本發(fā)明涉及能夠生產(chǎn)O-磷酸絲氨酸的微生物，和利用該微生物生產(chǎn)O-磷酸絲氨酸、半胱氨酸或半胱氨酸衍生物的方法。
背景技術(shù)：
：L-半胱氨酸，一種在所有活生物體中的硫代謝中起重要作用的氨基酸，不僅用于諸如毛發(fā)角蛋白、谷胱甘肽、生物素、甲硫氨酸及其它含硫代謝物的生物蛋白的合成，而且用作輔酶A的生物合成前體。利用微生物生產(chǎn)L-半胱氨酸的已知方法包括：1)利用微生物將D,L-ATC生物轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)-半胱氨酸的方法、2)利用大腸桿菌(E.coli)通過直接發(fā)酵來生產(chǎn)L-半胱氨酸的方法(EP0885962B；WadaM和TakagiH,Appl.Microbiol.Biochem.,73:48-54,2006)、和3)利用微生物通過發(fā)酵生產(chǎn)O-磷酸絲氨酸(下稱“OPS”)并在O-磷酸絲氨酸硫化氫解酶(下稱“OPSS”)的催化作用下通過使OPS與硫化物反應(yīng)而將OPS轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)-半胱氨酸的方法(韓國(guó)專利號(hào)1381048)。具體而言，為了通過方法3)以高產(chǎn)率生產(chǎn)半胱氨酸，應(yīng)過量生產(chǎn)前體OPS。就此而言，發(fā)明人已做出大量努力以發(fā)現(xiàn)能夠?qū)PS生產(chǎn)微生物中生成的O-磷酸絲氨酸從細(xì)胞中順利地輸出的適當(dāng)輸出因子。公開內(nèi)容技術(shù)問題在這些情況下，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了兩種新型的生產(chǎn)OPS的多肽YhhS和MdtD，并證實(shí)可以通過激活這兩種多肽而從OPS生產(chǎn)微生物中有效地輸出OPS，從而完成本發(fā)明。技術(shù)方案因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供生產(chǎn)OPS的微生物，其中能夠輸出OPS的多肽的活性相比于其內(nèi)源活性被增強(qiáng)。本發(fā)明的另一目的是提供用于生產(chǎn)OPS的方法，包括：在培養(yǎng)基中培養(yǎng)OPS生產(chǎn)微生物，并從OPS生產(chǎn)微生物或其培養(yǎng)物中分離OPS。本發(fā)明的又一目的是提供通過該多肽的OPS生產(chǎn)或輸出的用途。本發(fā)明的又一目的是提供生產(chǎn)半胱氨酸或其衍生物的方法，包括：a)通過在培養(yǎng)基中培養(yǎng)OPS生產(chǎn)微生物(其中能夠輸出OPS的多肽的活性相比于其內(nèi)源活性被增強(qiáng))而生產(chǎn)OPS；和b)在OPS硫化氫解酶或能夠表達(dá)其的微生物的存在下，使a)中生產(chǎn)的OPS或含有其的培養(yǎng)物與硫化物反應(yīng)。發(fā)明的有利效果本發(fā)明的具有SEQIDNO:1或SEQIDNO:2的氨基酸序列的新型多肽具有優(yōu)越的OPS輸出能力。因此，當(dāng)將本發(fā)明的新型多肽應(yīng)用于能夠生產(chǎn)OPS的微生物時(shí)，其可以導(dǎo)致高產(chǎn)率的OPS生產(chǎn)，并且還可以有效地用于L-半胱氨酸的合成等。附圖描述圖1顯示了示例在從YhhS和MdtD蛋白的功能被增強(qiáng)的本發(fā)明的重組微生物的培養(yǎng)物中去除所有輸出的OPS后，通過高效液相色譜法(HPLC)得到的OPS胞內(nèi)水平測(cè)量結(jié)果的圖。最佳方式一方面，本發(fā)明提供了OPS生產(chǎn)微生物，其中具有SEQIDNO:1或SEQIDNO:2的氨基酸序列并且能夠輸出O-磷酸絲氨酸的多肽的活性相比于其內(nèi)源活性被增強(qiáng)。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“O-磷酸絲氨酸”(下稱“OPS”)是指絲氨酸和磷酸的酯，其是很多蛋白質(zhì)的成分。具體而言，OPS是L-半胱氨酸的前體，并且可以在OPS硫化氫解酶(以下稱為“OPSS”)的催化作用下通過與硫化物反應(yīng)而轉(zhuǎn)化成半胱氨酸(韓國(guó)專利號(hào)1381048)。因此，增加OPS生產(chǎn)是半胱氨酸生產(chǎn)中的重要因素，因此需要研發(fā)能夠使胞內(nèi)OPS從OPS生產(chǎn)菌株有效地分泌出來的轉(zhuǎn)運(yùn)體。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“具有輸出O-磷酸絲氨酸的活性的多肽”是指具有將細(xì)胞中的OPS輸出到細(xì)胞外的活性的膜蛋白，并且具體地可以是源自大腸桿菌的膜蛋白。在存在過量OPS的條件下，從消除了生長(zhǎng)抑制的大腸桿菌中鑒定出兩種膜蛋白。具體地，由此鑒定的具有OPS輸出能力的膜蛋白是具有SEQIDNO:1的氨基酸序列的YhhSMFS(主要促進(jìn)子超家族(majorfacilitatorsuperfamily))轉(zhuǎn)運(yùn)體和具有SEQIDNO:2的氨基酸序列的YegBMFS轉(zhuǎn)運(yùn)體。在本發(fā)明中，YegBMFS轉(zhuǎn)運(yùn)體可以與MdtD互換使用。該蛋白的OPS輸出能力本發(fā)明首次驗(yàn)證之前是未知的。此外，該多肽可以是由SEQIDNO:1或SEQIDNO:2表示的氨基酸序列，并且可非限制地包括與上述序列具有至少70％、具體地至少80％、更具體地至少90％、還更具體地至少95％的序列同源性的膜蛋白，只要其具有與該多肽基本上相同或相當(dāng)?shù)腛PS輸出能力。此外，顯而易見的是，其中部分序列被刪除、修飾、取代或插入的多肽變體應(yīng)被包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)，只要其是具有這些同源性和OPS輸出能力的氨基酸序列。此外，呈現(xiàn)OPS輸出能力的多肽的多核苷酸序列可包括編碼由SEQIDNO:1或SEQIDNO:2表示的氨基酸的多核苷酸序列。此外，基于遺傳密碼簡(jiǎn)并、考慮到有機(jī)體表達(dá)多肽所優(yōu)選的密碼子，可以在不改變多肽的氨基酸序列的范圍內(nèi)對(duì)編碼區(qū)進(jìn)行各種修飾。多核苷酸序列可以是由SEQIDNO:3或SEQIDNO:4表示的氨基酸序列，并且可包括與這些序列具有至少70％的序列同源性的核苷酸序列，但并不限于此。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“同源性”是指與給定多肽序列或多核苷酸序列的同一性的程度，并且可以以百分比表示。如本文所用，與給定多肽序列或多核苷酸序列具有相同或相似活性的同源序列可以以“％同源性”表示。％同源性可以利用用于計(jì)算參數(shù)如評(píng)分、同一性和相似性的標(biāo)準(zhǔn)軟件(即BLAST2.0)或者通過經(jīng)由southern雜交實(shí)驗(yàn)比較序列來確定，并且適當(dāng)?shù)南薅s交條件可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法來確定(例如，Sambrook等人，1989，見下文)。在本發(fā)明的示例性實(shí)施方式中，證實(shí)了在能夠生產(chǎn)OPS的微生物中的YhhS蛋白(SEQIDNO:1)或MdtD蛋白(SEQIDNO:2)的活性增強(qiáng)時(shí)，該微生物顯示具有比RhtB蛋白增強(qiáng)的菌株(韓國(guó)專利申請(qǐng)公開號(hào)10-2012-0041115)(陽(yáng)性對(duì)照)、或MFS轉(zhuǎn)運(yùn)體EmrD或YcaD的活性增強(qiáng)的菌株(實(shí)驗(yàn)組)更優(yōu)的OPS輸出能力。“RhtB”是膜蛋白，由rhtB基因編碼，其可以輸出高絲氨酸/高絲氨酸內(nèi)酯。由于已經(jīng)證實(shí)OPS生產(chǎn)菌株中RhtB活性的增強(qiáng)使該菌株中的OPS輸出能力增加(韓國(guó)專利號(hào)138104)，因此將其用作陽(yáng)性對(duì)照。當(dāng)在OPS生產(chǎn)菌株中分別增強(qiáng)RhtB蛋白以及本發(fā)明的YhhS和MdtD蛋白的活性時(shí)，RhtB蛋白以及本發(fā)明的YhhS和MdtD蛋白呈現(xiàn)相對(duì)于RhtB蛋白優(yōu)越的OPS輸出能力。此外，術(shù)語(yǔ)“EmrD”和“YcaD”是指大腸桿菌的MFS轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，并且分別由emrD基因和ycaD基因編碼。