本發(fā)明涉及與c-met特異性結(jié)合的抗體(后文稱為c-met特異性抗體)或其片段，更具體地，涉及分離自人fv(scfv)噬菌體文庫的對c-met具有高親和力和特異性的全人抗體、編碼所述抗體的多核苷酸、包含所述多核苷酸的重組載體、使用所述重組載體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞和通過培養(yǎng)所述細(xì)胞產(chǎn)生c-met特異性抗體的方法。
背景技術(shù)：
：發(fā)現(xiàn)了c-met(間充質(zhì)上皮轉(zhuǎn)化因子)是細(xì)胞表面上的受體，是受體酪氨酸激酶家族的癌基因(致癌基因，oncogene)，其由α亞單元β亞單元構(gòu)成，α亞單元僅由50kd胞外結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，β亞單元由胞外、跨膜、酪氨酸激酶域以及磷酸化相關(guān)基序構(gòu)成，總共145kd(deanetal.,nature,4；318(6044):385,1985；parketal.,pnas,84(18):6379,1987,maggioraetal.,j.cellphysiol.,173:183,1997)。已報(bào)導(dǎo)c-met或hgf的不當(dāng)表達(dá)與多種類型的惡性腫瘤相關(guān)，且當(dāng)其過表達(dá)時(shí)，預(yù)后較差(www.vai.org/met,ederetal.,clin.cancerres.,15:2207,2009)。c-met響應(yīng)hgf且通過c-met的磷酸化刺激多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路以促進(jìn)轉(zhuǎn)化，也就是說，促進(jìn)癌細(xì)胞和血管細(xì)胞的分裂及細(xì)胞運(yùn)動性，抑制細(xì)胞死亡、以及誘導(dǎo)血管生成以及向細(xì)胞外基質(zhì)(ecm)的侵入和轉(zhuǎn)移等(jeffersetal.,j.mol.med.,74:505,1996；amiconeetal.,emboj.,16:495,1997；matsumotoandnakamura,biochem.biophys.res.comm.,239:639,1997；corpsetal.,int.j.cancer,73:151,1997)。特別是，已報(bào)導(dǎo)了c-met和hgf在膠質(zhì)瘤(koochekpouretal.,cancerres.,57:5391,1997)、乳腺癌(nagyetal.,surg.oncol.,5:15,1996；tucketal.,am.j.pathol.,148:225,1996)、胰腺癌(ebertetal.,cancerres.,54:5775,1994)、胸膜間皮瘤(tolpayetal.,j.cancerres.clin.oncol.,124:291,1998)；(klomineketal.intl.j.cancer,76:240,1998)等多種癌癥組織和細(xì)胞中同時(shí)過表達(dá)。然而，常常觀察到無論hgf如何，通過c-met過表達(dá)發(fā)展成癌癥的情況。例如，肝癌(肝細(xì)胞癌,suzukietal.,hepatology,20(5):1231,1996)、胃癌(taniguchietal.,cancer,82:2112-2122(1998))、肺癌(harveyetal.,j.pathol,180:.389,1996)、腎癌(natalietal.,intl.j.cancer,69:212,1996)、卵巢癌(nagyetal,j.surg.oncol,60:95,1995)、結(jié)腸直腸癌(hiscoxetal.,cancerinvest.,15:513,1997)等是很好的實(shí)例。這樣c-met活化或過表達(dá)的情況下轉(zhuǎn)化過程被促進(jìn)，因此，已建立了多種抑制c-met活化的方法作為有前景的抗癌治療策略。一個(gè)實(shí)例是設(shè)計(jì)為干擾atp(腺苷三磷酸)與c-met的相互作用的低分子量化合物。這些低分子量化合物包括k252a(fermentekbiotechnology)、su11274(sugen)、pha-665752(pfiza)等(morottietal.,oncogene,21(32):4885,2002；berthouetal.,oncogene,23(31):5387,2004；pfizer,christensenetal.,cancerres.,63(21):7345,2003)，這些實(shí)例被設(shè)計(jì)為干擾c-met的磷酸化，使得信號傳輸?shù)南掠蔚鞍撞槐换罨?。然而，低分子量化合物的缺點(diǎn)是無法特異性地抑制c-met所致的磷酸化。此外，作為中和hgf/c-met信號傳輸?shù)牡诙N方法，有抑制c-met和c-met配體hgf結(jié)合的方法。抑制c-met和hgf結(jié)合的方法包括使用失去的hgf片段(matsumoto&nakamura,cancersci.,94(4):321,2003)、可中和hgf的抗體(caoetal.,pnas.,98(13):7443,2001；kimetal.,clin.cancerres..,12:1292,2006；burgessetal.,cancerres.,66(3):1721,2006)或hgf前體(前-hgf,mazzoneetal.,j.clin.invest.,114(10):1418,2004)的方法，上述hgf前體不能活化c-met，但能比原始hgf更強(qiáng)的親和力與c-met結(jié)合。