被描述為“附加器官”的腸道微生物群落(或腸道微生物叢)通過行使眾多生物學功能來發(fā)揮對于宿主有益的關鍵作用，例如有助于消化的效率、底物的代謝、針對病原體的斗爭或者免疫應答的確立和穩(wěn)態(tài)。不同腸道細菌種群之間的不平衡具有有時有害的回應，其導致各種不同的病理學狀況(例如，慢性炎性疾病，或代謝病癥，包括肥胖癥或者2型糖尿病)的發(fā)展。這些不平衡還潛在地牽涉癌癥的發(fā)展和行為綜合征的確立。因此，維持腸道微生物叢的平衡是必需的：影響其組成和/或其活性將會是用于治療上述綜合征的一個主要成功手段。本著該精神，使用所謂“益生的”細菌菌株來干預由所述微生物叢所影響的病理學狀況的想法體現(xiàn)了其全部意義。

2001年由世界衛(wèi)生組織(WHO)和聯(lián)合國糧農(nóng)組織(FAO)定義，益生菌是“當以足夠的量攝入時對于健康產(chǎn)生超過傳統(tǒng)營養(yǎng)效應之外的正面效應的活微生物”。

至于本發(fā)明，其屬于允許優(yōu)化幼年生長或者在營養(yǎng)不良的背景下恢復正常的幼年生長的條件重建。

因此，本發(fā)明的目標在于提出新的組合物，其允許在已經(jīng)經(jīng)歷或正經(jīng)歷營養(yǎng)不良(尤其是進食不足和/或同化不良)的人或動物受試者中促進幼年生長或者重建正常的幼年生長。

本發(fā)明的另一個目標在于提供這樣的組合物，其基于使用具有腸道向性的細菌菌株，尤其是共生的或者作為益生菌可接受的菌株。

本發(fā)明的另一個目標在于提供這樣的組合物，其還可以被納入在治療背景中。

本發(fā)明的另外一個目標在于提供益生性處理或治療性處理的方法。

本發(fā)明的另外一個目標在于提供這樣的組合物和方法，其允許支持按照現(xiàn)行法規(guī)(尤其是歐洲法規(guī))的健康和/或營養(yǎng)主張。

本發(fā)明基于這樣的事實，即某些在動物物種中具有腸道向性的細菌菌株具有在經(jīng)歷營養(yǎng)不良(尤其是進食不足或同化不良)的該同一物種或另一物種的受試者中促進或重建幼年生長的效應。因此，已經(jīng)能夠證明乳桿菌屬(Lactobacillus)的細菌菌株在果蠅模型中和在與營養(yǎng)缺乏型營養(yǎng)飲食制度相聯(lián)合的小鼠模型中均能夠促進幼年生長，和此外，已經(jīng)能夠在這些在小鼠中的結(jié)果與在這些條件下用這些細菌處理的小鼠中的IGF-1血清滴度的增加之間建立聯(lián)系。

因此，本發(fā)明的目標在于包含至少一種具有腸道向性的細菌菌株(特別是乳酸細菌)的組合物，所述組合物用于為了在營養(yǎng)不良的情況下促進幼年生長而進行使用。營養(yǎng)不良的概念集合了進食不足、進食過量和同化不良。本發(fā)明特別地針對進食不足和/或同化不良。本發(fā)明優(yōu)選地針對進食不足。所述組合物的適應癥將可以是治療性的或健康的，例如藥物，或者是營養(yǎng)性的，例如益生制劑。

具有“腸道向性”的細菌是指具有通過胃屏障的能力和能夠在腸中堅持的細菌。

按照本發(fā)明的一個有利的特征，所述細菌可以在用根據(jù)本發(fā)明的組合物進行處理的人或動物中促進IGF-1的產(chǎn)生。

本發(fā)明尤其提出了屬于下列科的細菌菌株：乳桿菌科(Lactobacillaceae)、鏈球菌科(Streptoccaceae)、腸球菌科(Enterococcaceae)、明串珠菌科(Leuconostocaceae)、雙歧桿菌科(Bifidobacteriaceae)。依照一種方式，本發(fā)明使用一種或多種乳桿菌屬菌株，特別是下列物種之一：德氏乳桿菌(Lactobacillus delbrueckii)、植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)、發(fā)酵乳桿菌(Lactobacillus fermentum)、干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)、類干酪乳桿菌(Lactobacillus paracasei)、鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus)。

更特別地，所述細菌為屬于植物乳桿菌、發(fā)酵乳桿菌、干酪乳桿菌、類干酪乳桿菌、鼠李糖乳桿菌這些物種的細菌。依照一種方式，所述菌株選自植物乳桿菌、發(fā)酵乳桿菌、干酪乳桿菌這些物種。

依照一個實施方案，所述細菌菌株選自植物乳桿菌WJL、植物乳桿菌G821、干酪乳桿菌ATCC 393、干酪乳桿菌L919、類干酪乳桿菌ATCC25302、類干酪乳桿菌Shirota、發(fā)酵乳桿菌ATCC9338、鼠李糖乳桿菌L900、鼠李糖乳桿菌L908、鼠李糖乳桿菌GG。依照一種方式，所述菌株選自植物乳桿菌WJL、植物乳桿菌G821、干酪乳桿菌ATCC 393、干酪乳桿菌L919、發(fā)酵乳桿菌ATCC9338。

在一個特別的實施方案中，所述細菌是植物乳桿菌這一物種的細菌，例如菌株WJL，或菌株G821，其于2015年5月11日以登記號CNCM I-4979保藏于國家微生物保藏中心(Collection Nationale de Culture de Microorganismes)(Institut Pasteur)。已經(jīng)通過植物乳桿菌NIZO2877這一菌株的實驗進化(即通過天然變體的積累和選擇)而獲得了菌株G821。

依照一種方式，根據(jù)本發(fā)明的組合物包含至少一種從這些群中選擇的細菌菌株，其具有所要求的特性并且允許促進或重建幼年生長，盡管有著營養(yǎng)不良的插曲。當然，根據(jù)本發(fā)明的組合物可以包含多于一種符合本發(fā)明的需求的細菌菌株。尤其，所述組合物包含選自相同物種或不同物種的2種或更多種這些細菌菌株。