EmrD和YcaD——如YhhS和MdtD蛋白是屬于MFS轉(zhuǎn)運(yùn)體的蛋白——用作實(shí)驗(yàn)組，以檢驗(yàn)其它屬于MFS轉(zhuǎn)運(yùn)體的蛋白是否也可以呈現(xiàn)OPS輸出能力。結(jié)果證實(shí)，與YhhS和MdtD蛋白不同，EmrD和YcaD蛋白不呈現(xiàn)OPS輸出能力。同時(shí)，本發(fā)明的多肽具有OPS輸出能力，因而當(dāng)具有OPS生產(chǎn)能力的微生物中該多肽的活性與其內(nèi)源活性相比被增強(qiáng)時(shí)，可以有效地生產(chǎn)OPS。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“OPS生產(chǎn)”不僅指在菌株內(nèi)的OPS生產(chǎn)，而且還指將細(xì)胞中的OPS至細(xì)胞外(例如，至培養(yǎng)基)的輸出，和具體地，OPS從細(xì)胞內(nèi)部向外部的輸出。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“內(nèi)源活性”是指天然狀態(tài)下(即，在未經(jīng)修飾的狀態(tài)下)的微生物中的多肽的活性狀態(tài)。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“相比于其內(nèi)源活性增強(qiáng)”是指微生物中多肽與其天然狀態(tài)下所具有的活性相比時(shí)活性增加，并且其是包括在不具有具體多肽活性的微生物中賦予具體多肽活性的概念。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“活性增強(qiáng)”不僅指由于多肽本身的活性增加而獲取比原有功能更高的效果，而且指由于內(nèi)源基因活性增加、內(nèi)源基因通過內(nèi)部或外部因素?cái)U(kuò)增、啟動(dòng)子的置換、修飾或突變等而導(dǎo)致的蛋白質(zhì)活性增加(但不具體限制于此)。具體地，活性增強(qiáng)可以通過諸如下列的方法進(jìn)行：增加細(xì)胞中編碼多肽的基因的拷貝數(shù)的方法、對(duì)編碼多肽的基因的調(diào)控序列進(jìn)行修飾的方法、用突變基因取代染色體上編碼多肽的基因以增加該多肽的活性的方法、在染色體上的編碼多肽的基因中引入修飾以增強(qiáng)該多肽的活性的方法等，但并不限于此?？梢砸韵嗤姆绞絽⒄者@些活性增強(qiáng)方法來增強(qiáng)本發(fā)明的其它多肽的活性。在上述中，基因拷貝數(shù)的增加，盡管不具體限制于此，可以在可操作地連接至載體的狀態(tài)下或通過插入宿主細(xì)胞內(nèi)的染色體中而進(jìn)行。具體地，可以通過以下實(shí)施該方法：在宿主細(xì)胞中引入載體，通過該載體編碼本發(fā)明的蛋白質(zhì)的多核苷酸被可操作地連接至宿主細(xì)胞，并且可以復(fù)制并獨(dú)立于宿主發(fā)揮作用；或者在宿主細(xì)胞中引入與多核苷酸可操作地連接、能夠?qū)⒃摱嗪塑账岵迦胨拗骷?xì)胞的染色體中的載體。多核苷酸在染色體中的插入可以利用本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)行，例如通過同源重組。由于本發(fā)明的載體可以通過同源重組插入染色體中，因此可以進(jìn)一步包括用于確認(rèn)在染色體中的插入的選擇標(biāo)記物(selectionmarker)。選擇標(biāo)記物用于選擇轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，即，為了確認(rèn)靶多核苷酸是否已被插入，并且可以使用能夠提供可選表型(如耐藥性、營(yíng)養(yǎng)需求、細(xì)胞毒性試劑耐受性以及表面蛋白表達(dá))的標(biāo)記物，但并不限于此。在處理選擇劑的情況下，只有能夠表達(dá)選擇標(biāo)記物的細(xì)胞可以存活或表達(dá)其它表型性狀，因而轉(zhuǎn)化的細(xì)胞可以容易被選出。載體可以是DNA構(gòu)建體，其包含編碼目標(biāo)蛋白的多核苷酸的多核苷酸序列，可操作地連接至合適的調(diào)控序列，使得目標(biāo)蛋白可以在合適的宿主中表達(dá)。調(diào)控序列包括能夠啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子、用于調(diào)控轉(zhuǎn)錄的無規(guī)操縱子序列、編碼合適的mRNA核糖體結(jié)合域的序列、和用于調(diào)控轉(zhuǎn)錄和翻譯的序列。載體在被轉(zhuǎn)化到合適的宿主細(xì)胞中后可以獨(dú)立于宿主基因組復(fù)制或發(fā)揮作用，或者可被整合到宿主基因組本身中。本發(fā)明中所使用的載體可不受具體限制——只要該載體在宿主細(xì)胞中是可復(fù)制的，且可以使用本領(lǐng)域已知的任何載體。載體的實(shí)例可包括天然或重組質(zhì)粒、粘粒、病毒和噬菌體。例如，作為噬菌體載體或粘粒載體，可以使用pWE15、M13、λMBL3、λMBL4、λIXII、λASHII、λAPII、λt10、λt11、Charon4A、Charon21A等；并且作為質(zhì)粒載體，可以使用基于pBR、pUC、pBluescriptII、pGEM、pTZ、pCL、pET等的那些。具體地，可以使用pDZ、pACYC177、pACYC184、pCL、pECCG117、pUC19、pBR322、pMW118、pCC1BAC載體等。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)化”是指將包含編碼目標(biāo)蛋白的多核苷酸的載體引入宿主細(xì)胞，從而使該蛋白所編碼的多核苷酸能夠在宿主細(xì)胞中表達(dá)的過程。關(guān)于轉(zhuǎn)化的多核苷酸，無論是被插入宿主細(xì)胞的染色體并且定位于其中還是定位于染色體外都沒有關(guān)系，只要其可以在宿主細(xì)胞中表達(dá)。此外，多核苷酸包括編碼目標(biāo)蛋白的DNA和RNA。多核苷酸可以以任何形式插入，只要其可以被引入宿主細(xì)胞并在其中表達(dá)。例如，可以以表達(dá)盒的形式將多核苷酸引入宿主細(xì)胞中，所述表達(dá)盒是包括自我表達(dá)所需的所有必需元素的基因構(gòu)建體，但并不限于此。表達(dá)盒可常規(guī)地包括可操作地連接至多核苷酸的啟動(dòng)子、轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)、核糖體結(jié)合域和翻譯終止信號(hào)。表達(dá)盒可以是能夠自我復(fù)制的表達(dá)載體的形式。此外，多核苷酸可以被原樣引入宿主細(xì)胞中，并可操作地連接至其在宿主細(xì)胞中表達(dá)所必需的序列。此外，如本文所用，術(shù)語(yǔ)“可操作地連接”是指啟動(dòng)子序列(其啟動(dòng)和介導(dǎo)編碼本發(fā)明目標(biāo)蛋白的多核苷酸的轉(zhuǎn)錄)和上述基因序列之間的功能性連接。然后，用于增加多核苷酸表達(dá)的表達(dá)調(diào)控序列的修飾，盡管不具體受限于此，可以通過下列進(jìn)行：通過刪除、插入、保守取代、非保守取代或其組合，在多核苷酸序列中誘導(dǎo)變異，以進(jìn)一步增強(qiáng)表達(dá)調(diào)控序列的活性；或?qū)⒍嗪塑账嵝蛄杏没钚愿鼜?qiáng)的多核苷酸序列替代。表達(dá)調(diào)控序列，盡管不具體受限于此，可包括啟動(dòng)子、操縱子序列、編碼核糖體結(jié)合域的序列、和用于調(diào)控轉(zhuǎn)錄和翻譯的終止的序列等。強(qiáng)啟動(dòng)子，代替原有啟動(dòng)子，可以被連接至多核苷酸的表達(dá)單元的上端，但并不限于此。已知的強(qiáng)啟動(dòng)子的實(shí)例可包括cj1啟動(dòng)子(韓國(guó)專利號(hào)0620092)、lac啟動(dòng)子、trp啟動(dòng)子、trc啟動(dòng)子、tac啟動(dòng)子、λ噬菌體PR啟動(dòng)子、PL啟動(dòng)子和tet啟動(dòng)子。此外，染色體上多核苷酸序列的修飾，盡管不具體受限于此，可以通過下列進(jìn)行：通過刪除、插入、保守取代、非保守取代或其組合，在多核苷酸序列的表達(dá)調(diào)控序列上誘導(dǎo)變異，以進(jìn)一步增強(qiáng)多核苷酸序列的活性；或?qū)⒍嗪塑账嵝蛄杏没钚愿鼜?qiáng)的增強(qiáng)型多核苷酸序列替代?？傮w上，蛋白質(zhì)活性的引入和增強(qiáng)可以使相應(yīng)蛋白質(zhì)的活性或濃度相對(duì)于野生型蛋白質(zhì)的活性或濃度或在微生物菌株中增加至少1％、10％、25％、50％、75％、100％、150％、200％、300％、400％或500％至最高1000％或2000％，但并不限于此。