此外，使用噬菌體展示方法和淘選技術(shù)來選出能夠抑制c-met活性的肽序列，將相應(yīng)的肽用于防止c-met的活化(kimetal.,biochembiophysrescommun.,354:115,2007)。選出的肽應(yīng)用于分子成像，用于搜尋過表達(dá)c-met的體內(nèi)組織或器官(caoetal.,clin.cancerres.,13(20)；6049,2007)。雖然所選的肽受到僅抑制hgf依賴性c-met活化的限制，但現(xiàn)實(shí)中在體外或體內(nèi)顯示了抗癌效果，因而認(rèn)為選定的肽可以通過如與現(xiàn)有化療組合等有效地加以使用。此外，吉非替尼(gefitinib)和厄洛替尼(erlotinib)等表皮生長因子受體(egfr)激酶抑制劑已被用作有效的癌癥治療劑，但經(jīng)常發(fā)生耐藥，其原因據(jù)報(bào)導(dǎo)是c-met受體的強(qiáng)烈擴(kuò)增(engelmanetal.,science,316(5827):1039,2007)，因此，預(yù)期當(dāng)c-met抑制劑合并處理時(shí)，抗癌效果會增大。此外，已知c-met由hgf活化，其自身有助于新生血管形成，并已知c-met通過與新生血管形成的主要受體vegfr-2的相互作用刺激新生血管形成。此處，可觀察到當(dāng)同時(shí)靶向c-met和vegfr-2加以抑制時(shí)，在人異種移植模型中腫瘤生長被協(xié)同地抑制(zhangetal.,idrugs,13:112,2010)。已知hgf和c-met間的失調(diào)節(jié)和c-met的過表達(dá)在轉(zhuǎn)移性癌癥的進(jìn)展中起重要作用，因此，在抗癌劑中將c-met的抗體作為拮抗劑進(jìn)行了大量開發(fā)。因此，本發(fā)明的發(fā)明人為開發(fā)能夠與c-met以高親和力特異性結(jié)合、由人衍生的序列構(gòu)成、在體內(nèi)施用時(shí)誘導(dǎo)免疫響應(yīng)潛力低的c-met人抗體做出了努力，結(jié)果，通過使用噬菌體展示方法從單鏈fv(scfv)噬菌體文庫分離了與c-met以高親和力和特異性結(jié)合的完整人抗體，并完成了本發(fā)明。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供對c-met具有高親和力和特異性的c-met特異性抗體的重鏈可變區(qū)。本發(fā)明的另一目的是提供對c-met具有高親和力和特異性的c-met特異性抗體的輕鏈可變區(qū)。本發(fā)明的另一目的是提供包含c-met特異性抗體的重鏈可變區(qū)和c-met特異性抗體的輕鏈可變區(qū)的c-met特異性抗體或其片段。本發(fā)明的另一目的是提供編碼所述c-met特異性抗體的重鏈可變區(qū)或所述c-met特異性抗體的輕鏈可變區(qū)的多核苷酸。本發(fā)明的另一目的是提供包含所述多核苷酸的重組載體和用所述重組載體轉(zhuǎn)化的重組細(xì)胞。本發(fā)明的另一目的是提供使用所述重組細(xì)胞產(chǎn)生c-met特異性抗體的方法。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供c-met特異性抗體的重鏈可變區(qū)，其包含seqidno:1的氨基酸序列所示的重鏈可變區(qū)cdr1；seqidno:2的氨基酸序列所示的重鏈可變區(qū)cdr2；和seqidno:3的氨基酸序列所示的重鏈可變區(qū)cdr3，且優(yōu)選地，提供具有seqidno:7的氨基酸序列的c-met特異性抗體的重鏈可變區(qū)。此外，本發(fā)明提供c-met特異性抗體的輕鏈可變區(qū)，其包含seqidno:4的氨基酸序列所示的輕鏈可變區(qū)cdr1；seqidno:5的氨基酸序列所示的輕鏈可變區(qū)cdr2；和seqidno:6的氨基酸序列所示的輕鏈可變區(qū)cdr3，且優(yōu)選地，提供具有seqidno:8的氨基酸序列的c-met特異性抗體的輕鏈可變區(qū)。此外，本發(fā)明提供c-met特異性抗體或其片段，其包含c-met特異性抗體的重鏈可變區(qū)和c-met特異性抗體的輕鏈可變區(qū)，所述重鏈可變區(qū)包含seqidno:1的氨基酸序列所示的重鏈可變區(qū)cdr1、seqidno:2的氨基酸序列所示的重鏈可變區(qū)cdr2、和seqidno:3的氨基酸序列所示的重鏈可變區(qū)cdr3；所述輕鏈可變區(qū)包含seqidno:4的氨基酸序列所示的輕鏈可變區(qū)cdr1、seqidno:5的氨基酸序列所示的輕鏈可變區(qū)cdr2、和seqidno:6的氨基酸序列所示的輕鏈可變區(qū)cdr3。根據(jù)本發(fā)明的c-met特異性抗體或其片段可包含seqidno:7所示的重鏈可變區(qū)和seqidno:8所示的輕鏈可變區(qū)。此外，本發(fā)明提供編碼所述c-met特異性抗體的重鏈可變區(qū)或c-met特異性抗體的輕鏈可變區(qū)的多核苷酸。此外，本發(fā)明提供包含上述多核苷酸的重組載體，和使用所述重組載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。此外，本發(fā)明提供產(chǎn)生c-met特異性抗體的方法，其包括通過培養(yǎng)上述重組細(xì)胞產(chǎn)生c-met特異性抗體；并回收所產(chǎn)生的c-met特異性抗體。附圖說明圖1顯示了本發(fā)明中篩選的c-met特異性scfv與c-met結(jié)合的能力。圖2顯示了根據(jù)本發(fā)明的1e4-scfv與c-met結(jié)合的能力。圖3顯示了包含1e4-igg的重鏈恒定區(qū)和重鏈可變區(qū)的載體pigghd-1e4hvy的圖譜。