非人動物。術(shù)語“非人動物”包括全部脊椎動物，例如，哺乳動物和非哺乳動物，如非人靈長類、綿羊、犬、貓、馬、奶牛、雞、兩棲類、爬行類等。優(yōu)選地，該受試者是人。

抗ccr6抗體

在第一方面，本發(fā)明提供一種與ccr6結(jié)合的抗體或其片段，所述抗體或其片段包含了含有seqidno:31的氨基酸序列的重鏈cdr1；和/或含有seqidno:32、seqidno:190、seqidno:239、seqidno:240、seqidno:241、seqidno:242、seqidno:254或seqidno:255的氨基酸序列的重鏈cdr2和/或含有seqidno:33的氨基酸序列的重鏈cdr3；和/或包含了含有seqidno:34、seqidno:191、seqidno:244、seqidno:245、seqidno:246或seqidno:256的氨基酸序列的輕鏈cdr1，和/或含有seqidno:35、seqidno:247、seqidno:248或seqidno:257的氨基酸序列的輕鏈cdr2，和/或含有seqidno:36或seqidno:192或seqidno:193的氨基酸序列的輕鏈cdr3。

根據(jù)這個第一方面，本發(fā)明提供了一種與ccr6結(jié)合的抗體或其片段，所述抗體或其片段包含了含有seqidno:31的氨基酸序列的重鏈cdr1；和含有seqidno:241的氨基酸序列的重鏈cdr2和含有seqidno:33的氨基酸序列的重鏈cdr3；和/或包含了含有seqidno:245的氨基酸序列的輕鏈cdr1，和含有seqidno:248的氨基酸序列的輕鏈cdr2，和含有seqidno:192或seqidno:193的氨基酸序列的輕鏈cdr3。

根據(jù)本發(fā)明的這個方面，本發(fā)明還涉及包含在本公開的多個方面詳述的重鏈cdr或輕鏈cdr的抗ccr6抗體。

優(yōu)選地，抗體或其片段與人ccr6結(jié)合并且與鼠或大鼠或食蟹猴ccr6具有交叉反應(yīng)性。

本領(lǐng)域熟知，cdr3結(jié)構(gòu)域獨立于cdr1和/或cdr2結(jié)構(gòu)域，cdr3結(jié)構(gòu)域可以單獨決定抗體對相應(yīng)抗原的結(jié)合特異性，并且可以基于共同cdr3序列可預(yù)測地產(chǎn)生具有相同結(jié)合特異性的多種抗體。參見，例如，klimkaa等人,(2000)br.j.cancer,83(2):252-260(其描述了僅使用鼠抗cd30抗體ki-4的重鏈可變結(jié)構(gòu)域cdr3產(chǎn)生人源化抗cd30抗體)；beiboersh等人,(2000)j.mol.biol.296:833-849(其描述僅使用親本鼠moc-31抗egp-2抗體的重鏈cdr3序列的重組上皮糖蛋白-2(egp-2)抗體)；raderc等人,(1998)proc.natl.acad.sciusa,95:8910-8915(其描述使用鼠抗整聯(lián)蛋白αvβ3抗體lm609的重鏈可變cdr3結(jié)構(gòu)域和輕鏈可變cdr3結(jié)構(gòu)域的一組人源化抗整聯(lián)蛋白αvβ3抗體，其中每種成員抗體包含在cdr3結(jié)構(gòu)域外部的獨特序列并且能夠以高親和力或高于親本鼠抗體的親和力結(jié)合與親本鼠抗體相同的表位)；barbas等人,(1994)j.am.chem.soc.116:2161-62(其公開了cdr3結(jié)構(gòu)域為抗原結(jié)合作出最明顯的貢獻)。

因此，本發(fā)明提供與ccr6結(jié)合的抗體及其片段，所述抗體及其片段包含一個或多個重鏈和/或輕鏈cdr3結(jié)構(gòu)域，尤其包含含有seqidno:33的氨基酸序列的重鏈cdr3和/或含有seqidno:36、192或193的氨基酸序列的輕鏈cdr3，其中抗體能夠與ccr6結(jié)合。在一些實施方案中，包含來自非人類抗體的一個或多個重鏈和/或輕鏈cdr3結(jié)構(gòu)域的這類本發(fā)明抗體(a)能夠競爭與相應(yīng)的親本非人類(例如，鼠)抗體相同的表位結(jié)合；(b)保留功能特征；(c)結(jié)合與相應(yīng)的親本非人類(例如，鼠)抗體相同的表位；和/或(d)具有與相應(yīng)的親本非人類(例如，鼠)抗體相似的結(jié)合親和力。

在又一個方面，本發(fā)明提供一種與ccr6結(jié)合的抗體或其片段，所述抗體或其片段包含了含有seqidno:7、37、39、40、41、42、75、177、178、179或249的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)序列。在另一個方面，本發(fā)明提供一種與ccr6結(jié)合的抗體或其片段，所述抗體或其片段包含了含有seqidno:8、38、43、44、45、46、181、182、250、251、252或253的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)序列。在一些實施方案中，與ccr6結(jié)合的抗體或其片段包含了含有seqidno:37或249的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)序列和含有seqidno:38或250、251、252或253的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)序列。優(yōu)選地，抗體或其片段與人ccr6結(jié)合并且與食蟹猴ccr6具有交叉反應(yīng)性。

在另一個方面，本發(fā)明提供與ccr6結(jié)合的抗體或其片段的變體。因此，本發(fā)明提供這樣的抗體或其片段，所述抗體或其片段具有重鏈可變區(qū)序列和/或輕鏈可變區(qū)序列的非cdr區(qū)的氨基酸序列，所述非cdr區(qū)的氨基酸序列分別與重鏈或輕鏈的親本抗體的重鏈可變區(qū)序列和/或輕鏈可變區(qū)序列(如seqidno:7、37、39、40、41、42、75、177、178、179、249或seqidno:8、38、43、44、45、46、181、182、250、251、252或253中的重鏈可變區(qū)序列和輕鏈可變區(qū)序列)的非cdr區(qū)氨基酸序列至少90％同一(具有至少90％氨基酸序列同一性)。另外，本發(fā)明提供這樣的抗體或其片段，所述抗體或其片段具有重鏈可變區(qū)序列和/或輕鏈可變區(qū)序列的非延長的cdr區(qū)的氨基酸序列，所述非延長的cdr區(qū)的氨基酸序列與重鏈或輕鏈的親本抗體的重鏈可變區(qū)序列和/或輕鏈可變區(qū)序列非延長的cdr區(qū)的氨基酸序至少80％同一。優(yōu)選地，重鏈可變區(qū)序列和/或輕鏈可變區(qū)序列的非cdr區(qū)或非延長的cdr區(qū)的氨基酸序列同一性是至少85％、更優(yōu)選地至少90％、并且最優(yōu)選地至少95％、尤其96％、更具體地97％、甚至更具體地98％、最具體地99％，例如包括80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％和100％。關(guān)于氨基酸序列的同一性或同源性，在本文中定義為對齊序列并且根據(jù)需要引入空位以實現(xiàn)最大序列同一性百分比后，候選序列中與結(jié)合ccr6的抗體或其片段同一的氨基酸殘基的百分數(shù)。因此，可以通過常用來比較兩條多肽的氨基酸位置中相似性的標準方法，確定序列同一性。使用計算機程序如blast或fasta，將兩條多肽對齊以最佳匹配它們的相應(yīng)氨基酸(沿著一個或兩個序列的全長或沿著一個或兩個序列的預(yù)定部分)。程序提供默認開口罰分和默認空位罰分，并且評分矩陣如pam250(標準評分矩陣；參見dayhoffmo等人,(1978)引自atlasofproteinsequenceandstructure,第5卷,附錄3)可以與計算機程序聯(lián)合使用。例如，同一性百分數(shù)可以計算為：相同匹配的總數(shù)乘以100并且隨后除以匹配的范圍內(nèi)部較長序列的長度和引入較長序列中以對齊兩個序列的空位數(shù)目的總和。

在一些實施方案中，本公開因此提供一種與ccr6結(jié)合的抗體或其片段，其中抗體或其片段包含與seqidno:77、78、79、80、81的構(gòu)架區(qū)序列至少65％同一的重鏈可變構(gòu)架區(qū)序列和/或與seqidno:82、83、84、85、86的構(gòu)架區(qū)序列至少75％同一的輕鏈可變構(gòu)架區(qū)序列。在一些實施方案中，本公開提供一種與ccr6結(jié)合的抗體或其片段，其中抗體或其片段包含與seqidno:80的構(gòu)架區(qū)序列至少75％同一的重鏈可變構(gòu)架區(qū)序列和/或與seqidno:82的構(gòu)架區(qū)序列至少82％同一的輕鏈可變構(gòu)架區(qū)序列。

在另一個方面，本發(fā)明提供一種與ccr6結(jié)合的抗體或其片段，所述抗體或其片段包含如上文描述的重鏈cdr和/或輕鏈cdr并且還包含作為選自ighv3-11*04(seqidno:77)、ighv3-11*01(seqidno:78)、ighv3-48*03(seqidno:79)、ighv3-23*04(seqidno:80)和ighv3-66*04(seqidno:81)的人基因的產(chǎn)物或衍生自所述人基因的重鏈可變構(gòu)架區(qū)，優(yōu)選地作為人基因ighv3-23*04(seqidno:80)的產(chǎn)物或衍生自所述人基因的重鏈可變構(gòu)架區(qū)。重鏈可變構(gòu)架區(qū)可以包含在那些人基因的產(chǎn)物中存在或衍生自所述人基因的一個或多個(例如，一個、二個、三個和/或四個)重鏈構(gòu)架區(qū)序列(例如，構(gòu)架1(fw1)、構(gòu)架2(fw2)、構(gòu)架3(fw3)和/或構(gòu)架4(fw4))。優(yōu)選地，重鏈可變區(qū)構(gòu)架包含在選自ighv3-11*04(seqidno:77)、ighv3-11*01(seqidno:78)、ighv3-48*03(seqidno:79)、ighv3-23*04(seqidno:80)和ighv3-66*04(seqidno:81)的人基因的產(chǎn)物中存在或衍生自所述人基因的fw1、fw2和/或fw3、更優(yōu)選地fw1、fw2和fw3。如本文所用的重鏈構(gòu)架區(qū)序列包括fw1(位置1至位置25)、fw2(位置36至位置49)、fw3(位置66至位置94)和fw4(位置103至位置113)，其中利用kabat中所述的編號體系指示氨基酸位置。

在一些實施方案中，本公開提供一種包含重鏈序列的抗體或其片段，所述重鏈序列包含seqidno:10、173、175、183、184、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、221、224、227、230、233和235的氨基酸序列并且其中其重鏈可變構(gòu)架區(qū)包含來自相應(yīng)鼠抗體的相應(yīng)重鏈可變構(gòu)架區(qū)中的至少一個氨基酸修飾。

優(yōu)選地，氨基酸修飾包含選自氨基酸位置24、49和62處的氨基酸置換，其中每個組成員的氨基酸位置根據(jù)kabat編號法指示。

在另一個方面，本發(fā)明提供一種與ccr6結(jié)合的抗體或其片段，所述抗體或其片段包含輕鏈可變構(gòu)架區(qū)，所述輕鏈可變構(gòu)架區(qū)作為選自igkv2-30*02(seqidno:82)、igkv2-30*01(seqidno:83)、igkv2d-30*01(seqidno:84)、igkv2-29*02(seqidno:85)、igkv2-29*03(seqidno:86)的人基因的產(chǎn)物或衍生自所述人基因，優(yōu)選地作為人基因igkv2-30*02(seqidno:82)的產(chǎn)物或衍生自所述人基因。輕鏈可變構(gòu)架區(qū)可以包含在那些人基因的產(chǎn)物中存在或衍生自所述人基因中的一個或多個(例如，一個、二個、三個和/或四個)輕鏈構(gòu)架區(qū)序列(例如，構(gòu)架1(fw1)、構(gòu)架2(fw2)、構(gòu)架3(fw3)和/或構(gòu)架4(fw4))。優(yōu)選地，輕鏈可變區(qū)構(gòu)架包含在選自igkv2-30*02(seqidno:82)、igkv2-30*01(seqidno:83)、igkv2d-30*01(seqidno:84)、igkv2-29*02(seqidno:85)、igkv2-29*03(seqidno:86)的人基因的產(chǎn)物中存在或衍生自所述人基因中的fw1、fw2和/或fw3、更優(yōu)選地fw1、fw2和fw3。如本文所用的輕鏈構(gòu)架區(qū)序列包括fw1(位置1至位置23)、fw2(位置35至位置49)、fw3(位置57至位置88)和fw4(位置98至位置108)，其中利用kabat中所述的編號體系指示氨基酸位置。

在一些實施方案中，本公開提供一種抗體或其片段，所述抗體或其片段包含作為人基因igkv2-30*02(seqidno:82)的產(chǎn)物或衍生自所述人基因的輕鏈可變構(gòu)架區(qū)并且其中輕鏈可變構(gòu)架區(qū)包含來自相應(yīng)鼠抗體的輕鏈可變區(qū)的相應(yīng)構(gòu)架區(qū)中的至少一個氨基酸修飾。

在一些實施方案中，本公開提供一種包含輕鏈序列的抗體或其片段，所述輕鏈序列包含seqidno:30、176、186、187、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、222、225、228、231和236的氨基酸序列。備選地，輕鏈序列的輕鏈可變構(gòu)架區(qū)包含來自相應(yīng)鼠抗體的相應(yīng)輕鏈可變構(gòu)架區(qū)的至少一個氨基酸修飾。

氨基酸修飾可以包含選自氨基酸位置36和46處的氨基酸置換，其中每個組成員的氨基酸位置根據(jù)kabat編號法指示。

特別優(yōu)選無任何氨基酸修飾的包含seqidno:30、211或213的氨基酸序列的輕鏈序列。

在一些實施方案中，與ccr6結(jié)合的抗體或其片段包含作為選自ighv3-11*04(seqidno:77)、ighv3-11*01(seqidno:78)、ighv3-48*03(seqidno:79)、ighv3-23*04(seqidno:80)和ighv3-66*04(seqidno:81)的人基因的產(chǎn)物或衍生自所述人基因的重鏈可變構(gòu)架區(qū)和作為選自igkv2-30*02(seqidno:82)、igkv2-30*01(seqidno:83)、igkv2d-30*01(seqidno:84)、igkv2-29*02(seqidno:85)、igkv2-29*03(seqidno:86)的人基因的產(chǎn)物或衍生自所述人基因的輕鏈可變構(gòu)架區(qū)，優(yōu)選地作為人基因ighv3-23*04(seqidno:80)的產(chǎn)物或衍生自所述人基因的重鏈可變構(gòu)架區(qū)和作為人基因igkv2-30*02(seqidno:82)的產(chǎn)物或衍生自所述人基因的輕鏈可變構(gòu)架區(qū)。本發(fā)明還涵蓋在上文提到的不同人基因的產(chǎn)物中存在或衍生自所述不同人基因的重鏈可變構(gòu)架區(qū)和/或在上文提到的不同人基因的產(chǎn)物中存在或衍生自所述不同人基因的輕鏈可變構(gòu)架區(qū)的組合。

人重鏈可變區(qū)基因和人輕鏈可變區(qū)基因的種系dna序列可以在“vbase”人種系序列數(shù)據(jù)庫(在互聯(lián)網(wǎng)上以下網(wǎng)址可獲得：www.mrccpe.cam.ac.uk/vbase)中以及在kabatea等人,上文；tomlinsonim等人,(1992)j.mol.biol.227:776-798和coxjpl等人,(1994)eur.j.immunol.24:827-836中找到。作為另一個例子，人重鏈可變區(qū)基因和人輕鏈可變區(qū)基因的種系dna序列可以在genbank數(shù)據(jù)庫中找到。

在另一個方面，本公開還提供一種與ccr6結(jié)合的抗體或其片段，其中至少一個重鏈cdr和/或至少一個輕鏈cdr包含至少一個氨基酸修飾?？梢赃M行位點定向誘變或pcr介導(dǎo)的誘變引入修飾，并且可以在體外或體內(nèi)測定法中評估對抗體結(jié)合或其他目的功能特性的影響。優(yōu)選地引入保守性修飾。修飾可以是氨基酸置換、添加或缺失，但優(yōu)選地是置換。一般地，在cdr區(qū)內(nèi)部進行不多于五個、優(yōu)選地不多于四個、更優(yōu)選地不多于三個、甚至更優(yōu)選地不多于二個、最優(yōu)選地不多于一個氨基酸修飾。

在某些實施方案中，構(gòu)架序列可以用來工程化可變區(qū)以產(chǎn)生變體抗體。本發(fā)明的變體抗體包括其中已經(jīng)對例如vh和/或vk內(nèi)的構(gòu)架殘基進行修飾以改善抗體特性的那些抗體。一般地，進行這類構(gòu)架修飾以降低抗體的免疫原性。例如，一種方案是將一個或多個構(gòu)架殘基“回復(fù)突變”成相應(yīng)的鼠序列或?qū)⒁粋€或多個構(gòu)架殘基“回復(fù)突變”成相應(yīng)的種系序列。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語回復(fù)突變可互換地用來意指這些操作的任一者并且更通常地用來指依次修飾抗體的氨基酸序列中的一個或多個殘基，從而改變其特性，如免疫原性。

因此在又一個方面，本公開提供一種與ccr6結(jié)合的抗體或其片段，其中抗體或其片段的重鏈可變區(qū)的至少一個構(gòu)架區(qū)序列包含來自相應(yīng)鼠抗體的重鏈可變區(qū)的相應(yīng)構(gòu)架區(qū)中的至少一個氨基酸修飾。優(yōu)選地，氨基酸修飾是氨基酸置換。一般地，在構(gòu)架區(qū)內(nèi)部進行不多于七個、優(yōu)選地不多于六個、優(yōu)選地不多于五個、優(yōu)選地不多于四個、更優(yōu)選地不多于三個、甚至更優(yōu)選地不多于二個、最優(yōu)選地不多于一個氨基酸修飾。

本公開還提供一種與ccr6結(jié)合的抗體或其片段，其中抗體或其片段的輕鏈可變區(qū)的至少一個構(gòu)架區(qū)序列可以包含來自相應(yīng)鼠抗體的輕鏈可變區(qū)的相應(yīng)構(gòu)架區(qū)中的至少一個氨基酸修飾。優(yōu)選地，氨基酸修飾是氨基酸置換。一般地，在構(gòu)架區(qū)內(nèi)部進行不多于兩個、更優(yōu)選地不多于一個氨基酸修飾并且最優(yōu)選地不進行氨基酸修飾。

鑒于這些重鏈可變區(qū)序列和輕鏈可變區(qū)序列的每者均可以與ccr6結(jié)合，可以將重鏈可變區(qū)序列和輕鏈可變區(qū)序列“混合并匹配”以產(chǎn)生本發(fā)明的抗ccr6結(jié)合分子?？梢允褂美缭趯嵤├忻枋龅慕Y(jié)合測定法測試這類“混合及匹配”抗體的ccr6結(jié)合作用。

在本公開的一個實施方案中，抗體或其片段是人源化抗體。優(yōu)選地，抗體或其片段是人源化單克隆抗體。

本公開還提供與ccr6結(jié)合的單價抗體或其片段，即由單一抗原結(jié)合臂組成的抗體。本公開還提供與ccr6結(jié)合的抗體的片段，所述片段選自fab、fab′、fab′-sh、fd、fv、dab、f(ab')2、scfv、雙特異性單鏈fv二聚體、雙體抗體、三體抗體和與相同或不同抗體遺傳融合的scfv。優(yōu)選的片段是scfv、雙特異性單鏈fv二聚體和雙體抗體。本公開還提供與ccr6結(jié)合的全長抗體。