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“OPS生產(chǎn)微生物”是指其中能夠生產(chǎn)OPS的原核或真核微生物菌株，并且具體地是指通過基因工程其中能夠聚積OPS的微生物。在本發(fā)明的示例性實(shí)施方式中，微生物并不受具體限制，但可以是SEQIDNO:1或2的多肽的活性增強(qiáng)時(shí)可以生產(chǎn)OPS的任何原核或真核微生物，并且具體地是原核微生物。微生物的實(shí)例可包括屬于埃希氏菌屬(genusEscherichia)、歐文氏菌屬(genusErwinia)、沙雷氏菌屬(genusSerratia)、普羅威登斯菌屬(genusProvidencia)、棒狀桿菌屬(genusCorynebacterium)和短桿菌屬(genusBrevibacterium)的微生物菌株。具體地，微生物可以是埃希氏菌屬微生物。更具體地，其可以是大腸桿菌。具體地，埃希氏菌屬或棒狀桿菌屬微生物可生產(chǎn)OPS和L-絲氨酸，因?yàn)槠浜蠸erA、SerC和SerB蛋白——這些是L-絲氨酸的生物合成途徑中的酶(AhmedZahoor,ComputationalandStructuralBiotechnologyJournal,vol.3,2012年10月；WendischVF等,CurrOpinMicrobiol.2006年6月；9(3):268-74；Peters-WendischP等,ApplEnvironMicrobiol.2005年11月；71(11):7139-44)。此外，在OPS生產(chǎn)微生物中，磷酸絲氨酸磷酸酶(SerB)的活性可以相比于其內(nèi)源活性被進(jìn)一步減弱。SerB具有將OPS轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)-絲氨酸的活性，因而經(jīng)修飾以降低SerB活性的微生物具有在其中聚積OPS的性質(zhì)，因此可用于生產(chǎn)OPS。SerB可以是具有由SEQIDNO:17或SEQIDNO:18表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，但并不限于此。此外，SerB可包括具有80％或更高，具體地90％或更高，更具體地95％或更高，甚至更具體地99％或更高的序列同一性的氨基酸序列——只要其顯示出SerB活性，但并不限于此。此外，編碼SerB的多核苷酸序列可具有編碼由SEQIDNO:17或SEQIDNO:18表示的氨基酸的多核苷酸序列。基于遺傳密碼簡(jiǎn)并、考慮到生物體表達(dá)多肽所優(yōu)選的密碼子，可以在不改變多肽的氨基酸序列的范圍內(nèi)對(duì)編碼區(qū)域進(jìn)行多核苷酸的各種修飾。多核苷酸序列可以是由SEQIDNO:19或SEQIDNO:20表示的氨基酸序列，并且可包括與這些序列具有80％并且具體地至少90％的序列同源性的核苷酸序列，但并不限于此。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“相比于其內(nèi)源活性減弱”是指蛋白質(zhì)活性與其天然狀態(tài)下所具有的活性相比時(shí)降低，并且還包括其活性被消除時(shí)。減弱是指代以下情形的概念：蛋白質(zhì)的活性由于蛋白質(zhì)編碼基因中的修飾等而相比于微生物原有蛋白質(zhì)活性降低時(shí)的情形、整體蛋白質(zhì)表達(dá)水平由于其編碼基因的表達(dá)抑制或翻譯抑制而低于微生物的天然菌株的水平時(shí)的情形、或基因完全不表達(dá)時(shí)的情形、和基因表達(dá)但不呈現(xiàn)活性時(shí)的情形。蛋白質(zhì)活性的減弱或失活可以通過本領(lǐng)域公知的各種方法實(shí)現(xiàn)。方法的實(shí)例可包括利用突變基因取代染色體上編碼蛋白質(zhì)的基因以使酶活性可以降低的方法(包括消除蛋白質(zhì)活性時(shí)的情形)；對(duì)編碼蛋白質(zhì)的基因的表達(dá)調(diào)控序列進(jìn)行修飾的方法；將染色體上編碼蛋白質(zhì)的基因的部分或全部刪除的方法；引入反義寡核苷酸(如反義RNA)的方法，該反義寡核苷酸通過與染色體上的基因的轉(zhuǎn)錄子互補(bǔ)結(jié)合來抑制mRNA向蛋白質(zhì)的翻譯；使核糖體不能附接的方法——通過將Shine-Dalgarno(SD)序列及其互補(bǔ)序列人工添加在編碼蛋白質(zhì)的基因的SD序列的前端而形成二級(jí)結(jié)構(gòu)；逆轉(zhuǎn)錄工程(RTE)方法——添加啟動(dòng)子從而在相應(yīng)序列的開放閱讀框(ORF)的3’端進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，等等，并且還包括其組合，但并不限于此。具體地，將編碼蛋白質(zhì)的基因的部分或全部刪除的方法可以通過如下進(jìn)行：利用將染色體插入細(xì)菌的載體，用具有部分地刪除的核酸序列的多核苷酸或標(biāo)記基因替代染色體內(nèi)編碼內(nèi)源目標(biāo)蛋白的多核苷酸。在示例性實(shí)施方式中，可以通過同源重組來刪除基因。此外，如本文所用，術(shù)語(yǔ)“部分”，雖然其可以根據(jù)多核苷酸種類而相異，可以具體指代1個(gè)核苷酸至300個(gè)核苷酸，更具體地1個(gè)核苷酸至100個(gè)核苷酸，甚至更具體地1個(gè)核苷酸至50個(gè)核苷酸，但并不限于此。此外，對(duì)表達(dá)調(diào)控序列進(jìn)行修飾的方法可以通過如下進(jìn)行：經(jīng)由刪除、插入、保守取代、非保守取代或其組合，在表達(dá)調(diào)控序列中誘導(dǎo)變異，從而進(jìn)一步減弱表達(dá)調(diào)控序列的活性；或?qū)⑿蛄杏没钚暂^弱的核酸序列替代。表達(dá)調(diào)控序列包括啟動(dòng)子、操縱子序列、編碼核糖體結(jié)合域的序列和用于調(diào)控轉(zhuǎn)錄和翻譯的序列。此外，對(duì)基因序列進(jìn)行修飾的方法可以通過如下進(jìn)行：經(jīng)由刪除、插入、保守取代、非保守取代或其組合，在基因序列中誘導(dǎo)變異，從而進(jìn)一步減弱蛋白質(zhì)的活性；或?qū)⑿蛄杏酶牧己缶哂休^弱活性的基因序列或改良后完全不具有活性的基因序列替代。此外，OPS生產(chǎn)微生物可以是其中磷酸甘油酸脫氫酶(SerA)或磷酸絲氨酸轉(zhuǎn)氨酶(SerC)的活性相比于其內(nèi)源活性進(jìn)一步增強(qiáng)的微生物。SerA是能夠?qū)?-磷酸甘油酸轉(zhuǎn)化為3-磷酸-羥基丙酮酸的蛋白質(zhì)，并且關(guān)于SerA，可以使用野生型、或絲氨酸反饋被消除的變體。此外，SerC是能夠?qū)?-磷酸-羥基丙酮酸轉(zhuǎn)化為OPS的蛋白質(zhì)。因此，SerA和/或SerC活性增強(qiáng)的任何微生物都可以有效地用作OPS生產(chǎn)微生物。SerA可具有選自SEQIDNO:21至26的氨基酸序列，但并不限于此。SEQIDNO:21是野生型SerA的序列，而SEQIDNO:22至26是絲氨酸反饋被消除的變體的序列。此外，可以包括與上述氨基酸具有至少80％，具體地至少90％，更具體地至少95％，甚至更具體地至少99％的序列同一性的那些氨基酸序列，只要其呈現(xiàn)野生型SerA或絲氨酸反饋被消除的SerA變體的活性，但并不限于此。反饋被消除的變體是這樣的蛋白質(zhì)：其中通過插入、取代等，將修飾引入SerA編碼基因上，從而能夠維持通過絲氨酸或甘氨酸的反饋抑制而帶來的活性，或增強(qiáng)其活性，并且反饋被消除的那些變體已經(jīng)公知(GrantGA等,J.Biol.Chem.,39:5357-5361,1999；GrantGA等,Biochem.,39:7316-7319,2000；GrantGA等,J.Biol.Chem.,276:17844-17850,2001；Peters-WendischP等,Appl.Microbiol.Biotechnol.,60:437-441,2002；歐洲專利號(hào)EP0943687B)。此外，編碼野生型SerA或絲氨酸反饋被消除的變體的多核苷酸序列可以是編碼由SEQIDNO:21至26表示的任一氨基酸序列的多核苷酸序列，但并不限于此。由于遺傳密碼簡(jiǎn)并或考慮到生物體表達(dá)多肽所優(yōu)選的密碼子，可以在不改變多肽的氨基酸序列的范圍內(nèi)對(duì)編碼區(qū)進(jìn)行多核苷酸的各種修飾。例如，多核苷酸序列可以是由SEQIDNO:27至32表示的多核苷酸序列中的任一個(gè)，并且可具有與該多核苷酸序列具有至少80％，具體地至少90％的同源性的核苷酸序列，但并不限于此。SerC可以是具有例如由SEQIDNO:33表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，但并不限于此。