發(fā)明領(lǐng)域和背景本發(fā)明，在其一些實(shí)施方案中，涉及生產(chǎn)羅漢果苷的方法，和包含其的組合物及其用途。羅漢果苷是在葫蘆科植物羅漢果(siraitiagrosvenorii)(luohanguo)的果實(shí)中發(fā)現(xiàn)的三萜衍生的專門的次生代謝產(chǎn)物。它們在果實(shí)中的生物合成涉及糖苷配基羅漢果醇(mogrol)至最終甜味產(chǎn)物羅漢果苷v和羅漢果苷vi的多個相繼的糖基化(圖1)。羅漢果苷v在食品工業(yè)中已被認(rèn)為是一種天然的非糖食品甜味劑，其甜味能力是蔗糖的甜味能力約250倍(kasair.,等人,sweetcucurbitaneglycosidesfromfruitsofsiraitiasiamensis(chi-ziluo-han-guo),achinesefolkmedicine.agricbiolchem1989,53(12):3347-3349.)。此外，最近的研究中已經(jīng)揭示了羅漢果苷的額外的健康益處(li等人,chemistryandpharmacologyofsiraitiagrosvenorii:areview.chinjnatmed.201412(2):89-102.)。母體糖苷配基化合物羅漢果醇通過葫蘆二烯醇(立體特異性三萜合酶，葫蘆二烯醇合酶的初始產(chǎn)物)的連續(xù)羥基化而衍生。葫蘆二烯醇隨后通過尚未確定的酶在c11、c24和c25位的羥基化，產(chǎn)生羅漢果醇(圖1)。反式c24,c25-二羥基化在三萜類葫蘆二烯醇衍生物中是罕見的(chenjc,etal.,cucurbitacinsandcucurbitaneglycosides:structuresandbiologicalactivities.nat.prod.rep.2005,22,386-399)，并且因此使負(fù)責(zé)酶的鑒定成為一種挑戰(zhàn)。隨后，在果實(shí)發(fā)育期間以時間連續(xù)的模式，在c3和c24位對羅漢果醇進(jìn)行從1至6個葡糖基的不同程度的葡糖基化，并且葡糖基化的羅漢果醇化合物被稱為羅漢果苷。羅漢果苷的甜味強(qiáng)度隨著額外的葡萄糖部分而增加，使得m6(具有6個葡糖基)分別比m5更甜，隨后為m4(kasair.,等人,sweetcucurbitaneglycosidesfromfruitsofsiraithasiamensis(chi-ziluo-han-guo),achinesefolkmedicine.agricbiolchem1989,53(12):3347-3349)。純化的羅漢果苷v已在日本被批準(zhǔn)為高強(qiáng)度甜味劑(jakinovich,w.,jr.,moon,c.,choi,y.h.,&kinghorn,a.d.1990.evaluationofplantextractsforsweetnessusingthemongoliangerbil.journalofnaturalproducts,53,190-195)，并且提取物在美國已作為非營養(yǎng)甜味劑和增味劑取得一般公認(rèn)為安全(gras)的狀態(tài)。從果實(shí)提取羅漢果苷可以得到不同程度純度的產(chǎn)物，通常伴有不希望的余味。此外，由于植物產(chǎn)量低和植物的特殊栽培要求，來自栽培果實(shí)的羅漢果苷產(chǎn)率是有限的。因此，能夠經(jīng)由生物技術(shù)方法生產(chǎn)甜羅漢果苷化合物是有利的。額外的
背景技術(shù)：
：：包括：wo2013/076577公開了來自不天然產(chǎn)生羅漢果苷的植物，擬南芥(arabidopsisthaliana)和甜葉菊(steviarebaudianan)的ugt家族的酶(udp葡萄糖糖基轉(zhuǎn)移酶)。這些酶中的四種能夠進(jìn)行糖苷配基羅漢果醇的糖基化，特別是在c24位置添加單一葡萄糖部分以產(chǎn)生m1b。來自甜葉菊的第五種酶ugt73c5顯示在c3和c24的糖基化。wo2014086842公開了葫蘆二烯醇合酶，催化c-11oh產(chǎn)生的cyp450和來自羅漢果的一些ugt多肽，顯示這些酶在酵母中發(fā)揮功能，并且還提供了用于產(chǎn)生羅漢果苷的方法。此外，他們還公開了2種環(huán)氧化物水解酶，并證明了它們水合環(huán)氧角鯊烯的能力，表明它們同樣可以水合環(huán)氧葫蘆二烯醇。具體而言，本發(fā)明提出了可用于羅漢果苷產(chǎn)生的各種生物合成途徑，并提供了可用于羅漢果苷產(chǎn)生的酶。此外，本發(fā)明提供了可用于進(jìn)行本發(fā)明方法的重組宿主。tang等人,anefficientapproachtofindingsiraitiagrosvenoriitriterpenebiosyntheticgenesbyrna-seqanddigitalgeneexpressionanalysis.bmcgenomics.2011;12:343。發(fā)明概述根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案的一個方面，提供了包含氨基酸序列的分離的尿苷二磷酸-葡糖基轉(zhuǎn)移酶(ugt)多肽，其中所述多肽催化羅漢果醇在c24的主鏈葡糖基化和羅漢果苷在c3的主鏈葡糖基化。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，分離的ugt多肽催化：(a)羅漢果醇在c24的主鏈葡糖基化；(b)羅漢果苷在c3的主鏈葡糖基化；和(c)羅漢果苷在c3的分枝葡糖基化。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，所述氨基酸序列與seqidno:34具有至少34％同一性。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，所述氨基酸序列如seqidno:34所示。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案的一個方面，提供了包含氨基酸序列的分離的尿苷二磷酸-葡糖基轉(zhuǎn)移酶(ugt)多肽，其中所述多肽催化羅漢果苷在c3的(1-2)和(1-6)位置的分枝葡糖基化和羅漢果苷在c24的(1-2)和(1-6)位置的分枝葡糖基化。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案的一個方面，提供了包含氨基酸序列的分離的尿苷二磷酸-葡糖基轉(zhuǎn)移酶(ugt)多肽，其中所述多肽催化羅漢果苷m5至羅漢果苷m6的分枝葡糖基化。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，分離的ugt多肽催化：(a)羅漢果苷在c3的(1-2)和(1-6)位置的分枝葡糖基化；(b)羅漢果苷在c24的(1-2)和(1-6)位置的分枝葡糖基化，和(c)羅漢果苷m5至羅漢果苷m6的分枝葡糖基化。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，所述氨基酸序列與seqidno:38具有至少89％同一性。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案的一個方面，所述氨基酸序列如seqidno:38所示。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案的一個方面，提供了包含氨基酸序列的分離的尿苷二磷酸-葡糖基轉(zhuǎn)移酶(ugt)多肽，其中所述多肽催化羅漢果苷iv(m4)至羅漢果苷v(m5)的分枝葡糖基化。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，所述氨基酸序列選自與seqidno:34具有至少34％同一性的序列、與seqidno:6具有至少84％同一性的序列和與seqidno:38具有至少89％同一性的序列。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，所述氨基酸序列如seqidno:6所示。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，所述氨基酸序列如seqidno:38所示。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，所述氨基酸序列如seqidno:34所示。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，所述ugt是植物ugt。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，所述植物是葫蘆科的植物。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，所述植物是羅漢果。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案的一個方面，提供了包含與seqidno:14具有至少94％同一性或與seqidno:16具有至少89％同一性的氨基酸序列的分離的角鯊烯環(huán)氧酶(sqe)多肽，其中所述多肽催化由角鯊烯或氧化角鯊烯合成二環(huán)氧角鯊烯。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，所述氨基酸序列如seqidno:14或seqidno:16所示。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，所述sqe是植物sqe。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案的一個方面，提供了包含與seqidno:18、seqidno:22或seqidno:24具有至少75％同一性的氨基酸序列的分離的環(huán)氧化物水解酶(eh)多肽，其中所述多肽催化從3-羥基，24-25環(huán)氧葫蘆二烯醇合成3,24,25-三羥基葫蘆二烯醇。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，所述氨基酸序列如seqidno:18、seqidno:22和seqidno:24中任一者所示。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，所述eh是植物eh。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案的一個方面，提供了從羅漢果醇前體底物合成羅漢果醇或羅漢果醇前體產(chǎn)物的方法，所述方法包括使至少一種羅漢果醇前體底物與羅漢果苷途徑酶接觸，其中：(a)當(dāng)羅漢果醇前體產(chǎn)物包含雙環(huán)氧角鯊烯且羅漢果醇前體底物包含角鯊烯或氧化角鯊烯時，所述羅漢果苷途徑酶包含如權(quán)利要求18-20中任一項(xiàng)中所述的角鯊烯環(huán)氧酶多肽，由此產(chǎn)生二環(huán)氧角鯊烯，(b)當(dāng)羅漢果醇前體產(chǎn)物包含3-羥基，24-25環(huán)氧葫蘆二烯醇且羅漢果醇前體底物包含雙環(huán)氧角鯊烯時，所述羅漢果醇途徑酶包含如seqidno:12所示或與之具有60％同源性或同一性的葫蘆二烯醇合成酶多肽，由此產(chǎn)生3-羥基，24-25環(huán)氧葫蘆二烯醇，(c)當(dāng)產(chǎn)物包含3,24,25三羥基葫蘆二烯醇且底物包含3-羥基，24-25環(huán)氧葫蘆二烯醇時，所述羅漢果醇途徑酶包含如權(quán)利要求21-23中任一項(xiàng)中所述的環(huán)氧水合酶多肽，由此產(chǎn)生3,24,25三羥基葫蘆二烯醇，(d)當(dāng)產(chǎn)物包含羅漢果醇且羅漢果醇前體底物包含3,24,25三羥基葫蘆二烯醇時，所述羅漢果醇途徑酶是如seqidno:10所示或與之具有60％同源性或同一性的細(xì)胞色素p450酶，由此產(chǎn)生3,11,24,25四羥基葫蘆二烯醇(羅漢果醇)。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，所述細(xì)胞色素p450酶包含如seqidno:10中所示的氨基酸序列。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，產(chǎn)生羅漢果醇產(chǎn)物包括以下中的至少一種：(i)使角鯊烯或氧化角鯊烯與角鯊烯環(huán)氧酶多肽接觸，由此產(chǎn)生二環(huán)氧角鯊烯；(ii)使二環(huán)氧角鯊烯與葫蘆二烯醇合酶接觸，由此產(chǎn)生3-羥基，24-25環(huán)氧葫蘆二烯醇；(iii)使3-羥基，24-25環(huán)氧葫蘆二烯醇與環(huán)氧水合酶接觸，由此產(chǎn)生3,24,25三羥基葫蘆二烯醇；和(iv)使3,24-25三羥基葫蘆二烯醇與細(xì)胞色素p450酶接觸，由此產(chǎn)生羅漢果醇產(chǎn)物(3,11,24,25四羥基葫蘆二烯醇)。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，產(chǎn)生羅漢果醇產(chǎn)物包括至少(i)和(iv)，至少(ii)和(iv)，至少(iii)和(iv)，至少(i)、(ii)和(iii)，至少(i)、(ii)和(iv)，至少(i)、(iii)和(iv)，至少(ii)、(iii)和(iv)。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，產(chǎn)生羅漢果醇產(chǎn)物包括(i)、(ii)、(iii)和(iv)的全部。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案的一個方面，提供了合成羅漢果苷的方法，所述方法包括將至少一種本發(fā)明的ugt多肽或其組合與至少一種ugt底物羅漢果苷前體接觸。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，所述至少一種ugt多肽包含本發(fā)明的ugt多肽，所述多肽催化羅漢果醇在c24的主鏈葡糖基化和羅漢果苷在c3的主鏈葡糖基化。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，所述至少一種ugt多肽包含具有如seqidno:34所示的氨基酸序列的ugt多肽。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，所述至少一種ugt多肽包含本發(fā)明的ugt多肽，其催化羅漢果苷在c3的(1-2)和(1-6)位置的分枝葡糖基化和羅漢果苷在c24的(1-2)和(1-6)位置的分枝葡糖基化，和/或催化羅漢果苷m5至羅漢果苷m6的分枝葡糖基化。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，所述至少一種ugt多肽包含具有如seqidno:38所示的氨基酸序列的ugt多肽。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，所述至少一種ugt多肽包含本發(fā)明的ugt多肽，其催化羅漢果苷iv(m4)至羅漢果苷v(m5)的分枝葡糖基化。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，所述至少一種ugt多肽包含具有選自以下的氨基酸序列的ugt多肽：與seqidno:34具有至少34％同一性的序列、與seqidno:6具有至少84％同一性的序列和與seqidno:38具有至少89％同一性的序列。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，所述至少一種ugt多肽包含具有如seqidno:34所示的氨基酸序列的ugt多肽和具有如seqidno:38所示的氨基酸序列的ugt多肽。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，其中所述ugt底物羅漢果苷前體底物是羅漢果醇，所述方法包括：(a)根據(jù)本發(fā)明的方法產(chǎn)生羅漢果醇，和(b)根據(jù)本發(fā)明的合成羅漢果苷的方法從羅漢果醇合成羅漢果苷。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，所述羅漢果苷選自羅漢果苷i-a1、羅漢果苷i-e1、羅漢果苷iie、羅漢果苷iii、賽門苷(siamenoside)、羅漢果苷v和羅漢果苷vi。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，所述方法還包括分離羅漢果苷。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，所述方法在重組細(xì)胞中進(jìn)行，所述重組細(xì)胞外源表達(dá)本發(fā)明的羅漢果苷途徑酶多肽中的至少一種或其任何組合。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，所述至少一種多肽選自：具有如seqidno:34所示的氨基酸序列的多肽、具有如seqidno:38所示的氨基酸序列的多肽、具有如seqidno:14或16所示的氨基酸序列的多肽和具有如seqidno:18、22或24所示的氨基酸序列的多肽。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案的一個方面，提供了包含根據(jù)本發(fā)明的羅漢果苷生物合成方法生成的羅漢果苷的組合物。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案的一個方面，提供了包含核酸序列的分離的多核苷酸，所述核酸序列編碼本發(fā)明的se、cds、eh、cytp450和ugt酶多肽中任一種的分離的多肽。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，核酸序列選自seqidno.5、9、11、13、15、17、21、23、33和37。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案的一個方面，提供了核酸構(gòu)建體，其包含本發(fā)明的分離的多核苷酸和用于指導(dǎo)所述分離的多核苷酸的表達(dá)的順式作用調(diào)節(jié)元件。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，所述順式作用調(diào)節(jié)元件包含啟動子。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案的一個方面，提供了異源表達(dá)本發(fā)明的分離的多核苷酸的宿主細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，所述宿主細(xì)胞是微生物宿主細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，所述微生物選自酵母和細(xì)菌。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，所述宿主細(xì)胞是植物宿主細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，所述宿主細(xì)胞形成植物的一部分。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，所述植物是轉(zhuǎn)基因植物。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，所述植物是葫蘆科的植物。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，所述宿主細(xì)胞形成植物的果實(shí)或根部的一部分。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，所述宿主細(xì)胞在宿主細(xì)胞中產(chǎn)生羅漢果苷或羅漢果苷前體。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案的一個方面，提供了本發(fā)明的宿主細(xì)胞的細(xì)胞裂解物。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案的一個方面，提供了富集羅漢果苷vi到至少10%(wt/wt)的羅漢果苷vi的總濃度的組合物。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案的一個方面，提供了包含羅漢果苷vi(m6)和羅漢果苷ii(m2)的組合物。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案的一個方面，提供了包含羅漢果苷v(m5)、vi(m6)和羅漢果苷ii(m2)的組合物。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，羅漢果苷vi或羅漢果苷v的濃度足以引起風(fēng)味增強(qiáng)。