本公開還提供一種與ccr6結(jié)合的抗體或其片段，其還包含重鏈恒定區(qū)和/或輕鏈恒定區(qū)、尤其人重鏈恒定區(qū)和/或人輕鏈恒定區(qū)。人重鏈恒定區(qū)可以選自igg1(ighg1)、igg2(ighg2)、igg3(ighg3)、igg4(ighg4)、iga1(igha1)、iga2(igha2)、igm(ighm)、igd(ighd)或ige(ighe)組成的人免疫球蛋白群組，其中優(yōu)選人重鏈恒定區(qū)igg、尤其igg1(ighg1)。人輕鏈恒定區(qū)可以選自由κ恒定區(qū)或λ恒定區(qū)組成的人免疫球蛋白群組，其中優(yōu)選人κ恒定區(qū)。在一個優(yōu)選實施方案中，與ccr6結(jié)合的抗體或其片段包含人igg1(ighg1)重鏈恒定結(jié)構(gòu)域和人輕鏈κ恒定域。

除了在構(gòu)架區(qū)或cdr區(qū)內(nèi)部作出修飾之外或作為其替代，還可以工程化本發(fā)明的抗體以在fc區(qū)內(nèi)部包含修飾，一般旨在改變抗體的一種或多種功能特征，如血清半壽期、補體固定、fc受體結(jié)合和/或抗原依賴性細胞的細胞毒性。此外，可以化學(xué)修飾(例如，一個或多個化學(xué)部分可以結(jié)合到抗體上)或修飾本發(fā)明的抗體以改變其糖基化。下文中進一步詳細描述了這些實施方案中的每一個。如下文略述的fc區(qū)內(nèi)部修飾根據(jù)fc區(qū)內(nèi)殘基的eu編號法進行。在一個實施方案中，修飾ch1的鉸鏈區(qū)，從而改變(例如增加或減少)鉸鏈區(qū)中半胱氨酸殘基的數(shù)目。這種方案在美國專利號5,677,425中由bodmer等人進一步描述。改變ch1的鉸鏈區(qū)中半胱氨酸殘基的數(shù)目，例如旨在促進輕鏈和重鏈的裝配或增加或減少抗體的穩(wěn)定性。在另一個實施方案中，將抗體的fc鉸鏈區(qū)突變以減少抗體的生物學(xué)半壽期。更特別地，可以向fc鉸鏈片段的ch2-ch3結(jié)構(gòu)域界面區(qū)引入一個或多個氨基酸突變，使得抗體相對于天然的fc鉸鏈結(jié)構(gòu)域spa結(jié)合作用具有受損的葡萄球菌蛋白a(spa)結(jié)合作用。這種方案在美國專利號6,165,745中由ward等更詳細地描述。在另一個實施方案中，修飾抗體以增加其生物學(xué)半壽期。多種方法是可能的。例如，可以引入以下一個或多個突變：t252l、t254s、t256f，如ward的美國專利號6,277,375中所述。備選地，為了增加生物學(xué)半壽期，可以在ch1或cl區(qū)內(nèi)部改變抗體以含有救援受體(salvagereceptor)結(jié)合表位，所述救援受體結(jié)合表位取自igg的fc區(qū)的ch2結(jié)構(gòu)域的兩個環(huán)，如美國專利號5,869,046和6,121,022中由presta等人所述。在又一個實施方案中，通過將至少一個氨基酸殘基替換為不同氨基酸殘基，改變fc區(qū)，以改變抗體的效應(yīng)子功能。例如，可以將選自氨基酸殘基234、235、236、237、297、318、320和322的一個或多個氨基酸替換為不同的氨基酸殘基，從而抗體具有改變的效應(yīng)子配體親和力，但是保留親本抗體的抗原結(jié)合能力。改變了親和力的效應(yīng)子配體可以是例如fc受體或補體的c1組分。這種方案在美國專利號5,624,821和5,648,260中均由winter等人進一步詳細描述。在另一個例子中，可以將選自氨基酸殘基329、331和322的一個或多個氨基酸替換為不同的氨基酸殘基，從而抗體具有改變的c1q結(jié)合作用和/或減少或消除的補體依賴的細胞毒性(cdc)。這種方案在美國專利號6,194,551中由idusogie等人進一步詳細地描述。在另一個例子中，改變ch2結(jié)構(gòu)域n端區(qū)域氨基酸位置231至238內(nèi)部的一個或多個氨基酸殘基，旨在因此改變抗體固定補體的能力。這種方案在pct公開號wo1994/29351中由bodmer等人進一步描述。又在另一個例子中，通過修飾以下位置處的一個或多個氨基酸：238、239、248、249、252、254、255、256、258、265、267、268、269、270、272、276、278、280、283、285、286、289、290、292、293、294、295、296、298、301、303、305、307、309、312、315、320、322、324、326、327、329、330、331、333、334、335、337、338、340、360、373、376、378、382、388、389、398、414、416、419、430、434、435、437、438或439，修飾fc區(qū)以增加抗體介導(dǎo)抗體依賴性細胞毒作用(adcc)的能力和/或以增加抗體對fcγ受體的親和力。這種方案在pct公開wo2000/42072中由presta進一步描述。

本公開還提供一種包含人重鏈恒定區(qū)和/或輕鏈恒定區(qū)的與ccr6結(jié)合的抗體或其片段，其中人重鏈恒定區(qū)包含同種型變體，所述同種型變體包含來自人igg4(ighg4)的ch1區(qū)、鉸鏈區(qū)、ch2區(qū)和ch3區(qū)并且其中鉸鏈區(qū)在位置228包含絲氨酸至脯氨酸的置換。優(yōu)選地，包含同種型變體的抗體是全長抗體。包含同種型變體的與ccr6結(jié)合的特別優(yōu)選的抗體或其片段包含來自人igg4(ighg4)的ch1、具有s228p置換的來自人igg4(ighg4)的鉸鏈區(qū)以及來自人igg4(ighg4)的ch2和ch3。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)與包含來自人igg1(ighg1)(其通常是天然人igg1)的人重鏈恒定區(qū)的與ccr6結(jié)合的抗體或其片段相比，即與僅就修飾的重鏈恒定區(qū)而言不同于同種型變體的與ccr6結(jié)合的抗體或其片段相比，同種型變體不顯示fc介導(dǎo)的細胞毒性機制如adcc。

本公開還提供一種包含人iggfc區(qū)的與ccr6結(jié)合的抗體或其片段，其中與人iggfc區(qū)連接的成熟核心糖結(jié)構(gòu)缺少巖藻糖(本文中備選地稱作“非巖藻糖基化”)。如本文所用的術(shù)語“成熟核心糖結(jié)構(gòu)”包括與fc區(qū)連接的加工型核心糖結(jié)構(gòu)，所述的加工型核心糖結(jié)構(gòu)通常由下文示意性表示的雙天線狀低聚糖常見的糖結(jié)構(gòu)glcnac(巖藻糖)-glcnac-man-(man-glcnac)2組成：

本術(shù)語特別地包括g-1形式的缺少β1,2glcnac殘基的核心成熟糖結(jié)構(gòu)。然而，核心糖結(jié)構(gòu)優(yōu)選地包括兩個β1,2glcnac殘基。本文中成熟的核心糖結(jié)構(gòu)通常不高甘露糖化。成熟的核心糖結(jié)構(gòu)與糖蛋白的fc區(qū)連接，通常借助n-鍵連接至fc區(qū)的ch2結(jié)構(gòu)域的asn297。

在本發(fā)明的一個實施方案中，抗體包含人igg1(ighg1)fc區(qū)，其中與人igg1(ighg1)fc區(qū)連接的成熟的核心糖結(jié)構(gòu)缺少巖藻糖。更優(yōu)選包含人igg1(ighg1)fc區(qū)的全長抗體，其中與人igg1(ighg1)fc區(qū)連接的成熟的核心糖結(jié)構(gòu)缺少巖藻糖。從wo03/035835已知，與人iggfc區(qū)連接的成熟核心糖結(jié)構(gòu)中缺少巖藻糖可以增強adcc。因此在又一個實施方案中，本公開的抗體或其片段包含人igg1(ighg1)fc區(qū)，其中與人igg1(ighg1)fc區(qū)連接的成熟的核心糖結(jié)構(gòu)缺少巖藻糖，而與不缺少巖藻糖的親本抗體或其片段相比，缺少巖藻糖的抗體顯示增強的adcc。產(chǎn)生缺少巖藻糖的抗體的方法例如是(a)使用在巖藻糖代謝方面缺陷的工程化或突變宿主細胞，從而它具有降低的使其中表達的蛋白質(zhì)巖藻糖基化的能力(或不能使其巖藻糖基化)；(b)在阻止或減少巖藻糖基化的條件下培養(yǎng)細胞；(c)翻譯后移除巖藻糖(例如，用巖藻糖苷酶)；(d)翻譯后添加所需的糖，例如，在重組表達非糖基化的糖蛋白后添加；或(e)純化糖蛋白，從而選擇未巖藻糖基化的產(chǎn)物。優(yōu)選地使用wo2010/095031的實施例14中描述的方法，例如，在longmore等人,(1982)carbohydr.res.365-92或在imai-nishiya等人,(2007),bmcbiotechnol.7:84中描述的方法。

本發(fā)明還提供抗體或其片段，所述抗體或其片段與ccr6結(jié)合并且結(jié)合至與包含下述重鏈可變序列和輕鏈可變序列的抗體相同的表位，所述重鏈可變序列包含seqidno:7、37、39、40、41、42、75、177、178、179、249的氨基酸序列，所述輕鏈可變序列包含seqidno:8、38、43、44、45、46、181、182、250、251、252或253的氨基酸序列?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域已知的任何合適的表位定位方法聯(lián)合本發(fā)明提供的任一種抗體，確定ccr6多肽的這個特定區(qū)域或表位。這類方法的例子包括用最小片段針對與本發(fā)明抗體結(jié)合篩選衍生自ccr6的不同長度的肽，所述最小片段可以特異性結(jié)合至含有本發(fā)明抗體識別的表位的序列的抗體。ccr6肽可以合成產(chǎn)生或通過蛋白酶解消化ccr6多肽產(chǎn)生。可以通過例如質(zhì)譜分析鑒定結(jié)合抗體的肽。在另一個例子中，nmr光譜法或x光結(jié)晶學(xué)可以用來鑒定由本發(fā)明抗體結(jié)合的表位。一旦鑒定，如果需要，可以使用結(jié)合本發(fā)明抗體的表位片段作為免疫原以獲得結(jié)合相同表位的額外抗體。

抗ccr6抗體特性

本領(lǐng)域已知用于評價抗體例如針對ccr6的結(jié)合能力的標準測定法包括例如elisa、蛋白質(zhì)印跡法、ria和流式細胞分析。在實施例中詳述合適的測定法。也可以通過本領(lǐng)域已知的標準測定法，如通過scatchard或系統(tǒng)分析，評估抗體的結(jié)合動力學(xué)(例如，結(jié)合親和力如kd)?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域已知的標準競爭測定法評估相對結(jié)合親和力ki。

在又一個方面，本發(fā)明提供如通過elisa法或法可視化的與人、小鼠、大鼠和食蟹猴ccr6結(jié)合的抗體或其片段?？梢愿鶕?jù)實施例3實施和測量結(jié)合性elisa。

在又一個方面，本發(fā)明提供與重組或天然產(chǎn)生的人ccr6結(jié)合并阻止cd4t淋巴細胞活化及分泌細胞因子的抗體或其片段。

在又一個方面，本發(fā)明提供以850pm或更小、優(yōu)選地700nm或更小、更優(yōu)選地300nm或更小、更優(yōu)選地260nm或更小、甚至更優(yōu)選地250nm或更小的親和力(kd)與ccr6、尤其分離形式的ccr6結(jié)合的抗體或其片段，例如，通過在蛋白a偶聯(lián)的cm5研究級傳感芯片(gehealthcareeuropegmbh,glattbrugg,瑞士；br-1000-14)上，以作為分析物使用的人可溶性ccr6多肽(由seqidno:101編碼)捕獲抗體，在儀(gehealthcareeuropegmbh,glattbrugg,瑞士)上通過表面等離子體共振(spr)測量，如實施例5中詳述。在優(yōu)選的方面，本發(fā)明提供了保留相應(yīng)嵌合抗體的至少85％的ccr6結(jié)合親和力(kd)的人源化抗體或其片段。優(yōu)選地，人源化抗體或其片段保留相應(yīng)嵌合抗體的至少90％的ccr6結(jié)合親和力(kd)、更優(yōu)選地相應(yīng)嵌合抗體的至少95％的結(jié)合親和力(kd)。優(yōu)選地，人源化抗體或其片段以等同于相應(yīng)嵌合抗體的親和力結(jié)合人ccr6?！暗韧H和力”意指處于相應(yīng)嵌合抗體的ccr6結(jié)合親和力的±10％范圍內(nèi)的親和力值。更優(yōu)選地，本發(fā)明提供人源化抗體或其片段以高于相應(yīng)嵌合抗體的親和力結(jié)合人ccr6。優(yōu)選地，人源化抗體或其片段以高于相應(yīng)嵌合抗體兩倍的親和力、更優(yōu)選地以高于相應(yīng)嵌合抗體三倍的親和力結(jié)合人ccr6。在本發(fā)明的優(yōu)選方面，提供與人ccr6結(jié)合的人源化抗體或其片段，所述的人源化抗體或其片段具有500nm或更小、優(yōu)選地250nm或更小、更優(yōu)選地100nm或更小、更優(yōu)選地50nm或更小、甚至更優(yōu)選地48nm或更小的結(jié)合親和力(kd)，例如，通過在蛋白a偶聯(lián)的cm5研究級傳感芯片(gehealthcareeuropegmbh,glattbrugg,瑞士；br-1000-14)上，以作為分析物使用的人可溶性ccr6多肽(由seqidno:101編碼)捕獲抗體，在儀(gehealthcareeuropegmbh,glattbrugg,瑞士)上通過表面等離子體共振(spr)測量，如實施例7中詳述。

本發(fā)明的又一個方面提供與ccr6結(jié)合并具有良好熱穩(wěn)定性的抗體或其片段。在一個優(yōu)選的實施方案中，與ccr6結(jié)合的抗體或其片段具有大于70℃、優(yōu)選地大于75℃和甚至更優(yōu)選地大于80℃的fab片段熱穩(wěn)定性溫度。為了分析fab片段熱穩(wěn)定性，使用差示掃描量熱法測量，同時確定全長igg背景下fab片段的中點熔融溫度。這些種類的量熱測量是技術(shù)人員已知的并且可以例如根據(jù)garbere&demarestsj(2007)biochembiophysrescommun,355:751-7實施，如實施例5中進一步描述。

核酸、載體和宿主細胞

本公開還提供了編碼與ccr6結(jié)合的抗體及其片段的分離核酸、包含該核酸的載體和包含該核酸或載體的宿主細胞。所述核酸可以存在于完整細胞中，存在于細胞裂解物中，或可以是部分純化的或基本上純形式的。當通過包括堿/sds處理、cscl區(qū)帶法、柱色譜、瓊脂糖凝膠電泳的標準技術(shù)和本領(lǐng)域熟知的其他技術(shù)，與其他細胞組分或其他雜質(zhì)(例如，其他細胞核酸或蛋白質(zhì))分離純化時，核酸是“分離的”或“變得基本上純的”，參見，例如f.ausubel等人編著(1987)currentprotocolsinmolecularbiology,greenepublishingandwileyinterscience,newyork。本發(fā)明的核酸可以是例如dna或rna并且可以含有或可以不含有內(nèi)含子序列。在一個優(yōu)選實施方案中，核酸是cdna分子。

可以使用標準分子生物學(xué)技術(shù)，獲得本發(fā)明的核酸，例如，可以通過標準pcr擴增或cdna克隆技術(shù)獲得編碼抗體輕鏈和重鏈或編碼vh區(qū)段的和vl區(qū)段的cdna。對于從免疫球蛋白基因文庫(例如使用噬菌體展示技術(shù))獲得的抗體，可以從該文庫回收編碼該抗體的一個或多個核酸。向宿主細胞中引入外源核酸的方法是本領(lǐng)域熟知的并且將隨所用的宿主細胞變動。技術(shù)包括但不限于葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染法、磷酸鈣沉淀法、氯化鈣處理法、聚乙烯亞胺介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染法、聚凝胺(polybrene)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染法、原生質(zhì)體融合法、電穿孔法、病毒或噬菌體感染法、多核苷酸在脂質(zhì)體中的囊化法和直接微量注射dna至胞核中。在哺乳動物細胞的情況下，轉(zhuǎn)染可以是瞬時的或穩(wěn)定的。

本發(fā)明優(yōu)選的核酸分子是編碼選自seqidno:88、90、92、94、96、98的重鏈序列和/或選自seqidno:87、89、91、93、95、97的輕鏈序列的那些。

本發(fā)明優(yōu)選的核酸分子是編碼seqidno:7、37或249的重鏈可變區(qū)和/或seqidno:8、38、250、251、252或253的輕鏈可變區(qū)的那些核酸分子。

一旦獲得編碼vh區(qū)段和vl區(qū)段的dna片段，可以通過標準重組dna技術(shù)進一步操作這些dna片段，例如，以將可變區(qū)基因轉(zhuǎn)化成全長抗體鏈基因、或轉(zhuǎn)化成與上述片段相對應(yīng)的片段基因如fab片段基因或轉(zhuǎn)化成scfv基因。在這些操作中，將編碼vl或vh的dna片段與編碼另一種蛋白質(zhì)(如抗體恒定區(qū)或柔性接頭)的另一個dna片段有效連接。如這種環(huán)境下所用，術(shù)語“有效連接”意指兩個dna片段例如如此連接，從而由這兩個dna片段編碼的氨基酸序列仍符合可讀框?？梢酝ㄟ^將編碼vh的dna與編碼重鏈恒定區(qū)(ch1、ch2和ch3)的另一個dna分子有效連接，將編碼vh區(qū)的分離dna轉(zhuǎn)化成全長重鏈基因。人重鏈恒定區(qū)基因的序列是本領(lǐng)域已知的(參見，例如，kabatea等人,上文)并且可以通過標準pcr擴增獲得涵蓋這些區(qū)域的dna片段。重鏈恒定區(qū)可以是igg1(ighg1)、igg2(ighg2)、igg3(ighg3)、igg4(ighg4)、iga1(igha1)、iga2(igha2)、igm(ighm)、igd(ighd)或ige(ighe)恒定區(qū)，但最優(yōu)選地是igg1(ighg1)恒定區(qū)。對于fab片段重鏈基因，編碼vh的dna可以與僅編碼重鏈ch1恒定區(qū)的另一個dna分子有效連接?？梢酝ㄟ^將編碼vl的dna與編碼輕鏈恒定區(qū)cl的另一個dna分子有效連接，將編碼vl區(qū)的分離的dna轉(zhuǎn)化成全長輕鏈基因(以及fab輕鏈基因)。人輕鏈恒定區(qū)基因的序列是本領(lǐng)域已知的(參見，例如，kabatea等人,上文)并且可以通過標準pcr擴增獲得涵蓋這些區(qū)域的dna片段。在優(yōu)選的實施方案中，輕鏈恒定區(qū)可以是κ恒定區(qū)或λ恒定區(qū)、優(yōu)選地κ恒定區(qū)。為了產(chǎn)生scfv基因，將編碼vh的和編碼vl的dna片段與編碼柔性接頭(例如編碼氨基酸序列(gly4-ser)3)的另一個片段有效連接，從而vh序列和vl序列可以表達為vl區(qū)和vh區(qū)由柔性接頭連接的連續(xù)單鏈蛋白(參見例如birdre等人,(1988)science,242:423-426；hustonjs等人,(1988)proc.natl.acad.sci.usa,85:5879-83；mccaffertyj等人,(1990)nature,348:552-554)。已經(jīng)開發(fā)了多種技術(shù)用于產(chǎn)生抗體的抗體片段。通常，通過蛋白酶解消化完整抗體衍生這些片段(參見，例如，morimotok等人,(1992)j.biochem.&biophysicalmethods,24:107-117和brennanm等人,(1985)science,229:81-3)。然而，現(xiàn)在可以通過重組宿主細胞直接產(chǎn)生這些片段。例如，抗體片段可以從上文討論的抗體噬菌體文庫分離。備選地，fab'-sh片段可以從大腸桿菌直接回收并且化學(xué)地偶聯(lián)以形成f(ab')2片段(carterp等人,(1992)bio/technology,10:163-167)。根據(jù)另一種方法，f(ab′)2片段可以從重組宿主細胞培養(yǎng)物直接分離。用于產(chǎn)生抗體片段的其他技術(shù)對于技術(shù)人員將是顯而易見的。在其他實施方案中，選擇的抗體是單鏈fv片段(scfv)，參見，例如，wo1993/16185；美國專利號5,571,894；和美國專利號5,587,458?？贵w片段也可以是“線型抗體”，例如，如美國專利號5,641,870中描述。

