專利名稱：生產(chǎn)o-磷酸絲氨酸的微生物和使用該微生物由o-磷酸絲氨酸生產(chǎn)l-半胱氨酸或其衍生物 ...的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用O-磷酸絲氨酸作為中間體生產(chǎn)胱氨酸或其衍生物的方法以及用于生產(chǎn)O-磷酸絲氨酸的重組微生物。
背景技術(shù)：
L-半胱氨酸是在所有生物體的硫代謝中起著重要作用的氨基酸。它用于生物合成蛋白質(zhì)，如毛發(fā)角蛋白、谷胱甘肽、生物素、蛋氨酸和其它含硫代謝物以及作為輔酶A的前體。此外，半胱氨酸的生物合成已知與其它氨基酸的生物合成密切相關(guān)，包括L-絲氨酸、
L-甘氨酸和L-蛋氨酸。工業(yè)上，發(fā)現(xiàn)L-半胱氨酸及其衍生物應(yīng)用于各種領(lǐng)域，包括制藥業(yè)(用于治療支氣管疾病)、化妝品工業(yè)(在洗發(fā)液中、用于燙發(fā)的組合物)和食品工業(yè)(抗氧化劑、增味劑、面團(tuán)助劑(dough aids)等)。L-半胱氨酸曾通過(guò)將人頭發(fā)或動(dòng)物羽毛進(jìn)行酸水解工業(yè)性地獲得(氨基酸生產(chǎn)的生物技術(shù)(Biotechnology of the Amino Acids Production) Ko Aida 編,p 217-223,1986)。然而，不僅從頭發(fā)或羽毛獲得的半胱氨酸的產(chǎn)量低至7 8%，而且鹽酸或硫酸的使用產(chǎn)生大量的廢水，引起環(huán)境污染。此外，從頭發(fā)或羽毛中進(jìn)行提取可誘發(fā)使用者對(duì)其強(qiáng)烈的厭惡感。這些問(wèn)題導(dǎo)致迫切需要開(kāi)發(fā)環(huán)境友好型L-半胱氨酸的生產(chǎn)方法?，F(xiàn)代主要途徑包含用微生物發(fā)酵。在微生物生產(chǎn)L-半胱氨酸中，代表性的為I)用微生物對(duì)D、L-ATC進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化(Ryu 0H,Ju JY和 Shin CS, Process Biochem.，32 :201_209，1997)。然而，由于前體D、L_ATC的低溶解度，這種轉(zhuǎn)化方法在難以工業(yè)上應(yīng)用。2)另一種生產(chǎn)L-半胱氨酸的方法為用大腸桿菌直接發(fā)酵(專利號(hào)EP0885962B ；ffada M和 Takagi H, Appl. Microbiol. Biochem. ,73 48-54,2006)。微生物體內(nèi)的L-半胱氨酸的過(guò)度積累導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)毒性，限制了 L-半胱氨酸的高濃度生產(chǎn)。為了克服這種缺陷，使用了 L-半胱氨酸-輸出蛋白，但在生產(chǎn)率上也沒(méi)有顯著的改善。至于微生物和植物體內(nèi)的L-半胱氨酸的生物合成途徑，O-乙酰基-絲氨酸(OAS)作為一種中間前體物，提供L-半胱氨酸的碳骨架(Kredich匪和Tomkins GM, J. Biol.Chem. ,241 =4955-4965,1966)。O-乙?；z氨酸巰解酶(OASS)，用硫化氫作為硫供體，催化乙?；z氨酸向半胱氨酸的轉(zhuǎn)化?；蛘?，在半胱氨酸的生產(chǎn)中，可將SO4還原成硫代硫酸鹽作為硫供體(Nakamura T, Kon Y, Iwahashi H 和 Eguchi Y, J. Bacteriol. , 156 :656-662,1983)。因此，可用各種硫供體，用微生物積累OAS和OASS生產(chǎn)半胱氨酸(US6，579，705)。通過(guò)OAS的半胱氨酸生物合成途徑使用兩種酶，絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶(CysE)催化絲氨酸向OAS的轉(zhuǎn)化,半胱氨酸合成酶(CysK)催化OAS向半胱氨酸的轉(zhuǎn)化。這其中，絲氨酸乙酰基轉(zhuǎn)移酶(CysE)對(duì)最終產(chǎn)物半胱氨酸的反饋抑制作用高度敏感(Wada M and Takagi H，Appl.Microbiol. Biochem.，73 :48-54,2006)。

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問(wèn)題本發(fā)明的發(fā)明人通過(guò)深入研究完成本發(fā)明，發(fā)現(xiàn)在超嗜熱古菌(Aeropyrumpernix)、結(jié)核分支桿菌(Mycobacterium tuberculosis)和陰道毛滴蟲(Trichomonasvaginalis)中存在用于合成L-半胱氨酸的O-磷酸絲氨酸巰解酶(OPSS),其采用O-磷-L-絲氨酸(OPS)-特異性途徑，而非OAS-特異性途徑(Mino K和Ishikawa K，F(xiàn)EBSletters,551 :133-138,2003 ；Burns KE, Baumgart S, Dorrestein PC, Zhai H, McLaffertyFW 和 Begley TP，J.Am. Chem. Soc.，127 :11602-11603，2005 ；ffestrop ⑶，Goodall G,Mottram JC and Coombs GH,J. Biol. Chem. ,281 :25062-25075, 2006)，以及當(dāng)結(jié)核分支桿菌的OPSS的5個(gè)C-末端氨基酸殘基被去除后，即使不存在額外的酶，其也可利用Na2S作為硫供體，將 OPS 轉(zhuǎn)化成半胱氨酸(Argen D, Schnell R 和 Schneider G, FEBS letters, 583 330-336，2009)。本發(fā)明中，將微生物進(jìn)行突變，從而在其體內(nèi)積累OPS，接下來(lái)用OPSS酶進(jìn)行孵育，從而將OPS轉(zhuǎn)化成半胱氨酸。該方法之前在任何地方都沒(méi)有公開(kāi)過(guò)。