相關(guān)申請的交叉引用

本申請要求2014年10月15日提交的美國臨時申請?zhí)?2/063,983和2015年2月27日提交的美國臨時申請?zhí)?2/121,711的權(quán)益，所述申請二者均以引用的方式整體并入本文。

發(fā)明領(lǐng)域

本發(fā)明除其他事項外還涉及包含早期洗脫的色酰胺(tryptamide)和晚期洗脫的色酰胺的混合物的提取物。

發(fā)明背景

色酰胺調(diào)節(jié)了蛋白磷酸酶2a(pp2a)以增強(qiáng)腦健康及其各種認(rèn)知功能。目前，色酰胺、更確切地為二十烷?；?、二十二烷?；投耐轷；?-羥基色酰胺，可用于以非分離的形式摻入在人類飲食中，因為在咖啡和可可制品中可見痕量的色酰胺。

更確切地，羅布斯塔(robusta)咖啡豆可含有565-1120mg/kg總色酰胺，并且阿拉比卡(arabica)咖啡豆可含有500-2370mg/kg總色酰胺(maier，1981)。然而，人類消耗的咖啡可以呈每份僅提供0.6-0.8mg的總色酰胺(trpytaminde)的含水提取物的形式?？偵０房梢园?3.26％早期洗脫的色酰胺和86.74％晚期洗脫的色酰胺，其對應(yīng)地具有至少40％二十烷?；０?、41％二十二烷?；０泛?％二十四烷酰基色酰胺。

普通咖啡飲料中的二十烷?；?-羥基色酰胺水平示出在以下表1中。一份商業(yè)咖啡飲料的消耗可以提供0.6至0.72mg的二十烷?；?-羥基色酰胺。

表1

此外，咖啡中可見的某些二萜類(諸如咖啡醇和咖啡豆醇)在施用時與促進(jìn)受試者的膽固醇水平升高相關(guān)，這顯示在男性中至少增加8％，并且在女性中增加10％。事實(shí)上，咖啡含有高達(dá)0.6％-1％的二萜類，這轉(zhuǎn)換成每份調(diào)制咖啡的3-7mg二萜類。文獻(xiàn)表明每天消耗各10mg的二萜類可以使血清膽固醇升高5mg/dl。因此，每天3-5份咖啡似乎是長期神經(jīng)保護(hù)所需要的最低量，這可能具有一些心血管缺陷，特別是在具有使他們易于發(fā)生高膽固醇和/或其他心血管病的潛在情況(諸如現(xiàn)有心血管疾病、吸煙、久坐生活方式以及遺傳因素)的受試者中。

此外，咖啡含有大量的咖啡因，其量為每份50-436mg，而脫咖啡因咖啡為每份約2-25mg(http://www.cspinet.org/new/cafchart.htm)。已知咖啡因會升高已經(jīng)患有高血壓的患者的血壓，引起失眠、痛風(fēng)發(fā)作、消化不良、頭痛、尿失禁，并且降低女性生育能力?？Х纫蜻^量可能導(dǎo)致不良癥狀，包括死亡，尤其是在患有潛在醫(yī)學(xué)病狀的那些患者中(http://www.caffeineinformer.com/harmful-effects-of-caffeine)。

類似地，可可液醬產(chǎn)品含有40.1mg/kg的總色酰胺或每份約1.6mg。不幸的是，大部分色酰胺由二十二烷?；投耐轷；苌锝M成，而可可產(chǎn)品不含生物上大量的二十烷?；?-羥基色酰胺，其在神經(jīng)變性、帕金森病和阿爾茨海默病的各種模型中已被證明是有效的。

仍需要一種包括色酰胺的所有益處但沒有不良后果諸如升高的膽固醇水平和血壓的組合物。

還需要可以防止興奮毒性細(xì)胞死亡的另外的治療劑。僅在美國每年就有超過170萬個人患有創(chuàng)傷性腦損傷(tbi)(faul2010)。tbi的風(fēng)險群組包括但不限于士兵、運(yùn)動員、車禍?zhǔn)芎φ吆图彝ケ┝κ芎φ摺?hoge2008；dekosky2010；mckee2009；valera2003)。它已與諸如慢性損傷性腦病、阿爾茨海默病、帕金森病、肌萎縮性側(cè)索硬化、運(yùn)動神經(jīng)元疾病以及癡呆相關(guān)聯(lián)(mortimer1991；flemming2000；goldman2006；ben-shlomo1997；chen2007；schmidt2010)。損傷后觀察已顯示谷氨酸鹽水平增加2.8倍(faden1989，globus,1995)。過量谷氨酸鹽暴露的下游影響為ampa(α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異噁唑丙酸)受體、nmda(n-甲基-d-天冬氨酸鹽)受體和谷氨酸鹽受體的過度活化，從而導(dǎo)致ca2+的流入、氧化應(yīng)激和細(xì)胞損壞，最終導(dǎo)致興奮毒性細(xì)胞死亡。這種類型的繼發(fā)性損傷已經(jīng)成為疾病干預(yù)的目標(biāo)。例如，無毒的非致幻性nmda受體拮抗劑美金剛是神經(jīng)保護(hù)性的并且已用作阿爾茨海默病和帕金森病的治療(komhuber1994；emre2010；merello1999；reisberg2003)。盡管如此，另外的療法也將是有幫助的。