編碼本發(fā)明抗體的核酸可以并入載體、優(yōu)選地表達載體以表達蛋白質(zhì)。多種表達載體可以用于表達蛋白質(zhì)。表達載體可以包括自我復(fù)制型染色體外載體或整合入宿主基因組的載體。構(gòu)建表達載體以與宿主細胞類型相容。因此，在本發(fā)明中使用的載體、優(yōu)選地表達載體，包括但不限于能夠在哺乳動物細胞、細菌、昆蟲細胞、酵母中和在體外系統(tǒng)中實現(xiàn)蛋白質(zhì)表達的那些。如本領(lǐng)域已知，多種表達載體是商業(yè)可獲得的或可以在本發(fā)明中找到的用于表達抗體的載體。

表達載體一般包含與控制或調(diào)節(jié)序列、選擇標記、任何融合配偶體/或額外元件有效連接的蛋白質(zhì)。“有效連接的”在本文中意指令核酸處于與另一個核酸序列的功能性關(guān)系。術(shù)語“調(diào)節(jié)序列”意在包括啟動子、增強子和其他控制抗體鏈基因轉(zhuǎn)錄或翻譯的表達控制元件(例如，聚腺苷酸化信號)。此類調(diào)節(jié)序列例如在goeddel(geneexpressiontechnology.methodsinenzymology185,academicpress,sandiego,ca(1990))中描述。通常，這些表達載體包含與編碼抗體的核酸有效連接的轉(zhuǎn)錄性和翻譯性調(diào)節(jié)核酸，并且一般適宜于宿主細胞用來表達蛋白質(zhì)。通常，該轉(zhuǎn)錄性和翻譯性調(diào)節(jié)序列可以包括啟動子序列、核糖體結(jié)合位點、轉(zhuǎn)錄起始和終止序列、翻譯起始和終止序列和增強子或激活蛋白序列。還如本領(lǐng)域已知，表達載體一般含有選擇基因或標志物以允許選擇含有表達載體的轉(zhuǎn)化的宿主細胞。選擇基因是本領(lǐng)域熟知的并且將隨所用的宿主細胞變動。例如，選擇標記基因一般對其中已經(jīng)導(dǎo)入載體的宿主細胞賦予針對藥物(如g418、潮霉素或甲氨蝶呤)的耐藥性。優(yōu)選的選擇標記基因包括二氫葉酸還原酶(dhfr)基因(在dhfr^-宿主細胞中連同甲氨蝶呤選擇/擴增一起使用)和neo基因(用于g418選擇)。

用于克隆或表達本文載體中的dna的合適宿主細胞是原核生物細胞、酵母細胞或高等真核生物細胞。適合此目的的原核生物包括真細菌，包括革蘭氏陰性或革蘭氏陽性生物，例如，腸桿菌科(enterobacteriaceae)如埃希氏菌屬(escherichia)(例如，大腸桿菌)、腸桿菌屬(enterobacter)、克雷伯氏菌屬(klebsiella)、變形菌屬(proteus)、沙門氏菌屬(salmonella)(例如，鼠傷寒沙門氏菌(salmonellatyphimurium))、沙雷菌屬(serratia)(例如，粘質(zhì)沙雷菌(serratiamarcescans))和志賀氏菌(shigella)、以及芽孢桿菌綱(bacilli)如枯草芽孢桿菌(b.subtilis)和地衣芽孢桿菌(b.licheniformis)、假單胞菌屬(pseudomonas)(如銅綠假單胞菌(p.aeruginosa))和鏈霉菌屬(streptomyces)。合適的大腸桿菌克隆宿主包括大腸桿菌294(atcc31,446)、大腸桿菌b、大腸桿菌x1776(atcc31,537)和大腸桿菌w3110(atcc27,325)。除原核生物之外，真核微生物如絲狀真菌或酵母是合適的克隆宿主或表達宿主。低等真核宿主微生物當中，常使用釀酒酵母(saccharomycescerevisiae)或普通面包酵母。但是，眾多其他屬、物種和菌株是通?？色@得和有用的，如粟酒裂殖酵母(schizosaccharomycespombe)；克魯維酵母屬(kluyveromyces)宿主，包括乳酸克魯維酵母(k.lactis)、脆壁克魯維酵母(k.fragilis)(atcc12,424)、保加利亞克魯維酵母(k.bulgaricus)(atcc16,045)、k.wickeramii(atcc24,178)、k.waith(ajcc56,500)、k.drosopmarum(atcc36,906)、耐熱克魯維酵母(k.thermotolerans)、或k.marxianusyarrowia(ep402226)；巴斯德畢赤酵母(pichiapastoris)(ep183070)；假絲酵母屬(candida)；里氏木霉屬(trichodermareesia)(ep244234)；粗糙脈孢菌(neurosporacrassa)；許旺酵母屬(schwanniomyces)如西方許旺酵母屬(schwanniomycesoccidentalis)；和絲狀真菌，包括脈孢菌屬(neurospora)、青霉屬(penicillium)、彎頸霉屬(tolypocladium)、或曲霉屬(aspergillus)宿主如構(gòu)巢曲霉(a.nidulans)或黑曲霉(a.niger)。

表達本發(fā)明抗體的合適宿主細胞衍生自多細胞生物。無脊椎動物細胞的例子包括plaril細胞和昆蟲細胞。已經(jīng)鑒定了多個桿狀病毒毒株和變體及來自宿主如草地貪夜蛾(spodopterafrugiperda)(毛蟲)、埃及伊蚊(aedesaegypti)(蚊)、白紋伊蚊(aedesalbopictus)(蚊)、黑腹果蠅(drosophilamelanogaster)(果蠅)和家蠶(bombyxmori)的相應(yīng)容許性昆蟲宿主細胞。用于轉(zhuǎn)染的多種病毒株是可公開獲得的，例如，苜蓿銀紋夜蛾(autographacalifornica)npv的l-1變體和家蠶npv的bm-5毒株，并且可以使用這類病毒，尤其用于轉(zhuǎn)染草地貪夜蛾細胞。也可以利用棉花、谷物、馬鈴薯、大豆、碧冬茄、番茄和煙草的植物細胞培養(yǎng)物作為宿主。

用于表達本發(fā)明重組抗體的宿主細胞優(yōu)選地是哺乳動物宿主細胞，包括中國倉鼠卵巢(cho細胞)(包括urlaub和chasinla(1980)proc.natl.acad.sci,usa,77:4216-4220中所述的dhfr-cho細胞，所述細胞例如與如kaufmanrj和sharppa(1982)j.mol.biol,159:601-621中所述的dhfr選擇標記一起使用)、nso骨髓瘤細胞、cos細胞和sp2細胞。具體而言，對于nso骨髓瘤細胞的使用，另一個優(yōu)選的表達系統(tǒng)是在wo87/04462(授予wilson)、wo89/01036(授予bebbington)和ep338841(授予bebbington)中公開的gs基因表達系統(tǒng)。將重組抗體基因引入哺乳動物宿主細胞時，通過培養(yǎng)宿主細胞足以允許抗體在宿主細胞中表達或更優(yōu)選地允許抗體分泌入培養(yǎng)宿主細胞的培養(yǎng)基中的一段時間，產(chǎn)生抗體?？梢栽诙喾N培養(yǎng)基中培養(yǎng)可用于產(chǎn)生與ccr6結(jié)合的抗體的宿主細胞。市售培養(yǎng)基如hamf10(sigma-aldrichchemiegmbh,buchs,瑞士)、極限基本培養(yǎng)基(mem；sigma-aldrichchemiegmbh)、rpmi-1640((sigma-aldrichchemiegmbh,巴賽爾，瑞士)和dulbecco改良eagle培養(yǎng)基((dmem；sigma-aldrichchemiegmbh)適于培養(yǎng)宿主細胞?？梢杂脴藴实鞍踪|(zhì)純化方法從培養(yǎng)基回收抗體。

抗體可以有效連接于融合配偶體以能夠?qū)崿F(xiàn)導(dǎo)引表達的蛋白質(zhì)、純化、篩選、展示等。融合配偶體可以經(jīng)接頭序列與抗體序列連接。接頭序列將通常包含括小數(shù)目的氨基酸，一般小于十個氨基酸，不過也可以使用較長的接頭。一般地，選擇接頭序列為柔性并抵抗降解。如本領(lǐng)域技術(shù)人員將領(lǐng)會，可以使用多種類型的序列中任一者作為接頭。例如，常見的接頭序列包含氨基酸序列g(shù)4s。融合配偶體可以是指導(dǎo)抗體和任何結(jié)合的融合配偶體至所需細胞位置或胞外介質(zhì)的導(dǎo)引序列或信號序列。如本領(lǐng)域已知，某些信號傳導(dǎo)序列可以導(dǎo)引蛋白質(zhì)分泌入生長培養(yǎng)基、或分泌入位于細胞內(nèi)膜和外膜之間的周質(zhì)間隙。融合配偶體也可以是編碼能夠?qū)崿F(xiàn)純化和/或篩選的肽或蛋白質(zhì)的序列。這類融合配偶體包括但不限于多組氨酸標簽(his標簽)(例如，隨固定的金屬親和色譜(imac)系統(tǒng)(例如，ni⁺²親和柱)一起使用的h6和h10或其他標簽)、gst融合物、mbp融合物、strep標簽、細菌酶bira的bsp生物素?；行蛄泻涂贵w靶向的表位標簽(例如，c-myc標簽、flag-標簽等)。如本領(lǐng)域技術(shù)人員將領(lǐng)會，這類標簽可以用于純化、篩選或這兩種情況。

抗體的構(gòu)建和生產(chǎn)

可以通過免疫接種動物獲得，即通過使用熟知和例行方案施用多肽至動物、優(yōu)選地非人類動物，針對ccr6多肽生成的抗體，參見例如handbookofexperimentalimmunology(weirdm(編著),第4卷,blackwellscientificpublishers,oxford,england,1986)。許多溫血動物，如兔、小鼠、大鼠、綿羊、奶牛、駱駝或豬可以免疫接種。但是，小鼠、兔、豬和大鼠尤其小鼠通常最適合。也可以通過技術(shù)人員已知的重組dna技術(shù)產(chǎn)生抗體。此外，可以通過酶剪切或化學(xué)剪切天然存在的抗體，產(chǎn)生抗體?？梢酝ㄟ^轉(zhuǎn)移一個或多個來自非人類動物(例如，小鼠)vh區(qū)和/或vl區(qū)cdr或其部分至一個或多個來自人vh區(qū)和/或vl區(qū)的構(gòu)架區(qū)，產(chǎn)生本發(fā)明的人源化抗體。任選地，當需要或想要減少抗體的免疫原性和/或維持結(jié)合親和力時，如此存在于vh區(qū)和/或vl區(qū)中的人類構(gòu)架殘基可以是由相應(yīng)的非人類(例如，小鼠)殘基替換。任選地，存在于cdr中的非人類氨基酸殘基可以替換為人類殘基?？梢曰谏衔乃鲋苽涞姆侨祟悊慰寺】贵w的序列，制備本發(fā)明的嵌合抗體或人源化抗體。編碼重鏈和輕鏈免疫球蛋白的dna可以從目的非人類雜交瘤獲得并且使用標準分子生物學(xué)技術(shù)，經(jīng)工程化以含有非鼠(例如人)免疫球蛋白序列。例如，為產(chǎn)生嵌合抗體，可以使用本領(lǐng)域已知的方法，將鼠可變區(qū)與人恒定區(qū)連接(例如，參見授予cabilly等人的美國專利號4,816,567)。為產(chǎn)生人源化抗體，可以使用本領(lǐng)域已知的方法，將鼠cdr區(qū)插入人構(gòu)架中(例如，參見授予winter的美國專利號5,225,539和授予queen等人的美國專利號5,530,101；5,585,089；5,693,762和6,180,370)。

可以構(gòu)建本發(fā)明的人源化抗體，其中基于潛在接納分子可變區(qū)和鼠抗體的重鏈可變區(qū)之間的同源性考慮，選擇重鏈可變區(qū)的人接納分子。優(yōu)選人類種系候選接納分子以減少潛在的免疫原性。種系數(shù)據(jù)庫由通讀重鏈fw3區(qū)末端及部分地讀入cdr3序列的抗體序列組成。為了選擇fw4區(qū)，可以檢索已經(jīng)從所選擇種系分子衍生的成熟抗體序列數(shù)據(jù)庫或可以使用已經(jīng)從源自人供體的所選擇種系分子衍生的抗體序列。人接納分子優(yōu)選地選自與鼠供體分子相同的重鏈類別并具有鼠供體分子可變區(qū)的相同的規(guī)范結(jié)構(gòu)類別。針對重鏈可變區(qū)選擇人接納分子的次要考慮事項避開了鼠供體分子和人接納分子之間cdr長度方面的同源性。優(yōu)選地，通過同源性檢索v-base數(shù)據(jù)庫選擇人類接納體抗體分子，不過也可以使用其他數(shù)據(jù)庫如kabat和公用ncbi數(shù)據(jù)庫。

可以構(gòu)建本發(fā)明的人源化抗體，其中基于潛在接納分子可變區(qū)和鼠抗體的輕鏈可變區(qū)之間的同源性考慮，選擇輕鏈可變區(qū)的人接納分子。優(yōu)選人類種系候選接納分子以減少潛在的免疫原性。種系數(shù)據(jù)庫由通讀重鏈fw3區(qū)末端及部分地讀入cdr3序列的抗體序列組成。為了選擇fw4區(qū)，可以檢索已經(jīng)從所選擇種系分子衍生的成熟抗體序列數(shù)據(jù)庫或可以使用已經(jīng)從源自人供體的所選擇種系分子衍生的抗體序列。人接納分子優(yōu)選地選自與鼠供體分子相同的輕鏈類別并具有鼠供體分子可變區(qū)的相同的規(guī)范結(jié)構(gòu)類別。針對輕鏈可變區(qū)選擇人接納分子的次要考慮事項包括鼠供體分子和人接納分子之間cdr長度方面的同源性。優(yōu)選地，通過同源性檢索v-base數(shù)據(jù)庫選擇人類接納體抗體分子，并且也可以使用其他數(shù)據(jù)庫如kabat和公用ncbi數(shù)據(jù)庫。本文中(包括下文在實施例6中)描述了用于人源化非人類抗體的方法。

本發(fā)明提供一種產(chǎn)生與ccr6結(jié)合的抗體或其片段的方法，所述方法包括培養(yǎng)宿主細胞，所述宿主細胞包含編碼與ccr6結(jié)合的抗體或其片段的分離核酸或包含編碼與ccr6結(jié)合的抗體或其片段的分離核酸的載體，從而表達核酸并產(chǎn)生抗體。優(yōu)選地，分離抗體。對于宿主細胞、核酸和載體，可以使用上文描述的那些?？梢酝ㄟ^例如，如本領(lǐng)域熟知(例如，morrisons(1985)science229:1202)和如上文進一步概述的重組dna技術(shù)和基因轉(zhuǎn)染方法組合，獲得核酸的表達。例如，為了表達抗體，可以通過標準分子生物學(xué)技術(shù)(例如，使用表達目的抗體的雜交瘤的pcr擴增或cdna克隆法)獲得編碼部分或全長輕鏈和重鏈的dna，并且可以將所述dna插入載體(如表達載體)。選擇與所用表達宿主細胞相容的表達載體和表達控制序列?？梢詫⒖贵w輕鏈基因和抗體重鏈基因插入分立的載體，或者通常將兩個基因插入相同的表達載體。將抗體基因通過標準方法插入表達載體(例如，連接抗體基因片段和載體上的互補限制性位點，或如果不存在限制性位點，則平末端連接)。本文所述的抗體輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)可以用來通過以下方式產(chǎn)生具有任何抗體同種型的全長抗體基因：將它們插入已經(jīng)編碼所需同種型的重鏈恒定和輕鏈恒定區(qū)的表達載體，從而vh區(qū)段與載體內(nèi)部的ch1區(qū)段有效連接并且vk區(qū)段與載體內(nèi)部的ck區(qū)段有效連接。

抗ccr6抗體的表征和純化

可以使用測量與人ccr6結(jié)合的測定法和/或測量阻斷ccr6與其配體結(jié)合的能力的測定法，進行抗體的篩選。結(jié)合測定法的一個例子是elisa，尤其是使用固定在平板上的融合蛋白，為人ccr6和人fc，和使用綴合的第二抗體，檢測與融合蛋白結(jié)合的抗ccr6抗體的elisa。阻斷測定法的一個例子是ccl20-介導(dǎo)的移行測定法，所述測定法測量對baf轉(zhuǎn)染的細胞上配體蛋白與ccr6結(jié)合的阻斷。這種測定法尋找當上清液中的抗體阻斷表達ccr6的細胞響應(yīng)于ccl20而移行時的信號降低。阻斷測定法的又一個例子是其中通過化學(xué)發(fā)光測量ccr6激活過程阻斷的測定法。

本發(fā)明的抗體可以按照本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的多種方式分離或純化。標準純化方法包括色譜技術(shù)，包括在大氣壓或在高壓使用系統(tǒng)如fplc和hplc實施的離子交換色譜、疏水相互作用色譜、親和色譜、大小或凝膠過濾色譜和反相色譜。純化方法還包括電泳技術(shù)、免疫技術(shù)、沉淀技術(shù)、透析技術(shù)和聚焦色譜技術(shù)。與蛋白質(zhì)濃縮聯(lián)用的超濾和滲濾技術(shù)也是有用的。為了純化ccr6抗體，可以例如在轉(zhuǎn)瓶中培育選擇的宿主細胞供單克隆抗體純化用?？梢赃^濾和濃縮上清液，之后進行蛋白a-瓊脂糖凝膠親和色譜(pharmacia,piscataway,nj)?？梢酝ㄟ^凝膠電泳和高效液相色譜法檢查洗脫的抗體以確保純度。本發(fā)明的優(yōu)選抗體因此是分離和/或純化的與ccr6結(jié)合的抗體。