技術(shù)方案本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供生產(chǎn)半胱氨酸或其衍生物的方法。本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供用于生產(chǎn)O-磷酸絲氨酸的重組微生物。有益效果本發(fā)明的方法通過(guò)重組微生物高產(chǎn)量地生產(chǎn)O-磷酸絲氨酸并將其轉(zhuǎn)化成半胱氨酸，事實(shí)上，這更加環(huán)保，并且確保比化學(xué)合成方法更高效地生產(chǎn)半胱氨酸。本發(fā)明通過(guò)發(fā)酵和生物轉(zhuǎn)化而生產(chǎn)的半胱氨酸及其衍生物可廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)動(dòng)物和人類食品和食品添加劑。


圖I為通過(guò)微生物發(fā)酵積累O-磷酸絲氨酸和積累的O-磷酸絲氨酸酶轉(zhuǎn)化成L-半胱氨酸的示意圖。圖2所示為根據(jù)溫度的OPS巰解酶的活性。圖3為一組表示OPS巰解酶pH敏感性的圖表。圖4所示為通過(guò)SDS-PAGE分析的pET系統(tǒng)和pCL_Pc j I系統(tǒng)中Msm-T表達(dá)水平的照片。圖5所示為將純化的OPS發(fā)酵培養(yǎng)液(fermentation broth)轉(zhuǎn)化成半胱氨酸的OPS巰解酶的酶活性的圖。圖6所示為將OPS發(fā)酵培養(yǎng)液轉(zhuǎn)化成半胱氨酸的OPS巰解酶的酶活性的圖。
具體實(shí)施例方式如本申請(qǐng)中所使用的，術(shù)語(yǔ)“半胱氨酸轉(zhuǎn)化”是指O-磷酸絲氨酸巰解酶(OPSS)的催化反應(yīng)，其引起底物O-磷酸絲氨酸(OPS)轉(zhuǎn)化成產(chǎn)物半胱氨酸，即，它是指將OPS轉(zhuǎn)化成半胱氨酸的催化反應(yīng)。如本申請(qǐng)中所使用的，術(shù)語(yǔ)“半胱氨酸轉(zhuǎn)化率”是指產(chǎn)物半胱氨酸的量和起始原料OPS的百分比。在最佳的反應(yīng)條件下，I摩爾OPS被轉(zhuǎn)化成I摩爾半胱氨酸。例如，如果100摩爾的OPS被轉(zhuǎn)化成100摩爾的半胱氨酸，那么半胱氨酸轉(zhuǎn)化率為100%。根據(jù)其一個(gè)方面，本發(fā)明提供生產(chǎn)半胱氨酸或其衍生物的方法，其包括I)培養(yǎng)經(jīng)過(guò)修飾降低了內(nèi)源磷酸絲氨酸磷酸酶(SerB)活性的重組微生物，以生產(chǎn)O-磷酸絲氨酸(OPS)；以及2)0-磷酸絲氨酸巰解酶(OPSS)或表達(dá)OPSS的微生物存在下，將步驟I)的OPS和硫化物進(jìn)行反應(yīng)，以生產(chǎn)半胱氨酸或其衍生物。該方法中，步驟I)與培養(yǎng)內(nèi)源磷酸絲氨酸磷酸酶(SerB)活性降低的重組微生物有關(guān)。SerB是具有將OPS水解成L-絲氨酸的活性的蛋白質(zhì)。因此，內(nèi)源SerB活性降低的重組微生物的特征在于其積累OPS。SerB可包括但不限于任何表現(xiàn)SerB活性的氨基酸序列，并且優(yōu)選可具有SEQ ID NO :1或2所示的氨基酸序列。然而，只要表現(xiàn)出SerB活性，可使用任意氨基酸序列，優(yōu)選與SEQ ID NO :1或2具有90%或以上，更優(yōu)選96%或以上，還更優(yōu)選98%或以上，最優(yōu)選99%或以上的同源性。降低的SerB活性是指與修飾之前的菌·株相比，SerB活性降低包括SerB的裂解。降低SerB活性的方法是本領(lǐng)域公知的。示例性實(shí)例包括染色體serB的缺失、向染色體serB中引入突變以降低內(nèi)源SerB活性、向serB的調(diào)控區(qū)引入突變以降低內(nèi)源SerB活性、用突變基因取代染色體serB以降低內(nèi)源SerB活性，以及引入與serB轉(zhuǎn)錄本互補(bǔ)的反義寡核苷酸以抑制mRNA的反義,但降低SerB活性的方法不限于此。這些方法可用于降低本發(fā)明中其它酶的活性。內(nèi)源SerB的裂解導(dǎo)致向重組微生物引入絲氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型，因而培養(yǎng)基必須添加甘氨酸或絲氨酸。甘氨酸可以純甘氨酸、含甘氨酸酵母提取物或蛋白胨的形式提供。甘氨酸所含的濃度為O. I 10g/L，優(yōu)選濃度為O. 5 3g/L。至于絲氨酸，它可以純絲氨酸、含絲氨酸酵母提取物或蛋白胨的形式提供。它在培養(yǎng)基中的濃度范圍為O. I 5g/L，優(yōu)選
O.I lg/L。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)其內(nèi)源SerB活性受到破壞的(disrupted)突變谷氨酸棒狀桿菌(Corynebacterium glutamicum)或大腸桿菌(E. coli)培養(yǎng)于含甘氨酸或絲氨酸培養(yǎng)基時(shí)，發(fā)現(xiàn)其與野生型相比生產(chǎn)出更大量的OPS (見(jiàn)表2、3、6和7)。此外，本發(fā)明的重組微生物可具有增強(qiáng)的磷酸甘油酸脫氫酶(SerA)或磷酸絲氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(SerC)活性。SerA為具有將3-磷酸甘油酸轉(zhuǎn)化成3-磷酸羥基丙酮酸的活性的蛋白質(zhì)。SerA可具有野生型氨基酸或抗絲氨酸反饋抑制的突變氨基酸序列，但不限于這些。優(yōu)選地，SerA可具有選自SEQ ID NOS :3 7中的一種氨基酸序列。只要它表現(xiàn)出野生型的SerA的活性或抗絲氨酸反饋抑制的突變SerA活性，可使用任意氨基酸序列，但其優(yōu)選與SEQ ID NO :3 7中的一種具有90%或以上，更優(yōu)選96%或以上，還更優(yōu)選98%或以上，最優(yōu)選99%或以上的同源性。