發(fā)明背景在由高等真核生物表達(dá)的蛋白質(zhì)上進(jìn)行包括甲基化、硫酸化、磷酸化、脂質(zhì)添加和糖基化在內(nèi)的多種翻譯后修飾。糖基化包括糖部分共價(jià)附接至特定氨基酸，且為重組蛋白質(zhì)最常見(jiàn)且最重要的翻譯后修飾之一。蛋白質(zhì)糖基化在包括蛋白質(zhì)折疊和質(zhì)量控制、分子運(yùn)輸和分類以及細(xì)胞表面受體相互作用在內(nèi)的多種功能中起作用。已知許多分泌性蛋白質(zhì)、膜蛋白和靶向泡囊或某些細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器的蛋白質(zhì)都進(jìn)行糖基化。雖然糖基化可以有許多形式，但n連接的糖基化是最常見(jiàn)的。n連接的糖基化涉及使寡糖加至在蛋白質(zhì)中的某些識(shí)別序列(例如asn-x-ser/thr)中發(fā)現(xiàn)的天冬酰胺殘基上。n連接的糖蛋白含有由甘露糖、半乳糖、n-乙酰葡糖胺和神經(jīng)氨酸構(gòu)成的標(biāo)準(zhǔn)分支結(jié)構(gòu)。重組表達(dá)的治療性抗體的fc結(jié)構(gòu)域的n連接的糖基化是一種關(guān)鍵的翻譯后修飾。典型的治療性抗體具有復(fù)雜的糖型，該糖型具有其中三甘露糖基核心在每個(gè)分支上由n-乙酰半乳糖胺(glcnac)、半乳糖和n-乙酰神經(jīng)氨酸(neu5ac)殘基封端的巖藻糖基化雙觸角聚糖。其它糖型可以是非巖藻糖基化型，半乳糖基化型，唾液酸化型，具有末端或等分glcnac，具有高量甘露糖(5-9個(gè)殘基)等等。糖基化會(huì)影響重組蛋白藥物的治療功效。眾所周知fc糖基化的變異會(huì)影響fc介導(dǎo)的效應(yīng)功能。例如半乳糖基化和唾液酸化等一些糖型是降低免疫原性所需要的，而例如非巖藻糖基化、二分glcnac殘基和高量甘露糖聚糖等其它糖型增強(qiáng)抗體依賴性細(xì)胞毒性(adcc)活性。糖基化對(duì)決定治療性抗體的結(jié)構(gòu)和功能來(lái)說(shuō)是重要的。一旦被引入治療應(yīng)用后，其決定著結(jié)合能力，并常常決定抗體的識(shí)別和加工。在半乳糖基化和巖藻糖基化的情況下，其分別決定其影響的補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(cdc)活性和adcc功能。β-半乳糖基化水平與更“成熟”的糖型有關(guān)。添加半乳糖為在分泌前在高爾基體中發(fā)生的糖基化的最后階段之一。唾液酸化需要末端半乳糖，唾液酸化可能是一些蛋白質(zhì)的糖基化中的最后一步。半乳糖還用作半乳糖結(jié)合蛋白的配體，且為與碳水化合物水平有關(guān)的多種抗原反應(yīng)的基礎(chǔ)。還展示了半乳糖影響溶液中蛋白質(zhì)的構(gòu)形。(furukawa和sato，(1999)biochimicaetbiophysicaacta(bba)，1473(1)，第54-86頁(yè)和houde等人，(2010)molecularandcellularproteomics，9(8)，第1716-1728頁(yè)。巖藻糖基化還作為在分泌前蛋白質(zhì)成熟的一部分在高爾基體中進(jìn)行。如果蛋白質(zhì)進(jìn)行巖藻糖基化，那么其典型地在糖基化通路中的半乳糖基化前發(fā)生。然而，巖藻糖基化并非進(jìn)行半乳糖基化所必需的(hossler等人，(2009)_glycobiology，19(9)，第936-949頁(yè))。糖基化對(duì)治療性糖蛋白的生物活性、藥物動(dòng)力學(xué)、免疫原性、溶解性和體內(nèi)清除的影響已經(jīng)使得糖基化的監(jiān)測(cè)和控制成為生物制藥的關(guān)鍵參數(shù)。因此，操控治療性蛋白質(zhì)的聚糖含量水平的方法將是有益的。在制藥行業(yè)中需要操控和控制重組治療性糖蛋白的聚糖含量水平，且實(shí)現(xiàn)此同時(shí)不顯著影響細(xì)胞生長(zhǎng)、存活力和生產(chǎn)率的方法將是適用的。本發(fā)明提供了一種通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞培養(yǎng)基中銅和錳的水平和ph值來(lái)操控重組蛋白質(zhì)上的巖藻糖基化聚糖含量的方法。發(fā)明概要本發(fā)明提供了一種操控重組蛋白質(zhì)上的巖藻糖基化聚糖含量的方法，所述方法包括將生物反應(yīng)器用表達(dá)所述重組蛋白質(zhì)的宿主細(xì)胞接種，在無(wú)血清的化學(xué)成分確定的細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)宿主細(xì)胞；其中細(xì)胞培養(yǎng)基包括10至100ppb銅和50至1000nm錳，ph7.0；收獲由宿主細(xì)胞產(chǎn)生的重組蛋白質(zhì)，其中與在相同細(xì)胞培養(yǎng)基中在較低ph下獲得的非巖藻糖基化聚糖水平相比，所述重組蛋白質(zhì)上的非巖藻糖基化聚糖水平有所增加。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法進(jìn)一步包括增加重組蛋白質(zhì)上的β-半乳糖基化水平。在一個(gè)實(shí)施方案中，銅濃度為100ppb。在一個(gè)實(shí)施方案中，錳濃度為1000nm。在一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)巖藻糖基化聚糖含量進(jìn)行操作以影響重組蛋白質(zhì)的效應(yīng)功能。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法進(jìn)一步包括溫度變動(dòng)。在一相關(guān)實(shí)施方案中，溫度變動(dòng)是從36℃至31℃。在另一相關(guān)實(shí)施方案中，溫度變動(dòng)是在生長(zhǎng)期與生產(chǎn)期之間進(jìn)行轉(zhuǎn)變時(shí)發(fā)生。在又一相關(guān)實(shí)施方案中，溫度變動(dòng)是在生產(chǎn)期期間發(fā)生。在一個(gè)實(shí)施方案中，將表達(dá)重組蛋白質(zhì)的宿主細(xì)胞以分批培養(yǎng)、補(bǔ)料分批培養(yǎng)、灌注培養(yǎng)或其組合進(jìn)行培養(yǎng)。在一相關(guān)實(shí)施方案中，培養(yǎng)為灌注培養(yǎng)。在另一相關(guān)實(shí)施方案中，灌注包含連續(xù)灌注。在另一相關(guān)實(shí)施方案中，灌注速率是恒定的。在另一相關(guān)實(shí)施方案中，灌注以每天小于或等于1.0工作體積的速率進(jìn)行。在又一相關(guān)中，灌注通過(guò)交替切向流來(lái)實(shí)現(xiàn)。在一個(gè)實(shí)施方案中，生物反應(yīng)器具有至少500l的容量。在一個(gè)實(shí)施方案中，生物反應(yīng)器具有至少500l至2000l的容量。在一個(gè)實(shí)施方案中，生物反應(yīng)器具有至少1000l至2000l的容量。在一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)生物反應(yīng)器用至少0.5×106個(gè)細(xì)胞/毫升進(jìn)行接種。在一個(gè)實(shí)施方案中，無(wú)血清的化學(xué)成分確定的細(xì)胞培養(yǎng)基為灌注細(xì)胞培養(yǎng)基。在一個(gè)實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞為哺乳動(dòng)物細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞為中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(cho)細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，重組蛋白質(zhì)為糖蛋白。在一個(gè)實(shí)施方案中，重組蛋白質(zhì)選自人抗體、人源化抗體、嵌合抗體、重組融合蛋白或細(xì)胞因子。在一個(gè)實(shí)施方案中，由宿主細(xì)胞產(chǎn)生的重組蛋白質(zhì)被純化和配制成藥學(xué)上可接受的制劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，為一種由本發(fā)明的方法產(chǎn)生的重組蛋白質(zhì)。在一相關(guān)實(shí)施方案中，因此純化重組蛋白質(zhì)。在又一相關(guān)實(shí)施方案中，重組蛋白質(zhì)被配制成藥學(xué)上可接受的制劑。圖示簡(jiǎn)單說(shuō)明圖1積分活細(xì)胞密度(106個(gè)細(xì)胞天/毫升)ph6.8550mn2+10cu2+(具有+的灰虛線)ph6.8550mn2+100cu2+(具有+的灰線)ph6.851000mn2+10cu2+(具有空心圓的灰虛線)ph6.8550mn2+100cu2+(具有空心圓的灰線)ph7.050mn2+10cu2+(具有+的黑虛線)ph7.050mn2+100cu2+(具有+的黑線)ph7.01000mn2+10cu2+(具有空心圓的黑虛線)ph7.050mn2+100cu2+(具有空心圓的黑線)ph值似乎是影響細(xì)胞生長(zhǎng)的唯一因素。錳和銅的濃度似乎對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)沒(méi)有影響。圖2存活力(％)ph6.8550mn2+10cu2+(具有+的灰虛線)ph6.8550mn2+100cu2+(具有+的灰線)ph6.851000mn2+10cu2+(具有空心圓的灰虛線)ph6.8550mn2+100cu2+(具有空心圓的灰線)ph7.050mn2+10cu2+(具有+的黑虛線)ph7.050mn2+100cu2+(具有+的黑線)ph7.01000mn2+10cu2+(具有空心圓的黑虛線)ph7.050mn2+100cu2+(具有空心圓的黑線)到第17天，在ph6.85下的培養(yǎng)物與在ph7.0下的培養(yǎng)物相比最終存活力更高。然而，最終存活力超過(guò)80％，無(wú)論ph值為多少。在測(cè)試范圍內(nèi)的銅和錳濃度對(duì)存活力沒(méi)有影響。fig.3經(jīng)紅細(xì)胞壓積調(diào)整的滴度(g/l)ph6.8550mn2+10cu2+(具有+的灰虛線)ph6.8550mn2+100cu2+(具有+的灰線)ph6.851000mn2+10cu2+(具有空心圓的灰虛線)ph6.8550mn2+100cu2+(具有空心圓的灰線)ph7.050mn2+10cu2+(具有+的黑虛線)ph7.050mn2+100cu2+(具有+的黑線)ph7.01000mn2+10cu2+(具有空心圓的黑虛線)ph7.050mn2+100cu2+(具有空心圓的黑線)ph值似乎對(duì)經(jīng)紅細(xì)胞壓積調(diào)整的滴度沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的影響，同樣，銅和錳的濃度對(duì)此細(xì)胞系和過(guò)程沒(méi)有影響。圖4活細(xì)胞密度(105個(gè)細(xì)胞天/毫升)ph6.8550mn10cu(具有+的灰虛線)ph6.8550mn100cu(具有+的灰線)ph6.851000mn10cu(具有空心圓的灰虛線)ph6.8550mn2+100cu2+(具有空心圓的灰線)ph7.050mn2+10cu2+(具有+的黑虛線)ph7.050mn2+100cu2+(具有+的黑線)ph7.01000mn2+10cu2+(具有空心圓的黑虛線)ph7.050mn2+100cu2+(具有空心圓的黑線)在ph6.85下操作的反應(yīng)器比ph7.0下生長(zhǎng)的反應(yīng)器多生長(zhǎng)至每毫升幾乎106個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞密度。在針對(duì)此細(xì)胞系和過(guò)程的此實(shí)驗(yàn)中，銅和錳的濃度對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的影響。ph值為影響細(xì)胞生長(zhǎng)的唯一因素。圖5：使用jmp統(tǒng)計(jì)軟件產(chǎn)生的β-半乳糖基化(調(diào)整的r2＝0.95)預(yù)測(cè)剖析圖。該剖析圖說(shuō)明由于操控ph值和錳濃度而引起的β-半乳糖基化改變的方向和量值。剖析圖中的項(xiàng)目表示統(tǒng)計(jì)模型中在去除統(tǒng)計(jì)學(xué)上不顯著的那些項(xiàng)目后剩余的項(xiàng)目。錳的添加對(duì)β-半乳糖基化水平具有顯著影響；錳的濃度越大，β-半乳糖基化的百分比越大。