圖4顯示了包含1e4-igg的輕鏈恒定區(qū)和輕鏈可變區(qū)的載體piggld-1e4lgt的圖譜。圖5顯示了純化的1e4-igg的sds-page結(jié)果。圖6顯示了通過mdck-2細(xì)胞系確認(rèn)根據(jù)本發(fā)明的c-met特異性抗體的分散能力(scattering)所得的結(jié)果。圖7顯示了通過蛋白免疫印跡確認(rèn)根據(jù)本發(fā)明的c-met特異性抗體的磷酸化能力所得的結(jié)果。圖8顯示了根據(jù)本發(fā)明的c-met特異性抗體與小鼠c-met和與人c-met結(jié)合的能力。最佳模式只要未以其他方式定義，本說明書中使用的全部技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所述領(lǐng)域的技術(shù)人員所一般理解相同的含義。一般而言，本說明書中使用的命名和下文將進(jìn)行說明的實(shí)驗(yàn)方法是已知的，并且是本
技術(shù)領(lǐng)域：
通常使用的。根據(jù)本發(fā)明的抗體能夠與c-met以高親和力特異性結(jié)合，并包含來源于人的序列。在本發(fā)明的一個(gè)方面中，本發(fā)明提供c-met特異性抗體的重鏈可變區(qū)，其包含：seqidno:1的氨基酸序列所示的重鏈可變區(qū)cdr1；seqidno:2的氨基酸序列所示的重鏈可變區(qū)cdr2；和seqidno:3的氨基酸序列所示的重鏈可變區(qū)cdr3。本發(fā)明的另一個(gè)方面中，本發(fā)明提供c-met特異性抗體的輕鏈可變區(qū)，其包含：seqidno:4的氨基酸序列所示的輕鏈可變區(qū)cdr1；seqidno:5的氨基酸序列所示的輕鏈可變區(qū)cdr2；和seqidno:6的氨基酸序列所示的輕鏈可變區(qū)cdr3。本發(fā)明的另一個(gè)方面中，本發(fā)明提供c-met特異性抗體或其片段，其包含c-met特異性抗體的重鏈可變區(qū)和c-met特異性抗體的輕鏈可變區(qū)，所述重鏈可變區(qū)包含seqidno:1的氨基酸序列所示的重鏈可變區(qū)cdr1、seqidno:2的氨基酸序列所示的重鏈可變區(qū)cdr2、和seqidno:3的氨基酸序列所示的重鏈可變區(qū)cdr3；所述輕鏈可變區(qū)包含seqidno:4的氨基酸序列所示的輕鏈可變區(qū)cdr1、seqidno:5的氨基酸序列所示的輕鏈可變區(qū)cdr2、和seqidno:6的氨基酸序列所示的輕鏈可變區(qū)cdr3。具體而言，本發(fā)明通過使用噬菌體展示方法從單鏈fv(scfv)噬菌體文庫獲得了與c-met以高親和力和特異性結(jié)合的完全人抗體。噬菌體文庫和噬菌體展示可通過如美國專利號7,063,943、美國專利號6,172,197等公開的那樣制備。通過上述的方法獲得并提供的根據(jù)本發(fā)明的c-met特異性抗體具有重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，所述重鏈可變區(qū)包含分別具有seqidno:1、2和3的序列的重鏈可變區(qū)cdr1(hcdr1)、重鏈可變區(qū)cdr2(hcdr2)和重鏈可變區(qū)cdr3(hcdr3)，所述輕鏈可變區(qū)包含分別具有seqidno:4、5和6的序列的輕鏈可變區(qū)cdr1(lcdr1)、輕鏈可變區(qū)cdr2(lcdr2)和輕鏈可變區(qū)cdr3(lcdr3)。在本發(fā)明示例性的實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的c-met特異性抗體是1e4抗體，其包含具有seqidno:7的序列的重鏈可變區(qū)和具有seqidno:8的序列的輕鏈可變區(qū)。此外，本發(fā)明提供包含分別由seqidno:1、2和3所示的hcdr1、hcdr2和hcdr3的重鏈可變區(qū)和分別由seqidno:4、5和6所示的lcdr1、lcdr2和lcdr3的輕鏈可變區(qū)。優(yōu)選地，本發(fā)明提供1e4抗體的由seqidno:7所示的重鏈可變區(qū)和1e4抗體的由seqidno:8所示的輕鏈可變區(qū)?！颈?】根據(jù)本發(fā)明的c-met特異性抗體的重鏈和輕鏈的cdr和可變區(qū)序列如上文所述根據(jù)本發(fā)明的抗體片段可以為相同的目的使用。本發(fā)明的抗體片段包含具有與c-met結(jié)合的能力的單鏈抗體、雙抗體、三抗體、四抗體、fab片段、f(ab')2片段、fd、scfv、域抗體、雙特異性抗體、微抗體、scab、igd抗體、igm抗體、igg1抗體、igg2抗體、igg3抗體、igg4抗體、抗體恒定區(qū)的衍生物、基于蛋白支架的人工抗體等，但本發(fā)明不限于此。對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言不言自明的是，只要保持與c-met的結(jié)合功能，根據(jù)本發(fā)明的抗體片段也具有與根據(jù)本發(fā)明的抗體相同的特征。根據(jù)本發(fā)明的抗體片段可通過切割完整的抗體或表達(dá)編碼所述片段的dna而產(chǎn)生。所述抗體片段可通過如已知文件所述的方法產(chǎn)生(lamoyietal.,j.immunol.methods,56:235,1983；parham,j.immunol.,131:2895,1983)。在本發(fā)明的scfv中，重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)序列可通過接頭彼此連接，其中所述接頭優(yōu)選為氨基酸接頭，且根據(jù)本發(fā)明的1e4抗體的scfv中接頭的氨基酸序列可以是seqidno:9的序列，且整個(gè)scfv可以是seqidno:10的序列。