“抗反饋抑制的突變SerA”是指不管對(duì)絲氨酸或甘氨酸的反饋抑制，該突變表現(xiàn)出維持或增強(qiáng)的SerA活性。抗反饋突變體是本領(lǐng)域公知的(Grant GA等人，J. Biol. Chem. ,39 :5357-5361,1999 ；Grant GA 等人，Biochem. ,39 :7316-7319,2000 ；Grant GA 等人，J. Biol. Chem. , 276 :17844-17850,2001 ；Peters-ffendisch P 等人，Appl.Microbiol. B iotechnol. ,60 :437-441,2002 ； EP0943687B)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)進(jìn)一步向具有受到破壞的serB的谷氨酸棒狀桿菌或大腸桿菌中導(dǎo)入抗反饋serA時(shí),發(fā)現(xiàn)其與野生型相比生產(chǎn)更大量的OPS (見(jiàn)表4和9)。SerC為具有將3_磷酸羥基丙酮酸轉(zhuǎn)化成0_磷酸絲氨酸的活性的蛋白質(zhì)。SerC包括但不限于表現(xiàn)出SerC活性的序列，優(yōu)選其具有SEQ ID NO :8的氨基酸序列。然而，只要它表現(xiàn)出SerC活性，可使用任意氨基酸序列，但優(yōu)選與SEQ ID NO :8具有90%或以上，更優(yōu)選96 %或以上，還更優(yōu)選98 %或以上，最優(yōu)選99 %或以上的同源性。此外，可向serC引入突變，以增加酶活性。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)進(jìn)一步向具有受到破壞的serB和抗反饋抑制的SerA的谷氨酸棒狀桿菌或大腸桿菌中導(dǎo)入抗反饋serC時(shí),發(fā)現(xiàn)其與野生型相比生產(chǎn)更大量的OPS (見(jiàn)表9)。進(jìn)一步地，可降低本發(fā)明重組微生物進(jìn)行O-磷酸絲氨酸細(xì)胞內(nèi)攝取或降解的能力。具體地，可對(duì)重組微生物進(jìn)行改性以降低PhnC /PhnD/PhnE烷基磷酸酯ABC運(yùn)載蛋白(PhnCDE操縱子，即磷酸酯轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(PhnC ;EG 10713)的ATP結(jié)合組分-Pn運(yùn)載蛋白(PhnD ；EG 10714)的周質(zhì)結(jié)合蛋白組分-烷基磷酸酯ABC運(yùn)載蛋自(PhnE ;EG11283)的整體膜組分)、堿性磷酸化酶(PhoA)或酸性磷酸化酶(AphA)的活性。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，觀察到進(jìn)一步缺失重組突變體的phnCDE操縱子導(dǎo)致OPS產(chǎn)量的增加(表10)。在PhoA或AphA活性被進(jìn)一步受到破壞的重組微生物中，當(dāng)培養(yǎng)基中磷酸濃度降低的時(shí)候，OPS的降解開(kāi)始減少(表12)。然而，引入抗反饋的serA或serC增加了 OPS的產(chǎn)量(表14 16)。同樣，本發(fā)明的重組微生物進(jìn)一步的特征在于嘧啶核苷酸轉(zhuǎn)氫酶(PntAB5EC
I.6. I. I)活性的增加。如之前(Sauer UP 等人，J Biol Chem. 20 ;279 (8) :6613-9. Epub2003)所公開(kāi)的，PntAB參與NADPH代謝，以調(diào)控細(xì)胞內(nèi)氧化還原平衡。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，觀察到通過(guò)在重組微生物中過(guò)表達(dá)PntAB進(jìn)一步增加PntAB活性，增加了 OPS產(chǎn)量(表17)。此外，本發(fā)明重組微生物的特征在于O-乙酰基絲氨酸/半胱氨酸外排透性酶(YfiK)、高絲氨酸/高絲氨酸內(nèi)酯外排蛋白質(zhì)(RhtB ；EG11469)或蘇氨酸/高絲氨酸內(nèi)酯外排蛋白質(zhì)(RhtC ;EG11468)的增加。已知YfiK作為外運(yùn)蛋白用來(lái)向細(xì)胞外運(yùn)輸半胱氨酸和 OAS (Franke I 等人，J. Bacteriology, 185 :1161-1166，2003)，據(jù)報(bào)道 RhtB 作為高絲氨酸/高絲氨酸內(nèi)酯、蘇氨酸前體的胞間外運(yùn)蛋白。此外，已知RhtC為蘇氨酸和高絲氨酸的外運(yùn)蛋白。YfiK、RhtC和RhtB活性的增加表明了 OPS積累菌株生長(zhǎng)和OPS產(chǎn)量的增加(表18)。可使用各種公知的方法，包括但不限于增加編碼目的酶的基因拷貝數(shù)、向基因調(diào)控區(qū)引入突變以增加酶活性、用突變基因取代染色體基因以增加酶活性，以及向染色體基因弓I入突變以增加酶活性，從而實(shí)現(xiàn)酶活性的增加。此外，本發(fā)明的重組微生物進(jìn)一步的特征在于，磷酸甘油酸變位酶活性的降低。磷酸甘油酸變位酶存在三種形式的同工酶GpmI、GpmA和GpmB,其在糖酵解方法中用于將3-磷酸甘油酸轉(zhuǎn)化成2-磷酸甘油酸。對(duì)于使用3-磷酸甘油酸作為底物，這三種酶與催化3-磷酸羥基丙酮酸合成的SerA競(jìng)爭(zhēng)。因此，觀察到各個(gè)酶活性的降低導(dǎo)致產(chǎn)生大量的OPS前體3-磷酸甘油酸，從而引起OPS生產(chǎn)水平的增加(表19)。在本發(fā)明的重組微生物中，也可減少L-絲氨酸脫水酶I (SdaA ；EC 4. 3. I. 17)或2-氨基-3-酮丁酸輔酶A連接酶(Kbl)。因此，該重組微生物的特征在于，即使當(dāng)它培養(yǎng)于含低濃度甘氨酸或絲氨酸的培養(yǎng)基中，仍能維持或增加OPS的產(chǎn)量(表20)。此外，本發(fā)明的重組微生物進(jìn)一步的特征在于，IclR活性的降低。