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，羅漢果苷vi的濃度為至少0.2ppm。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，所述組合物是甜味劑。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，所述組合物還包含選自以下的風(fēng)味成分：蔗糖、果糖、葡萄糖、高果糖玉米糖漿、木糖、阿拉伯糖、鼠李糖、赤蘚醇、木糖醇、甘露糖醇、山梨糖醇、肌醇、acek、阿斯巴甜、紐甜(neotame)、三氯蔗糖、糖精、柚皮苷二氫查耳酮(nardhc)、新橙皮苷二氫查耳酮(ndhc)、甜茶苷(rubusoside)、萊鮑迪苷a、甜菊苷、甜葉菊、三葉苷(trilobtain)。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，所述組合物是消耗性組合物。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，所述組合物還包含一種或多種額外的風(fēng)味成分。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，所述組合物是飲料。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，所述飲料選自水性飲料、增強(qiáng)/稍甜化的水飲料、礦泉水、碳酸飲料、非碳酸飲料、碳酸水、靜水、軟飲料、非酒精飲料、酒精飲料、啤酒、葡萄酒、酒、水果飲料、汁液、果汁、蔬菜汁、肉湯飲料、咖啡、茶、紅茶、綠茶、烏龍茶、草藥茶、可可、茶基飲料、咖啡基飲料、可可基飲料、糖漿、乳制品、冷凍水果、冷凍果汁、水基冰、水果冰、果汁冰糕、醬料、沙拉醬、醬汁、湯和飲料植物材料或用于復(fù)原的速溶粉末。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，所述組合物為coca-cola?等。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，所述組合物是固體消耗品。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，所述固體消耗品選自谷物、烘焙食品、餅干、面包、早餐谷物、谷物棒、乳制品、能量棒/營養(yǎng)棒、格蘭諾拉麥片、蛋糕、曲奇、薄脆餅干、甜甜圈、松餅、糕點(diǎn)、糖果、口香糖、巧克力、軟糖、硬糖、棉花糖、壓片、休閑食品、植物材料(完整的或研磨的)和用于復(fù)原的速溶粉末。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，所述組合物是食物。除非另有定義，本文所使用的所有技術(shù)和/或科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員之一通常理解的相同含義。盡管與本文所述那些類似或相當(dāng)?shù)姆椒ê筒牧峡捎糜诒景l(fā)明實(shí)施方案的實(shí)踐和測試，但下面描述了示例性的方法和/或材料。在沖突的情況下，則以本專利說明書(包括定義)為準(zhǔn)。另外，材料、方法和實(shí)例只是說明性的，并無意必定是限制性的。附圖的幾個視圖的簡述參照附圖，本文以僅例示的方式描述了本發(fā)明的一些實(shí)施方案?，F(xiàn)在具體參照附圖細(xì)節(jié)，應(yīng)強(qiáng)調(diào)，所示細(xì)節(jié)是例示方式，并用于說明性論述本發(fā)明實(shí)施方案的目的。在這一方面，連同附圖的描述使本領(lǐng)域技術(shù)人員清楚可如何實(shí)施本發(fā)明的實(shí)施方案。在附圖中：圖1是圖解說明(改編自tang等人,anefficientapproachtofindingsiraitiagrosvenoriitriterpenebiosyntheticgenesbyrna-seqanddigitalgeneexpressionanalysis.bmcgenomics.2011；12：343)。羅漢果中的推定羅漢果苷生物合成途徑。aact：乙酰輔酶a乙酰轉(zhuǎn)移酶，ec:2.3.1.9；hmgs：羥甲基戊二酰輔酶a合酶，ec:2.3.3.10；hmgr：3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶a還原酶，ec:1.1.1.34；mk：甲羥戊酸激酶，ec:2.7.1.36；pmk：磷酸甲羥戊酸激酶，ec:2.7.4.2；mvd：二磷酸甲羥戊酸脫羧酶，ec:4.1.1.33；dxs：1-脫氧-d-木酮糖-5-磷酸合酶，ec:2.2.1.7；dxr：1-脫氧-d-木酮糖-5-磷酸還原異構(gòu)酶，ec:1.1.1.267；mct：2-c-甲基-d-赤蘚醇4-磷酸胞苷酰轉(zhuǎn)移酶，ec:2.7.7.60；cmk：4-二磷酸胞苷基-2-c-甲基-d-赤蘚醇激酶，ec:2.7.1.148；mcs：2-c-甲基-d-赤蘚醇2,4-環(huán)二磷酸合酶，ec:4.6.1.12；hds：4-羥基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸合酶，ec:1.17.7.1；ids：4-羥基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸還原酶(異戊烯基/二甲基烯丙基二磷酸合酶)，ec:1.17.1.2；ipi：異戊烯基-二磷酸δ-異構(gòu)酶，ec:5.3.3.2；gps：牦牛兒基二磷酸合酶，ec:2.5.1.1；fps：法呢基二磷酸合酶/法呢基焦磷酸合成酶，ec:2.5.1.10；sqs：角鯊烯合成酶；cas：環(huán)阿屯醇合酶，ec:2.5.1.21；sqe：角鯊烯環(huán)氧酶，ec:1.14.99.7；cs：葫蘆二烯醇合酶，ec:5.4.99.8；p450：細(xì)胞色素p450，ec:1.14.-.-；和udpg：udp-葡糖基轉(zhuǎn)移酶，ec:2.4.1.e.c.2.4.1是ugt；圖2是提出的羅漢果果實(shí)中羅漢果苷合成途徑的圖解說明；圖3圖解說明與2,3;22,23-二氧化角鯊烯(線性，上面)和羅漢果醇(環(huán)狀，下面)相關(guān)的化合物的編號系統(tǒng)，顯示關(guān)鍵編號的碳(藍(lán)色)；圖4a-4b是顯示在羅漢果果實(shí)發(fā)育和成熟過程中的羅漢果苷水平的圖解說明。注意m2和m3的進(jìn)行性損失以及m4和m5的伴隨增加(圖4b)，表明相繼的葡糖基化。數(shù)值在4a中表示為相對于最高羅漢果苷含量，以及在4b中表示為基于色譜圖的峰面積的每種化合物的相對量；圖5a和5b是圖解說明角鯊烯環(huán)氧酶1(5a)和角鯊烯環(huán)氧酶2(5b)的相對表達(dá)模式的圖。在正在發(fā)育的羅漢果果實(shí)中，顯示在最年輕的果實(shí)中的相對高表達(dá)；圖6a-6c顯示hplc-ms色譜圖，其圖解說明在酵母宿主中2,3-單氧化角鯊烯和2,3;22,23-二氧化角鯊烯的產(chǎn)生(6a)；在表達(dá)羅漢果葫蘆二烯醇合酶(sgcds)的酵母宿主中，將這些底物環(huán)化為葫蘆二烯醇和24,25-環(huán)氧葫蘆二烯醇(6b)。圖6c-底物和產(chǎn)物標(biāo)準(zhǔn)品。在酵母提取物中，通過ms和nmr鑒定葫蘆二烯醇和24,25-環(huán)氧葫蘆二烯醇；圖7是在正在發(fā)育的羅漢果果實(shí)中表達(dá)的8種環(huán)氧化物水解酶基因的表達(dá)模式的層次聚類熱圖(hierarchicalclusterheatmap)。呈現(xiàn)的果實(shí)發(fā)育的五個階段是15、34、51、77和103天，且對應(yīng)于圖4a和4b中的果實(shí)發(fā)育階段；圖8a-8b圖解說明環(huán)氧化物水解酶表達(dá)對24,25-二羥基葫蘆二烯醇的影響。圖8a顯示lc-ms色譜圖，表明由于在表達(dá)葫蘆二烯醇合酶(sgcds)的酵母提取物中環(huán)氧化物水解酶基因的表達(dá)，24,25-二羥基葫蘆二烯醇的增加。前三個色譜圖分別顯示eph1、2和3(seqidno.17、19和21)的效果。底部色譜圖顯示攜帶cds、而沒有額外的eph基因的對照酵母。圖8b是顯示在對照酵母系和表達(dá)eph的酵母系中的24,25-二羥基葫蘆二烯醇(8a的化合物1)和24,25-環(huán)氧葫蘆二烯醇(8a的化合物3)的相對水平的圖；圖9是報道的羅漢果環(huán)氧化物水解酶蛋白序列的同一性-相似性矩陣。綠色[由重疊群_6184(seqidno:39)和重疊群_8262(seqidno:40)編碼]的序列來自tang等人(2011)中報道的數(shù)據(jù)庫，并分別作為us2015/0064743的seqidno.38和40被報道。由重疊群101438、102175、102581和22474編碼的序列分別為seqidno.41、42、43和44。矩陣是使用clustalomega程序(wwwdotebidotacdotuk/tools/msa/clustalo/)制備的；圖10是在正在發(fā)育的羅漢果果實(shí)中表達(dá)的細(xì)胞色素p450基因的表達(dá)模式的層次聚類熱圖。呈現(xiàn)的果實(shí)發(fā)育的五個階段是15、34、51、77和103天，且對應(yīng)于圖4a和4b中的果實(shí)發(fā)育階段；功能表達(dá)約40種候選物并測定其葫蘆二烯醇羥基化活性；圖11a-11c是hplc-ms色譜圖，其顯示通過細(xì)胞色素p450cyp102801(seqidno:10)對葫蘆二烯醇的c11-羥基化(11a)。圖11b顯示來自表達(dá)cyp102801的酵母系(缺乏cds(葫蘆二烯醇合酶表達(dá)))的提取物的色譜圖。圖11c顯示來自表達(dá)cds而不表達(dá)cyp102801的酵母宿主的酵母提取物的色譜圖；圖12是用于篩選葡糖基轉(zhuǎn)移酶活性的羅漢果苷底物的列表，根據(jù)各種命名法鑒定底物，以及它們的來源和用于鑒定它們的方法；圖13a-13b顯示本發(fā)明的一些實(shí)施方案的尿苷二磷酸葡糖基轉(zhuǎn)移酶(ugt)序列的系統(tǒng)發(fā)生分析。圖13a是來自clustalomega比對的ugt蛋白序列的系統(tǒng)發(fā)生分析。圖13b是羅漢果ugt的系統(tǒng)發(fā)生樹。對應(yīng)于相同基因家族的分枝通過顏色標(biāo)記。在本申請中顯示使羅漢果醇和羅漢果苷葡糖基化的羅漢果ugt以紅色加框；圖14是在正在發(fā)育的羅漢果果實(shí)中表達(dá)的ugt基因的表達(dá)模式的層次聚類熱圖。呈現(xiàn)的果實(shí)發(fā)育的五個階段是15、34、51、77和103天，且對應(yīng)于圖4a和4b中的果實(shí)發(fā)育階段。功能表達(dá)約100種候選物并用羅漢果苷底物測定其ugt活性；圖15是ugt酶-糖-受體分子活性的示意圖，其基于從具有在大腸桿菌中表達(dá)的單一重組ugt酶和羅漢果醇和羅漢果苷底物的無細(xì)胞葡糖基化反應(yīng)鑒定的產(chǎn)物。圖15a顯示主鏈葡糖基化，而圖15b顯示分枝葡糖基化，且圖15c顯示圖15b中呈現(xiàn)的分枝酶進(jìn)行的主鏈葡糖基化。當(dāng)每對環(huán)狀葫蘆烷環(huán)(cucrbitanering)通過藍(lán)色橢圓形表示(環(huán)a和b被示意性地組合成下方橢圓形，并且環(huán)c和d組合成上方橢圓形)時，糖分子的示意圖顯示為圓形，并且導(dǎo)致c-24和c-25的葫蘆二烯醇分子的非環(huán)狀支鏈部分通過短線表示。來自ugt反應(yīng)的新連接的葡萄糖部分通過綠色圓形標(biāo)記，衍生自底物的葡萄糖分子呈紅色，并且紫色圓形表明通過nmr鑒定為c-25位葡萄糖的添加的葡萄糖的位置。當(dāng)圓形指向上(左對角線或右對角線)時，其代表(1-6)糖苷鍵，而指向下的圓形(左對角線或右對角線)代表(1-2)糖苷鍵。指向左的圓形代表(1-4)糖苷鍵。星號表明痕量的物質(zhì)；圖16顯示在如圖15中所示的無細(xì)胞反應(yīng)介質(zhì)中包括糖苷配基羅漢果醇(m)后，從每種主鏈葡糖基酶合成的羅漢果苷產(chǎn)物的hplc/dad色譜圖。前三種酶各自合成c-3葡糖苷羅漢果醇m1e1。ugt85e5(269-1)合成c-24葡糖苷羅漢果醇m1a和c3,c24-二葡糖苷m2e二者。產(chǎn)物通過ms和nmr鑒定；圖17a-17d顯示hplc/dad色譜圖，其顯示ugt94c9(289-3)使用羅漢果苷v作為底物催化羅漢果苷vi的無細(xì)胞產(chǎn)生[在1.9分鐘洗脫的峰(m/z=1449.7113)]。圖17a圖解說明與無活性酶對照相比，羅漢果苷vi在反應(yīng)混合物中的積累(圖17b)。在反應(yīng)混合物中未完全轉(zhuǎn)化為羅漢果苷vi的殘余羅漢果苷v在2.1分鐘洗脫。(圖17a)。圖17c是羅漢果苷vi(鑒定為m6-ii)的標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖。使用lc-ms驗(yàn)證反應(yīng)產(chǎn)物。顯示了對來自17a的兩種羅漢果苷vi(m6)化合物，羅漢果苷v(m5)，和羅漢果苷vi(m6)標(biāo)準(zhǔn)品的所得光譜。為了區(qū)分兩種羅漢果苷vi，它們被標(biāo)記為m6-i(在1.5分鐘洗脫)和m6-ii(在1.9分鐘洗脫)；圖18是ugt氨基酸序列的比對的相似性和同一性成對矩陣。使用以blosum62運(yùn)行的matgat2.02(www.bitinckadotcom/ledion/matgat/)計算矩陣。氨基酸序列之間的百分比相似性呈現(xiàn)在“100％自身”對角線的左側(cè)和下方，并且百分比同一性呈現(xiàn)在“100％自身”對角線的右側(cè)和上方；圖19a和19b是色譜圖，其顯示ugt94-289-3在無細(xì)胞反應(yīng)體系中進(jìn)行相繼葡糖基化以從羅漢果苷2e生成賽門苷和羅漢果苷4a。圖19a是來自在ugt74-345-2和ugt94-289-3存在下，以羅漢果苷1a作為底物的反應(yīng)的產(chǎn)物的lc-ms色譜圖的實(shí)例。圖19b顯示羅漢果苷3x和兩種羅漢果苷iv部分(羅漢果苷iva和賽門苷)的光譜；圖20顯示由重疊群19984(其由于在果實(shí)發(fā)育中晚期表達(dá)而未被選擇)編碼的，來自羅漢果的候選角鯊烯環(huán)氧酶同源物的表達(dá)模式，以及其后其急劇下降；圖21顯示針對果實(shí)發(fā)育中高和早期表達(dá)而選擇的重疊群73966(seqidno:17)編碼的來自羅漢果的候選環(huán)氧水合酶同源物的表達(dá)模式，以及在成熟期間表達(dá)的逐漸下降；圖22顯示針對果實(shí)發(fā)育中高和早期表達(dá)而選擇的重疊群86123(seqidno:19)編碼的來自羅漢果的候選環(huán)氧水合酶同源物的表達(dá)模式，以及在成熟期間表達(dá)的逐漸下降；圖23顯示針對果實(shí)發(fā)育中高和早期表達(dá)而選擇的重疊群102640(seqidno:3)編碼的來自羅漢果的候選環(huán)氧水合酶同源物的表達(dá)模式，以及在成熟期間表達(dá)的逐漸下降；圖24顯示針對果實(shí)發(fā)育中高和早期表達(dá)而選擇的重疊群28382(seqidno:4)編碼的來自羅漢果的候選環(huán)氧水合酶同源物的表達(dá)模式，以及在成熟期間表達(dá)的逐漸下降。本發(fā)明具體實(shí)施方案的描述本發(fā)明，在其一些實(shí)施方案中，涉及生產(chǎn)羅漢果醇、羅漢果苷的方法，和包含其的組合物及其用途。在詳細(xì)解釋本發(fā)明的至少一個實(shí)施方案之前，應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明的應(yīng)用不一定限于下面描述中描述或由實(shí)施例例舉的細(xì)節(jié)。本發(fā)明能夠具有其它實(shí)施方案或者以各種方式實(shí)踐或進(jìn)行。羅漢果醇(3,11,24,25四羥基葫蘆二烯醇)是用于生物合成羅漢果苷(糖基化的羅漢果醇)的底物，在位置3,24和/或25的碳的糖基化被葡糖基轉(zhuǎn)移酶、諸如尿苷-5-二磷酸依賴性葡糖基轉(zhuǎn)移酶(ugt)催化。羅漢果醇生物合成需要類固醇前體角鯊烯作為底物，并且涉及殘基的環(huán)化和羥基化。目前尚不知道確切的生物化學(xué)途徑，然而本發(fā)明人已經(jīng)鑒定了可能在羅漢果醇的內(nèi)源性生物合成中突出的羅漢果醇合成途徑，已經(jīng)鑒定了對羅漢果醇、羅漢果醇前體、羅漢果苷前體和羅漢果苷的產(chǎn)生關(guān)鍵的羅漢果酶，已經(jīng)用重組合成的羅漢果醇/羅漢果苷途徑酶成功地重構(gòu)了生物合成途徑的重要部分(參見實(shí)施例5和6以及圖15a-15c)。基于組合的代謝概況分析、功能表達(dá)和蛋白建模結(jié)果，本發(fā)明人提出以下羅漢果的羅漢果苷生物合成的代謝途徑：在果實(shí)發(fā)育的初始階段期間，角鯊烯經(jīng)由角鯊烯合酶、角鯊烯環(huán)氧酶、葫蘆二烯醇合酶、環(huán)氧化物水解酶、細(xì)胞色素p450(cyp102801)和ugt85的進(jìn)行性作用代謝為二葡糖基化的m2。在果實(shí)成熟期間，存在ugt94成員，并且可能還有ugt85的進(jìn)行性活性，向m2的主鏈葡糖基部分添加支鏈葡糖基，導(dǎo)致甜味的m4、m5和m6化合物。來自羅漢果醇的羅漢果苷合成通過在羅漢果醇分子的碳c3和c24的主鏈葡糖基化起始，并通過進(jìn)一步添加葡萄糖部分(全部都通過尿苷二磷酸-葡糖基轉(zhuǎn)移酶(ec2.4.1)催化)來進(jìn)行。本發(fā)明人已經(jīng)意外地發(fā)現(xiàn)了具有催化活性的關(guān)鍵utg酶，其可能對羅漢果的羅漢果苷生物合成是關(guān)鍵的。因此，根據(jù)本發(fā)明的一些方面的一些實(shí)施方案，提供了包含氨基酸序列的分離的尿苷二磷酸-葡糖基轉(zhuǎn)移酶(ugt)多肽，其中所述多肽催化羅漢果醇在c24的主鏈葡糖基化和羅漢果苷在c3的主鏈葡糖基化。本發(fā)明人已經(jīng)顯示，該ugt在其底物特異性方面是混雜的：因此，在一些實(shí)施方案中，使用羅漢果醇作為底物，分離的ugt多肽可以催化羅漢果醇在c24的主鏈糖基化，可以催化c24葡糖基化的羅漢果苷在c3的主鏈葡糖基化，并且可以催化羅漢果苷的支鏈葡糖基化。在一個具體實(shí)施方案中，支鏈葡糖基化在c3的主鏈葡萄糖上。本發(fā)明人已經(jīng)將該ugt多肽鑒定為ugt85家族的成員。在一些實(shí)施方案中，催化羅漢果醇在c24的主鏈葡糖基化和羅漢果苷在c3的主鏈葡糖基化的分離的ugt多肽包含與seqidno:34具有至少34％同一性的氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，所述氨基酸序列與seqidno:34具有至少34％同源性。在一些實(shí)施方案中，催化羅漢果醇在c24的主鏈葡糖基化和羅漢果苷在c3的主鏈葡糖基化的分離的ugt多肽與seqidno:34具有至少35%、至少37%、至少40%、至少42%、至少45%、至少47%、至少50%、至少55%、至少58%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少78%、至少80%、至少83%、至少88%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%同源性或同一性。在一些實(shí)施方案中，所述utg多肽包含與seqidno:34具有34-100%、40-90%、37-85%、45-80%、50-75%、55-65%、80-90%、93-100%范圍內(nèi)的同源性或同一性的氨基酸序列。在一個具體實(shí)施方案中，催化羅漢果醇在c24的主鏈葡糖基化和羅漢果苷在c3的主鏈葡糖基化的分離的ugt多肽的氨基酸序列如seqidno:34所示。在一些情況下，seqidno:34也稱為ugt85e5、85e5和ugt85-269-1。本發(fā)明人已經(jīng)鑒定了具有對羅漢果苷合成至關(guān)重要的分枝葡糖基化活性的ugt酶。因此，根據(jù)本發(fā)明的一些方面，提供了包含氨基酸序列的分離的尿苷二磷酸-葡糖基轉(zhuǎn)移酶(ugt)多肽，其中所述多肽催化羅漢果苷在c3的(1-2)和(1-6)位置的分枝葡糖基化和羅漢果苷在c24的(1-2)和(1-6)位置的分枝葡糖基化。根據(jù)本發(fā)明的一些方面，提供了包含氨基酸序列的分離的尿苷二磷酸-葡糖基轉(zhuǎn)移酶(ugt)多肽，其中所述多肽催化羅漢果苷m5至羅漢果苷m6的分枝葡糖基化。該催化活性是高度重要的，因?yàn)閙6羅漢果苷是具有所有羅漢果的羅漢果苷化合物中味道最甜的羅漢果苷。本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了ugt多肽，其催化羅漢果苷在c3的(1-2)和(1-6)位置的分枝葡糖基化和羅漢果苷在c24的(1-2)和(1-6)位置的分枝葡糖基化，以及羅漢果苷m5至羅漢果苷m6的分枝葡糖基化。