在本發(fā)明示例性的實(shí)施方案中，在c-met特異性人抗體1e4的場合，確認(rèn)了即使無hgf處理c-met亦被磷酸化，且通過使用犬腎上皮細(xì)胞mdck-2細(xì)胞確認(rèn)細(xì)胞分散能力，結(jié)果確認(rèn)了細(xì)胞分散能力與陽性對照組——hgf處理的細(xì)胞組在相同水平(圖6)。此外，可變區(qū)中發(fā)生修飾的抗體只要保持本發(fā)明抗體的特征也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。作為其實(shí)例，可包括可變區(qū)中氨基酸的保守取代。保守取代意為使用具有與原始氨基酸序列相似特征的其他氨基酸殘基的取代，例如，賴氨酸、精氨酸和組氨酸的相似的特性在于具有堿性側(cè)鏈；天冬氨酸和谷氨酸的相似特性在于具有酸性側(cè)鏈。此外，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸和色氨酸的相似特點(diǎn)在于具有不帶電的極性側(cè)鏈，且丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、蘇氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸和甲硫氨酸的相似特點(diǎn)在于具有非極性側(cè)鏈，且酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和組氨酸的相似特點(diǎn)在于具有具有芳香族側(cè)鏈。因此，對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言不言自明的是，即使即使發(fā)生上述具有相似特征的組內(nèi)的氨基酸置換，也不會導(dǎo)致顯著的特征改變，由于在可變區(qū)中保守取代而修飾的這些抗體也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)，只要其保持本發(fā)明抗體的特征。此外，根據(jù)本發(fā)明的c-met特異性抗體包括通過如直接突變、親和力成熟、噬菌體展示、鏈改組等方法具有改進(jìn)的親和力和特異性的抗體。可通過突變cdr并篩選對應(yīng)具有合意特征的抗原結(jié)合位點(diǎn)的cdr，來改進(jìn)和修飾親和力和特異性(yangetal.,j.mol.bio.,254:392,1995)。cdr可以多種方式突變。例如，一種方法是隨機(jī)化開發(fā)的殘基或殘基組合，使得在相同抗原結(jié)合位點(diǎn)的群體中在特定位置處出現(xiàn)全部20種氨基酸，且可通過引起突變的易錯(cuò)pcr法在整個(gè)cdr殘基的范圍內(nèi)引入突變(hawkinsetal.,j.mol.bio.,226:889,1992)。在大腸桿菌的突變株中復(fù)制包含重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)基因的噬菌體展示載體(噬菌粒)(lowetal.,j.mol.biol.,250:359,1996)。這些誘變方法是本領(lǐng)域中通常使用的方法。此外，根據(jù)本發(fā)明的抗體或其片段可以與其他材料組合的偶聯(lián)物的形式使用。因此，本發(fā)明提供抗體-藥物偶聯(lián)物，其中組合了根據(jù)本發(fā)明的c-met特異性抗體和治療藥物。可用于根據(jù)本發(fā)明的抗體-藥物偶聯(lián)物的治療藥物可不受限制使用，只要其滿足本發(fā)明的目的。本發(fā)明提供藥物組合物，其包含根據(jù)本發(fā)明的抗體或其片段。所述藥物組合物可進(jìn)一步包含藥物上可接受的常規(guī)載劑、賦形劑等。另一方面，本發(fā)明提供編碼c-met特異性抗體的重鏈可變區(qū)的多核苷酸、包含所述多核苷酸的重組載體、編碼所述c-met特異性抗體輕鏈可變區(qū)的多核苷酸和包含所述多核苷酸的重組載體。編碼根據(jù)本發(fā)明的抗體或其片段的可變區(qū)的多核苷酸序列優(yōu)選具有eqidno:11的重鏈可變區(qū)和seqidno:12的輕鏈可變區(qū)，但本發(fā)明不限于此。此外，對本發(fā)明所述領(lǐng)域的技術(shù)人員(后文稱為本領(lǐng)域的技術(shù)人員)不言自明的是，可能具有簡并序列，即編碼與seqidno:7所示的重鏈可變區(qū)和seqidno:8所示的輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列相同的氨基酸序列但具有不同多核苷酸序列的序列，且本領(lǐng)域的技術(shù)人員顯然也能夠從seqidno:1-6所示的相應(yīng)cdr序列推斷編碼本發(fā)明提供的每條重鏈和輕鏈的cdr序列的多核苷酸序列。【表2】編碼根據(jù)本發(fā)明的c-met特異性抗體可變區(qū)的多核苷酸序列本發(fā)明提供包含所述多核苷酸序列的重組載體、包含所述載體的宿主細(xì)胞和通過使用重組載體或宿主細(xì)胞產(chǎn)生與本發(fā)明的c-met(c-met特異性抗體)特異性結(jié)合的抗體的方法。具體而言，本發(fā)明的c-met特異性抗體優(yōu)選通過在基因重組方法中包括表達(dá)和純化步驟而產(chǎn)生，且具體地，優(yōu)選通過分別表達(dá)編碼本發(fā)明的c-met特異性抗體的每一個(gè)可變區(qū)，或通過在一個(gè)宿主細(xì)胞中同時(shí)表達(dá)編碼本發(fā)明的c-met特異性抗體的可變區(qū)而產(chǎn)生。