免疫綴合物

在另一個方面，本發(fā)明表征了與治療劑如細胞毒素、藥物(例如，免疫抑制劑)或放射性毒素連接的與人ccr6結(jié)合的ccr6抗體或其片段。這類綴合物在本文中稱作“免疫綴合物”。包含一種或多種細胞毒素的免疫綴合物稱作“免疫毒素”。術(shù)語“細胞毒素”或“細胞毒性劑”包括有害于(例如，殺死)細胞的任何物質(zhì)。例子包括紫杉酚、松胞菌素b、短桿菌肽d、溴化乙啶、依米丁、絲裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷、長春新堿、長春堿、秋水仙堿、多柔比星、佐柔比星、二羥基蒽二酮、米托蒽醌、光神霉素、放線菌素d、1-脫氫睪酮、糖皮質(zhì)激素、普魯卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛爾和嘌呤霉素及其類似物或同源物。治療劑還例如包括抗代謝物(例如甲氨蝶呤、6-巰基嘌呤、6-硫鳥嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶達卡巴嗪)、烷基化劑(例如氮芥、硫代苯丁酸氮芥、美法倉、卡莫司汀(bsnu)和羅莫司汀(ccnu)、環(huán)磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、鏈佐星、絲裂霉素c、和順-二氯二胺鉑(ii)(ddp)順鉑、蒽環(huán)類(例如佐柔比星(以前為柔紅霉素)和多柔比星)、抗生素(例如更生霉素(以前為放線菌素d)、博來霉素、光神霉素和安曲霉素(amc))以及抗有絲分裂藥(例如長春新堿和長春堿)?？膳c本發(fā)明的抗體連接的治療性細胞毒素的其他例子包括倍癌霉素、刺孢霉素、美坦辛和澳瑞司他汀及其衍生物。刺孢霉素抗體綴合物的例子是可商業(yè)獲得的(americanhomeproducts)。細胞毒素可以使用本領(lǐng)域可獲得的接頭技術(shù)與本發(fā)明的抗體連接。已經(jīng)用來將細胞毒素與抗體綴合的接頭類型的例子包括但不限于含腙、硫醚、酯、二硫鍵和肽的接頭?？梢赃x擇例如對于溶酶體區(qū)室內(nèi)部低ph所致剪切敏感或?qū)τ诘鞍酌?如腫瘤組織中優(yōu)先表達的蛋白酶如組織蛋白酶(例如，組織蛋白酶b、c、d))所致剪切敏感的接頭。對于細胞毒素類型、接頭和用于將治療劑與抗體綴合的方法的進一步討論，還參見saitog等人,(2003)adv.drugdeliv.rev.55:199-215；trailpa等人,(2003)cancerimmunol.immunother.52:328-337；payneg(2003)cancercell,3:207-212；allentm(2002)nat.rev.cancer,2:750-763；pastani&kreitmanrj(2002)curr.opin.investig.drugs,3:1089-1091；senterpd&springercj,(2001)adv.drugdeliv.rev.53:247-264。本發(fā)明的抗體也可以與放射性同位素連接，以產(chǎn)生細胞毒性放射藥物，也稱作放射免疫綴合物?？梢耘c抗體綴合的用于診斷或治療性用途的放射性同位素的例子包括但不限于碘¹³¹、銦¹¹¹、釔⁹⁰和镥¹⁷⁷。本領(lǐng)域中建立了用于制備放射性免疫綴合物的方法。放射免疫綴合物的例子是可商業(yè)獲得的包括(edecpharmaceuticals)和(corixapharmaceuticals)，并且相似的方法可以用來利用本發(fā)明的抗體制備放射免疫綴合物。本發(fā)明的抗體綴合物可以用來調(diào)節(jié)給定的生物學(xué)反應(yīng)，并且藥物部分不得解釋為限于經(jīng)典的化學(xué)治療劑。例如，藥物部分可以是擁有所需生物學(xué)活性的蛋白質(zhì)或多肽。這類蛋白質(zhì)可以包括，例如，酶活性毒素或其活性片段，如相思豆毒蛋白，蓖麻毒蛋白a，假單胞菌外毒素，或白喉毒素；蛋白質(zhì)如腫瘤壞死因子或干擾素-γ；或生物學(xué)反應(yīng)調(diào)節(jié)物如，例如，淋巴因子、白介素-1(il-1)、白介素-2(il-2)、白介素-6(il-6)、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(gm-csf)、粒細胞集落刺激因子(g-csf)、或其他生長因子。

將這類治療劑與抗體連接的技術(shù)是熟知的，參見，例如arnon等人,“monoclonalantibodiesforimmunotargetingofdrugsincancertherapy”,引自monoclonalantibodiesandcancertherapy,reisfeld等人,(編者),第243-56頁(alanr.liss,inc.1985)；hellstrom等人,“antibodiesfordrugdelivery”,引自controlleddrugdelivery(第2版),robinson等人,(編者),第623-53頁(marceldekker,inc.1987)；thorpe,“antibodycarriersofcytotoxicagentsincancertherapy:areview”,引自monoclonalantibodies'84:biologicalandclinicalapplications,pinchera等人,(編者),第475-506頁(1985)；“analysis,results,andfutureprospectiveofthetherapeuticuseofradiolabeledantibodyincancertherapy”,引自monoclonalantibodiesforcancerdetectionandtherapy,baldwin等人,(編者),第303-16頁(academicpress1985)和thorpepe&rosswc(1982)immunol.rev.62:119-58。

在另一個方面，本發(fā)明提供了與治療劑如細胞毒素、藥物(例如，免疫抑制劑)或放射性毒素一起施用的與ccr6結(jié)合的ccr6抗體或其片段。

藥物組合物

在另一個方面，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明抗體或其片段和可藥用載體的組合物，例如，藥物組合物。這類組合物可以包括本發(fā)明抗體和/或免疫綴合物和/或如上文描述的治療劑(如細胞毒素、藥物(例如，免疫抑制劑)或放射性毒素)的一個或多個(例如，兩個或更多個不同)組合。例如，本發(fā)明的藥物組合物可以包含與靶抗原上不同表位結(jié)合或具有互補活性的抗體(或免疫綴合物)的組合。本發(fā)明的藥物組合物也可以在聯(lián)合療法中施用，即，與其他藥劑組合。例如，聯(lián)合療法可以包括與至少一種其他抗炎藥或免疫抑制劑組合的本發(fā)明ccr6抗體。

如本文所用，“可藥用載體”包括生理上相容的任何和全部溶劑、分散介質(zhì)、包衣、抗細菌藥和抗真菌藥等滲劑和吸收延遲劑等。優(yōu)選地，載體適于靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、腸胃外、脊髓或表皮施用(例如，通過注射或輸注)。取決于施用途徑，可以將活性化合物(即，抗體或免疫綴合物)包覆在保護該化合物免遭可能使這種化合物失活的酸和其他天然條件作用的材料中。可藥用載體包括無菌水溶液或分散體和用于現(xiàn)場制備無菌可注射溶液劑或分散劑的無菌粉末。使用藥學(xué)活性物質(zhì)的此類介質(zhì)和試劑是本領(lǐng)域已知的。除了任何常規(guī)介質(zhì)或試劑與活性化合物不相容的情況下之外，構(gòu)思了在本發(fā)明藥物組合物中使用所述介質(zhì)或試劑。補充性活性化合物也可以并入組合物中。

在另一個方面，本發(fā)明提供一種包含免疫綴合物和可藥用載體的組合物，所述免疫綴合物包含與治療劑連接的與ccr6結(jié)合的抗體或其片段。如上文描述了可以使用的免疫綴合物和治療劑。

在另一個方面，本發(fā)明提供一種包含本發(fā)明抗體或其片段的組合物，所述組合物還包含另一個藥物活性物質(zhì)。優(yōu)選地，另一種藥物活性物質(zhì)是以下一者或多者：a)ccr6的另一種拮抗劑、b)抗炎藥、c)免疫阻抑劑(例如tnfα拮抗劑、可的松或類固醇等)和/或d)抗過敏藥。

本發(fā)明的藥物組合物還可以包括可藥用的抗氧化物質(zhì)?？伤幱玫目寡趸镔|(zhì)的例子包括：(1)水溶性抗氧化物質(zhì)，如抗壞血酸、鹽酸半胱氨酸、硫酸氫鈉、焦亞硫酸鈉、亞硫酸鈉等；(2)油溶性抗氧化物質(zhì)，如抗壞血酸棕櫚酸酯、丁化羥基茴香醚(bha)、丁化羥基甲苯(bht)、卵磷脂、沒食子酸丙酯、α-生育酚等；和(3)金屬絡(luò)合劑，如檸檬酸、乙二胺四乙酸(edta)、山梨醇、酒石酸、磷酸等?？梢栽诒景l(fā)明的藥物組合物中使用的合適水質(zhì)和非水質(zhì)載體的例子包括水、乙醇、多元醇(如，甘油、丙二醇、聚乙二醇等)及其合適的混合物、植物油(如橄欖油)和可注射的有機酯如油酸乙酯?？梢岳缤ㄟ^使用包衣材料如卵磷脂、在分散體的情況下通過維持要求的粒度和通過使用表面活性劑，維持適宜的流動性。這些組合物也可以含有輔助劑如防腐劑、潤濕劑、乳化劑和分散劑?？梢酝ㄟ^上文的消毒方法和通過納入多種抗細菌劑和抗真菌劑例如尼泊金酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸等確保防止存在微生物。還可能想要將等滲劑如糖、氯化鈉等納入所述組合物。此外，可以通過納入延遲吸收的物質(zhì)如單硬脂酸鋁和明膠引起可注射藥物形式的延長吸收。

治療用途和其他用途

本發(fā)明的抗體具有涉及診斷和治療ccr6介導(dǎo)的疾病的多種體外和體內(nèi)診斷用途和治療用途。例如，可以將這些分子施用至體外或體內(nèi)培養(yǎng)的細胞或(例如體內(nèi))施用至人類受試者以治療、預(yù)防及診斷ccr6介導(dǎo)的多種病癥。優(yōu)選的受試者是人類并且包括具有ccr6活性介導(dǎo)的疾病(ccr6介導(dǎo)的疾病)的患者。本發(fā)明的中和抗體可以有效治療患者，無關(guān)于他們是否具有異常的ccr6狀態(tài)，如與幼稚t細胞群體相比，活化的t細胞群體中ccr6表達增加或記憶t細胞群體上ccr6表達增加或在th17t細胞群體上ccr6表達增加。更優(yōu)選的受試者是人類并且包括表達高水平ccr6的患者。

出于本發(fā)明目的，“患者”包括人類和其他動物，優(yōu)選地包括哺乳動物并且最優(yōu)選地包括人類。因此，本發(fā)明的抗體具有人類治療應(yīng)用和獸醫(yī)應(yīng)用。在本發(fā)明中，術(shù)語“治療”或“治療著”意在包括治療性療法、以及疾病或病癥的預(yù)防性或阻抑性措施。因此，例如，在疾病發(fā)作之前成功施用抗體導(dǎo)致疾病的治療。作為另一個例子，在疾病的臨床表現(xiàn)后成功施用抗體以減輕疾病癥狀構(gòu)成治療疾病。“治療”和“治療著”還涵蓋在疾病出現(xiàn)后施用抗體以根除疾病。在發(fā)作后和在臨床癥狀已經(jīng)出現(xiàn)后成功施用抗體，同時可能減輕臨床癥狀和或許改善疾病，構(gòu)成治療疾病。那些“需要治療的患者”包括已經(jīng)患有這種病狀或病癥的哺乳動物以及易于患有這種病狀或病癥的那些患者，包括其中待防止該疾病或病癥的那些患者。

在一個具體實施方案中，在體內(nèi)使用抗體以治療、防止或診斷ccr6介導(dǎo)的多種病癥。因此，本發(fā)明提供一種用于治療受試者中ccr6介導(dǎo)的疾病的方法，所述方法包括向受試者施用治療有效量的抗體或其片段。ccr6介導(dǎo)的示例性病癥包括但不限于炎性疾病和/或自身免疫性疾病，例如，炎性腸病(ibd)，包括潰瘍性結(jié)腸炎和節(jié)段性回腸炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、ms、1型和2型糖尿病、銀屑癬、銀屑病性關(guān)節(jié)炎、強直性脊柱炎、異位性皮炎；過敏反應(yīng)或狀況，例如包括哮喘和過敏性肺部炎癥；癌、動脈粥樣硬化、感染、神經(jīng)變性病、移植排異、移植物抗宿主病(gvhd)和心血管障礙/疾病。優(yōu)選地，ccr6介導(dǎo)的疾病包括炎性疾病和/或自身免疫性疾病，尤其包括炎性腸病(例如，潰瘍性結(jié)腸炎和節(jié)段性回腸炎)、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、ms和動脈粥樣硬化、慢性阻塞性肺病(copd)、視神經(jīng)炎、年齡相關(guān)性黃斑變性、sle、舍格倫綜合征、硬皮病、全身性硬化癥、慢性腎臟疾病、肝纖維化、結(jié)核病、特發(fā)性肺纖維化、結(jié)核病所致肺纖維化、腹膜后纖維變性、肺纖維化、囊性纖維化、心內(nèi)膜心肌纖維化、心房纖維化、縱膈纖維化、骨髓纖維變性(骨髓)、腹膜后纖維化、進行性大塊性纖維化、腎源性系統(tǒng)性纖維化、關(guān)節(jié)纖維化。

用本發(fā)明抗體待治療的優(yōu)選的ccr6介導(dǎo)的疾病選自炎性腸病、多發(fā)性硬化、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和哮喘。用本發(fā)明抗體待治療的特別優(yōu)選的ccr6介導(dǎo)的疾病是炎性腸病。

在一個實施方案中，本發(fā)明的抗體可以用來檢測ccr6的水平，或在其膜表面上含有ccr6的細胞的水平，所述水平可以隨后與某些疾病癥狀關(guān)聯(lián)。備選地，抗體可以用來抑制或阻斷ccr6功能，這轉(zhuǎn)而可以與預(yù)防或改善某些疾病癥狀關(guān)聯(lián)，因而提示ccr6作為該疾病的介體。這可以通過使樣品和對照樣品與抗ccr6抗體在允許抗體和ccr6之間形成復(fù)合物的條件下接觸來實現(xiàn)。檢測抗體和ccr6之間形成的任何復(fù)合物并且在樣品和對照中比較。鑒于本發(fā)明抗體對ccr6的特異性結(jié)合，本發(fā)明的抗體可以用來特異性檢測細胞表面上表達的ccr6，例如，可以用來檢測具有低或高ccr6表達水平的患者。本發(fā)明的抗體也可以用來借助免疫親和純化法純化ccr6。

在另一個實施方案中，可以對本發(fā)明的抗體初步測試與體外治療用途或診斷用途相關(guān)的結(jié)合活性。例如，可以使用流式細胞分析法測試本發(fā)明的組合物。

本公開進一步提供抗體或其片段作為藥物的用途和抗體或其片段在制備用于治療ccr6介導(dǎo)的疾病的藥物中的用途。在又一個實施方案中，本公開提供用作藥物的抗體或其片段。本公開還提供在治療ccr6介導(dǎo)的疾病方法中使用的抗體或其片段。ccr6介導(dǎo)的疾病是如上文描述的病癥。本發(fā)明的抗體或其片段可以特別用于治療與患者的共刺激狀態(tài)無關(guān)的ccr6介導(dǎo)的疾病。在一個優(yōu)選實施方案中，抗體或其片段可以用于治療ccr6介導(dǎo)的疾病，例如其中患者表達高水平的ccr6。

如先前所述，本發(fā)明的抗ccr6抗體可以隨一種或其多種他治療劑例如細胞毒性劑、放射毒性藥物或免疫抑制藥一起共施用?？贵w可以與所述藥物連接(如上文描述，作為免疫綴合物)或可以與所述藥物獨立地施用。在后一種情況下(獨立施用)，抗體可以在所述藥物之前、之后或與其同時施用或可以與其他已知的療法(例如抗癌治療，例如，放療法)共施用。

對于施用抗體，劑量是約0.0001至100mg/kg和更常見地0.01至10mg/kg宿主體重。示例性治療方案需要施用每周一次、每兩周一次、每三周一次、每四周一次、每月一次、每三個月一次或每三個月至六個月一次。通常在多種場合施用抗體。單次劑量之間的間隔期可以是例如每周、每月、每隔三個月或每年。間隔期也可以是不規(guī)則的，如通過測量患者中針對靶抗原的抗體的血液水平所指示。在一些方法中，調(diào)整劑量以實現(xiàn)約1-1000μg/ml的血漿抗體濃度，并且在一些方法中實現(xiàn)約25-300μg/ml的血漿抗體濃度。備選地，抗體可以作為持續(xù)釋放形式施用，在這種情況下需要較低施用頻率。根據(jù)抗體在患者中的半壽期變動劑量和頻率。施用的劑量和頻率可以根據(jù)治療是否為預(yù)防性或治療性而變動。在預(yù)防性應(yīng)用中，相對低的劑量以相對不頻繁的間隔期在長的時間范圍內(nèi)施用。一些患者繼續(xù)接受治療持續(xù)其余生。在治療性應(yīng)用中，有時需要在相對短的間隔期用相對高的劑量直至疾病的進展減少或終止。

可以改變本發(fā)明的藥物組合物中活性成分(即抗體)的實際劑量水平，以獲得活性成份的這種量，所述量就具體患者、組合物和施用方式而言可以有效達到想要的治療反應(yīng)，同時對患者無毒。選擇的劑量水平將取決于多種藥物代謝動力學(xué)因素，包括所用的本發(fā)明具體組合物的活性、施用途徑、施用時間、正在使用的具體抗體的排泄速率、治療的持續(xù)期、與所用具體組合物聯(lián)合使用的其他藥物、化合物和/或材料、正在治療的患者的年齡、性別、重量、狀況、總體健康和既往醫(yī)史等醫(yī)學(xué)領(lǐng)域熟知的因素。

本發(fā)明的抗ccr6抗體的“治療有效量”優(yōu)選地導(dǎo)致疾病癥狀的嚴重程度降低、無疾病癥狀期的頻率和持續(xù)時間增加和/或防止因疾病侵襲所致的損傷或致殘。可以在預(yù)示人類中功效的動物模型系統(tǒng)中評價化合物治療ccr6介導(dǎo)的疾病的能力。備選地，可以通過檢測化合物抑制細胞生長的能力評價組合物的這種特性，這種抑制作用可以通過熟練技術(shù)人員已知的測定法體外測量。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將能夠基于以下這類因素如受試者的體格大小、受試者癥狀的嚴重性和選擇的特定組合物或施用途徑，確定這類量。

本發(fā)明的抗體或組合物可以使用本領(lǐng)域已知的多種方法中的一種或多種方法，通過一種或多種施用途徑施用。如熟練技術(shù)人員將理解，施用的途徑和/或模式將取決于所想要的結(jié)果而變動。優(yōu)選的施用途徑包括靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下、脊柱或其他腸胃外施用途徑，例如通過注射或輸注。更優(yōu)選的施用途徑是靜脈內(nèi)或皮下。如本文所用，短語“腸胃外施用”意指除了腸內(nèi)和局部施用之外的施用模式，通常通過注射施用，并且包括但不限于靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、動脈內(nèi)、鞘內(nèi)、囊內(nèi)、眶內(nèi)、心內(nèi)、皮內(nèi)、腹膜內(nèi)、經(jīng)氣管、皮下、角皮下、關(guān)節(jié)內(nèi)、被膜下、蛛網(wǎng)膜下、椎管內(nèi)、硬膜外和胸骨的胸骨內(nèi)注射和輸注。備選地，本發(fā)明的抗體可以通過非腸胃外途徑，如局部、表皮或粘膜施用途徑，例如鼻內(nèi)、口服、陰道、直腸、舌下或局部地施用。

制造品和試劑盒

在本公開的另一個實施方案中，提供了制造品，其包含本發(fā)明的抗體或其片段、組合物或免疫綴合物，用于治療ccr6介導(dǎo)的疾病。該制造品可以包括容器和或在該容器上或與之結(jié)合的標簽或包裝插頁。合適的容器例如包括瓶、小瓶或注射器。容器可以從多種材料如玻璃或塑料中形成。該容器容納了有效治療所述病癥的組合物并且可以具有無菌接入口(例如，該容器可以是靜脈內(nèi)輸液袋或是具有皮下注射針頭可穿透的瓶塞的小藥瓶)。組合物中的至少一種活性物質(zhì)可以是本文所述的抗體。標簽或包裝插頁可以顯示組合物可以用于治療所選的病狀，如癌癥。在一個實施方案中，標簽或包裝插頁可以顯示包含抗體的組合物可以用來治療ccr6介導(dǎo)的疾病。