此外，氨基酸序列，只要其呈現(xiàn)SerC活性，也可包括與上述氨基酸序列具有至少80％，具體地至少90％，更具體地至少95％，甚至更具體地至少99％的序列同一性的氨基酸序列，但并不限于此。此外，編碼SerC的多核苷酸序列可以是編碼由SEQIDNO:33表示的氨基酸的多核苷酸序列。由于遺傳密碼簡(jiǎn)并或考慮到生物體表達(dá)多肽所優(yōu)選的密碼子，可以在不改變多肽的氨基酸序列的范圍內(nèi)對(duì)編碼區(qū)進(jìn)行多核苷酸的各種修飾。例如，多核苷酸序列可以是由SEQIDNO:34表示的多核苷酸序列，并且可具有與該多核苷酸序列具有至少80％，具體地至少90％的同源性的核苷酸序列，但并不限于此。此外，微生物可以是其中將OPS引入或分解到細(xì)胞中的能力被進(jìn)一步減弱的微生物。關(guān)于OPS生產(chǎn)微生物的內(nèi)容，除了上述那些之外，韓國(guó)專利號(hào)1381048或美國(guó)專利申請(qǐng)公開號(hào)2012-0190081中的公開內(nèi)容也可以用作本發(fā)明的參考。另一方面，本發(fā)明提供生產(chǎn)OPS的方法，包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)能夠生產(chǎn)O-磷酸絲氨酸的微生物——其中具有SEQIDNO:1或SEQIDNO:2的氨基酸序列并且能夠輸出O-磷酸絲氨酸的多肽的活性被增強(qiáng)；和從能夠生產(chǎn)O-磷酸絲氨酸的微生物或其培養(yǎng)基中分離O-磷酸絲氨酸。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“培養(yǎng)”是指使微生物在適當(dāng)調(diào)節(jié)的環(huán)境中生長(zhǎng)。培養(yǎng)過程可以根據(jù)適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基和本領(lǐng)域已知的培養(yǎng)條件來進(jìn)行。培養(yǎng)過程可以容易被本領(lǐng)域普通技術(shù)人員根據(jù)所要選擇的菌株調(diào)整使用。具體地，培養(yǎng)可以是分批培養(yǎng)、連續(xù)培養(yǎng)和補(bǔ)料分批培養(yǎng)(fetchculture)，但并不限于此。在培養(yǎng)SerB活性相比于其內(nèi)源活性降低的重組微生物時(shí)，培養(yǎng)基可以進(jìn)一步含有甘氨酸或絲氨酸，因?yàn)橹亟M微生物的絲氨酸需求被誘導(dǎo)。甘氨酸可以以純化的甘氨酸、含甘氨酸的酵母提取物或胰蛋白胨的形式提供。培養(yǎng)基中的甘氨酸濃度總體上為0.1g/L至10g/L，具體為0.5g/L至3g/L。此外，絲氨酸可以以純化的絲氨酸、含絲氨酸的酵母提取物或胰蛋白胨的形式提供。培養(yǎng)基中的絲氨酸濃度總體上為0.1g/L至5g/L，具體為0.1g/L至1g/L。培養(yǎng)基中包含的碳源的實(shí)例可包括碳水化合物和糖類，如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麥芽糖、淀粉和纖維素；油和脂肪，如大豆油、葵花油，蓖麻油和椰子油；脂肪酸，如棕櫚酸、硬脂酸和亞油酸；醇，如甘油和乙醇；和有機(jī)酸，如乙酸。這些碳源可以單獨(dú)使用或組合使用，但并不限于此。培養(yǎng)基中包含的氮源的實(shí)例可包括有機(jī)氮源，如蛋白胨、酵母提取物、肉汁、麥芽提取物、玉米漿(CSL)和豆粉；和無機(jī)氮源，如尿素、硫酸銨、氯化銨、磷酸銨、碳酸銨和硝酸銨。這些氮源可以單獨(dú)使用或組合使用，但并不限于此。作為磷源，培養(yǎng)基可進(jìn)一步包括磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀和相應(yīng)的含鈉鹽，但并不限于此。培養(yǎng)基可包括金屬，如硫酸鎂和硫酸鐵。此外，可包括氨基酸、維生素和適當(dāng)?shù)那绑w。這些培養(yǎng)基或前體可以被添加至以分批培養(yǎng)或連續(xù)培養(yǎng)的形式的培養(yǎng)中，但并不限于此。此外，培養(yǎng)物的pH可以通過以適當(dāng)?shù)姆绞皆谂囵B(yǎng)期間添加諸如氫氧化銨、氫氧化鉀、氨、磷酸和硫酸的化合物來調(diào)節(jié)。此外，可以利用諸如脂肪酸聚乙二醇酯的消泡劑來防止培養(yǎng)期間氣泡形成。此外，可以向培養(yǎng)物中添加氧氣或含有氧氣的氣體以維持培養(yǎng)液中的有氧條件；可不添加空氣以維持厭氧條件或微氧條件；或者可以注入氮?dú)?、氫氣或二氧化碳。培養(yǎng)溫度可以為27℃至37℃，具體地30℃至35℃。可以持續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)直至可實(shí)現(xiàn)期望物質(zhì)的生產(chǎn)，具體為10小時(shí)至100小時(shí)。在本發(fā)明中，可以進(jìn)一步分離和純化培養(yǎng)期間生產(chǎn)的OPS。根據(jù)培養(yǎng)方法，如分批培養(yǎng)、連續(xù)培養(yǎng)和補(bǔ)料分批培養(yǎng)，可以利用本領(lǐng)域已知的適當(dāng)方法從培養(yǎng)物中回收目標(biāo)OPS，但并不限于此。另一方面，本發(fā)明提供了通過具有SEQIDNO:1或SEQIDNO:2的氨基酸序列的多肽得到的OPS生產(chǎn)和OPS輸出的用途。又一方面，本發(fā)明提供了生產(chǎn)半胱氨酸或其衍生物的方法，包括a)通過在培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物來生產(chǎn)O-磷酸絲氨酸(OPS)，該微生物中具有SEQIDNO:1或SEQIDNO:2的氨基酸序列并且能夠輸出O-磷酸絲氨酸的多肽的活性相比于其內(nèi)源活性被增強(qiáng)；和b)在O-磷酸絲氨酸硫化氫解酶(OPSS)或能夠表達(dá)其的微生物的存在下，使a)中生成的O-磷酸絲氨酸(OPS)或含有其的培養(yǎng)物與硫化物反應(yīng)。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“O-磷酸絲氨酸硫化氫解酶”(下稱“OPSS”)是指催化其中向OPS提供巰基(SH)以使OPS轉(zhuǎn)化為半胱氨酸的反應(yīng)的多肽。此酶在Aeropyrumpernix、結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)、恥垢分枝桿菌(Mycobacteriumsmegmatics)和陰道毛滴蟲(Trichomonasvaginalis)中被首先發(fā)現(xiàn)(MinoK和IshikawaK,FEBSLetters,551:133-138,2003；BurnsKE等,J.Am.Chem.Soc.,127:11602-11603,2005)。此外，OPSS的范圍不僅包括野生型OPSS蛋白，而且包括在編碼OPSS的多核苷酸序列部分中包括刪除、取代或添加，顯示等于或高于野生型OPSS蛋白生物活性的活性的變體，例如，包括韓國(guó)專利號(hào)1381048和1208267中公開的OPSS蛋白及其變體。本發(fā)明中所使用的硫化物可以是任何硫化物——不僅有以本領(lǐng)域常用的固體形式提供的硫化物，而且有因pH、壓力和溶解度差異而以液體或氣體形式提供的硫化物，因而可以以例如硫化物(S2-)或硫代硫酸鹽(S2O32-)的形式轉(zhuǎn)化為巰基(SH)。具體地，本發(fā)明中所使用的硫化物可以是Na2S、NaSH、H2S、(NH4)2S或Na2S2O3，其可以為OPS提供巰基。在反應(yīng)中，一個(gè)巰基被供應(yīng)至一個(gè)反應(yīng)性O(shè)PS基團(tuán)以產(chǎn)生一個(gè)半胱氨酸或其衍生物。在反應(yīng)中，具體地，硫化物的添加量為0.1mol至3mol，具體地1mol至2mol——每1molOPS。此外，本發(fā)明的方法進(jìn)一步包括將步驟b)的反應(yīng)中生成的半胱氨酸分離和純化。在此，可以通過本領(lǐng)域已知的適當(dāng)反應(yīng)從反應(yīng)溶液中分離和純化半胱氨酸來回收期望的半胱氨酸。此外，本發(fā)明涉及通過增強(qiáng)OPS生產(chǎn)微生物中SEQIDNO:1或SEQIDNO:2的多肽的活性而實(shí)現(xiàn)的高產(chǎn)率OPS生產(chǎn)，然后使由此生產(chǎn)的OPS與OPSS反應(yīng)，從而有效地生產(chǎn)半胱氨酸。由此制備的半胱氨酸可以通過本領(lǐng)域已知的化學(xué)合成反應(yīng)來合成各種半胱氨酸衍生物——通過修飾氫原子或具體的原子基團(tuán)。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“衍生物”是指通過化學(xué)修飾任何化合物的一部分而獲得的類似化合物。