IclR為一種轉(zhuǎn)錄因子，其能夠抑制旁路操縱子aceBAK的表達(dá)(L Gui等人，J. Bacteriol. ,Vol 178，No. 1，321-324,1996)。當(dāng)它被缺失后，觀察到OPS產(chǎn)量的增加(表21)。同樣，本發(fā)明的重組微生物進(jìn)一步的特征在于，選自下組的酶的活性增加i)乙?；?CoA合成酶(Acs)、ii)乙酸激酶(AckA)-磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶(Pta)、iii)蘋果酸合成酶G (GlcB), iv)蘋果酸脫氫酶(MaeB)、V)谷氨酸脫氫酶(GdhA)、vi)乙醛酸醛連接酶(Glc)、vii)羥基丙二酸半醛還原酶2 (GlxR)、viii)甘油酸激酶II (GlxK)和其組合。在本發(fā)明具體的實(shí)施方案中，當(dāng)進(jìn)一步增加i)Acs (EC No. 6. 2. I. I ;JBacteriol. 1995 May ; 177 (10) :2878-86)或丙酮酸氧化酶單體(PoxB ；EC I. 2. 2. 2)或 ii)AckA和Pta(EC 2,3,1，8)，所有這些旨在伴隨著生產(chǎn)的NADH的消耗而有效地再利用積累的醋酸鹽，發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的重組微生物中OPS產(chǎn)量的增加(表22)。iii)GlcB(EC No. 2. 3. 3. 9)和iv)MaeB(EC 1.1.137)的功能是催化由乙醛酸合成蘋果酸和蘋果酸向丙酮酸的轉(zhuǎn)化，其可削弱TCA循環(huán)，因此可用于增加葡萄糖的消耗和O-磷酸絲氨酸的產(chǎn)量(表23)。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，催化由2-氧化戊二酸和NADPH合成SerC的底物谷氨酸的V) GdhA (EC I. 4. I. 2)的增加，賦予了微生物更高的生產(chǎn)OPS的潛能(表17)。已知vi)Glc(EC
4.I. I. 47)、vii)GlxR(EC I. I. I. 60)和 viii)GlxK(EC 2. 7. I. 31)都將乙醛酸轉(zhuǎn)化成 3-磷酸甘油酸，即增加磷酸甘油酸脫氫酶的底物的水平(Kim HJ等人，J. Bacteriol.，186(11)，3453-3460，2004 ；Eva Cusa 等人，J. Bacteriol.，181(24)，7479-7484，1999 ；Chnag YY 等人，J. Biol. Chem. 268(6) :3911-3919，1993)。當(dāng)進(jìn)一步增加 Glc、GlxR 和 GlxK 的活性，改善了本發(fā)明的重組微生物的糖消耗和生產(chǎn)(表24)。本發(fā)明的重組微生物涉及SerB活性降低從而以更高的水平生產(chǎn)OPS的任何微生物。如果條件滿足，任何微生物，無(wú)論是原核的或真核的，都落在本發(fā)明的范圍內(nèi)。它們中的典型代表為腸道菌或棒狀桿菌。用于本發(fā)明的微生物的實(shí)例包括埃希氏菌屬(Escherichia sp.)、歐文氏菌屬(Erwinia sp.)、沙雷氏菌屬(Serratia sp.)、普羅維登斯菌屬(Providencia sp.)、棒狀桿菌屬(Corynebacterium sp.)和短桿菌屬(Brevibacterium sp)。優(yōu)選為埃希氏菌屬和棒狀桿菌屬，更優(yōu)選為埃希氏菌屬,最優(yōu)選為大腸桿菌。在一個(gè)實(shí)施方案中，將能生產(chǎn)OPS的重組菌株命名為大腸桿菌CA07-0012，并于2011年10月12日保藏于位于韓國(guó)首爾市西大門區(qū)弘濟(jì)I洞，361-221的韓國(guó)微生物保藏中心(Korean Culture Center of Microorganisms),保藏號(hào)為 KCCMl 1212P。此外，在一個(gè)實(shí)施方案中，將能生產(chǎn)OPS的重組菌株命名為大腸桿菌CA07-0022/pCL-prmf-serA*(G336V) -serC，并于2010年9月28日保藏于位于韓國(guó)首爾西大門區(qū)弘濟(jì)I洞，361-221的韓國(guó)微生物保藏中心，保藏號(hào)為KCCMl1103P。本申請(qǐng)中，術(shù)語(yǔ) “CA07-0022/pCL-prmf-serA*(G336V)-serC” 可與 CA07_0022serA* (G336V) /pCL-prmf-serA* (G336V) -serC 互換使用。菌株在IL發(fā)酵罐中培養(yǎng)80小時(shí)后，以19. 5g/L的濃度生產(chǎn)0_磷酸絲氨酸(實(shí)施例 35)。如本申請(qǐng)中所使用的，術(shù)語(yǔ)“培養(yǎng)”是指在人工控制的條件下生產(chǎn)微生物?？墒褂帽绢I(lǐng)域公知的合適培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件實(shí)施培養(yǎng)過(guò)程。本領(lǐng)域技術(shù)人員可易于控制與所使用的菌株相應(yīng)的培養(yǎng)過(guò)程。例如，可以分批型、連續(xù)型、補(bǔ)料分批型實(shí)施，但不限于此。