另外，制造品可以包含(a)其中含有組合物的第一容器，其中所述組合物包含本文的抗體；和(b)其中含有組合物的第二容器，其中所述組合物包含除抗體之外的治療劑。本公開的這個實施方案中的制造品還可以包含包裝插頁，所述包裝插頁指示第一和第二組合物可以聯(lián)合使用以治療ccr6介導(dǎo)的疾病或病癥。這種治療劑可以是在前述部分中描述的任何輔助治療劑(例如，溶栓劑、抗血小板藥、化療藥、抗血管生成藥、抗激素化合物、保心藥和/或哺乳動物中免疫功能的調(diào)節(jié)物，包括細胞因子)。備選地或額外地，該制造品可以還包含第二(或第三)容器，其包含可藥用的緩沖液，如抑菌注射用水(bwfi)、磷酸鹽緩沖鹽水、林格溶液和葡萄糖溶液。它可以還包括從商業(yè)和用戶觀點看受歡迎的其他材料、包括其他緩沖液、稀釋劑、濾器、針頭和注射器。

包含本發(fā)明的抗體、組合物或免疫綴合物和使用說明書的試劑盒也處于本發(fā)明的范圍內(nèi)。該試劑盒可以進一步含有一種或多種額外的試劑，如免疫抑制試劑、細胞毒性劑或放射毒性劑或一種或多種額外的本發(fā)明抗體(例如抗體，其具有與ccr6抗原上不同于第一抗體的表位結(jié)合的互補活性)。

在不進一步描述的情況下，認為使用前文描述和以下示意性實施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以制得并利用本公開的物質(zhì)并實施要求保護的方法。提供以下工作實施例以促進本公開的實施，并且不得解釋為以任何方式限制本公開的剩余部分。

實施例

實施例1：

建立穩(wěn)定地表達人ccr6的cho細胞和baf/3細胞

構(gòu)建體的克?。?/p>

人ccr6的基因訂購自imagenes(現(xiàn)稱sourcebioscienceslifesciences,nottingham,uk)。由imagenes賦予的構(gòu)建體名稱是iratp970e0757d?？寺∮冒休d體是pglex33[ires-rep]，其是具有表達盒受小鼠cmv啟動子控制的glenmark專利載體。多克隆位點(mcs)允許克隆目的基因ccr6。mcs(和因此，在最終構(gòu)建體中，ccr6的可讀框)后接ires和編碼報道蛋白(rep)的第二可讀框。

為了在pglex33[ires-rep]中克隆ccr6的可讀框(seqidno:101)，使用向可讀框5’和3’添加便利的限制性位點(nhei/clai)的特異性引物對(glnpr863和glnpr864)，使用構(gòu)建體iratp970e0757d作為pcr的模板。使用nhei/clai切割擴增子并將其克隆入pglex33[ires-rep]的主鏈，其中將所述主鏈使用相同的酶在mcs中切割并用cip處理以防止重新環(huán)化。所得到的構(gòu)建體命名為pglex33[ccr6-ires-rep]并通過測序證實(fasteris,日內(nèi)瓦,瑞士)。

cho[hsccr6]

將中國倉鼠卵巢細胞(cho-s，invitrogen，carlsbad，ca，美國)在補充有4mml-谷氨酰胺(applichem，德國)的powercho-2cd培養(yǎng)基(lonza,verviers，比利時)中懸浮培養(yǎng)并在搖床(200轉(zhuǎn)/分鐘，具有2.5cm圓形沖程)中于37℃、5％co2和80％濕度溫育。

使用接種密度0.5x10⁶個活細胞/ml，每3-4日在新鮮培養(yǎng)基中常規(guī)實施cho-s細胞的繼代培養(yǎng)。使用10ml培養(yǎng)基，在含有允許氣體交換的可透性濾器的50ml生物反應(yīng)器管(tubespinbioreactor50；tpp，trasadingen，瑞士)中培育細胞。使用臺盼藍細胞拒染法，用countess自動化細胞計數(shù)器(invitrogen，carlsbad，ca，美國)確定細胞生存力和濃度。對于cho-s細胞使用pcv管(tpp，trasadingen，瑞士)，通過細胞壓積法(pcv)確定細胞濃度。使用聚乙烯亞胺(pei；jetpei，polyplus-transfection，illkirch，法國)轉(zhuǎn)染cho-s細胞。pei是可以與帶負電荷的分子如dna復(fù)合的陽離子聚合物。帶正電荷的dna-pei復(fù)合物與帶負電荷的細胞表面結(jié)合并且由內(nèi)體內(nèi)化。它達到溶酶體區(qū)室，從這里它通過裂解釋放至胞核。dna-pei復(fù)合物的高轉(zhuǎn)染效率因pei保護dna免于溶酶體降解的能力所致。根據(jù)制造商提供的手冊轉(zhuǎn)染細胞。

同時共轉(zhuǎn)染將兩個質(zhì)粒，即表達目的基因以及報道基因的pglex33[ccr6-ires-rep]和表達針對選擇標記嘌呤霉素提供耐藥性的pac基因的第二載體。將兩種載體在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染之前線性化并且按照已知允許產(chǎn)生穩(wěn)定細胞群體的比率轉(zhuǎn)染。

轉(zhuǎn)染后當日，將細胞按不同濃度用選擇培養(yǎng)基稀釋并且分配入96孔平板，以產(chǎn)生將稱作微型匯集物的穩(wěn)定細胞群體。使用的選擇培養(yǎng)基是powercho-2，4mm谷氨酰胺，所述培養(yǎng)基按已知允許選擇穩(wěn)定細胞系的特定濃度補充嘌呤霉素。

在轉(zhuǎn)染后七日，通過添加選擇培養(yǎng)基至細胞更新選擇嚴格性。一旦96孔平板中的集落匯合，使用熒光讀數(shù)儀分析平板的報道基因表達。48個最高的表達者擴充成24孔平板規(guī)模。在這個規(guī)模，使用facs和人ccr6特異性抗體，測試細胞的人ccr6表達。5個克隆#12、16、25、37和47顯示最均一和最高的ccr6表達。將這些細胞進一步擴充供制備研究用細胞庫，每細胞庫10個冷凍管。將rcb在-80℃保存在蛋白質(zhì)表達和細胞系開發(fā)小組的細胞庫中。

ba/f3[ccr6]

ba/f3是一種很可能衍生自c3h小鼠的il-3依賴性鼠prob細胞系。該細胞以訂單號acc300購自dsmz(布倫瑞克，德國)。將細胞在t型瓶中使用ba/f3生長培養(yǎng)基(80％rpmi(vol./vol.)、10％熱滅活fcs(vol./vol.)、10％(vol./vol.)wehi-3b細胞系條件培養(yǎng)基(dsmz目錄編號acc26)常規(guī)培養(yǎng)并且在靜置培養(yǎng)箱(37℃、5％co2和80％濕度)中溫育。

使用接種密度0.1x10⁶個活細胞/ml，每3-4日在新鮮培養(yǎng)基中常規(guī)實施ba/f3細胞的繼代培養(yǎng)。將細胞在t-150培養(yǎng)瓶(tpp,trasadingen,瑞士)中使用20ml培養(yǎng)基培育。使用臺盼藍細胞拒染法，用countess自動化細胞計數(shù)器(invitrogen，carlsbad，ca，美國)確定細胞生存力和濃度。

使用neon裝置(lifetechnologies,carlsbad,ca)使用電穿孔法進行ba/f3細胞的轉(zhuǎn)染。使用neon裝置手冊中提供的說明書，優(yōu)化電穿孔條件(脈沖數(shù)、脈沖時長、電壓)。

同時共轉(zhuǎn)染兩種質(zhì)粒，即表達目的基因以及報道基因的pglex33[ccr6-ires-rep]和表達針對選擇標記嘌呤霉素提供耐藥性的pac基因的第二載體。將兩種載體在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染之前線性化并且按照已知允許產(chǎn)生穩(wěn)定細胞群體的比率轉(zhuǎn)染。

將細胞按不同濃度稀釋于生長培養(yǎng)基中并分配入96孔平板中。次日，向細胞添加另一個體積的選擇培養(yǎng)基。所用的選擇培養(yǎng)基是補充有嘌呤霉素的ba/f3生長培養(yǎng)基。已知按不同濃度稀釋的ba/f3細胞及嘌呤霉素處理的組合允許選擇穩(wěn)定的細胞系

一旦96孔平板中的集落匯合，使用熒光讀數(shù)儀分析平板的報道基因表達。96個最高的表達者擴充成24孔平板規(guī)模。在這個規(guī)模，使用facs和人ccr6特異性抗體，測試細胞的人ccr6表達。5個克隆#7、17、21和48顯示最均一和最高的ccr6表達。將這些細胞進一步擴充供制備研究用細胞庫，每細胞庫10個冷凍管。將rcb在-80℃保存在蛋白質(zhì)表達和細胞系開發(fā)小組的細胞庫中。

>glnpr863seqidno:99

gaggctagccaccatgagcggggaatcaatgaa

>glnpr864seqidno:100

aggggcatcgattcacatagtgaaggacgacgc

>hsccr6seqidno:101

atgagcggggaatcaatgaatttcagcgatgttttcgactccagtgaagattattttgtgtcagtcaatacttcatattactcagttgattctgagatgttactgtgctccttgcaggaggtcaggcagttctccaggctatttgtaccgattgcctactccttgatctgtgtctttggcctcctggggaatattctggtggtgatcacctttgctttttataagaaggccaggtctatgacagacgtctatctcttgaacatggccattgcagacatcctctttgttcttactctcccattctgggcagtgagtcatgccaccggtgcgtgggttttcagcaatgccacgtgcaagttgctaaaaggcatctatgccatcaactttaactgcgggatgctgctcctgacttgcattagcatggaccggtacatcgccattgtacaggcgactaagtcattccggctccgatccagaacactaccgcgcagcaaaatcatctgccttgttgtgtgggggctgtcagtcatcatctccagctcaacttttgtcttcaaccaaaaatacaacacccaaggcagcgatgtctgtgaacccaagtaccagactgtctcggagcccatcaggtggaagctgctgatgttggggcttgagctactctttggtttctttatccctttgatgttcatgatattttgttacacgttcattgtcaaaaccttggtgcaagctcagaattctaaaaggcacaaagccatccgtgtaatcatagctgtggtgcttgtgtttctggcttgtcagattcctcataacatggtcctgcttgtgacggctgcaaatttgggtaaaatgaaccgatcctgccagagcgaaaagctaattggctatacgaaaactgtcacagaagtcctggctttcctgcactgctgcctgaaccctgtgctctacgcttttattgggcagaagttcagaaactactttctgaagatcttgaaggacctgtggtgtgtgagaaggaagtacaagtcctcaggcttctcctgtgccgggaggtactcagaaaacatttctcggcagaccagtgagaccgcagataacgacaatgcgtcgtccttcactatgtgaa

小鼠抗人ccr6抗體的產(chǎn)生和篩選

將人ccr6轉(zhuǎn)染的cho細胞和baf細胞用pbs洗滌并重懸于pbs中。對于首次免疫，將ccr6轉(zhuǎn)染的cho細胞轉(zhuǎn)移至0.5ml胰島素注射器(bdpharmingen,allschwil,瑞士)并且用10x10⁶個轉(zhuǎn)染的細胞在后足墊、尾根和頸部皮下免疫balb/c動物(harlan,荷蘭)。兩周后遵循相同的注射途徑，用ccr6轉(zhuǎn)染的baf重復(fù)免疫。

使用轉(zhuǎn)染的baf細胞和作為陰性對照的baf模擬，通過流式細胞術(shù)評價免疫小鼠血清中循環(huán)型抗人ccr6抗體的存在。將不同小鼠血清的系列稀釋物(從1:100至1:109)添加至細胞，并且使用pe標記的山羊抗小鼠igg第二抗體(bdbiosciences,allschwil,瑞士)檢測結(jié)合的抗體。在處死前三天，在展示最佳抗人ccr6igg血清滴度的動物中用1x10⁶個ccr6轉(zhuǎn)染的baf細胞進行末次皮下強化免疫。

使動物安樂死并且采集腹股溝淋巴結(jié)、腋淋巴結(jié)、肱淋巴結(jié)、腘淋巴結(jié)和坐骨淋巴結(jié)以通過在dna酶(rochediagnostics(schweiz)ag,rotkreuz,瑞士)和膠原酶(rochediagnostics(schweiz)ag,rotkreuz,瑞士)溶液中用二根25g針破壞淋巴結(jié)結(jié)構(gòu)，制備單細胞懸液。將單細胞懸液與骨髓瘤細胞系x63ag8.653(小鼠balb/c骨髓瘤細胞系；atcc登錄號：crl1580；kearneyjf等人,(1979)j.immunol.123(4):1548-1550)按7:1的比率(融合配偶體對收獲的淋巴結(jié)細胞)用聚乙二醇1500(rochediagnostics(schweiz)ag,rotkreuz,瑞士)融合。將融合細胞鋪種入含有小鼠巨噬細胞的96孔平底平板的dmem-10培養(yǎng)基(invitrogenag,巴賽爾,瑞士)中，所述培養(yǎng)基補充有10％胎牛血清(fbs,paalaboratories,pasching,奧地利)、2mml-谷氨酰胺、100u/ml(biochromag,德國)青霉素、100μg/ml鏈霉素(biochromag,德國)、10mmhepes(invitrogenag,巴賽爾,瑞士)、50μmβ-巰基乙醇(sigma-aldrichchemiegmbh,buchs,瑞士)、hat(sigma-aldrichchemiegmbh,buchs,瑞士)和1％生長因子(hybridokine,interchim/uptima,法國)。

針對識別人ccr6的小鼠igg的存在，通過facs篩選來自融合物的大約800個孔。將陽性孔擴充并進行兩輪亞克隆。收集細胞，并且克隆重鏈和輕鏈并測序。

實施例2：

來自雜交瘤細胞的抗ccr6抗體vh鏈和vl鏈的克隆和測序

從雜交瘤分離rna、逆轉(zhuǎn)錄成cdna，并且通過pcr擴增vh基因和vl基因。將這些pcr產(chǎn)物連接入拯救載體，從而允許對各個pcr產(chǎn)物測序并確定雜交瘤的單克隆性或多克隆性。當不存在插入物時，用于此目的pdrive載體(qiagen,德國)編碼laczα-肽。這允許在含有iptg和x-gal的lb瓊脂平板(無插入物的菌落因為laczα肽降解x-gal而為藍色)上進行藍色/白色選擇。擴增白色菌落并進行微量制備以分離質(zhì)粒，采用在載體上復(fù)性的標準引物(m13rev、m13fwd、t7或sp6)對所述質(zhì)粒測序。使用三種不同的軟件：geneious、clonemanager和bioedit分析序列。隨后將獲得的序列亞克隆入表達載體以重組表達目的抗體。

1.rna分離

使用來自macherey-nagel(德國，目錄號740955)的nucelosspinrnaii試劑盒遵循生產(chǎn)商的操作方案(采用600μlra1緩沖液，除均化柱和60μl洗脫用無rna酶的h2o(隨試劑盒提供)之外，還均化注射器)，從2-10x10⁶個細胞分離來自雜交瘤的總rna。

使用nanodropnd-1000分光光度計(thermofischerscientific,美國)，對rna制備物的產(chǎn)率定量。

2.一步rt-pcr

將上文描述的總rna制備物進一步逆轉(zhuǎn)錄成cdna，并且使用簡并引物的二種不同混合物(每種混合物允許回收小鼠免疫球蛋白重鏈可變片段和可變重鏈交界區(qū)域的全部不同亞家族或回收全部小鼠免疫球蛋白輕鏈κ可變片段和可變輕鏈κ交界區(qū)域)，通過pcr擴增vh和vl片段。使用qiagen一步rt-pcr試劑盒(qiagen，德國，目錄號210212)，同時進行逆轉(zhuǎn)錄和pcr擴增。由于該技術(shù)使用特異性引物，所以每份mrna樣品隨后一式兩份處理，從而允許獨立逆轉(zhuǎn)錄和擴增vh片段或vl片段。

將溶解于無rna酶水至終體積30μl的2μg總rna與10μl5x母液qiagenonesteprt-pcr緩沖液、濃度為10mm的2μldntp混合物、濃度為10μm的3μl引物混合物及2μlqiagenonesteprt-pcr酶混合物進行混合。將最終溶液置于pcr管中并且使用以下設(shè)定在pcr熱循環(huán)儀(bioradicycler版本4.006,biorad,美國)中循環(huán)：

50℃30分鐘

95℃15分鐘

40個循環(huán)：94℃30秒

55℃30秒

72℃1分鐘

72℃10分鐘

在4℃保持

3.pdrive克隆

將pcr產(chǎn)物加載于2％瓊脂糖凝膠上并且從凝膠切下目的產(chǎn)物(約450bp)，并使用macherey-nagelnuclospin凝膠和pcrclean-up試劑盒(德國，目錄號740609)純化。對于dna測序，將提取的pcr產(chǎn)物克隆入拯救載體(pdrive載體，qiagen，德國，目錄號231124)并轉(zhuǎn)化入大腸桿菌top10感受態(tài)細胞(invitrogenag，巴賽爾，瑞士，目錄號c404006)。

微量制備提取

將陽性菌落在mn方孔塊(macherey-nagel，德國，目錄號740488)的1.5mllb+100μg/ml氨芐青霉素中擴增并且使用nucleospin96質(zhì)粒試劑盒(macherey-nagel，德國，目錄號740625)進行微量制備提取。

4.測序

將樣品送至dna測序服務(wù)公司fasteris(plan-les-ouates，瑞士)，以便用標準引物m13rev、m13fwd、t7或sp6進行dna測序。

5.序列分析

geneious、clonemanager9專業(yè)版和bioedit序列比對編輯器(hall,t.a.1999.bioedit:auser-friendlybiologicalsequencealignmenteditorandanalysisprogramforwindows95/98/nt.nucl.acids.symp.ser.41:95-98)用于分析序列。

6.表達重組嵌合抗體的表達載體的克隆

為了在哺乳動物細胞中重組表達，使用基于裝配的pcr方法，將分離的鼠vh片段和vl片段安排成嵌合免疫球蛋白。這些嵌合抗體由其中鼠重鏈可變結(jié)構(gòu)域與人igg1重鏈恒定域(γ1區(qū)、鉸鏈區(qū)、γ2區(qū)和γ3區(qū))融合的重鏈和其中鼠輕鏈可變結(jié)構(gòu)域與人κ恒定域(cκ)融合的輕鏈組成。將全部嵌合抗體克隆入內(nèi)部哺乳動物表達載體pglex18載體供在hek-293(atcc編號：crl-1573)中表達和瞬時轉(zhuǎn)染。

通過重疊pcr產(chǎn)生第一批嵌合體(對于hc和lc)。通過pcr擴增可變部分和恒定部分并且隨后通過第二pcr反應(yīng)融合在一起。隨后在bspei限制性位點上游含有前導(dǎo)肽的一個內(nèi)部載體中，使用bspei/noti，符合可讀框地克隆它們。使用hindiii/xhoi(對于lc)或hindiii/xbai(對于hc)，將所產(chǎn)生的編碼序列(前導(dǎo)肽、可變部分、恒定部分)亞克隆入pglex18表達載體。在重疊pcr期間在抗體的可變部分和恒定部分之間添加限制性位點rsrii(對于lc)和bbvci(對于hc)。對于下一批嵌合體，通過pcr擴增vl和vh并且使用bspei/rsrii(對于lc)和bspei/bbvci(對于hc)，符合可讀框地直接克隆入含有前導(dǎo)肽和相應(yīng)恒定部分的pglex18主鏈。