本發(fā)明試圖解決這些未滿足的需求。

發(fā)明概述

本發(fā)明的一個方面提供一種eht提取物，其中所述eht提取物包含至少約7:1晚期洗脫的色酰胺:早期洗脫的色酰胺的重量比的晚期洗脫的色酰胺和早期洗脫的色酰胺的混合物，其中所述eht提取物包含基于eht提取物中的色酰胺的總重量的至少30％的二十烷?；?5-羥基色酰胺。在某些實(shí)施方式中，eht提取物中咖啡因的量不超過基于提取物的總重量的約15％，并且/或者提取物中二萜類的量小于約1mg/kg。

還提供了包含eht提取物的組合物，也稱eht提取物組合物。eht提取物組合物還可以包含維生素、微量元素、食物或健康補(bǔ)充劑、草藥提取物以及藥物中的一或多種。在某些實(shí)施方式中，eht提取物組合物包含維生素、微量元素和食物或健康補(bǔ)充劑。在某些實(shí)施方式中，eht提取物組合物包含維生素、微量元素、食物或健康補(bǔ)充劑和草藥提取物。

在一個實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種制劑(例如，固體單位劑量，諸如片劑)，包含1.4-1.8mg維生素b6(吡哆醇hcl)、380-420mcg葉酸鹽(葉酸)、8-12mcg維生素b12(氰鈷胺)、14-18mg鎂以及70-80mgeht提取物。在另一實(shí)施方式中，所述制劑包含1.6mg維生素b6(吡哆醇hcl)、400mcg葉酸鹽(葉酸)、10mcg維生素b12(氰鈷胺)、16mg鎂以及75mgeht提取物。在替代實(shí)施方式中，所述制劑基本上由以下組成或由以下組成：維生素b6(吡哆醇hcl)、葉酸鹽(葉酸)、維生素b12(氰鈷胺)、鎂以及eht提取物。

在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種制劑(例如，固體單位劑量，諸如片劑)，包含1800-2200iu維生素d(膽鈣化醇)、1.4-1.8mg維生素b6(吡哆醇hcl)、8-12mcg維生素b12(甲鈷胺)、14-18mg鎂、68-72mcg硒(硒代甲硫氨酸)、48-52mgα硫辛酸、48-52mcg石杉堿甲以及30-40mgeht提取物。在另一實(shí)施方式中，所述制劑包含2000iu維生素d(膽鈣化醇)、1.6mg維生素b6(吡哆醇hcl)、10mcg維生素b12(甲鈷胺)、16mg鎂、70mcg硒(硒代甲硫氨酸)、50mgα硫辛酸、50mcg石杉堿甲以及35mgeht提取物。在替代實(shí)施方式中，所述制劑基本上由以下組成或由以下組成：維生素d(膽鈣化醇)、維生素b6(吡哆醇hcl)、維生素b12(甲鈷胺)、鎂、硒(作為硒代甲硫氨酸)、α硫辛酸、石杉堿甲以及eht提取物。

在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種制劑(例如，固體單位劑量，諸如片劑)，包含1800-2200iu維生素d(膽鈣化醇)、1.4-1.8mg維生素b6(吡哆醇hcl)、380-420mcg葉酸鹽(葉酸)、8-12mcg維生素b12(氰鈷胺)、14-18mg鎂、68-72mcg硒(硒代甲硫氨酸)、48-52mgα硫辛酸、48-52mcg石杉堿甲以及30-40mgeht提取物。在另一實(shí)施方式中，所述制劑包含2000iu維生素d(膽鈣化醇)、1.6mg維生素b6(吡哆醇hcl)、400mcg葉酸鹽(葉酸)、10mcg維生素b12(氰鈷胺)、16mg鎂、70mcg硒(硒代甲硫氨酸)、50mgα硫辛酸、50mcg石杉堿甲以及35mgeht提取物。在替代實(shí)施方式中，所述制劑基本上由以下組成或由以下組成：維生素d(膽鈣化醇)、維生素b6(吡哆醇hcl)、葉酸鹽(葉酸)、維生素b12(甲鈷胺)、鎂、硒(硒代甲硫氨酸)、α硫辛酸、石杉堿甲以及eht提取物。

在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種制劑(例如，固體單位劑量，諸如片劑)，包含800-1000iu維生素d(膽鈣化醇)、1.4-1.8mg維生素b6(吡哆醇hcl)、8-12mcg維生素b12(甲鈷胺)、14-18mg鎂、68-72mcg硒(硒代甲硫氨酸)、98-102mg銀杏提取物粉末、48-52mgα硫辛酸以及30-40mgeht提取物。在另一實(shí)施方式中，所述制劑包含1000iu維生素d(膽鈣化醇)、1.6mg維生素b6(吡哆醇hcl)、10mcg維生素b12(甲鈷胺)、16mg鎂、70mcg硒(硒代甲硫氨酸)、100mg銀杏提取物粉末、50mgα硫辛酸以及35mgeht提取物。在替代實(shí)施方式中，所述制劑基本上由以下組成或由以下組成：維生素d(膽鈣化醇)、維生素b6(作為吡哆醇hcl)、維生素b12(甲鈷胺)、鎂、硒(硒代甲硫氨酸)、銀杏提取物粉末、α硫辛酸以及eht提取物。