此外，可讓編碼前導(dǎo)序列的多核苷酸位于本發(fā)明抗體的n-末端，用于產(chǎn)生根據(jù)本發(fā)明的抗體。此外，為了促進(jìn)分離和純化，并分析所產(chǎn)生的抗體，可附加標(biāo)簽。代表性的標(biāo)簽是his-標(biāo)簽，但本發(fā)明不限于此。本發(fā)明中的術(shù)語“重組載體”是能夠在適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中表達(dá)靶蛋白的表達(dá)載體，且表示包含彼此可操作連接的基本控制元件使得基因插入物得以表達(dá)的基因構(gòu)建體。本發(fā)明中的術(shù)語“可操作連接”意為核酸表達(dá)控制序列和編碼合意蛋白的核酸序列功能性地彼此連接，以實(shí)施一般功能。與重組載體的可操作連接可通過使用本領(lǐng)域已知的基因重組技術(shù)實(shí)施，位點(diǎn)特異性的dna裂解和連接可通過使用本領(lǐng)域一般知曉的酶容易地實(shí)施。本發(fā)明適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體可包括用于膜靶向或分泌的信號序列以及啟動子、起始密碼子、終止密碼子和表達(dá)控制元件如多聚腺苷酸化信號和增強(qiáng)子。起始密碼子和終止密碼子一般視為編碼免疫靶蛋白的核苷酸的部分，且當(dāng)施用基因構(gòu)建體時(shí)，應(yīng)在注射的受試者中呈現(xiàn)功能，故應(yīng)該與編碼序列合框。一般啟動子可以是構(gòu)成型或誘導(dǎo)型的。原核細(xì)胞具有l(wèi)ac、tac、t3和t7啟動子，但本發(fā)明不限于此。真核細(xì)胞具有猴病毒40(sv40)啟動子、小鼠乳腺腫瘤病毒(mmtv)啟動子、人免疫缺陷病毒(hiv)例如hiv長末端重復(fù)(ltr)啟動子、莫洛尼病毒(moloneyvirus)、巨細(xì)胞病毒(moloneyvirus，cmv)、eb病毒(epstein-barrvirus，ebv)、勞斯肉瘤病毒(roussarcomavirus，rsv)啟動子，且還具有β-肌動蛋白啟動子、人類血紅蛋白、人肌肉肌酸、人金屬硫蛋白來源的啟動子，但本發(fā)明不限于此。表達(dá)載體可包含用于選擇包含載體的宿主細(xì)胞的選擇標(biāo)記。選擇標(biāo)記用于篩選所述載體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，可以使用賦予藥物耐性、營養(yǎng)缺陷型、對細(xì)胞毒性劑的耐性，或表面蛋白的表達(dá)等可選擇表型的標(biāo)記。由于只有表達(dá)選擇標(biāo)記的細(xì)胞才能夠在使用選擇劑處理的環(huán)境中存活，使得轉(zhuǎn)化的細(xì)胞能夠被選擇。此外，當(dāng)載體為可復(fù)制表達(dá)載體時(shí)，載體可包含復(fù)制起點(diǎn)，復(fù)制起點(diǎn)是起始復(fù)制的特定核酸序列。作為用于插入外源基因的重組表達(dá)載體，可使用多種載體如質(zhì)粒、病毒、粘粒載體等。重組載體的種類沒有特別限制，只要其在多種原核細(xì)胞和真核細(xì)胞的宿主細(xì)胞中表達(dá)合意的基因，并產(chǎn)生合意的蛋白即可，但優(yōu)選保有強(qiáng)活性的啟動子和強(qiáng)表達(dá)力，并能夠以與天然狀態(tài)相似的形式產(chǎn)生大量外源蛋白的載體。為表達(dá)根據(jù)本發(fā)明的二重靶抗體，可使用多種表達(dá)宿主/載體組合。適于真核宿主的表達(dá)載體的實(shí)例包括源自sv40、牛乳頭瘤病毒(bovinepapillomavirus)、腺病毒(adenovirus)、腺伴隨病毒(adeno-associatedvirus)、巨細(xì)胞病毒(cytomegalovirus)、桿狀病毒(baculovirus)和逆轉(zhuǎn)錄病毒(retrovirus)的表達(dá)控制序列，但本發(fā)明不限于此。能夠在細(xì)菌宿主中使用的表達(dá)載體的實(shí)例包括從大腸桿菌獲得的細(xì)菌質(zhì)粒，如pet、prset、pbluescript、pgex2t、puc載體、cole1、pcr1、pbr322、pmb9及其衍生物；具有更大宿主范圍的質(zhì)粒，如rp4；噬菌體dna，如λgt10和λgt11、nm989等非常多樣的噬菌體λ衍生物，以及其他dna噬菌體如m13和絲狀單鏈dna噬菌體。具體而言，對于在大腸桿菌中表達(dá)，可包括編碼鄰氨基苯甲酸合酶(trpe)和在羧基末端的多聚接頭的dna序列，且其他表達(dá)載體系統(tǒng)基于β-半乳糖苷酶(pex)；λpl麥芽糖結(jié)合蛋白(pmal)和谷胱甘肽s-轉(zhuǎn)移酶(gene67:31,1988；peptideresearch3:167,1990)。當(dāng)需要在酵母中實(shí)施表達(dá)時(shí)，適用于在酵母中使用的基因是在酵母質(zhì)粒yrp7中存在的trpl基因(stinchcombetal.,nature,282:39,1979；kingsmanetal,gene,7:141,1979)。trpl基因提供在色氨酸中缺乏生長能力的酵母突變株，如atccno.44076或pep4-1(jones,genetics,85:12,1977)等的選擇標(biāo)記。因此，酵母宿主細(xì)胞基因組中trpl損壞的存在通過在缺乏色氨酸條件下的生長而提供了用于檢測轉(zhuǎn)化的有效環(huán)境。相似地，leu2-缺陷型酵母株(atccno.20,622或no.38,626)可被已知的包含leu2基因的質(zhì)粒補(bǔ)全。在酵母細(xì)胞中有用的表達(dá)載體是2μ質(zhì)粒及其衍生物，在昆蟲細(xì)胞中有用的載體是pvl941。