此外，培養(yǎng)基含有碳源。碳源的實(shí)例包括糖類和碳水化合物如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麥芽糖、淀粉和纖維素，油類和脂肪如豆油、葵花油、蓖麻油和椰油，脂肪酸如棕櫚酸、硬脂酸和亞油酸，醇類如甘油和乙醇，以及有機(jī)酸如乙酸。這些碳源可單獨(dú)存在或組合存在于培養(yǎng)基中。該培養(yǎng)基可含有作為氮源的有機(jī)物如蛋白胨、酵母提取物、肉汁、麥芽提取物、玉米漿、大豆和面粉蛋白，或無(wú)機(jī)氮化合物如尿素、硫酸銨、氯化銨、磷酸銨、碳酸銨和硝酸銨。這些氮源可單獨(dú)使用或組合使用。培養(yǎng)基可含有磷酸二氫鉀、磷酸鉀或相應(yīng)的鈉鹽作為磷源。培養(yǎng)基可含有金屬鹽如硫酸鎂或硫酸鐵。培養(yǎng)基還可含有氨基酸、微生物和適合的前體物。營(yíng)養(yǎng)元素可以分批的方式或連續(xù)的方式添加到培養(yǎng)基中。在培養(yǎng)過(guò)程中，可以適宜的方式向培養(yǎng)基加入化合物如氫氧化銨、氫氧化鉀、氨、磷酸和硫酸，以調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的PH值。此外，在培養(yǎng)過(guò)程中，可用消泡劑如脂肪酸聚乙二醇酯抑制泡沫的形成。此外，為維持培養(yǎng)基中的富氧環(huán)境，可將氧氣或含氧的氣體注入到培養(yǎng)基中。為維持厭氧或微氧環(huán)境，在不通氣的條件下提供氮?dú)?、氫氣或二氧化碳。通常，可將培養(yǎng)基維持在27°C 37°C，優(yōu)選維持在30°C 35°C?？蓪⑴囵B(yǎng)期維持到獲得所需量的目標(biāo)產(chǎn)物，優(yōu)選范圍為10 100小時(shí)。為了進(jìn)一步在培養(yǎng)過(guò)程中從培養(yǎng)基中收集和回收0PS，可根據(jù)培養(yǎng)類型，即分批、連續(xù)或分批補(bǔ)料培養(yǎng)，選擇本領(lǐng)域公知的適宜方法。在本發(fā)明的方法中，步驟2)致力于在O-磷酸絲氨酸巰解酶(OPSS)或表達(dá)OPSS的微生物存在下，使步驟I)的OPS和硫化物反應(yīng)，以誘導(dǎo)將O-磷酸絲氨酸轉(zhuǎn)化成半胱氨酸或其衍生物。由于pH、壓強(qiáng)和/或溶解度的差異，可以液態(tài)或氣態(tài)以及本領(lǐng)域通常所用的固態(tài)形式提供硫化物。只要它能轉(zhuǎn)化成硫醇基(SH)，任何硫化物如硫化物(S2—)或硫代硫酸鹽(S2O32O可用于本發(fā)明中。優(yōu)選地，可為OPS提供硫醇基的Na2S、NaSH、H2S、(NH4) 2S、NaSH和Na2S2O3都可使用。在該反應(yīng)中，一個(gè)硫醇基提供給一個(gè)OPS分子，以生產(chǎn)一分子的半胱氨酸或其衍生物。在這個(gè)酶轉(zhuǎn)化中，優(yōu)選以所使用OPS摩爾濃度的O. I 3倍，更優(yōu)選以I 2倍的摩爾濃度添加硫化物。鑒于經(jīng)濟(jì)性,提供硫醇基的硫化物和OPS最優(yōu)選以摩爾比
I I使用。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，使用Na2S作為硫源。Na2S以在該轉(zhuǎn)化反應(yīng)中使用的OPS摩爾濃度的I 3倍進(jìn)行添加。優(yōu)選地，以O(shè)PS兩倍的摩爾濃度進(jìn)行添加，從而有效地將OPS轉(zhuǎn)化成半胱氨酸(表34)。如本申請(qǐng)中所使用的，術(shù)語(yǔ)“O-磷酸絲氨酸巰解酶(OPSS) ”是指催化硫醇基(SH)向OPS (O-磷酸絲氨酸)轉(zhuǎn)移從而將OPS轉(zhuǎn)化成半胱氨酸的酶。該酶首次發(fā)現(xiàn)于超嗜熱古菌(Aeropyrum pernix)、結(jié)核分支桿菌(Mycobacterium tuberculosis)和陰道毛滴蟲(Trichomonas vaginalis)中(Mino K 和 Ishikawa K, FEBS letters,551 :133-138,2003;Burns KE 等人，J. Am. Chem. Soc.，127 :11602-11603，2005)。如本申請(qǐng)中所使用的，術(shù)語(yǔ)“突變體”是指表現(xiàn)出可遺傳或不可遺傳的表型改變的培養(yǎng)物或個(gè)體。當(dāng)和OPSS —起使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)“突變體”傾向于指遺傳上發(fā)生改變的OPSS酶，其與野生型相比有效地增加了活性。在本發(fā)明中，可通過(guò)缺失、取代或添加一部分編碼OPSS核苷酸序列構(gòu)建OPSS突變。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，優(yōu)選通過(guò)缺失恥垢分枝桿菌(Mycobacterium smegmatis)OPSS酶C末端的五個(gè)氨基酸殘基而制備活性提高的OPSS酶。
可在廣泛用于酶表達(dá)的大腸桿菌中獲得OPSS突變體，使用基于密碼子優(yōu)化的基因合成方法，從而高產(chǎn)率地獲得目標(biāo)酶?；蛘撸墒褂没诖罅课⑸镞z傳信息的生物信息學(xué)有用酶來(lái)源的篩選方法獲得OPSS突變體。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)在各種微生物中篩選氨基酸的同源序列，選擇利用OPS為底物合成半胱氨酸的OPSS酶。在這點(diǎn)上，將使用通過(guò)本領(lǐng)域合適培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件獲得的細(xì)胞團(tuán)進(jìn)行裂解，接著純化含有酶的上清生產(chǎn)OPSS酶(表26)。此外，開(kāi)發(fā)了經(jīng)濟(jì)地獲得OPSS酶的高產(chǎn)率表達(dá)系統(tǒng)。使用T7啟動(dòng)子的pET載體是本領(lǐng)域公知的。然而，本發(fā)明的發(fā)明人開(kāi)發(fā)了一種名為CJl系統(tǒng)(韓國(guó)專利10-0620092BI)的酶表達(dá)系統(tǒng)，替代常規(guī)的系統(tǒng)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，在相同條件下將含有T7啟動(dòng)子的PET系統(tǒng)和含有CJl啟動(dòng)子的CJl系統(tǒng)的OPSS表達(dá)水平進(jìn)行比較。結(jié)果，CJl系統(tǒng)表現(xiàn)出比PET系統(tǒng)更高的OPSS表達(dá)水平。