在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種制劑(例如，固體單位劑量，諸如片劑)，包含800-1000iu維生素d(膽鈣化醇)、1.4-1.8mg維生素b6(吡哆醇hcl)、8-12mcg維生素b12(甲鈷胺)、14-18mg鎂、68-72mcg硒(硒代甲硫氨酸)、48-52mgα硫辛酸以及30-40mgeht提取物。在另一實(shí)施方式中，所述制劑包含1000iu維生素d(膽鈣化醇)、1.6mg維生素b6(作為吡哆醇hcl)、10mcg維生素b12(作為甲鈷胺)、16mg鎂、70mcg硒(硒代甲硫氨酸)、50mgα硫辛酸以及35mgeht提取物。在替代實(shí)施方式中，所述制劑基本上由以下組成或由以下組成：維生素d(膽鈣化醇)、維生素b6(吡哆醇hcl)、維生素b12(甲鈷胺)、鎂、硒(硒代甲硫氨酸)、α硫辛酸以及eht提取物。

在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種制劑(例如，固體單位劑量，諸如片劑)，包含1800-2200iu維生素d(膽鈣化醇)、34-39mg維生素c、1.4-1.8mg維生素b6(吡哆醇hcl)、8-12mcg維生素b12(氰鈷胺)、14-18mg鎂、82-86mcg硒(硒酵母)、135-139mg銀杏提取物粉末以及30-40mgeht提取物。在另一實(shí)施方式中，所述制劑包含2000iu維生素d(膽鈣化醇)、36.36mg維生素c、1.6mg維生素b6(作為吡哆醇hcl)、10mcg維生素b12(氰鈷胺)、16mg鎂、84mcg硒(硒酵母)、137.50mg銀杏提取物粉末以及35mgeht提取物。在替代實(shí)施方式中，所述制劑基本上由以下組成或由以下組成：維生素d(膽鈣化醇)、維生素c、維生素b6(吡哆醇hcl)、維生素b12(氰鈷胺)、鎂、硒(硒酵母)、銀杏提取物粉末以及eht提取物。

本發(fā)明的另一方面提供了一種治療有需要的受試者的創(chuàng)傷性腦損傷或腦病的方法，包括向所述受試者施用有效量的本文所述的組合物。

附圖簡述

圖1描繪了本發(fā)明的組合物的hplc分析。對應(yīng)的色酰胺的水平被量化并列出在表2中。

圖2描繪了短期tbi引起ptau水平增加，并且長期tbi引起pp2a去甲基化。

圖3表明gfap充當(dāng)tbi和cte的生物標(biāo)志物，并且作為飲食施用給動物的eht出乎意料地降低在tbi后小鼠腦中的gfap。

圖4表明降低的神經(jīng)元細(xì)胞毒性由用eht提取物處理時觀察到的谷氨酸鹽以劑量依賴性方式誘導(dǎo)。

詳述

本部分(或本申請的任何其他部分)中使用的標(biāo)題和副標(biāo)題僅僅是為了方便參考而不旨在限制。

定義

如本文所用的，色酰胺是指式(i)中包括的化合物：

其中n為14-22，并且(ch2)n基團(tuán)中的一或多個ch2基團(tuán)可以任選地被ch替代以提供一或多個雙鍵。

如本文所用的，早期洗脫的色酰胺是指在二十烷?；?-羥基色酰胺之前在反相柱上洗脫的如上所定義的色酰胺。在烷基鏈中具有少于20個總碳的色酰胺(即，式(i)中的n小于18)較少是早期洗脫的色酰胺。通常，早期洗脫的色酰胺具有<40℃的熔點(diǎn)并具有黃油樣的稠度。

如本文所用的，晚期洗脫的色酰胺是指在二十烷酰基5-羥基色酰胺之后在反相柱上洗脫的如上所定義的色酰胺并且包含二十烷?；?-羥基色酰胺本身。在烷酰基鏈中具有20個或更多個總碳的色酰胺(即式(i)中的n為18或更大)為晚期洗脫的色酰胺。二十烷酰基、二十二烷?；投耐轷；?-羥基色酰胺，所有這些都是在早期洗脫的色酰胺之后在反相柱上洗脫的晚期洗脫的色酰胺的示例。通常，晚期洗脫的色酰胺具有>40℃的熔點(diǎn)并且是固體的。