用于逆轉(zhuǎn)錄和擴增的引物由microsynth(balgach，瑞士)合成并經(jīng)hplc純化。可以在表1中找到引物序列。

表1

引物混合物vh反向100um(來自100um母液)(seqidno:102–120)

引物混合物vh正向100um(來自100um母液)(seqidno:121–124)

引物混合物vl反向100um(來自100um母液)(seqidno:125–144)

引物混合物vl反向100um(來自100um母液)(seqidno:145–148)

使用如表2中所示的以下測序引物：

表2：

實施例3：

抗人ccr6抗體的生物學(xué)特征

通過流式細胞術(shù)檢測ccr6特異性抗體

通過流式細胞術(shù)確定雜交瘤的抗體滴度、特異性和產(chǎn)量以及確定重組抗體候選物。簡而言之，培養(yǎng)人ccr6轉(zhuǎn)染的baf細胞(這些轉(zhuǎn)染細胞的產(chǎn)生詳述于實施例1中)并且將2×10⁵個細胞分配在96孔v底平板(tpp,trasadingen,瑞士)中，并且以1300轉(zhuǎn)/分鐘離心三分鐘；棄去上清液，將細胞收集并如下文描述通過流式細胞術(shù)分析。將細胞重懸于50μl雜交瘤上清液中或50μl含5μg/ml同種型對照或商業(yè)小鼠抗人ccr6抗體(克隆11a9，bdbiosciences,allschwil,瑞士)的facs緩沖液(pbs，2％fbs，10％versene(invitrogen，美國))中。將細胞在冰上溫育30分鐘，洗滌兩次并重懸于50μlfacs緩沖液中。1/200稀釋的抗小鼠igg-藻紅蛋白-pe(bdbiosciences,allschwil,瑞士)用來檢測ccr6特異性小鼠雜交瘤和同種型對照抗體。將細胞在冰上溫育15分鐘，洗滌一次并重懸于400μlfacs緩沖液中，并且在facs儀(cyan,beckmancoulterinternationals.a.,nyon,瑞士)上分析。圖1顯示多種克隆的親本雜交瘤上清液識別在轉(zhuǎn)染的baf細胞表面上表達的人ccr6蛋白(圖1a)，但是不識別在baf模擬細胞表面上表達的人ccr6蛋白(圖1b)。

選擇4h11，因為在全部選擇的重組候選物(n＝5)當中，就雜交瘤穩(wěn)定性及更好的功能特性而言，它顯示超過其他候選物的優(yōu)越特性。

在discoverx生物測定法中4h11嵌合抗體抵消ccr6介導(dǎo)的細胞活化

為了確定當激活ccr6受體時，嵌合4h11是否抵消β-停止蛋白的召集作用，根據(jù)生產(chǎn)商的說明書，使用abhunter抗ccr6試劑盒(discoverx公司，birmingham，uk)評估生物測定法。使用微量平板讀數(shù)儀(biotek,美國；分銷商：wittecag,littau,瑞士)，讀取化學(xué)發(fā)光活性。在該測定法中，嵌合4h11以5個不同濃度(20、6.7、2、0.7和0.2μg/ml)使用。分別使用20μg/ml的嵌合igg1同種型對照和抗ccl20(r&dsystems,minneapolis,美國)作為陰性對照和陽性對照。在使用嵌合igg1同種型對照作為100％發(fā)光活性的條件下，考慮化學(xué)發(fā)光信號時計算相對發(fā)光單位(rlu)百分數(shù)。圖2a顯示與同種型匹配的對照相比，嵌合4h11以劑量依賴性方式顯著地減少ccr6受體信號傳導(dǎo)。此外，嵌合4h11在低濃度(0.2μg/ml)仍有活性。

抑制ccl20誘導(dǎo)的表達ccr6的baf細胞移行

實施例1中詳述了產(chǎn)生人ccr6轉(zhuǎn)染的baf細胞。測試了嵌合4h11抵消人ccr6轉(zhuǎn)染的baf細胞響應(yīng)于人ccl20而移行的能力。簡而言之，將以1x10⁶個細胞/ml稀釋的100μlbaf-ccr6與3個劑量的嵌合4h11(10、2和0.4μg/ml)預(yù)溫育并添加到含8.0μm孔聚碳酸酯膜插入物[corning,chemiebrunschwigag,瑞士]的6.5mm上室。transwell的下室含有以10ng/ml稀釋于500μlbaf培養(yǎng)基(含有10％fcs(amimed，由bioconcept分銷,allschwil,瑞士)的rpmi-1640(sigma-aldrichchemiegmbh,巴塞爾,瑞士))中的重組人ccl20(r&dsystems)。在溫育后，從下室和上室收獲細胞并且使用guavaeasycyteht(milliporeag,zug,瑞士)計數(shù)。分別使用10μg/ml的嵌合igg1同種型和抗ccl20(r&dsystems)作為陰性對照和陽性對照。通過下室中的細胞數(shù)目除以上室和下室中的細胞總數(shù)，計算移行率。抑制移行的百分數(shù)計算為對同種型對照所觀察到的抑制移行的百分數(shù)。圖2b表明與同種型對照相比，嵌合4h11減少人ccl20誘導(dǎo)的bafccr6細胞移行，甚至在0.4μg/ml也是如此。

實施例4：

依據(jù)流式細胞術(shù)，4h11候選物在人和其他動物物種外周血單個核細胞(pbmc)上的結(jié)合

人細胞

含有人白細胞的濾器采集自瑞士lachaux-de-fonds的血液采集中心(centredetransfusionsanguineetlaboratoiredesérologie,ruesophie-mairet29,ch-2300)。通過60ml含有10u/ml肝素(liquemin)(drossapharmag,lucern,瑞士)的pbs反沖洗從濾器取下細胞。隨后遵循生產(chǎn)商的說明書，用50ml血液分離濾管(brunschwig，巴賽爾，瑞士)純化pbmc。將細胞用含fbs(paalaboratories,pasching,奧地利)的羅斯維爾公園紀念學(xué)院(rpmi,paalaboratories,pasching,奧地利)培養(yǎng)基洗滌3次。計數(shù)細胞并且將2×10⁵個細胞分配在96孔v底平板(tpp,trasadingen,瑞士)中，并且以1300轉(zhuǎn)/分鐘離心三分鐘；將細胞收集并如下文描述通過流式細胞術(shù)分析。

將如上述制備的人pbmc細胞重懸于50μl含10μg/ml嵌合4h11抗體、10μg/ml或適宜同種型對照或10μg/ml商業(yè)抗人ccr6抗體(克隆r6h9，ebioscience，維也納，奧地利)的facs緩沖液(pbs，2％fbs，10％versene(invitrogen，美國))中。將細胞在冰上溫育30分鐘，洗滌一次并重懸于50μlfacs緩沖液中。1/200稀釋的抗人igg-藻紅蛋白-pe和抗小鼠igg-藻紅蛋白-pe(bdbiosciences,allschwil,瑞士)分別用來檢測嵌合4h11抗體和商業(yè)抗人ccr6抗體。將細胞在冰上溫育15分鐘，洗滌一次并重懸于400μlfacs緩沖液中，并且在facs儀(cyan,beckmancoulterinternationals.a.,nyon,瑞士)上分析。

食蟹猴原代細胞

在檸檬酸鹽管(bdbiosciences,allschwil,瑞士)中收集來自食蟹猴(從瑞士弗里堡州弗里堡大學(xué)神經(jīng)生理學(xué)實驗室ericrouiller教授獲得)的全血。2mlpbs與3ml血液混合并且將混合物鋪在10ml85:15ficoll:pbs混合物(gehealthcareeuropegmbh,glattbrugg,瑞士)的頂部上。將樣品在室溫不停地離心20分鐘。收集pbmc層并用pbs洗滌3次。細胞重懸于dulbecco改良eagle培養(yǎng)基(dmem,paalaboratories,pasching,奧地利)、10％fbs(paalaboratories,pasching,奧地利)、非必需氨基酸(paalaboratories,pasching,奧地利)、1mm丙酮酸鈉(paalaboratories,pasching,奧地利)，2mmultraglutamine(lonza,比利時)、100u/ml青霉素(biochromag,德國)、100μg/ml鏈霉素(biochromag,德國)中。計數(shù)細胞并且將2×10⁵個細胞分配在96孔v底平板(tpp,trasadingen,瑞士)中，并且以1300轉(zhuǎn)/分鐘離心三分鐘。將嵌合4h11、同種型對照或商業(yè)抗人ccr6非人靈長類交叉反應(yīng)性抗體(克隆11a9，bdpharmingen,allschwil,瑞士)按10μg/ml添加至各孔。洗滌細胞，并且按1/200在facs緩沖液中稀釋的抗人igg-藻紅蛋白-pe和抗小鼠igg-藻紅蛋白-pe(bdbiosciences,allschwil,瑞士)分別用來檢測嵌合4h11抗體和商業(yè)抗人ccr6抗體。將細胞在冰上溫育15分鐘，洗滌一次并重懸于400μlfacs緩沖液中，并且在facs儀(cyan,beckmancoulterinternationals.a.,nyon,瑞士)上分析。圖3顯示，嵌合4h11能夠識別在人淋巴細胞(圖3a)和食蟹猴淋巴細胞(圖3b)的表面上表達的ccr6受體，因此提供藥物開發(fā)迫切所需的交叉反應(yīng)性特性。

實施例5：ccr6表位繪制研究

評估這項研究以鑒定人ccr6序列(hsccr6)中對嵌合4h11mab結(jié)合作用重要的小區(qū)域和各個氨基酸。由于嵌合4h11不識別小鼠ccr6受體(mmccr6)，使用人-小鼠雜合分子(其中人ccr6受體的n端區(qū)域和胞外環(huán)被小鼠等同區(qū)域替換)的線性方法用來確定這種mab的表位。

產(chǎn)生小鼠-人雜合ccr6突變體。

稱作hsccr6/mmecl1的第一突變體對應(yīng)于這樣的hsccr6序列，其中氨基酸105至119(hsccr6的胞外環(huán)1)由mmccr6序列的氨基酸97至111替換(mmccr6的胞外環(huán)1)。稱作hsccr6/mmecl2的第二突變體對應(yīng)于這樣的hsccr6序列，其中氨基酸181至211(hsccr6的胞外環(huán)2)由mmccr6序列的氨基酸173至203替換(mmccr6的胞外環(huán)2)。稱作hsccr6/mmecl3的第三突變體對應(yīng)于這樣的hsccr6序列，其中氨基酸280至303(hsccr6的胞外環(huán)3)由mmccr6序列的氨基酸272至295替換(mmccr6的胞外環(huán)3)。

對于第一突變體hsccr6/mmecl1，通過融合pcr(使用3次pcr)，將hsecl1序列替換為mmecl1序列。

使用hsccr6作為模板(gsd491)、正向引物glnpr1778(含有nhei限制性位點和hsccr6序列的起始)和反向引物glnpr1947(含有hsccr6在hsecl1之前的24bp和mmecl1的前34bp)，進行第一pcr(pcr1)。

使用hsccr6作為模板(gsd491)、正向引物glnpr1948(含有mmecl1的最后33bp和hsccr6在hsecl1之后的25bp)和反向引物glnpr1779(含有hsccr6序列的末端和xhoi限制性位點)，與第一pcr平行地進行第二pcr(pcr2)。

使用pcr1和pcr2作為模板(重疊22bp)和glnpr1778和glnpr1779作為正向引物和反向引物，進行第三pcr(pcr3)。

對于第二突變體hsccr6/mmecl2，通過融合pcr(使用3次pcr)，將hsecl2序列替換為mmecl2序列。

使用hsccr6作為模板(gsd491)、正向引物glnpr1778(含有nhei限制性位點和hsccr6序列的起始)和反向引物glnpr1949(含有hsccr6在hsecl2之前的28bp和mmecl2的前54bp)，進行第一pcr(pcr1)。

使用hsccr6作為模板(gsd491)、正向引物glnpr1950(含有mmecl2的最后57bp和hsccr6在hsecl2之后的25bp)和反向引物glnpr1779(含有hsccr6序列的末端和xhoi限制性位點)，與第一pcr平行地進行第二pcr(pcr2)。

使用pcr1和pcr2作為模板(重疊18bp)和glnpr1778和glnpr1779作為正向引物和反向引物，進行第三pcr(pcr3)。

對于第三突變體hsccr6/mmecl3，通過融合pcr(使用3次pcr)，將hsecl3序列替換為mmecl3序列。

使用hsccr6作為模板(gsd491)、正向引物glnpr1778(含有nhei限制性位點和hsccr6序列的起始)和反向引物glnpr1951(含有hsccr6在hsecl3之前的25bp和mmecl3的前46bp)，進行第一pcr(pcr1)。

使用hsccr6作為模板(gsd491)、正向引物glnpr1952(含有mmecl3的最后44bp和hsccr6在hsecl3之后的27bp)和反向引物glnpr1779(含有hsccr6序列的末端和xhoi限制性位點)，與第一pcr平行地進行第二pcr(pcr2)。

使用pcr1和pcr2作為模板(重疊18bp)和glnpr1778和glnpr1779作為正向引物和反向引物，進行第三pcr(pcr3)。

對于全部三種突變體，使用單一限制性位點nhei和xhoi，將pcr產(chǎn)物插入pt1載體(gsd980)。隨后將dna轉(zhuǎn)化入大腸桿菌細菌并鋪在氨芐青霉素平板上。次日，每種突變體選擇2-4個克隆，提取它們的dna并送至fasteris供測序?；跍y序結(jié)果，每種突變體選擇一個克隆，對于突變體pt1-hsccr6/mmecl1，選擇gsb202，對于突變體pt1-hsccr6/mmecl2，選擇gsb208，并且對于突變體pt1-hsccr6/mmecl3，選擇gsb206。

對全部三種突變體進行微量制備以在hek細胞中進行瞬時轉(zhuǎn)染。

引物序列：

glnpr1778:gatcgctagccaccatgagcggggaatcaatgaa(seqidno:153)

glnpr1779:gatcctcgagtcatcacatagtgaaggacgacg(seqidno:154)

glnpr1947:

catcgctgaaaacccaagtgttggtggcatgagtcactgcccagaatgggagagtaag(seqidno:155)

glnpr1948:

aacacttgggttttcagcgatgcactgtgtaaattgctaaaaggcatctatgccatca(seqidno:156)

glnpr1949:

ctcacagacatcacgatcctgcagctcgtatttcttgttgaagataaatgtagggctggagatgatgactgacagcccccac(seqidno:157)

glnpr1950:gatcgtgatgtctgtgagccacggtacaggtctgtctcagagcccatcacgtggaagctgctgatgttggggcttgagctac(seqidno:158)

glnpr1951:cgaggactttctcggtgctgcagctccggcccactttgcccgtgtttgcagccgtcacaagcaggaccatg(seqidno:159)

glnpr1952:

gcaccgagaaagtcctcgcctacaccaggaacgtggccgaggtcctggctttcctgcactgctgcctgaac(seqidno:160)

生成兩種其他的人/小鼠突變體：突變體4由含有小鼠n端區(qū)域的人ccr6受體組成，而突變體5對應(yīng)于含有人n端區(qū)域的小鼠ccr6受體。

稱作hsccr6/mmn-term的突變體4對應(yīng)于這樣的hsccr6序列，其中氨基酸1至47(hsccr6n端直至第一跨膜結(jié)構(gòu)域)由mmccr6序列的氨基酸1至39(mmccr6n端直至第一跨膜結(jié)構(gòu)域)替換。稱作mmccr6/hsn-term的突變體5對應(yīng)于這樣的mmccr6序列，其中氨基酸1至39(mmccr6n端直至第一跨膜結(jié)構(gòu)域)由hsccr6序列的氨基酸1至47(hsccr6n端直至第一跨膜結(jié)構(gòu)域)替換。

對于突變體hsccr6/mmn-term，通過融合pcr(使用3次pcr)，將hsn-term序列替換為mmn-term序列。

使用mmccr6作為模板(gsd363)、正向引物glnpr866(含有nhei限制性位點和mmccr6序列的起始)和反向引物glnpr1983(含有mmn-term序列的末端和hsccr6第一跨膜結(jié)構(gòu)域的起始)，進行第一pcr(pcr1)。

使用hsccr6作為模板(gsd491)、正向引物glnpr1984(含有mmn-term序列的末端和hsccr6第一跨膜結(jié)構(gòu)域的起始)和反向引物glnpr1779(含有hsccr6序列的末端和xhoi限制性位點)，與第一pcr平行地進行第二pcr(pcr2)。

使用pcr1和pcr2作為模板(重疊40bp)和glnpr866和glnpr1779作為正向引物和反向引物，進行第三pcr(pcr3)。

對于突變體mmccr6/hsn-term，通過融合pcr(使用3次pcr)，將mmn-term序列替換為hsn-term序列。

使用hsccr6作為模板(gsd491)、正向引物glnpr1778(含有nhei限制性位點和hsccr6序列的起始)和反向引物glnpr1985(含有hsn-term序列的末端和mmccr6第一跨膜結(jié)構(gòu)域的起始)，進行第一pcr(pcr1)。

使用mmccr6作為模板(gsd363)、正向引物glnpr1986(含有hsn-term序列的末端和mmccr6第一跨膜結(jié)構(gòu)域的起始)和反向引物glnpr1987(含有mmccr6序列的末端和xhoi限制性位點)，與第一pcr平行地進行第二pcr(pcr2)。

使用pcr1和pcr2作為模板(重疊33bp)和glnpr1778和glnpr1987作為正向引物和反向引物，進行第三pcr(pcr3)。

對于突變體4和5，使用單一限制性位點nhei和xhoi，將pcr產(chǎn)物插入pt1載體(gsd980)。隨后將dna轉(zhuǎn)化入大腸桿菌細菌并鋪在氨芐青霉素平板上。次日，每種突變體選擇4個克隆，提取它們的dna并送至fasteris供測序?；跍y序結(jié)果，每種突變體選擇一個克隆，對于突變體pt1-hsccr6/mmn-term，選擇gsb210，并且對于突變體pt1-mmccr6/hsn-term，選擇gsb215。

使用baf細胞，對兩種突變體進行大量制備以建立穩(wěn)定的細胞系。

引物序列：

glnpr866:agaggctagccaccatgaattccacagagtccta(seqidno:161)

glnpr1983:caaggagtaggcaatcggtacaaataccttggtgaagtttctgac(seqidno:162)

glnpr1984:aaacttcaccaaggtatttgtaccgattgcctactccttgatctg(seqidno:163)

glnpr1779:gatcctcgagtcatcacatagtgaaggacgacg(seqidno:154)

glnpr1778:gatcgctagccaccatgagcggggaatcaatgaa(seqidno:153)

glnpr1985:caattggcacaaatagcctggagaactgcctgacctcctg(seqidno:164)

glnpr1986:tcaggcagttctccaggctatttgtgccaattgcctactc(seqidno:165)

glnpr1987:ccgcgatcctcgagtcattacatggtaaaggacgatgcattatca(seqidno:166)

下表3中顯示全部上述5種突變體的總結(jié)：

表3：用于表位繪制的人/小鼠ccr6雜合突變體的總結(jié)

n端

hsccr6–seqidno:71,mmccr6–seqidno:72,hsccr6/mmecl1-seqidno:13,hsccr6/mmecl2–seqidno:15,hsccr6/mmecl3–seqidno:17,hsccr6/mmn-term–seqidno:168,mmccr6/hsn-term–seqidno:170.

