生物膜被定義為嵌入細(xì)胞外聚合物的基質(zhì)中的固著群落，其特征在于不可逆地附著至表面或彼此的細(xì)胞。生物膜群落可由單一種類的微生物形成，但在自然界中，生物膜幾乎總是由許多細(xì)菌種類的混合物組成。例如，在典型的牙菌斑生物膜中已鑒定了超過500種細(xì)菌物種。

體內(nèi)牙菌斑的起始和生長以及生物膜一般而言由幾個階段組成，并且是由生物和物理化學(xué)來源的許多因素決定的復(fù)雜過程。流體動力學(xué)也在細(xì)菌附著和生物膜形成中起作用。在哺乳動物中的生物膜形成的早期階段，例如，表面形貌也可能是決定細(xì)菌對表面的粘附的主要因素。由于粗糙表面的表面積增加，粗糙表面在給定時間段內(nèi)可能趨于積累比平滑表面更多的細(xì)菌。

然而，可用于評估生物膜形成的體外口腔生物膜模型并未考慮唾液流動和剪切條件。相應(yīng)地，這種模型更適于研究牙周病原體，而不是研究菌斑相關(guān)病原體和菌斑形成。此外，使用常規(guī)體外生物膜模型的研究已證明增加的表面粗糙度和增加的生物膜積累之間無關(guān)聯(lián)。因此，仍然需要允許對牙齒或植入物表面上的生物膜形成的更真實分析的口腔生物膜模型，以及用于評估拋光制劑的方法。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本公開內(nèi)容涉及包括下述的口腔生物膜模型：包括第一表面、第二表面和固定地附著至第一表面的多個樣本的基底，其中口腔生物膜能夠在樣本上形成，并且其中多個樣本中的至少一個的表面粗糙度小于或大于多個中的至少第二樣本的表面粗糙度；以及具有限定容器的側(cè)面和底部的本體，本體適于接納基底和多個樣本，并且還適于接納流體。

在另一個方面，本公開內(nèi)容涉及用于生長口腔生物膜的方法，所述方法包括：在基底上提供至少第一樣本和第二樣本，其中第一樣本包括的表面粗糙度小于或大于第二樣本的表面粗糙度，其中口腔生物膜能夠在樣本上形成；提供包括液體生長培養(yǎng)基的容器，其中所述液體生長培養(yǎng)基包括能夠進(jìn)行口腔生物膜生產(chǎn)的微生物；攪動液體生長培養(yǎng)基；將包括至少第一樣本和第二樣本的基底懸浮在容器中；并且使至少第一樣本和第二樣本與包括微生物的液體生長培養(yǎng)基一起溫育，由此在至少第一樣本和第二樣本上形成生物膜。

在另外一個方面，本公開內(nèi)容涉及用于鑒定用于降低或抑制生物膜形成的試劑的方法，所述方法包括：在基底上提供至少第一樣本和第二樣本，其中第一樣本包括的表面粗糙度小于或大于第二樣本的表面粗糙度，其中口腔生物膜能夠在樣本上形成；提供包括液體生長培養(yǎng)基的容器，其中所述液體生長培養(yǎng)基包括能夠進(jìn)行牙齒生物膜生產(chǎn)的微生物；使至少第一樣本與測試試劑接觸；攪動液體生長培養(yǎng)基；使與測試試劑接觸后的至少第一樣本和第二樣本懸浮于容器中；使與測試試劑接觸后的至少第一樣本和第二樣本與包括微生物的液體生長培養(yǎng)基一起溫育；并且比較在至少第一樣本和第二樣本上形成的生物膜的量，其中與至少第二樣本上的生物膜形成量相比較，至少第一樣本上的生物膜形成的量減少指示測試試劑降低或抑制生物膜形成。

本公開內(nèi)容的進(jìn)一步適用范圍根據(jù)下文提供的詳細(xì)描述將變得顯而易見。應(yīng)當(dāng)理解詳細(xì)描述和具體實例雖然指示本公開內(nèi)容的優(yōu)選實施例，但預(yù)期僅用于舉例說明性目的，并且不預(yù)期限制本公開內(nèi)容的范圍。

附圖說明

本公開內(nèi)容根據(jù)詳細(xì)描述和附圖將得到更充分地理解，其中：

圖1描繪了容器的實施例。

圖2描繪了容器和基底的實施例。

圖3描繪了嵌入樣本的基底的實施例。

圖4a描繪了三格研究的分層：用美白牙膏刷過的牙釉質(zhì)相對于粗糙牙釉質(zhì)相對于拋光牙釉質(zhì)。圖4b描繪了兩格研究的分層：用敏感牙膏刷過的牙釉質(zhì)相對于粗糙牙釉質(zhì)。