ph值也對(duì)β-半乳糖基化具有統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的影響，當(dāng)ph值增加時(shí)，β-半乳糖基化也增加，但未達(dá)到添加錳時(shí)所觀測(cè)到的程度。圖6：使用jmp統(tǒng)計(jì)軟件產(chǎn)生的非巖藻糖基化(調(diào)整的r2＝0.92)預(yù)測(cè)剖析圖。該剖析圖說(shuō)明由于操控ph值、錳和銅濃度而引起的非巖藻糖基化改變的方向和量值。剖析圖中的項(xiàng)目表示統(tǒng)計(jì)模型中在去除統(tǒng)計(jì)學(xué)上不顯著的那些項(xiàng)目后剩余的項(xiàng)目。銅、錳和ph值都對(duì)非巖藻糖基化水平具有統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的影響。增加銅和錳的水平以及增加ph值都引起非巖藻糖基化增加。圖7在基礎(chǔ)非巖藻糖基化(4％)、6％非巖藻糖基化和8％非巖藻糖基化下的adcc相對(duì)細(xì)胞毒性。圖8在基礎(chǔ)β-半乳糖基化(2.7％)、25％β-半乳糖基化和50％β-半乳糖基化下的以cdc衡量的劑量反應(yīng)。發(fā)明詳述改變細(xì)胞培養(yǎng)基中的錳的濃度會(huì)影響重組抗體的β-半乳糖基化程度。錳在調(diào)節(jié)半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的活性中充當(dāng)輔因子。半乳糖基轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的反應(yīng)采用udp-半乳糖作為糖底物并采用錳作為輔因子。半乳糖基化水平的改變可以由udp-半乳糖可用性的改變或酶活性的改變(例如通過(guò)改變錳輔因子的濃度)或兩者引起。類似地，巖藻糖基化可以通過(guò)改變gdp-巖藻糖的水平，通過(guò)干擾巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的活性，或通過(guò)改變gdp-巖藻糖轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制來(lái)減輕。然而，尚未報(bào)導(dǎo)金屬離子在任一這些機(jī)制中起直接作用。如本文中所描述，發(fā)現(xiàn)增加錳和銅的水平通過(guò)顯著增加非巖藻糖基化聚糖水平而影響重組蛋白質(zhì)的巖藻糖基化聚糖含量。另外，發(fā)現(xiàn)ph值在決定糖基化模式中也起到重要的作用。已知igg1抗體上n連接的糖基化的類型和程度影響fc介導(dǎo)的效應(yīng)功能。舉例來(lái)說(shuō)，非巖藻糖基化水平通過(guò)增加對(duì)fcγ受體的結(jié)合親和力而有力地增強(qiáng)抗體依賴性的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(adcc)，而半乳糖基化水平會(huì)影響補(bǔ)體依賴性的細(xì)胞毒性(cdc)活性。此使得了解和控制治療性蛋白質(zhì)的糖基化的性質(zhì)和水平是關(guān)鍵的。如本文中所描述，非巖藻糖基化和半乳糖基化的增強(qiáng)對(duì)adcc和cdc效應(yīng)功能具有很大影響。提供了一種方法，所述方法通過(guò)操控ph值和細(xì)胞培養(yǎng)基中錳(mn2+)和銅(cu2+)的濃度，改善對(duì)重組蛋白質(zhì)上的非巖藻糖基化聚糖水平的控制。在不影響細(xì)胞培養(yǎng)性能下增加非巖藻糖基化和β-半乳糖基化聚糖水平。本發(fā)明提供了一種操控重組蛋白質(zhì)上的巖藻糖基化聚糖含量的方法，所述方法包括將生物反應(yīng)器用表達(dá)所述重組蛋白質(zhì)的宿主細(xì)胞接種，在無(wú)血清的化學(xué)成分確定的細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)宿主細(xì)胞；其中細(xì)胞培養(yǎng)基包括10至100ppb銅和50至1000nm錳，ph7.0；收獲由宿主細(xì)胞生產(chǎn)的重組蛋白質(zhì)，其中與在相同細(xì)胞培養(yǎng)基中在較低ph值下獲得的非巖藻糖基化聚糖水平相比，重組蛋白質(zhì)上的非巖藻糖基化聚糖水平有所增加。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法進(jìn)一步包括增加重組蛋白質(zhì)上的β-半乳糖基化水平。在一個(gè)實(shí)施方案中，銅的濃度為10ppb。在一個(gè)實(shí)施方案中，錳濃度為1000nm。在一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)巖藻糖基化聚糖含量進(jìn)行操控以影響重組蛋白質(zhì)的效應(yīng)功能。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法進(jìn)一步包括溫度變動(dòng)。在一相關(guān)實(shí)施方案中，溫度變動(dòng)是從36℃至31℃。在另一相關(guān)實(shí)施方案中，溫度變動(dòng)是發(fā)生在生長(zhǎng)期與生產(chǎn)期之間進(jìn)行轉(zhuǎn)變時(shí)。在又一相關(guān)實(shí)施方案中，溫度變動(dòng)是發(fā)生在生產(chǎn)期期間。在一個(gè)實(shí)施方案中，將表達(dá)重組蛋白質(zhì)的宿主細(xì)胞以分批培養(yǎng)、補(bǔ)料分批培養(yǎng)、灌注培養(yǎng)或其組合進(jìn)行培養(yǎng)。在一相關(guān)實(shí)施方案中，培養(yǎng)為灌注培養(yǎng)。在另一相關(guān)實(shí)施方案中，灌注包含連續(xù)灌注。在另一相關(guān)實(shí)施方案中，灌注速率是恒定的。在另一相關(guān)實(shí)施方案中，灌注以每天小于或等于1.0工作體積的速率進(jìn)行。在又一相關(guān)實(shí)施方案中，灌注通過(guò)交替切向流來(lái)實(shí)現(xiàn)。在一個(gè)實(shí)施方案中，生物反應(yīng)器具有至少500l的容量。在一個(gè)實(shí)施方案中，生物反應(yīng)器具有至少500l至2000l的容量。在一個(gè)實(shí)施方案中，生物反應(yīng)器具有至少1000l至2000l的容量。在一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)生物反應(yīng)器用至少0.5×106個(gè)細(xì)胞/毫升進(jìn)行接種。在一個(gè)實(shí)施方案中，無(wú)血清的化學(xué)成分確定的細(xì)胞培養(yǎng)基為灌注細(xì)胞培養(yǎng)基。在一個(gè)實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞為哺乳動(dòng)物細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞為中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(cho)細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，重組蛋白質(zhì)為糖蛋白。在一個(gè)實(shí)施方案中，重組蛋白質(zhì)選自人抗體、人源化抗體、嵌合抗體、重組融合蛋白或細(xì)胞因子。在一個(gè)實(shí)施方案中，由宿主細(xì)胞產(chǎn)生的重組蛋白質(zhì)被純化和配制成藥學(xué)上可接受的制劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，為一種由本發(fā)明的方法產(chǎn)生的重組蛋白質(zhì)。在一相關(guān)實(shí)施方案中，因此純化重組蛋白質(zhì)。在又一相關(guān)實(shí)施方案中，重組蛋白質(zhì)被配制成藥學(xué)上可接受的制劑。細(xì)胞培養(yǎng)“細(xì)胞培養(yǎng)”或“培養(yǎng)”意指細(xì)胞在多細(xì)胞生物體或組織外的生長(zhǎng)和繁殖。本領(lǐng)域中已知適合于哺乳動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)條件。參見(jiàn)例如animalcellculture：apracticalapproach，d.rickwood等人，oxforduniversitypress，newyork(1992)。哺乳動(dòng)物細(xì)胞可以懸浮培養(yǎng)或在附接于固體底物的同時(shí)培養(yǎng)。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“細(xì)胞培養(yǎng)基”(又稱“培養(yǎng)基”、“細(xì)胞培養(yǎng)基”、“組織培養(yǎng)基”)是指用于例如動(dòng)物或哺乳動(dòng)物細(xì)胞等細(xì)胞生長(zhǎng)且一般提供至少一種或更多種來(lái)自以下的組分的任何營(yíng)養(yǎng)液：能源(通常呈碳水化合物形式，例如葡萄糖)；所有必需氨基酸中的一種或多種，和一般二十種堿性氨基酸加半胱氨酸；維生素和/或典型地需要低濃度的其它有機(jī)化合物；脂質(zhì)或游離脂肪酸；以及微量元素，例如無(wú)機(jī)化合物或典型地需要極低濃度，通常在微摩爾濃度范圍內(nèi)的天然存在的元素。營(yíng)養(yǎng)液可以任選地補(bǔ)充有其它組分以使細(xì)胞的生長(zhǎng)最佳，例如激素和其它生長(zhǎng)因子，例如胰島素、鐵轉(zhuǎn)遞蛋白、表皮生長(zhǎng)因子、血清等等；鹽，例如鈣、鎂和磷酸鹽，以及緩沖液，例如hepes；核苷和堿基，例如腺苷、胸苷、次黃嘌呤；以及蛋白質(zhì)和組織水解產(chǎn)物，例如水解動(dòng)物蛋白(胨或胨混合物，其可以從動(dòng)物副產(chǎn)品、純化明膠或植物物質(zhì)獲得)；抗生素，例如慶大霉素(gentamycin)；細(xì)胞保護(hù)劑或表面活性劑、聚胺，例如腐胺、亞精胺或精胺(參見(jiàn)例如wipo公布no.wo2008/154014)以及丙酮酸鹽(參見(jiàn)例如美國(guó)專利no.8053238)，取決于待培養(yǎng)的細(xì)胞的需要和/或所需細(xì)胞培養(yǎng)參數(shù)。非離子型表面活性劑也可以添加到細(xì)胞培養(yǎng)基中。非離子型表面活性劑的實(shí)例包括(但不限于)聚乙烯醇、聚乙二醇以及非離子型嵌段共聚物表面活性劑。還包括烷基聚(氧化乙烯)、聚(氧化乙烯)與聚(氧化丙烯)的共聚物(eo-po嵌段共聚物)、聚(乙烯基吡咯烷酮)、烷基多聚葡糖苷(例如蔗糖單硬脂酸酯、月桂基二葡糖苷或脫水山梨糖醇單月桂酸酯、辛基葡糖苷以及癸基麥芽糖苷)、脂肪族醇(十六烷醇或油醇)或椰子酰胺(椰子酰胺mea、椰子酰胺dea以及椰子酰胺tea)。還包括基于環(huán)氧乙烷和環(huán)氧丙烷的嵌段共聚物，還稱為聚氧化丙烯-聚氧化乙烯嵌段共聚物。這些分子為具有側(cè)接聚氧化乙烯(聚(氧化乙烯))的兩條親水性鏈的聚氧化丙烯(聚(氧化丙烯))的中心疏水鏈的非離子型三嵌段共聚物。其中特別關(guān)注具有70個(gè)聚氧化丙烯單元和各30個(gè)單元的聚氧化乙烯鏈的共聚物。在一優(yōu)選實(shí)施方案中，嵌段共聚物為泊洛沙姆(poloxamer)188(平均分子量為8.4kd的cas#90003-11-6，basfchemical，washington，nj)，其以例如f68、p-188、f68和188等各種商標(biāo)名稱出售。此類非離子型表面活性劑可以依多達(dá)5g/l或更多的濃度添加，并可以用于在atf灌注條件下維持細(xì)胞存活力達(dá)更長(zhǎng)培養(yǎng)持續(xù)時(shí)間。本發(fā)明提供了一種含有10至100ppb銅和50至1000nm錳的細(xì)胞培養(yǎng)基。在一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞培養(yǎng)基含有100ppb錳。在另一實(shí)施方案中，細(xì)胞培養(yǎng)基含有1000nm錳。在另一實(shí)施方案中，細(xì)胞培養(yǎng)基含有100ppb錳和1000nm錳?？捎糜诒景l(fā)明的銅鹽和錳鹽包括(但不限于)五水合硫酸銅和單水合硫酸錳。包括銅和錳在內(nèi)的細(xì)胞培養(yǎng)基組分可以完全磨成粉末培養(yǎng)基制劑；部分碾磨，并且需要時(shí)將液體補(bǔ)充劑添加至細(xì)胞培養(yǎng)基中；或細(xì)胞培養(yǎng)基組分可以呈完全液體形式添加至細(xì)胞培養(yǎng)物中。