通常，該術(shù)語(yǔ)是指其中氫原子或原子基團(tuán)被另一氫原子或原子基團(tuán)取代的化合物。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“半胱氨酸衍生物”是指其中半胱氨酸的氫原子或原子基團(tuán)被另一個(gè)原子或原子基團(tuán)取代的化合物。例如，半胱氨酸衍生物可具有如下形式：其中半胱氨酸中的胺基(-NH2)的氮原子或巰基(-SH)的硫原子附接有另一原子或原子基團(tuán)。半胱氨酸衍生物的實(shí)例包括N-乙?；腚装彼?NAC)、S-羧甲基半胱氨酸(SCMC)、Boc-Cys(Me)-OH、(R)-S-(2-氨基-2-羧乙基)-L-高半胱氨酸、(R)-2-氨基-3-磺基丙酸、D-2-氨基-4-(乙基硫)丁酸、3-亞磺基-L-丙氨酸、Fmoc-Cys(Boc-甲基)-OH、硒-L-半胱氨酸、S-(2-噻唑基)-L-半胱氨酸、S-(2-噻吩基)-L-半胱氨酸、S-(4-甲苯基)-L-半胱氨酸，但并不限于此。半胱氨酸通過與乙?；噭┓磻?yīng)可容易合成N-乙?；腚装彼?NAC)，并且在堿性條件下，其可通過與鹵代乙酸反應(yīng)合成S-羧甲基半胱氨酸(SCMC)。這些半胱氨酸衍生物主要用作鎮(zhèn)咳劑、止咳劑和支氣管炎、支氣管哮喘、喉咽炎治療劑等的藥用材料。發(fā)明方式下文將參考以下實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更詳細(xì)地描述。然而，這些實(shí)施例僅以示例為目的，并不意圖本發(fā)明受限于這些實(shí)施例。實(shí)施例1：YhhSMFS轉(zhuǎn)運(yùn)體和YegBMFS轉(zhuǎn)運(yùn)體的鑒定為了鑒定OPS輸出涉及的大腸桿菌膜蛋白，對(duì)大腸桿菌K12_W3110(ATCC27325)的基因組DNA文庫(kù)進(jìn)行篩選。具體地，為建立OPS抑制大腸桿菌生長(zhǎng)的條件，構(gòu)建了生產(chǎn)OPS的平臺(tái)菌株(platformstrain)。用于篩選的平臺(tái)菌株是經(jīng)修飾降低野生型大腸桿菌菌株W3110的內(nèi)源磷酸絲氨酸磷酸酶(SerB)的活性的重組微生物，并被命名為“KCCM11212P”(也稱為“CA07-0012”；韓國(guó)專利號(hào)10-1381048；美國(guó)專利申請(qǐng)公開號(hào)2012-0190081)。利用該OPS生產(chǎn)菌株KCCM11212P，通過在含有OPS的培養(yǎng)基中培養(yǎng)作為OPS生產(chǎn)菌株的KCCM11212P，建立顯示出生長(zhǎng)抑制的最佳篩選條件。然后，通過電穿孔(vanderRest等.1999)將W3110的基因組文庫(kù)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到CA07-0012中，并選擇在含有過量OPS的培養(yǎng)基條件下顯示出生長(zhǎng)抑制消除的菌落。從選擇的菌落獲得質(zhì)粒，并通過測(cè)序技術(shù)分析其核苷酸序列。結(jié)果是，鑒定出在含有過量OPS的培養(yǎng)基條件下消除生長(zhǎng)抑制所涉及的兩種大腸桿菌膜蛋白。這兩種大腸桿菌膜蛋白被鑒定為yhhS和mdtD，其分別編碼YhhS主要促進(jìn)子超家族(MFS)轉(zhuǎn)運(yùn)體(SEQIDNO:1的氨基酸序列和SEQIDNO:3的核苷酸序列)和YegBMFS轉(zhuǎn)運(yùn)體(SEQIDNO:2的氨基酸序列和SEQIDNO:4的核苷酸序列)(PaoSS,PaulsenIT,SaierMH(1998).“Majorfacilitatorsuperfamily.”MicrobiolMolBiolRev1998；62(1)；1-34.PMID:9529885)。實(shí)施例2：yhhS-和mdtD-過表達(dá)載體的構(gòu)建為了檢驗(yàn)當(dāng)YhhSMFS轉(zhuǎn)運(yùn)體和YegBMFS轉(zhuǎn)運(yùn)體(其在消除OPS造成的生長(zhǎng)抑制中被涉及)在OPS生產(chǎn)菌株中被增強(qiáng)時(shí)OPS輸出能力是否增強(qiáng)，構(gòu)建了過表達(dá)各基因的載體。此外，由于發(fā)明人已經(jīng)證實(shí)當(dāng)高絲氨酸/高絲氨酸內(nèi)酯轉(zhuǎn)運(yùn)體RhtB在OPS生產(chǎn)菌株中被增強(qiáng)時(shí)OPS的濃度會(huì)增加(韓國(guó)專利號(hào)138104)，因此將RhtB增強(qiáng)型菌株作為陽(yáng)性對(duì)照。此外，還評(píng)價(jià)了多藥物排出物(multidrugefflux)轉(zhuǎn)運(yùn)體EmrD和YcaDMFS，其屬于MacB所屬的主要促進(jìn)子超家族(MFS)。以與YhhS和MdtD中相同的方式，對(duì)多藥物排出物轉(zhuǎn)運(yùn)體EmrD和YcaDMFS轉(zhuǎn)運(yùn)體(其是屬于主要促進(jìn)子超家族(MFS)的大腸桿菌膜蛋白)也進(jìn)行了評(píng)價(jià)。在此實(shí)施例中，利用W3110的基因組DNA作為模板，通過PCR獲得了編碼YhhSMFS轉(zhuǎn)運(yùn)體的基因yhhS(SEQIDNO:3，登錄號(hào)：b3473)的片段和編碼YegBMFS轉(zhuǎn)運(yùn)體的基因mdtD(SEQIDNO:4，登錄號(hào)：b2077)的片段。用于構(gòu)建各膜蛋白基因的過表達(dá)載體的引物序列顯示在下表1中。[表1]具體地，使用SEQIDNO:5和6的引物進(jìn)行yhhS的PCR反應(yīng)，并使用SEQIDNO:7和8的引物進(jìn)行mdtD的PCR反應(yīng)?；诒２赜贜IHGenBank的K12W3110基因(GenBank登錄號(hào)AP00347)和周圍核苷酸序列的信息構(gòu)建PCR反應(yīng)中所使用的引物。此外，使用下表1所示的各引物對(duì)，通過PCT反應(yīng)擴(kuò)增rhtB、emrD和ycaD基因的片段。將各擴(kuò)增基因片段用限制酶EcoRV和HindIII進(jìn)行處理，并克隆到pCL-PrhtB載體的EcoRV和HindIII限制酶位點(diǎn)——該pCL-PrhtB載體包括插入到pCL1920載體(GenBank編號(hào)AB236930)中的大腸桿菌rhtB基因的啟動(dòng)子(PrhtB)，從而分別構(gòu)建出pCL-PrhtB-rhtB、pCL-PrhtB-yhhS、pCL-PrhtB-mdtD、pCL-PrhtB-emrD和pCL-PrhtB-ycaD。實(shí)施例3：構(gòu)建YhhSMFS轉(zhuǎn)運(yùn)體和YegBMFS轉(zhuǎn)運(yùn)體增強(qiáng)的菌株和評(píng)價(jià)OPS生產(chǎn)能力<實(shí)施例3-1：利用CA07-0012構(gòu)建YhhSMFS轉(zhuǎn)運(yùn)體和YegBMFS轉(zhuǎn)運(yùn)體增強(qiáng)的菌株和評(píng)價(jià)OPS生產(chǎn)能力>將實(shí)施例2中構(gòu)建的5種質(zhì)粒中的每一種引入OPS生產(chǎn)菌株CA07-0012中，然后對(duì)所得菌株的OPS生產(chǎn)能力進(jìn)行評(píng)價(jià)。具體地，將每種菌株鋪平在LB固體培養(yǎng)基上，并在培養(yǎng)箱中于33℃培養(yǎng)過夜。將在LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)過夜的每種菌株接種到下表2所示的25mL效價(jià)培養(yǎng)基(titermedium)中，然后在培養(yǎng)箱中于34.5℃和200rpm培育40小時(shí)。結(jié)果顯示在表3中。[表2]組成濃度(每1L)葡萄糖50gKH2PO46g(NH4)2SO417gMgSO4·7H2O1gFeSO4·7H2O5mgMnSO4·4H2O10mgL-甘氨酸2.5g酵母提取物3g碳酸鈣30gpH6.8[表3]如上表3所示，在大腸桿菌膜蛋白基因分別被進(jìn)一步引入大腸桿菌CA07-0012菌株的情況之中，具有增強(qiáng)的rhtB、emrD或ycaD的菌株相比于CA07-0012菌株顯示OPS生產(chǎn)顯著增加，并且具體地，具有增強(qiáng)的YhhS和MdtD的菌株顯示OPS濃度至少150％的增加。相反，用作實(shí)驗(yàn)組的具有增強(qiáng)的EmrD和YcaD的菌株未顯示出任何OPS濃度增加。