圖5顯示了在100X放大率下的牙釉質(zhì)表面的代表性共焦圖像。圖5a：酸蝕刻的牙釉質(zhì)，圖5b：拋光的牙釉質(zhì)，圖5c：用測試美白牙膏刷過的酸蝕刻的牙釉質(zhì)，圖5d：用測試敏感牙膏刷過的酸蝕刻的牙釉質(zhì)。

圖6顯示了在牙釉質(zhì)塊上經(jīng)過6小時對表面積標(biāo)準(zhǔn)化的總細(xì)菌積累。

圖7顯示了在牙釉質(zhì)塊上經(jīng)過6小時對表面積標(biāo)準(zhǔn)化的總細(xì)菌積累。

具體實施方式

下述描述本質(zhì)上僅是示例性的，并且決不預(yù)期限制本公開內(nèi)容、其應(yīng)用或用途。

如自始至終使用的，范圍用作描述在范圍內(nèi)的每個和每一個值的簡寫?？蛇x擇范圍內(nèi)的任何值作為范圍的終點。另外，本文引用的所有參考文獻(xiàn)均以引用的方式在此全文并入。在本公開內(nèi)容中的定義和引用的參考文獻(xiàn)的定義沖突的情況下，以本公開內(nèi)容為準(zhǔn)。

除非另有說明，否則本文和說明書其他地方所表示的所有百分比和數(shù)量應(yīng)當(dāng)理解為指按重量計的百分比。給出的量基于材料的有效重量。

口腔生物膜模型

本公開內(nèi)容涉及固定體積的動態(tài)口腔生物膜模型，用于評價具有不同表面粗糙度的樣本上的口腔生物膜形成的方法，以及使用口腔生物膜模型測試試劑例如口腔產(chǎn)品組合物的方法。

如本文使用的，口腔生物膜指嵌入細(xì)胞外多糖基質(zhì)中并附著至固體表面的三維結(jié)構(gòu)化細(xì)菌群落，所述固體表面例如牙釉質(zhì)、根部或牙植入物的表面。

本公開內(nèi)容的口腔生物膜模型包括粘附至基底的樣本。如本文使用的，術(shù)語“樣本”指可在其上形成口腔生物膜的天然或合成材料。天然樣本的例子包括拔出的哺乳動物牙齒、哺乳動物牙釉質(zhì)和哺乳動物牙本質(zhì)。天然樣本可得自任何哺乳動物，包括但不限于人、非人靈長類動物、駱駝、貓、黑猩猩、灰鼠、牛、犬、山羊、大猩猩、馬、美洲駝、小鼠、豬、鼠、大鼠和綿羊。拔出的哺乳動物牙齒例如牛和/或人牙齒是商購可得的。拔出的人牙齒也可得自牙科診所。在一些實施例中，天然樣本是牛牙釉質(zhì)。

用于樣本的有用合成材料包括用于形成牙植入物的合成材料，例如鈦、陶瓷。允許生物膜形成的其他合成材料包括但不限于合成羥基磷灰石、玻璃、硅、氨基甲酸酯或類似材料。

合成材料樣本可為任何形狀，包括以幾何形狀的形式，例如正方形或圓柱體。樣本還可包括例如玻璃或塑料珠或盤。在一些實施例中，合成材料被建模以形成哺乳動物的牙齒。

使用本領(lǐng)域已知的任何方法將樣本固定地附著至基底，包括使用粘合劑例如生物相容性粘合劑，例如牙科粘合劑。在一些實施例中，使用模型粘土將樣本粘附至基底。在另一個實施例中，可使用硅酮建模膩子(puddy)或其他鑄模樹脂。

在一些實施例中，超過一個樣本，例如至少2、4、6、12、24、36、50、60或更多個樣本粘附至基底。相應(yīng)地，基底可含有與之附著的多個樣本。

在一些實施例中，多個樣本中的至少第一樣本的至少表面粗糙度小于或大于多個樣本中的至少第二樣本的表面粗糙度。即，所有的樣本均可共享相同的表面粗糙度，而樣本之一具有比基底上的多個樣本的剩余部分更大或更小的表面粗糙度?？商娲?，粘附至基底的1、2、3、4、5、10、20、50、100個或更多個樣本可共享相同的表面粗糙度，而在基底上的多個樣本的剩余部分共享不同的表面粗糙度。在其他實施例中，多個樣本各自具有不同的表面粗糙度。在另外其他實施例中，基底將具有其中存在至少1、2、3、4、5、6、10、20、50、80或100個或更多個表面粗糙度值的樣本，所述表面粗糙度值不同于多個樣本的剩余部分中的表面粗糙度值。