本發(fā)明的表達(dá)載體可包含與待表達(dá)的dna序列或其片段可操作地連接的一個(gè)或多個(gè)表達(dá)控制序列。表達(dá)控制序列插入載體以調(diào)節(jié)或控制克隆的dna序列的表達(dá)。有用的表達(dá)控制序列的實(shí)例可包括lac系統(tǒng)、trp系統(tǒng)、tac系統(tǒng)、trc系統(tǒng)、噬菌體λ的主要的操縱基因和啟動子區(qū)、fd包被蛋白的控制區(qū)、酵母的糖酵解啟動子如3-磷酸甘油酸激酶的啟動子、酵母酸性磷酸酶的啟動子如pho5的啟動子和酵母α-交配因子和源自多瘤病毒、腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒和猴病毒的啟動子如sv40的早期和晚期啟動子，和其他已知控制原核細(xì)胞或真核細(xì)胞及其病毒的基因表達(dá)的序列，及其組合。另一方面，本發(fā)明涉及使用所述重組載體轉(zhuǎn)化的重組細(xì)胞。在本發(fā)明中，所述重組細(xì)胞是使用包含編碼c-met特異性抗體的重鏈可變區(qū)的多核苷酸的重組載體和包含編碼c-met特異性抗體的輕鏈可變區(qū)的多核苷酸的重組載體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。另一方面，本發(fā)明提供使用所述重組細(xì)胞或其片段產(chǎn)生c-met特異性抗體的方法，其中所述方法包括培養(yǎng)重組細(xì)胞并從所述培養(yǎng)的重組細(xì)胞分離c-met特異性抗體。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的c-met特異性抗體優(yōu)選根據(jù)基因重組方法通過表達(dá)和純化獲得。具體地，編碼抗體的重鏈可變區(qū)或完整重鏈區(qū)的基因序列和編碼輕鏈可變區(qū)或完整輕鏈區(qū)的基因序列可在一個(gè)載體中、或分別在兩個(gè)載體中表達(dá)，但本發(fā)明不限于此。具體地，產(chǎn)生c-met特異性抗體的方法可包括：通過將編碼本發(fā)明的c-met特異性抗體的核苷酸序列插入載體產(chǎn)生重組載體；用該重組載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞并培養(yǎng)；并從所述培養(yǎng)的轉(zhuǎn)化體分離并純化c-met特異性抗體。此外，c-met特異性抗體可通過在營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)表達(dá)的重組載體的而轉(zhuǎn)化體大量制造，培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件可取決于宿主細(xì)胞使用適當(dāng)?shù)剡x擇。溫度、培養(yǎng)基的ph、培養(yǎng)時(shí)間等條件可適當(dāng)控制，使其適于培養(yǎng)時(shí)的細(xì)胞生長和蛋白的大量生產(chǎn)。如上文所述重組產(chǎn)生的c-met特異性抗體可從培養(yǎng)基或細(xì)胞裂解物回收。在膜偶聯(lián)類型的情況中，可通過使用適當(dāng)?shù)谋砻婊钚詣┤芤?例如：tritone-x100)或酶裂解來分離膜。在表達(dá)c-met特異性抗體中使用的細(xì)胞可由多種物理或化學(xué)方式如凍融純化、超聲處理、機(jī)械破壞和細(xì)胞分解劑，可通過一般的生化分離技術(shù)分離和純化(sambrooketal.,molecularcloning:alaboratorymanual,2nded.,coldspringharborlaboratorypress(1989)；deuscher,m.,guidetoproteinpurificationmethodsenzymology,vol.182.academicpress.inc.,sandiego,ca(1990))?？捎玫姆椒ㄓ须娪尽㈦x心、凝膠過濾、沉淀、透析、色譜法(離子交換色譜、親和色譜、免疫吸附色譜色譜、尺寸排阻色譜等)、等電聚焦和多種改變和復(fù)雜方法，但本發(fā)明不限于此。此后，本發(fā)明將參照下述實(shí)施例進(jìn)行更詳細(xì)的說明。然而，下述實(shí)施例僅為例示本發(fā)明，本領(lǐng)域的技術(shù)人員顯然實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的范圍不應(yīng)理解為受這些實(shí)施例限制。實(shí)施例1:生物淘選在生物淘選中使用的完全人非免疫單鏈抗體(scfv)噬菌體展示文庫是在之前注冊的專利中(韓國專利號10-0883430)建立的噬菌體展示文庫。為回收其中展示單鏈的噬菌體，使噬菌體文庫儲液生長至對數(shù)期，并通過m13k07輔助噬菌體(gehealthcare,usa)拯救，且隨后通過添加1mmiptg至包含34μg/ml的氯霉素(cm)和70μg/ml的卡那霉素的2xyt培養(yǎng)基，在30℃擴(kuò)增過夜。使用人fc去除顯示抗人fcscfv的噬菌體。為阻斷其他非特異性結(jié)合，讓噬菌體制備物在4％peg6000/0.5mnacl中沉淀，并在包含500μg/ml的人fc蛋白的2％脫脂牛奶/pbs中重懸，隨后在37℃溫育1小時(shí)。對于用5μg/ml的c-met-fc(r&dsystems，重組人hgfr/c-metfc嵌合(目錄號358-mt/cf))包被的96孔nunc-immuno板(nunc,denmark)，首先使用2％脫脂牛奶/pbs在室溫封閉2小時(shí)，然后在室溫接種3x1011pfu的噬菌體制劑1小時(shí)。