細(xì)胞培養(yǎng)基包括典型地用于任何細(xì)胞培養(yǎng)方法和/或因用于任何細(xì)胞培養(yǎng)方法而眾所周知的細(xì)胞培養(yǎng)基，所述細(xì)胞培養(yǎng)方法為例如(但不限于)細(xì)胞的分批培養(yǎng)、延長(zhǎng)分批培養(yǎng)、補(bǔ)料分批培養(yǎng)和/或灌注培養(yǎng)或連續(xù)培養(yǎng)?！盎A(chǔ)”(或分批)細(xì)胞培養(yǎng)基是指典型地用于開(kāi)始細(xì)胞培養(yǎng)并足夠完全支持細(xì)胞培養(yǎng)的細(xì)胞培養(yǎng)基?！吧L(zhǎng)”細(xì)胞培養(yǎng)基是指在指數(shù)生長(zhǎng)時(shí)期(“生長(zhǎng)期”)期間典型地用于細(xì)胞培養(yǎng)并足夠完全支持此時(shí)期期間的細(xì)胞培養(yǎng)的細(xì)胞培養(yǎng)基。生長(zhǎng)細(xì)胞培養(yǎng)基還可以含有賦予對(duì)并入宿主細(xì)胞系中的選擇性標(biāo)記物的抗性或歷經(jīng)所述標(biāo)記物而存活的選擇試劑。此類選擇試劑包括(但不限于)遺傳霉素(g4118)、新霉素(neomycin)、潮霉素b(hygromycinb)、嘌呤霉素(puromycin)、零霉素(zeocin)、甲硫氨酸磺基肟、甲氨蝶呤(methotrexate)、無(wú)谷氨酰胺的細(xì)胞培養(yǎng)基、缺乏甘氨酸、次黃嘌呤和胸苷的細(xì)胞培養(yǎng)基或單獨(dú)胸苷?！吧a(chǎn)”細(xì)胞培養(yǎng)基是指當(dāng)指數(shù)生長(zhǎng)結(jié)束且蛋白質(zhì)生產(chǎn)取而代之時(shí)在轉(zhuǎn)變和生產(chǎn)期期間典型地用于細(xì)胞培養(yǎng)并在這些時(shí)期期間足夠完全維持所需細(xì)胞密度、存活力和/或產(chǎn)物滴度的細(xì)胞培養(yǎng)基?！肮嘧ⅰ奔?xì)胞培養(yǎng)基是指典型地用于通過(guò)灌注或連續(xù)培養(yǎng)法而維持的細(xì)胞培養(yǎng)物中并足夠完全支持此過(guò)程期間的細(xì)胞培養(yǎng)的細(xì)胞培養(yǎng)基。灌注細(xì)胞培養(yǎng)基制劑可以被富集或比基礎(chǔ)細(xì)胞培養(yǎng)基制劑更濃縮，從而適應(yīng)用于去除用過(guò)的培養(yǎng)基的方法。在生長(zhǎng)期與生產(chǎn)期期間都可以使用灌注細(xì)胞培養(yǎng)基。細(xì)胞培養(yǎng)物可以補(bǔ)充含有例如營(yíng)養(yǎng)素和氨基酸等的在培養(yǎng)物生產(chǎn)期過(guò)程期間消耗的組分的濃縮補(bǔ)料培養(yǎng)基。濃縮細(xì)胞培養(yǎng)基可以含有維持細(xì)胞培養(yǎng)所必需的一些或所有營(yíng)養(yǎng)素；具體地說(shuō)，濃縮培養(yǎng)基可以含有被鑒別為或已知在細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)期過(guò)程期間消耗的營(yíng)養(yǎng)素。濃縮培養(yǎng)基可以基于幾乎任何細(xì)胞培養(yǎng)基制劑。此類濃縮補(bǔ)料培養(yǎng)基可以含有例如正常量的約2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、12倍、14倍、16倍、20倍、25倍、30倍、40倍、50倍、75倍、100倍、200倍、400倍、600倍、800倍或甚至1000倍的細(xì)胞培養(yǎng)基的一些或所有組分。在某些實(shí)施方案中，細(xì)胞培養(yǎng)基可以無(wú)血清和/或無(wú)動(dòng)物來(lái)源的產(chǎn)物或成分。在某些實(shí)施方案中，細(xì)胞培養(yǎng)基可以是化學(xué)成分確定的，其中已知所有化學(xué)組分。如開(kāi)業(yè)醫(yī)生所了解，在適于所培養(yǎng)的具體細(xì)胞并可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員在不進(jìn)行過(guò)度實(shí)驗(yàn)下確定的培養(yǎng)基中培養(yǎng)動(dòng)物或哺乳動(dòng)物細(xì)胞?？梢岳檬惺叟囵B(yǎng)基并包括(但不限于)伊斯科夫氏改良的杜爾貝科氏培養(yǎng)基(iscove′smodifieddulbecco′smedium)、rpmi1640和最低基礎(chǔ)培養(yǎng)基-α(mem-α)、杜爾貝科氏改良的伊格爾氏培養(yǎng)基(dulbecco′smodificationofeagle′smedium，dmem)、dme/f12、αmem、具有厄爾bss的厄爾基礎(chǔ)培養(yǎng)基(basalmediumeaglewithearle′sbss)、具有谷氨酰胺的高葡萄糖dmem、無(wú)谷氨酰胺的高葡萄糖dmem、無(wú)谷氨酰胺的低葡萄糖dmem、具有谷氨酰胺的dmem:f121:1、gmem(格拉斯哥氏mem(glasgow′smem))、具有谷氨酰胺的gmem、格雷斯完全昆蟲培養(yǎng)基(grace′scompleteinsectmedium)、無(wú)fbs的格雷斯昆蟲培養(yǎng)基、具有谷氨酰胺的ham′sf-10、具有谷氨酰胺的ham′sf-12、具有hepes和谷氨酰胺的imdm、具有hepes且無(wú)谷氨酰胺的imdm、ip41昆蟲培養(yǎng)基、無(wú)谷氨酰胺或酚紅的15(leibovitz)(2x)、無(wú)谷氨酰胺的15(leibovitz)、麥考伊氏改良培養(yǎng)基(mccoy′s5amodifiedmedium)、培養(yǎng)基199、無(wú)谷氨酰胺或酚紅的伊格爾氏mem(2x)、具有谷氨酰胺的伊格爾氏mem-厄爾bss、無(wú)谷氨酰胺的伊格爾氏mem-厄爾bss、無(wú)谷氨酰胺的伊格爾氏mem-漢克斯bss、具有谷氨酰胺的nctc-109、具有谷氨酰胺的黎克特cm培養(yǎng)基(richter′scmmedium)、具有hepes、谷氨酰胺和/或青霉素-鏈霉素的rpmi1640、具有谷氨酰胺的rpmi1640、無(wú)谷氨酰胺的rpmi1640、施奈德昆蟲培養(yǎng)基(schneider′sinsectmedium)或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的針對(duì)具體細(xì)胞類型而配制的任何其它培養(yǎng)基?？梢愿鶕?jù)需要或需要時(shí)且如本領(lǐng)域的技術(shù)人員使用常規(guī)技能所知和實(shí)施，向上述示例性培養(yǎng)基添加適當(dāng)濃度或量的補(bǔ)充組分或成分，包括任選的組分。細(xì)胞培養(yǎng)物還可以補(bǔ)充可能難以配制或在細(xì)胞培養(yǎng)中快速消耗的具體營(yíng)養(yǎng)素的獨(dú)立濃縮補(bǔ)料。此類營(yíng)養(yǎng)素可以為氨基酸，例如酪氨酸、半胱氨酸和/或胱氨酸(參見(jiàn)例如wipo公布no.2012/145682)。舉例來(lái)說(shuō)，濃縮酪氨酸溶液可以獨(dú)立地補(bǔ)料至在含有酪氨酸的細(xì)胞培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的細(xì)胞培養(yǎng)物中。酪氨酸和胱氨酸的濃縮溶液也可以獨(dú)立地補(bǔ)料至在缺乏酪氨酸、胱氨酸和/或半胱氨酸的細(xì)胞培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的細(xì)胞培養(yǎng)物。獨(dú)立補(bǔ)料可以在生產(chǎn)期前或生產(chǎn)期開(kāi)始時(shí)開(kāi)始。獨(dú)立補(bǔ)料可以在與濃縮補(bǔ)料培養(yǎng)基相同或不同的日子伴隨著補(bǔ)料分批至細(xì)胞培養(yǎng)基。還可以在與灌注培養(yǎng)基相同或不同的日子灌注獨(dú)立的補(bǔ)料?？梢圆捎梅椒ㄟB續(xù)補(bǔ)料哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物，例如未采用反饋控制的細(xì)胞培養(yǎng)物(參見(jiàn)wipo公布no.wo2013/040444)。培養(yǎng)基處理可以使用方法或裝置處理細(xì)胞培養(yǎng)基以在添加至生物反應(yīng)器和/或細(xì)胞培養(yǎng)物前將培養(yǎng)基殺菌或消毒?？梢允褂酶邷囟虝r(shí)滅菌法(htst)處理細(xì)胞培養(yǎng)基(參見(jiàn)例如美國(guó)專利no.7,420,183)。還可以使用uv與過(guò)濾組合，處理細(xì)胞培養(yǎng)基(參見(jiàn)例如wipo公布wo2008/157247；wo2012/115874；wo2013/063298和wo2013/138159)。細(xì)胞培養(yǎng)基可以經(jīng)受納米過(guò)濾(參見(jiàn)例如liu等人(2000)biotechnol.prog.16：425-434)。細(xì)胞培養(yǎng)基可以用例如溶劑、清潔劑、補(bǔ)骨脂素或β-丙內(nèi)酯等使病毒失活的化學(xué)物質(zhì)處理。細(xì)胞用于本發(fā)明的細(xì)胞系(又稱為“宿主細(xì)胞”)進(jìn)行基因工程化，以表達(dá)商業(yè)或科學(xué)關(guān)注的多肽。細(xì)胞系典型地來(lái)源于由可以維持培養(yǎng)無(wú)限時(shí)間的原始培養(yǎng)物產(chǎn)生的譜系。細(xì)胞可以含有例如經(jīng)由轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、感染或注射引入的表達(dá)載體(構(gòu)筑體)，例如質(zhì)粒等等，所述表達(dá)載體具有編碼在培養(yǎng)方法中表達(dá)和生產(chǎn)的蛋白質(zhì)的編碼序列或其部分。此類表達(dá)載體含有插入編碼序列轉(zhuǎn)錄和翻譯所必需的元件。本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知并實(shí)施的方法可以用于構(gòu)筑含有編碼所生產(chǎn)的蛋白質(zhì)和多肽的序列以及適當(dāng)轉(zhuǎn)錄和翻譯控制元件的表達(dá)載體。這些方法包括體外重組dna技術(shù)、合成技術(shù)和體內(nèi)基因重組。此類技術(shù)描述于j.sambrook等人，2012，molecularcloning，alaboratorymanual，第4版coldspringharborpress，plainview，n.y.或任何先前版本；f.m.ausubel等人，2013，currentprotocolsinmolecularbiology，johnwiley&sons，newyork，n.y或任何先前版本；kaufman，r.j.，largescalemammaliancellculture，1990，都以引用的方式并入本文中以達(dá)成任何目的。動(dòng)物細(xì)胞、哺乳動(dòng)物細(xì)胞、培養(yǎng)細(xì)胞、動(dòng)物或哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞、宿主細(xì)胞、重組細(xì)胞、重組宿主細(xì)胞等等都是可以根據(jù)本發(fā)明的方法培養(yǎng)的細(xì)胞的術(shù)語(yǔ)。此類細(xì)胞典型地為獲自或來(lái)源于哺乳動(dòng)物的細(xì)胞系并能夠在放于含有適當(dāng)營(yíng)養(yǎng)素和/或其它因子(例如本文中描述的因子)的培養(yǎng)基中進(jìn)行單層培養(yǎng)或懸浮培養(yǎng)時(shí)生長(zhǎng)和存活。典型地選擇可以表達(dá)和分泌蛋白質(zhì)，或可以在分子層面上進(jìn)行工程化以表達(dá)和分泌大量具體蛋白質(zhì)、更尤其是相關(guān)糖蛋白至培養(yǎng)基中的細(xì)胞。應(yīng)了解，由宿主細(xì)胞生產(chǎn)的蛋白質(zhì)可以是宿主細(xì)胞內(nèi)源性的或與其同源?；蛘?，蛋白質(zhì)為與宿主細(xì)胞異源的，即外來(lái)的，舉例來(lái)說(shuō)，人類蛋白質(zhì)由中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(cho)宿主細(xì)胞生產(chǎn)和分泌。另外，哺乳動(dòng)物蛋白質(zhì)，即原始獲自或來(lái)源于哺乳動(dòng)物生物體的蛋白質(zhì)，通過(guò)本發(fā)明的方法獲得，并可以被細(xì)胞分泌至培養(yǎng)基中。本發(fā)明的方法可以用于培養(yǎng)多種細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，培養(yǎng)細(xì)胞為真核細(xì)胞，例如植物和/或動(dòng)物細(xì)胞。