如本文使用的，“表面粗糙度”指樣本表面的微觀結(jié)構(gòu)紋理。表面粗糙度可根據(jù)本領(lǐng)域已知的許多參數(shù)進(jìn)行測量，包括但不限于平均表面粗糙度Ra；Rq(也稱RMS；均方根粗糙度)；Rt(樣品表面上的最大粗糙度深度)；Rz(平均最大峰到谷高度)；和Rmax(最大表面粗糙度)。表面粗糙度可根據(jù)平均表面粗糙度Ra進(jìn)行測量。Ra是距離在采樣長度內(nèi)測量的平均線的粗糙度分量不規(guī)則的算術(shù)平均高度。較小的Ra值指示更平滑的表面。表面粗糙度可通過本領(lǐng)域已知的用于測量Ra的任何方法進(jìn)行測量，所述方法例如表面輪廓測量法、表面掃描法、共焦顯微鏡檢查、原子力顯微鏡檢查和掃描電子顯微鏡檢查。表面粗糙度可在至少一個治療期之前或之后以及在任何后續(xù)的基本暴露于其他試劑(例如再礦化溶液(包括唾液))或測試試劑之前進(jìn)行測量。

在一些實施例中，平均Ra值范圍為約2500nm至約5nm、2000nm至約10nm、約1000nm至約40nm、約750nm至約40nm、約250nm至約20nm、約200nm至約60nm、約50nm、約40nm或約30nm。在其他實施例中，平均Ra大于約250nm。

樣本的表面粗糙度可通過酸蝕刻賦予。例如，可將樣本浸入含有37重量％磷酸的溶液中一分鐘。在其他實施例中，可將樣本浸入含有5％檸檬酸混合物的溶液中30秒。

在另外其他實施例中，通過用試劑刷洗酸蝕刻后的樣本可降低樣本的表面粗糙度，所述試劑將表面粗糙度減少至所需的表面粗糙度。該試劑可含有例如水合二氧化硅、水合氧化鋁、碳酸鈣或磷酸二鈣。在一些實施例中，該試劑采取牙膏、凝膠、液體或乳膏的形式。

基底可為玻璃基底、金屬基底、聚苯乙烯基底、聚乙烯基底、乙酸乙烯酯基底、聚丙烯基底、聚甲基丙烯酸酯基底、聚丙烯酸酯基底、聚乙烯基底、聚環(huán)氧乙烷基底、聚硅酸酯基底、聚碳酸酯基底、聚四氟乙烯基底、碳氟化合物基底、尼龍基底、硅基底、橡膠基底、聚酐基底、聚乙醇酸基底、聚羥基酸基底、聚酯基底、聚己內(nèi)酯基底、聚羥基丁酸酯、聚磷腈、聚原酸酯、聚氨基甲酸酯、硅鑄模樹脂或其他鑄模樹脂、及其組合。

在實施例中，在本公開內(nèi)容的口腔生物膜模型中使用的基底具有在約100mm²和3000mm²之間，通常在約100mm²和2500mm²之間，更通常在2200mm²和500mm²之間，且再更通常在2000mm²和500mm²之間的表面積。在一些實施例中，基底是顯微鏡載玻片，例如玻璃顯微鏡載玻片的尺寸和形狀，通常為25mm×75mm。

在將樣本固定至基底之后，將樣本懸浮在含有液體生長培養(yǎng)基的容器內(nèi)。本公開內(nèi)容的容器可被設(shè)計成容納例如1、2、3、4、5、6、7、8個或更多個分開的基底。在一些實施例中，本公開內(nèi)容的口腔生物膜模型的每個基底包括具有相同面積的表面，而在其他實施例中，本公開內(nèi)容的口腔生物膜模型中的至少一個基底包括的表面積不同于口腔生物膜模型中的另一種基底的表面積。

容器適于接納以流體密封連通的支撐基底和附著樣本，所述流體密封連通能夠在其中保留液體生長培養(yǎng)基。適當(dāng)?shù)娜萜靼ɡ缟藤徔傻玫?-、6-、8-、12-、24-、96-或384-孔塑料組織板或培養(yǎng)皿，例如100x15mm方形培養(yǎng)皿。用于容器的有用材料包括但不限于玻璃、聚苯乙烯、聚丙烯、聚碳酸酯、共聚物(例如乙烯乙酸乙烯酯共聚物)等等。