例如，以下所示的二十烷?；?-羥基色酰胺是晚期洗脫的色酰胺，并且烷基鏈中的碳總數(shù)為20：

以下所示的n-(2-(5-羥基-1h-吲哚-3-基)乙基)硬脂酰胺或“18-5ht”是早期洗脫的色酰胺，并且烷基鏈中的碳總數(shù)為18：

如本文所用的，“二萜類”是指式(ii)中包括的化合物：

其中虛線可以存在或不存在。

如本文所用的，術(shù)語“eht提取物”是指包含早期洗脫的色酰胺和晚期洗脫的色酰胺的混合物的咖啡提取物。在某些實(shí)施方式中，eht提取物是指至少約1:7、1:8、1:9、1:10、1:25、1:50、1:75以及至多1:100的比率的早期洗脫的咖啡色酰胺和晚期洗脫的咖啡色酰胺的混合物，具有基于組合物中所有色酰胺的重量的至少30％、或35％、40％、45％或50％的二十烷酰基-5-羥基色酰胺。此外，為了簡潔起見，如本文所用的，eht提取物也可以被解讀為是指替代實(shí)施方式，其中eht提取物是指包含二十烷?；?5-羥基色酰胺的任何組分(諸如源自咖啡豆或咖啡的含有二十烷?；?5-羥基色酰胺的提取物)或二十烷?；?5-羥基色酰胺本身，無論是從有機(jī)起始材料中分離還是合成制備)。

創(chuàng)傷性腦損傷(tbi)也稱為顱內(nèi)損傷，它在外力創(chuàng)傷性損傷腦時發(fā)生。tbi可以基于嚴(yán)重性、機(jī)制(閉合性或穿透性腦損傷)或其他特征(例如，發(fā)生在指定位置或廣泛區(qū)域上)進(jìn)行分類。腦損傷通常是指tbi，但是它是更廣泛的類別，因為它可能涉及對除腦以外的結(jié)構(gòu)的損害，諸如頭皮和頭骨。tbi可能與戰(zhàn)斗、馬術(shù)、軍事訓(xùn)練、墜落、運(yùn)動(接觸性運(yùn)動和單人運(yùn)動)、沖擊波暴露(單個或多個小沖擊波)、自行車和機(jī)動車輛事故中遭受的腦損傷有關(guān)。

慢性創(chuàng)傷性腦病(cte)是一種進(jìn)行性退行性疾病的腦病形式，它目前只能在具有多次腦震蕩和其他形式的腦損傷的病史的個體中進(jìn)行明確的驗尸診斷。

如本公開所用的，術(shù)語“有效量”可與“治療有效量”互換，并且意指化合物或組合物有效于治療本文公開的特定疾病、病狀或病癥的量或劑量，并且因此“治療”包括產(chǎn)生所需的預(yù)防、抑制、緩解或改善效果。在根據(jù)本發(fā)明的治療方法中，向受試者(例如，哺乳動物)施用“有效量”的至少一種化合物。如本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所理解的，“有效量”將根據(jù)化合物或組合物、疾病(及其嚴(yán)重性)、所需的治療、受試者的年齡和體重等而變化。

在某些實(shí)施方式中，eht提取物可以具有降低量的咖啡因，其不超過基于提取物的總重量的約15％、或10％、或5％。在某些實(shí)施方式中，eht提取物中的咖啡因的量不超過每份或每單位劑量2mg、3mg、4mg、5mg、6mg、7mg、8mg、9mg或10mg。

在又一實(shí)施方式中，eht提取物(諸如上述eht提取物中的任一種)具有降低量的二萜類。例如，在一個實(shí)施方式中，eht提取物具有每kgeht提取物不超過約2mg的二萜類。在一個實(shí)施方式中，eht提取物具有每kgeht提取物不超過約1mg的咖啡醇，或者每份或每單位劑量的eht提取物小于約0.12mg的咖啡醇。

在另一實(shí)施方式中，eht提取物作為組合物的一部分以固體劑型施用。例如，固體劑型可以是片劑、膠囊、囊劑、散劑或呈固體食物的形式。在某些實(shí)施方式中，諸如以固體劑型施用的eht提取物的量可以是每日份量或每單位劑量1mg與2克之間(例如，1mg、5mg、10mg、25mg、50mg、75mg、100mg、250mg、500mg、1g、1.5g或2g)。

在又一實(shí)施方式中，eht提取物以液體劑型作為飲料、糖漿、懸浮液、乳劑、酊劑、酏劑、茶、泡騰制劑等施用。例如，eht提取物可以液體劑型施用，并且在某些實(shí)施方式中，組合物中的eht提取物的量可以提供每日份量或每單位劑量不少于1mg且不超過約2克。