細(xì)胞可以為哺乳動(dòng)物細(xì)胞、魚類細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、兩棲動(dòng)物細(xì)胞或鳥(niǎo)類細(xì)胞。適于培養(yǎng)生長(zhǎng)的多種哺乳動(dòng)物細(xì)胞系可得自美國(guó)典型菌種保藏中心(manassas，va.)和其它存放機(jī)構(gòu)以及商業(yè)供應(yīng)商。可以用于本發(fā)明的方法中的細(xì)胞包括(但不限于)mk2.7細(xì)胞、per-c6細(xì)胞、中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(cho)，例如cho-k1(atccccl-61)、dg44(chasin等人，1986，som.cellmolec.genet.，12：555-556；kolkekar等人，1997，biochemistry，36：10901-10909；以及wo01/92337a2)、二氫葉酸還原酶陰性cho細(xì)胞(cho/-dhfr，urlaub和chasin，1980，proc.natl.acad.sci.usa，77：4216)以及dp12.cho細(xì)胞(美國(guó)專利no.5,721,121)；猴腎細(xì)胞(cv1，atccccl-70)；由sv40轉(zhuǎn)化的猴腎cv1細(xì)胞(cos細(xì)胞、cos-7，atcccrl-1651)；hek293細(xì)胞和sp2/0細(xì)胞、5l8雜交瘤細(xì)胞、多蒂細(xì)胞(daudicell)、el4細(xì)胞、海拉細(xì)胞(helacell)、hl-60細(xì)胞、k562細(xì)胞、朱卡特細(xì)胞(jurkatcell)、thp-1細(xì)胞、sp2/0細(xì)胞、初級(jí)上皮細(xì)胞(例如角化細(xì)胞、子宮頸上皮細(xì)胞、支氣管上皮細(xì)胞、氣管上皮細(xì)胞、腎上皮細(xì)胞和視網(wǎng)膜上皮細(xì)胞)和確立的細(xì)胞系和其品系(例如人類胚腎細(xì)胞(例如293細(xì)胞或被亞克隆用于懸浮培養(yǎng)生長(zhǎng)的293細(xì)胞，graham等人，1977，j.gen.virol.，36：59)；幼倉(cāng)鼠腎細(xì)胞(bhk，atccccl-10)；小鼠足細(xì)胞(tm4，mather，1980，riol.reprod.，23：243-251)；人類子宮頸癌細(xì)胞(hela，atccccl-2)；犬腎細(xì)胞(mdck，atccccl-34)；人類肺細(xì)胞(w138，atccccl-75)；人類肝細(xì)胞瘤細(xì)胞(hep-g2，hb8065)；小鼠乳腺腫瘤細(xì)胞(mmt060562，atccccl-51)；水牛大鼠肝細(xì)胞(brl3a，atcccrl-1442)；tri細(xì)胞(mather，1982，annalsnyacad.sci.，383：44-68)；mcr5細(xì)胞；fs4細(xì)胞；per-c6視網(wǎng)膜細(xì)胞、mdbk(nbl-1)細(xì)胞、911細(xì)胞、crfk細(xì)胞、mdck細(xì)胞、bewo細(xì)胞、張氏細(xì)胞(changcell)、底特律(detroit)562細(xì)胞、海拉229細(xì)胞、海拉s3細(xì)胞、hep-2細(xì)胞、kb細(xì)胞、ls180細(xì)胞、ls174t細(xì)胞、nci-h-548細(xì)胞、rpmi2650細(xì)胞、sw-13細(xì)胞、t24細(xì)胞、wi-28va13、2ra細(xì)胞、wish細(xì)胞、bs-c-i細(xì)胞、llc-mk2細(xì)胞、克隆m-3細(xì)胞、1-10細(xì)胞、rag細(xì)胞、tcmk-1細(xì)胞、y-1細(xì)胞、llc-pk1細(xì)胞、pk(15)細(xì)胞、gh1細(xì)胞、gh3細(xì)胞、l2細(xì)胞、llc-rc256細(xì)胞、mh1c1細(xì)胞、xc細(xì)胞、mdok細(xì)胞、vsw細(xì)胞以及th-i、b1細(xì)胞或其衍生物)、來(lái)自任何組織或器官的成纖維細(xì)胞(包括(但不限于)心臟、肝臟、腎、結(jié)腸、腸、食管、胃、神經(jīng)組織(腦、脊髓)、肺、血管組織(動(dòng)脈、靜脈、毛細(xì)管)、淋巴組織(淋巴腺、腺狀物、扁桃腺、骨髓和血液)、脾和成纖維細(xì)胞和成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞系(例如trg-2細(xì)胞、imr-33細(xì)胞、don細(xì)胞、ghk-21細(xì)胞、瓜氨酸血癥細(xì)胞、登普西細(xì)胞(dempseycell)、底特律551細(xì)胞、底特律510細(xì)胞、底特律525細(xì)胞、底特律529細(xì)胞、底特律532細(xì)胞、底特律539細(xì)胞、底特律548細(xì)胞、底特律573細(xì)胞、hel299細(xì)胞、imr-90細(xì)胞、mrc-5細(xì)胞、wi-38細(xì)胞、wi-26細(xì)胞、micl1細(xì)胞、cv-1細(xì)胞、cos-1細(xì)胞、cos-3細(xì)胞、cos-7細(xì)胞、非洲綠猴腎細(xì)胞(vero-76、atcccrl-1587；vero、atccccl-81)；dbs-frhl-2細(xì)胞、balb/3t3細(xì)胞、f9細(xì)胞、sv-t2細(xì)胞、m-msv-balb/3t3細(xì)胞、k-balb細(xì)胞、blo-11細(xì)胞、nor-10細(xì)胞、c3h/ioti/2細(xì)胞、hsdm1c3細(xì)胞、kln205細(xì)胞、mccoy細(xì)胞、小鼠l細(xì)胞、品系2071(小鼠l)細(xì)胞、l-m品系(小鼠l)細(xì)胞、l-mtk(小鼠l)細(xì)胞、nctc克隆2472和2555、scc-psa1細(xì)胞、swiss/3t3細(xì)胞、赤麂(indianmuntac)細(xì)胞、sirc細(xì)胞、cii細(xì)胞以及延森細(xì)胞(jensencell)或其衍生物)或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何其它細(xì)胞類型。細(xì)胞可以適于貼壁培養(yǎng)、單層培養(yǎng)或懸浮培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染和蛋白質(zhì)(例如抗體)的表達(dá)。細(xì)胞可以用于分批培養(yǎng)、補(bǔ)料分批培養(yǎng)和灌注或連續(xù)培養(yǎng)法。細(xì)胞培養(yǎng)類型為了理解，但不限于，熟練開(kāi)業(yè)醫(yī)生應(yīng)了解用于蛋白質(zhì)生產(chǎn)的細(xì)胞培養(yǎng)和培養(yǎng)操作可以包括三個(gè)通用類型；即，分批或延長(zhǎng)分批培養(yǎng)、補(bǔ)料分批培養(yǎng)、灌注培養(yǎng)或其組合。在分批培養(yǎng)中，細(xì)胞初始在培養(yǎng)基中培養(yǎng)且不去除、替換或補(bǔ)充此培養(yǎng)基，即，在培養(yǎng)操作期間或在培養(yǎng)操作結(jié)束前細(xì)胞不“加入”新鮮培養(yǎng)基。在培養(yǎng)操作結(jié)束時(shí)收獲所需產(chǎn)物。在補(bǔ)料分批培養(yǎng)中，通過(guò)在操作期間將培養(yǎng)基補(bǔ)充新鮮培養(yǎng)基一次或多次(或連續(xù))來(lái)增加培養(yǎng)操作時(shí)間，即在培養(yǎng)期期間細(xì)胞用新培養(yǎng)基(“補(bǔ)料培養(yǎng)基”)“補(bǔ)料”。補(bǔ)料分批培養(yǎng)可以包括各種補(bǔ)料方案和次數(shù)，例如每天、每隔一天、每?jī)商斓鹊?，每天超過(guò)一次或每天少于一次等等。此外，補(bǔ)料分批培養(yǎng)物可以用補(bǔ)料培養(yǎng)基連續(xù)補(bǔ)料。接著可以在培養(yǎng)/生產(chǎn)操作結(jié)束時(shí)收獲所需產(chǎn)物。有時(shí)稱為連續(xù)培養(yǎng)的灌注培養(yǎng)為其中細(xì)胞培養(yǎng)物接收新鮮灌注培養(yǎng)基且其中在操作期間從生物反應(yīng)器去除用過(guò)的培養(yǎng)基的培養(yǎng)。新鮮培養(yǎng)基灌注至細(xì)胞培養(yǎng)物且去除用過(guò)的培養(yǎng)基可以是連續(xù)、逐步、間歇的或任何或所有這些的組合。灌注速率可以在每天少于一個(gè)工作容積至每天多個(gè)工作容積的范圍內(nèi)。術(shù)語(yǔ)“灌注流速”為在給定時(shí)間內(nèi)從生物反應(yīng)器通過(guò)(添加和去除)的培養(yǎng)基的量，典型地表示為工作容積的一部分或多個(gè)。灌注流速可以在細(xì)胞培養(yǎng)操作持續(xù)時(shí)間內(nèi)變化。“工作容積”是指用于細(xì)胞培養(yǎng)的生物反應(yīng)器容積的量。在一個(gè)實(shí)施方案中，灌注流速小于或等于每天一個(gè)工作容積。灌注補(bǔ)料培養(yǎng)基可以經(jīng)配制以最大化灌注營(yíng)養(yǎng)素濃度，從而使灌注速率減至最少。優(yōu)選地，細(xì)胞保持在培養(yǎng)物中，且所去除的用過(guò)的培養(yǎng)基基本上無(wú)細(xì)胞或具有比培養(yǎng)物顯著少的細(xì)胞。由細(xì)胞培養(yǎng)物表達(dá)的重組蛋白質(zhì)也可以保持在培養(yǎng)物中供隨后收獲，或與用過(guò)的培養(yǎng)基一起去除。灌注可以通過(guò)包括離心、沉降或過(guò)濾在內(nèi)的許多方式實(shí)現(xiàn)，參見(jiàn)例如voisard等人，(2003)，biotechnologyandbioengineering82：751-65。在一個(gè)實(shí)施方案中，使用過(guò)濾法。過(guò)濾器包括膜式過(guò)濾器、陶瓷過(guò)濾器和金屬過(guò)濾器，且可以為任何形狀，包括螺旋纏繞式或管狀或呈薄片形式。一個(gè)或多個(gè)過(guò)濾器可以一起或獨(dú)立地連接至生物反應(yīng)器、與生物反應(yīng)器呈流體連通，串聯(lián)或并聯(lián)。中空纖維過(guò)濾器可以用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞灌注培養(yǎng)中以保留細(xì)胞和/或重組蛋白質(zhì)。當(dāng)包括細(xì)胞培養(yǎng)基、細(xì)胞(全細(xì)胞和溶解細(xì)胞)、可溶性的所表達(dá)的重組蛋白質(zhì)、宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)、廢產(chǎn)物等在內(nèi)的細(xì)胞培養(yǎng)物被引入過(guò)濾器時(shí)，取決于孔徑或分子量截止(mwco)，中空纖維材料可以將某些細(xì)胞培養(yǎng)物組分保留在腔側(cè)(內(nèi)部)，且基于中空纖維材料的孔徑或分子量截止，允許某些組分通過(guò)過(guò)濾器(透過(guò)物)。所保留的物質(zhì)(保留物)返回至生物反應(yīng)器。將新鮮的灌注細(xì)胞培養(yǎng)基添加至生物反應(yīng)器，并以預(yù)定時(shí)間間隔或連續(xù)從過(guò)濾器取出透過(guò)物，以維持所需或恒定生物反應(yīng)器容積。透過(guò)物可以丟棄，存儲(chǔ)在貯槽、袋子或手提包中，或直接轉(zhuǎn)移至另一個(gè)單元操作，例如過(guò)濾、絮凝、離心和/或其它下游的純化方法等等。用于微過(guò)濾器的中空纖維典型地具有在0.1μm至5-10μm范圍內(nèi)的孔徑或500kda或更大的分子量截止，且可以用于允許蛋白質(zhì)通過(guò)透過(guò)物。超濾中空纖維典型地具有在0.01μm至0.1μm的孔徑范圍或300kda或更小的分子量截止，且可以用于保留保留物中的所需蛋白質(zhì)并將其返回至生物反應(yīng)器。此可以用于例如濃縮重組蛋白質(zhì)產(chǎn)物以供收獲。此類過(guò)濾器可以購(gòu)得，例如xamplerufp-750-e-4ma、xamplerufp-30-e-4ma(gehealthcare，pittsburg，pa)和midikrostcmodulest02-e030-10、t02-050-10、t02-e750-05、t02-m10u-06(spectrumlaboratories，inc，dominguez，ca)?？梢酝ㄟ^(guò)抽吸系統(tǒng)，將細(xì)胞培養(yǎng)物從生物反應(yīng)器抽出并抽入過(guò)濾器中，所述抽吸系統(tǒng)使細(xì)胞培養(yǎng)物通過(guò)中空纖維的腔側(cè)。