本發(fā)明人已經(jīng)將催化羅漢果苷在c3的(1-2)和(1-6)位置的分枝葡糖基化和羅漢果苷在c24的(1-2)和(1-6)位置的分枝葡糖基化，和/或羅漢果苷m5至羅漢果苷m6的分枝葡糖基化的ugt多肽鑒定為ugt94家族的成員。在一些實(shí)施方案中，催化羅漢果苷在c3的(1-2)和(1-6)位置的分枝葡糖基化和羅漢果苷在c24的(1-2)和(1-6)位置的分枝葡糖基化和/或羅漢果苷m5至羅漢果苷m6的分枝葡糖基化的分離的ugt多肽包含與seqidno:38具有至少89％同一性的氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，所述氨基酸序列與seqidno:38具有至少89％同源性。在一些實(shí)施方案中，催化羅漢果苷在c3的(1-2)和(1-6)位置的分枝葡糖基化和羅漢果苷在c24的(1-2)和(1-6)位置的分枝葡糖基化和/或羅漢果苷m5至羅漢果苷m6的分枝葡糖基化的分離的ugt多肽包含與seqidno:38具有至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99或100%同源性或同一性的氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，所述utg多肽包含與seqidno:38具有89-100%、90-100%、92-85%、94-80%、95-100%、96-100%、97-100%或99-100%范圍內(nèi)的同源性或同一性的氨基酸序列。在具體實(shí)施方案中，催化羅漢果苷在c3的(1-2)和(1-6)位置的分枝葡糖基化和羅漢果苷在c24的(1-2)和(1-6)位置的分枝葡糖基化和/或羅漢果苷m5至羅漢果苷m6的分枝葡糖基化的分離的ugt多肽包含如seqidno:38所示的氨基酸序列。在一些情況下，seqidno:38也稱為ugt94c9和ugt94-289-3?？梢源呋_漢果苷m5至羅漢果苷m6的分枝葡糖基化的額外utg酶多肽包括但不限于包含與seqidno:8具有至少41％同一性或同源性的氨基酸序列的ugt多肽。在一些實(shí)施方案中，所述ugt多肽包含seqidno:8所示的氨基酸序列。seqidno:8也被稱為ugt73-327-2、ugt73e7和eo7。根據(jù)本發(fā)明的一些方面，提供了包含氨基酸序列的分離的尿苷二磷酸-葡糖基轉(zhuǎn)移酶(ugt)多肽，其中所述多肽催化羅漢果苷iv(m4)至羅漢果苷v(m5)的分枝葡糖基化。在一些實(shí)施方案中，催化羅漢果苷iv(m4)至羅漢果苷v(m5)的分枝葡糖基化的分離的ugt多肽包含與seqidno:38具有至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%同源性或同一性的氨基酸序列，或與seqidno:34具有至少35%、至少37%、至少40%、至少42%、至少45%、至少47%、至少50%、至少55%、至少58%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少78%、至少80%、至少83%、至少88%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%同源性或同一性的氨基酸序列，或與seqidno:6具有至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%同源性或同一性的氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，催化羅漢果苷iv(m4)至羅漢果苷v(m5)的分枝葡糖基化的分離的ugt多肽包含與seqidno:38具有89-100%、90-100%、92-85%、94-80%、95-100%、96-100%、97-100%或99-100%范圍內(nèi)的同源性或同一性，或與seqidno:6具有84-100%、86-100%、88-100%、85-95%、89-100%、90-100%、92-85%、94-86%、95-100%、96-100%、97-100%或99-100%范圍內(nèi)的同源性或同一性，或與seqidno:34具有34-100%、40-90%、37-85%、45-80%、50-75%、55-65%、80-90%、93-100%范圍內(nèi)的同源性或同一性的氨基酸序列。在一個具體實(shí)施方案中，催化羅漢果苷iv(m4)至羅漢果苷v(m5)的分枝葡糖基化的分離的ugt多肽包含如seqidno:38或seqidno:6或seqidno:34所示的氨基酸序列。在一些情況下，seqidno:6也稱為ugt94a9、a09或ugt94-289-1。在一些實(shí)施方案中，所述utg酶多肽催化羅漢果苷或羅漢果醇的c3或c24在(1-2)和/或(1-6)位置的支鏈葡糖基化。然而，應(yīng)當(dāng)理解，在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的ugt酶多肽也可以包含在(1-4)位置的葡糖基化活性。根據(jù)本發(fā)明的一些方面的一些實(shí)施方案，所述酶多肽是催化羅漢果醇合成的酶，即角鯊烯合酶、角鯊烯環(huán)氧酶、葫蘆二烯醇合酶、環(huán)氧化物水解酶(也稱為環(huán)氧水合酶)和細(xì)胞色素p450。因此，根據(jù)本發(fā)明的一些方面，提供了包含與seqidno:14具有至少94％同一性或與seqidno:16具有至少89％同一性的氨基酸序列的分離的角鯊烯環(huán)氧酶(sqe，也稱為se)多肽，其中所述多肽催化由角鯊烯或氧化角鯊烯合成二環(huán)氧角鯊烯。在一些實(shí)施方案中，所述角鯊烯環(huán)氧酶(sqe)多肽包含與seqidno:14具有至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%同源性或同一性或與seqidno:16具有至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%同源性或同一性的氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，所述分離的sqe多肽包含與seqidno:14具有95-100%、96-100%、97-100%或99-100%范圍內(nèi)的同源性或同一性，或與seqidno:16具有89-100%、90-100%、92-100%、93-100%、94-100%、95-100%、96-100%、97-100%或99-100%范圍內(nèi)的同源性或同一性的氨基酸序列。在一個具體實(shí)施方案中，催化由角鯊烯或氧化角鯊烯合成二環(huán)氧角鯊烯的分離的sqe多肽包含如seqidno:14或seqidno:16所示的氨基酸序列。在一些情況下，seqidno:14也稱為se1、sqe1和重疊群18561。在一些情況下，seqidno:14也稱為se2、sqe2和重疊群16760。根據(jù)本發(fā)明的一些方面，提供了包含與seqidno:18、seqidno:22或seqidno:24具有至少75％同一性的氨基酸序列的分離的環(huán)氧化物水解酶(eh，eph)多肽，所述多肽催化從3-羥基，24-25環(huán)氧葫蘆二烯醇合成3,24,25三羥基葫蘆二烯醇。在一些實(shí)施方案中，所述環(huán)氧化物水解酶(eh)多肽包含與seqidno:18、seqidno:22或seqidno:24具有至少75%、至少78%、至少80%、至少83%、至少88%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%同源性或同一性的氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，所述分離的eh多肽包含與seqidno:18或22或24具有75-100%、78-97%、80-95%、85-92%、87-98%、90-99%、92-100%、95-100%、96-100%、97-100%或99-100%范圍內(nèi)的同源性或同一性的氨基酸序列。在一個具體實(shí)施方案中，催化從3-羥基，24-25環(huán)氧葫蘆二烯醇合成3,24,25三羥基葫蘆二烯醇的分離的eh多肽包含如seqidno:18或seqidno:22或seqidno:24所示的氨基酸序列。在一些情況下，seqidno:18也稱為eh1、eph1和重疊群73966。在一些情況下，seqidno:22也稱為eh3、eph3和重疊群102640。在一些情況下，seqidno:24稱為eh4、eph4和重疊群28382。具有所示催化活性的本發(fā)明的ugt、sqe和eh酶多肽可以包括具有所示催化活性的任何生物體的ugt、sqe和eh酶多肽。在一些實(shí)施方案中，分離的ugt、sqe或eh多肽是植物ugt、sqe或eh多肽。在一些實(shí)施方案中，所述植物是葫蘆科的植物。下文可見葫蘆科成員的詳細(xì)、非限制性列表。在具體實(shí)施方案中，分離的ugt多肽是羅漢果ugt、sqe或eh多肽。如本文所用，短語“羅漢果醇前體”或“羅漢果醇途徑前體”、“羅漢果醇前體”，“羅漢果醇前體底物”是指至少角鯊烯、單環(huán)氧角鯊烯、二環(huán)氧角鯊烯、3-羥基,24-25環(huán)氧葫蘆二烯醇、3,11二羥基24-25環(huán)氧葫蘆二烯醇、3,24,25三羥基葫蘆二烯醇。應(yīng)當(dāng)理解，由于羅漢果醇是羅漢果苷合成的底物，所以羅漢果醇前體(前體底物、羅漢果醇途徑前體)也構(gòu)成羅漢果苷途徑前體/底物。如本文所用，短語“羅漢果醇途徑酶”是指至少角鯊烯環(huán)氧酶或與之具有至少89％同源性或同一性的能夠催化從角鯊烯合成二環(huán)氧角鯊烯的酶，或至少葫蘆二烯醇合成酶或與之具有60％同源性或同一性的能夠催化從二環(huán)氧角鯊烯合成3-羥基,24-25環(huán)氧葫蘆二烯醇的酶，或至少環(huán)氧水合酶或與之具有75%同源性或同一性的能夠催化從3-羥基，24-25環(huán)氧葫蘆二烯醇合成3,24,25三羥基葫蘆二烯醇的酶，以及細(xì)胞色素p450酶或與之具有60%同源性或同一性的能夠催化從3,24,25三羥基葫蘆二烯醇合成3,11,24,25四羥基葫蘆二烯醇的酶。(sqe：角鯊烯環(huán)氧酶，ec:1.14.99.7；cs：葫蘆二烯醇合酶，ec:5.4.99.8；p450：細(xì)胞色素p450，ec:1.14.-.-；以及udpg：udp-葡糖基轉(zhuǎn)移酶，ec:2.4.1。e.c.2.4.1是ugt)如本文所用，術(shù)語“羅漢果苷途徑酶”是指至少一種或多種催化羅漢果醇(未葡糖基化)或羅漢果苷底物的葡糖基化的尿苷二磷酸-葡糖基轉(zhuǎn)移酶(ugt)。下表1包含可用于本發(fā)明的方法和組合物中的一些羅漢果醇和羅漢果苷途徑酶的非限制性列表，包括可適用于本發(fā)明的一些實(shí)施方案中的同源物的實(shí)例。表1：羅漢果醇/羅漢果苷途徑酶如本文所用，術(shù)語“羅漢果醇”是指糖苷配基化合物羅漢果醇。糖基化的羅漢果醇或羅漢果苷是指在位置3、24和/或25具有至少一個主鏈葡萄糖或支鏈葡萄糖的羅漢果醇。根據(jù)一個具體實(shí)施方案，糖基化或葡糖基化的羅漢果醇或羅漢果苷是指在位置3和/或24具有至少一個主鏈葡萄糖或支鏈葡萄糖的羅漢果醇。本發(fā)明的ugt酶多肽可以催化羅漢果醇或羅漢果苷底物的主鏈葡糖基化和/或支鏈葡糖基化。如本文所用，術(shù)語“主鏈葡糖基化”是指將葡萄糖部分共價添加至羅漢果醇或羅漢果苷底物的未葡糖基化的碳，導(dǎo)致單葡糖基化(m1)(當(dāng)?shù)孜锸翘擒张浠?aglycol)羅漢果醇時)或二葡糖基化(當(dāng)?shù)孜锸菃纹咸腔牧_漢果苷時)的羅漢果苷(m2)。葡糖基化通常位于羅漢果醇骨架的c3和c24碳。如本文所用，術(shù)語“分枝葡糖基化”或“支鏈葡糖基化”是指向羅漢果苷底物的葡糖基化碳的葡萄糖共價添加葡萄糖部分，導(dǎo)致多葡糖基化的羅漢果苷(m2、m3、m4、m5或m6)，這取決于羅漢果苷底物的葡糖苷化水平。葡糖基化通常位于羅漢果醇骨架的c3和c24碳。圖12中顯示了說明非限制數(shù)量的非葡糖基化的羅漢果醇，和不同形式的，在不同碳處葡糖基化，且具有不同鍵合的羅漢果苷的表格。本發(fā)明的羅漢果醇生物合成途徑酶和羅漢果苷生物合成途徑酶多肽可用于合成羅漢果醇、羅漢果醇前體或羅漢果苷或羅漢果苷前體。因此，根據(jù)本發(fā)明的一些方面的一些實(shí)施方案，提供了從羅漢果醇前體底物合成羅漢果醇或羅漢果醇前體產(chǎn)物的方法，所述方法包括使至少一種羅漢果醇前體底物與羅漢果苷途徑酶接觸。催化羅漢果醇、羅漢果苷或羅漢果醇或羅漢果苷前體生物合成的步驟的羅漢果苷途徑酶可以如下：(a)當(dāng)羅漢果醇前體產(chǎn)物包含雙環(huán)氧角鯊烯且羅漢果醇前體底物包含角鯊烯或氧化角鯊烯時，所述羅漢果苷途徑酶包含如本文所述的角鯊烯環(huán)氧酶多肽，由此產(chǎn)生二環(huán)氧角鯊烯。適用于該方法的本發(fā)明的角鯊烯環(huán)氧酶多肽包括包含seqidno:14或與之具有至少94％同一性或同源性，或包含seqidno:16或與之具有至少89％同一性或同源性的sqe多肽，或(b)當(dāng)羅漢果醇前體產(chǎn)物包含3-羥基，24-25環(huán)氧葫蘆二烯醇且羅漢果醇前體底物包含雙環(huán)氧角鯊烯時，所述羅漢果醇途徑酶包含如seqidno:12所示的或與之具有60％同源性或同一性的葫蘆二烯醇合成酶多肽，由此產(chǎn)生3-羥基，24-25環(huán)氧葫蘆二烯醇，或(c)當(dāng)產(chǎn)物包含3,24,25三羥基葫蘆二烯醇且底物包含3-羥基，24-25環(huán)氧葫蘆二烯醇時，所述羅漢果醇途徑酶包含如權(quán)利要求21-23中任一項(xiàng)中所述的環(huán)氧水合酶多肽，由此產(chǎn)生3,24,25三羥基葫蘆二烯醇。適用于該方法中的本發(fā)明的環(huán)氧水合酶(也稱為環(huán)氧化物水解酶)多肽包括包含seqidno:18、22或24或與之具有至少75％同一性或同源性的eh多肽，或(d)當(dāng)產(chǎn)物包含羅漢果醇且羅漢果醇前體底物包含3,24,25三羥基葫蘆二烯醇時，所述羅漢果醇途徑酶是如seqidno:10所示或與之具有60％同源性或同一性的細(xì)胞色素p450酶，由此產(chǎn)生3,11,24,25四羥基葫蘆二烯醇(羅漢果醇)?？梢栽诒磉_(dá)一種或多種本發(fā)明的羅漢果苷生物合成酶多肽的細(xì)胞中重構(gòu)羅漢果醇或羅漢果苷的生物合成。取決于細(xì)胞(或細(xì)胞裂解物)中羅漢果醇前體和生物合成酶的可用性，可以使用上述步驟中的任一種、一些或全部重構(gòu)各個反應(yīng)或其組合。因此，在一些實(shí)施方案中，產(chǎn)生羅漢果醇產(chǎn)物包括以下步驟中的至少一個：(i)使角鯊烯或氧化角鯊烯與本發(fā)明的角鯊烯環(huán)氧酶多肽接觸，由此產(chǎn)生二環(huán)氧角鯊烯；(ii)使二環(huán)氧角鯊烯與本發(fā)明的葫蘆二烯醇合酶接觸，由此產(chǎn)生3-羥基，24-25環(huán)氧葫蘆二烯醇；(iii)使3-羥基，24-25環(huán)氧葫蘆二烯醇與本發(fā)明的環(huán)氧水合酶(環(huán)氧化物水解酶)接觸，由此產(chǎn)生3,24,25三羥基葫蘆二烯醇；和(iv)使3,24-25三羥基葫蘆二烯醇與本發(fā)明的細(xì)胞色素p450酶接觸，由此產(chǎn)生羅漢果醇產(chǎn)物(3,11,24,25四羥基葫蘆二烯醇)。在一些實(shí)施方案中，產(chǎn)生羅漢果醇產(chǎn)物包括至少(i)和(iv)，至少(ii)和(iv)，至少(iii)和(iv)，至少(i)、(ii)和(iii)，至少(i)、(ii)和(iv)，至少(i)、(iii)和(iv)，至少(ii)、(iii)和(iv)以及任選地(i)、(ii)、(iii)和(iv)的全部。例如，為了在缺乏角鯊烯環(huán)氧酶或角鯊烯環(huán)氧酶缺陷、但具有完成從二氧化角鯊烯合成羅漢果醇的生物合成能力的細(xì)胞中重構(gòu)或增強(qiáng)二氧化角鯊烯合成，該方法可以包括(i)。在能夠合成二氧化角鯊烯、3-羥基,24-25環(huán)氧葫蘆二烯醇和3,24-25三羥基葫蘆二烯醇、但環(huán)氧化物水解酶(環(huán)氧水合酶)缺陷或缺乏環(huán)氧化物水解酶(環(huán)氧水合酶)的細(xì)胞中，該方法可以包括(iii)。在能夠合成3-羥基,24-25環(huán)氧葫蘆二烯醇和3,24-25三羥基葫蘆二烯醇、但角鯊烯環(huán)氧酶和環(huán)氧化物水解酶(環(huán)氧水合酶)缺陷或缺乏角鯊烯環(huán)氧酶和環(huán)氧化物水解酶(環(huán)氧水合酶)的細(xì)胞中，該方法可以包括(i)和(iii)。本發(fā)明考慮了羅漢果苷生物合成。根據(jù)本發(fā)明的一些方面的一些實(shí)施方案，提供了合成羅漢果苷的方法，所述方法包括將至少一種本發(fā)明的ugt多肽或其組合與至少一種ugt底物羅漢果苷前體接觸。根據(jù)一些實(shí)施方案，該方法包括羅漢果醇或羅漢果苷前體底物的主鏈和分枝葡糖基化的步驟。催化羅漢果苷或羅漢果苷前體生物合成的步驟的羅漢果苷途徑酶可以如下：(aa)當(dāng)?shù)孜锸橇_漢果醇或在c3未葡糖基化的羅漢果苷時，催化羅漢果醇在c24的主鏈葡糖基化和羅漢果苷在c3的主鏈葡糖基化的ugt是包含seqidno:34所示的氨基酸序列或與之具有至少34％同源性或同一性的ugt。(bb)當(dāng)?shù)孜锸橇_漢果苷時，催化羅漢果苷在c3的(1-2)和(1-6)位置的分枝葡糖基化和/或羅漢果苷在c24的(1-2)和(1-6)位置的分枝葡糖基化的ugt包含如seqidno:38所示的或與之具有至少89％同源性或同一性的氨基酸序列。(cc)當(dāng)?shù)孜锸橇_漢果苷m5時，催化羅漢果苷m5至羅漢果苷m6的分枝葡糖基化的ugt包含如seqidno:38所示或與之具有至少89％同源性或同一性，或seqidno:8或與之具有至少41％同源性或同一性的氨基酸序列。(dd)當(dāng)?shù)孜锸橇_漢果苷iv(m4)時，催化m4至羅漢果苷v(m5)的分枝葡糖基化的ugt包含如seqidno:38或與之具有至少89％同源性或同一性的，seqidno:34或與之具有至少34%同源性或同一性的，和seqidno:6或與之具有至少84%同源性或同一性的序列中任一者所示的氨基酸序列。因此，在一些實(shí)施方案中，所述方法包括使羅漢果苷底物與至少一種ugt多肽接觸，所述ugt多肽選自如seqidno:38或與之具有至少89％同源性或同一性，seqidno:34或與之具有至少34%同源性或同一性，seqidno:8或與之具有至少41%同源性或同一性，和seqidno:6或與之具有至少84%同源性或同一性的序列所示的氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，產(chǎn)生羅漢果苷產(chǎn)物包括至少(aa)和(bb)，至少(aa)和(cc)，至少(aa)和(dd)，至少(aa)、(bb)和(cc)，至少(aa)、(cc)和(dd)，至少(bb)、(cc)和(dd)，至少(bb)和(cc)，至少(cc)和(dd)以及任選(aa)、(bb)、(cc)和(dd)的全部。例如，為了在缺乏催化在c3或c24的主鏈葡糖基化的ugt，或催化在c3或c24的主鏈葡糖基化的ugt缺陷，但具有完成從單葡糖基化的羅漢果苷合成羅漢果苷的生物合成能力的細(xì)胞中重構(gòu)或增強(qiáng)羅漢果苷合成，該方法可以包括(aa)。在能夠合成m5，但催化m5至m6的分枝葡糖基化的ugt缺陷，或缺乏催化m5至m6的分枝葡糖基化的ugt的細(xì)胞中，該方法可以包括(cc)。在能夠具有完成從單葡糖基化的羅漢果苷合成羅漢果苷m5的生物合成能力，但c3或c24的主鏈葡糖基化以及m5至m6的分枝葡糖基化缺陷，或缺乏c3或c24的主鏈葡糖基化以及m5至m6的分枝葡糖基化的細(xì)胞中，該方法可以包括(aa)和(cc)。在一些實(shí)施方案中，所述方法包括使羅漢果苷底物與至少一種包含如seqidno:34所示或與之具有至少34%同源性或同一性的氨基酸序列的ugt多肽，以及包含如seqidno:8所示或與之具有至少41%同源性或同一性的氨基酸序列的ugt多肽、包含如seqidno:6所示或與之具有至少84%同源性或同一性的氨基酸序列的ugt多肽，和包含如seqidno:38所示或與之具有至少89%同源性或同一性的氨基酸序列的ugt多肽中的一種或多種。在一個具體實(shí)施方案中，所述方法包括使羅漢果苷底物至少與包含如seqidno:34所示或與之具有至少34％同源性或同一性的氨基酸序列的ugt多肽，和包含如seqidno:38所示或與之具有89％同源性或同一性的氨基酸序列的ugt多肽。本發(fā)明考慮從羅漢果醇底物和/或前體生物合成羅漢果苷。因此，本發(fā)明的用于合成羅漢果苷的方法包括組合根據(jù)本發(fā)明的方法產(chǎn)生羅漢果醇和如上所述合成羅漢果苷，即組合本文所述的羅漢果醇合成的任何一個或多個或全部步驟與本文所述的羅漢果苷合成的任何一個或多個或全部步驟。