此外，在pET系統(tǒng)中OPSS的過(guò)表達(dá)需要低溫(18°C)和長(zhǎng)時(shí)間，但在pCL-pCJl系統(tǒng)中需要高溫(37°C)和短時(shí)間。優(yōu)選地，使用pCL-pCJl 系統(tǒng)用于獲得OPSS (實(shí)施例46)?？墒褂酶鞣N本領(lǐng)域公知的方法實(shí)現(xiàn)酶活性的增加。例如，可通過(guò)增加編碼OPSS基因的拷貝數(shù)、使用強(qiáng)啟動(dòng)子或引入基因突變來(lái)實(shí)現(xiàn)?？墒褂酶鞣N本領(lǐng)域公知的方法實(shí)現(xiàn)OPSS酶轉(zhuǎn)化的優(yōu)化。例如，該優(yōu)化可基于充分了解OPSS的特性，如最佳的溫度和pH、對(duì)底物的抑制、底物濃度、熱穩(wěn)定性等。此外，可通過(guò)酶轉(zhuǎn)化的最佳條件來(lái)確定優(yōu)化，如最佳OPSS濃度、依據(jù)濃度使用的底物的最佳平衡、為酶轉(zhuǎn)化提供SH的優(yōu)選硫化物、優(yōu)選的特定緩沖劑、產(chǎn)生的離子的影響和輔因子以及它們的最佳濃度。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，將使用上述方法獲得的OPSS酶特征化，并且基于確定的特征，開(kāi)發(fā)了經(jīng)濟(jì)上有益、具有將OPS向半胱氨酸轉(zhuǎn)化的高轉(zhuǎn)化率并保證酶穩(wěn)定性的酶轉(zhuǎn)化方法。在該酶轉(zhuǎn)化方法中，反應(yīng)溫度可設(shè)置在37°c 80°C，具體地，古細(xì)菌(Archea)的Ape-OPSS (SEQ ID NO 12)在60°C的酶活性比37°C的高，并且該酶本身對(duì)熱的穩(wěn)定性高，最佳反應(yīng)性在60°C。另一方面，Msm-T (SEQ ID NO 10)的最佳活性在37°C，并且在60°C熱處理時(shí)，活性解除。觀察到OPSS酶在6. O 10. O的pH范圍內(nèi)具有酶活性。Ape-OPSS在PH7. 4時(shí)具有最佳活性。由于Msm-T在8. O 9. O的pH范圍內(nèi)具有最佳活性，因此其與Ape-OPSS相比在更寬的pH范圍內(nèi)表現(xiàn)出穩(wěn)定性(表28和31，以及圖2和3)。作為輔助因子的0.001-2mM PLP (卩比哆醛_5’_磷酸酯)或0.001-100mM DTT可用于酶轉(zhuǎn)化中。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，在25mM DTT或0. 2mM PLP存在下，半胱氨酸轉(zhuǎn)化率提高了 2. 3倍。同樣地，用DTT或PLP處理提高了步驟2)的半胱氨酸轉(zhuǎn)化率?？紤]生產(chǎn)成本的增加和轉(zhuǎn)化率的增加，將輔助因子的添加設(shè)置在合理的水平(表30)。OPSS的反應(yīng)條件可根據(jù)所使用的OPSS的種類和濃度而改變。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，在各種條件下使用純OPS (市售獲得)、從步驟I)制備的培養(yǎng)物中純化的OPS以及步驟I)的含有OPS的培養(yǎng)物，以提供最佳的轉(zhuǎn)化率。結(jié)果，半胱氨酸轉(zhuǎn)化率根據(jù)OPSS的種類和濃度、反應(yīng)溫度以及OPS的種類和濃度而變化(圖5和6，表35)。本發(fā)明的方法可進(jìn)一步包括分離和純化步驟2)生產(chǎn)的半胱氨酸。酶轉(zhuǎn)化以后，可使用本領(lǐng)域公知的方法從培養(yǎng)基中分離和純化半胱氨酸。本領(lǐng)域技術(shù)人員可使用公知的方法通過(guò)半胱氨酸化學(xué)合成半胱氨酸衍生物。半胱氨酸可易與乙?；噭┓磻?yīng)而生產(chǎn)NAC(N-乙酰基半胱氨酸)，以及在基本條件下與鹵化醋酸反應(yīng)而生產(chǎn)SCMC (S-羧甲基半胱氨酸)。這些半胱氨酸衍生物用作治療咳嗽、支氣管炎、支氣管哮喘和咽喉痛藥物中的原料。在本發(fā)明中，通過(guò)微生物發(fā)酵獲得的OPS液體培養(yǎng)基用作合成半胱氨酸的底物。通過(guò)微生物發(fā)酵獲得的OPS液體培養(yǎng)基與常規(guī)市售獲得的純OPS相比，具有經(jīng)濟(jì)上的優(yōu)勢(shì)，因?yàn)镺PS液體培養(yǎng)基不需要額外的純化就可以使用，而且轉(zhuǎn)化所需的輔助因子PLP可從發(fā)酵培養(yǎng)物中獲得。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，開(kāi)發(fā)了一種轉(zhuǎn)化方法，當(dāng)使用50 μ g/ml Msm_T,在50mM OPS液體培養(yǎng)基或60mM純化的OPS培養(yǎng)基、IOOmM Na2S或120mM Na2S和O. 2mM PLP的條件下，這種轉(zhuǎn)化方法能確保高達(dá)80 %的半胱氨酸轉(zhuǎn)化率。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可易于優(yōu)化并按比例放大使用高活性酶的酶轉(zhuǎn)化。 根據(jù)其另一個(gè)方面，本發(fā)明提供用于生產(chǎn)OPS的SerB活性降低的重組微生物。在一個(gè)實(shí)施方案中，重組微生物表現(xiàn)出抗絲氨酸反饋的serA或serC的增加或至少一個(gè)選自PhnC/PhnD/PhnE烷基磷酸酯ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(phnCDE操縱子)、堿性磷酸酶(phoA)和酸性磷酸酶(aphA)的缺失。優(yōu)選地，生產(chǎn)OPS的重組微生物為保藏號(hào)為KCCM11103P或KCCM11212P的保藏微生物。更優(yōu)選地，生產(chǎn)OPS的重組微生物為保藏號(hào)為KCCMl 1103P的微生物。發(fā)明實(shí)施方式通過(guò)下述實(shí)施例可更好地了解本發(fā)明，所述實(shí)施例用于說(shuō)明而非旨在限制本發(fā)明?！粗苽渖a(chǎn)O-磷酸絲氨酸的棒狀桿菌(Corynebacterium)和使用該棒狀桿菌生產(chǎn)