流式細胞術(shù)

使用流式細胞術(shù)評估m(xù)ab與ccr6轉(zhuǎn)染的cho細胞的表面結(jié)合。將2×10⁵個細胞分配在96孔v底平板中，并且以1300轉(zhuǎn)/分鐘離心三分鐘。將細胞收集并且在facs緩沖液中以50μl體積與終濃度10μg/ml的適宜mab溫育。將細胞在冰上溫育30分鐘，洗滌兩次并重懸于50μl按1/200在facs緩沖液中稀釋的pe標記的第二抗體中。將細胞在冰上溫育15分鐘，洗滌一次并重懸于400μlfacs緩沖液中，并且在facs儀(cyan,beckmancoulterinternationals.a.,nyon,瑞士)上在通道fl-2中分析。圖4中的facs分析顯示，ccr6的小鼠-人雜合突變體在細胞表面上正確表達，因為全部轉(zhuǎn)染子均由商業(yè)抗小鼠或抗人ccr6抗體識別。如圖4中所示，嵌合4h11mab識別含有人n端區(qū)域的全部雜合突變體(圖4a、d、e和f)，而它不與含有小鼠n端區(qū)域的嵌合構(gòu)建體結(jié)合(圖4c)，從而顯示人ccr6n端區(qū)域是ccr6和嵌合4h11mab之間相互作用必需的。

為了鑒定ccr6n端區(qū)域上對嵌合4h11mab的結(jié)合重要的關(guān)鍵殘基，生成n端區(qū)域內(nèi)部的兩個其他突變體。

在ccr6n端區(qū)域中產(chǎn)生小鼠-人雜合突變體

目標是將小鼠ccr6(mmccr6)的n端序列內(nèi)部的兩個小區(qū)域(“區(qū)段”)替換為它們的人類(hsccr6)對應(yīng)物，并且通過facs評價嵌合4h11抗體對這些雜合構(gòu)建體的結(jié)合活性。

鑒定了兩個不同位置并命名為區(qū)段1(從氨基酸3至11)(mmccr6)和區(qū)段2(從氨基酸8至16)。稱作mmccr6區(qū)段1hsccr6的第一突變體對應(yīng)于這樣的mmccr6序列，其中氨基酸3至11由hsccr6序列的氨基酸21至27替換。稱作mmccr6區(qū)段2hsccr6的第二突變體對應(yīng)于這樣的mmccr6序列，其中氨基酸8至16由hsccr6序列的氨基酸29至35替換。

對于突變體“區(qū)段1”，使用mmccr6作為模板(gsd363a)和引物glnpr2188(含有hsccr6序列和nhei限制性位點)和引物glnpr2189(含有終止密碼子和xhoi限制性位點)，通過pcr，將mmccr6序列替換為hsccr6序列。

對于突變體“區(qū)段2”，使用mmccr6作為模板(gsd363a)，通過融合pcr，將mmccr6序列替換為hsccr6序列。引物glnpr2190(含有起始密碼子和nhei限制性位點)和引物glnpr2191(含有hsccr6序列)用來產(chǎn)生第一產(chǎn)物。同時，引物glnpr2192(含有hsccr6序列)和引物glnpr2193(含有終止密碼子和xhoi限制性位點)用來產(chǎn)生第二產(chǎn)物。已知兩種pcr產(chǎn)物具有27bp重疊，使用它們作為第二輪pcr的模板，兩個最外側(cè)引物為glnpr2190(含有起始密碼子和nhei限制性位點)和glnpr2193(含有終止密碼子和xhoi限制性位點)。

對于兩個突變體(“區(qū)段1”和“區(qū)段2”)，使用單一限制性位點nhei和xhoi，將pcr產(chǎn)物插入pt1載體(gsd980)。隨后將dna轉(zhuǎn)化入大腸桿菌細菌并鋪在氨芐青霉素平板上。次日，每種突變體選擇4個克隆，提取它們的dna并送至fasteris供測序?；跍y序結(jié)果，每種突變體選擇一個克隆，對于突變體pt1-mmccr6區(qū)段1hsccr6，選擇gsa32，并且對于突變體pt1-mmccr6區(qū)段2hsccr6，選擇gsa33。

cho細胞的瞬時轉(zhuǎn)染

使用pei試劑，用mmccr6突變體轉(zhuǎn)染cho細胞。為此目的，轉(zhuǎn)染前當日，將細胞分瓶以獲得1x10⁶個細胞/ml的細胞密度。在轉(zhuǎn)染當日，將細胞離心并重懸于5ml轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基(來自gibco的opti-mem)中，直至細胞密度為2x10⁶個細胞/ml(必需離心10x10⁶個細胞)。添加12.5μgdna至250μl150mmnacl。平行地，添加25μgpei至250μl150mmnacl。隨后，將兩種溶液混合并在室溫溫育10分鐘以允許復(fù)合物形成。將dna混合物傾倒于細胞上并且將細胞在37℃在搖床(105轉(zhuǎn)/分鐘，5％co2)上溫育4-5小時。向細胞添加5ml生長培養(yǎng)基(含有4mm谷氨酰胺的來自lonza的powercho2)以達到1x10⁶個細胞/ml的最終密度。最后將細胞在搖床(37℃，105轉(zhuǎn)/分鐘，5％co2)上溫育4天，之后在facs上分析。

來自圖5的結(jié)果顯示，嵌合4h11與小鼠ccr6受體中含有人區(qū)段1的突變體1結(jié)合，但不與人ccr6受體中由人區(qū)段2序列組成的突變體2結(jié)合。因此，4h11的表位位于ccr6受體的n端區(qū)域內(nèi)部，并且更精確地位于包含位置18處phe和位置16處glu之間的9個殘基的序列中。

下表4中顯示n端人/小鼠雜合構(gòu)建體的總結(jié)。

表4：用于表位繪制的人/小鼠雜合n端ccr6序列的總結(jié)

hsccr6n端序列–seqidno:172、mmccr6n端序列–seqidno:174、突變體mmccr6區(qū)段1hsccr6–seqidno:180、突變體mmccr6區(qū)段2hsccr6–seqidno:¹⁸⁵。

實施例6：小鼠單克隆抗體4h11的人源化

此處描述了抗人ccr6小鼠抗體4h11的人源化，所述人源化包括選擇人接納體構(gòu)架、回復(fù)突變和基本上保留和/或改善移植有人cdr的接納體構(gòu)架結(jié)合特性的突變。

設(shè)計再塑造的可變區(qū)

同源性匹配用來選擇人接納體構(gòu)架以移植4h11cdr。數(shù)據(jù)庫，例如，來自人和小鼠免疫球蛋白基因座的種系可變基因數(shù)據(jù)庫(imgt數(shù)據(jù)庫，上文)或vbase2(retteri等人,(2005)nucleicacidsres.33,數(shù)據(jù)庫?？痙671-d674)或kabat數(shù)據(jù)庫(johnsong等人,(2000)nucleicacidsres.28:214-218)或出版物(例如，kabatea等人,上文)，可以用來鑒定鼠重鏈v區(qū)和輕鏈v區(qū)(分別是seqidno:7和8)所屬的人類亞家族并且確定最佳配合的人種系構(gòu)架以用作接納分子。待用作接納體的這些亞家族內(nèi)部的重鏈可變序列和輕鏈可變序列(vh和vl)的選擇可以基于序列同源性和/或cdr1區(qū)和cdr2區(qū)的結(jié)構(gòu)的匹配，以幫助保留移植后六個cdr的適宜的相對呈遞作用。

例如，使用imgt數(shù)據(jù)庫顯示了4h11重鏈可變結(jié)構(gòu)域構(gòu)架和人重鏈可變結(jié)構(gòu)域亞家族3成員之間的良好同源性。對以下種系序列觀察到cdr序列和構(gòu)架序列的最高同源性和同一性：ighv3-11*04(seqidno:77)、ighv3-11*01(seqidno:78)、ighv3-48*03(seqidno:79)、ighv3-23*04(seqidno:80)和ighv3-66*04(seqidno:81)，前述序列全部對完整序列直至cdr3具有74％以上的序列同一性。ighv3-11*04和ighv3-11*01顯示76％序列同一性，而ighv3-48*03和ighv3-23*04顯示75％的序列同一性。選擇ighv3-23*04作為vh構(gòu)架，原因在于其穩(wěn)定性。

使用相同的方法，4h11輕鏈可變結(jié)構(gòu)域序列顯示與人輕鏈可變結(jié)構(gòu)域κ亞家族2的成員良好同源。對以下種系序列觀察到cdr序列和構(gòu)架序列的最高同源性和同一性：igkv2-30*02(seqidno:82)和igkv2-30*01(seqidno:83)顯示出最高同一性，分別是82％和81％，緊隨其后的是igkv2d-30*01(seqidno:84)、igkv2-29*02(seqidno:85)和igkv2-29*03(seqidno:86)組成的另一個群組，前述序列均顯示78％以上的序列同一性。

作為人源化過程的起點，選擇人ighv3-23*04(seqidno:80)和igkv2-30*02(seqidno:82)可變結(jié)構(gòu)域作為4h11cdr的接納體。制備了人γ1同種型的第一人源化抗體(參見下文)。該抗體包含人-小鼠雜合重鏈可變結(jié)構(gòu)域和人-小鼠雜合輕鏈可變結(jié)構(gòu)域。雜合重鏈可變結(jié)構(gòu)域基于人重鏈可變結(jié)構(gòu)域ighv3-23*04，其中將種系cdr1和cdr2分別地替換為4h11重鏈cdr1和cdr2。從上文提到的imgt檢索中鑒定到與人接納體構(gòu)架最佳匹配的jh區(qū)段序列。所產(chǎn)生的人-小鼠雜合重鏈可變序列具有人ighv3-23*04構(gòu)架區(qū)、4h11小鼠cdr和最佳匹配的jh區(qū)段。類似地，人-小鼠雜合輕鏈可變結(jié)構(gòu)域具有人igkv2-30*02構(gòu)架區(qū)、4h11小鼠cdr和與人接納體最佳匹配的jk。為了在人接納體構(gòu)架上容納cdr，通過將人類殘基置換成小鼠殘基，修飾關(guān)鍵位置。這個過程稱作回復(fù)突變并且是單克隆抗體人源化中最不可預(yù)測的過程。必須從小鼠抗體鑒定并選擇關(guān)鍵構(gòu)架殘基，其中所述關(guān)鍵構(gòu)架殘基需要留存以保留親和力，而與此同時最大限度減少人源化抗體中的潛在免疫原性。

為了鑒定可能影響大部分cdr構(gòu)象和/或可變結(jié)構(gòu)域間堆積的殘基，使用以自動化模式設(shè)置的結(jié)構(gòu)同源性-建模服務(wù)器swiss-model(arnoldk等人,(2006)bioinformatics,22(2):195-201；http://swissmodel.expasy.org)，計算可變結(jié)構(gòu)域的人-小鼠雜合vh-vl對的3d模型。該模型分析允許基于位置對cdr區(qū)和/或重鏈-輕鏈可變結(jié)構(gòu)域堆積的推定性影響，選擇位置的子集。這個位置子集由可變重鏈位置24和49以及可變輕鏈位置36和46(kabat編號)組成。

新設(shè)計的可變結(jié)構(gòu)域在本文中稱作seqidno:75的重鏈可變結(jié)構(gòu)域vh1并稱作seqidno:38的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域vl1。包含vh1和vl1的第一人源化抗體在本文中縮寫為vh1/vl1抗體。

第一人源化抗體原型的產(chǎn)生

vh1和vl1的編碼性dna序列(cdna)以scfv樣式由geneartag(雷根斯堡，德國)合成，因而允許單一cdna序列涵蓋兩個可變結(jié)構(gòu)域(seqidno:167)。通過pcr從這個scfv構(gòu)建體回收各個可變結(jié)構(gòu)域cdna，并且使用pcr裝配技術(shù)，在其相應(yīng)的恒定結(jié)構(gòu)域cdna序列上游進一步裝配。最后，在獨立的載體中連接完整的重鏈cdna和輕鏈cdna，所述載體基于攜帶cmv啟動子和牛生長激素聚腺苷酸化信號的改良型pcdna3.1載體(invitrogen,ca,美國)。輕鏈特異性載體通過在κ輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域cdna之前使用bamhi和bsiwi限制性酶位點連接目的cdna的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域，允許表達人κ同種型輕鏈；而重鏈特異性載體經(jīng)工程化以允許使用bamhi和sali限制性酶位點，在編碼人ighg1ch1、ighg1鉸鏈區(qū)、ighg1ch2和ighg1ch3恒定結(jié)構(gòu)域的cdna序列之前連接目的cdna的重鏈可變結(jié)構(gòu)域。在重鏈表達載體和輕鏈表達載體中，分泌受含有bamhi位點的小鼠vj2c前導(dǎo)肽驅(qū)動。bsiwi限制性酶位點存在于κ恒定結(jié)構(gòu)域中；而sali限制性酶位點存在于ighg1ch1結(jié)構(gòu)域中。

通過將等量的重鏈載體和輕鏈載體使用聚乙烯亞胺(pei,sigma,buchs,瑞士)共轉(zhuǎn)染入適應(yīng)懸浮培養(yǎng)的hek293-ebna1細胞(目錄號：crl-10852)，瞬時產(chǎn)生vh1/vl1抗體(具有重鏈seqidno:173和輕鏈seqidno:30)。一般地，用dna-pei混合物轉(zhuǎn)染密度為0.8-1.2百萬個細胞/ml的100ml懸浮細胞，所述混合物含有50μg編碼重鏈的表達載體和50μg編碼輕鏈的表達載體。將編碼抗體基因的重組表達載體引入宿主細胞時，通過進一步培養(yǎng)宿主細胞4至5天時間產(chǎn)生抗體，以允許向培養(yǎng)基中分泌(ex-cell293，hek293無血清培養(yǎng)基；sigma,buchs,瑞士，補充有0.1％普蘭尼克(pluronic)酸、4mm谷氨酰胺和0.25μg/ml遺傳霉素)。

使用重組蛋白a流線介質(zhì)(gehealthcareeuropegmbh,glattbrugg,瑞士)，將vh1/vl1抗體從無細胞上清液純化并且在分析之前緩沖交換成磷酸鹽緩沖鹽水。

表達人ccr6的cho細胞上的細胞elisa

如實施例1中所述那樣生成人ccr6轉(zhuǎn)染的cho細胞。為了檢測人源化候選物與cho細胞中表達的ccr6的相互作用，開發(fā)一種細胞elisa。簡而言之，將96孔微量滴定板(costar,美國；分銷商vwrag,nyon,瑞士)用pbs中1μg/ml的100μl聚d賴氨酸(sigma-aldrichchemiegmbh,buchs,瑞士)包被并在4℃溫育過夜。次日，洗滌平板并將表達ccr6的cho細胞以1300轉(zhuǎn)/分鐘離心3分鐘并且按1x10⁶個細胞/孔在補充有10％fbs(paalaboratories,pasching,奧地利)、2mml-谷氨酰胺(lonza,leuven，比利時)、100u/ml青霉素，100μg/ml鏈霉素(biochromag,柏林，德國)的dulbecco改良eagle培養(yǎng)基(dmem,paalaboratories,pasching,奧地利)中鋪種在37℃，5％co2過夜。次日，將細胞在室溫與各種濃度的(范圍從10至0.0137μg/ml)人源化4h11候選物溫育一小時。在溫育細胞后，將樣品用含有10％fcs的dmem洗滌3次并且用含有4％pfa(sigma-aldrichchemiegmbh,buchs,瑞士)的50μlpbs在室溫固定15分鐘。將細胞用含有2％bsa(牛血清白蛋白,paalaboratories,pasching,奧地利)的pbs洗滌，并用200μl相同的緩沖液在室溫封閉1小時。將樣品與辣根過氧化物酶(hrp)標記的山羊抗人igfc片段特異性hrp(jacksonimmunoresearcheuropeltd,newmarket,uk)溫育。將細胞用含有2％bsa的pbs洗滌5次，并將平板與tmb底物(sigma-aldrichchemiegmbh,buchs,瑞士)溫育以顯示抗體結(jié)合作用。用微量平板讀數(shù)儀(biotek,美國；分銷商：wittecag,littau,瑞士)讀取吸光度。

從小鼠殘基回復(fù)突變成人類殘基

由于vh1/vl1抗體導(dǎo)致與嵌合抗體vh1和vl1可比較的結(jié)合作用，所以使用作為進一步誘變的起點。為了減少4h11的潛在免疫原性，通過將vh中位置24和49處和vl中位置36和46處的小鼠構(gòu)架殘基回復(fù)突變成人類殘基，設(shè)計其他人源化候選物。額外的變體包含cdrh2中位置62處的保守突變，其中小鼠殘基蘇氨酸由人類殘基絲氨酸置換。

抗體表達和純化遵循上文描述的方法。通過如先前所描述的細胞elisa測定人源化抗體候選物的結(jié)合作用。

圖6顯示人源化變體當中，vh5/vl1抗體在表達人ccr6的cho上顯示了相似或比其他候選物更好的結(jié)合作用。類似地，圖7顯示，vh5/vl1抗體在abhunter抗ccr6生物測定法上展示了相似或比其他候選物更好的抑制性功能。另外，vh5(seqidno:37)與人類構(gòu)架ighv3-23*04(seqidno:80)具有最高的同一性，序列同一性為89.5％，從而產(chǎn)生較低的免疫原性風(fēng)險。

依據(jù)差示掃描量熱法的所選擇人源化抗ccr6抗體的熱穩(wěn)定性

使用差示掃描量熱法(dsc)測量人源化抗體的熱穩(wěn)定性。單克隆抗體熔化特征是其同種型的特征(garbere和demarestsj(2007)biochem.biophys.res.commun.355:751-7)，然而可以甚至在全長igg的背景下容易地鑒定fab片段的中點熔化溫度。fab部分的這種中點熔化用來監(jiān)測人源化候選物的單克隆穩(wěn)定性。

在vp-dsc示差掃描微量量熱計(gehealthcareeuropegmbh)上實施量熱測量。細胞體積是0.128ml，加熱速率是200℃/小時，并且過壓保持在65p.s.i。全部抗體均以pbs(ph7.4)中1mg/ml的濃度使用。通過與已經(jīng)從中省略抗體的含有相同緩沖液的一式兩份重復(fù)樣品比較，估計抗體的摩爾熱容。使用標準程序分析部分摩爾熱容和熔化曲線。在軟件originv7.0中使用非雙態(tài)模型進一步分析之前，溫度記錄圖經(jīng)基線修正和濃度歸一化。

人源化變體vh5/vl1fab片段在79.4℃展示了單一轉(zhuǎn)變，形狀和幅度與通常對緊湊折疊的fab片段觀察到的協(xié)同性解折疊一致，這表明工程化過程成功保留fab穩(wěn)定性?？傮w上，人源化變體顯示良好的熱穩(wěn)定性。

表5：人源化的抗人ccr6抗體

上表中所述的h5/l1抗體設(shè)計為igg1樣式并且還設(shè)計為鉸鏈區(qū)穩(wěn)定化的人igg4以產(chǎn)生無細胞毒性的抗ccr6人源化抗體。

實施例7：

在來自人和食蟹猴物種的ccr6可溶性n端區(qū)域上測試4h11人源化候選物的結(jié)合活性

由于嵌合4h11的表位定位于ccr6n端區(qū)域，所以生成與這個n端片段相對應(yīng)的可溶性肽并用來評價4h11vh5/vl1igg4hs候選物在人類物種和食蟹猴物種中的親和力。如下生成可溶性n端肽區(qū)域：

表達人和食蟹猴ccr6n端和igg1同種型的人fc的可溶性融合構(gòu)建體。

克隆人ccr6n端的可溶性融合構(gòu)建體：

在lifetechnology(carlsbad，ca)訂購了編碼人ccr6n端的可溶性融合構(gòu)建體的dna。通過首先使信號肽與人ccr6的胞外n端(swissprot條目p51684中的氨基酸1至47)融合，設(shè)計該氨基酸構(gòu)建體。如seqid[正確的編號，參見人ccr6-fc]中所示，將這個構(gòu)建體借助修飾的甘氨酸接頭(ggggt)與人igg1同種型的fc部分連接(swissprot條目p01857中的氨基酸104至330)。geneart將這種氨基酸反向翻譯成dna序列，并且在編碼融合蛋白的可讀框5’連接nhei限制性位點和kozak序列及3’連接xhoi限制性位點。將這個構(gòu)建體克隆在質(zhì)粒13abrc6p中并發(fā)送至glenmark。