依照一個令人感興趣的實施方案，所述細菌為植物乳桿菌。合適的菌株為植物乳桿菌G821和植物乳桿菌WJL(Eun-Kyoung Kim等人,Genome Announcements,2013年11/12月,vol.1,no.6e00937-13,GenBank AUTE00000000,Lactobacillus plantarum WJL,whole genome shotgun sequencing project)。該菌株WJL最初已分離出并且可以從果蠅中分離(JH Ryu等人,Science 2008,319:777-782)。

合適菌株的其他例子為下列：干酪乳桿菌ATCC 393、干酪乳桿菌L919(Koryszewska-Baginska A.等人,2013年9月26日,Genome Announc)、類干酪乳桿菌ATCC25302、類干酪乳桿菌Shirota(Yuki N等人,Int J Food Microbiol.1999年4月1日,48(1):51-7)、發(fā)酵乳桿菌ATCC9338、鼠李糖乳桿菌L900(Aleksandrzak-Piekarczyk T.等人,Genome Announc,2013年8月15日)、鼠李糖乳桿菌L908(Koryszewska-Baginska A.等人,2014年2月20日,Genome Announc)、鼠李糖乳桿菌GG(Kankainen M.等人,Proc Natl Acad Sci USA,2009年10月6日)。

因此，本發(fā)明在技術(shù)上提供了教導，即具有腸道向性的細菌菌株促進幼年生長，尤其是在營養(yǎng)不良的(人或動物)患者中。但是，本發(fā)明并不局限于該教導，它還向技術(shù)人員提供可靠地測定對于本發(fā)明來說有用的細菌菌株。不同的標準可以基于測試，其中單獨地或相聯(lián)合地進行使用。在這些標準中，將會注意到在模型動物(例如小鼠)中的IGF-1血清水平、在黑腹果蠅(Drosophila melanogaster)中的幼蟲生長、模型小鼠的生長(例如通過股骨大小或動物大小的獲取來舉例說明)。在這些標準或相似標準的基礎之上，對于技術(shù)人員來說可能的是，制定這樣的測試，其比較在營養(yǎng)不良的條件下在待測試細菌存在或不存在下所飼養(yǎng)的個體。通過下述方式，本發(fā)明還提供了更多：提出無菌動物模型和在待測試細菌存在或不存在下的動物飼養(yǎng)，從而使得能夠?qū)y試集中在所測試的菌株的內(nèi)在特性的分析上并因此擺脫常規(guī)動物的常駐腸道微生物叢在功能測試的背景下可能具有的效應。由此得到關于所測試的菌株的功能潛力的測試的增加的可預測性。

“無菌(的)”生物是指在沒有微生物并因此沒有腸道微生物區(qū)系的環(huán)境中飼養(yǎng)的生物(例如果蠅、小鼠)。

“單菌(的)”生物是指在單一微生物存在下進行飼養(yǎng)并因此攜帶該單一微生物作為腸道微生物區(qū)系的相關聯(lián)的無菌生物(例如果蠅、小鼠)。

依照本發(fā)明的一個特征，根據(jù)本發(fā)明的細菌菌株的特征在于，它們對于這樣的測試作出陽性反應或者已通過使用這樣的測試而被選擇，在所述測試中將在缺乏酵母(并因此缺乏蛋白質(zhì))的營養(yǎng)培養(yǎng)基上來自無菌果蠅的幼蟲的生長與在常規(guī)營養(yǎng)培養(yǎng)基上的生長進行比較。實驗室的常規(guī)營養(yǎng)培養(yǎng)基通常至少包含植物粉，典型地玉米粉，滅活酵母，典型地啤酒酵母或面包酵母(釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))，瓊脂，和水。缺乏滅活酵母的培養(yǎng)基不允許果蠅幼蟲的最佳的胚胎后(即幼年)發(fā)育，如已經(jīng)在G.Storelli等人,Cell Metabolism 14,403-414,2011中所報告的。此外，用待測試細菌接種一組胚胎，這允許將從胚胎出現(xiàn)的幼蟲與待測試細菌相關聯(lián)。因此，可以檢測該細菌是否能夠促進或允許幼年生長，盡管是缺乏酵母的營養(yǎng)培養(yǎng)基。

所述果蠅測試典型地以下述方式來進行：

-擁有一批來自無菌的黑腹果蠅親本(例如，果蠅yw這一株系，或任何其他所謂“野生型”的株系)的胚胎；

-在第1天：在包含玉米粉、瓊脂和水且缺乏酵母的營養(yǎng)培養(yǎng)基上將這些胚胎分配成至少2個組(40個胚胎，以三次重復實施，對于總共120個胚胎/組)，此外將所述胚胎組之一用在鹽水緩沖液(例如PBS)中的大約10⁸CFU的待測試細菌的懸浮液進行接種，這形成單菌組，另一組形成無菌組，在大約25℃下進行飼養(yǎng)直至第7天；典型地，所述培養(yǎng)基由7.14g的瓊脂、80g的玉米粉和6g的滅活酵母(對于1升的培養(yǎng)基而言)組成，將所述培養(yǎng)基在沸水中煮10分鐘，然后冷卻；典型地，不缺乏滅活酵母的相同的培養(yǎng)基包含50g的滅活酵母；

-在第7天：從每個組中回收至少60只來自經(jīng)接種或未接種的胚胎的果蠅幼蟲(分別為單菌幼蟲和無菌幼蟲)，對它們施行快速的熱休克(例如5秒鐘；典型地，將幼蟲在加熱至100℃的板上放置5秒鐘；這涉及殺死幼蟲而不使其變形以便使得能夠測量其大小)；