O-磷酸絲氨酸>實(shí)施例I :制備磷酸絲氨酸磷酸酶(serB)缺失的棒狀桿菌菌株通過(guò)使編碼催化由O-磷酸絲氨酸合成L-絲氨酸的磷酸絲氨酸磷酸酶的serB基因(SEQ ID NO 13,EC 3. 1.3.3)從谷氨酸棒狀桿菌(Corynebacterium glutamicum) 13032上發(fā)生缺失，從而對(duì)其進(jìn)行修飾。將用于失活serB的片段構(gòu)建到這個(gè)末端。為此，設(shè)計(jì)用于制備本發(fā)明的重組菌株13032-Λ serB的引物。首先，根據(jù)NIH GenBank的數(shù)據(jù)，獲得谷氨酸棒狀桿菌13032的serB序列，并且基于該serB序列合成SEQ ID NOS 22 27所示的引物。為了進(jìn)行位點(diǎn)特異性基因中斷(gene disruption),使用不能在谷氨酸棒狀桿菌中復(fù)制的pDC載體。構(gòu)建其中serB的開(kāi)放閱讀框被內(nèi)部受到破壞的pDC-Δ serB質(zhì)粒,用于在谷氨酸棒狀桿菌的突變菌株中制備位點(diǎn)特異性serB基因缺失。通過(guò)使用SEQ ID NOS :22和23以及SEQ ID N0S:24和25的引物對(duì)，以谷氨酸棒狀桿菌ATCC13032的基因組DNA為模板，進(jìn)行交叉PCR，并將PCR產(chǎn)物導(dǎo)入到pDC載體中，產(chǎn)生pDC-AserB的內(nèi)部基因中斷。通過(guò)電穿孔，將產(chǎn)生的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到野生型谷氨酸棒狀桿菌中van der Rest等人，1999)。通過(guò)初級(jí)重組(交換)，再進(jìn)行二級(jí)重組(交換)將質(zhì)粒導(dǎo)入到染色體，以從染色體中切除原始serB。完成二級(jí)重組后，用SEQ ID NOS 26和27所示的一對(duì)基因特異性引物進(jìn)行診斷PCR,分析含有serB缺失突變的谷氨酸棒狀桿菌轉(zhuǎn)化子。將重組菌命名為CB01-0047。實(shí)施例2 :磷酸絲氨酸磷酸酶缺失型棒狀桿菌菌株的O-磷酸絲氨酸生產(chǎn)率試驗(yàn)將谷氨酸棒狀桿菌13032發(fā)生serB缺失而產(chǎn)生的預(yù)期積累O-磷酸絲氨酸的突變菌株CB01-0047涂布于BHIS平板，并在30°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜。此后，用鉬環(huán)將出現(xiàn)在BHIS平板上的菌落接種到如表I所示25mL的滴度培養(yǎng)基(titer medium)中，然后于30°C、200rpm振蕩培養(yǎng)48小時(shí)。結(jié)果概述與下表2中。表I
權(quán)利要求
1.生產(chǎn)半胱氨酸或其衍生物的方法，其包括 1)培養(yǎng)其中內(nèi)源磷酸絲氨酸磷酸酶(SerB)活性降低的重組微生物，以生產(chǎn)O-磷酸絲氨酸(OPS);以及 2)在O-磷酸絲氨酸巰解酶(OPSS)或表達(dá)OPSS的微生物存在下，使步驟I)的OPS和硫化物進(jìn)行反應(yīng)，以生產(chǎn)半胱氨酸或其衍生物。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中所述磷酸絲氨酸磷酸酶具有SEQID N0:1或2所示的氨基酸序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中通過(guò)選自下組的方法降低酶活性缺失編碼該酶的染色體基因、向染色體基因中引入突變以降低內(nèi)源基因活性、用突變基因取代染色體基因以降低內(nèi)源酶活性、向基因的調(diào)控區(qū)引入突變以降低內(nèi)源基因活性，以及引入與基因轉(zhuǎn)錄本互補(bǔ)的反義寡核苷酸以抑制mRNA的翻譯。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中內(nèi)源SerB活性被降低的重組微生物培養(yǎng)于含有甘氨酸或絲氨酸的培養(yǎng)基中。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中培養(yǎng)基所含的甘氨酸的量為O.I 10g/L。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中培養(yǎng)基中所含的絲氨酸的量為O.I 5g/L。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中所述重組微生物被進(jìn)一步改性，以增加磷酸甘油酸脫氫酶(SerA)或磷酸絲氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(SerC)的活性。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中SerA為野生型或抗絲氨酸反饋抑制的突變體。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中 i)SerA具有選自SEQ ID NOS 3 7的一種氨基酸序列；以及 ii)SerC具有SEQ ID NO 8的氨基酸序列。
10.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中所述重組微生物被進(jìn)一步改性，以降低PhnCDE (phnC (磷酸酯轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白EG 10713的ATP結(jié)合組分)-phnD (Pn轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白EG 10714的周質(zhì)結(jié)合組分)-PhnE (烷基磷酸酯ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白EG 11283的整體膜組分))。