稱為“CA07-0012/pCL-PrhtB-yhhS”的菌株被命名為“大腸桿菌CA07-0266(CA07-0266)”，并于2013年12月9日被保藏于根據(jù)布達(dá)佩斯條約認(rèn)定為國(guó)際保藏機(jī)構(gòu)的韓國(guó)微生物培養(yǎng)中心(KoreanCultureCenterofMicroorganisms)，登錄號(hào)為KCCM11495P。此外，稱為“CA07-0012/pCL-PrhtB-mdtD”的菌株被命名為“大腸桿菌CA07-0267(CA07-0267)”，并于2013年12月9日被保藏于根據(jù)布達(dá)佩斯條約認(rèn)定為國(guó)際保藏機(jī)構(gòu)的韓國(guó)微生物培養(yǎng)中心，登錄號(hào)為KCCM11496P。<實(shí)施例3-2：利用SerA和SerC增強(qiáng)的菌株構(gòu)建YhhSMFS轉(zhuǎn)運(yùn)體和YegBMFS轉(zhuǎn)運(yùn)體增強(qiáng)的菌株和評(píng)價(jià)OPS生產(chǎn)能力>此外，利用OPS生產(chǎn)菌株，CA07-0022/pCL-Prmf-SerA*(G336V)-(RBS)SerC(韓國(guó)專利申請(qǐng)公開號(hào)10-2012-004111)，檢驗(yàn)大腸桿菌膜蛋白基因的效果，該菌株中作為OPS生物合成途徑的D-3-磷酸甘油酸脫氫酶(SerA)和3-磷酸絲氨酸轉(zhuǎn)氨酶(SerC)的活性被增強(qiáng)。結(jié)果顯示在下表4中。[表4]如上述表4所示，再次確認(rèn)了在大腸桿菌膜蛋白基因被進(jìn)一步引CA07-0022/pCL-Prmf-SerA*(G336V)-(RBS)SerC菌株的菌株中，本發(fā)明的具有增強(qiáng)的YhhS和MdtD的菌株和具有增強(qiáng)的RhtB的菌株(陽(yáng)性對(duì)照)相比于源自大腸桿菌的CA07-0012菌株顯示出OPS生產(chǎn)增加。具體地，本發(fā)明的具有增強(qiáng)的YhhS和MdtD的菌株顯示出OPS濃度至少145％的增加，類似于上述表3所示的結(jié)果。相反，具有增強(qiáng)的ErmD和YcaD的菌株相對(duì)于對(duì)照組顯示出OPS濃度降低。<實(shí)施例3-3：根據(jù)啟動(dòng)子強(qiáng)度構(gòu)建YhhSMFS轉(zhuǎn)運(yùn)體和YegBMFS轉(zhuǎn)運(yùn)體增強(qiáng)的菌株和評(píng)價(jià)OPS生產(chǎn)能力>此外，為了檢驗(yàn)啟動(dòng)子強(qiáng)度的增強(qiáng)是否可以增加輸出能力，將具有OPS濃度增加的膜蛋白YhhS和MdtD與對(duì)照組進(jìn)行比較——通過利用trc啟動(dòng)子(Ptrc)(一種比rhtB啟動(dòng)子(PrhtB)更強(qiáng)的啟動(dòng)子)進(jìn)一步將yhhS和mdtD基因引入CA07-0022/pCL-Prmf-SerA*(G336V)-(RBS)SerC中。將yhhS和mdtD基因的片段中的每一個(gè)用限制酶EcoRV和HindIII處理，并克隆到pCL-Ptrc-GFP載體的EcoRV和HindIII限制酶位點(diǎn)——該pCL-Ptrc-GFP載體包括插入到pCL1920載體中的trc啟動(dòng)子，從而分別構(gòu)建pCL-Ptrc-yhhS和pCL-Ptrc-mdtD。然后，利用各質(zhì)粒作為模板連同SEQIDNO:15和SEQIDNO:16的引物對(duì)進(jìn)行PCR反應(yīng)，并將所得物用HindIII處理，然后克隆到pCL-Prmf-SerA*(G336V)-(RBS)SerC的HindIII限制位點(diǎn)。[表5]結(jié)果是，如上表5所示，當(dāng)通過增強(qiáng)啟動(dòng)子來增加大腸桿菌膜蛋白的表達(dá)時(shí)，產(chǎn)量相比于對(duì)照組有至少150％的增加，并且相比于使用rhtB啟動(dòng)子時(shí)有至少120％的增加。<實(shí)施例3-4：根據(jù)染色體上的啟動(dòng)子強(qiáng)度構(gòu)建YhhSMFS轉(zhuǎn)運(yùn)體和YegBMFS轉(zhuǎn)運(yùn)體增強(qiáng)的菌株和評(píng)價(jià)OPS生產(chǎn)能力>此外，為了檢驗(yàn)在染色體上利用更強(qiáng)的啟動(dòng)子替代yhhS和mdtD基因的啟動(dòng)子是否可以增強(qiáng)輸出能力，通過構(gòu)建其中cj1啟動(dòng)子(韓國(guó)專利號(hào)0620092)替代自身啟動(dòng)子的菌株來評(píng)價(jià)OPS生產(chǎn)能力。cj1啟動(dòng)子在大腸桿菌染色體中的引入通過下述常規(guī)方法進(jìn)行。關(guān)于染色體上yhhS和mdtD自身啟動(dòng)子的替代，將構(gòu)建的重組載體轉(zhuǎn)化到OPS生產(chǎn)菌株CA07-0022/pCL-Prmf-SerA*(G336V)-(RBS)SerC(韓國(guó)專利號(hào)138104)中，并通過同源重組置換載體上的上述啟動(dòng)子序列和自身啟動(dòng)子序列，從而將cj1啟動(dòng)子序列插入到染色體中。將各菌株鋪平在LB固體培養(yǎng)基上，并在培養(yǎng)箱中于33℃培養(yǎng)過夜。將在LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)過夜的各菌株接種到上表2所示的25mL效價(jià)培養(yǎng)基中，然后在培養(yǎng)箱中于34.5℃和200rpm下培育40小時(shí)。結(jié)果顯示在下表6中。[表6]如上表6所示，當(dāng)染色體上各膜蛋白的表達(dá)增加時(shí)，產(chǎn)量相對(duì)于對(duì)照組增加上至130％。實(shí)施例4：確認(rèn)YhhSMFS轉(zhuǎn)運(yùn)體和YegBMFS轉(zhuǎn)運(yùn)體的OPS輸出功能在實(shí)施例3中確認(rèn)OPS生產(chǎn)的燒瓶樣品之中，在利用CA07-0022/pCL-Prmf-SerA*(G336V)-(RBS)SerC(膜蛋白未增強(qiáng)的陰性對(duì)照)和樣品CA07-0022/pCL-Prmf-SerA*(G336V)-(RBS)SerC-Ptrc-yhhS和CA07-0022/pCL-Prmf-SerA*(G336V)-(RBS)SerC-Ptrc-mdtD(其中膜蛋白YhhS和MdtD被增強(qiáng))去除培養(yǎng)基中輸出的全部OPS后，僅收集細(xì)胞，并將細(xì)胞破碎。通過高效液相色譜法(HPLC)測(cè)量細(xì)胞內(nèi)的OPS濃度，結(jié)果顯示在圖1中。結(jié)果是，如圖1所示，本發(fā)明的具有增強(qiáng)的YhhS和MdtD的菌株相比于對(duì)照組顯示出胞內(nèi)OPS濃度降低30％至40％，從而確認(rèn)Yhhs和MdtD蛋白在輸出OPS至細(xì)胞外中具有重要作用。因此，確認(rèn)Yhhs和MdtD蛋白的增強(qiáng)可順利地將細(xì)胞中的OPS輸出到外部，從而提高OPS產(chǎn)生能力。根據(jù)前述，本發(fā)明所屬領(lǐng)域技術(shù)人員將能夠理解，在不改變本發(fā)明的技術(shù)思路或本質(zhì)特征的情況下，本發(fā)明可以以其它具體形式實(shí)施。在這方面，本文公開的示例性實(shí)施方式僅以示例為目的，并且不應(yīng)被解釋為限制本發(fā)明的范圍。相反，本發(fā)明旨在不僅包括示例性實(shí)施方式，而且包括可被包括在根據(jù)所附權(quán)利要求限定的本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)的各種替代形式、改動(dòng)、等同形式和其它實(shí)施方式。<110>CJ第一制糖株式會(huì)社<120>生產(chǎn)O-磷酸絲氨酸的微生物和利用其生產(chǎn)O-磷酸絲氨酸或L-半胱氨酸的方法<130>OPA15193<150>KR10-2014-0104670<151>2014-08-12<160>34<170>KopatentIn2.0<210>1<211>405<212>PRT<213>大腸桿菌<220><221>肽<222>(1)..