-測定每個組的幼蟲的長度平均值，并比較所獲得的平均值；

-如果單菌組的幼蟲的長度平均值以下述程度大于無菌組的幼蟲的長度平均值，那么認為所測試的細菌菌株對于所述測試作出陽性反應：在對于所述兩個組的幼蟲的整套大小數(shù)據(jù)進行的Mann-Whitney統(tǒng)計學檢驗中具有小于或等于0.001，優(yōu)選地小于或等于0.0001的p值。

因此，本發(fā)明的目標在于包含至少一種具有腸道向性的細菌菌株(特別是乳酸細菌)的組合物，所述組合物用于為了在營養(yǎng)不良的情況下促進幼年生長而進行使用，其中所述細菌菌株對于上面所描述的在果蠅上的測試作出陽性反應。作為例子，可以提及下列菌株：植物乳桿菌WJL、植物乳桿菌G821、干酪乳桿菌ATCC 393、干酪乳桿菌L919、類干酪乳桿菌ATCC25302、類干酪乳桿菌Shirota、發(fā)酵乳桿菌ATCC9338、鼠李糖乳桿菌L900、鼠李糖乳桿菌L908、鼠李糖乳桿菌GG。其他菌株可以從具有腸道向性的細菌中和尤其是從上面提及的物種中鑒定出來。

在本發(fā)明的一個實施方案中，使用菌株WJL或具有“明顯的”效應的任何其他菌株(例如，干酪乳桿菌ATCC 393、發(fā)酵乳桿菌ATCC 9338、類干酪乳桿菌ATCC 25302)作為參照菌株以便鑒定和選擇這樣的細菌菌株，其具有“明顯的”對于幼年生長的效應，即與該參照菌株例如WJL的效應接近的效應(并非顯著地不同于參照菌株例如WJL的效應)，或者“強的”對于幼年生長的效應(顯著地大于參照菌株例如WJL的效應)。

為此，將所述果蠅測試(包括60只幼蟲/條件)應用于參照菌株例如WJL和待測試菌株(平行地，優(yōu)選地或者可以擁有對于參照菌株例如WJL事先產(chǎn)生的參照數(shù)據(jù)，例如在實施例中所給出的數(shù)據(jù))。然后，比較關于所述兩個菌株而獲得的平均值。如果單菌組的幼蟲的長度平均值并不顯著地不同于參照組(例如WJL)的幼蟲的長度平均值，那么認為所測試的細菌菌株為具有明顯的效應的菌株，其中在對于整套數(shù)據(jù)進行的Mann-Whitney統(tǒng)計學檢驗中具有大于0.001的p值。如果關于待測試菌株的所述平均值顯著地大于關于參照菌株例如WJL的平均值，那么該效應是強的，這是當統(tǒng)計學檢驗的p值小于或等于0.001，優(yōu)選地小于或等于0.0001時的情況。如果關于待測試菌株的所述平均值顯著地小于關于參照菌株例如WJL的平均值，那么該效應被視為中間的，這是當統(tǒng)計學檢驗的p值小于或等于0.001，優(yōu)選地小于或等于0.0001時的情況。

因此，本發(fā)明的目標在于包含至少一種具有腸道向性的細菌菌株(特別是乳酸細菌)的組合物，所述組合物用于為了在營養(yǎng)不良的情況下促進幼年生長而進行使用，其中所述細菌菌株在上面所描述的果蠅模型中對于生長具有明顯或強的效應。作為例子，可以提及下列菌株：植物乳桿菌WJL、植物乳桿菌G821、干酪乳桿菌ATCC 393、干酪乳桿菌L919、類干酪乳桿菌ATCC25302、類干酪乳桿菌Shirota、發(fā)酵乳桿菌ATCC9338、鼠李糖乳桿菌L900、鼠李糖乳桿菌L908、鼠李糖乳桿菌GG。其他菌株可以從具有腸道向性的細菌中和尤其是從上面提及的物種中鑒定出來。

本發(fā)明的目標尤其在于包含具有腸道向性的細菌菌株(其尤其屬于上面提及的科、屬或物種，優(yōu)選地屬于乳桿菌屬)的組合物，所述組合物用于旨在在營養(yǎng)不良的情況下促進幼年生長的用途，其中所述細菌菌株對于下述測試作出陽性反應：

-擁有一批無菌的黑腹果蠅親本的胚胎；

-在第1天：在包含玉米粉、瓊脂和水且缺乏酵母的營養(yǎng)培養(yǎng)基上將這些胚胎分配成至少2個組(40個胚胎，以三次重復實施，即120個胚胎/組)，將所述胚胎組之一用在鹽水緩沖液中的大約10⁸CFU的所述細菌的懸浮液進行接種，這形成測試單菌組，將另一組用在鹽水緩沖液中的大約10⁸CFU的參照細菌即植物乳桿菌WJL、干酪乳桿菌ATCC 393、發(fā)酵乳桿菌ATCC 9338或類干酪乳桿菌(L.paracasei)ATCC 25302的懸浮液進行接種，從而形成參照單菌組，在大約25℃下進行這兩個組的飼養(yǎng)直至第7天；

-在第7天：從每個組中回收至少60只果蠅幼蟲，對它們施行熱休克；

-測定每個組的幼蟲的長度平均值，并比較所獲得的平均值；

-所述細菌菌株相對于參照細菌而言具有強的效應，其中用該細菌菌株的測試單菌組的幼蟲的長度平均值顯著地大于關于用參照菌株的單菌組的平均值，其中在對于所述兩個組的幼蟲的整套大小數(shù)據(jù)進行的Mann-Whitney統(tǒng)計學檢驗中p值小于或等于0.001，優(yōu)選地小于或等于0.0001。

根據(jù)本發(fā)明，還可能的是，通過使用無菌小鼠模型來測定具有腸道向性的細菌菌株是否允許在營養(yǎng)不良的情況下促進生長，所述無菌小鼠模型使得能夠與微生物叢的不存在和/或與參照細菌菌株的存在相比較地實施在待測試細菌存在下小鼠骨骼生長的監(jiān)測。該模型可以以最初的意圖進行使用或者在對于果蠅測試作出陽性反應的菌株上進行使用。