無論是作為固體劑型還是作為液體劑型施用，eht提取物都可以與以下物質(zhì)一起施用：維生素(例如，維生素a、維生素b1、維生素b2、維生素b3、維生素b5、維生素b6、維生素b7、維生素b9(葉酸或葉酸鹽)、維生素b12、維生素c、維生素d、維生素e、維生素k)、微量元素(例如，碘、鐵、鎂、鉻、鈣、硒、鋅、錳、鉀)、食物和健康補(bǔ)充劑(例如，n-乙酰l-半胱氨酸、乙酰l-肉堿、s-腺苷甲硫氨酸、長春西汀、石杉堿甲、l-茶氨酸、磷脂酰絲氨酸、假馬齒莧屬(bacopa)、蝶芪、l-酪氨酸、l-谷氨酰胺、巴戟天(bacopin)、l-焦谷氨酸、磷脂酰絲氨酸、二十二碳六烯酸、膽堿、肌醇、n-乙酰酪氨酸、γ-氨基丁酸、激活素、l-α甘油基磷酰膽堿、胞磷膽堿)、草藥部分(例如，葉、根、芽、花、莖等)或草藥、水果或植物提取物(例如，綠茶提取物、覆盆子果實(shí)標(biāo)準(zhǔn)提取物、葡萄皮提取物、瓜拉那提取物、可樂果提取物、薄荷油、圖爾西(tulsi)提取物(圣羅勒(holybasil))、綠茶提取物、銀杏提取物、紅景天提取物、白茶提取物、紅茶提取物、人參)、藥學(xué)上可接受的賦形劑(例如，微晶纖維素、磷酸二鈣、硬脂酸、硬脂酸鎂、交聯(lián)羧甲基纖維素鈉、二氧化硅、腸溶包衣、天然香料、明膠、二氧化鈦、白米粉、鹽、乙酸、edta二鈉、米糠油、植物蠟、明膠、甘油、水、顏料(例如，胭脂紅、洋紅、角豆粉)、纖維素、水、磷酸二鈣、藥用釉、淀粉、麥芽糖糊精、蔬菜纖維素、向日葵卵磷脂、紅花油、甘油、向日葵卵磷脂、山梨醇、改性食物淀粉)以及藥物(例如，吡拉西坦、adhd藥物、黃嘌呤、尼古丁、噻奈普汀、膽堿能劑、丙戊酸鹽、普拉西坦、奧拉西坦、考拉西坦以及阿尼西坦)。

在某些實(shí)施方式中，eht提取物包含在組合物(即，eht提取物組合物)中，所述組合物還包含選自維生素d、維生素b6、維生素b9、維生素b12和維生素c中的至少一種維生素。可選地，eht提取物組合物可以包含選自維生素d、維生素b6、維生素b9、維生素b12和維生素c中的至少兩種或至少三種維生素。在一個實(shí)施方式中，eht提取物組合物包含維生素d、維生素b6和維生素b12。在另一實(shí)施方式中，eht提取物組合物包含維生素d、維生素b6、維生素b12和維生素c。在又一實(shí)施方式中，eht提取物組合物包含維生素d、維生素b6、維生素b9和維生素b12。

在一個實(shí)施方式中，維生素d作為膽鈣化醇(維生素d3)包含在內(nèi)。類似地，維生素b6可以作為吡哆醇hcl包含在內(nèi)，并且維生素b12可以作為甲鈷胺包含在內(nèi)。可選地，除上述形式之外，還可以包含這些維生素的其他形式，或者還可以包含這些維生素的其他形式來代替上述形式。

在包含維生素b6的eht提取物組合物中，維生素b6可以一定量提供在組合物中，以便提供每個單位劑量或每份約250微克至約5mg、或約750微克至約3mg、或約1mg至約2mg(例如約1.6mg)的維生素b6。可選地，可以包含其他量的維生素b6。

在包含維生素b9的eht提取物組合物中，維生素b9可以一定量提供在組合物中，以便提供每個單位劑量或每份約50微克至約1mg、或約100微克至約750微克、或約200微克至約600微克(例如，約400微克)的維生素b9。可選地，可以包含其他量的維生素b9。

在包含維生素b12的eht提取物組合物中，維生素b12可以一定量提供在組合物中，以便提供每個單位劑量或每份約1微克至約100微克、或約2.5微克至約25微克、或約5微克至約15微克(例如，約10微克)的維生素b12?？蛇x地，可以包含其他量的維生素b12。

在包含維生素d的eht提取物組合物中，維生素d可以一定量提供在組合物中，以便提供每個單位劑量或每份約250iu至約6000iu、或約500iu至約5000iu、或約750iu至約2500iu(例如，約1000iu、約2000iu)的維生素d?？蛇x地，可以包含其他量的維生素d。

在某些實(shí)施方式中，eht提取物組合物包含選自鎂和硒的至少一種微量元素。例如，eht提取物組合物可以包含鎂和硒二者。鎂可以作為檸檬酸鎂包含在內(nèi)，或者可以包含其他藥學(xué)上可接受的鎂鹽。類似地，硒可以作為硒代甲硫氨酸包含在內(nèi)，盡管也可以包含硒(亞硒酸鹽)的無機(jī)形式。硒也可以作為硒酵母包含在內(nèi)。

在包含鎂的eht提取物組合物中，鎂可以一定量提供在組合物中，以便提供每個單位劑量或每份約500微克至約100mg、或約1mg至約30mg、或約8mg至約24mg(例如，約16mg)的鎂?？蛇x地，可以包含其他量的鎂。如本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員將理解的，當(dāng)鎂作為藥學(xué)上可接受的鎂鹽(例如，檸檬酸鎂)包含在內(nèi)時，需要根據(jù)化學(xué)計量來調(diào)整劑量(例如，100mg檸檬酸鎂產(chǎn)生16mg的鎂)。