(405)<223>YhhSMFS轉(zhuǎn)運(yùn)體,YhhS<400>1MetProGluProValAlaGluProAlaLeuAsnGlyLeuArgLeuAsn151015LeuArgIleValSerIleValMetPheAsnPheAlaSerTyrLeuThr202530IleGlyLeuProLeuAlaValLeuProGlyTyrValHisAspValMet354045GlyPheSerAlaPheTrpAlaGlyLeuValIleSerLeuGlnTyrPhe505560AlaThrLeuLeuSerArgProHisAlaGlyArgTyrAlaAspSerLeu65707580GlyProLysLysIleValValPheGlyLeuCysGlyCysPheLeuSer859095GlyLeuGlyTyrLeuThrAlaGlyLeuThrAlaSerLeuProValIle100105110SerLeuLeuLeuLeuCysLeuGlyArgValIleLeuGlyIleGlyGln115120125SerPheAlaGlyThrGlySerThrLeuTrpGlyValGlyValValGly130135140SerLeuHisIleGlyArgValIleSerTrpAsnGlyIleValThrTyr145150155160GlyAlaMetAlaMetGlyAlaProLeuGlyValValPheTyrHisTrp165170175GlyGlyLeuGlnAlaLeuAlaLeuIleIleMetGlyValAlaLeuVal180185190AlaIleLeuLeuAlaIleProArgProThrValLysAlaSerLysGly195200205LysProLeuProPheArgAlaValLeuGlyArgValTrpLeuTyrGly210215220MetAlaLeuAlaLeuAlaSerAlaGlyPheGlyValIleAlaThrPhe225230235240IleThrLeuPheTyrAspAlaLysGlyTrpAspGlyAlaAlaPheAla245250255LeuThrLeuPheSerCysAlaPheValGlyThrArgLeuLeuPhePro260265270AsnGlyIleAsnArgIleGlyGlyLeuAsnValAlaMetIleCysPhe275280285SerValGluIleIleGlyLeuLeuLeuValGlyValAlaThrMetPro290295300TrpMetAlaLysIleGlyValLeuLeuAlaGlyAlaGlyPheSerLeu305310315320ValPheProAlaLeuGlyValValAlaValLysAlaValProGlnGln325330335AsnGlnGlyAlaAlaLeuAlaThrTyrThrValPheMetAspLeuSer340345350LeuGlyValThrGlyProLeuAlaGlyLeuValMetSerTrpAlaGly355360365ValProValIleTyrLeuAlaAlaAlaGlyLeuValAlaIleAlaLeu370375380LeuLeuThrTrpArgLeuLysLysArgProProGluHisValProGlu385390395400AlaAlaSerSerSer405<210>2<211>471<212>PRT<213>大腸桿菌<220><221>肽<222>(1)..(471)<223>YegBMFS轉(zhuǎn)運(yùn)體,MdtD<400>2MetThrAspLeuProAspSerThrArgTrpGlnLeuTrpIleValAla151015PheGlyPhePheMetGlnSerLeuAspThrThrIleValAsnThrAla202530LeuProSerMetAlaGlnSerLeuGlyGluSerProLeuHisMetHis354045MetValIleValSerTyrValLeuThrValAlaValMetLeuProAla505560SerGlyTrpLeuAlaAspLysValGlyValArgAsnIlePhePheThr65707580AlaIleValLeuPheThrLeuGlySerLeuPheCysAlaLeuSerGly859095ThrLeuAsnGluLeuLeuLeuAlaArgAlaLeuGlnGlyValGlyGly100105110AlaMetMetValProValGlyArgLeuThrValMetLysIleValPro115120125ArgGluGlnTyrMetAlaAlaMetThrPheValThrLeuProGlyGln130135140ValGlyProLeuLeuGlyProAlaLeuGlyGlyLeuLeuValGluTyr145150155160AlaSerTrpHisTrpIlePheLeuIleAsnIleProValGlyIleIle165170175GlyAlaIleAlaThrLeuLeuLeuMetProAsnTyrThrMetGlnThr180185190ArgArgPheAspLeuSerGlyPheLeuLeuLeuAlaValGlyMetAla195200205ValLeuThrLeuAlaLeuAspGlySerLysGlyThrGlyLeuSerPro210215220LeuThrIleAlaGlyLeuValAlaValGlyValValAlaLeuValLeu225230235240TyrLeuLeuHisAlaArgAsnAsnAsnArgAlaLeuPheSerLeuLys245250255LeuPheArgThrArgThrPheSerLeuGlyLeuAlaGlySerPheAla260265270GlyArgIleGlySerGlyMetLeuProPheMetThrProValPheLeu275280285GlnIleGlyLeuGlyPheSerProPheHisAlaGlyLeuMetMetIle290295300ProMetValLeuGlySerMetGlyMetLysArgIleValValGlnVal305310315320ValAsnArgPheGlyTyrArgArgValLeuValAlaThrThrLeuGly325330335LeuSerLeuValThrLeuLeuPheMetThrThrAlaLeuLeuGlyTrp340345350TyrTyrValLeuProPheValLeuPheLeuGlnGlyMetValAsnSer355360365ThrArgPheSerSerMetAsnThrLeuThrLeuLysAspLeuProAsp370375380AsnLeuAlaSerSerGlyAsnSerLeuLeuSerMetIleMetGlnLeu385390395400SerMetSerIleGlyValThrIleAlaGlyLeuLeuLeuGlyLeuPhe405410415GlySerGlnHisValSerValAspSerGlyThrThrGlnThrValPhe420425430MetTyrThrTrpLeuSerMetAlaLeuIleIleAlaLeuProAlaPhe435440445IlePheAlaArgValProAsnAspThrHisGlnAsnValAlaIleSer450455460ArgArgLysArgSerAlaGln465470<210>3<211>1218<212>DNA<213>大腸桿菌<220><221>基因<222>(1)..(1218)<223>yhhS<400>3atgcccgaacccgtagccgaacccgcgctaaacggattgcgcctgaatttgcgcattgtc60tctatagtcatgtttaacttcgccagctacctcaccatcgggttgccgctcgctgtatta120ccgggctatgtccatgatgtgatgggctttagcgccttctgggcaggattggttatcagc180ctgcaatatttcgccaccttgctgagccgccctcatgccggacgttacgccgattcgctg240ggacccaaaaagattgtcgtcttcggtttatgcggctgctttttgagcggtctggggtat300ctgacggcaggattaaccgccagtctgcctgtcatcagcctgttattactttgcctgggg360cgcgtcatccttgggattgggcaaagttttgccggaacgggatcgaccctatggggcgtt420ggcgtggttggctcgctgcatatcgggcgggtgatttcgtggaacggcattgtcacttac480ggggcgatggcgatgggtgcgccgttaggcgtcgtgttttatcactggggcggcttgcag540gcgttagcgttaatcattatgggcgtggcgctggtggccattttgttggcgatcccgcgt600ccgacggtaaaagccagtaaaggcaaaccgctgccgtttcgcgcggtgcttgggcgcgtc660tggctgtacggtatggcgctggcactggcttccgccggatttggcgtcatcgccaccttt720atcacgctgttttatgacgctaaaggttgggacggtgcggctttcgcgctgacgctgttt780agctgtgcgtttgtcggtacgcgtttgttattccctaacggcattaaccgtatcggtggc840ttaaacgtagcgatgatttgctttagcgttgagataatcggcctgctactggttggcgtg900gcgactatgccgtggatggcgaaaatcggcgtcttactggcgggggccgggttttcgctg960gtgttcccggcattgggtgtagtggcggtaaaagcggttccgcagcaaaatcagggggcg1020gcgctggcaacttacaccgtatttatggatttatcgcttggcgtgactggaccactggct1080gggctggtgatgagctgggcgggcgtaccggtgatttatctggcggcggcgggactggtc1140gcaatcgcgttattactgacgtggcgattaaaaaaacggcctccggaacacgtccctgag1200gccgcctcatcatcttaa1218<210>4<211>1416<212>DNA<213>大腸桿菌<220><221>基因<222>(1)..