考慮所有可能的羅漢果苷產(chǎn)物的生產(chǎn)。因此，在一些實(shí)施方案中，所述羅漢果苷選自羅漢果苷i-a1、羅漢果苷i-e1、羅漢果苷iie、羅漢果苷iii、賽門苷、羅漢果苷v和羅漢果苷vi。根據(jù)一些實(shí)施方案，該方法還包括分離羅漢果苷。羅漢果苷化合物的分離和純化的方法是本領(lǐng)域眾所周知的，例如，li,d.等人lj.nat.med.2007,61,307-312；venkatachaturvedula和indraprakash.,j.carb.chem.201130,16-26；venkatasaiprakashchaturvedula,indraprakash.iosrjournalofpharmacy(iosrphr)2012.2,7-12。如本文所用，術(shù)語“多肽”是指由鏈中通過肽鍵鍵合在一起的大量氨基酸殘基組成的線性有機(jī)聚合物，形成蛋白分子的一部分(或全部)。多肽的氨基酸序列是指構(gòu)成多肽或其部分的氨基酸的線性連續(xù)排列。如本文所用，術(shù)語“多核苷酸”是指單鏈或雙鏈核酸序列，其以rna序列、互補(bǔ)多核苷酸序列(cdna)、基因組多核苷酸序列和/或復(fù)合多核苷酸序列(例如，上述的組合)的形式分離和提供。術(shù)語“分離的”是指至少部分地從天然環(huán)境(例如植物細(xì)胞)分離。如本文所用，“表達(dá)”是指在mrna和任選多肽水平的表達(dá)。如本文所用，短語“外源多核苷酸”是指可能不在植物內(nèi)天然表達(dá)的異源核酸序列(例如，來自不同物種的核酸序列)或期望在植物中過表達(dá)的異源核酸序列?？梢砸苑€(wěn)定或瞬時的方式將外源多核苷酸引入植物中，以便產(chǎn)生核糖核酸(rna)分子和/或多肽分子。應(yīng)當(dāng)注意，外源多核苷酸可以包含與植物的內(nèi)源性核酸序列具有同一性或部分同源性的核酸序列。如本文所用，術(shù)語“內(nèi)源性”是指在植物或其細(xì)胞內(nèi)存在和/或天然表達(dá)的任何多核苷酸或多肽。同源序列包括直向同源和旁系同源序列。術(shù)語“旁系同源”涉及導(dǎo)致旁系同源基因的物種的基因組內(nèi)的基因重復(fù)。術(shù)語“直向同源”涉及由于祖先關(guān)系而在不同生物體內(nèi)的同源基因。因此，直系同源物是從給定兩種物種的最后共同祖先中的單一祖先基因衍生的進(jìn)化對應(yīng)物，并且因此有很大可能性具有相同的功能。在單子葉植物物種中鑒定直向同源物的一個選擇是通過進(jìn)行雙向blast搜索(reciprocalblastsearch)。這可以通過第一次blast來實(shí)現(xiàn)，所述blast涉及將目標(biāo)序列針對任何序列數(shù)據(jù)庫進(jìn)行blast比對，所述序列數(shù)據(jù)庫例如可以在ncbi(dot)nlm(dot)nih(dot)gov找到的公開可得的ncbi數(shù)據(jù)庫。如果是尋找水稻中的直向同源物，則可以將目標(biāo)序列針對例如可在ncbi獲得的來自日本水稻(oryzasativanipponbare)的28,469個全長cdna克隆進(jìn)行blast比對?？梢赃^濾blast結(jié)果。然后將過濾結(jié)果或未過濾結(jié)果的全長序列針對衍生出目標(biāo)序列的生物體的序列進(jìn)行反向blast比對(第二次blast比對)。然后比較第一次和第二次blast比對的結(jié)果。當(dāng)在第一次blast比對中得到最高評分(最佳命中)的序列在第二次blast比對中將查詢序列(原始目標(biāo)序列)鑒定為最佳命中時，鑒定直向同源物。使用相同的推理，發(fā)現(xiàn)旁系同源物(同一生物體中的基因的同源物)。在大序列家族的情況下，可以使用clustalw程序[ebi(dot)ac(dot)uk/tools/clustalw2/index(dot)html]，隨后使用鄰接樹(wikipedia(dot)org/wiki/neighbor-joining)，其有助于顯現(xiàn)聚類?？梢允褂糜嬎愠蓪π蛄斜葘Φ娜魏瓮葱员容^軟件來確定同源性(例如，百分比同源性、序列同一性+序列相似性)。如本文所用，在兩個核酸或多肽序列的上下文中的“序列同一性”或“同一性”包括當(dāng)比對時相同的兩個序列中的殘基。當(dāng)就蛋白而言使用序列同一性百分比時，認(rèn)識到不同的殘基位置經(jīng)常由于保守氨基酸取代而不同，其中氨基酸殘基被取代為具有相似化學(xué)特性(例如電荷或疏水性)的其它氨基酸殘基，因此不改變分子的功能特性。當(dāng)序列在保守取代上不同時，百分比序列同一性可以向上調(diào)整以校正取代的保守性質(zhì)。由于此類保守取代而不同的序列被認(rèn)為具有“序列相似性”或“相似性”。用于進(jìn)行該調(diào)整的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。通常，這涉及將保守取代評分為部分錯配，而不是完全錯配，由此增加百分比序列同一性。因此，例如，當(dāng)相同的氨基酸評分為1且非保守取代評分為零時，保守取代評分為0和1之間。計算保守取代的評分，例如，根據(jù)henikoffs和henikoffjg.[aminoacidsubstitutionmatricesfromproteinblocks.proc.natl.acad.sci.u.s.a.1992,89(22):10915-9]的算法?？梢允褂萌魏瓮葱员容^軟件，包括例如國家生物技術(shù)信息中心(ncbi)的blastn軟件，諸如通過使用默認(rèn)參數(shù)，確定同一性(例如，百分比同源性)。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，同一性是全局同一性，即在本發(fā)明的整個氨基酸或核酸序列上的同一性，而不是其部分上的同一性。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，術(shù)語“同源性”或“同源的”是指兩個或更多個核酸序列的同一性；或兩個或更多個氨基酸序列的同一性；或氨基酸序列與一個或多個核酸序列的同一性。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，同源性是全局同源性，即在本發(fā)明的整個氨基酸或核酸序列上的同源性，而不是其部分上的同源性?？梢允褂脀o2014/102774中描述的各種已知的序列比較工具來確定兩個或更多個序列之間的同源性或同一性程度。可以使用的局部比對工具包括但不限于tblastx算法，其將核苷酸查詢序列(兩條鏈)的六框概念翻譯產(chǎn)物針對蛋白序列數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比較。默認(rèn)參數(shù)包括：最大靶序列：100；預(yù)期閾值：10；字體大?。?；查詢范圍內(nèi)的最大匹配：0；評分參數(shù)：matrix–blosum62；過濾器和掩蔽：過濾器-低復(fù)雜度區(qū)域?？梢蚤_發(fā)微生物、植物細(xì)胞或植物，其表達(dá)可用于生物合成羅漢果醇(三萜核心)和各種羅漢果醇糖苷(羅漢果苷)的多肽。糖苷配基羅漢果醇用不同數(shù)目的葡萄糖部分糖基化以形成各種羅漢果苷化合物。通常，產(chǎn)生羅漢果苷的方法可以在體外或體內(nèi)進(jìn)行。本發(fā)明還包括一些步驟在體外進(jìn)行，而其它步驟可以在體內(nèi)進(jìn)行。因此，例如，可以在體外進(jìn)行第一步驟，并且在其之后可以將中間產(chǎn)物進(jìn)料至能夠進(jìn)行該方法的剩余步驟的重組宿主細(xì)胞?；蛘?，可以在體內(nèi)進(jìn)行第一步驟，并且在其之后中間產(chǎn)物可以用作體外進(jìn)行的后續(xù)步驟的底物。也可以設(shè)想其它組合。當(dāng)在體外進(jìn)行方法時，可以分別進(jìn)行該方法的每個步驟?；蛘撸梢栽谙嗤旌衔飪?nèi)進(jìn)行一個或多個步驟。在其中該方法的一些或全部步驟分開進(jìn)行的實(shí)施方案中，則每個步驟的中間產(chǎn)物可以在進(jìn)行下一步驟之前純化或部分純化。當(dāng)該方法在體內(nèi)進(jìn)行時，所述方法使用表達(dá)一種或多種酶的重組宿主，或者該方法可以使用幾種表達(dá)一種或多種酶的重組宿主。本發(fā)明考慮羅漢果醇或羅漢果苷的重組產(chǎn)生。因此，在一些實(shí)施方案中，在外源表達(dá)本發(fā)明的sqe、cds、eh、cytp450和ugt酶多肽中的至少一種的重組細(xì)胞中進(jìn)行羅漢果醇和/或羅漢果苷生物合成的方法。在一些實(shí)施方案中，所述重組細(xì)胞表達(dá)至少一種酶多肽，所述酶多肽選自包含如seqidno:34或與之具有至少34％同一性或同源性的序列所示的氨基酸序列的ugt多肽、包含如seqidno:6或與之具有至少84％同一性或同源性的序列所示的氨基酸序列的ugt多肽、包含如seqidno:38或與之具有至少89％同一性或同源性的序列所示的氨基酸序列的ugt多肽、包含如seqidno:14或與之具有至少94％同一性或同源性的序列或seqidno:16或與之具有至少89％同一性或同源性的序列所示的氨基酸序列的sqe多肽和包含如seqidno:18、22或24中任一種或與之具有至少75％同一性或同源性的序列所示的氨基酸序列的eh多肽?？梢栽谒拗骷?xì)胞中進(jìn)行本發(fā)明的多肽的重組表達(dá)，或羅漢果醇底物、羅漢果醇和/或羅漢果苷化合物的重組產(chǎn)生，所述宿主細(xì)胞表達(dá)分離的多核苷酸，所述分離的多核苷酸包含編碼本發(fā)明的羅漢果醇和/或羅漢果苷生物合成途徑酶的分離的多肽的核酸序列。在一些實(shí)施方案中，在可用于轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞的核酸構(gòu)建體中提供分離的多核苷酸。合適的宿主細(xì)胞包括可以在發(fā)酵、植物和其它真核細(xì)胞中培養(yǎng)或生長的細(xì)菌、酵母和其它微生物。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的一些實(shí)施方案的核酸構(gòu)建體可用于轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞。適用于本發(fā)明的方法的分離的多核苷酸包括但不限于編碼如表1中所示的羅漢果醇和羅漢果苷生物合成途徑酶中任一種的多核苷酸。因此，在一些實(shí)施方案中，提供了分離的多核苷酸，其包含編碼如seqidno:6、10、12、14、16、22、24、34和38中任一項(xiàng)所述的氨基酸序列或其功能同系物的核酸序列。上述多肽的功能同系物也適用于本文所述的方法和重組宿主中。功能同系物是與參考多肽具有序列相似性且執(zhí)行參考多肽的一種或多種生化或生理功能的多肽。因此，本文所述的酶的功能同系物是與參考酶具有序列相似性且能夠催化與參考酶相同的本發(fā)明方法的步驟或部分步驟的多肽。通常優(yōu)選的是，功能同系物與參考多肽共享至少一定程度的序列同一性，例如如上文對本發(fā)明的ugt、se、eh、cds、cytp450酶多肽所示。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，本發(fā)明的異源多核苷酸編碼包含如seqidno:34或與之具有至少34％同一性或同源性的序列所示的氨基酸序列的ugt多肽、包含如seqidno:6或與之具有至少84％同一性或同源性的序列所示的氨基酸序列的ugt多肽、包含如seqidno:38或與之具有至少89％同一性或同源性的序列所示的氨基酸序列的ugt多肽、包含如seqidno:14或與之具有至少94％同一性或同源性的序列或seqidno:16或與之具有至少89％同一性或同源性的序列所示的氨基酸序列的sqe多肽和包含如seqidno:18、22或24中任一種或與之具有至少75％同一性或同源性的序列所示的氨基酸序列的eh多肽。在一些實(shí)施方案中，分離的多核苷酸包含選自seqidno.5、9、11、13、15、17、21、23、33和37的核酸序列。如本文所用的術(shù)語“植物”涵蓋全株植物、嫁接植物、植物的祖先和后代和植物部分，包括種子、枝條、莖、根(包括塊莖)、根莖、接穗和植物細(xì)胞、組織和器官。所述植物可呈任何形式，包括懸浮培養(yǎng)物、胚芽、分生組織區(qū)、愈傷組織、葉、配子體、孢子體、花粉和小孢子。在本發(fā)明的方法中特別有用的植物包括屬于綠色植物(viridiplantee)總科的所有植物，尤其是單子葉和雙子葉植物，包括草料或飼料豆科植物、觀賞植物、糧食作物、樹或灌木，選自包含以下的列表：相思樹屬(acaciaspp.)、槭樹屬(acerspp.)、獼猴桃屬(actinidiaspp.)、七葉樹屬(aesculusspp.)、澳大利亞貝殼杉(agathisaustralis)、苦合歡(albiziaamara)、三色桫欏(alsophilatricolor)、須芒草(andropogonspp.)、落花生屬(arachisspp)、檳榔(arecacatechu)、香桂(asteliafragrans)、鷹嘴紫云英(astragaluscicer)、多小葉紅蘇木(baikiaeaplurijuga)、樺木屬(betulaspp.)、蕓苔屬(brassicaspp.)、木欖(bruguieragymnorrhiza)、伯克蘇木(burkeaafricana)、紫鉚花(buteafrondosa)、粉質(zhì)胚乳白花菜(cadabafarinosa)、朱纓花屬(calliandraspp)、野茶樹(camelliasinensis)、美人蕉(cannaindica)、辣椒屬(capsicumspp.)、決明屬(cassiaspp.)、距豌豆(centroemapubescens)、木瓜屬(chacoomelesspp.)、肉桂(cinnamomumcassia)、小果咖啡(coffeaarabica)、可樂豆木(colophospermummopane)、變異小冠花(coronilliavaria)、枸子(cotoneasterserotina)、山楂屬(crataegusspp.)、黃瓜屬(cucumisspp.)、柏木屬(cupressusspp.)、銀蕨(cyatheadealbata)、榅桲(cydoniaoblonga)、日本柳杉(cryptomeriajaponica)、香茅屬(cymbopogonspp.)、銀蕨(cyntheadealbata)、榅桲(cydoniaoblonga)、貨貝黃檀(dalbergiamonetaria)、大葉骨碎補(bǔ)(davalliadivaricata)、金錢草屬(desmodiumspp.)、新西蘭樹蕨(dicksoniasquarosa)、dibeteropogonamplectens、迪奧豆屬(diocleaspp)、扁豆屬(dolichosspp.)、dorycniumrectum、金字塔稗(echinochloapyramidalis)、ehraffiaspp.、穇子(eleusinecoracana)、幽眉草屬(eragrestisspp.)、刺桐屬(erythrinaspp.)、桉屬(eucalypfusspp.)、假烏木(eucleaschimperi)、絨毛狀金茅(eulaliavi/losa)、蕎麥屬(pagopyrumspp.)、費(fèi)約果(feijoasellowlana)、草莓屬(fragariaspp.)、千斤拔屬(flemingiaspp)、河岸藤露覽樹(freycinetiabanksli)、東亞老鶴草(geraniumthunbergii)、銀杏(ginagobiloba)、野黃豆(glycinejavanica)、墨西哥丁香屬(gliricidiaspp)、陸地棉(gossypiumhirsutum)、銀禪屬(grevilleaspp.)、鞘桿古夷布提木(guibourtiacoleosperma)、巖黃蓍屬(hedysarumspp.)、牛鞭草(hemaffhiaaltissima)、黃茅(heteropogoncontoffus)、大麥(hordeumvulgare)、紅荀茅(hyparrheniarufa)、小連翅(hypericumerectum)、hypeffheliadissolute、異花木藍(lán)(indigoincamata)、鳶尾屬(irisspp.)、leptarrhenapyrolifolia、胡枝子屬(lespedizaspp.)、萬苣屬(lettucaspp.)、銀合歡(leucaenaleucocephala)、單羅得草(loudetiasimplex)、lotonusbainesli、百脈根屬(lotusspp.)、硬皮豆(macrotylomaaxillare)、蘋果屬(malusspp.)、木薯(manihotesculenta)、紫苜蓿(medicagosaliva)、水杉(metasequoiaglyptostroboides)、香蕉(musasapientum)、煙草屬(nicotianumspp.)、驢食豆屬(onobrychisspp.)、鳥足豆屬(ornithopusspp.)、稻屬(oryzaspp.)、非洲雙翼豆(peltophorumafricanum)、狼尾草屬(pennisetumspp.)、酪梨(perseagratissima)、碧冬煎屬(petuniaspp.)、菜豆屬(phaseolusspp.)、加拿利海棗(phoenixcanariensis)、新西蘭劍麻(phormiumcookianum)、石楠屬(photiniaspp.)、白云杉(piceaglauca)、松屬(pinusspp.)、豌豆(pisumsativam)、新西蘭羅漢松(podocarpustotara)、pogonarthriafleckii、pogonaffhriasquarrosa、楊屬(populusspp.)、瓜葉牧豆(prosopiscineraria)、花旗松(pseudotsugamenziesii)、星狀老虎剌(pterolobiumstellatum)、西洋梨(pyruscommunis)、櫟屬(quercusspp.)、厚葉石斑木(rhaphiolepsisumbellata)、美味棒花棕(rhopalostylissapida)、納塔爾漆樹(rhusnatalensis)、歐洲醋栗(ribesgrossularia)、荼薦子屬(ribesspp.)、剌槐(robiniapseudoacacia)、薔薇屬(rosaspp.)、懸鉤子屬(rubusspp.)、柳屬(salixspp.)、紅裂稃草(schyzachyriumsanguineum)、金松(sciadopitysvefficillata)、北美紅杉(sequoiasempervirens)、巨杉(sequoiadendrongiganteum)、兩色高梁(sorghumbicolor)、菠菜屬(spinaciaspp.)、流蘇狀鼠尾粟(sporobolusfimbriatus)、stiburusalopecuroides、矮柱花草(stylosanthoshumilis)、葫蘆茶屬(tadehagispp)、落羽杉(taxodiumdistichum)、阿拉伯黃背草(themedatriandra)、三葉草屬(trifoliumspp.)、小麥屬(triticumspp.)、異葉鐵杉(tsugaheterophylla)、越桔屬(vacciniumspp.)、蠶豆屬(viciaspp.)、葡萄(vitisvinifera)、錐穗沃森花(watsoniapyramidata)、馬蹄蓮(zantedeschiaaethiopica)、玉蜀黍(zeamays)、莧菜(amaranth)、洋薊、蘆筍、球花甘藍(lán)、抱子甘藍(lán)(brusselssprouts)、卷心菜、油菜(canola)、胡蘿卜、花椰菜、芹菜、綠葉羽衣甘藍(lán)(collardgreens)、亞麻、散葉甘藍(lán)、小扁豆、油籽油菜(oilseedrape)、秋葵、洋蔥、馬鈴薯、水稻、大豆、稻草、甜菜、甘蔗、向日葵、西紅柿、南瓜茶(squashtea)、樹?；蛘撸孱惡推渌蔷G色植物(non-viridiplantae)可用于本發(fā)明的一些實(shí)施方案的方法。在具體實(shí)施方案中，所述植物是葫蘆科的植物，諸如羅漢果。在一些實(shí)施方案中，表達(dá)本發(fā)明的多肽的植物細(xì)胞包含葫蘆科植物的果實(shí)或根細(xì)胞。本發(fā)明考慮使用核酸構(gòu)建體用于轉(zhuǎn)化細(xì)胞用于表達(dá)羅漢果苷生物合成途徑酶多肽和產(chǎn)生羅漢果醇、羅漢果醇前體和羅漢果苷。因此，在一些實(shí)施方案中，提供了核酸構(gòu)建體，所述核酸構(gòu)建體包含本發(fā)明的分離的多核苷酸和用于指導(dǎo)分離的多核苷酸的表達(dá)的順式作用調(diào)節(jié)元件?？梢允褂帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的重組dna技術(shù)來構(gòu)建可用于根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案的方法中的構(gòu)建體?？