依照本發(fā)明的一個特征，根據(jù)本發(fā)明的細菌菌株的特征在于，它們對于下面的骨骼生長測試作出陽性反應：

-從相同的小鼠品系(典型地，Balb/c小鼠)開始，建立無菌親本小鼠品系和單菌親本小鼠品系(與待測試細菌相關聯(lián)的)，并且產(chǎn)生幼年鼠，將所述幼年鼠與親本一起用常規(guī)營養(yǎng)培養(yǎng)基進行飼養(yǎng)直至其斷奶(在第21天)；為了形成單菌幼年鼠組，使用與待測試細菌菌株單相關聯(lián)的親本；

-在第21天：擁有來自這兩個品系中每一個品系的8只經(jīng)斷奶的幼年鼠，從而形成單菌組和無菌組，并且將它們以缺乏蛋白質(zhì)(8％)和脂質(zhì)(2.5％)的營養(yǎng)飲食制度進行飼養(yǎng)；典型地，常規(guī)營養(yǎng)飲食制度包含23％的蛋白質(zhì)和5％的脂質(zhì)；

-在第56天：通過對每個個體從口鼻部端部至尾巴基部進行測量，測定關于所考慮的組的小鼠的大小平均值；另一種可能的測量在于處死個體、從中取出股骨和測量這些股骨；

-如果單菌組的個體和/或股骨的平均大小分別以下述程度大于無菌組的個體和/或股骨的平均大小，那么認為所述乳酸細菌菌株對于所述測試作出陽性反應：在Tukey統(tǒng)計學檢驗中具有小于或等于0.05的p值。

因此，本發(fā)明的目標在于包含至少一種具有腸道向性的細菌菌株(特別是乳酸細菌)的組合物，所述組合物用于為了在營養(yǎng)不良的情況下促進幼年生長而進行使用，其中所述細菌菌株對于在小鼠上的骨骼生長測試作出陽性反應。果蠅測試允許更快速的篩選，因而通常也擁有在果蠅上的測試，并且所述細菌菌株對于果蠅測試和骨骼生長測試作出陽性反應。作為例子，可以提及下述菌株：植物乳桿菌WJL。其他菌株可以從具有腸道向性的細菌中，和尤其是從上面提及的物種和菌株中，尤其是從植物乳桿菌G821、干酪乳桿菌ATCC 393、干酪乳桿菌L919、類干酪乳桿菌ATCC25302、類干酪乳桿菌Shirota、發(fā)酵乳桿菌ATCC9338、鼠李糖乳桿菌L900、鼠李糖乳桿菌L908、鼠李糖乳桿菌GG這些菌株中鑒定出來。

在本發(fā)明的一個實施方案中，使用菌株WJL或具有“明顯的”效應的其他菌株作為參照菌株以便鑒定和選擇這樣的細菌菌株，其具有“明顯的”對于幼年生長的效應，即與該參照菌株例如WJL的效應接近的效應(并非顯著地不同于參照菌株例如WJL的效應)，或者“強的”對于幼年生長的效應(顯著地大于參照菌株例如WJL的效應)。

為此，將所述小鼠測試(包括8只小鼠/條件)應用于參照菌株例如WJL和待測試菌株(平行地，優(yōu)選地或者可以擁有對于菌株WJL事先產(chǎn)生的參照數(shù)據(jù)，例如在實施例中所給出的數(shù)據(jù))。然后，比較關于所述兩個菌株而獲得的平均值。如果單菌組的個體和/或股骨的平均大小的平均值并不顯著地不同于關于參照組(例如WJL)的相應的平均值，那么認為所測試的細菌菌株為具有明顯的效應的菌株，其中在Tukey統(tǒng)計學檢驗中具有大于0.05的p值。如果關于待測試菌株的所述平均值顯著地大于關于參照菌株例如WJL的平均值，那么該效應是強的，這是當統(tǒng)計學檢驗的p值小于或等于0.05時的情況。如果關于待測試菌株的所述平均值(其已在前面的測試中相關于無菌小鼠進行了描述)顯著地小于關于參照菌株例如WJL的平均值，那么該效應被視為中間的，這是當統(tǒng)計學檢驗的p值小于或等于0.05時的情況。

根據(jù)本發(fā)明的組合物優(yōu)選地將會包含具有這樣的明顯或強的效應的細菌菌株。

根據(jù)本發(fā)明的細菌菌株的特征可以在于，它們對于血清IGF-1水平具有正面影響。因此，在無菌小鼠模型的基礎之上，可能的是證明，用具有低的蛋白質(zhì)含量的培養(yǎng)基但在細菌存在下進行飼養(yǎng)的小鼠(單菌小鼠)具有更大的生長和同時更高的血清IGF-1水平，相對于用該缺乏蛋白質(zhì)的培養(yǎng)基并且在細菌不存在下進行飼養(yǎng)的這些相同小鼠(無菌小鼠)而言。這使得能夠提出這樣的測試，其使得能夠測定細菌菌株是否具有增加IGF-1血清水平的潛力，該測試可以與骨骼生長測試相聯(lián)合地進行應用以便明確或提煉所述菌株在該幼年生長背景下的效應，或者以最初的意圖進行應用。

在該情況下，根據(jù)本發(fā)明的細菌菌株的特征在于，它們對于下面的血清IGF-1水平測試作出陽性反應：

-從相同的無菌小鼠品系(典型地，Balb/c小鼠)開始，建立無菌親本小鼠品系和單菌親本小鼠品系(與待測試細菌相關聯(lián)的)，并且產(chǎn)生幼年鼠，將所述幼年鼠與親本一起用常規(guī)營養(yǎng)培養(yǎng)基進行飼養(yǎng)直至其斷奶(第21天)；為了形成單菌幼年鼠組，使用與待測試細菌菌株單相關聯(lián)的親本；