使用nhei/xhoi切割質(zhì)粒13abrc6p，并將插入物克隆到pglex18(表達盒在人cmv啟動子和orip元件控制下的glenmark專利載體)的主鏈，其中將所述主鏈使用相同的酶在mcs中切割并用cip處理以防止重新環(huán)化。所得到的構(gòu)建體命名為pglex18-hsccr6-nter-fc并通過測序證實(fasteris,日內(nèi)瓦,瑞士)。

克隆食蟹猴融合構(gòu)建體的程序是相似的。在lifetechnologies訂購的融合構(gòu)建體僅在食蟹猴ccr6的胞外n端(swissprot條目g7mr72的氨基酸6至52)不同并且克隆在質(zhì)粒geneart序列#31中。最終的構(gòu)建體命名為pglex18-cynoccr6-nter-fc并通過測序證實(fasteris,日內(nèi)瓦,瑞士)。

表達：

在使用150ml培養(yǎng)基的1lschott瓶中使用聚乙烯亞胺(polyplus-transfection,illkirch,法國)，用表達載體轉(zhuǎn)染hek293-ebna懸浮細胞。為此目的，將指數(shù)生長的細胞以密度8e6個細胞/ml接種在75mloptimem培養(yǎng)基(#31985-047,invitrogen)中。將dna復(fù)合物按重量比3(μg/μg)添加至細胞。細胞懸液中的dna終濃度是2.5μg/ml。在37℃振搖(200轉(zhuǎn)/分鐘)下溫育5小時后，添加75ml新鮮培養(yǎng)基至細胞懸液。隨后，將細胞在振搖的平臺上在37℃，5％co2和80％濕度溫育5天直至收獲。使用0.2μm濾器，澄清細胞的上清液，并且使用蛋白a純化蛋白質(zhì)。

seqidno:188[人ccr6-fc]

metdtlllwvlllwvpgstgmsgesmnfsdvfdssedyfvsvntsyysvdsemllcslqevrqfsrlggggtdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk

seqidno:189[食蟹猴ccr6-fc]

metdtlllwvlllwvpgstgmsgesmnfsdvfdssedyfasvntsyytvdsemllctlhevrqfsrlggggtdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk

elisa：

進行結(jié)合elisa以測試4h11vh5/vl1igg1和4h11vh5/vl1igg4hs抗體對來自人類物種和食蟹猴物種的ccr6n端區(qū)域組成的肽的反應(yīng)性。簡而言之，將96孔微量滴定板(costar,美國；分銷商vwrag,nyon,瑞士)用pbs中2μg/ml的100μl重組人和食蟹猴n端肽-fc包被。將平板在4℃溫育過夜并隨后用pbs2％bsa(牛血清白蛋白，paalaboratories,pasching,奧地利)在室溫(rt)封閉1小時。移除封閉液并添加多種濃度的4h11vh5/vl1igg1和4h11vh5/vl1igg4hs。將平板在室溫溫育1小時，隨后用pbs0.01％tween-20(sigma-aldrichchemiegmbh,buchs,瑞士)洗滌六次，并加入山羊抗人igf(ab′)2片段特異性hrp(jacksonimmunoresearcheuropeltd,newmarket,uk)。在洗滌后，將平板與tmb底物(bio-radlaboratoriesag,reinach,瑞士)溫育以顯示抗體結(jié)合作用。通過添加2mh2so4終止反應(yīng)，并且在synergyht2分光光度計(biotek,美國；分銷商：wittecag,littau,瑞士)上在450nm讀取光密度(od450nm)。圖8顯示4h11vh5/vl1igg1和4h11vh5/vl1igg4hs抗體類似地識別與人類物種(圖8a)和食蟹猴物種(圖8b)的ccr6n端區(qū)域相對應(yīng)的n端肽。

通過表面等離子體共振(spr)的動力學(xué)結(jié)合親和力常數(shù)：

以4h11vh5/vl1igg4hs抗體作為分析物，對fc融合的huccr6n端肽和食蟹猴ccr6n端肽測量動力學(xué)結(jié)合親和力常數(shù)(kd)。為了比較，使用4h11vh5/vl1igg1抗體和嵌合4h11抗體進行相同的測量。室溫在biacore2000(gehealthcare-biacore,gehealthcareeuropegmbh,glattbrugg,瑞士)上實施測量，并使用雙價分析物動力學(xué)親和力模型，以biaevaluation軟件(biacore；v4.1，gehealthcareeuropegmbh)分析。

通過注射35μl1:1n-羥基磺基琥珀酰亞胺(nhs)/1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(edc)溶液(v/v；5μl/分鐘流速；在流路1和2上)，活化cm5研究級傳感芯片(gehealthcareeuropegmbh；參考號br-1000-14)。將fc融合的人或食蟹猴ccr6n端肽在乙酸鹽緩沖液ph4.5(gehealthcareeuropegmbh，br-1003-50；pi以下一個ph單位)中稀釋至終濃度25nm并且隨后通過在流路1和2上注射20μl(5μl/分鐘)，固定在之前活化的cm5傳感芯片上；這對應(yīng)于大約300個響應(yīng)單位(ru)。隨后通過注射35μl乙醇胺溶液(5μl/分鐘)，使偶聯(lián)人或食蟹猴ccr6n端肽的cm5傳感芯片失活。最后，注射兩次3mmgcl2溶液(gehealthcareeuropegmbh，參考號br100839)以釋放未交聯(lián)的fc-融合肽。

為了測量親和力，將1xpbs緩沖液中儲存的重組4h11抗體稀釋于hbs-ep緩沖液(gehealthcareeuropegmbh，參考號br-1001-88；0.01mhepes，0.15mnacl，edta3mm，0.005％表面活性劑p20，ph7.4)中，并且按不同的濃度(3.8nm至1μm)在流路1和2(流路1用作參照)上以30μl/分鐘流速注射4分鐘，隨后是在運行緩沖液中的10分鐘解離時間。在每個結(jié)合事件后，用3mmgcl2令表面再生10秒(30μl/分鐘流速)。

用雙價分析物模型最佳擬合量值(傳感圖：fc2-fc1)。測量包括參比用零濃度樣品。這個模型將結(jié)合數(shù)據(jù)對兩個序貫反應(yīng)擬合，導(dǎo)致確定二個平衡解離常數(shù)集合并且隨后確定兩個kd值：kd1和kd2。用來測定動力學(xué)數(shù)據(jù)的模仿igg與其膜結(jié)合型靶之間在體內(nèi)出現(xiàn)的相互作用的樣式允許增加表觀親和力的親合力。

chi2值表示在每個點處實驗數(shù)據(jù)和參考數(shù)據(jù)之間的平方差和；而殘差曲線表示擬合中每個點的實驗數(shù)據(jù)和參考數(shù)據(jù)之間的差異。chi2和殘差值均用來評價實驗數(shù)據(jù)和個體結(jié)合模型之間擬合的質(zhì)量。

圖9顯示4h11vh5/vl1igg4hs抗體識別fc融合的人類n端肽和食蟹猴n端肽，kd值分別為1.56nm和4.67nm。

抑制ccl20誘導(dǎo)的經(jīng)嵌合人-小鼠ccr6構(gòu)建體轉(zhuǎn)染的baf細胞移行：

如圖8和圖9中所示，4h11vh5/vl1igg4hs特異性識別ccr6受體的n端部分。為了進一步探索ccr6n端區(qū)域的生物學(xué)功能，在阻斷性抗小鼠ccr6或4h11vh5/vl1igg4hs存在下使用經(jīng)含有人n端區(qū)域的雜合小鼠ccr6或含有小鼠n端區(qū)域的人ccr6轉(zhuǎn)染的baf細胞。根據(jù)實施例3中描述的方案評估一種移行測定法。來自圖10的結(jié)果顯示，4h11vh5/vl1igg4hs能夠抵消人ccl20介導(dǎo)的經(jīng)含有小鼠n端區(qū)域的人ccr6受體轉(zhuǎn)染的baf細胞移行，但是不抵消鼠ccl20介導(dǎo)的經(jīng)含有小鼠n端區(qū)域的人ccr6受體轉(zhuǎn)染的baf細胞移行。因此，這種抗體特異性阻斷由ccr6n端區(qū)域介導(dǎo)的生物學(xué)功能。作為對照，阻斷性大鼠抗小鼠ccr6抗體(r&dsystems，克隆140706)以終濃度10μg/ml使用。

抑制ccl20-ccr6相互作用：

為了確定4h11vh5/vl1igg4hs是否通過直接抑制ccl20-ccr6相互作用抵消ccr6介導(dǎo)的生物學(xué)功能，建立一種使用流式細胞術(shù)方案的測定法。簡而言之，將ccr6轉(zhuǎn)染的baf細胞計數(shù)并且在含有0.1％疊氮化物的facs緩沖液中按1*10⁶個細胞/ml稀釋。隨后將100μl的這些細胞在4℃與多種濃度的稀釋于含0.1％疊氮化物的facs緩沖液中的4h11vh5/vl1igg4hs溫育20分鐘。在溫育后，將細胞離心和洗滌2次并且與固定濃度(0.5μg/ml)的稀釋于含0.1％疊氮化物的facs緩沖液中的重組ccl20(r&dsystems)溫育20分鐘。隨后，使用生物素酰化的抗人ccl20(r&dsystems，克隆baf360)，隨后使用分別按1μg/ml和1/100稀釋于facs緩沖液+0.1％疊氮化物中的別藻藍蛋白(apc)-標記鏈霉親和素檢測ccl20。將細胞在facs緩沖液，0.1％疊氮化物中洗滌兩次并且通過流式細胞術(shù)分析樣品。在使用嵌合igg1同種型對照作為100％熒光活性的條件下，考慮熒光信號時計算ccl20與ccr6結(jié)合的相對百分數(shù)。圖11顯示與同種型匹配的對照相比，4h11vh5/vl1igg4hs以劑量依賴性方式顯著地減少ccl20與ccr6受體結(jié)合的信號傳導(dǎo)。此外，4h11vh5/vl1igg4hs在低濃度(低于0.5μg/ml)仍有活性。

實施例8：

評價雙價和單價4h11vh5/vl1的結(jié)合潛力及中和潛力。

在結(jié)合測定法中測試雙價和單價vh5/vl1mab

使用人ccr6全長蛋白轉(zhuǎn)染的baf細胞，遵循實施例3中描述的方案，通過流式細胞術(shù)評價雙價vh5/vl1igg1抗體(seqidno:10和30)和單價vh5/vl1抗體(seqidno:218、219和220)的結(jié)合活性。在該測定法中，將轉(zhuǎn)染的細胞與多種濃度的兩種抗體(范圍從3至0.01μg/ml)溫育。使用按1/200稀釋的抗人h+l-藻紅蛋白-pe(bdbiosciences,allschwil,瑞士)作為第二抗體以檢測雙價igg1抗體分子和單價抗體分子。圖12顯示igg1抗體和vh5/vl1抗體均以劑量依賴性方式識別細胞表面上的ccr6。但是，雙價vh5/vl1抗體與單價片段相比，展示更好的結(jié)合特征，前者顯示高于后者的最大結(jié)合活性。

在ccl20介導(dǎo)的移行生物測定法中測試雙價和單價vh5/vl1mab。

為了評價及比較單價vh5/vl1和雙價vh5/vl1igg1抗體的中和有效性，遵循實施例3中詳述的方案，將兩種分子在趨化測定法中在不同的濃度(范圍從50至0.4μg/ml)測試。如圖13中所示，與同種型照對相比，測試的兩種抗體均顯示細胞移行減少，甚至單價vh5/vl1抗體與雙價樣式相比也顯示減少的活性。

總之，來自圖12和圖13的結(jié)果顯示，作為單價抗體，vh5/vl1仍有活性，盡管如與雙價分子相比，結(jié)合作用和功能效應(yīng)減少。這些觀察結(jié)果支持使用vh5/vl1作為能夠與多于一種抗原結(jié)合的抗體(如雙特異性抗體)的組分。

實施例9：

人源化vh5/vl1抗體的工程化

親和力成熟

通過噬菌體展示法進一步工程化vh5/vl1對人ccr6n端區(qū)域的親和力。使用噬菌體展示使抗體親和力成熟的技術(shù)是已知的(benhari(2007)expertopinbiolther.,7(5):763-79)。vh5/vl1抗體基因序列設(shè)計為scfv片段供展示，并且通過位點定向誘變引入多樣性。

建立兩個不同的噬菌體文庫：第一噬菌體文庫在cdr-h2中多樣化(在kabat殘基：52、53、56和58處使用nnk密碼子)，而其他cdr不改變，并且第二噬菌體文庫在cdr-l3中多樣化(在kabat殘基：92、93和94處使用nnk密碼子，而通過混合物五種不同的寡核苷酸，使kabat殘基96對leu；phe；ile；tyr和trp多樣化)，其他cdr不改變。所得到的親和力成熟文庫具有>2x10e7的多樣性，并且使用生物素?；目乖?與人igg1fc片段融合的人ccr6n端區(qū)域)和鏈霉親和素捕獲法進行三輪選擇?？乖瓭舛仍谌齻€輪次之間降低(輪次1：50nm，輪次2：5nm，和輪次3：0.5nm)，并且增加采用非生物素?；乖母偁幉襟E以選擇高親和力變體(輪次2和輪次3中1μm)。通過表面等離子體共振(spr)對親和力成熟的scfv候選物評價融合蛋白上改善的結(jié)合解離速率(圖14)。來自cdr-h2文庫的變體不顯示解離速率改善或僅顯示中度的解離速率改善，而來自cdr-l3文庫變體顯示中度至明顯的解離速率改善。

一個優(yōu)選的cdr-h2變體是攜帶置換n53t和i56r(kabat編號)的vh5/vl1-h2-b3scfv克隆(圖14a)。與親本對照相比，這個變體具有中度的解離速率改善，具有下述增加的益處：移除親本cdr-h2序列中kabat位置53和54處存在的推定性脫酰胺化位點。

兩個優(yōu)選的cdr-l3變體因其解離速率改善超過親本對照而鑒定：變體vh5/vl1-l3-c9和vh5/vl1-l3-g8(圖14b)。vh5/vl1-l3-c9具有以下cdr-l3置換：s92t、h93y和v94y(kabat編號)，而vh5/vl1-l3-g8序列僅在位置94處不同于vh5/vl1-l3-c9，并且經(jīng)如下置換：s92t、h93y和v94l(kabat編號)。

cdr-h2和cdr-l3中從這些改進的克隆所鑒定的全部優(yōu)選的氨基酸變化用來形成如下文描述的新fab片段和抗體。

移除cdr-l1中的推定性脫酰胺化基序

vh5/vl1的cdr-l1在kabat位置28和29處具有脫酰胺化基序。采用幾種置換以廢除其共有序列。產(chǎn)生了在cdr-l1中的位置n28t、n28s、n28q、n28e和g29a處置換的vh5/vl1fab片段。在cdr-l1位置28處的全部置換均損害結(jié)合作用，如通過人或食蟹猴融合蛋白上的spr所判斷(圖15)；僅g29a不影響vh5/vl1對人ccr6的親和力或其fab穩(wěn)定性(圖16)。

設(shè)計

從噬菌體展示篩選中鑒定的cdr-l3置換和cdr-h2置換用來產(chǎn)生工程化的vh5/vl1抗體及其片段，所述抗體及其片段還包含前述的g29a修飾，因而移除位于cdrl1的脫酰胺化位點。樣式包括人fab片段、人igg1抗體、人單價抗體(pct公開號wo2012/131555和wo2014/049003)和鉸鏈區(qū)穩(wěn)定化的igg4抗體，如圖17中所述。fab構(gòu)建體用于人或食蟹猴ccr6融合蛋白偶聯(lián)到傳感芯片時，通過spr測定kd。

使用添加cdr-l1g29a修飾的優(yōu)選的cdr-l3文庫scfv克隆vh5/vl1-l3-c9和vh5/vl1-l3-g8的可變結(jié)構(gòu)域，產(chǎn)生第一對工程化的fab。與相同實驗集合中作為對照使用的親本fab相比，本文中稱作vh5/vl1-c9-g29a和vh5/vl1-g8-g29a的兩種fab顯示出kd值改善約二十倍(圖18)。注意，與先前測量的48nm相反(實施例7)，親本fab具有約20nm的kd值，所述差異由這組實驗中融合蛋白的質(zhì)量、所用抗原的質(zhì)量變異更大而解釋。

還產(chǎn)生第二對工程化的fab，所述fab涵蓋與優(yōu)選的cdr-h2置換(n53t和i56r)和cdr-l1g29a修飾組合的優(yōu)選的cdr-l3置換(s92t、h93y和v94y或s92t、h93y和v94l)。本文中稱作vh5/vl1-b3c9-g29a和vh5/vl1-b3g8-g29a的fab僅在cdr-h2中異于第一對fab構(gòu)建體并且顯示kd值進一步改善兩倍。vh5/vl1-b3c9-g29a和vh5/vl1-b3g8-g29a均對人ccr6的n端區(qū)域具有約0.5nm的kd值并且對食蟹猴ccr6的n端區(qū)域具有約1nm的kd值，這代表與親本vh5/vl1fab相比，對人ccr6的親和力改善約40倍，以及對食蟹猴ccr6的親和力改善約30倍。

實施例10：

親和力成熟的vh5/vl1變體的阻斷潛力改善。

為了評價vh5/vl1igg1的親和力成熟對趨化活性的影響，在使用全長人ccr6轉(zhuǎn)染的baf細胞的移行測定法中在多種濃度(范圍從20至0.75μg/ml)測試處于雙價igg1樣式或單價樣式的四種工程化變體vh5/vl1。簡而言之，將100000個細胞在親和力成熟的變體存在下添加至hts-96平板[corning,chemiebrunschwigag,瑞士]的上室。transwell的下室含有按照10ng/ml稀釋于235μlbaf培養(yǎng)基(含有10％fcs(amimed，由bioconcept,allschwil,瑞士分銷)的rpmi-1640(sigma-aldrichchemiegmbh,巴塞爾,瑞士))中的重組人ccl20(r&dsystems)。在37℃，5％co2溫育4小時后，從下室和上室收獲細胞并且使用guavaeasycyteht(milliporeag,zug,瑞士)計數(shù)。作為陰性對照，無關(guān)的人igg1抗體以20μg/ml使用。使用非親和力成熟的雙價vh5/vl1igg1和單價vh5/vl1分子作為生物測定法中的參比。對于全部受測分子，通過下室中的細胞數(shù)目除以上室和下室中的細胞總數(shù)，計算移行率。抑制移行的百分數(shù)計算為對同種型對照所觀察到的抑制移行的百分數(shù)。圖19表明，對人ccr6-n端肽顯示出增加的親和力的vh5/vl1變體(如圖18中所示的b3g8g29a和b3c9g29a)更有效地抑制表達ccr6的baf細胞移行。四種工程化的變體顯示高阻斷潛力，甚至在低濃度(例如0.75μg/ml)時也是如此。有趣地，與親和力成熟之前的單價vh5/vl1抗體相比，單價形式的親和力成熟變體還顯示增加的中和潛力。特別地，在低濃度時，與20μg/ml未工程化的單價vh5/vl1的抑制特征(為大約20％)相比，b3g8g29a和b3c9g29a突變體展示更高的抑制特征(大約35％)。

總之，來自圖19的數(shù)據(jù)展示了在移行測定法中四個不同工程化的vh5/vl1變體的親和力增加與其阻斷潛力增加之間的直接關(guān)系。