現(xiàn)在參考圖1，顯示了含有兩個基底支撐物(110)的容器(100)的視圖。基底支撐物沿容器(100)的兩側(cè)平行對齊。在該實施例中，基底支撐物是3.5英寸移液管片(pipette piece)。然而，可使用懸浮基底和樣本的任何其他合適的方法，例如，基底支撐物可在制造過程期間與容器(100)整體形成。在圖1中所示的實施例中，將攪動棒(120)放置在容器中，以攪動液體生長培養(yǎng)基，促使生長培養(yǎng)基移動穿過樣本。

現(xiàn)在參考圖2，顯示了含有兩個基底(130)的容器(100)的視圖。基底含有樣本固定至其的第一表面(未示出)和第二表面(140)。每個基底(130)的每個遠(yuǎn)端(150)被放置在每個基底支撐物(110)上。樣本固定至其的基底的第一表面懸浮于液體生長培養(yǎng)基中。

圖3描繪了在第一表面(160)上具有建模粘土(170)的基底的第一表面(160)。樣本(180)嵌入建模粘土(170)中。在一些實施例中，僅將一個基底置于容器中。在其他實施例中，可將各自含有樣本(180)的兩個、三個、四個、十個或二十個基底放置在容器中。

本文描述的口腔生物膜模型允許在含有液體生長培養(yǎng)基的容器(100)中同時測試具有不同表面粗糙度值的樣本(180)。本公開內(nèi)容的基底(130)允許通過從容器(100)中取出整個基底(130)來仔細(xì)監(jiān)測和控制生物膜的暴露時間/生長時間，其中所有樣本(180)被附著至基底(130)。因此，取出基底(130)的過程可與從液體生長培養(yǎng)基同時取出所有樣本(180)關(guān)聯(lián)。因此，基底(130)促進(jìn)在每個樣本(180)上均勻的生物膜形成，因為所有樣本(180)均可在單個動作中從容器(100)中取出。均勻生物膜的生產(chǎn)可確保測試結(jié)果是統(tǒng)一和準(zhǔn)確的。再進(jìn)一步地，本公開內(nèi)容的口腔生物膜模型允許生物膜形成的高流通量，因為可一次制備大量樣本(180)。

充當(dāng)含有生物膜形成生物的液體生長培養(yǎng)基的儲庫的容器(100)可生成跨越樣本的剪切力。生成的剪切力允許在樣本上的最佳生物膜形成。在容器中發(fā)展的剪切力可通過如圖1和2中所示的攪動棒生成，或者例如可通過搖擺臺或旋轉(zhuǎn)振蕩器生成。本文描述的固定體積的動態(tài)口腔生物膜模型的容器允許在類似于口中發(fā)生的流動、好氧條件下，對樣本上生長的生物膜的更真實分析；而本領(lǐng)域已知的靜態(tài)口腔生物膜模型并未考慮唾液流動、剪切和氧合條件。

使用口腔生物膜模型的方法

本公開內(nèi)容的固定體積的動態(tài)口腔生物膜模型可用于生長生物膜，并且評價生物膜的特征。例如，可評價表面粗糙度對特定樣本例如如本文所述的牙釉質(zhì)樣本的作用。將樣本例如在37℃下在好氧條件下在含有液體生長培養(yǎng)基的容器中溫育一段時間，以允許在樣本上形成生物膜。允許生物膜形成的時間段范圍為約2小時至約24小時、約3小時至約24小時、約3小時至約10小時、約4小時至約8小時，或可為約6小時。在溫育期間，可通過提供液體生長培養(yǎng)基的攪動來促進(jìn)生物膜形成，允許培養(yǎng)基流過樣本。例如，可在容器中包括如上所述的攪動棒、搖擺臺或旋轉(zhuǎn)振蕩器以促進(jìn)攪動。在生物膜形成之后，生物膜可通過例如超聲處理從樣本中去除，以評價例如菌落形成單位(CFU)的量。

可與本文所述的模型和方法一起使用的液體生長培養(yǎng)基可為本領(lǐng)域已知的用于生長生物膜的任何液體生長培養(yǎng)基。例如，可使用補(bǔ)充有人血清(Sigma-Aldrich)的腦心浸液培養(yǎng)基(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)、(4∶1)唾液樣培養(yǎng)基(SLM、0.1％Lab Lemco Powder、0.2％酵母提取物、0.5％蛋白胨、0.25％來自豬胃的粘液蛋白III型(Sigma-Aldrich)、6mM NaCl、2.7mM KCl、3.5mM KH₂PO₄、1.5mM K₂HPO₄、0.05％尿素，pH 6.7)(1∶3)?？商娲?，可使用不含任何葡萄糖或補(bǔ)充人血清(4∶1)、50mM葡萄糖或50mM蔗糖的化學(xué)成分確定的培養(yǎng)基(CDM)，參見以引用的方式并入本文的Rijn和Kessler，Infect Immun.，1984，27(2)：444-448。在一些實施例中，使用補(bǔ)充有蔗糖、氯高鐵血紅素、維生素K和新鮮或冷凍唾液的McBain培養(yǎng)基，參見以引用的方式并入本文的McBain等人，2005，“Development and characterization of a simple perfused oral microcosm”，J.Appl.Microbiol，98，624-634。在一些實施例中，液體生長培養(yǎng)基包含葡萄糖或蔗糖。