-在第21天：擁有來自這兩個品系中每一個品系的8只經(jīng)斷奶的幼年鼠，從而形成單菌組和無菌組，并且將它們以缺乏蛋白質(zhì)(8％)和脂質(zhì)(2.5％)的營養(yǎng)飲食制度進行飼養(yǎng)；典型地，常規(guī)營養(yǎng)飲食制度包含23％的蛋白質(zhì)和5％的脂質(zhì)；

-在第56天：抽取每個組的幼年鼠的血液，并測定關于每個組的IGF-1的平均血清水平；IGF-1血清水平的該測量優(yōu)選地在經(jīng)稀釋的(1:25)血清上進行；優(yōu)選地使用IGF-1檢測的商業(yè)ELISA試劑盒，其中依照制造商的使用說明書；

-如果單菌組的IGF-1的平均血清水平以下述程度大于無菌組的平均血清水平，那么認為所述乳酸細菌菌株對于所述測試作出陽性反應：在Tukey統(tǒng)計學檢驗中具有小于或等于0.05的p值。

因此，本發(fā)明的目標在于包含至少一種具有腸道向性的細菌菌株(特別是乳酸細菌)的組合物，所述組合物用于為了在營養(yǎng)不良的情況下促進幼年生長而進行使用，其中所述細菌菌株增加血清IGF-1水平。它尤其是對于上面所描述的在小鼠上的測試作出陽性反應的細菌菌株。

本發(fā)明的目標還在于包含至少一種具有腸道向性的細菌菌株(特別是乳酸細菌)的組合物，所述組合物用于為了在營養(yǎng)不良的情況下促進幼年生長而進行使用，其中所述細菌菌株對于在小鼠上的骨骼生長測試作出陽性反應并在這些相同小鼠中增加IGF-1血清水平，所述菌株尤其還對于在果蠅上的測試作出陽性反應。

作為例子，可以提及下述菌株：植物乳桿菌WJL。其他菌株可以從具有腸道向性的細菌中，和尤其是從上面提及的物種和菌株中，尤其是從植物乳桿菌G821、干酪乳桿菌ATCC 393、干酪乳桿菌L919、類干酪乳桿菌ATCC25302、類干酪乳桿菌Shirota、發(fā)酵乳桿菌ATCC9338、鼠李糖乳桿菌L900、鼠李糖乳桿菌L908、鼠李糖乳桿菌GG這些菌株中鑒定出來。

在本發(fā)明的一個實施方案中，使用菌株WJL或具有“明顯的”效應的其他菌株作為參照菌株以便鑒定和選擇這樣的細菌菌株，其具有“明顯的”對于IGF-1血清水平的效應，即與該參照菌株例如WJL的效應接近的效應(并非顯著地不同于參照菌株例如WJL的效應)，或者“強的”對于IGF-1血清水平的效應(顯著地大于參照菌株例如WJL的效應)。

為此，將所述用于測量IGF-1血清水平的小鼠測試(包括8只小鼠/條件)應用于參照菌株例如WJL和待測試菌株(平行地，優(yōu)選地或者可以擁有對于參照菌株例如WJL事先產(chǎn)生的參照數(shù)據(jù)，例如在實施例中所給出的數(shù)據(jù))。然后，比較關于所述兩個菌株而獲得的IGF-1血清水平平均值。如果單菌組的IGF-1水平平均值并不顯著地不同于關于參照組(例如WJL)的平均值，那么認為所測試的細菌菌株為具有明顯的效應的菌株，其中在Tukey統(tǒng)計學檢驗中具有大于0.05的p值。如果當p值小于或等于0.05時，關于待測試菌株的所述平均值顯著地大于關于參照菌株例如WJL的平均值，那么該效應是強的。如果當p值小于或等于0.05時，關于待測試菌株的所述平均值(其事先對于前面的無菌測試進行了描述)顯著地小于關于參照菌株例如WJL的平均值，那么該效應被視為中間的。因此，根據(jù)本發(fā)明的組合物優(yōu)選地將會包含具有這樣的明顯或強的效應的細菌菌株，和特別地該細菌菌株同時對于骨骼生長和對于IGF-1血清水平具有明顯或強的效應。

包含至少一種按照本發(fā)明的細菌菌株的根據(jù)本發(fā)明的組合物能夠用作旨在在營養(yǎng)不良(尤其是具有蛋白質(zhì)缺乏的營養(yǎng)不良)的情況下促進幼年生長的藥物或益生制劑。依照本發(fā)明的一個特征，待處理的受試者(其是營養(yǎng)不良的或已經(jīng)經(jīng)過了營養(yǎng)不良的)可以具有比在相同年齡和性別的且非營養(yǎng)不良的個體中所碰到的IGF-1血清水平低的IGF-1血清水平。

所述組合物可用于從出生至青春期的人。

所述組合物可用于處于斷奶和性成熟之間的哺乳動物，尤其是農(nóng)用動物(牛、綿羊、山羊、豬、禽類)、伴侶動物(狗、貓)和體育運動用動物(馬、單峰駝、雙峰駝)。

所述組合物包含10⁵至10¹²，尤其是10⁶至10¹²，優(yōu)選地10⁸至10¹²個根據(jù)本發(fā)明的形成菌落的細菌細胞(CFU)/克組合物這樣的量。按照英語的技術(shù)表述，術(shù)語“CFU”表示“菌落形成單位”?！敖M合物的克數(shù)”優(yōu)選地涉及由細菌、共組分和賦形劑或載體形成的藥物組合物或益生組合物?！凹毦毎鄙婕鞍凑毡景l(fā)明的單一細菌菌株，或者至少兩種按照本發(fā)明的細菌的混合物。

所述組合物包含以活的形式的乳酸細菌。所述組合物可以是細菌懸浮液，其可以進行冷凍和在使用前進行解凍；或者凍干粉末，其可以就這樣進行使用或在接納在合適的載體中之后進行使用。在這種情況下，所述組合物可以包含慣用的凍干賦形劑。