在包含硒的eht提取物組合物中，硒可以一定量提供在組合物中，以便提供每個單位劑量或每份約1微克至約500mg、或約10微克至約400微克、或約40微克至約100微克(例如，約70微克或約84微克)的硒?？蛇x地，可以包含其他量的硒。

在某些實(shí)施方式中，eht提取物組合物包含銀杏，諸如銀杏提取物粉末。例如，可以包含約1mg至約750mg、或約10mg至約400mg、或約100mg至約170mg(例如，約137.50mg)的銀杏。可選地，可以包含其他量的銀杏。

在某些實(shí)施方式中，eht提取物組合物包含選自α硫辛酸和石杉堿甲的至少一種健康補(bǔ)充劑。例如，eht提取物組合物可以包含α硫辛酸和石杉堿甲二者。

在包含α硫辛酸的eht提取物組合物中，α硫辛酸可以一定量提供在組合物中，以便提供每個單位劑量或每份約1mg至約1.3g、或約2.5mg至約500mg、或約25mg至約75mg(例如，約50mg)的α硫辛酸?？蛇x地，可以包含其他量的α硫辛酸。

在包含石杉堿甲的eht提取物組合物中，石杉堿甲可以一定量提供在組合物中，以便提供每個單位劑量或每份約1mg至約1g、或約2.5mg至約500mg、或約25mg至約75mg(例如，約50mg)的石杉堿甲?？蛇x地，可以包含其他量的石杉堿甲。

在某些實(shí)施方式中，eht提取物可以每kg組合物1mg至1克的量存在。在某些實(shí)施方式中，eht提取物以一定量提供在組合物中，以便提供每個單位劑量或每份約1mg至約150mg、或約5mg至約75mg、或約10mg至約60mg(例如，約35mg)的eht提取物。

正如所指出的，eht提取物可以與例如b族維生素(例如，維生素b6、維生素b9(葉酸)、維生素b12)一起施用。在一些實(shí)施方式中，b族維生素可以總體上以每單位劑量或每份約1微克至10mg或約50微克至約5mg的量存在。eht提取物還可以包含鎂和硒的一或多種或鎂和硒兩者，并且任選地還可以包含一或多種草藥、水果或植物提取物(例如，銀杏以及蛇足石杉(huperiziaserrate)的提取物，諸如石杉堿甲)。

在一個實(shí)施方式中，將包含有效量的eht提取物的組合物施用于患有創(chuàng)傷性腦損傷(tbi)的受試者以治療創(chuàng)傷性腦損傷。在一個實(shí)施方式中，將有效量的二十烷?；?-羥基色酰胺施用于患有創(chuàng)傷性腦損傷(tbi)的受試者以治療創(chuàng)傷性腦損傷。eht提取物或二十烷?；?-羥基色酰胺可以例如口服或腸胃外(例如iv)施用。

在另一實(shí)施方式中，將包含有效量的eht提取物的組合物施用于患有腦病或處于發(fā)展腦病的風(fēng)險中的受試者以治療腦病。在一個實(shí)施方式中，將有效量的二十烷酰基5-羥基色酰胺施用于患有腦病的受試者以治療腦病。腦病可以是例如慢性創(chuàng)傷性腦病(cte)。eht提取物或二十烷?；?-羥基色酰胺可以例如口服或腸胃外(例如iv)施用。

在另一實(shí)施方式中，將eht提取物施用于由于炎癥、感染、血管不規(guī)則、自身免疫障礙、代謝障礙和遺傳因素而處于發(fā)展tbi的風(fēng)險中的受試者或處于發(fā)展腦病(例如，cte)的風(fēng)險中的受試者。

在又一實(shí)施方式中，將eht提取物施用于處于以下風(fēng)險中的受試者：心血管疾病、代謝綜合征、肺部病癥、內(nèi)分泌病癥、自身免疫病癥、炎癥、感染、肝臟病癥、腎臟病癥、腫瘤病癥、肌肉骨骼病癥、胃腸道病癥、泌尿生殖病癥、性功能障礙、功能障礙、遺傳傾向、營養(yǎng)不良、環(huán)境和毒素暴露以及藥物反應(yīng)/暴露。

eht提取物的有效量可以由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員部分基于eht提取物中含有的二十烷?；?-羥基色酰胺的量來確定。然而，應(yīng)指出，因為eht提取物可以含有其他活性組分，諸如二十二烷?；投耐轷；?-羥基色酰胺，所以與單獨(dú)施用二十烷酰基5-羥基色酰胺時相比，可能需要更低量的二十烷?；?-羥基色酰胺。

例如，eht提取物的有效量可以是提供0.1mg/天或更多的二十烷?；?-羥基色酰胺的eht的量。在某些實(shí)施方式中，施用eht提取物以便提供例如0.1mg/天、5mg/天、10mg/天、20mg/天、25mg/天、50mg/天或100mg/天的二十烷酰基5-羥基色酰胺。例如，根據(jù)本發(fā)明描述的治療方法，可以將3mg/kg體重-120mg/kg體重的eht提取物口服或腸胃外(例如，iv)施用于受試者。