本公開內(nèi)容的口腔生物膜模型適合于形成通過菌斑產(chǎn)生微生物引起的生物膜和/或形成通過負(fù)責(zé)牙周病的微生物引起的生物膜。在一些實施例中，該模型可用于形成通過菌斑產(chǎn)生微生物引起的生物膜。

在一些實施例中，液體生長培養(yǎng)基含有一種或多種生物膜形成生物。在一些實施例中，生物膜形成微生物是屬于與牙周病相關(guān)的屬的微生物，所述屬包括但不限于密螺旋體屬(Treponema)、擬桿菌屬(Bacteroides)、卟啉單胞菌屬(Porphyromonas)、普雷沃氏菌屬(Prevotella)、噬二氧化碳細(xì)胞菌屬(Capnocytophaga)、消化鏈球菌屬(Peptostreptococcus)、梭桿菌屬(Fusobacterium)、放線桿菌屬(Actinobacillus)和艾肯菌屬(Eikenella)。在其他實施例中，液體生長培養(yǎng)基含有一種或多種牙周相關(guān)物種，例如齒垢密螺旋體(Treponema denticola)、牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonas gingivalis)、福賽斯擬桿菌(Bacteroides forsythus，)、中間普雷沃氏菌(Prevotella intermedia)、變黑普雷沃氏菌(Prevotella nigrescens)、微小消化鏈球菌(Peptostreptococcus micros)、具核梭桿菌(Fusobacterium nucleatum)亞種、糾纏真桿菌(Eubacterium nodatum)或星座鏈球菌(Streptococcus constellatus)。

在其他實施例中，液體生長培養(yǎng)基含有選自下述屬的與牙菌斑形成相關(guān)的至少一種微生物：鏈球菌屬(Streptococcus)、韋榮球菌屬(Veillonella)、放線菌屬(Actinomyces)、顆粒鏈菌屬(Granulicatella)、纖毛菌屬(Leptotrichia)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、硫單胞菌屬(Thiomonas)、雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)、丙酸桿菌屬(Propionibacterium)或奇異菌屬(Atopobium)。在其他實施例中，液體生長培養(yǎng)基含有與牙菌斑形成相關(guān)的一個或多個物種，包括但不限于變形鏈球菌(Streptococcus mutans)、遠(yuǎn)緣鏈球菌(Streptococcus sobrinus)、格氏鏈球菌(Streptococcus gordonii)、血鏈球菌(Streptococcus sanguinis)、嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)、干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)、發(fā)酵乳桿菌(Lactobacillus fermentum)、德氏乳桿菌(Lactobacillus delbrueckii)、植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)、詹氏乳桿菌(Lactobacillus jensenii)、短乳桿菌(Lactobacillus brevis)、唾液乳桿菌(Lactobacillus salivarius)、加氏乳桿菌(Lactobacillus gasseri)和內(nèi)氏放線菌(Actinomyces naeslundii)。在其他實施例中，液體生長培養(yǎng)基至少含有變形鏈球菌。

在一些實施例中，液體生長培養(yǎng)基可含有來自哺乳動物供體的唾液，哺乳動物供體例如人、非人靈長類動物、駱駝、貓、黑猩猩、灰鼠、牛、犬、山羊、大猩猩、馬、美洲駝、小鼠、豬、鼠、大鼠和綿羊。在一些實施例中，使用人唾液。

使用本公開內(nèi)容的口腔生物膜模型，可評價表面粗糙度對生物膜形成的作用?？赏ㄟ^例如使用共焦激光掃描顯微鏡觀察生物膜形態(tài)和/或?qū)颖颈砻娴恼掣絹頊y定生物膜形成的評價。也可測定每個形成的生物膜中的菌落形成單位的數(shù)目。存在于生物膜中的細(xì)菌的計數(shù)也可通過使用分子方法例如定量聚合酶鏈反應(yīng)(qPCR或?qū)崟rPCR)來實現(xiàn)。