所述組合物可以是口服施用形式(例如，粉劑、明膠膠囊、片劑)，其任選地以使得能夠通過胃并在腸中釋放細菌的保護胃的形式。

本發(fā)明的目標還在于用于在營養(yǎng)不良的情況下促進幼年生長的益生性處理或治療性處理的方法，所述方法包括向有此需要的(即營養(yǎng)不良的或已經(jīng)經(jīng)歷了營養(yǎng)不良時期的，所述營養(yǎng)不良尤其具有蛋白質(zhì)缺乏)人患者(從出生至青春期)或動物患者(從斷奶至性成熟)施用根據(jù)本發(fā)明的組合物。有此需要的患者可以具有比在相同年齡和性別的且非營養(yǎng)不良的個體中所碰到的IGF-1血清水平低的IGF-1血清水平。

如所指出的，所述方法可以是治療性處理或益生性(或營養(yǎng)補充的)處理。所述方法包括施用足夠量的上面所描述的組合物。數(shù)量和施用頻率將會尤其取決于營養(yǎng)不良的嚴重度、患者的年齡和患者的狀況。所述方法將會包括以一次或幾次施用根據(jù)本發(fā)明的組合物的劑量，所述施用可以在受試者的生長期(直至青春期或性成熟)內(nèi)分期進行。所述劑量可以是分成幾部分的以有助于施用，尤其是根據(jù)患者的年齡。施用頻率尤其在每天一劑(單一的或分成幾部分的)和每月一劑之間。典型地，施用頻率將會在每天一劑(單一的或分成幾部分的)和每周一劑之間，甚至每2、3、4、5或6天一劑。每個劑量(單一的或分成幾部分的)尤其相當于幾克至幾十克的組合物。所述方法尤其包括施用這樣的組合物，其包含10⁵至10¹²，尤其是10⁶至10¹²，優(yōu)選地10⁸至10¹²個形成菌落的細菌細胞(CFU)/克組合物這樣的量(細菌細胞涉及按照本發(fā)明的單一細菌菌株，或者至少兩種按照本發(fā)明的細菌的混合物)。所述方法尤其包括施用包含以活的形式的乳酸細菌的組合物。該組合物可以是細菌懸浮液，其可以進行冷凍和在使用前進行解凍；或者凍干粉末，其可以就這樣進行使用或在接納在合適的載體中之后進行使用。在這種情況下，該組合物可以包含慣用的凍干賦形劑，可以是口服施用形式(例如，粉劑、明膠膠囊、片劑)，其任選地以使得能夠通過胃并在腸中釋放細菌的保護胃的形式，或者可以是直腸形式(例如，栓劑)。

在一個實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的組合物，尤其是在所述處理方法中所使用的組合物，包含至少一種不在待處理的患者所屬于的物種中天然地存在的細菌菌株。因此，它可以是不在人中或在動物中天然地存在的細菌。在該設定下，當存在幾種不同的細菌時，它們之一不是天然存在的就足夠了。另一方面，該細菌經(jīng)證明在待處理的患者中或在相應的物種(根據(jù)本發(fā)明，人或動物)中具有腸道向性，并且符合根據(jù)本發(fā)明的活性菌株的定義。

本發(fā)明還涉及通過使用無菌果蠅模型和/或無菌小鼠模型來篩選能夠在營養(yǎng)不良的情況下促進幼年生長的細菌的方法。

用果蠅模型的方法包括下列步驟：

-擁有一批來自無菌的黑腹果蠅(例如，果蠅yw這一株系或任何其他所謂“野生型”的株系)的胚胎；

-在包含對于果蠅來說有營養(yǎng)的介質(zhì)且缺乏酵母的營養(yǎng)培養(yǎng)基上將這些胚胎分配成至少2個組，此外將所述胚胎組之一用待測試細菌的懸浮液進行接種，這形成單菌個體組，另一組形成無菌組；

-在合適的溫度(通常大約25℃)下進行飼養(yǎng)；

-在合適的飼養(yǎng)期(通常大約7天)結(jié)束時，從每個組中回收來自最初經(jīng)接種或未接種的胚胎的果蠅幼蟲(無菌幼蟲和單菌幼蟲)，優(yōu)選地以相等的數(shù)目進行回收；

-測定每個組的幼蟲的長度平均值，并比較所獲得的平均值；

-如果單菌組的幼蟲的長度平均值以下述程度大于無菌組的幼蟲的長度平均值，那么認為所測試的細菌菌株對于所述測試作出陽性反應：在對于所述兩個組的幼蟲的整套大小數(shù)據(jù)進行的Mann-Whitney統(tǒng)計學檢驗中具有小于或等于0.001，優(yōu)選地小于或等于0.0001的p值。

優(yōu)選地，所述篩選方法重新采取上面描述過的果蠅測試的特征。

用小鼠模型的方法包括下列步驟：

-擁有來自源于相同小鼠株系(典型地，Balb/c小鼠)的兩個品系的幼年鼠，所述兩個品系即無菌親本小鼠品系和單菌親本小鼠品系(與待測試細菌相關聯(lián)的)；

-將它們以缺乏蛋白質(zhì)和優(yōu)選地還缺乏脂質(zhì)的營養(yǎng)飲食制度進行飼養(yǎng)；

-在合適的飼養(yǎng)期結(jié)束時，測定每個組的一個或多個參數(shù)的值的平均值，這些參數(shù)與生長(例如，體重增加，骨骼生長，例如通過測量個體的大小或其股骨的大小)相關和/或與血清IGF-1水平相關；

-如果單菌組的所測量的參數(shù)的平均值以下述程度大于無菌組的所測量的參數(shù)的平均值，那么認為所述乳酸細菌菌株對于所述測試作出陽性反應：在Tukey統(tǒng)計學檢驗中具有小于或等于0.05的p值。