梢詫⒒驑?gòu)建體插入可商購的載體中，所述載體適合于轉(zhuǎn)化至植物中并適合于在轉(zhuǎn)化細(xì)胞中表達(dá)目標(biāo)基因。所述遺傳構(gòu)建體可以是表達(dá)載體，其中核酸序列與允許在植物細(xì)胞中表達(dá)的一個或多個調(diào)節(jié)序列可操作連接。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案的一個具體實(shí)施方案中，所述調(diào)節(jié)序列是植物可表達(dá)的啟動子。如本文所用，短語“植物可表達(dá)”是指啟動子序列，包括添加至其中或其中含有的任何額外的調(diào)節(jié)元件，其至少能夠在植物細(xì)胞、組織或器官、優(yōu)選單子葉植物或雙子葉植物細(xì)胞、組織或器官中誘導(dǎo)、賦予、激活或增強(qiáng)表達(dá)?？捎糜诒景l(fā)明一些實(shí)施方案的方法的優(yōu)選啟動子的實(shí)例呈現(xiàn)于表2、3、4和5中。表2：用于進(jìn)行本發(fā)明的一些實(shí)施方案的示例性組成型啟動子。表3：用于進(jìn)行本發(fā)明的一些實(shí)施方案的示例性種子優(yōu)選的啟動子。表4：用于進(jìn)行本發(fā)明的示例性花特異性啟動子。表5：用于進(jìn)行本發(fā)明的替代水稻啟動子?？梢葬槍χ参锉磉_(dá)優(yōu)化本發(fā)明的一些實(shí)施方案的多肽的核酸序列。此類序列修飾的實(shí)例包括但不限于改變的g/c含量以更接近于通常在目標(biāo)植物物種中發(fā)現(xiàn)的g/c含量，以及去除植物物種中非典型發(fā)現(xiàn)的密碼子，通常稱為密碼子優(yōu)化。短語“密碼子優(yōu)化”是指選擇適當(dāng)?shù)膁na核苷酸，用于在接近目標(biāo)植物內(nèi)的密碼子使用的結(jié)構(gòu)基因或其片段內(nèi)使用。因此，優(yōu)化的基因或核酸序列是指其中天然或天然存在的基因的核苷酸序列已被修飾以便利用植物內(nèi)統(tǒng)計學(xué)優(yōu)選或統(tǒng)計學(xué)有利的密碼子的基因。通常在dna水平上檢查核苷酸序列，并且使用任何合適的程序測定針對植物物種中的表達(dá)優(yōu)化的編碼區(qū)，例如如sardana等人.(1996,plantcellreports15:677-681)中所述。在該方法中，密碼子使用的標(biāo)準(zhǔn)偏差(密碼子使用偏差的度量)可以通過如下計算：首先找到天然基因的每個密碼子的使用相對于高度表達(dá)的植物基因的每個密碼子的使用的平方比例偏差，隨后計算平均平方偏差。所使用的公式為：1sdcu=n=1n[(xn-yn)/yn]2/n，其中xn是指高度表達(dá)的植物基因中密碼子n的使用頻率，其中yn是指目標(biāo)基因中密碼子n的使用頻率，且n是指目標(biāo)基因中的密碼子的總數(shù)。使用murray等人(1989,nucacidsres.17:477-498)的數(shù)據(jù)匯編了來自雙子葉植物的高度表達(dá)基因的密碼子使用表。一種根據(jù)特定植物細(xì)胞類型的優(yōu)選密碼子使用優(yōu)化核酸序列的方法基于直接使用，而不進(jìn)行任何額外統(tǒng)計計算密碼子優(yōu)化表，諸如在日本通過nias(nationalinstituteofagrobiologicalsciences)dna文庫在密碼子使用數(shù)據(jù)庫在線提供的那些(www.kazusa.or.jp/codon/)。密碼子使用數(shù)據(jù)庫含有許多不同物種的密碼子使用表，其中每個密碼子使用表已基于genbank中存在的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計測定。通過使用上述表來確定特定物種(例如，水稻)中每種氨基酸的最優(yōu)選或最有利的密碼子，編碼目標(biāo)蛋白的天然存在的核苷酸序列可以針對該特定植物物種進(jìn)行密碼子優(yōu)化。這通過將在特定物種基因組中可能具有低統(tǒng)計學(xué)發(fā)生率的密碼子替換為相應(yīng)的密碼子(考慮統(tǒng)計學(xué)更有利的氨基酸)來實(shí)現(xiàn)。然而，可以選擇一種或多種不太有利的密碼子來缺失現(xiàn)有的限制性位點(diǎn)，以在潛在有用的結(jié)點(diǎn)(5'和3'末端以添加信號肽或終止盒，可能用于切割和將片段剪接在一起以產(chǎn)生正確的全長序列的內(nèi)部位點(diǎn))生成新位點(diǎn)，或消除可負(fù)面影響mrna穩(wěn)定性或表達(dá)的核苷酸序列。天然存在的編碼核苷酸序列可以在任何修飾之前已經(jīng)含有對應(yīng)于特定植物物種中統(tǒng)計學(xué)有利的密碼子的許多密碼子。因此，天然核苷酸序列的密碼子優(yōu)化可以包括確定天然核苷酸序列內(nèi)的哪些密碼子在特定植物方面不是統(tǒng)計學(xué)有利的，和根據(jù)特定植物的密碼子使用表來修飾這些密碼子以產(chǎn)生密碼子優(yōu)化的衍生物。修飾的核苷酸序列可以針對植物密碼子使用來完全或部分地優(yōu)化，條件是由修飾的核苷酸序列編碼的蛋白的產(chǎn)生水平高于由相應(yīng)天然存在或天然基因編碼的蛋白的水平。通過改變密碼子使用構(gòu)建合成基因描述于例如pct專利申請93/07278中。因此，本發(fā)明的一些實(shí)施方案包括上文所述的核酸序列；其片段，與其可雜交的序列，與其同源的序列，與其直向同源的序列，編碼具有不同密碼子使用的相似多肽的序列，特征在于突變的改變的序列，所述突變諸如天然存在或人誘導(dǎo)、隨機(jī)或靶向方式的一個或多個核苷酸的缺失、插入或取代。植物細(xì)胞可以用本發(fā)明的一些實(shí)施方案的核酸構(gòu)建體穩(wěn)定或瞬時轉(zhuǎn)化。在穩(wěn)定轉(zhuǎn)化中，將本發(fā)明的一些實(shí)施方案的核酸分子整合至植物基因組中，因此其代表穩(wěn)定和遺傳的性狀。在瞬時轉(zhuǎn)化中，所述核酸分子由轉(zhuǎn)化的細(xì)胞表達(dá)，但其未整合至基因組中，因此其代表瞬時性狀。存在將外來基因引入單子葉植物和雙子葉植物中的多種方法(potrykus,i.,annu.rev.plant.physiol.,plant.mol.biol.(1991)42:205-225;shimamoto等人.,nature(1989)338:274-276)。引起外源dna穩(wěn)定整合至植物基因組dna中的主要方法包括兩種主要方法：(i)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移：klee等人(1987)annu.rev.plantphysiol.38:467-486;klee和rogers,cellcultureandsomaticcellgeneticsofplants,vol.6,molecularbiologyofplantnucleargenes,編輯schell,j.,和vasil,l.k.,academicpublishers,sandiego,calif.(1989)p.2-25;gatenby,plantbiotechnology,編輯kung,s.和arntzen,c.j.,butterworthpublishers,boston,mass.(1989)p.93-112。(ii)直接dna攝?。簆aszkowski等人,cellcultureandsomaticcellgeneticsofplants,vol.6,molecularbiologyofplantnucleargenes編輯schell,j.,和vasil,l.k.,academicpublishers,sandiego,calif.(1989)p.52-68;包括用于將dna直接攝取至原生質(zhì)體中的方法，toriyama,k.等人(1988)bio/technology6:1072-1074。通過植物細(xì)胞的短暫電休克誘導(dǎo)的dna攝?。簔hang等人plantcellrep.(1988)7:379-384.fromm等人nature(1986)319:791-793。通過粒子轟擊將dna注入植物細(xì)胞，klein等人bio/technology(1988)6:559-563;mccabe等人bio/technology(1988)6:923-926;sanford,physiol.plant.(1990)79:206-209；通過使用微量吸液系統(tǒng)：neuhaus等人,theor.appl.genet.(1987)75:30-36;neuhausandspangenberg,physiol.plant.(1990)79:213-217；細(xì)胞培養(yǎng)物、胚胎或愈傷組織的玻璃纖維或碳化硅晶須轉(zhuǎn)化，美國專利號5,464,765或通過dna與發(fā)芽花粉的直接孵育，dewet等人，experimentalmanipulationofovuletissue,編輯chapman,g.p.和mantell,s.h.以及daniels,w.longman,london,(1985)p.197-209;和ohta,proc.natl.acad.sci.usa(1986)83:715-719。土壤桿菌系統(tǒng)包括使用整合至植物基因組dna中的定義dna取代的質(zhì)粒載體。植物組織的接種方法根據(jù)植物物種和土壤桿菌遞送系統(tǒng)改變。廣泛使用的方法是可用為開始全植物分化提供良好來源的任何組織外植體進(jìn)行的葉盤程序。horsch等人在plantmolecularbiologymanuala5,kluweracademicpublishers,dordrecht(1988)p.1-9中。補(bǔ)充方法采用與真空滲入組合的土壤桿菌遞送系統(tǒng)。土壤桿菌系統(tǒng)在轉(zhuǎn)基因雙子葉植物的生成中尤其可行。存在向植物細(xì)胞中直接轉(zhuǎn)移dna的各種方法。在電穿孔中，將原生質(zhì)體短暫地暴露于強(qiáng)電場。在顯微注射中，使用極小的微量移液管將dna直接機(jī)械注入細(xì)胞中。在微粒轟擊中，將dna吸附在微彈諸如硫酸鎂晶體或鎢顆粒上，將微彈物理加速至細(xì)胞或植物組織中。在穩(wěn)定轉(zhuǎn)化后進(jìn)行植物繁殖。最常見的植物繁殖方法是通過種子。然而，通過種子繁殖的再生具有以下缺陷，由于種子由植物根據(jù)受孟德爾定律控制的遺傳差異產(chǎn)生，所以由于雜合性在作物中缺乏均一性?；旧?，每顆種子在基因上都不同并且各自將以其自身的特定性狀生長。因此，優(yōu)選的是，產(chǎn)生轉(zhuǎn)化的植物，使得再生植物具有親本轉(zhuǎn)基因植物的相同性狀和特征。因此，優(yōu)選的是，通過提供轉(zhuǎn)化植物的快速、一致生殖的微繁殖，再生轉(zhuǎn)化植物。微繁殖是由已經(jīng)從所選親本植物或栽培品種切除的單一組織片生長出新一代植物的過程。該過程允許具有表達(dá)融合蛋白的優(yōu)選組織的植物大量生殖。產(chǎn)生的新一代植物在基因上與原始植物相同，并且具有原始植物的所有特征。微繁殖允許在短時間段內(nèi)大量生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)植物材料并且在原始轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)化植物特征的保持中提供了所選栽培品種的快速增殖?？寺≈参锏膬?yōu)點(diǎn)是植物增殖的速度和所產(chǎn)植物的質(zhì)量和均一性。微繁殖是需要在階段之間改變培養(yǎng)基或生長條件的多階段程序。因此，微繁殖過程涉及4個基本階段：階段1，初始組織培養(yǎng)；階段2，組織培養(yǎng)增殖；階段3，分化和植株形成；和階段4，溫室培養(yǎng)和硬化。在階段1，初始組織培養(yǎng)期間，建立組織培養(yǎng)并保證無污染物。在階段2期間，初始組織培養(yǎng)物增殖直至生成足夠量的組織樣品以滿足生產(chǎn)目標(biāo)。在階段3期間，將階段2中生長的組織樣品分開并生長成單獨(dú)的幼苗。在階段4，將轉(zhuǎn)化幼苗轉(zhuǎn)移到溫室中硬化，在溫室中植物對光的耐受性逐漸增強(qiáng)，以致其可以在自然環(huán)境中生長。盡管目前優(yōu)選穩(wěn)定轉(zhuǎn)化，但本發(fā)明的一些實(shí)施方案還設(shè)想葉細(xì)胞、分生組織細(xì)胞或全植物的瞬時轉(zhuǎn)化。瞬時轉(zhuǎn)化可以通過上述直接dna轉(zhuǎn)移方法中任一種或通過使用修飾的植物病毒的病毒感染來實(shí)現(xiàn)。已顯示可用于轉(zhuǎn)化植物宿主的病毒包括camv、tmv和bv。使用植物病毒轉(zhuǎn)化植物描述于美國專利號4,855,237(bgv)、ep-a67,553(tmv)、日本公開申請?zhí)?3-14693(tmv)、epa194,809(bv)、epa278,667(bv)；和gluzman,y.等人,communicationsinmolecularbiology:viralvectors,coldspringharborlaboratory,newyork,pp.172-189(1988)。在wo87/06261中描述了用于在許多宿主(包括植物)中表達(dá)外源dna的假病毒顆粒。上述參考文獻(xiàn)以及dawson,w.o.等人,virology(1989)172:285-292；takamatsu等人.emboj.(1987)6:307-311；french等人.science(1986)231:1294-1297；和takamatsu等人.febsletters(1990)269:73-76表明構(gòu)建植物rna病毒用于在植物中引入和表達(dá)非病毒外源核酸序列。當(dāng)病毒是dna病毒時，可以對病毒本身進(jìn)行合適的修飾?；蛘?，可以首先將病毒克隆至細(xì)菌質(zhì)粒中以便于用外來dna構(gòu)建所需病毒載體。然后可以從質(zhì)粒切除病毒。如果病毒是dna病毒，則細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)可以連接至病毒dna，然后由細(xì)菌復(fù)制。該dna的轉(zhuǎn)錄和翻譯將產(chǎn)生衣殼蛋白，其將包裹病毒dna。如果病毒是rna病毒，則通常將病毒作為cdna克隆并插入質(zhì)粒。然后將質(zhì)粒用于制備所有結(jié)構(gòu)。然后通過轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒的病毒序列和翻譯病毒基因以產(chǎn)生包裹病毒rna的衣殼蛋白來產(chǎn)生rna病毒。上述參考文獻(xiàn)以及美國專利號5,316,931表明構(gòu)建植物rna病毒用于在植物中引入和表達(dá)非病毒外源核酸序列(諸如包括在本發(fā)明的一些實(shí)施方案的構(gòu)建體中的那些)。在一個實(shí)施方案中，提供了植物病毒核酸，其中已經(jīng)從病毒核酸缺失天然衣殼蛋白編碼序列，已經(jīng)插入非天然植物病毒衣殼蛋白編碼序列和非天然啟動子，優(yōu)選地非天然衣殼蛋白編碼序列的亞基因組啟動子，其能夠在植物宿主中表達(dá)，包裝重組植物病毒核酸以及確保重組植物病毒核酸對宿主的全身感染。或者，衣殼蛋白基因可以通過在其內(nèi)插入非天然核酸序列來失活，使得產(chǎn)生蛋白。重組植物病毒核酸可以含有一種或多種另外的非天然亞基因組啟動子。每個非天然亞基因組啟動子均能夠在植物宿主中轉(zhuǎn)錄或表達(dá)相鄰基因或核酸序列并且不能相互地和與天然亞基因組啟動子重組。非天然(外來)核酸序列可插入天然植物病毒亞基因組啟動子附近或者如果包括多于一個核酸序列，則插入天然和非天然植物病毒亞基因組啟動子附近。非天然核酸序列在宿主植物中在亞基因組啟動子的控制下轉(zhuǎn)錄或表達(dá)以生成所需產(chǎn)物。在第二個實(shí)施方案中，提供了重組植物病毒核酸，除天然外殼蛋白編碼序列置于非天然外殼蛋白亞基因組啟動子之一而不是非天然外殼蛋白編碼序列的附近外，與第一實(shí)施方案一樣。在第三個實(shí)施方案中，提供了重組植物病毒核酸，其中天然外殼蛋白基因在其亞基因組啟動子的附近并且已經(jīng)向病毒核酸中插入了一個或多個非天然亞基因組啟動子。插入的非天然亞基因組啟動子能夠在植物宿主中轉(zhuǎn)錄或表達(dá)相鄰基因并且不能相互地和與天然亞基因組啟動子重組。非天然核酸序列可插入非天然亞基因組植物病毒啟動子附近，以便在宿主植物中在亞基因組啟動子的控制下轉(zhuǎn)錄或表達(dá)所述序列以生成所需產(chǎn)物。在第四個實(shí)施方案中，提供了重組植物病毒核酸，除天然外殼蛋白編碼序列由非天然外殼蛋白編碼序列代替外，與第三實(shí)施方案一樣。病毒載體被重組植物病毒核酸編碼的衣殼蛋白殼體化以產(chǎn)生重組植物病毒。重組植物病毒核酸或重組植物病毒用于感染適當(dāng)?shù)乃拗髦参?。重組植物病毒核酸能夠在宿主中復(fù)制，在宿主中系統(tǒng)性傳播，并且在宿主中轉(zhuǎn)錄或表達(dá)外來基因(分離的核酸)以產(chǎn)生所需產(chǎn)物。除以上外，本發(fā)明的一些實(shí)施方案的核酸分子也可引入葉綠體基因組中，從而實(shí)現(xiàn)葉綠體表達(dá)。將外源核酸序列引入葉綠體基因組的技術(shù)是已知的。這種技術(shù)涉及以下過程。首先，化學(xué)處理植物細(xì)胞以便將每個細(xì)胞的葉綠體數(shù)量減少為約1個。然后，經(jīng)由粒子轟擊將外源核酸引入細(xì)胞中，其目的是將至少一個外源核酸分子引入葉綠體中。選擇外源核酸，使得其可經(jīng)由易于用葉綠體固有的酶實(shí)現(xiàn)的同源重組整合到葉綠體基因組中。為此，除目標(biāo)基因外，外源核酸包括源自葉綠體基因組的至少一個核酸段。另外，外源核酸包括選擇標(biāo)記，其通過相繼選擇過程用于確定全部或大體上全部的葉綠體基因組拷貝在此類選擇后將包括外源核酸。在美國專利號4,945,050和5,693,507中找到關(guān)于這種技術(shù)的更多詳情，所述專利通過引用并入本文。因此，多肽可由葉綠體的蛋白表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)生并且變得整合至葉綠體的內(nèi)膜中。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，提供了異源表達(dá)如上所述的本發(fā)明的分離的多核苷酸的宿主細(xì)胞。所述宿主細(xì)胞可以是任何合適的宿主細(xì)胞，包括可以在發(fā)酵、植物和其它真核細(xì)胞中培養(yǎng)或生長的細(xì)菌、酵母和其它微生物。例如，所述宿主細(xì)胞包括用含有本文所述的核酸分子的異源核酸、諸如噬菌體dna、質(zhì)粒dna或粘粒dna表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的細(xì)菌細(xì)胞(例如大腸桿菌和枯草芽孢桿菌)，或用含有本文所述的核酸分子的重組酵母表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的酵母(例如，釀酒酵母或粟酒酵母)。在一些實(shí)施方案中，所述宿主細(xì)胞是酵母細(xì)胞。在一個具體實(shí)施方案中，所述酵母細(xì)胞是缺乏內(nèi)源性甾醇生物合成的酵母細(xì)胞，諸如gil77，或內(nèi)源性角鯊烯環(huán)氧酶erg1基因缺陷的酵母系，如rasberyjm等人(jour.biol.chem.2007.282:17002-17013)中所述。在一些實(shí)施方案中，所述宿主細(xì)胞產(chǎn)生羅漢果醇、羅漢果醇或羅漢果苷前體或羅漢果苷。所述方法還可以采用重組和非重組宿主的混合物。如果使用多于一種宿主，則可以共培養(yǎng)宿主，或者分開培養(yǎng)它們。如果分開培養(yǎng)宿主，則可以回收中間產(chǎn)物并任選地將其純化和部分純化，并使用中間產(chǎn)物作為底物加入重組宿主。本文所述的重組宿主可用于產(chǎn)生羅漢果苷化合物的方法。例如，如果重組宿主是微生物，則所述方法可以包括在其中催化本發(fā)明的方法的步驟的酶中的一種或多種(例如合成酶、水解酶、cyp450和/或ugt)表達(dá)的條件下使重組微生物在培養(yǎng)基中生長?？梢允怪亟M微生物在補(bǔ)料或連續(xù)過程中生長。通常，使重組微生物在發(fā)酵罐中在定義的溫度下生長所需時間段?？梢詮谋磉_(dá)一種或多種酶的重組宿主制備細(xì)胞裂解物，并將其用于接觸底物，使得可以產(chǎn)生羅漢果苷。例如，可以從表達(dá)一種或多種ugt的重組宿主制備細(xì)胞裂解物，并將其用于接觸羅漢果醇或羅漢果苷，使得可以產(chǎn)生羅漢果苷化合物。在一些實(shí)施方案中，羅漢果苷化合物可以使用全細(xì)胞來產(chǎn)生，所述全細(xì)胞被提供含有前體分子(例如，羅漢果醇)的原材料。