使用pbst(包含0.1％tween20的pbs)洗滌管5次，再用pbs洗滌5次。結(jié)合型的噬菌體用100mm三乙胺溶液在室溫歷時(shí)10分鐘洗脫。將洗脫的噬菌體與10ml的中對數(shù)期(mid-log)xl1-blue細(xì)胞共同在37℃靜置30分鐘，而后震蕩培養(yǎng)30分鐘。隨后，將經(jīng)感染的xl1-blue細(xì)胞在30℃于包含1％葡萄糖的2xyt/cm+板上培養(yǎng)過夜。在首次生物淘選后，通過將洗滌次數(shù)順次增加至10次、15次和20次來實(shí)施第二、第三和第四次生物淘選。實(shí)施第4次淘選后，再次通過c-met結(jié)合測定確認(rèn)所獲得的噬菌體的c-met的結(jié)合能力。為實(shí)施c-met結(jié)合測定，將用100ng的c-met(r&dsystem)包被過夜的微孔板與2％脫脂牛奶/pbs在37℃反應(yīng)2小時(shí)。使用pbs洗滌微孔板，并將每次淘選獲得的噬菌體在室溫反應(yīng)1小時(shí)。使用pbs洗滌反應(yīng)溶液，用hrp(辣根過氧化物酶)偶聯(lián)的小鼠抗m13抗體(gehealthcare)在室溫反應(yīng)1小時(shí)。反應(yīng)完成后的孔通過使用tmb溶液(bd)誘導(dǎo)顯色并在450nm測量吸收(圖1)。結(jié)果確認(rèn)了1e4、1a5、1d9、2h3、3d1和3f1具有結(jié)合c-met的能力。實(shí)施例2:可溶性scfv的產(chǎn)生和純化為了制造與實(shí)施例1中已確認(rèn)了c-met結(jié)合能力的1e4-scfv、1a5-scfv、1d9-scfv、2h3-scfv、3d1-scfv和3f1-scfv相應(yīng)的可溶性1e4-scfv、1a5-scfv、1d9-scfv、2h3-scfv、3d1-scfv和3f1-scfv，將通過生物淘選獲得的pak-1e4、pak-1a5、pak-1d9、pak-2h3、pak-3d1和pak-3f1使用xbai和ecori切割，獲得具有1e4-scfv、1a5-scfv、1d9-scfv、2h3-scfv、3d1-scfv和3f1-scfv序列的片段，并將這些片段插入使用相同限制酶獲得的大腸桿菌表達(dá)載體(pet21b-6a6,novagen,u.s.a.)，產(chǎn)生pet21b-1e4、pet21b-1a5、pet21b-1d9、pet21b-2h3、pet21b-3d1和pet21b-3f1。將產(chǎn)生的pet21b-1e4、pet21b-1a5、pet21b-1d9、pet21b-2h3、pet21b-3d1和pet21b-3f1轉(zhuǎn)化入大腸桿菌bl21(de3)用于蛋白表達(dá)，利用轉(zhuǎn)化體表達(dá)可溶性scfv蛋白，再離心細(xì)胞。隨后，通過使用包含20％蔗糖，200μg/ml溶菌酶和蛋白酶抑制劑雞尾酒(roche,switzerland)的50mmtris(ph8.0)溶液獲得細(xì)胞的周質(zhì)級分。獲得的級分用ni-nta離心試劑盒(qiagen,germany)處理以純化scfv蛋白。實(shí)施例3:使用scfv的c-met結(jié)合測定確認(rèn)了實(shí)施例2中純化的可溶性1e4-scfv、1a5-scfv、1d9-scfv、2h3-scfv、3d1-scfv和3f1-scfv是否具有結(jié)合c-met的能力。為此，用100ngc-met包被96孔nunc-immuno板(nunc,denmark)，于4℃過夜，隨后與2％脫脂牛奶/pbs在37℃反應(yīng)2小時(shí)。反應(yīng)完成后，使用pbs洗滌平板，將純化的scfv添加到其中，室溫反應(yīng)1小時(shí)。反應(yīng)完成后，使用pbs洗滌平板，添加hrp偶聯(lián)的抗myc小鼠抗體(sigma,usa)在室溫反應(yīng)1小時(shí)。隨后，使產(chǎn)物與tmb溶液反應(yīng)，并在450nm測量吸收。結(jié)果，如圖2所示，確認(rèn)了純化的1e4-scfv、1a5-scfv、1d9-scfv、2h3-scfv、3d1-scfv和3f1-scfv全部具有結(jié)合c-met的能力。實(shí)施例4:igg的表達(dá)和純化為表達(dá)成為完整的igg形式，產(chǎn)生了包含完整的恒定區(qū)的重鏈表達(dá)載體和輕鏈表達(dá)載體。對于重鏈，將使用sfii處理過的具有人4-1bb重鏈骨架的pigghd載體(aprogen,korea)與使用sfii處理pakscfv的重鏈可變區(qū)獲得的片段連接，產(chǎn)生包含完整重鏈恒定區(qū)和重鏈可變區(qū)的表達(dá)載體pigghd-1e4hvy、pigghd-1a5hvy、pigghd-1d9hvy、pigghd-2h3hvy、pigghd-3d1hvy和pigghd-3f1hvy(圖3)。對于輕鏈，將使用bstxi處理的具有人4-1bb的輕鏈骨架的piggld載體(aprogen,korea)與使用bstxi處理pak-scfv的輕鏈可變區(qū)獲得的片段連接，產(chǎn)生了包含完整輕鏈恒定區(qū)和輕鏈可變區(qū)的表達(dá)載體piggld-1e4lgt、piggld-1a5lgt、piggld-1d9lgt、piggld-2h3lgt、piggld-3d1lgt和piggld-3f1lgt。為了表達(dá)igg，將相同量的輕鏈表達(dá)載體和重鏈表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染入hek-293t細(xì)胞中。將轉(zhuǎn)染的細(xì)胞在無血清培養(yǎng)基freestyle293中培養(yǎng)(37℃，5％co2)，隨后收集培養(yǎng)基。