優(yōu)選地，所述篩選方法重新采取上面所描述的關于骨骼生長或IGF-1血清水平的小鼠測試的特征。

所述篩選方法還可以是與參照菌株(例如菌株WJL)的比較測試，并且該測試在這種情況下重新采取上面對于果蠅測試或小鼠測試所描述的特征。

本發(fā)明的目標還在于以活的或殺死的形式的菌株G821(CNCM I-4979)的純培養(yǎng)物或分離物，在保存介質(zhì)或培養(yǎng)介質(zhì)中包含活的該菌株的組合物，包含該菌株和任選地凍干賦形劑和/或防腐劑的凍干組合物，在保存介質(zhì)中包含以殺死的形式的該菌株或在保存介質(zhì)中包含殺死的該菌株的組合物，在對于口服施用或直腸施用來說可接受的介質(zhì)或賦形劑中包含活的或殺死的該菌株的可施用給人或動物的組合物。所述保存介質(zhì)、培養(yǎng)介質(zhì)、凍干賦形劑、防腐劑、對于口服施用或直腸施用來說可接受的介質(zhì)或賦形劑是上面所描述的那些或者技術(shù)人員熟知的那些。

現(xiàn)在，將借助于作為非限制性實例而選取的本發(fā)明的實施方案并參考附圖來更詳細地描述本發(fā)明，在所述附圖中：

-圖1是顯示了從第28天至第56天小鼠的生長速率(以“cm/天”表示)的圖；GF：無菌小鼠；WJL：在植物乳桿菌WJL這一菌株存在下飼養(yǎng)的小鼠；NIZO 2877：在植物乳桿菌WJL NIZO 2877這一菌株存在下飼養(yǎng)的小鼠；^*p<0.05；^***p<0.001；

-圖2是顯示了在第56天在GF、WJL或NIZO 2877小鼠中股骨的大小的圖；^*p<0.05；^***p<0.001；

-圖3是顯示了在第56天GF、WJL或NIZO 2877組的雄性小鼠的血清水平(以“ng/ml”表示)的圖；^*p<0.05；^***p<0.001；

-圖4是顯示了在營養(yǎng)不足的條件下在7天時果蠅幼蟲的大小的圖：陰性對照組(在產(chǎn)卵后未在生長培養(yǎng)基上添加細菌)，和以在生長培養(yǎng)基上添加植物乳桿菌NIZO 2877、WJL或G821這一菌株為特征的組。

實施例1：在單菌果蠅上的細菌的功能篩選

第1天：采用無菌的成年果蠅(黑腹果蠅yw)；將它們放置在包括底的產(chǎn)卵籠(培養(yǎng)皿類型)中，在所述底上布置常規(guī)營養(yǎng)培養(yǎng)基；通過在25℃下將該成年群體在籠中維持一夜來確保產(chǎn)卵。

第0天：切割出6個營養(yǎng)培養(yǎng)基碎塊以便以6次收集40個胚胎，將所述碎塊中的每一個放置在包含在培養(yǎng)皿中的營養(yǎng)缺乏型營養(yǎng)培養(yǎng)基上，用無菌的1×PBS接種三個平皿，然后用在1×PBS中的細菌的懸浮液接種另外三個平皿。

在25℃下溫育7天。

第7天：然后從每個平皿中回收已在那里發(fā)育的幼蟲(從20只幼蟲/平皿開始該實驗是可采用的，我們因此在下面使用具有多于60只個體的組)。使幼蟲經(jīng)歷熱休克處理(在加熱至100℃的板上5秒鐘)，然后測量幼蟲的大小。

將該實驗方案應用于不同的細菌菌株，并且將實驗和結(jié)果概括在下面的表1中：

關于“幼蟲生長”表型測試的驗證有效標準的指導：

所述菌株應當至少滿足標準1以便經(jīng)驗證是有效的，并且其活性的程度可以根據(jù)標準1+2來定性。

定性標準1＝相對于無菌條件而言促進生長的菌株：

相對于無菌個體的值而言，將統(tǒng)計學檢驗應用于相關聯(lián)的個體的全部長度值(至少60只幼蟲/條件)。小于0.001的p值(Mann-Whitney檢驗)將所述菌株視為是“促進生長的”。在該情況下，下列菌株被視為是促進生長的：

植物乳桿菌WJL

植物乳桿菌NIZO2877

干酪乳桿菌ATCC 393

發(fā)酵乳桿菌ATCC 9338

類干酪乳桿菌ATCC 25302

類干酪乳桿菌Shirota

干酪乳桿菌L919

鼠李糖乳桿菌L900

鼠李糖乳桿菌L908

鼠李糖乳桿菌GG。

下列菌株不具有促進生長的效應：

發(fā)酵乳桿菌KLD

發(fā)酵乳桿菌LMG

類干酪乳桿菌BL23

德氏乳桿菌保加利亞亞種(Lactobacillus delbrueckii spp.bulgaricus)ATCC 11842。

定量標準2＝促進生長的效應的程度(具有事先經(jīng)驗證有效的標準1)：

相對于與植物乳桿菌WJL這一菌株單相關聯(lián)的個體的值而言，將統(tǒng)計學檢驗應用于與所測試的菌株相關聯(lián)的個體的全部長度值(至少60只幼蟲/條件)。

出現(xiàn)三種特定情形：

統(tǒng)計學檢驗的p值大于0.001(Mann-Whitney檢驗)，該菌株將被視為對于幼蟲生長具有“明顯的”效應(與植物乳桿菌WJL這一菌株類似的效應)。

在本實施例中，下列菌株具有明顯的效應：

干酪乳桿菌ATCC 393

發(fā)酵乳桿菌ATCC 9338

類干酪乳桿菌ATCC 25302

類干酪乳桿菌Shirota

干酪乳桿菌L919

鼠李糖乳桿菌L900

鼠李糖乳桿菌L908

鼠李糖乳桿菌GG

植物乳桿菌WJL。

統(tǒng)計學檢驗的p值小于0.001(Mann-Whitney檢驗)，如果個體的平均大小小于與植物乳桿菌WJL相關聯(lián)的個體的平均大小，那么該菌株將被視為對于幼蟲生長具有“中間的”效應(在本實施例中，植物乳桿菌NIZO 2877這一菌株的情況)。如果個體的平均大小大于與植物乳桿菌WJL相關聯(lián)的個體的平均大小，那么該菌株將被視為具有“強的”效應(在本實施例中未鑒定出的情況)。