細(xì)胞抽吸系統(tǒng)的實(shí)例包括蠕動(dòng)泵、雙隔膜泵、低剪切泵(泵，zurich，switzerland)和交替切向流系統(tǒng)(atftm，refinetechnology，pinebrook，nj，參見(jiàn)例如美國(guó)專利no.6,544,424；furey(2002)gen.eng.news.22(7)，62-63)。透過(guò)物可以通過(guò)利用蠕動(dòng)泵從過(guò)濾器抽出。在一優(yōu)選實(shí)施方案中，灌注通過(guò)交替切向流系統(tǒng)的使用來(lái)實(shí)現(xiàn)。細(xì)胞培養(yǎng)方法細(xì)胞培養(yǎng)可以在用于重組蛋白質(zhì)的小規(guī)模至大規(guī)模生產(chǎn)的條件下使用常用于動(dòng)物或哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)容器和/或培養(yǎng)設(shè)備進(jìn)行。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所了解，在實(shí)驗(yàn)室工作臺(tái)規(guī)模上，典型地使用組織培養(yǎng)皿、t形燒瓶和旋轉(zhuǎn)瓶。對(duì)于更大規(guī)模的培養(yǎng)，可以使用例如(但不限于)發(fā)酵罐型槽培養(yǎng)裝置、氣升型培養(yǎng)裝置、流化床生物反應(yīng)器、中空纖維生物反應(yīng)器、滾瓶培養(yǎng)、攪拌槽式生物反應(yīng)器系統(tǒng)、填充床型培養(yǎng)裝置以及一次性使用的袋子，或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何其它適合的裝置。微載體可以用于滾瓶或攪拌槽式生物反應(yīng)器系統(tǒng)。系統(tǒng)可以呈分批、補(bǔ)料分批或灌注/連續(xù)模式操作。另外，培養(yǎng)設(shè)備或系統(tǒng)可以裝備有其它設(shè)備，如使用過(guò)濾器、重力、離心力等的細(xì)胞分離器。重組蛋白質(zhì)的生產(chǎn)可以在多期培養(yǎng)方法中進(jìn)行。在多期方法中，細(xì)胞在兩個(gè)或更多個(gè)不同時(shí)期中培養(yǎng)。舉例來(lái)說(shuō)，細(xì)胞可以首先在一個(gè)或多個(gè)生長(zhǎng)期中在最大化細(xì)胞增殖和存活力的環(huán)境條件下培養(yǎng)，接著轉(zhuǎn)變至在最大化蛋白質(zhì)生產(chǎn)的條件下的生產(chǎn)期。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)重組蛋白質(zhì)的商業(yè)方法中，通常存在多個(gè)，例如至少約2個(gè)、3個(gè)、4個(gè)、5個(gè)、6個(gè)、7個(gè)、8個(gè)、9個(gè)、10個(gè)或更多個(gè)在最終生產(chǎn)培養(yǎng)前發(fā)生在不同培養(yǎng)容器中的生長(zhǎng)期(n-x至n-1)。生長(zhǎng)期和生產(chǎn)期可以在一個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)變期前或間隔一個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)變期。生產(chǎn)期可以大規(guī)模進(jìn)行。術(shù)語(yǔ)細(xì)胞培養(yǎng)物的“生長(zhǎng)期”是指指數(shù)細(xì)胞生長(zhǎng)時(shí)期(即對(duì)數(shù)期)，其中細(xì)胞一般快速分裂。細(xì)胞維持在生長(zhǎng)期達(dá)約一天或約兩天或約三天或約四天或超過(guò)四天的時(shí)間。細(xì)胞維持在生長(zhǎng)期的持續(xù)時(shí)間將基于例如細(xì)胞類型和/或細(xì)胞生長(zhǎng)速率和/或培養(yǎng)條件變化。術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)變期”是指生長(zhǎng)期與生產(chǎn)期之間的時(shí)間段。一般來(lái)說(shuō)，轉(zhuǎn)變期為培養(yǎng)條件可以進(jìn)行控制以支持從生長(zhǎng)期變動(dòng)至生產(chǎn)期的時(shí)間。可以控制的各種細(xì)胞培養(yǎng)參數(shù)包括(但不限于)以下中的一者或多者：溫度、ph值、滲透壓度、維生素、氨基酸、糖、胨、銨、鹽等等。術(shù)語(yǔ)細(xì)胞培養(yǎng)的“生產(chǎn)期”是指細(xì)胞生長(zhǎng)平穩(wěn)的時(shí)間段。對(duì)數(shù)細(xì)胞生長(zhǎng)典型地在此時(shí)期前或期間結(jié)束，且蛋白質(zhì)生產(chǎn)取而代之。補(bǔ)料分批和灌注細(xì)胞培養(yǎng)方法補(bǔ)充細(xì)胞培養(yǎng)基或提供新鮮培養(yǎng)基，以便在此階段實(shí)現(xiàn)和維持所需細(xì)胞密度、存活力和產(chǎn)物滴度。生產(chǎn)期可以大規(guī)模進(jìn)行。大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)可以維持在至少約100升、500升、1000升、2000升、3000升、5000升、7000升、8000升、10,000升、15,000升、20,000升的容積中。在本發(fā)明的一實(shí)施方案中，生產(chǎn)期在500l、1000l和/或2000l生物反應(yīng)器中進(jìn)行。典型地，在最終生產(chǎn)培養(yǎng)前的細(xì)胞培養(yǎng)經(jīng)歷兩個(gè)先前時(shí)期，種子和接種體培養(yǎng)。種子培養(yǎng)期(n-x)小規(guī)模進(jìn)行，其中細(xì)胞數(shù)目迅速擴(kuò)增。在接種體培養(yǎng)期(n-1)，細(xì)胞進(jìn)一步擴(kuò)增，以產(chǎn)生用于生產(chǎn)生物反應(yīng)器的接種體，例如至少0.5×106個(gè)細(xì)胞/毫升的接種體。種子和n-1培養(yǎng)可以通過(guò)任何培養(yǎng)法，典型地分批細(xì)胞培養(yǎng)來(lái)產(chǎn)生。n-1細(xì)胞密度≥0.5×105個(gè)細(xì)胞/毫升是生產(chǎn)生物反應(yīng)器接種典型的細(xì)胞密度。較高的n-1細(xì)胞密度可以減少或甚至消除生產(chǎn)生物反應(yīng)器中為達(dá)到所需細(xì)胞密度所需的時(shí)間。一種實(shí)現(xiàn)較高n-1細(xì)胞密度的優(yōu)選方法為使用交替切向流過(guò)濾進(jìn)行灌注培養(yǎng)。借助于灌注法，使用交替切向流過(guò)濾生長(zhǎng)的n-1細(xì)胞培養(yǎng)物可以提供任何所需密度，例如密度＞90×106個(gè)細(xì)胞/毫升或更多的細(xì)胞。n-1細(xì)胞培養(yǎng)物可以用于產(chǎn)生單劑接種培養(yǎng)物，或可以用作滾動(dòng)種子儲(chǔ)備培養(yǎng)物，維持其接種多個(gè)生產(chǎn)生物反應(yīng)器。接種密度可以對(duì)所產(chǎn)生的重組蛋白質(zhì)的水平具有積極影響。產(chǎn)物水平趨向于隨著接種密度增加而增加。滴度的改善不僅與較高接種密度相聯(lián)，而且可能受放入生產(chǎn)中的細(xì)胞的代謝和細(xì)胞周期狀態(tài)影響。在本發(fā)明之一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)用至少0.5×106個(gè)細(xì)胞/毫升對(duì)生物反應(yīng)器進(jìn)行接種來(lái)建立細(xì)胞培養(yǎng)物。術(shù)語(yǔ)“細(xì)胞密度”是指在給定的培養(yǎng)基容積中細(xì)胞的數(shù)目?！盎罴?xì)胞密度”是指如通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)存活力分析法(例如錐蟲藍(lán)染料排除法)來(lái)測(cè)定，給定的培養(yǎng)基容積中活細(xì)胞的數(shù)目。術(shù)語(yǔ)“紅細(xì)胞壓積”(pcv)又稱為“紅細(xì)胞壓積百分比”(％pcv)，為細(xì)胞占據(jù)的容積與細(xì)胞培養(yǎng)物的總?cè)莘e的比率，表示為百分比(參見(jiàn)stettler等人，(2006)biotechnolbioeng.dec20：95(6)：1228-33)。紅細(xì)胞壓積為細(xì)胞密度和細(xì)胞直徑的函數(shù)；紅細(xì)胞壓積的增加可能由細(xì)胞密度或細(xì)胞直徑或兩者的增加而引起。紅細(xì)胞壓積為細(xì)胞培養(yǎng)物中固體含量的量度。細(xì)胞培養(yǎng)控制適于本發(fā)明方法的細(xì)胞培養(yǎng)條件為典型地用于和已知用于細(xì)胞的分批、補(bǔ)料分批或灌注(連續(xù))培養(yǎng)或那些方法的任何組合的條件，其中關(guān)注ph值、溶解氧(o2)和二氧化碳(co2)、攪動(dòng)和濕度以及溫度。在重組蛋白質(zhì)生產(chǎn)期間，需要具有一種控制系統(tǒng)，其中細(xì)胞生長(zhǎng)所需時(shí)間或生長(zhǎng)至所需密度，然后細(xì)胞的生理狀態(tài)轉(zhuǎn)換至生長(zhǎng)限制或抑制的高生產(chǎn)狀態(tài)，其中細(xì)胞使用能量和底物產(chǎn)生重組蛋白質(zhì)，有利于細(xì)胞密度增加。對(duì)于工業(yè)規(guī)模的細(xì)胞培養(yǎng)和生物治療劑的制造，非常需要在生產(chǎn)期期間能夠限制或抑制細(xì)胞生長(zhǎng)并能夠維持細(xì)胞處于生長(zhǎng)限制或抑制的狀態(tài)。此類方法包括例如單獨(dú)或組合的溫度變動(dòng)、使用蛋白質(zhì)生產(chǎn)的化學(xué)誘導(dǎo)物、營(yíng)養(yǎng)限制或饑餓和細(xì)胞周期抑制劑。用于限制或抑制生長(zhǎng)的一種此類機(jī)制是在細(xì)胞培養(yǎng)期間變動(dòng)溫度。溫度變動(dòng)可以發(fā)生在細(xì)胞培養(yǎng)期間的任何時(shí)間。生長(zhǎng)期可以發(fā)生在比生產(chǎn)期更高的溫度下。細(xì)胞培養(yǎng)可以在約35℃至約38℃的第一溫度設(shè)定點(diǎn)下操作，然后溫度變動(dòng)至約29℃至約37℃，任選地約30℃至約36℃或約30℃至約34℃的第二溫度設(shè)定點(diǎn)。在一個(gè)實(shí)施方案中，溫度變動(dòng)可以發(fā)生在生長(zhǎng)期與生產(chǎn)期之間的轉(zhuǎn)變期間。在另一實(shí)施方案中，溫度變動(dòng)可以發(fā)生在生產(chǎn)期期間。轉(zhuǎn)換溫度設(shè)定點(diǎn)可以人工進(jìn)行，或可以通過(guò)利用生物反應(yīng)器控制系統(tǒng)自動(dòng)進(jìn)行。溫度設(shè)定點(diǎn)可以在預(yù)定時(shí)間或響應(yīng)于一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)參數(shù)，例如細(xì)胞密度、滴度或一種或多種培養(yǎng)基組分的濃度來(lái)轉(zhuǎn)換。一種此類方法使用整合至生物反應(yīng)器控制系統(tǒng)中的在線生物質(zhì)監(jiān)測(cè)工具，在達(dá)到所需細(xì)胞密度時(shí)觸發(fā)溫度設(shè)定點(diǎn)改變。舉例來(lái)說(shuō)，可以使用基于電容的生物質(zhì)探針在線估計(jì)細(xì)胞密度，且來(lái)自在線測(cè)量的數(shù)據(jù)可以用于觸發(fā)生物反應(yīng)器溫度的變動(dòng)。此類基于電容的探針包括fogale電容傳感器(dn12-200)(nimes，france)?？梢元?dú)立于溫度變動(dòng)，或與溫度變動(dòng)同時(shí)、在溫度變動(dòng)前或在溫度變動(dòng)后，添加蛋白質(zhì)生產(chǎn)的化學(xué)誘導(dǎo)物，例如咖啡因、丁酸鹽和/或六亞甲基雙乙酰胺(hmba)。如果在溫度變動(dòng)后添加誘導(dǎo)物，那么誘導(dǎo)物可以在溫度變動(dòng)后一小時(shí)至五天，任選地在溫度變動(dòng)后一天至兩天添加。接著細(xì)胞培養(yǎng)可以維持?jǐn)?shù)天或甚至數(shù)周，同時(shí)細(xì)胞生產(chǎn)所需蛋白質(zhì)。