另外，本公開內(nèi)容的口腔生物膜模型可用于測試測試試劑例如以牙膏、凝膠、漱口劑、粉末或乳膏形式的口腔護(hù)理產(chǎn)品例如對樣本的表面粗糙度的功效，以評價其對生物膜形成的作用。例如，在酸蝕刻之后，可將測試試劑例如口腔護(hù)理產(chǎn)品刷到樣本上。在刷洗后，可將樣本懸浮于液體生長培養(yǎng)基中并溫育。在溫育后，可通過共焦掃描顯微鏡檢查、通過測定集落形成單位(CFU)的數(shù)目、或通過qPCR來評價生物膜，以測定測試試劑用于降低或抑制口腔生物膜的功效。

本公開內(nèi)容的口腔生物膜模型并不限于用于測試表面粗糙度對生物膜形成的變化或測試與具有不同表面粗糙度值的樣本組合的試劑。本公開內(nèi)容的口腔生物膜模型可容易地用于比較例如不同微生物、不同樣本和/或不同液體生長培養(yǎng)基和/或測試試劑和/或改變樣本的表面粗糙度對生物膜形成的作用。例如，當(dāng)本公開內(nèi)容的口腔生物膜模型的容器是多孔板時，可在每個孔內(nèi)摻入含有不同微生物的液體生長培養(yǎng)基。然后可使用本文所述的口腔生物膜模型，來評價單獨或與表面粗糙度組合的不同微生物的效應(yīng)。

實例

實例1.牙釉質(zhì)樣本的制備

預(yù)切割的牛牙釉質(zhì)樣本得自Bennet Amaechi、DDS、MS、PhD、FDI、在San Antonio，7703 Floyd Curl Drive，MC 7917，San Antonio，TX 78229-3900的Cariology，Department of Comprehensive Dentistry，University of Texas Health Science Center的教授和主管。使用丙烯酸鑄模樹脂將樣本澆鑄到38mm直徑的盤內(nèi)，以允許使用Buehler拋光機(jī)將樣本拋光至鏡面光潔度。

目視檢查樣本以確保牙釉質(zhì)完全暴露且無缺陷。每個盤具有大約18至20個樣本。將樣本分為三組：拋光的、酸蝕刻的、酸蝕刻加用測試牙膏刷洗的。通過將樣本浸入5％檸檬酸中30秒來完成酸蝕刻。使用測試牙膏的1∶3漿料，在Kal-Tech線性刷洗機(jī)上，對酸蝕刻樣本的亞集進(jìn)行刷洗。普通的平直修整牙刷用于刷洗樣本。將刷毛張力調(diào)節(jié)至280g向下壓力，并且將樣本刷洗4500次。

使用Leica DCM3D共焦顯微鏡，使用藍(lán)光和100x(NA 0.9)EP1-L鏡頭，測量各個樣本的表面粗糙度。通過使用Leica Map軟件分析形貌圖像來獲得Ra值。使用在明視野模式下操作的Olympus BX60顯微鏡，測量各個牙釉質(zhì)樣本的表面積測量。用Olympus MPlanAPO 1.25X/0.04鏡頭觀察樣本。使用Hitachi KP-M1U CCD相機(jī)和Scion Image PCI Frame抓取器捕獲樣本的圖像。使用Scion Image 4.0軟件進(jìn)行面積計算。使用已知直徑(5mm)的羥基磷灰石盤來校準(zhǔn)面積測量值，并且將像素轉(zhuǎn)換成表面積單位(mm²)。

實例2.根據(jù)表面粗糙度(拋光的、酸蝕刻的、和酸蝕刻/用測試牙膏刷洗的)與牙釉質(zhì)樣本的細(xì)菌附著

使用固定體積的動態(tài)流動口腔生物膜模型進(jìn)行細(xì)菌附著研究。在該模型中，反應(yīng)容器是100x15mm方形聚苯乙烯培養(yǎng)皿(Electron Microscopy Science)。使用建模粘土將牙釉質(zhì)樣本固定在顯微鏡載玻片上。小心地確保只有調(diào)理的牙釉質(zhì)表面被暴露，并且具有牙釉質(zhì)樣本的粘土表面盡可能平坦，以使湍流中樣本與樣本以及載玻片與載玻片之間的變化最小化。對于特定的實驗運行，使用三個反應(yīng)容器。每個容器含有最多24個牙釉質(zhì)樣本(各具有12個樣本的兩個載玻片)。在實驗1中，進(jìn)行三格研究：粗糙相對于拋光相對于美白牙膏。對于實驗2，進(jìn)行兩格研究：粗糙相對于敏感牙膏，以簡化實驗并增加統(tǒng)計功效。對于三格研究，確定需要兩次運行(n＝48)以獲得足夠的能力來看出治療之間的顯著差異。對于兩格研究，單次運行(N＝24)足以看到顯著的治療差異。牙釉質(zhì)樣本的分布在三個反應(yīng)容器(標(biāo)記為紅色、綠色和藍(lán)色用于三格研究，并且標(biāo)記為紅色、綠色和紅色/綠色用于兩格研究)中分層，以解釋與流動相關(guān)的位置效應(yīng)。圖4a中顯示了三格研究的分層，并且圖4b中顯示了兩格研究的分層。不同顏色的塊代表牙釉質(zhì)樣本中的不同處理。