“幼蟲生長”表型測試實施例的分析

-已經(jīng)測試了14個乳桿菌屬菌株(表1)以便借助于在黑腹果蠅中的“幼蟲生長”測試來測定其促進生長的潛力。

-這些菌株是從ATCC、巴黎巴斯德研究所、里爾巴斯德研究所處可得的，或者是在科學文獻中發(fā)表且從所提及的出版物的負責研究者處可得的(表2)。

-在與待測試細菌菌株相關聯(lián)和然后在缺乏酵母的營養(yǎng)培養(yǎng)基中飼養(yǎng)幼年個體之后的第7天，關于每種條件研究最少60只個體的大小。表1呈現(xiàn)了這些數(shù)據(jù)集的平均值和標準偏差。

-這些結(jié)果的統(tǒng)計學分析使得能夠根據(jù)“幼蟲生長測試”的標準1來選出符合要求的10個屬于不同乳桿菌屬物種的菌株。該選擇揭示了嚴格菌株特異性的且并不必然地與給定的乳桿菌屬物種相關的功能效應。

-結(jié)果的統(tǒng)計學分析使得能夠根據(jù)標準2將植物乳桿菌NIZO2877這一菌株的效應視為“中間的”，而9個其他的促進生長的菌株具有“明顯的”效應。

實施例2：在果蠅模型上具有強的效應的菌株的描述

用3個細菌菌株重做實施例1的果蠅測試：

-植物乳桿菌WJL

-植物乳桿菌NIZO2877

-植物乳桿菌G821。

結(jié)果的分析(參見圖4)顯示了下列效應：

“無菌的”對“NIZO 2877”，p<0.001(^***)

“NIZO 2877”對“WJL”，p<0.0001(^****)

“G821”對“WJL”，p<0.0001(^****)

“無菌的”對“WJL”或“G821”，p<0.0001(^****)。

結(jié)論：

-植物乳桿菌WJL：明顯的效應

-植物乳桿菌NIZO2877：中間的效應

-植物乳桿菌G821：強的效應。

實施例3：在小鼠上的細菌的功能篩選-表型分析

在小鼠中研究了借助于實施例1的“幼蟲生長”測試而鑒定出的具有“中間的”和“明顯的”效應的兩個菌株(分別為植物乳桿菌NIZO2877和植物乳桿菌WJL)的促進幼年生長的效應。

研究了在三個來自相同無菌小鼠集群的個體組中的雄性后代(最少15只個體)：第一組由無菌幼年鼠組成(GF組)，第二組由來自與植物乳桿菌WJL這一菌株單相關聯(lián)的親本的幼年鼠組成(WJL組)，和第三組由來自與植物乳桿菌NIZO2877這一菌株單相關聯(lián)的親本的幼年鼠組成(NIZO 2877組)。將親本和幼年鼠用常規(guī)營養(yǎng)培養(yǎng)基進行飼養(yǎng)直至幼年鼠斷奶(第21天)，然后將經(jīng)斷奶的幼年鼠用缺乏蛋白質(zhì)和脂質(zhì)(分別為8％和2.5％)的營養(yǎng)培養(yǎng)基進行飼養(yǎng)直至第56天。

常規(guī)營養(yǎng)培養(yǎng)基：23％蛋白質(zhì)和5％脂質(zhì)。

營養(yǎng)缺乏型營養(yǎng)培養(yǎng)基：8％蛋白質(zhì)和2.5％脂質(zhì)。

研究了闡明這些個體的幼年生長的三個參數(shù)：(1)在斷奶后28天的時間段(從第28天至第56天)期間的大小增加；(2)在第56天，代表了所測試的群體的一批個體(最少9只個體)的股骨大??；和最后，(3)在第56天，在至少8只個體中生長因子IGF-1的血清水平。

通過使用Tukey檢驗進行了統(tǒng)計學分析，其中使用軟件GraphPad(GraphPad Prism 5.04,San Diego,USA)；p值<0.05被認為是顯著的。

(1)大小增加：

在第28天和第56天，通過短暫暴露于異氟烷來使小鼠麻醉，以使得能夠測量小鼠的大小(從口鼻部至尾巴基部)。

表3：生長速率(以cm表示的大小增加/天，從第28天至第56天)-Nb＝小鼠數(shù)目

這些數(shù)據(jù)匯集在圖1中。

(2)股骨大?。?/p>

在第56天處死小鼠，取出無肌肉的股骨，并用游標卡尺測量其長度。

表4：在第56天，在雄性中以mm表示的股骨長度

這些數(shù)據(jù)匯集在圖2中。

(3)在血清中IGF-1的滴度：

在從在第56天處死的小鼠的血液開始獲得的血清上測量IGF-1的滴度。所述測量在經(jīng)稀釋的(1:25)血清上進行，其中使用試劑盒ELISA Ready-Set-Go(eBioscience,USA)，依照制造商的使用說明書。

表5：以pg/ml表示的IGF-1血清滴度(從ELISA平板開始的雙重測量)

這些數(shù)據(jù)匯集在圖3中。

結(jié)果闡明了植物乳桿菌WJL這一菌株于對生長速率的“明顯的”效應(相對于無菌條件而言p值<0.001)和植物乳桿菌NIZO2877這一菌株的“中間的”效應(相對于無菌條件而言p值<0.05，和相對于植物乳桿菌WJL條件而言p值<0.001)。這些效應用參數(shù)“IGF-1水平”得到了證實(不同測試的相同的p值范圍)，然后用參數(shù)“股骨大小”得到了加強(在無菌條件和植物乳桿菌NIZO 2877條件之間，p值<0.001)。

所有這些結(jié)果通過科學證據(jù)證明了某些對于“幼蟲生長”測試也作出陽性反應的乳桿菌屬菌株的促進幼年生長的效應。

在此所引用的所有公共文獻通過提及而合并入本文。同樣地，技術(shù)人員將能夠參考這些各種各樣的文獻和在此已提及的商業(yè)菌株保藏物。