維持細(xì)胞處于所需生理狀態(tài)下的另一種方法是通過(guò)將細(xì)胞培養(yǎng)物暴露于低l-天冬酰胺條件來(lái)誘發(fā)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制(參見(jiàn)例如wipo公布no.wo2013/006479)。可以通過(guò)含有有限濃度的l-天冬酰胺的培養(yǎng)基并維持細(xì)胞培養(yǎng)物中低濃度的l-天冬酰胺來(lái)實(shí)現(xiàn)和維持細(xì)胞生長(zhǎng)抑制。維持l-天冬酰胺的濃度在5mm或更小下可以用于維持細(xì)胞處于生長(zhǎng)抑制狀態(tài)。細(xì)胞周期抑制劑也可用于誘發(fā)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制，細(xì)胞周期抑制劑是已知或懷疑調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)展和轉(zhuǎn)錄、dna修復(fù)、分化、衰老和細(xì)胞凋亡的相關(guān)過(guò)程的化合物。與循環(huán)機(jī)制相互作用的細(xì)胞周期抑制劑，例如細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(cdk)，如與來(lái)自其它通路(例如akt、mtor和直接或間接影響細(xì)胞周期的其它通路)的蛋白質(zhì)相互作用的那些分子般適用。收獲和純化所表達(dá)的重組蛋白質(zhì)可以分泌至培養(yǎng)基中，從培養(yǎng)基中可以回收和/或收集重組蛋白質(zhì)。接著重組蛋白質(zhì)可以進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)加工步驟，包括收獲、純化、內(nèi)毒素和/或病毒失活/過(guò)濾和/或超濾/滲濾?？梢栽谑斋@的透過(guò)物中捕捉所表達(dá)的重組蛋白質(zhì)?？梢允褂帽绢I(lǐng)域中已知和/或可以從商業(yè)供應(yīng)商獲得的方法和市售產(chǎn)品，從收獲的透過(guò)物純化或部分純化蛋白質(zhì)。此類方法包括絮凝；離心；沉淀；過(guò)濾法，例如深度過(guò)濾；色譜法，包括親和色譜法、空間排阻色譜法、離子交換色譜法、混合模式陰離子交換色譜法、疏水相互作用色譜法和羥磷灰石色譜法，可用方法之一。純化的蛋白質(zhì)接著可以加以“配制”，意指緩沖液更換、殺菌、散裝包裝和/或加上包裝，以用于最終用戶。本領(lǐng)域中已知適用于藥物組合物的制劑并包括以下中描述的制劑：remington′spharmaceuticalsciences，第18版1995，mackpublishingcompany，easton，pa。過(guò)程分析技術(shù)過(guò)程分析技術(shù)和方法可以用來(lái)監(jiān)測(cè)和評(píng)估在細(xì)胞培養(yǎng)和純化過(guò)程期間所取的樣品，以定量和/或定性地監(jiān)測(cè)重組蛋白質(zhì)和生產(chǎn)過(guò)程的特征。此實(shí)時(shí)或在線信息可以用于監(jiān)測(cè)和/或控制產(chǎn)品和生產(chǎn)參數(shù)，例如滴度、細(xì)胞密度；產(chǎn)品質(zhì)量屬性，例如翻譯后修飾；產(chǎn)品或過(guò)程可變性，例如雜質(zhì)等等，以根據(jù)需要及時(shí)作出決定和修改方法。可以監(jiān)測(cè)上游細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程或下游純化過(guò)程的每個(gè)步驟，以提供有關(guān)具體產(chǎn)品質(zhì)量屬性(pqa)的量的信息并在預(yù)設(shè)目標(biāo)和范圍下控制此pqa?？梢蚤g歇性，在所需頻率下，或連續(xù)地取樣?？梢詫?shí)時(shí)或接近實(shí)時(shí)分析樣品，或存儲(chǔ)以供隨后分析。此信息可以用于在上游和下游過(guò)程期間作出改變。可以使用質(zhì)譜分析法、液相色譜法與uv和/或質(zhì)譜分析檢測(cè)和毛細(xì)管電泳等，檢測(cè)產(chǎn)品質(zhì)量屬性。這些方法適合于如所指定的產(chǎn)品質(zhì)量屬性的水平所確定，在與例如補(bǔ)料、溫度、過(guò)程持續(xù)時(shí)間等人工或自動(dòng)過(guò)程調(diào)整下進(jìn)行連續(xù)監(jiān)測(cè)。可以使用呈尺寸排除模式操作且與esi-ms聯(lián)合的聚羥乙基天冬酰胺柱，檢測(cè)例如氨基酸加工和糖基化等翻譯后修飾的存在的完整質(zhì)量分析(brady等人，(2008)jamsocmassspectro，19：502-509)。通過(guò)使用激光散射檢測(cè)器和uv吸光度，監(jiān)測(cè)每種洗脫份的標(biāo)準(zhǔn)化ls/uv比來(lái)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)來(lái)自離子交換色譜法的洗脫物，參見(jiàn)美國(guó)專利公布no.us2013-0303732。多屬性方法使用單一液相色譜法/質(zhì)譜分析法(lc/ms)，使用各種數(shù)據(jù)庫(kù)和搜索平臺(tái)搜索和表征串聯(lián)ms數(shù)據(jù)，例如sequest(thescrippsresearchinstitute，lajolla，ca)、x！tandem(theglobalproteomemachineorganization)或mascot(matrixscience，boston，ma)。樣品可以在高ph值下變性，或?yàn)榫S持二硫化物同種型并保護(hù)琥珀酰亞胺變異體，在低ph值下變性。接著將樣品還原并烷基化，接著用胰蛋白酶消化。接著將樣品注射至ms(例如qexactivetmhybridquadrupole-orbitrap質(zhì)譜儀，thermofischerscientific，waltham，ma)并使用pinpoint軟件(thermofischerscientific)進(jìn)行分析?？梢澡b別、定量和監(jiān)測(cè)的屬性包括異構(gòu)化、脫氨基、二硫化物還原、宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)污染、突變、錯(cuò)誤并入、羥基賴氨酸、硫醚、未糖基化重鏈、c端酰胺化、剩余蛋白a，表征聚糖并提供分子身份。每種監(jiān)測(cè)屬性的質(zhì)量準(zhǔn)確度可以設(shè)定為少于預(yù)測(cè)質(zhì)量的5ppm。通過(guò)ms2片段化和正交表征法(例如對(duì)于糖基化為hilic-ms)來(lái)證實(shí)肽/屬性的鑒別。當(dāng)與理論同位素分布相比時(shí)，實(shí)驗(yàn)同位素分布必須具有超過(guò)0.95的點(diǎn)積分?jǐn)?shù)。為每種屬性設(shè)定保留時(shí)間窗，且考慮每種屬性的所有可檢測(cè)電荷狀態(tài)進(jìn)行定量。界定將檢測(cè)屬性改變的標(biāo)準(zhǔn)。舉例來(lái)說(shuō)，可以通過(guò)確定脫氨基值(脫去氨基的肽除以脫去氨基的肽與未修飾的親本肽的總和乘以100)來(lái)監(jiān)測(cè)脫氨基。通過(guò)將每種特定聚糖相對(duì)于所有可檢測(cè)聚糖的總和進(jìn)行比較來(lái)監(jiān)測(cè)。蛋白質(zhì)如本文所用，“肽”、“多肽”和“蛋白質(zhì)”通篇可互換使用，且是指包含兩個(gè)或更多個(gè)由肽鍵彼此接合的氨基酸殘基的分子。肽、多肽和蛋白質(zhì)也包括修飾，包括(但不限于)產(chǎn)生糖蛋白的糖基化、脂質(zhì)附接、硫酸化、谷氨酸殘基的γ-羧化、羥基化和adp-核糖基化。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“糖蛋白”是指具有至少一個(gè)包括甘露糖殘基的寡糖側(cè)鏈的肽和蛋白質(zhì)。糖蛋白可以與所用的宿主細(xì)胞同源，或可以與宿主細(xì)胞異源，即外來(lái)的，舉例來(lái)說(shuō)，由中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(cho)宿主細(xì)胞產(chǎn)生的人類糖蛋白。此類糖蛋白一般稱為“重組糖蛋白”。在某些實(shí)施方案中，由宿主細(xì)胞表達(dá)的糖蛋白直接分泌至培養(yǎng)基中。在科學(xué)或商業(yè)上會(huì)關(guān)注蛋白質(zhì)，包括基于蛋白質(zhì)的藥物。蛋白質(zhì)尤其包括抗體和融合蛋白。肽、多肽和蛋白質(zhì)可以通過(guò)重組動(dòng)物細(xì)胞系，使用細(xì)胞培養(yǎng)方法產(chǎn)生，并可以稱為“重組肽”、“重組多肽”、“重組蛋白質(zhì)”、“重組糖蛋白”。所表達(dá)的重組蛋白質(zhì)可以在細(xì)胞內(nèi)生產(chǎn)或分泌至培養(yǎng)基中，從培養(yǎng)基中可以回收和/或收集重組蛋白質(zhì)?？梢杂欣杀景l(fā)明的方法產(chǎn)生的哺乳動(dòng)物蛋白質(zhì)的非限制性實(shí)例包括氨基酸序列與以下蛋白質(zhì)之一的全部或一部分一致或基本上類似的蛋白質(zhì)：腫瘤壞死因子(tnf)、flt3配體(wo94/28391)、促紅細(xì)胞生成素、促血小板生成素、降鈣素、il-2、促血管生成素-2(maisonpierre等人(1997)，science277(5322)：55-60)、nf-κb受體活化劑的配體(rankl，wo01/36637)、腫瘤壞死因子(tnf)相關(guān)的細(xì)胞凋亡誘發(fā)配體(trail，wo97/01633)、胸腺基質(zhì)衍生的淋巴細(xì)胞生成素、粒細(xì)胞群落刺激因子、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞群落刺激因子(gm-csf，澳大利亞專利no.588819)、肥大細(xì)胞生長(zhǎng)因子、干細(xì)胞生長(zhǎng)因子(美國(guó)專利no.6,204,363)、表皮生長(zhǎng)因子、角化細(xì)胞生長(zhǎng)因子、巨有核細(xì)胞生長(zhǎng)與發(fā)育因子、rantes、人類纖維蛋白酶原樣2蛋白質(zhì)(fgl2；ncbi寄存編號(hào)nm_00682；rüegg和pytela(1995)，gene160：257-62)生長(zhǎng)激素、胰島素、促胰島素、胰島素樣生長(zhǎng)因子、甲狀旁腺激素、干擾素(包括α-干擾素、γ-干擾素和復(fù)合干擾素)(美國(guó)專利no.4,695,623和4,897471)、神經(jīng)生長(zhǎng)因子、腦衍生神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、突觸結(jié)合蛋白樣蛋白質(zhì)(slp1-5)、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)蛋白-3、胰高血糖素、白細(xì)胞介素、群落刺激因子、淋巴細(xì)胞毒素-β、白血病抑制因子和制癌蛋白-m?？梢愿鶕?jù)本發(fā)明的方法產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的描述可見(jiàn)于例如humancytokines：handbookforbasicandclinicalresearch，所有卷(aggarwal和gutterman編輯，blackwellsciences，cambridge，ma，1998)；growthfactors：apracticalapproach(mckay和leigh編輯，oxforduniversitypressinc.，newyork，1993)；和thecytokinehandbook，第1卷和第2卷(thompson和lotze編輯，academicpress，sandiego，ca，2003)。另外，本發(fā)明的方法可用于產(chǎn)生包含任何上述蛋白質(zhì)的受體的氨基酸序列全部或一部分的蛋白質(zhì)、此類受體或任何上述蛋白質(zhì)的拮抗劑和/或基本上類似于此類受體或拮抗劑的蛋白質(zhì)。