實(shí)施例1.eht提取物的制備

將可商購獲得的咖啡蠟(7kg)裝入配備有機(jī)械攪拌器和熱電偶的20l夾套玻璃反應(yīng)器中。添加熱水(10l，75℃)，并且將溫度維持在70℃-75℃下2小時。一旦已觀察到兩個層的形成，就通過底閥排出水層。再次重復(fù)熱水洗滌，并且此時將異丙醇(16l，99.9％)裝入反應(yīng)器中。然后在劇烈攪拌下將混合物加熱至75℃，持續(xù)2小時。停止攪拌器，并且將混合物冷卻至4℃過夜，然后將粗產(chǎn)物收集在玻璃過濾器上，將其干燥并且然后轉(zhuǎn)移至真空烘箱中36小時(或直到恒重)，以產(chǎn)生粗咖啡提取物(1.2kg；10％色酰胺)。

通過裝載閥將粗咖啡提取物(5kg，來自上文)添加到配備有攪拌器的20l夾套玻璃反應(yīng)器中，接著添加異丙醇(10l，99％)并且加熱至75℃。在攪拌下將溫度維持另外1小時以確保咖啡提取物完全溶解。然后將異丙醇溶液通過底閥分配到結(jié)晶容器中并過夜冷卻至室溫。通過在玻璃過濾器(5l，chemglass)上分三批過濾來收集產(chǎn)物，并在真空烘箱中干燥至恒重(約36小時)。將最終產(chǎn)物(3.4kg，68％產(chǎn)率)包裝(任選進(jìn)行研磨)在塑料容器中的雙聚乙烯袋中。

實(shí)施例2.eht提取物的hplc分析

圖1描繪了如實(shí)施例1所述地制備的根據(jù)本發(fā)明的eht提取物的hplc分析。通常如karlspeer等的braz.j.plantphysiol.,18(1):201-216(2006)(以引用的方式并入本文)中所描述地進(jìn)行hplc分析，其中采用在280nm激發(fā)波長和330nm發(fā)射波長下的熒光檢測。對應(yīng)的色酰胺的水平被量化并列出在表2中。色酰胺1-6是早期洗脫的色酰胺，并且7-11(eht提取物中未發(fā)現(xiàn)可量化量的12和13)是晚期洗脫的色酰胺。

表2

在咖啡、可可以及如實(shí)施例1所述地制備的根據(jù)本發(fā)明的eht提取物中的色酰胺的水平。在eht提取物中未檢測到可量化量的色酰胺4、12和13。

實(shí)施例3.eht提取物中咖啡醇和咖啡豆醇水平的測定。

hplc方法。

在agilent1200儀器上使用phenomenexlunac183u50mmx4.6mm和c18保護(hù)柱在室溫下進(jìn)行高效液相色譜分析。流動相為溶劑a：具有0.05％tfa的hplc級水(以下稱為“溶劑a”)和溶劑b：流速為1ml/分鐘的具有0.05％tfa的hplc級乙腈(以下稱為“溶劑b”)。梯度設(shè)定如下：以0％溶劑b開始，然后在16分鐘時為99％溶劑b，接著99％溶劑b持續(xù)10分鐘。通過對咖啡醇使用214nm的熒光并對咖啡豆醇使用254nm的熒光來量化峰，將峰面積與先前測定的對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線比較?？Х却嫉耐Ａ魰r間為11.77分鐘，并且咖啡豆醇的停留時間為11.67分鐘。

使用合成咖啡醇(aldrich)和咖啡豆醇(aldrich)運(yùn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線。咖啡醇的檢測下限確定在0.5μg/ml下。咖啡醇的定量下限確定為1μg/ml?？Х榷勾嫉臋z測下限(llod)確定在1μg/ml下?？Х榷勾嫉亩肯孪?lloq)確定為2μg/ml。

樣品制備和計算：

將eht提取物(1.1mg，如實(shí)施例1所述地制備)的樣品溶解于dmso(1ml)中，將其升溫至40℃并渦旋5分鐘。將10μl的此溶液注入hplc中。在三次連續(xù)運(yùn)行中在11.67分鐘處未觀察到峰并且在11.77分鐘處觀察到小峰(6.2iu)。為了驗證11.77分鐘的峰為咖啡醇，將咖啡醇的分析標(biāo)準(zhǔn)加入到eht樣品中并再次運(yùn)行。另外，在11.77分鐘時觀察到單個峰，并將其鑒定為咖啡醇。使用由咖啡醇標(biāo)準(zhǔn)曲線得出的方程式，確定1mgeht提取物含有約1.58μg咖啡醇。eht提取物中的咖啡豆醇的量低于llod。

實(shí)施例4.eht提取物片劑

將來自實(shí)施例1的eht提取物與吡哆醇hcl、葉酸、氰鈷胺和檸檬酸鎂組合并放置在混合器中，并且共混至均勻混合。未觀察到成粒作用。然后將共混的制劑放置在標(biāo)準(zhǔn)壓片機(jī)中并壓制成片劑。選擇大部分制劑中的維生素b6、葉酸、氰鈷胺和檸檬酸鎂的量，以便產(chǎn)生作為由受試者口服施用的單位劑量的如以下表3所述的片劑。