實例3.用于生長和定量牙釉質(zhì)塊上的多種微生物生物膜的方案

A.半動態(tài)系統(tǒng)制備

將聚苯乙烯移液管切成兩個3.5英寸片。將移液管片制成緊貼在正方形容器內(nèi)。將移液管片用1∶10漂白溶液消毒30分鐘，用無菌水徹底沖洗，然后使其干燥。如圖3中所示，將樣本在含有均勻分布的建模粘土層的基底(顯微鏡載玻片)的頂部上嵌入(12個/載玻片)。將塊分層，使得每個載玻片中存在不同處理的樣本，以平衡任何可能的位置效應(yīng)。將顯微鏡載玻片紫外線滅菌(牙釉質(zhì)塊側(cè)面朝上)30分鐘。在無菌條件下，如圖1中所示，將兩個移液管片放置在含有小型無菌攪動棒的方形皿(容器)內(nèi)。將顯微鏡載玻片轉(zhuǎn)移到容器中，使得它如圖2中所示被倒置放置在吸液管的頂部上。將容器紫外線滅菌另外30分鐘。

B.唾液收集

用于唾液收集的人類供體的牙齒在取樣前的晚上和在取樣當(dāng)天沒有刷洗。在最后一餐和/或飲料后至少兩個小時獲取樣品。要求唾液供體咀嚼石蠟?zāi)?，并且將唾液收集在無菌錐形管中，所述無菌錐形管在收集唾液期間保持在冰上。在無菌條件下，用60％無菌甘油1∶1稀釋唾液樣品。將唾液樣品在無菌微量離心管內(nèi)稀釋成800μl等分樣本。將唾液樣品標(biāo)記并貯存于-20℃下的管中直至使用。

C.培養(yǎng)皿接種和溫育條件

使用40ml McBain培養(yǎng)基、400μl 20％無菌蔗糖、80μl 0.05％氯高鐵血紅素、1.6μl 0.5％維生素K和800μl新鮮或1.6ml在甘油中的冷凍唾液準(zhǔn)備50ml無菌錐形管。將含有嵌入建模粘土中的樣本的容器(方形培養(yǎng)皿)用唾液-McBain混合物接種。使容器在37℃下好氧溫育，伴隨輕輕攪動6小時。

D.生物膜的收獲和菌落形成單位(CFU)的定量

在無菌條件下，將含有樣本的載玻片從容器中取出并且浸沒在45ml PBS pH 7.4中，以去除浮游細(xì)胞。用無菌鑷子從載玻片中輕輕取出每個樣本；并且將樣本轉(zhuǎn)移到預(yù)先標(biāo)記的24孔板中的1ml PBS pH 7.4中。將懸浮液超聲處理2分鐘(30秒脈沖)。將懸浮液在PBS pH 7.4中連續(xù)稀釋，并且在具有5％綿羊血的胰蛋白酶大豆瓊脂(TSA II)板上鋪平板，以測定CFU。用于計數(shù)的通常稀釋度為10⁰-10^-3。使板在37℃下好氧溫育48小時。通過菌落計數(shù)測定菌落形成單位(CFU)，并且結(jié)果報告為CFU/ml。

結(jié)果和總結(jié)