這些受體和拮抗劑包括：腫瘤壞死因子受體的兩種形式(tnfr，稱為p55和p75，美國(guó)專利no.5,395,760和美國(guó)專利no.5,610,279)、白細(xì)胞介素-1(il-1)受體(i型和ii型；歐洲專利no.0460846、美國(guó)專利no.4,968,607和美國(guó)專利no.5,767,064)、il-1受體拮抗劑(美國(guó)專利no.6,337,072)、il-1拮抗劑或抑制劑(美國(guó)專利no.5,981,713、6,096,728和5,075,222)、il-2受體、il-4受體(歐洲專利no.0367566和美國(guó)專利no.5,856,296)、il-15受體、il-17受體、il-18受體、fc受體、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞群落刺激因子受體、粒細(xì)胞群落刺激因子、制癌蛋白-m和白血病抑制因子的受體、nf-κb受體活化劑(rank，wo01/36637和美國(guó)專利no.6,271,349)、骨保護(hù)素(美國(guó)專利no.6,015,938)、trail受體(包括trail受體1、2、3和4)以及包含死亡結(jié)構(gòu)域的受體，例如fas或細(xì)胞凋亡誘發(fā)受體(air)?？梢允褂帽景l(fā)明產(chǎn)生的其它蛋白質(zhì)包括包含分化抗原的氨基酸序列全部或一部分的蛋白質(zhì)(稱為cd蛋白質(zhì))或其配體或基本上類似于這些中任一者的蛋白質(zhì)。此類抗原在leukocytetypingvi(proceedingsofthevithinternationalworkshopandconference，kishimoto，kikutani等人編輯，kobe，japan，1996)中公開(kāi)。類似cd蛋白質(zhì)在隨后研討會(huì)中公開(kāi)。此類抗原的實(shí)例包括cd22、cd27、cd30、cd39、cd40和其配體(cd27配體、cd30配體等等)。若干cd抗原為tnf受體家族的成員，tnf受體家族還包括41bb和ox40。配體與41bb配體和ox40配體也一樣常為tnf家族的成員。還可以使用本發(fā)明產(chǎn)生酶活性蛋白質(zhì)或其配體。實(shí)例包括包含以下蛋白質(zhì)之一的全部或一部分的蛋白質(zhì)或其配體或基本上類似于這些之一的蛋白質(zhì)：解聚素和金屬蛋白酶結(jié)構(gòu)域家族成員，包括tnf-α轉(zhuǎn)變酶、各種激酶、葡糖腦苷脂酶、過(guò)氧化物歧化酶、組織纖溶酶原活化劑、因子viii、因子ix、阿樸脂蛋白e、阿樸脂蛋白a-i、球蛋白、il-2拮抗劑、α-1抗胰蛋白酶、任何上述酶的配體和許多其它酶和其配體。除非另作說(shuō)明，否則術(shù)語(yǔ)“抗體”包括提及任何同種型或子類的糖基化與非糖基化免疫球蛋白，或與完整抗體競(jìng)爭(zhēng)特異性結(jié)合的其抗原結(jié)合區(qū)，包括人、人源化、嵌合、多特異性、單克隆、多克隆和寡聚體或其抗原結(jié)合片段。還包括具有如下抗原結(jié)合片段或區(qū)域的蛋白：fab、fab’、f(ab’)2、fv、雙功能抗體、fd、dab、最大功能抗體(maxibody)、單鏈抗體分子、互補(bǔ)決定區(qū)(cdr)片段、scfv、雙功能抗體、三功能抗體、四功能抗體和含有足夠賦予標(biāo)靶多肽特異性抗原結(jié)合的免疫球蛋白的至少一部分的多肽。術(shù)語(yǔ)“抗體”包括(但不限于)通過(guò)重組方式制備、表達(dá)、產(chǎn)生或分離的抗體，例如從經(jīng)轉(zhuǎn)染以表達(dá)抗體的宿主細(xì)胞分離的抗體?？贵w的實(shí)例包括(但不限于)識(shí)別包括(但不限于)上述蛋白質(zhì)的任一蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)組合和/或以下抗原的抗體：cd2、cd3、cd4、cd8、cd11a、cd14、cd18、cd19、cd20、cd22、cd23、cd25、cd27l、cd32、cd33、cd40、cd44、cd52、cd80(b7.1)、cd86(b7.2)、cd147、il-1α、il-1β、il-2、il-3、il-7、il-4、il-5、il-8、il-10、il-12、il-12p35亞單位、il-13、il-21、il-23、il-23p19亞單位、il-12/il-23共享的p40亞單位、il-2受體、il-4受體、il-6受體、il-13受體、il-17受體、il-18受體亞單位、fgl2、pdgf-β和其類似物(參見(jiàn)美國(guó)專利no.5,272,064和5,149,792)、b7rp-1、b7rp-2、vegf、tgf、tgf-β2、tgf-β1、c-fms、egf受體(參見(jiàn)美國(guó)專利no.6,235,883)、cgrp受體、vegf受體、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子、前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草桿菌蛋白酶/科星第9型(proproteinconvertasesubtilisin/kexintype9，pcsk9)、fgf21、骨保護(hù)素配體、干擾素γ、egfrviii、b淋巴細(xì)胞刺激物(blys，又稱為baff、thank、tall-1和ztnf4；參見(jiàn)do和chen-kiang(2002)，cytokinegrowthfactorrev.13(1)：19-25)、st2、c5補(bǔ)體、ige、腫瘤抗原ca125、腫瘤抗原muc1、pem抗原、lcg(其為與肺癌相關(guān)表達(dá)的基因產(chǎn)物)、her-2、her-3、腫瘤相關(guān)的糖蛋白tag-72、sk-1抗原、以高水平存在于結(jié)腸癌和/或胰腺癌患者的血清中的腫瘤相關(guān)表位、在乳房、結(jié)腸、鱗狀上皮細(xì)胞、前列腺、胰腺、肺和/或腎癌細(xì)胞和/或黑素瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤或神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞上表達(dá)的癌癥相關(guān)表位或蛋白質(zhì)、腫瘤的壞死中心、整合素α4β7、整合素vla-4、b2整合素、tslp、ifnγ、trail受體1、2、3和4、rank、rank配體、tnf-α、粘著分子vap-1、上皮細(xì)胞粘著分子(epcam)、細(xì)胞間粘著分子-3(icam-3)、促血管生成素1(ang1)、促血管生成素2(ang2)、白細(xì)胞整合素粘附素、血小板糖蛋白gpiib/iiia、心肌肌球蛋白重鏈、甲狀旁腺激素、rnapc2(其為因子viia-組織因子的抑制劑)、mhci、癌胚抗原(cea)、α-甲胎蛋白(afp)、腫瘤壞死因子(tnf)、ctla-4(其為細(xì)胞毒性t淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原)、程序性細(xì)胞死亡1(pd-1)、程序性細(xì)胞死亡配體1(pdl-1)、程序性細(xì)胞死亡配體2(pdl-2)、淋巴細(xì)胞活化基因-3(lag-3)、t細(xì)胞免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域和粘蛋白結(jié)構(gòu)域3(tim3)、fc-γ-1受體、hla-dr10β、hla-dr抗原、硬骨素、l-選擇蛋白、呼吸道合胞病毒、人類免疫缺陷性病毒(hiv)、乙型肝炎病毒(hbv)、變異鏈球菌(streptococcusmutans)和金黃色葡萄球菌(staphlycoccusaureus)。可以使用本發(fā)明方法產(chǎn)生的已知抗體的特定實(shí)例包括(但不限于)阿達(dá)木單抗(adalimumab)、阿利若單抗(alirocumab)、貝伐單抗(bevacizumab)、英利昔單抗(infliximab)、阿昔單抗(abciximab)、阿倫單抗(alemtuzumab)、巴匹珠單抗(bapineuzumab)、巴利昔單抗(basiliximab)、貝利木單抗(belimumab)、布雷奴單抗(briakinumab)、布若達(dá)單抗(brodalumab)、卡那奴單抗(canakinumab)、賽妥珠單抗(certolizumabpegol)、西妥昔單抗(cetuximab)、克土木單抗(conatumumab)、地諾單抗(denosumab)、杜皮利單抗(dupililumab)、依庫(kù)麗單抗(eculizumab)、吉妥單抗(gemtuzumab)、古賽單抗(guselkumab)、奧唑米星(ozogamicin)、戈利木單抗(golimumab)、依吐單抗(ibritumomab)、依珠單抗(ixekizumab)、伊匹單抗(ipilimumab)、替克西坦(tiuxetan)、拉貝珠單抗(labetuzumab)、樂(lè)珠單抗(lebrikizumab)、馬帕木單抗(mapatumumab)、馬瑞木單抗(mavrilimumab)、馬妥珠單抗(matuzumab)、美泊利單抗(mepolizumab)、莫維珠單抗(motavizumab)、莫羅單抗-cd3(muromonab-cd3)、尼魯單抗(nivolumab)、那他珠單抗(natalizumab)、尼妥珠單抗(nimotuzumab)、奧法木單抗(ofatumumab)、奧瑪珠單抗(omalizumab)、奧戈伏單抗(oregovomab)、帕利珠單抗(palivizumab)、帕尼單抗(panitumumab)、派吐單抗(pemtumomab)、帕妥株單抗(pertuzumab)、派姆單抗(pembrolizumab)、蘭尼單抗(ranibizumab)、利妥昔單抗(rituximab)、洛索珠單抗(romosozumab)、羅維珠單抗(rovelizumab)、瑞吐珠單抗(rilotumumab)、替珠單抗(tildrakizumab)、托珠單抗(tocilizumab)、托西莫單抗(tositumomab)、曲努單抗(tralokinumab)、曲妥珠單抗(trastuzumab)、曲米木單抗(tremelimumab)、優(yōu)特克單抗(ustekinumab)、維里單抗(vedolizomab)、扎魯木單抗(zalutumumab)和扎木單抗(zanolimumab)。本發(fā)明還可以用于產(chǎn)生包含例如任何上述蛋白質(zhì)的重組融合蛋白。舉例來(lái)說(shuō)，可以使用本發(fā)明的方法產(chǎn)生包含上述蛋白質(zhì)之一加多聚化結(jié)構(gòu)域(例如亮氨酸拉鏈、卷曲螺旋、免疫球蛋白的fc部分或基本上類似的蛋白質(zhì))的重組融合蛋白。參見(jiàn)例如wo94/10308；lovejoy等人(1993)，science259：1288-1293；harbury等人(1993)，science262：1401-05；harbury等人(1994)，nature371：80-83；等人(1999)，structure7：255-64。此類重組融合蛋白中特別包括的是其中受體的一部分與抗體的fc部分融合的蛋白質(zhì)，例如依那西普(etanercept)(ap75tnfr：fc)和貝拉西普(belatacept)(ctla4：fc)。嵌合蛋白和多肽以及任何上述蛋白質(zhì)和多肽的片段或部分或突變體、變異體或類似物也包括在可以通過(guò)本發(fā)明的方法產(chǎn)生的適合蛋白質(zhì)、多肽和肽中。此包括曲巴那尼(trebananib)，一種促血管生成素(ang)1和2中和肽體。還包括選擇性發(fā)揮作用且引導(dǎo)人類免疫系統(tǒng)針對(duì)腫瘤細(xì)胞的雙特異性t細(xì)胞接合器(bite)。此類bite中特別包括靶向cd19的抗體，例如博納吐單抗(blinatumomab)。其它分子包括阿柏西普(aflibercept)。雖然本申請(qǐng)中所用的術(shù)語(yǔ)是本領(lǐng)域內(nèi)的標(biāo)準(zhǔn)術(shù)語(yǔ)，但本文中提供了某些術(shù)語(yǔ)的定義以保證權(quán)利要求書含義的清楚和明確。單位、前綴以及符號(hào)可以呈其si公認(rèn)形式表示。本文中敘述的數(shù)值范圍包括界定范圍的數(shù)目，且包括并支持所界定范圍內(nèi)的每個(gè)整數(shù)。除非另有指示，否則本文中描述的方法和技術(shù)一般根據(jù)本領(lǐng)域中眾所周知且如本說(shuō)明書通篇所引用和論述的各種通用和更特定參考文獻(xiàn)中所述的常規(guī)方法進(jìn)行。參見(jiàn)例如sambrook等人molecularcloning：alaboratorymanual，第3版，coldspringharborlaboratorypress，coldspringharbor，n.y.(2001)和ausubel等人，currentprotocolsinmolecularbiology，greenepublishingassociates(1992)，以及harlow和laneantibodies：alaboratorymanualcoldspringharborlaboratorypress，coldspringharbor，n.y.(1990)。本申請(qǐng)中引用的所有文獻(xiàn)或文獻(xiàn)的部分，包括(但不限于)專利、專利申請(qǐng)、文章、書和論文，都以引用的方式明確并入本文中。在本發(fā)明的一實(shí)施方案中描述的內(nèi)容可以與本發(fā)明的其它實(shí)施方案組合。