11.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中所述重組微生物被進(jìn)一步改性，以降低堿性磷酸酶(PhoA)或酸性磷酸酶(AphA)的活性。
12.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中所述重組微生物被進(jìn)一步改性，以增加核苷酸轉(zhuǎn)氫酶(PntAB)的活性。
13.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中所述重組微生物被進(jìn)一步改性，以增加失少一種選自下組酶的活性0-乙?；z氨酸/半胱氨酸外排透性酶(YfiK)、高絲氨酸/高絲氨酸內(nèi)酯外排蛋白(RhtB)，以及蘇氨酸/高絲氨酸外排蛋白(RhtC)。
14.根據(jù)權(quán)利要求7、12或13所述的方法，其中通過(guò)選自下述的方法增加酶活性水平增加編碼酶的基因的拷貝數(shù)、向基因調(diào)控區(qū)引入突變以增加酶活性、用突變基因取代染色體基因以增加酶活性，以及向染色體基因引入突變以增加酶活性。
15.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中所述重組微生物被進(jìn)一步改性，以降低至少一種選自下組的酶的活性磷酸甘油酸變位酶同工酶(GpmA、GpmI或GpmB)。
16.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中所述重組微生物被進(jìn)一步改性，以降低L-絲氨酸脫水酶I (SdaA)的活性。
17.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中所述重組微生物被進(jìn)一步改性，以降低2-氨基-3-酮丁酸輔酶A連接酶(Kbl)或轉(zhuǎn)錄因子(IclR)的活性。
18.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中所述重組微生物被進(jìn)一步改性，以增加至少一種選自下組的酶的活性乙?；?CoA合成酶(Acs)、乙酸激酶(AckA)-磷酸轉(zhuǎn)乙酰基酶(Pta)、蘋果酸合成酶G(GlcB)、蘋果酸脫氫酶(MaeB)、谷氨酸脫氫酶(GdhA)、乙醛酸醛連接酶(Glc)、羥丙二酸半醛還原酶2 (GlxR)和甘油酸激酶II (GlxK)。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中所述重組微生物通過(guò)增加至少一種選自下組的酶的活性而在糖消耗和生長(zhǎng)方面得到改善Glc、GlxR以及GlxK。
20.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中所述重組微生物為埃希氏菌屬(Escherichiasp.)或棒狀桿菌(Coryneform bacteria)。
21.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中步驟2)的硫化物選自下組Na2S、NaSH、(NH4)2S,H2S、Na2S2O3和其組合。
22.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中步驟2)中使用的硫化物的摩爾濃度為酶轉(zhuǎn)化中所用OPS的O. I 3倍。
23.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中步驟2)的OPSS源自至少一種選自下述的菌種超嗜熱古菌(Aeropyrum pernix)、結(jié)核分支桿菌(Mycobacterium tuberculosis)、恥垢分枝桿菌(Mycobacterium smegmatis)和陰道毛滴蟲(Trichomonas vaginalis)。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其中OPSS被進(jìn)一步改性，以增加步驟2)的轉(zhuǎn)化率。
25.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中在選自O(shè).001 2mM PLP (吡哆醛-5-磷酸酯)、O. 001 IOOmM DTT (二硫蘇糖醇)和其組合的輔助因子的存在下，進(jìn)行步驟2)的轉(zhuǎn)化。
26.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其進(jìn)一步包括純化分離和純化半胱氨酸或其衍生物。
27.重組微生物，其內(nèi)源SerB的活性被降低。
28.根據(jù)權(quán)利要求27所述的重組微生物，其被進(jìn)一步改性，以增加SerA或SerC的活性，其中所述SerA抗絲氨酸的反饋抑制。
29.根據(jù)權(quán)利要求27所述的重組微生物，其被進(jìn)一步改性，以降低Phn⑶E、PhoA和AphA中至少一種的活性。
30.根據(jù)權(quán)利要求27所述的重組微生物，其保藏號(hào)為KCCMl1103P。
全文摘要
本發(fā)明涉及用O-磷酸絲氨酸作為中間體生產(chǎn)半胱氨酸或其衍生物的方法以及用于生產(chǎn)O-磷酸絲氨酸的重組微生物。
文檔編號(hào)C12N15/54GK102906272SQ201180002042
公開(kāi)日2013年1月30日 申請(qǐng)日期2011年10月18日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月20日
發(fā)明者申秀安, 嚴(yán)惠媛, 張真淑, 裵賢愛(ài), 全成后, 趙宰賢, 宋秉哲, 李京珉, 梁殷彬, 申容旭, 金蕙園, 金率 申請(qǐng)人:Cj第一制糖株式會(huì)社