表3

將下述包衣溶液與熱空氣一起并入以形成包衣混合物，以在片劑包衣機(jī)中施加到新壓制的片劑。將包衣的片劑在受控條件下干燥，以制備最終單位劑型。

僅香草包衣：磷酸二鈣、微晶纖維素、交聯(lián)羧甲基纖維素鈉、硬脂酸、包衣(羥丙甲纖維素、滑石粉、二氧化鈦、聚乙二醇、糖精鈉、天然香料、三氯蔗糖)、硬脂酸鎂以及二氧化硅。

僅紅色包衣：磷酸二鈣、微晶纖維素、交聯(lián)羧甲基纖維素鈉、硬脂酸、包衣(聚乙烯醇、聚乙二醇、fd&cf#40、滑石粉和二氧化鈦)、硬脂酸鎂以及二氧化硅。

香草和紅色包衣：磷酸二鈣、微晶纖維素、交聯(lián)羧甲基纖維素鈉、硬脂酸、包衣(聚乙烯醇、聚乙二醇、fd&c紅色#40色淀、滑石粉、二氧化鈦、香草醛)、硬脂酸鎂以及二氧化硅。

通過相同的方法，還制備了以下表4-8中列出的片劑制劑。在每個這些表中，一份是一個片劑，指示每日施用一次。

表4

表5

表6

表7

表8

實(shí)施例5.eht提取物含水制劑。

將如實(shí)施例1所述地制備的兩克eht提取物在劇烈攪拌下在70℃下與3克2-羥乙基12-羥基十八酸酯(solutolhs15)和2克聚氧乙烯(20)脫水山梨醇單油酸酯(吐溫80)一起熔化以產(chǎn)生非常粘稠的深棕色糖漿。將所述糖漿進(jìn)一步與少量熱水混合并攪拌至均勻。冷卻后，將所述糖漿進(jìn)一步用水稀釋至需要的濃度。出乎意料地，由此產(chǎn)生的含水eht提取物可以提高其口服生物利用度。

以下表9提供了此含水eht提取物的藥代動力學(xué)描述。正如所指出的，這表明與基于使用dmso進(jìn)行的萃取制備而不是用2-羥乙基12-羥基十八酸酯和聚氧乙烯(20)脫水山梨醇單油酸酯處理的非含水eht制劑相比，本實(shí)施例中所述的含水制劑出乎意料地提高了口服生物利用度。

表9.

實(shí)施例6.使用eht提取物治療tbi和cte

圖2表明短期tbi引起ptau水平增加，并且長期tbi引起pp2a去甲基化。有論文(papa)指出，在創(chuàng)傷性腦損傷(tbi)之后膠質(zhì)纖維酸性蛋白(gfap)釋放到血清中，并且可以用于檢測顱內(nèi)ct病變，特別是在顱外骨折的情況中(j.neurotrauma.2014nov15；31(22):1815-22.pmid24903744)。

因此，gfap充當(dāng)tbi和cte的生物標(biāo)志物。圖2示出了如實(shí)施例1所述地制備的eht提取物，并施用于患有tbi的小鼠。據(jù)估計小鼠通過其嚙齒動物食物每天接收約5克的0.1％eht提取物，持續(xù)約3周。發(fā)現(xiàn)與其中不施用eht提取物的對照飲食組相比，接收eht提取物的這組小鼠在tbi后的小鼠腦中顯示出乎意料地更低的gfap。

實(shí)施例7：原代神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)

根據(jù)brewer1995，從大鼠胚胎(e17)獲得大腦皮層的原代神經(jīng)元培養(yǎng)物。將補(bǔ)充有2％b27、谷氨酰胺和青霉素-鏈霉素(pen-strep)抗生素的培養(yǎng)基中的細(xì)胞以1×10⁴個細(xì)胞/cm²的濃度接種在預(yù)先涂覆有聚-d-賴氨酸的培養(yǎng)板上。將培養(yǎng)物保持在37℃和5％co2下。

谷氨酸鹽興奮毒性

在根據(jù)實(shí)施例1制備的eht提取物存在或不存在下，將原代皮質(zhì)神經(jīng)元與10μm谷氨酸鹽共處理；使用去甲丙米嗪(despramine)作為陽性對照。在37℃和5％co2下24小時后，通過根據(jù)制造商的方案(roche)測量培養(yǎng)物上清液中乳酸脫氫酶的活性來測定細(xì)胞活力。圖4表明降低的神經(jīng)元細(xì)胞毒性由用eht提取物處理時觀察到的谷氨酸鹽以劑量依賴性方式誘導(dǎo)。

尚不清楚eht提取物或二十烷?；?5-羥基色酰胺是否對興奮毒性細(xì)胞死亡表現(xiàn)出神經(jīng)保護(hù)特性。當(dāng)與先前報道的在類似的谷氨酸鹽興奮毒性的實(shí)驗方式中的美金剛劑量-反應(yīng)曲線相比時，eht提取物表現(xiàn)出對大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元的神經(jīng)保護(hù)的優(yōu)越效力。