所述原材料可以在細(xì)胞生長期間或細(xì)胞生長后提供。全細(xì)胞可以是懸浮或固定的。全細(xì)胞可以在發(fā)酵液或反應(yīng)緩沖液中。在一些實(shí)施方案中，可需要滲透劑以有效地將底物轉(zhuǎn)移至細(xì)胞中?？梢酝ㄟ^從培養(yǎng)基提取樣品用于根據(jù)公開的方法進(jìn)行分析來測定產(chǎn)物、底物和中間體的水平?？梢允褂帽绢I(lǐng)域已知的各種技術(shù)從培養(yǎng)物或培養(yǎng)基回收羅漢果苷化合物。在一些實(shí)施方案中，提供宿主細(xì)胞的細(xì)胞裂解物。此細(xì)胞裂解物可以包含本發(fā)明的羅漢果苷途徑酶，以及所述途徑的羅漢果醇、羅漢果醇和羅漢果苷前體和羅漢果苷產(chǎn)物。因此，所述細(xì)胞裂解物可用于回收羅漢果苷途徑的產(chǎn)物(例如羅漢果醇、羅漢果苷m4、m5和m6)或回收重組表達(dá)的酶多肽。提取活性酶多肽的方法是本領(lǐng)域眾所周知的。本發(fā)明的細(xì)胞裂解物也可以單獨(dú)或與其它合適的底物或酶組合用于無細(xì)胞細(xì)胞合成羅漢果醇、羅漢果醇或羅漢果苷前體和羅漢果苷。重組宿主本文獻(xiàn)的特征還在于重組宿主。如本文所用，術(shù)語重組宿主意指其基因組已通過至少一種并入的dna序列增強(qiáng)的宿主。并入的dna序列可以是編碼一種或多種多肽的異源核酸。此類dna序列包括但不限于不是天然存在的基因，通常不轉(zhuǎn)錄成rna或翻譯成蛋白(“表達(dá)”)的dna序列以及期望引入非重組宿主中的其它基因或dna序列。應(yīng)當(dāng)理解，通常通過穩(wěn)定引入一種或多種重組基因來增強(qiáng)本文所述的重組宿主的基因組。所述重組基因也可以是編碼一種或多種多肽的異源核酸。通常，引入的dna或異源核酸最初不存在于作為dna的受體的宿主中，但在本發(fā)明的范圍內(nèi)的是，從給定宿主分離dna區(qū)段并隨后將一個或多個額外拷貝的該dna引入同一宿主中，例如，以增強(qiáng)基因產(chǎn)物的產(chǎn)生或改變基因的表達(dá)模式。在一些情況下，引入的dna或異源核酸將通過例如同源重組或定點(diǎn)誘變來修飾或甚至替代內(nèi)源基因或dna序列。根據(jù)一個具體實(shí)施方案，所訴植物是葫蘆科的植物。下面提供了示例性物種。亞科翅子瓜亞科(zanonioideae)(小條紋花粉粒)?族zanonieaeo亞族fevilleinae:fevilleao亞族翅子瓜亞族(zanoniinae):alsomitra翅子瓜屬(zanonia)siolmatra睡布袋屬(gerrardanthus)zygosicyos碧雷鼓屬(xerosicyos)棒錘瓜屬(neoalsomitra)o亞族gomphogyninae:雪膽屬(hemsleya)棒瓜屬(gomphogyne)絞股藍(lán)屬(gynostemma)o亞族actinostemmatinae:假貝母屬(bolbostemma)合子草屬(actinostemma)o亞族sicydiinae:sicydiumchalemapteropeponpseudosicydiumcyclantheropsis亞科葫蘆亞科(花柱合并為單列)?族melothrieaeo亞族dendrosicyinae:kedrostisdendrosicyoscorallocarpus布袋屬(ibervillea)tumamocahalosicyosceratosanthesdoyereatrochomeriopsisseyrigiadieterlea葫蘆屬(cucurbitella)apodantheraguraniopsismelothrianthuswilbrandiao亞族guraniinae:helmontiapsiguriaguraniao亞族cucumerinae:melanciumcucumeropsisposadaea垂果瓜屬(melothria)muellarargia馬交兒屬(zehneria)黃瓜屬(cucumis)(包括:紅鈕子屬(mukia),dicaelospermum,cucumella,oreosyce和myrmecosicyos[4]).o亞族trochomeriinae:茅瓜屬(solena)trochomeriadactyliandractenolepsis?族裂瓜族(schizopeponeae):裂瓜屬(schizopepon)?族joliffieaeo亞族thladianthinae:藏瓜屬(indofevillea)羅漢果(siraitia)青牛膽屬(thladiantha)苦瓜屬(momordica)o亞族telfairiinae:telfaria?族trichosantheaeo亞族油渣果亞族(hodgsoniinae):油渣果屬(hodgsonia)o亞族ampelosicyinae:ampelosicyospeponiumo亞族trichosanthinae:金瓜屬(gymnopetalum)栝樓屬(trichosanthes)tricyclandrao亞族herpetosperminae:cephalopentandra三裂瓜屬(biswarea)波棱瓜屬(herpetospermum)三棱瓜屬(edgaria)?族benincaseaeo亞族benincasinae:cogniauxiaruthalicia葫蘆屬(lagenaria)冬瓜屬(benincasa)praecitrullus西瓜屬(citrullus)acanthosicyoseureiandrabambekeanothoalsomitra紅瓜屬(coccinia)雙輪瓜屬(diplocyclos)raphidiocystislemurosicyoszombitsia噴瓜屬(ecballium)歐洲甜瓜屬(bryonia)o亞族絲瓜亞族(luffinae):絲瓜屬(luffa)?族南瓜族(cucurbiteae)(具散孔的，多刺花粉):南瓜屬(cucurbita)sicanatecunumaniacalycophysumpeponopsisanacaonapolyclathraschizocarpumpenelopeiacionosicyos瀉瓜根屬(cayaponia)selysiaabobra?族sicyeae(毛狀蜜腺，4至10個孔溝的花粉粒)o亞族cyclantherinae:hanburiaechinopeponmarah刺瓜屬(echinocystis)vaseyanthusbrandegeaapatzinganiacremastopuselateriopsispseudocyclanthera辣子瓜屬(cyclanthera)rytidostyliso亞族sicyinae:刺果瓜屬(sicyos)sicyospermaparasicyosmicrosechium佛手瓜屬(sechium)sechiopsispterosicyos?地位未定:odosicyos屬的按字母順序排列：abobraacanthosicyos合子草屬(actinostemma)alsomitraampelosyciosanacaonaapatzinganiaapodantherabambekea冬瓜屬(benincasa)三裂瓜屬(biswarea)假貝母屬(bolbostemma)brandegea歐洲甜瓜屬(bryonia)calycophysum瀉瓜根屬(cayaponia)cephalopentandraceratosantheschalemacionosicyos西瓜屬(citrullus)紅瓜屬(coccinia)cogniauxiacorallocarpuscremastopusctenolepiscucumellacucumeropsis黃瓜屬(cucumis)南瓜屬(cucurbita)葫蘆屬(cucurbitella)辣子瓜屬(cyclanthera)dactyliandradendrosicyosdicaelospermumdieterlea雙輪瓜屬(diplocyclos)doyerea噴瓜屬(ecballium)刺瓜屬(echinocystis)echinopepon三棱瓜屬(edgaria)elateriopsiseureiandrafevillea睡布袋屬(gerrardanthus)棒瓜屬(gomphogyne)guraniaguraniopsis金瓜屬(gymnopetalum)絞股藍(lán)屬(gynostemma)halosicyoshanburiahelmontia雪膽屬(hemsleya)波棱瓜屬(herpetospermum)油渣果屬(hodgsonia)布袋屬(ibervillea)藏瓜屬(indofevillea)kedrostis葫蘆屬(lagenaria)lemurosicyos絲瓜屬(luffa)marahmelancium垂果瓜屬(melothria)melothrianthusmicrosechium苦瓜屬(momordica)muellerargia紅鈕子屬(mukia)myrmecosicyos棒錘瓜屬(neoalsomitra)nothoalsomitraodosicyosoreosyceparasicyospenelopeiapeponiumpeponopsispolyclathraposadaeapraecitrulluspseudocyclantherapseudosicydiumpsiguriapteropeponpterosicyosraphidiocystisruthaliciarytidostylisschizocarpum裂瓜屬(schizopepon)sechiopsis佛手瓜屬(sechium)selysiaseyrigiasicanasicydium刺果瓜屬(sicyos)sicyospermasiolmatra羅漢果(siraitia)茅瓜屬(solena)tecunumaniatelfairia青牛膽屬(thladiantha)栝樓屬(trichosanthes)tricyclandratrochomeriatrochomeriopsistumacocavaseyanthuswilbrandia碧雷鼓屬(xerosicyos)翅子瓜屬(zanonia)馬交兒屬(zehneria)zombitsiazygosicyos。葫蘆屬是指原產(chǎn)于并且最初栽培在安第斯山脈和中美洲的葫蘆科cucurbitaceae的屬。葫蘆種可能是馴化或非馴化的。示例性物種包括但不限于：?c.argyrosperma(同義詞c.mixta)–pipian,倭瓜南瓜(cushawpumpkin)；起源-巴拿馬，墨西哥oc.kellyana，起源-墨西哥西部的太平洋海岸oc.palmeri，起源-墨西哥西北部的太平洋海岸oc.sororia，起源-太平洋海岸墨西哥到尼加拉瓜，墨西哥東北部?c.digitata–手指葫蘆；起源-美國西南部，墨西哥西北部oc.californicaoc.cordataoc.cylindrataoc.palmata?c.ecuadorensis，起源-厄瓜多爾的太平洋海岸?c.ficifolia–黑子葫蘆，chilacayote；起源-墨西哥，巴拿馬，智利北部和阿根廷?c.foetidissima–臭葫蘆，水牛葫蘆；起源-墨西哥oc.scabridifolia，可能是c.foetidissima和c.pedatifolia的天然雜交物[67][68]?c.galeottii知之甚少；起源-瓦哈卡，墨西哥?c.lundelliana，起源-墨西哥，危地馬拉，伯利茲?c.maxima–冬季南瓜，南瓜；起源-阿根廷，玻利維亞，厄瓜多爾oc.andreana，起源-阿根廷?c.moschata–胡桃南瓜，'dickinson'南瓜，金色倭瓜；起源-玻利維亞，哥倫比亞，厄瓜多爾，墨西哥，巴拿馬，波多黎各，委內(nèi)瑞拉?c.okeechobeensis，起源-佛羅里達(dá)oc.martinezii，起源-墨西哥灣海岸和山麓丘陵?c.pedatifolia，起源-克雷塔羅，墨西哥oc.moorei?c.pepo–野南瓜，夏季南瓜，綠皮西葫蘆，西葫蘆，小胡瓜，小青南瓜；起源-墨西哥，美國oc.fraterna，起源-塔毛利帕斯和新萊昂，墨西哥oc.texana，起源-得克薩斯，usa?c.radicans–calabacilla,calabazadecoyote；起源-墨西哥中部oc.gracilior本發(fā)明的多肽、多核苷酸、細(xì)胞和方法可用于產(chǎn)生羅漢果苷vi。因此，根據(jù)一些實(shí)施方案，提供了富集羅漢果苷vi至至少10%(wt/wt)的羅漢果苷vi的總濃度的組合物。在一些實(shí)施方案中，特別是在產(chǎn)生羅漢果苷的重組細(xì)胞群體中，羅漢果苷mii和mv或mvi可以以顯著量一起發(fā)現(xiàn)。因此，根據(jù)一個實(shí)施方案，提供了包含羅漢果苷vi(m6)和羅漢果苷ii(m2)的組合物，和/或包含羅漢果苷v(m5)、vi(m6)和羅漢果苷ii(m2)的組合物。在一些實(shí)施方案中，特別是在異源表達(dá)本發(fā)明的一種或多種羅漢果醇生物合成途徑酶的重組細(xì)胞中產(chǎn)生包含羅漢果苷的組合物的情況下，所述組合物包含羅漢果苷m4、和/或m5和/或m6，以及包含至少一種編碼一種或多種羅漢果醇生物合成途徑酶的dna序列(所述dna序列缺乏至少一個內(nèi)含子)的dna。在一些實(shí)施方案中，所述序列是羅漢果醇生物合成途徑多肽的完整編碼序列的10％、20％、30％、40％、50％、60％或更多。在一些情況下，至少一種包含編碼序列的dna序列包含針對在重組宿主中表達(dá)優(yōu)化且核酸序列與天然(例如，羅漢果)序列的不同在于至少5％、至少10％、至少15％、至少20％或更多的編碼序列。在其中期望增強(qiáng)甜味的一些實(shí)施方案中，羅漢果苷vi或羅漢果苷v的濃度足以引起風(fēng)味增加，并且可以用作甜味劑。此組合物可以包含濃度為至少0.2ppm(例如，0.2-300ppm)或更多的羅漢果苷vi。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物是消耗性組合物。消耗品包括所有食物產(chǎn)品，包括但不限于谷類食品、稻米產(chǎn)品、木薯產(chǎn)品、西米產(chǎn)品、面包師產(chǎn)品、餅干產(chǎn)品、糕點(diǎn)產(chǎn)品、面包產(chǎn)品、糕點(diǎn)糖果產(chǎn)品、點(diǎn)心產(chǎn)品、樹膠、口香糖、巧克力、冰塊、蜂蜜產(chǎn)品、糖蜜產(chǎn)品、酵母產(chǎn)品、烘焙粉、鹽和香料產(chǎn)品、開胃產(chǎn)品、芥末產(chǎn)品、醋產(chǎn)品、醬料(調(diào)味品)、煙草產(chǎn)品、雪茄、香煙、加工食品、烹煮水果和蔬菜產(chǎn)品、肉類和肉產(chǎn)品、果膠、果醬、水果沙司、蛋產(chǎn)品、牛奶和乳產(chǎn)品、酸奶、奶酪產(chǎn)品、黃油和黃油替代產(chǎn)品、乳替代產(chǎn)品、大豆產(chǎn)品、食用油和脂肪產(chǎn)品、藥品、飲料、碳酸飲料、酒精飲料、啤酒、軟飲料、礦泉水和汽水和其它非酒精飲料、水果飲料、果汁、咖啡、人造咖啡、茶、可可，包括需要復(fù)原的形式、食物提取物、植物提取物、肉類提取物、調(diào)味品、甜味劑、營養(yǎng)保健品、明膠、藥物和非藥物膠、片劑、錠劑、滴劑、乳劑、酏劑、糖漿和用于制備飲料的其它制劑及其組合。本發(fā)明的羅漢果苷組合物可用于各種消耗品，包括但不限于水基消耗品、固體干性消耗品和乳制品、乳制品衍生產(chǎn)品和乳制品替代產(chǎn)品。在一些實(shí)施方案中，所述組合物是食物。水基消耗品包括但不限于飲料、水、水性飲料、增強(qiáng)/稍甜化的水飲料、礦泉水、碳酸飲料、非碳酸飲料、碳酸水、靜水、軟飲料、非酒精飲料、酒精飲料、啤酒、葡萄酒、酒、水果飲料、汁液、果汁、蔬菜汁、肉湯飲料、咖啡、茶、紅茶、綠茶、烏龍茶、草藥茶、可可茶(水基)、茶基飲料、咖啡基飲料、可可基飲料、糖漿、冷凍水果、冷凍果汁、水基冰、水果冰、果汁冰糕、醬料、沙拉醬、醬汁、湯和飲料植物材料(完整的或研磨的)或用于復(fù)原的速溶粉末(咖啡豆、研磨咖啡、速溶咖啡、可可豆、可可粉、速溶可可、茶葉、速溶茶粉)。在一些實(shí)施方案中，所述組合物可以是飲料諸如coca-cola?等。固體干性消耗品包括但不限于谷物、烘焙食品、餅干、面包、早餐谷物、谷物棒、乳制品、乳制品、能量棒/營養(yǎng)棒、格蘭諾拉麥片、蛋糕、曲奇、薄脆餅干、甜甜圈、松餅、糕點(diǎn)、糖果、口香糖、巧克力、軟糖、硬糖、棉花糖、壓片、休閑食品和植物材料(完整的或研磨的)以及如上所提及的用于復(fù)原的速溶粉末。對于水性或固體干性消耗品，有用濃度可以為0.2ppm(例如0.2-300ppm)或更多。在某些產(chǎn)品中，通常需要較高的甜味劑濃度以達(dá)到相似的甜度強(qiáng)度，例如在乳制品、乳制品衍生產(chǎn)品和乳制品替代產(chǎn)品中。乳制品衍生食品含有乳或乳蛋白。乳制品替代產(chǎn)品含有來自植物來源(大豆、稻米和其它富含蛋白的植物材料)的蛋白(而不是衍生自哺乳動物乳的乳蛋白)。乳制品、乳制品衍生產(chǎn)品和乳制品替代產(chǎn)品包括但不限于乳、流體乳、培養(yǎng)乳制品、培養(yǎng)和非培養(yǎng)的乳制品基飲料、用乳桿菌培養(yǎng)的培養(yǎng)的乳制品、酸奶、酸奶基飲料、光滑奶酪、印度奶昔、奶昔、酸乳、酸乳飲料、黃油乳、克非爾(kefir)、乳基飲料、乳/果汁共混物、發(fā)酵乳飲料、冰淇淋、甜點(diǎn)、酸奶油、蘸醬、沙拉醬、松軟干酪、冷凍酸奶、豆?jié){、米漿、大豆飲料、米漿飲料。乳包括但不限于全乳、脫脂乳、煉乳、蒸乳、減脂乳、低脂乳、脫脂乳和乳固體(可能是脂肪或非脂肪的)。對于乳制品、乳制品衍生產(chǎn)品和乳制品替代產(chǎn)品，有用的濃度為約0.3至500ppm或更高，并且可高達(dá)550ppm、600ppm、650ppm、700ppm或750ppm。本發(fā)明的組合物還可以包括一種或多種額外的風(fēng)味成分，諸如額外的甜味劑?？捎糜诒景l(fā)明的組合物的合適的風(fēng)味成分的非限制性列表包括蔗糖、果糖、葡萄糖、高果糖玉米糖漿、木糖、阿拉伯糖、鼠李糖、赤蘚醇、木糖醇、甘露糖醇、山梨糖醇、肌醇、acek、阿斯巴甜、紐甜、三氯蔗糖、糖精、柚皮苷二氫查耳酮(nardhc)、新橙皮苷二氫查耳酮(ndhc)、甜茶苷、萊鮑迪苷a、甜菊苷、甜葉菊和三葉苷。通常用于消耗品中的甜味劑包括：雪蓮果糖漿-天然甜味劑。如本文使用，術(shù)語“約”是指±10%。術(shù)語“包含(comprises)”、“包含(comprising)”、“包括(includes)”、“包括(including)”、“具有”及其詞形變化意指“包括但不限于”。術(shù)語“由……組成”意指“包括并限于”。術(shù)語“基本由……組成”意味著組成、方法或結(jié)構(gòu)可包括其它成分、步驟和/或部分，但只要其它成分、步驟和/或部分不實(shí)質(zhì)性地改變所要求保護(hù)的組成、方法或結(jié)構(gòu)的基本和新的特征。如本文使用，單數(shù)形式“一個/種(a)”、“一個/種(an)”和“所述/該(the)”包括復(fù)數(shù)指代物，除非文中另有明確規(guī)定。例如，術(shù)語“一種化合物”或“至少一種化合物”可包括多種化合物，包括其混合物。在整個本申請中，本發(fā)明的不同的實(shí)施方案可以范圍形式呈現(xiàn)。應(yīng)理解，范圍形式的描述僅出于方便和簡潔，不應(yīng)解釋為本發(fā)明范圍的不可變更的限制。因此，范圍的描述應(yīng)視為具體公開了所有可能的子范圍以及該范圍的各個數(shù)值。例如，范圍諸如1-6的描述應(yīng)視為具體公開了諸如1-3、1-4、1-5、2-4、2-6、3-6等子范圍，以及該范圍的各個數(shù)，例如1、2、3、4、5和6。其不論范圍寬度均適用。每當(dāng)本文規(guī)定數(shù)值范圍時，均意指包括該指定范圍內(nèi)的任何所述的數(shù)值(分?jǐn)?shù)或整數(shù))。短語第一標(biāo)示數(shù)字和第二標(biāo)示數(shù)字“之間的范圍”和“從”第一標(biāo)示數(shù)字“到”第二標(biāo)示數(shù)字“的范圍”在本文互換使用，意指包括第一標(biāo)示數(shù)字和第二標(biāo)示數(shù)字和其間的所有分?jǐn)?shù)和整數(shù)。如本文使用，術(shù)語“方法”是指用于完成給定任務(wù)的方式、手段、技術(shù)和程序，包括但不限于化學(xué)、藥理學(xué)、生物、生物化學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域從業(yè)人員已知或容易由他們從已知的方式、手段、技術(shù)和程序開發(fā)的方式、手段、技術(shù)和程序。當(dāng)提及特定的序列表時，此提及應(yīng)被理解為也包括基本上對應(yīng)于其互補(bǔ)序列的序列，包括由于例如測序錯誤、克隆錯誤或?qū)е聣A基取代、堿基缺失或堿基添加的其它改變而導(dǎo)致的次要序列變異，條件是此類變異的頻率為小于1/50個核苷酸，或者小于1/100個核苷酸，或者少于1/200個核苷酸，或者少于1/500個核苷酸，少于1/1000個核苷酸，或者，少于1/5,000個核苷酸，或者少于1/10,000個核苷酸。