圖5顯示了拋光的牙釉質(zhì)、酸蝕刻的牙釉質(zhì)和在用測試牙膏刷洗之后酸蝕刻的牙釉質(zhì)的代表性共焦圖像。這些代表性圖像的Ra值對于粗糙的為237nm，對于拋光的為26nm，對于美白牙膏為55nm，并且對于敏感牙膏為63nm。根據(jù)圖5和Ra值，酸蝕刻表面清楚地具有最粗糙的表面形貌，隨后為用測試牙膏刷洗的酸蝕刻的牙釉質(zhì)，然后為高度拋光的牙釉質(zhì)表面。圖6和7顯示了實驗1和2的細(xì)菌附著結(jié)果。在上文實例1中上述的實驗1中，成功測量了164個牙釉質(zhì)樣本中的159個的CFU值，和實驗2的48個樣本中的43個的CFU值。無法測量CFU值是細(xì)菌污染的結(jié)果。在實驗1中，針對表面積標(biāo)準(zhǔn)化的平均細(xì)菌計數(shù)對于粗糙的為5054CFU/mm²，對于拋光的為1030CFU/mm²，并且對于美白牙膏為2077CFU/mm²。ANOVA分析顯示處理效應(yīng)是統(tǒng)計學(xué)顯著的(p＝0.001)。使用Tukey檢驗在處理中的比較顯示，與美白牙膏和拋光的牙釉質(zhì)表面相比較，統(tǒng)計學(xué)顯著(p＜0.05)更多的細(xì)菌在6小時時間段內(nèi)粘附至粗糙牙釉質(zhì)。美白牙膏處理的蝕刻牙釉質(zhì)與高度拋光的牙釉質(zhì)表面之間不存在統(tǒng)計學(xué)顯著的(p＞0.05)差異。對于上述實例1中所述的實驗2，將粗糙牙釉質(zhì)與用敏感牙膏刷洗的酸蝕刻的牙釉質(zhì)進(jìn)行比較。在6小時后，與敏感牙膏處理的表面相比較，統(tǒng)計學(xué)顯著(p＜0.05)更多的細(xì)菌在酸蝕刻的表面上積累。針對表面積標(biāo)準(zhǔn)化的平均細(xì)菌積累對于酸蝕刻的牙釉質(zhì)為4299CFU/mm²，并且對于敏感牙膏為1647CFU/mm²。

總之，表面形貌可能是細(xì)菌粘附中的關(guān)鍵因素。在本研究中，探究了牙釉質(zhì)表面粗糙度對6小時時間段內(nèi)在牙釉質(zhì)表面上的細(xì)菌積累的作用。檢查了三種牙釉質(zhì)表面：高度拋光的(拋光的)、酸蝕刻的(粗糙的)、以及酸蝕刻隨后用含有在10％HCS基料(base)中的0.243％NaF(美白牙膏)或在10％HCS基料中的5％硝酸鉀、0.243％NaF(敏感牙膏)的牙膏刷洗的。

通過共焦顯微鏡檢查分析三種不同牙釉質(zhì)樣本處理組的表面形貌，指示了酸蝕刻、拋光和刷洗樣本的粗糙度中的明確差異。酸蝕刻的牙釉質(zhì)樣本由于檸檬酸使表面粗糙而明顯地喪失了顯著量的反射率。用美白或敏感牙膏刷洗酸蝕刻的使牙釉質(zhì)表面平滑，并且?guī)椭謴?fù)表面的反射率。拋光的牙釉質(zhì)樣本是三種表面中最光滑和最反射的，這是預(yù)期的，因為使用非常精細(xì)的金剛石研磨膏拋光了該表面。在實驗1中，酸蝕刻、拋光和美白牙膏刷洗的牙釉質(zhì)的比較顯示，在牙釉質(zhì)表面上發(fā)現(xiàn)的細(xì)菌數(shù)量與牙釉質(zhì)的粗糙度呈正相關(guān)：酸腐蝕的牙釉質(zhì)具有最多的細(xì)菌，隨后為刷洗的牙釉質(zhì)，然后為拋光的牙釉質(zhì)。酸蝕刻的牙釉質(zhì)與拋光的牙釉質(zhì)相比較具有4.9倍更多的細(xì)菌/單位表面積，以及與美白牙膏相比較具有2.4倍更多的細(xì)菌/單位表面積。在實驗2中，酸蝕刻的牙釉質(zhì)與用敏感牙膏刷涂的牙釉質(zhì)相比較具有2.6倍更多的細(xì)菌/單位表面積。粗糙和測試牙膏處理之間的差異的相對量級對于實驗1和2是相似的。這是預(yù)期的，因為美白牙膏和敏感牙膏具有相同的清潔/拋光系統(tǒng)，并且差異主要在于顏色和敏感牙膏中5％KNO₃的存在。

總之，本研究的結(jié)果證實了表面粗糙度與牙釉質(zhì)表面上的細(xì)菌粘附之間的正相關(guān)。牙釉質(zhì)對酸的暴露使表面變粗糙，并且允許細(xì)菌更容易積累。在兩種測試牙膏中使用的清潔/拋光系統(tǒng)能夠使牙釉質(zhì)拋光且平滑，導(dǎo)致與粗糙化的酸蝕刻的牙釉質(zhì)相比較更少的細(xì)菌附著。