根據(jù)制造商所述的方案，使用蛋白a柱(gehealthcare,usa)通過親和層析從上清液純化1e4-igg、1a5-igg、1d9-igg、2h3-igg、3d1-igg和3f1-igg。將上清液注射入以20mm磷酸鈉(ph7.0)和100mmnacl溶液平衡的蛋白a柱，并使用包含20mm磷酸鈉(ph7.0)、1mmedta和500mmnacl的溶液洗滌，隨后使用包含100mmnacl的0.1m甘氨酸-hcl(ph3.3)溶液洗脫。洗脫的蛋白使用1mtris中和。將洗脫的蛋白與5mm磷酸鈉(ph6.0)以1:1的比率混合，并注射入用含有50mmnacl的5mm磷酸鈉(ph6.0)平衡的預(yù)裝填sp-瓊脂糖(gehealthcare)柱。使用包含50mmnacl的磷酸鈉(ph7.0)緩沖液洗脫與柱結(jié)合的蛋白，并注射入使用洗脫緩沖液平衡的預(yù)裝填q-sepharose(gehealthcare)，由此獲得未結(jié)合的蛋白。獲得的蛋白通過30kdvivaspin20(sartorius)濃縮并使用pbs透析。通過上述方法純化的1e4-igg、1a5-igg、1d9-igg、2h3-igg、3d1-igg和3f1-igg蛋白中若干者的sds-page結(jié)果示于圖5中。實(shí)施例5:c-met特異性抗體的分散能力(scattering)分析為評估6種c-met特異性抗體的分散能力，培養(yǎng)了犬腎上皮細(xì)胞mdck-2(madin-darby犬腎上皮細(xì)胞-2)。在24孔板中以2x104細(xì)胞/孔的濃度，使用添加有5％胎牛血清的dmem培養(yǎng)細(xì)胞。培養(yǎng)1天后，一旦細(xì)胞良好附著于平板生長，使用10μg/ml的抗體或30ng/ml或50ng/ml的hgf處理細(xì)胞。培養(yǎng)16小時(shí)后，通過使用水晶紫(sigma-aldrich,u.s.a)染色并拍攝圖像來評估細(xì)胞的分散和生長(圖6)。結(jié)果，如圖6中所示，可以確認(rèn)在6種抗體中，僅在1e4處理時(shí)細(xì)胞與陽性對照組hgf處理組的分散和生長相同。實(shí)施例6:通過蛋白免疫印跡的體內(nèi)c-met磷酸化分析為再次確認(rèn)如實(shí)施例5中所示的1e4作為激動劑的活性，通過蛋白免疫印跡測量了c-met特異性抗體1a5和1e4對c-met的磷酸化活性。將過表達(dá)c-met的直腸癌細(xì)胞系ht29細(xì)胞以2x105在6孔板中培養(yǎng)24小時(shí)，并在不包含胎牛血清的rpmi培養(yǎng)基條件下于無血清培養(yǎng)基中處理6小時(shí)，然后用10μg/ml的higg和c-met抗體預(yù)處理30分鐘。隨后在處理組中處理30ng/ml的人hgf15分鐘。為了蛋白免疫印跡分析，用裂解緩沖液(1％(w/v)sds、10mmtris(ph7.4)、1mmna3vo4(原釩酸鈉)、2mmegta、2mmedta、1mm苯甲基磺酰氟、1mm氟化鈉和1x蛋白酶抑制劑結(jié)尾酒(sigma))處理獲得裂解物，將裂解物煮沸，隨后在4℃以10,000g離心5分鐘以去除不可溶的沉淀。將上清與sds樣品緩沖液混合并煮沸10分鐘備用。sds-page和蛋白免疫印跡通過本領(lǐng)域公知的方法實(shí)施，且使用的樣品如下提供：4-20％sds-聚丙烯酰胺凝膠(biorad,u.s.a.)、pvdf膜(millipore#ipvh00010,u.s.a.)、抗c-met抗體(santacruz,u.s.a.)和抗磷酸化-c-met抗體(cellsignalingtechnology,u.s.a.)作為一抗用于分析c-met磷酸化活性；抗p-erk抗體(cellsignalingtechnology,u.s.a.)和hrp-偶聯(lián)的山羊抗小鼠igg抗體(santacruzbiotechnology,u.s.a.)和hrp-偶聯(lián)的山羊抗兔igg(cellsignalingtechnology,u.s.a.)作為與一抗結(jié)合用于化學(xué)發(fā)光的二抗(圖7)。結(jié)果，如圖7中所示，可以確認(rèn)1e4即使在單獨(dú)處理時(shí)也具有磷酸化c-met的能力。實(shí)施例7:抗c-metigg(1e4-igg)結(jié)合能力的分析通過biacore(gehealthcare)測量抗體與c-met的結(jié)合能力。根據(jù)制造商的說明，通過在cm5芯片(gehealthcare,sweden)上固定小鼠c-met和人c-met(r&dsystem)，并使不同量的抗體流過而獲得傳感圖。以在每種濃度獲得的傳感圖為基礎(chǔ)測定速率常數(shù)kon和koff，并從速率常數(shù)的比率(koff/kon)計(jì)算kd(表3)。結(jié)果，1e4-igg不但具有與人c-met的結(jié)合能力，還具有與小鼠c-met的高結(jié)合能力(圖8)?！颈?】根據(jù)本發(fā)明的抗體的ka、kd和kd值ka(1/ms)kd(1/s)kd(m)小鼠c-met-fc2.58x1061.59x10-36.15x10-10人c-met-fc2.71x1068.07x10-42.98x10-10盡管已對本發(fā)明的特定實(shí)施方案進(jìn)行了詳述，對本領(lǐng)域的技術(shù)人員將顯而易見的是，具體的說明僅為優(yōu)選的示例性實(shí)施方案，不應(yīng)理解為限制了本發(fā)明的范圍。因此，本發(fā)明的實(shí)質(zhì)范圍將由隨附的權(quán)利要求及其等同物所限定。工業(yè)實(shí)用性根據(jù)本發(fā)明的c-met特異性抗體能夠特異性地與c-met以高親和力結(jié)合并具有激動劑功能。當(dāng)前第1頁12