本發(fā)明在范圍上不受本文中描述的特定實(shí)施方案限制，所述實(shí)施方案僅僅意圖說(shuō)明本發(fā)明的個(gè)別方面，且功能等效的方法和組分在本發(fā)明的范圍內(nèi)。實(shí)際上，除本文中所示和所述外，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)上述描述和附圖將變得顯而易見(jiàn)本發(fā)明的各種修改。此類修改意圖在隨附權(quán)利要求書范圍內(nèi)。實(shí)施例細(xì)胞培養(yǎng)在第0天，將表達(dá)重組抗tnfα抗體的cho細(xì)胞于1500ml工作容積的無(wú)血清的化學(xué)成分確定的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中以9.0×106個(gè)活細(xì)胞/毫升接種至3l生物反應(yīng)器(applikon，fostercity，ca)。將培養(yǎng)物維持在36℃下，do在30mmhg下，在400rpm下攪動(dòng)。細(xì)胞培養(yǎng)以分批模式開(kāi)始，且在第3天，使用裝備有30kdanfwcgertp中空纖維濾筒(gehealthcare，pittsburg，pa)的atf-2tm交替切向流過(guò)濾系統(tǒng)(refinetechnologies，hanover，nj)開(kāi)始灌注。培養(yǎng)基是無(wú)血清的化學(xué)成分確定的灌注培養(yǎng)基，其包括如表1中所述的單水合硫酸錳和五水合硫酸銅以及ph值。實(shí)驗(yàn)一式兩份進(jìn)行。表1phmn2+(nm)cu2+(ppb)6.8550106.85501006.851000106.8510001007.050107.0501007.01000107.01000100在細(xì)胞培養(yǎng)操作期間，灌注速率從0.3工作容積/天逐漸增加至1.0工作容積/天。當(dāng)天，溫度變動(dòng)至31℃，且在第17天收獲培養(yǎng)物。葡萄糖維持在4-8g/l之間。每天取樣以評(píng)定培養(yǎng)物。使用rapidlab1260血液氣體分析器(siemens，malvern，pa)測(cè)量ph值和co2(pco2)和o2(po2)的分壓；使用novaflex(novabiomedical，waltham，ma)測(cè)量葡萄糖和乳酸鹽的濃度。通過(guò)型號(hào)2020滲透壓力計(jì)(advancedinstruments，norwood，ma)測(cè)定滲透壓度。使用applikonadi1010控制器控制溫度、ph值、溶解氧和攪動(dòng)。在第7天、第10天、第13天、第15天和第17天，從生物反應(yīng)器去除50ml培養(yǎng)物樣品，用于分析產(chǎn)物質(zhì)量。將樣品在室溫下在3000rpm下離心30分鐘(beckmancoulter，indianapolis，in)并通過(guò)0.2μm筒狀頂過(guò)濾器(corning，fisherscientific，pittsburgh，pa)過(guò)濾上層清液。接著將無(wú)細(xì)胞的上層清液冷凍在-20℃下，直至解凍和蛋白a純化，接著分析產(chǎn)物質(zhì)量。在17天生產(chǎn)結(jié)束后，從生物反應(yīng)器去除剩余培養(yǎng)物。通過(guò)在4℃下在3000rpm下離心30分鐘來(lái)分離細(xì)胞與上層清液，且使用0.2μm聚醚砜(pes)筒式過(guò)濾器將條件培養(yǎng)基無(wú)菌過(guò)濾至nalgene瓶(fisherscientific，pittsburgh，pa)中，接著通過(guò)蛋白質(zhì)進(jìn)行純化，并如上所述，測(cè)試中和洗脫物?；罴?xì)胞密度和細(xì)胞存活力通過(guò)vi-cell(beckmancoulter，brea，ca)測(cè)定。積分活細(xì)胞密度(ivcd)被計(jì)算為在整個(gè)生產(chǎn)時(shí)間長(zhǎng)度期間累積活細(xì)胞密度。使用蛋白a(lifetechnologies，grandisland，ny)測(cè)量滴度。在上層清液中測(cè)定滴度，然后針對(duì)細(xì)胞所占據(jù)的容積進(jìn)行調(diào)整，以便其代表實(shí)際上存在于給定容積的細(xì)胞培養(yǎng)流體中的細(xì)胞。因?yàn)榧t細(xì)胞壓積被表示為總?cè)莘e的百分比，所以經(jīng)pcv調(diào)整的滴度始終低于上層清液中的滴度。通過(guò)親水性相互作用液相色譜法(hilic)分析不同的n-聚糖物質(zhì)并呈現(xiàn)為組合聚糖的總峰面積的百分比。通過(guò)蛋白a收集和純化含有抗體的樣品。純化的樣品用pngase-f處理并在37℃下培育2小時(shí)以釋放n連接的聚糖。在80℃下將酶促釋放的聚糖用2-氨基苯甲酸(2-aa)標(biāo)記75分鐘。接著用glycocleans濾筒去除過(guò)量2-aa標(biāo)記。將樣品蒸發(fā)過(guò)夜并用水復(fù)原所得的干燥小球，以用于隨后使用uplc(waterscorporation，milford，ma)進(jìn)行hilic分析。在高有機(jī)條件下將聚糖注射并結(jié)合于柱并用增加梯度的水性甲酸銨緩沖液洗脫。使用熒光檢測(cè)來(lái)監(jiān)測(cè)聚糖洗脫并計(jì)算主要和次要聚糖物質(zhì)的相對(duì)百分比。β-半乳糖基化水平包括a1g1f、a2g1f、a2g2f和類似的非巖藻糖基化形式。非巖藻糖基化形式包括a1go、a2go、a1g1、a2g1和a2g2。還測(cè)定甘露糖5和甘露糖7。此實(shí)驗(yàn)被設(shè)計(jì)成能界定每個(gè)主要因子(銅、錳和ph值)的影響和雙向相互作用。實(shí)驗(yàn)是界定主要影響和雙向相互作用的三因子雙層(23)全因子設(shè)計(jì)，且不包括中心點(diǎn)。該研究意圖使用1.25的信噪比，提供大約0.8的功率值。使用jmp統(tǒng)計(jì)軟件和預(yù)測(cè)剖析圖(sasinstitute，inc.，cary，nc)產(chǎn)生剖析特征。結(jié)果灌注培養(yǎng)基中銅和錳的濃度不影響細(xì)胞培養(yǎng)性能或生產(chǎn)率。雖然ph值不影響細(xì)胞生長(zhǎng)或生產(chǎn)率，但ph6.85使最終存活力減少大約10％(p＜0.001)，圖1-4。高甘露糖聚糖ph值是顯著影響高甘露糖水平的唯一因子。當(dāng)ph值增加時(shí)，高甘露糖的水平也增加，參見(jiàn)表2。β-半乳糖基化錳的添加增強(qiáng)β-半乳糖基化。錳的濃度越大，β-半乳糖基化的百分比越大。ph值也對(duì)β-半乳糖基化具有統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的影響。ph值增加，β-半乳糖基化也增加，但增加程度低于添加錳時(shí)的增加，參見(jiàn)圖5。銅對(duì)β-半乳糖基化的影響不顯著。非巖藻糖基化銅、錳和ph值都對(duì)非巖藻糖基化水平具有統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的影響。銅和錳的濃度越大，且ph值越高，非巖藻糖基化水平越高，參見(jiàn)圖6。所有關(guān)鍵聚糖都受ph值顯著影響。β-半乳糖基化受錳濃度的增加顯著影響。如通過(guò)統(tǒng)計(jì)模型測(cè)定，錳水平增加至其最高水平會(huì)引起β-半乳糖基化增加達(dá)超過(guò)基線(在相同ph值下銅和錳的最低水平)大約14％。非巖藻糖基化顯著受銅與錳濃度的增加影響。增加銅和錳的水平增強(qiáng)非巖藻糖基化水平超過(guò)基線值大約1.3％。雖然高濃度銅和錳的添加未影響細(xì)胞培養(yǎng)性能，但其對(duì)產(chǎn)物質(zhì)量有影響。參見(jiàn)表2和3。表2.來(lái)自第17天收獲的結(jié)果表3.作為模型的一部分的項(xiàng)目的模型擬合(r2)和統(tǒng)計(jì)顯著性(p值)的概述。名稱“較高”是指其中ph值或其它因子較高，然后不同類型糖基化上升的情況。糖基化會(huì)影響重組蛋白藥物的治療功效。眾所周知fc糖基化的變異會(huì)影響fc介導(dǎo)的效應(yīng)功能。非巖藻糖基化和高甘露糖聚糖會(huì)增強(qiáng)抗體依賴性的細(xì)胞毒性(adcc)活性。為用于adcc分析法中，使用補(bǔ)料分批培養(yǎng)分開(kāi)產(chǎn)生非巖藻糖基化和巖藻糖基化的重組抗tnfα抗體物質(zhì)。在添加的巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶抑制劑的幫助下，制造非巖藻糖基化抗體。所得重組抗體大約85％非巖藻糖基化。非巖藻糖基化抗體物質(zhì)接著與完全巖藻糖基化的抗體物質(zhì)混合，以產(chǎn)生最終抗體混合物中特定水平的非巖藻糖基化。接著使用抗體物質(zhì)測(cè)量在各種水平非巖藻糖基化下的adcc活性水平，以確定adcc反應(yīng)的敏感性。在基于細(xì)胞的分析法中，使用穩(wěn)定表達(dá)橫跨膜tnfα的tnfα轉(zhuǎn)變酶(tace)抗性形式的chom7細(xì)胞作為標(biāo)靶細(xì)胞，來(lái)評(píng)估抗體混合物的adcc活性。經(jīng)人cd16(fcγriiia-158v)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的nk92-m1細(xì)胞用作效應(yīng)細(xì)胞。簡(jiǎn)單地說(shuō)，將標(biāo)靶細(xì)胞用增加濃度(0.143ng/ml至40ng/ml)的抗體調(diào)理，接著與nk92-m1/cd16效應(yīng)細(xì)胞共同培育。在adcc介導(dǎo)的標(biāo)靶細(xì)胞溶解后，胞內(nèi)酶腺苷酸激酶釋放至細(xì)胞培養(yǎng)基。使用toxilighttm生物分析試劑盒(lonza，allendale，nj)測(cè)量釋放的腺苷酸激酶的量。pro(moleculardevices，sunnyvale，ca)將進(jìn)行4參數(shù)數(shù)據(jù)分析并與劑量-反應(yīng)數(shù)據(jù)進(jìn)行約束模型曲線擬合。通過(guò)將測(cè)試樣品反應(yīng)與針對(duì)參考標(biāo)準(zhǔn)獲得的反應(yīng)比較，確定測(cè)試樣品活性，并報(bào)導(dǎo)為相對(duì)細(xì)胞毒性百分比。為用于補(bǔ)體依賴性的細(xì)胞毒性(cdc)分析法，從用色譜法富集的重組抗tnfα抗體洗脫份獲得β-半乳糖基化物質(zhì)。富集的抗體用來(lái)制備具有特定水平β-半乳糖基化的溶液。接著測(cè)量在各種水平β-半乳糖基化下的cdc活性水平以確定cdc反應(yīng)的敏感性。在功能性的基于細(xì)胞的分析中評(píng)估由抗體引起的cdc活性程度。將chom7細(xì)胞預(yù)先與20μm鈣黃綠素-am(sigma，st.louis，mo)一起培育。鈣黃綠素-am進(jìn)入細(xì)胞并由非特異性酯酶裂解，變得發(fā)熒光并被捕捉在完整細(xì)胞膜內(nèi)。負(fù)載鈣黃綠素的標(biāo)靶細(xì)胞與不同劑量濃度的抗體(1.563ng/ml至200ng/ml)一起培育，接著添加補(bǔ)體(2.5％最終濃度)用于第二次培育。在補(bǔ)體培育后，去除上層清液并使用微盤式讀數(shù)器(envision，perkinelmer，waltham，ma)測(cè)量熒光。熒光強(qiáng)度與細(xì)胞溶解的量成正比。pro(moleculardevices，sunnyvale，ca)將用于進(jìn)行4參數(shù)數(shù)據(jù)分析并與劑量-反應(yīng)數(shù)據(jù)進(jìn)行約束模型曲線擬合。通過(guò)將測(cè)試樣品反應(yīng)與針對(duì)參考標(biāo)準(zhǔn)獲得的反應(yīng)比較，確定測(cè)試樣品活性，并報(bào)導(dǎo)為相對(duì)細(xì)胞毒性百分比。僅僅使非巖藻糖基化水平增加2％就對(duì)adcc活性具有實(shí)際影響(圖7)。cdc活性還清楚地受β-半乳糖基化水平的增加影響，不過(guò)反應(yīng)不太敏感(圖8)。adcc和cdc效應(yīng)功能可能是治療性蛋白質(zhì)的臨床活性的關(guān)鍵因子，且實(shí)現(xiàn)特定聚糖的所需目標(biāo)值對(duì)于達(dá)到所需臨床終點(diǎn)來(lái)說(shuō)是關(guān)鍵的。非巖藻糖基化微小改變對(duì)糖蛋白的adcc活性可能具有巨大的影響。通過(guò)改變銅和錳，可以控制負(fù)責(zé)這些效應(yīng)功能并管理產(chǎn)物質(zhì)量的聚糖水平。當(dāng)前第1頁(yè)12