應(yīng)理解，為了清楚起見，在各個實(shí)施方案的背景下描述的本發(fā)明的某些特征，也可在單一實(shí)施方案中組合提供。相反，出于簡潔起見，在單一實(shí)施方案的背景下描述的本發(fā)明的不同特征，也可單獨(dú)提供或以任何合適的亞組合提供或適用于本發(fā)明的任何其它描述的實(shí)施方案。在不同實(shí)施方案的情況下描述的某些特征不視為所述實(shí)施方案的必需特征，除非該實(shí)施方案在無所述要素時是無效的。在下面的實(shí)施例中，提供對上文描述和隨附權(quán)利要求書部分要求保護(hù)的本發(fā)明的不同實(shí)施方案和方面的實(shí)驗(yàn)支持。實(shí)施例現(xiàn)在參照以下實(shí)施例，連同上文的描述，其以非限制性方式說明本發(fā)明的一些實(shí)施方案。一般而言，本文使用的命名和本發(fā)明中利用的實(shí)驗(yàn)室程序包括分子、生物化學(xué)、微生物和重組dna技術(shù)。文獻(xiàn)中全面闡釋了這樣的技術(shù)。參見例如"molecularcloning：alaboratorymanual"sambrook等人(1989)；"currentprotocolsinmolecularbiology"第i-iii卷,ausubel,r.m.編輯(1994)；ausubel等人,"currentprotocolsinmolecularbiology",johnwileyandsons,baltimore,maryland(1989)；perbal,"apracticalguidetomolecularcloning",johnwiley&sons,newyork(1988)；watson等人,"recombinantdna",scientificamericanbooks,newyork；birren等人(編輯)"genomeanalysis：alaboratorymanualseries",第1-4卷,coldspringharborlaboratorypress,newyork(1998)；如美國專利號4,666,828、4,683,202、4,801,531、5,192,659和5,272,057；"cellbiology：alaboratoryhandbook",第i-iii卷,cellis,j.e.編輯(1994)；“cultureofanimalcells–amanualofbasictechnique”freshney,wiley-liss,n.y.(1994)第三版；"currentprotocolsinimmunology"第i-iii卷,coliganj.e.編輯(1994)；stites等人(編輯),"basicandclinicalimmunology"(第8版),appleton和lange,norwalk,ct(1994)；mishell和shiigi(編輯),"selectedmethodsincellularimmunology",w.h.freemanandco.,newyork(1980)中所示的方法；可得的免疫測定法大量描述于專利和科學(xué)文獻(xiàn)中，參見例如美國專利號3,791,932、3,839,153、3,850,752、3,850,578、3,853,987、3,867,517、3,879,262、3,901,654、3,935,074、3,984,533、3,996,345、4,034,074、4,098,876、4,879,219、5,011,771和5,281,521，"oligonucleotidesynthesis"gait,m.j.編輯(1984)；“nucleicacidhybridization"hames,b.d.和higginss.j.,編輯(1985)；"transcriptionandtranslation"hames,b.d.和higginss.j.編輯(1984)；"animalcellculture"freshney,r.i.編輯(1986)；"immobilizedcellsandenzymes"irlpress,(1986)；"apracticalguidetomolecularcloning"perbal,b.,(1984)以及"methodsinenzymology"第1-317卷,academicpress；"pcrprotocols：aguidetomethodsandapplications",academicpress,sandiego,ca(1990)；marshak等人,"strategiesforproteinpurificationandcharacterization-alaboratorycoursemanual"cshlpress(1996)；其全部通過引用并入，如同在本文完全闡述一樣。在整個文件中提供其它一般參考文獻(xiàn)。其中的程序被視為是本領(lǐng)域中眾所周知的，并且為了方便讀者而提供。其中所含的全部信息通過引用并入本文。實(shí)驗(yàn)程序基因篩選為了鑒定可參與羅漢果苷生物合成的候選羅漢果基因，本發(fā)明人已經(jīng)進(jìn)行了正在發(fā)育的羅漢果果實(shí)的6個階段的詳細(xì)轉(zhuǎn)錄組分析。果實(shí)階段為果實(shí)成形后15、34、55、77、93、103天，其通過用通常用于生產(chǎn)單性結(jié)實(shí)的南瓜果實(shí)的商業(yè)果實(shí)成形激素(20ppmnaa萘乙酸，商業(yè)制劑alphatop,perelmanco.telaviv,israel)處理噴灑開花期雌花來完成。將正在發(fā)育的果實(shí)取樣，儲存于-80℃，并用于進(jìn)一步分析。從粉狀果實(shí)樣品提取rna，并根據(jù)制造商的指導(dǎo)，使用truseq?rna樣品制備試劑盒v2(illuminasandiego,california,usa)制備轉(zhuǎn)錄物。在伊利諾伊大學(xué)基因組研究中心(universityofillinoisgenomeresearchcenter)，使用illuminahiseq2500技術(shù)分析rna-seq文庫，并使用標(biāo)準(zhǔn)從頭組裝軟件包，將讀數(shù)組裝成轉(zhuǎn)錄物重疊群(contigs)。針對公共基因組數(shù)據(jù)庫，包括ncbi非冗余蛋白(nr)和葫蘆基因組數(shù)據(jù)庫諸如甜瓜基因組(https://melonomicsdotnet/)和黃瓜基因組(wwwdotcugidotorg)，注釋轉(zhuǎn)錄物。選擇注釋為參與羅漢果苷代謝的各種酶(角鯊烯環(huán)氧酶、葫蘆二烯醇合酶、環(huán)氧化物水解酶、細(xì)胞色素p450和udp葡萄糖葡糖基轉(zhuǎn)移酶)的候選基因的轉(zhuǎn)錄物，用于異源表達(dá)和功能分析。分析相同的果實(shí)樣品的羅漢果苷含量，以確定連續(xù)添加葡糖基的階段。組織取樣用于代謝概況分析組織制備-對于hplc，使用ikaa11研磨機(jī)，在液氮中，研磨新鮮或冷凍(-80℃)果實(shí)組織。然后，將600μl的甲醇：水(1:1)添加至200mg精細(xì)研磨的粉末，并將所得混合物渦旋30秒，超聲處理15分鐘并再次渦旋30秒。通過離心(20,000xg)并通過使用axiva注射器過濾器(ptfe，0.2μm)的過濾而凈化樣品的碎片。hplc-dad：在具有agilent1200二極管陣列檢測器(dad)的agilent1200hplc系統(tǒng)上進(jìn)行分析。分析柱：zorbaxstablebond-c18柱(4.6x150.0mm,5.0μm,agilenttechnologies,usa)。流動相含有a，含有0.1％甲酸的h2o；b，100％hplc級乙腈。該柱用80％a平衡，并且然后注入樣品，10分鐘后達(dá)到90％b梯度。流動相流速為1.5mlmin-1。通過與商業(yè)標(biāo)準(zhǔn)品共遷移并通過將每個核苷峰的譜與標(biāo)準(zhǔn)品的譜匹配來鑒定每種物質(zhì)。hplc-ms：在與agilent1290infinitydad和agilent6224精確質(zhì)量飛行時間(tof)質(zhì)譜(ms)聯(lián)用的agilent1290infinity系列液相色譜上進(jìn)行分析。分析柱為：zorbaxextend-c18rapidresolutionht柱(2.1x50.0mm,1.8μm,agilenttechnologies,waldbronn,germany)。使用配備有雙-噴霧器正交esi源(一個噴霧器用于分析流，并且一個用于參考化合物)的agilent6224accuratemasstoflc/ms系統(tǒng)(agilenttechnologies,santaclara,usa)進(jìn)行質(zhì)譜。流動相含有a，含有0.1％甲酸的h2o；b，100％hplc級乙腈。該柱用80％a平衡，然后注入樣品，10分鐘后達(dá)到90％b梯度。流動相流速為0.4mlmin-1。通過與商業(yè)標(biāo)準(zhǔn)品共遷移并通過將推定峰的質(zhì)譜與標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)譜匹配來鑒定每種物質(zhì)。色譜圖最初通過masshunter定性分析軟件v.b.05.00(agilent)進(jìn)行分析，并通過masshuntermassprofiler軟件v.b.05.00(agilent)進(jìn)一步分析。ugt表達(dá)和功能分析對于在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行的ugt表達(dá)，將所得質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌arcticexpress(agilent)中。為了表達(dá)ugt酶，將新鮮的過夜培養(yǎng)物在25ml含有50μg/ml卡那霉素和慶大霉素的lb培養(yǎng)基中1:100稀釋，并在37℃和250rpm下孵育，直到達(dá)到0.4的a600。隨后，添加iptg至0.5mm的濃度，并在18℃和250rpm下繼續(xù)孵育過夜。第二天，通過離心收獲細(xì)胞，并將沉淀重懸浮于2ml50mmtrishclph=7.0和5mmβ-巰基乙醇中。通過超聲處理破碎細(xì)胞后，通過離心除去不溶物質(zhì)，并將可溶性級分用于表征酶。將蛋白儲存在-20℃，直到進(jìn)一步分析。ugt測定：將底物(羅漢果苷)在50％dmso中溶解至1mm。使用8mmudp-木糖和0.1mm底物和25μl酶粗提取物，在50mmtrishclph=7.0和5mmβ-巰基乙醇中進(jìn)行酶測定(終體積為100μl的反應(yīng))。在30℃下孵育過夜后，通過添加300μl甲醇和0.1％甲酸來終止反應(yīng)。通過短暫渦旋來制備樣品。然后，將提取物以13,000rpm離心15分鐘并在lc-ms上分析。將產(chǎn)物與含有攜帶空pet28a的大腸桿菌的酶制備物的對照孵育進(jìn)行比較。實(shí)施例1：羅漢果苷積累的時間模式在羅漢果果實(shí)的發(fā)育期間的羅漢果苷積累顯示于圖4a和4b中。在冷凍粉末的甲醇提取物上進(jìn)行了果實(shí)成熟期間的羅漢果的羅漢果苷的靶向代謝概況分析，并通過具有光電二極管陣列和質(zhì)譜檢測的hplc進(jìn)行分析。結(jié)果揭示了其獨(dú)特的時間分布。羅漢果苷僅限于正在發(fā)育的果實(shí)，并且在根、莖或葉組織中沒有觀察到。在已經(jīng)分析的未成熟果實(shí)的最年輕階段，在15daa(開花后的天數(shù))，大多數(shù)羅漢果醇以二葡糖基化的形式存在，其中c-3和c-24羅漢果醇碳各自是單葡糖基化的。沒有觀察到非葡糖基化的、單葡糖基化的或替代的m2化合物，其中第二葡糖基部分作為主鏈葡萄糖部分之一上的支鏈葡萄糖存在，表明羅漢果苷葡糖基化的初始代謝步驟限于兩次主鏈葡糖基化，并且這些發(fā)生在果實(shí)發(fā)育早期。正在發(fā)展的小果實(shí)中的總體羅漢果苷水平在整個發(fā)育中保持相似，且沒有跡象表明羅漢果苷隨著發(fā)育的凈積累。這些結(jié)果表明羅漢果苷代謝的強(qiáng)烈時間分布，并且羅漢果醇合成的早期步驟和初始的主鏈葡糖基化限于早期果實(shí)發(fā)育，為后續(xù)的葡糖苷化準(zhǔn)備羅漢果苷的儲庫。在合成m2之后，在c24位置存在額外的支鏈1-6糖基化，導(dǎo)致m3x的積累。在后期階段(77和90daa)期間，出現(xiàn)了許多m4化合物，主要是通過nmr確認(rèn)為在c24位置的第三支鏈葡糖基化的賽門苷(siaminoside)。還存在替代的四葡糖基化的羅漢果苷，諸如m4a，但量小。在c3位置具有第二次葡糖基化的m5在77daa開始以m4化合物為代價積累，并在成熟的最后階段期間急劇增加。在成熟的103daa果實(shí)中，m5，以及小痕量的im5，占果實(shí)羅漢果苷組分的大多數(shù)。(圖4b)。因此，在分析的最年輕階段，已經(jīng)存在直至二葡糖基化的羅漢果醇m2的羅漢果苷代謝物的全部定員(fullcomplement)。然后進(jìn)行羅漢果苷合成的早期階段的候選基因的表達(dá)，特別包括角鯊烯環(huán)氧酶、環(huán)氧化物水解酶、葫蘆二烯醇合酶、cyp450和主鏈葡糖基化ugt。基因克隆與合成一般來說，合成基因訂購自gen9bio(cambridgema,usa)，并使用nhei和noti限制酶亞克隆至pet28a載體中，并通過測序驗(yàn)證插入物。以下實(shí)施例表明用于鑒定負(fù)責(zé)該途徑的基因的方法。實(shí)施例2：將羅漢果葫蘆二烯醇合酶(sgcds)鑒定為使2,3-單環(huán)氧角鯊烯和2,3;22,23-二環(huán)氧角鯊烯二者環(huán)化，分別產(chǎn)生葫蘆二烯醇和24,25-環(huán)氧葫蘆二烯醇的酶用于合成新型反式-c24,c25-二羥基葫蘆二烯醇的優(yōu)選底物是2,3;22,23-二環(huán)氧角鯊烯，其在角鯊烯分子的兩端，在角鯊烯的編號為c2,3和c22,23的位置對稱環(huán)氧化(圖3)。2,3;22,23-二環(huán)氧角鯊烯通過在角鯊烯代謝生物體(包括酵母菌株gil77)中普遍存在的酶角鯊烯環(huán)氧酶(sqe)合成。酵母菌株gil77是這樣的菌株之一，其中編碼羊毛甾醇合酶的酵母基因erg7是突變且非功能性的，由此使得2,3-環(huán)氧角鯊烯前體可用于葫蘆二烯醇合酶環(huán)化反應(yīng)，并允許合成葫蘆二烯醇。先前已經(jīng)對于南瓜物種cds基因(在shibuyam等人2004.tetrahedron60:6995-7003中被稱為cpq)顯示了這一點(diǎn)。盡管已知葫蘆二烯醇合酶可以將2,3環(huán)氧角鯊烯環(huán)化為葫蘆二烯醇(圖1)，但不知道其是否可以將2,3,22,23-二環(huán)氧角鯊烯環(huán)化為24,25-二環(huán)氧葫蘆二烯醇，這是在提出的羅漢果的羅漢果苷合成途徑中的關(guān)鍵中間體(圖2)。令人驚訝地，發(fā)現(xiàn)編碼葫蘆二烯醇合酶sgcds的羅漢果基因進(jìn)行2,3-環(huán)氧角鯊烯的環(huán)化(產(chǎn)生葫蘆二烯醇)和2,3;22,23-二環(huán)氧角鯊烯的環(huán)化(產(chǎn)生羅漢果醇合成途徑的關(guān)鍵底物，24,25-環(huán)氧葫蘆二烯醇)。如davidovich-rikanati等人(yeast.2015.32(1):103-114)中所述，在gil77酵母菌株中異源表達(dá)sgcds基因(序列g(shù)b/aem42982)。簡言之，培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的酵母，并通過用半乳糖代替葡萄糖碳源來誘導(dǎo)gal1啟動子。誘導(dǎo)2天后，在20%koh:50%etoh存在的情況下破壞酵母，并用己烷提取甾醇。所得細(xì)胞提取物使用apci中間相進(jìn)行l(wèi)c-tof-ms分析，且色譜圖呈現(xiàn)于圖6b中。由于內(nèi)源酵母erg1角鯊烯環(huán)氧酶活性，gil77對照培養(yǎng)物(圖6a)產(chǎn)生2,3-環(huán)氧角鯊烯(r.t.12.6)和2,3;22,23-二環(huán)氧角鯊烯(r.t9.0)。sgcds的表達(dá)(圖6b)不僅導(dǎo)致葫蘆二烯醇的積累，而且導(dǎo)致24,25-環(huán)氧葫蘆二烯醇(用于環(huán)氧化物水解酶的后續(xù)反應(yīng)的適當(dāng)?shù)孜?的積累。角鯊烯環(huán)氧酶已經(jīng)被報道進(jìn)行角鯊烯的單-和二-環(huán)氧化。這已經(jīng)顯示在動物系統(tǒng)(即，在膽固醇代謝中合成24,25-環(huán)氧膽固醇，nelsonja等人,jour.biol.chem.1981.256,1067-1068;baim,等人,bioch.biophys.res.comm.1992.185:323-329)和植物系統(tǒng)(即，rasberyjm等人,jour.biol.chem.2007.282:17002-17013)二者中發(fā)揮功能。為了鑒定可參與羅漢果醇生物合成的候選羅漢果角鯊烯環(huán)氧酶基因，進(jìn)行了正在發(fā)育的羅漢果果實(shí)的6個階段的詳細(xì)轉(zhuǎn)錄組分析。果實(shí)期為果實(shí)成形后的15、34、55、77、93和103天，并用于產(chǎn)生上述轉(zhuǎn)錄組和羅漢果苷代謝組。羅漢果轉(zhuǎn)錄組的數(shù)據(jù)挖掘?qū)е逻x擇出在結(jié)果實(shí)期間具有高和早期表達(dá)的2種候選角鯊烯環(huán)氧酶(重疊群16760和18561)(圖5a和5b)。這些角鯊烯環(huán)氧酶基因可以在酵母中被克隆并表達(dá)，所述酵母諸如如上所述除去內(nèi)源甾醇生物合成(gil77)的株系或缺乏內(nèi)源角鯊烯環(huán)氧酶erg1基因的酵母系，諸如rasberyjm等人(jour.biol.chem.2007.282:17002-17013)中所述，并測定產(chǎn)物的羅漢果醇前體2,3;24,25-二環(huán)氧角鯊烯的產(chǎn)生，所述2,3;24,25-二環(huán)氧角鯊烯然后可被環(huán)化成24,25-環(huán)氧葫蘆二烯醇，并繼續(xù)進(jìn)行羅漢果醇生物合成途徑。實(shí)施例3：催化羅漢果醇生物合成中24,25-環(huán)氧葫蘆二烯醇的水合的羅漢果環(huán)氧水合酶的鑒定為了鑒定可參與羅漢果醇生物合成的候選羅漢果環(huán)氧水合酶基因，進(jìn)行了正在發(fā)育的羅漢果果實(shí)的6個階段的詳細(xì)轉(zhuǎn)錄組分析。果實(shí)期為果實(shí)成形后的15、34、55、77、93和103天，并用于產(chǎn)生上述轉(zhuǎn)錄組和羅漢果苷代謝組。羅漢果轉(zhuǎn)錄組的數(shù)據(jù)挖掘?qū)е略诠麑?shí)發(fā)育早期具有高水平表達(dá)的4種候選環(huán)氧水合酶(重疊群73966、86123、102640和28382)的鑒定和分離(圖7和21-24)。環(huán)氧水合酶基因在gil77酵母中表達(dá)，且測定產(chǎn)物的從24,25-環(huán)氧葫蘆二烯醇(以前描述的sgcds反應(yīng)的產(chǎn)物)的24,25-二羥基葫蘆二烯醇的產(chǎn)生。圖8a和8b顯示在攜帶sgcds基因的gil77酵母菌株中的三種eph候選基因(編碼序列eph1-seqidno:17、eph2-seqidno:19和eph3-seqidno:21)的異源表達(dá)的效果。cmp1(峰)代表24,25-二羥基葫蘆二烯醇產(chǎn)物，且cmp3(峰)代表24,25-環(huán)氧葫蘆二烯醇底物。結(jié)果顯示，羅漢果sgeph基因的表達(dá)導(dǎo)致24,25-二羥基葫蘆二烯醇產(chǎn)物的量的大量增加(圖8b中顯示了通過峰下面積的定量顯示)。由于內(nèi)源酵母環(huán)氧化物水解酶活性，沒有sgeph基因的對照菌株也積累24,25-二羥基葫蘆二烯醇，但達(dá)到低得多的水平(gil77+sgcds)。圖9顯示在我們的轉(zhuǎn)錄組和基因組分析中鑒定的羅漢果的8種eph基因與tang等人(2011)報道且隨后在wo2014086842中用于產(chǎn)生四羥基角鯊烯的兩種eph序列(被鑒定為wo2014086842中的seqidno.38和40)之間的氨基酸序列同一性矩陣。因此，該實(shí)施例的結(jié)果顯示，在羅漢果轉(zhuǎn)錄組中鑒定為eph基因的基因能夠在角鯊烯二環(huán)氧化物的cds催化的環(huán)化之后，進(jìn)行新型反式-24,25二羥基化步驟。實(shí)施例4：葫蘆二烯醇11-水解酶的鑒定為了鑒定可參與羅漢果醇生物合成的候選羅漢果細(xì)胞色素p450基因，進(jìn)行了正在發(fā)育的羅漢果果實(shí)的6個階段的詳細(xì)轉(zhuǎn)錄組分析。