(1416)<223>mdtD<400>4atgacagatcttcccgacagcacccgttggcaattgtggattgtggctttcggcttcttt60atgcagtcgctggacaccaccatcgtaaacaccgcccttccctcaatggcgcaaagcctc120ggggaaagtccgttgcatatgcacatggtcattgtctcttatgtgctgaccgtggcggtg180atgctgcccgccagcggctggctggcggacaaagtcggcgtgcgcaatattttctttacc240gccatcgtgctgtttactctcggttcactgttttgcgcgctttccggcacgctgaacgaa300ctgttgctggcacgcgcgttacagggcgttggcggcgcgatgatggtgccggtcggcaga360ttgacggtgatgaaaatcgtaccgcgcgagcaatatatggcggcgatgacctttgtcacg420ttacccggtcaggtcggtccgctgctcggtccggcgctcggcggtctgctggtggagtac480gcatcgtggcactggatctttttgatcaacattccggtggggattatcggtgcgatcgcc540acattgctgttaatgccgaactacaccatgcagacgcggcgctttgatctctccggattt600ttattgctggcggttggcatggcggtattaaccctggcgctggacggcagtaaaggtaca660ggtttatcgccgctgacgattgcaggcctggtcgcagttggcgtggtggcactggtgctt720tatctgctgcacgccagaaataacaaccgtgccctgttcagtctgaaactgttccgtact780cgtaccttttcgctgggcctggcggggagctttgccggacgtattggcagtggcatgttg840ccctttatgacaccggttttcctgcaaattggcctcggtttctcgccgtttcatgccgga900ctgatgatgatcccgatggtgcttggcagcatgggaatgaagcgaattgtggtacaggtg960gtgaatcgctttggttatcgtcgggtactggtagcgaccacgctgggtctgtcgctggtc1020accctgttgtttatgactaccgccctgctgggctggtactacgttttgccgttcgtcctg1080tttttacaagggatggtcaactcgacgcgtttctcctccatgaacaccctgacgctgaaa1140gatctcccggacaatctggcgagcagcggcaacagcctgctgtcgatgattatgcaattg1200tcgatgagtatcggcgtcactatcgccgggctgttgctgggactttttggttcacagcat1260gtcagcgtcgacagcggcaccacacaaaccgtctttatgtacacctggcttagcatggcg1320ttgatcatcgcccttccggcgttcatctttgccagagtgccgaacgatacgcatcaaaat1380gtagctatttcgcggcgaaaaaggagcgcgcaatga1416<210>5<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>用于擴(kuò)增yhhS以構(gòu)建pCL-PrhtB-yhhS的引物<400>5gatatcatgcccgaacccgtagc23<210>6<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>用于擴(kuò)增yhhS以構(gòu)建pCL-PrhtB-yhhS的引物<400>6aagcttttaagatgatgaggcggcct26<210>7<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>用于擴(kuò)增mdtD以構(gòu)建pCL-PrhtB-mdtD的引物<400>7gatatcatgacagatcttcccgacagc27<210>8<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>用于擴(kuò)增mdtD以構(gòu)建pCL-PrhtB-mdtD的引物<400>8aagctttcattgcgcgctccttt23<210>9<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>用于擴(kuò)增rhtB以構(gòu)建pCL-PrhtB-rhtB的引物<400>9gatatcatgaccttagaatggtgg24<210>10<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>用于擴(kuò)增rhtB以構(gòu)建pCL-PrhtB-rhtB的引物<400>10aagctttcacgcatgcctcgccga24<210>11<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>用于擴(kuò)增emrD以構(gòu)建pCL-PrhtB-emrD的引物<400>11gatatcatgaaaaggcaaagaaacgtcaa29<210>12<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>用于擴(kuò)增emrD以構(gòu)建pCL-PrhtB-emrD的引物<400>12aagcttttaaacgggctgcccct23<210>13<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><223>用于擴(kuò)增ycaD以構(gòu)建pCL-PrhtB-ycaD的引物<400>13gatatcatgtccacgtatacccagcctg28<210>14<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>用于擴(kuò)增ycaD以構(gòu)建pCL-PrhtB-ycaD的引物<400>14aagcttttacacgtgagcaacgggttt27<210>15<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>用于擴(kuò)增pCL-PrhtB-基因以構(gòu)建pCL-Prmf-serA(G336V)-serC_PrhtB-基因的引物<400>15aagcttcgggcctcttcgctattacgc27<210>16<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>用于擴(kuò)增pCL-PrhtB-基因以構(gòu)建pCL-Prmf-serA(G336V)-serC_PrhtB-基因的引物<400>16aagcttaggcttacccgtcttactgtc27<210>17<211>446<212>PRT<213>谷氨酸棒狀桿菌<220><221>肽<222>(1)..(446)<223>磷酸絲氨酸磷酸酶,SerB<400>17MetSerCysSerAlaLeuArgHisGluThrIleValAlaValThrGlu151015LeuIleGlnAsnGluSerGlnGluIleAlaGluLeuGluAlaGlyGln202530GlnValAlaLeuArgGluGlyTyrLeuProAlaValIleThrValSer354045GlyLysAspArgProGlyValThrAlaAlaPhePheArgValLeuSer505560AlaAsnGlnValGlnValLeuAspValGluGlnSerMetPheArgG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