果實(shí)期為果實(shí)成形后的15、34、55、77、93和103天，并用于產(chǎn)生上述轉(zhuǎn)錄組和羅漢果苷代謝組。羅漢果轉(zhuǎn)錄組表明，cyp450家族包含超過100個成員。基于同源性分析和表達(dá)模式的羅漢果轉(zhuǎn)錄組的數(shù)據(jù)挖掘得到在正在發(fā)育的果實(shí)中表達(dá)(圖10)且因此選擇用于功能性表達(dá)以測試其在葫蘆二烯醇存在的情況下的活性的約50種細(xì)胞色素cyp450同源物。為了測試候選p450在羅漢果醇生物合成中的可能參與并測試其功能，根據(jù)其推導(dǎo)的全長開放閱讀框合成所有候選物的核苷酸序列(gen9bio,cambridge,ma,usa)，并在酵母表達(dá)載體系統(tǒng)中克隆。將候選p450克隆至具有兩個多克隆位點(diǎn)(mcs)的雙重表達(dá)pesc-ura載體系統(tǒng)(agilenttechnologies)中，用于在半乳糖誘導(dǎo)型gal1和gal10啟動子下兩種基因的基因表達(dá)。將每個候選cyp引入mcs2，同時將sgcds克隆在mcs1中，并在誘導(dǎo)時產(chǎn)生葫蘆二烯醇。將所得質(zhì)粒轉(zhuǎn)移至源自酵母缺失項(xiàng)目保藏中心(brachmanncb等人yeast14(2):115-32)的釀酒酵母菌株by4743_yhr072(mata/αhis3δ1/his3δ1leu2δ0/leu2δ0lys2/lys2δ0met15δ0/met15ura3δ0/ura3δ0kanmax::erg7/erg7)，其對于羊毛甾醇合成酶erg7是雜合的(coreyej等人.procnatlacadsciusa91:2211-2215.)。為了通過提供質(zhì)子源來幫助p450活性，所有酵母都用攜帶擬南芥nadph細(xì)胞色素p450還原酶(atcpr1)的pesc-his載體轉(zhuǎn)化。培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的酵母，并通過用半乳糖代替葡萄糖碳源來誘導(dǎo)gal1啟動子，并如實(shí)施例2所述提取。所得細(xì)胞提取物使用apci中間相進(jìn)行l(wèi)c-tof-ms分析。轉(zhuǎn)化的酵母提取物的提取離子色譜圖顯示于圖11a-11c中。緊接于sgcds和atcrp1的重疊群102801的異源表達(dá)導(dǎo)致產(chǎn)生在8.25分鐘和8.3分鐘的兩種主要的洗脫化合物，其中根據(jù)其443.3883和441.3727的精確質(zhì)量，分別指定分子式為c30h50o2和c30h48o2(圖11a)。進(jìn)一步分離在8.3分鐘洗脫的主要產(chǎn)物，用于通過nmr進(jìn)行化學(xué)分析，以鑒定發(fā)現(xiàn)在葫蘆二烯醇的c11上的oh位置。沒有sgcds的相同重疊群的表達(dá)導(dǎo)致沒有新的化合物(圖11b)，表明編碼的酶作用于葫蘆二烯醇，而不是由酵母內(nèi)生產(chǎn)生的羊毛甾醇。實(shí)施例5：用于ugt測定的羅漢果苷前體底物的制備合成候選ugt基因序列(biogen9,cambridge,ma,usa)，并在大腸桿菌細(xì)胞中單獨(dú)表達(dá)基因。平行地，純化用于每種葡糖基化反應(yīng)的底物，包括羅漢果醇，m1-e1m2-a1，m2a，m3，m3x，賽門苷(siamenoside)，m4，m5(描繪于圖12中)。從商業(yè)羅漢果苷粉末純化這些底物(對于m4和以上的化合物，描述于vspchaturvedula,iprakash,journalofcarbohydratechemistry,201130:16-26doi:10.1080/07328303.2011.583511；并且其他羅漢果苷描述于saiprakashchaturvedulav.和prakashi.,iosrjournalofpharmacy.20122(4):2250-3013中)，或通過化學(xué)和酶促水解純化的m5并隨后通過hplc純化。主鏈葡糖基化為了鑒定負(fù)責(zé)羅漢果醇葡糖基化的ugt家族酶，在正在發(fā)育的果實(shí)中顯示表達(dá)(圖14)的羅漢果基因組中總共約160種ugt的接近100種基因(圖13a和13b)如上所述在大腸桿菌中功能表達(dá)。提取的重組酶用0.1mm10種底物(m、m1-e1、m2-a1、m2a、m2-e、m3x、m3、賽門苷、m4和m5)中每一種和8mmudp-葡萄糖作為葡萄糖供體進(jìn)行測定。篩選的總體結(jié)果呈現(xiàn)于圖16a-16c中的活性矩陣中。結(jié)果鑒定了嚴(yán)格進(jìn)行主鏈c3糖基化的三種基因，ugt家族的成員74、75和85(圖15a列a-d)。第四種基因ugt85e5(seqidno:33)是唯一鑒定的能夠嚴(yán)格進(jìn)行特異性c24主鏈葡糖基化的基因(圖15a，c1)。鑒定了ugt73家族的額外酶，其進(jìn)行c25葡糖基化或c24和c25葡糖基化的混合(圖15a，列e-g)，如通過nmr所鑒定。值得注意的是，ugt85-269-1不僅能夠進(jìn)行羅漢果醇的主鏈c-24葡糖基化，而且隨后還能夠進(jìn)行c-24-葡糖基化的羅漢果醇的c-3主鏈葡糖基化，因此本身負(fù)責(zé)二葡糖基化m2的合成。因此，ugt85-269-1酶當(dāng)與羅漢果醇，而不是m1-c3孵育時產(chǎn)生m1-c24和m2-c3，c24(圖15a，c2-3，圖16)。還可以在圖15a中看到，進(jìn)行主鏈c3葡糖基化的酶也能夠進(jìn)行該反應(yīng)，而與葡糖基化狀態(tài)c24無關(guān)，無論0、1、2還是3個葡萄糖部分占據(jù)該位置(圖15a，列a-d，行2-6)。分枝葡糖基化隨后的二級分枝糖基化通過單個ugt家族ugt94的三個成員進(jìn)行，ugt94對于分枝是特異性的，并且不進(jìn)行主鏈葡糖基化(圖15b列i、j、k；圖15c，列m、n、o)。三種ugt94酶顯示底物特異性和活性的差異，如圖15b和15c中所描繪。ugt94(289-3)和ugt94(289-1)似乎是最通用的，各自導(dǎo)致來自m4的五葡糖基化m5，而ugt94(289-2)似乎在其底物特異性方面最為有限。圖18顯示本文所述的每種基因和tang等人(2011)和wo2013/076577中描述的來自羅漢果的現(xiàn)有已知基因序列之間的相似性和同一性得分。使用以blosum62運(yùn)行的matgat2.02(www.bitincka.com/ledion/matgat/)確定矩陣。令人驚訝的是，在ugt94(289-3)與作為底物的m5的一些反應(yīng)中，我們觀察到m6產(chǎn)物(m/z1642.5)(圖17a)。此外，分枝酶ugt94(289-3)也能夠進(jìn)行分枝的連續(xù)反應(yīng)(圖19a)。當(dāng)m1a1與ugt74-345-2和ugt94-289-3兩者一起孵育時，我們觀察到m4產(chǎn)物。由于ugt94-289-3可以從m4底物產(chǎn)生m5，如圖15b中所描繪，不希望限于單一假設(shè)，如果提供足夠的底物和最佳反應(yīng)條件，ugt94-289-3可以進(jìn)行分枝反應(yīng)的完整陣列是可能的。令人驚訝的是，ugt85e5還顯示分枝活性，特別是對c-3主鏈葡萄糖的分枝活性(圖15b，列h))，并且其也可有助于途徑的分枝部分，使其成為羅漢果苷合成中的關(guān)鍵酶。總之，基于組合的代謝概況分析、功能表達(dá)和蛋白建模結(jié)果，以下羅漢果苷生物合成的代謝途徑是可想象的。在果實(shí)發(fā)育的初始階段期間，角鯊烯經(jīng)由角鯊烯合酶、角鯊烯環(huán)氧酶、葫蘆二烯醇合酶、環(huán)氧化物水解酶、細(xì)胞色素p450(cyp102801)和ugt85的進(jìn)行性作用，代謝為二葡糖基化的m2。在果實(shí)成熟期間，存在ugt94成員，并且可能還有ugt85的進(jìn)行性活性，向m2的主鏈葡糖基部分添加支鏈葡糖基，導(dǎo)致甜味的m4、m5和m6化合物。圖15a-15c中概述的各個反應(yīng)描述于以下各個實(shí)施例中。實(shí)施例6：ugt74-345-2催化在位置c3添加主鏈葡萄糖提供0.1mm糖苷配基羅漢果醇作為底物和8mmudp-葡萄糖作為糖供體的含有ugt74-345-2重組酶的反應(yīng)導(dǎo)致mi-e1的積累(圖15a-a1)，而含有0.1mmmi-a1作為底物的相同反應(yīng)導(dǎo)致mii-e的積累(圖15a-a2)。此外，在含有0.1mmm2-a1的反應(yīng)中，測量到m3x的積累，并且在含有mii-a的反應(yīng)中，觀察到m3的積累(圖16a-a4和a5)。此外，在miii-a1存在的情況下，產(chǎn)生賽門苷(圖16a-a6)。那些反應(yīng)的產(chǎn)物的分析指出ugt74-345-2進(jìn)行主鏈葡糖基化、將葡萄糖部分連接至羅漢果醇/羅漢果苷的c-3位置上的能力。ugt75-281-2催化在位置c3添加主鏈葡萄糖提供0.1mm糖苷配基羅漢果醇作為底物和8mmudp-葡萄糖作為糖供體的含有ugt75-281-2重組酶的反應(yīng)導(dǎo)致mi-e1的積累(圖15a-b1和圖16)，而含有0.1mmmi-a1作為底物的相同反應(yīng)導(dǎo)致mii-e的積累(圖15a-b2和圖16)。此外，在含有0.1mmm2-a1的反應(yīng)中，測量到m3x的積累，并且在含有mii-a的反應(yīng)中，觀察到m3的積累(圖15a-b4和b5)。那些反應(yīng)的產(chǎn)物的分析指出ugt75-281-2進(jìn)行主鏈葡糖基化、將葡萄糖部分連接至羅漢果醇/羅漢果苷的c-3位置上的能力。ugt85-269-1是一種混雜酶，并催化葡萄糖的主鏈和分枝添加使用0.1mmm、m1a1、m1e1、m2a1或m2a作為底物和8mmudp-葡萄糖作為糖供體，當(dāng)將ugt85-269-1重組酶加入反應(yīng)時，分別觀察到m1a1、m2e、m2e、m3x或m3的積累(圖16a-c1-c5和圖16)。因此，ugt85-269-1是來自羅漢果苷生物合成途徑的主鏈葡糖基轉(zhuǎn)移酶，并且能夠在羅漢果醇/羅漢果苷的c-3或c-24連接葡萄糖(葡糖基化)。給予m2e、m3、m3x或賽門苷作為底物，含有ugt269-1的反應(yīng)分別混合累積的推定m3-c3(1-6)、異羅漢果苷4和痕量的m4、m4a和異羅漢果苷5(圖15b-h1-h3和h4)。表明ugt85-269-1可以充當(dāng)來自羅漢果苷生物合成途徑的主鏈和分枝葡糖基轉(zhuǎn)移酶。ugt85-269-4催化在位置c3添加主鏈葡萄糖使用0.1mmm、m1a1m2a1或m2a作為底物和8mmudp-葡萄糖作為糖供體，當(dāng)將ugt85-269-4重組酶加入反應(yīng)時，分別觀察到m1e1、m2e、m3x或m3的積累(圖15a-d1-d5和圖16)。因此，ugt85-269-4是來自羅漢果苷生物合成途徑的主鏈葡糖基轉(zhuǎn)移酶，并且能夠在羅漢果醇的c-3位置連接葡萄糖(葡糖基化)。ugt73-251-5催化在位置c24或c25添加主鏈葡萄糖當(dāng)將ugt73-251-5重組酶加入含有0.1mm糖苷配基羅漢果醇作為底物和8mmudp-葡萄糖作為糖供體的反應(yīng)混合物時，觀察到m1-a1和m1-b的積累(圖15a-e1)，表明ugt73-251-5充當(dāng)c-24和c-25葡糖基轉(zhuǎn)移酶。ugt73-251-6催化在位置c25添加主鏈葡萄糖當(dāng)將ugt73-251-6重組酶加入含有0.1mm糖苷配基羅漢果醇作為底物和8mmudp-葡萄糖作為糖供體的反應(yīng)混合物時，觀察到m1-b的積累(圖15a-d1)，表明ugt73-348-2是c-25葡糖基轉(zhuǎn)移酶。ugt73-348-2催化在位置c24添加主鏈葡萄糖當(dāng)將ugt73-348-2重組酶加入含有0.1mm糖苷配基羅漢果醇作為底物和8mmudp-葡萄糖作為糖供體的反應(yīng)混合物時，觀察到m1-a1和m1-b的積累(圖15a-g1)，表明ugt73-348-2是c-24和c-25葡糖基轉(zhuǎn)移酶。ugt94-289-1催化將葡萄糖在1-6位分枝添加至c24和c3位的主鏈葡萄糖使用0.1mm羅漢果苷iie作為底物和8mmudp-葡萄糖作為糖供體，當(dāng)將ugt94-289-1重組酶加入反應(yīng)時，觀察到m3x的積累(圖15b-k1)。當(dāng)使用m3作為底物時，賽門苷和痕量的m4在反應(yīng)混合物中積聚(圖15b-k2)。最后，當(dāng)使用m4作為底物時，發(fā)現(xiàn)m5在反應(yīng)混合物中積累(圖15b-k4)。另外，當(dāng)加入m1a1、m2a1或m2a作為葡糖基化的底物時，分別積累m2a1、m3-a1和m3-a1(圖15c-o1、o3和o4)。因此，ugt94-289-1是來自羅漢果苷生物合成途徑的分枝葡糖基轉(zhuǎn)移酶，并且能夠在c-24和c-3葡糖基化的羅漢果苷上的(1-6)和(1-2)位置連接葡萄糖。ugt94-289-2催化將葡萄糖在1-6位分枝添加至c24位的主鏈葡萄糖使用0.1mm羅漢果苷iie作為底物和8mmudp-葡萄糖作為糖供體，當(dāng)將ugt94-289-2重組酶加入反應(yīng)時，觀察到m3x的積累(圖15b-j1)，而當(dāng)使用m3作為底物時，在反應(yīng)混合物中觀察到賽門苷的積累(圖15b-j2)。另外，當(dāng)加入m1a1或m2a作為葡糖基化的底物時，分別積累m2a1和m3-a1(圖15c-n1和n4)。因此，ugt94-289-2是來自羅漢果苷生物合成途徑的分枝葡糖基轉(zhuǎn)移酶，并且能夠在c-24葡糖基化的羅漢果苷上的(1-6)位置連接葡萄糖。ugt94-289-3是一種混雜酶，其催化將葡萄糖在1-6或1-2位分枝添加至c24和c3位的主鏈葡萄糖使用0.1mm羅漢果苷iie作為底物和8mmudp-葡萄糖作為糖供體，當(dāng)將ugt94-289-3重組酶加入反應(yīng)時，觀察到m3x的積累(圖15b-i1)。當(dāng)使用m3、m3xm4或賽門苷作為底物，分別在反應(yīng)混合物中發(fā)現(xiàn)賽門苷(具有痕量的m4)、具有賽門苷的m4a、m5，和m5(圖16b-i2-i5和圖20)。另外，當(dāng)加入m1a1、m1e1、m2a1或m2作為葡糖基化的底物時，分別積累m2a1、m2-a2、m3-a1和m3-a1(圖16c-m1-m4)。因此，ugt94-289-3是來自羅漢果苷生物合成途徑的分枝葡糖基轉(zhuǎn)移酶，并且能夠在c-24或c-3葡糖基化的羅漢果苷上的(1-6)和(1-2)位置連接葡萄糖。在ugt94-289-3與作為底物的m5的一些反應(yīng)中，我們觀察到m6產(chǎn)物(m/z1449.7113)(圖15b-i6和圖17a)。ugt73-327-2催化將葡萄糖在1-2位分枝添加至c3位的主鏈葡萄糖，以從m5產(chǎn)生m6發(fā)現(xiàn)酶ugt73-327-2催化羅漢果苷vi的生物合成的最后一步。當(dāng)將異源表達(dá)的ugt73-327-2蛋白添加至含有0.1mm羅漢果苷v和8mmudp-葡萄糖的反應(yīng)中，在反應(yīng)產(chǎn)物內(nèi)發(fā)現(xiàn)羅漢果苷vi，因此將ugt73-327-2指定為可能的(1-2)c-3-glu葡糖基轉(zhuǎn)移酶(圖15b-l6)。實(shí)施例7：ugt酶的系統(tǒng)發(fā)生樹使用以blosum62運(yùn)行的matgat2.02(www.bitincka(dot)com/ledion/matgat/)測定本文所述的每種基因和來自羅漢果的9種先前已知的基因序列之間的相似性和同一性得分。圖13a-b描述了當(dāng)前已知的ugt以及本發(fā)明的一些實(shí)施方案的新型ugt的系統(tǒng)發(fā)生樹。使用clustalx軟件使用默認(rèn)設(shè)置進(jìn)行比對。bootstrap值也使用clustalx軟件進(jìn)行(1000次迭代)。使用njplot軟件使樹可視化。樹枝上的數(shù)字顯示bootstrap比例，其為在復(fù)制數(shù)據(jù)集的分析中遇到那些組的頻率，因此提供了對那些組的支持索引。分枝的長度對應(yīng)于每個位點(diǎn)的取代數(shù)。盡管結(jié)合其具體實(shí)施方案描述了本發(fā)明，但顯然，許多替代方案、修改和變化對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言將是顯而易見的。因此，旨在包括落入隨附權(quán)利要求書的精神和寬泛范圍內(nèi)的所有這樣的替代方案、修改和變化。本說明書中提及的所有出版物、專利和專利申請通過引用全文并入本說明書，其程度如同各個出版物、專利或?qū)＠暾埦唧w且單獨(dú)指明通過引用并入本文一樣。另外，本申請中任何參考文獻(xiàn)的引用或鑒定不應(yīng)解釋為承認(rèn)這樣的參考文獻(xiàn)可作為本發(fā)明的現(xiàn)有技術(shù)獲得。在使用章節(jié)標(biāo)題的程度上，它們不應(yīng)解釋為必要限制性的。序列表<110>thestateofisrael,ministryofagriculture&ruraldevelopment,agriculturalresearchorganization(aro)(volcanicenter)itkin,maximrachel,davidovich-rikanatishahar,cohenvitaly,portnoyadi,doron-faigenboimmarina,petreikovshmuel,shenyaakov,tadmoryosef,burgerefraim,lewinsohnnurit,katzirschaffer,arthuraelad,oren<120>生產(chǎn)羅漢果苷的方法和包含其的組合物及其用途<130>63579<150>us62/048,924<151>2014-09-11<150>us62/089,929<151>2014-12-10<160>59<170>patentinversion3.5<210>1<211>1647<212>dna<213>羅漢果<400>1atggacgaaaattataattttttaaaagttcaaaccttcaatctcaagaaattcaacaaa60aattttccatcgcaacgacgccgttcacctgcaccaagtaactacttcatgtgtacttca120cttgctgaattccttccgtgtaaaacgtggttccagtttgtctcagcaatattctattta180aatggtccttcgcacgatttccaccatttgcctgctgcaccgggcggcgattccgacgga240agagagaagagccgatcgccggaaatggacgagacgacggtgaacggagggcggagagcg300agtgatgtggtggtgttcgctttcccgaggcacggccatatgagtccgatgctccaattc360tccaagcgtttggtctccaaaggcctccgcgtcacgtttctcatcaccacctctgcaact420gaatccctccgactaaatcttcctccctcttcttctctcgatcttcaagttatctccgac480gtccctgaaagtaacgacatcgcgacgctcgaagggtatcttcgaagcttcaaggccact540gtttccaaaaccttggcggatttcatcgacggaatcggaaatcctccaaagttcatcgtt600tacgattcggtcatgccgtgggtgcaggaggtagccagagggcgcggcctcgatgcggcg660ccgtttttcactcaatcgtccgccgttaatcacatcctcaatcatgtgtacggaggatct720ttgagcattccggccccggagaacacggcagtttcgcttccttcgatgccggttcttcaa780gccgaggatctgccggccttccccgacgacccagaagtggttatgaacttcatgaccagt840caattctccaatttccaggatgcaaaatggattttcttcaacacattcgatcagctggag900tgcaagaaacaaagtcaggttgttaattggatggccgacagatggcccatcaagacagtg960ggaccgaccattccatcggcatatttggacgacggtcggttggaggatgacagggcgttt1020ggtctgaatctcctaaaacctgaagatgggaagaacactaggcagtggcagtggttagac1080tcaaaagacactgcttctgtcctttatatttcatttggaagcttggctatcttacaagaa1140gaacaagtgaaggaactggcatatttcctcaaagac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