本申請要求2013年7月19日提交的美國臨時專利申請No.61/856,652(代理人案卷號34246-780.101)的權(quán)益，該申請的全部內(nèi)容以引用方式并入本文。有關(guān)聯(lián)邦政府資助研究的聲明本發(fā)明是在美國政府支持下完成的，與美國能源部簽定的合同號為DE-AR0000088。政府對本發(fā)明享有一定權(quán)利。
背景技術(shù)：
：脂肪酸和脂肪酸衍生物(例如脂肪酸甲酯(FAME)、脂肪醇、脂肪胺等)是制造許多消費(fèi)品、工業(yè)化學(xué)品和燃料的重要前體。例如，可使用脂肪酸和脂肪酸衍生物來制作洗滌劑、清潔劑、塑料、紙張、油漆、潤滑劑、蠟類、涂料與表面活性劑。也可將脂肪酸和脂肪酸衍生物用作風(fēng)味劑和芳香劑。目前，脂肪酸和脂肪酸衍生物以油脂化學(xué)品(植物和動物脂肪)或石油化學(xué)品為來源生產(chǎn)。一般來講，源自油脂化學(xué)品的脂肪酸的脂肪鏈具有偶數(shù)個碳原子，而源自石油化學(xué)品的脂肪酸的脂肪鏈具有奇數(shù)個碳原子。油脂化學(xué)品和石油化學(xué)品脂肪酸有明顯的缺點(diǎn)。最值得注意的是，用于制備此類脂肪酸的原料通常包括不同碳鏈長度的脂肪酸的混合物，而且可包括各種不同的鏈長度，以及飽和脂肪酸與不飽和脂肪酸。圖1是圖表，示出了各種常用油脂化學(xué)品原料的脂肪酸碳組成。然而，脂肪酸和脂肪酸衍生物的許多商業(yè)應(yīng)用需要對于其脂肪鏈長度具有較高特異性的脂肪酸前體。例如，用C6-C10脂肪酸生產(chǎn)噴射潤滑劑，用C12-C14脂肪酸制作表面活性劑和洗滌劑，用C16-C18脂肪酸生產(chǎn)金屬皂。因此，當(dāng)前生產(chǎn)脂肪酸的方法需要成本高昂的原料加工過程，例如分餾、蒸餾，才能分離出指定應(yīng)用所需的脂肪酸組分。有多種技術(shù)限制約束著這類加工過程的效率以及分離出濃度較高且鏈長彼此不一的脂肪酸的能力。油脂化學(xué)品和石油化學(xué)品脂肪酸的另一個缺點(diǎn)是，這些原料的成本會大幅波動。油脂化學(xué)品原料的價(jià)格極不穩(wěn)定，可能逐年劇烈波動，在不同地理區(qū)域也可能明顯不同。由于總生產(chǎn)成本對原料價(jià)格非常敏感，所以這種不穩(wěn)定性會顯著影響利潤。就石油化學(xué)品脂肪酸來說，越來越多的人認(rèn)識到石油烴儲量正不斷減少，因而，預(yù)期這種脂肪酸的成本會持續(xù)上升。最后，愈發(fā)讓人擔(dān)憂的是化學(xué)工業(yè)內(nèi)的可持續(xù)性，對由可再生資源生產(chǎn)的化學(xué)品的需求不斷增長。實(shí)際上，多個化學(xué)公司及其客戶已實(shí)施了可持續(xù)發(fā)展計(jì)劃，目標(biāo)是用由可再生資源制成的化學(xué)品替代當(dāng)前的化學(xué)品，如石油基化學(xué)品。這些公司一直在努力研制可再生化學(xué)品，這些可再生化學(xué)品對產(chǎn)品性能或特性的影響極小，此外，對下游產(chǎn)品和客戶的影響也微乎其微。甚至在油脂化學(xué)品工業(yè)領(lǐng)域，也存在可持續(xù)性問題。雖然多種油脂化學(xué)品脂肪酸源自可再生資源，但當(dāng)前的行業(yè)慣例并未以可持續(xù)方式管理這些資源的采集。例如，一直以來讓人倍感憂慮的是生產(chǎn)棕櫚油(油脂化學(xué)品脂肪酸的主要來源)過程中森林遭受砍伐。因?yàn)槭突舅帷⒂椭舅岷椭舅嵫苌锎嬖谶@些缺點(diǎn)，所以，人們越來越熱衷于開發(fā)并改進(jìn)可利用可持續(xù)植物基原料生產(chǎn)化學(xué)品和燃料的工業(yè)微生物系統(tǒng)。這類工業(yè)微生物系統(tǒng)能夠完全或部分地替代石油烴或油脂化學(xué)品用來生產(chǎn)某些化學(xué)品和產(chǎn)品?？捎眠@類微生物系統(tǒng)生產(chǎn)多種化學(xué)品，涉及的范圍從抗生素、抗瘧藥品，到精細(xì)化學(xué)品，再到像乙醇之類的燃料。然而，對經(jīng)修飾微生物仍然有商業(yè)需求，這種微生物適宜生產(chǎn)脂肪酸和脂肪酸衍生產(chǎn)物，具體地講，適宜生產(chǎn)具有高濃度特定脂肪酸鏈長的脂肪酸和脂肪酸衍生產(chǎn)物。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：在一個方面，本發(fā)明提供了包含異源核酸序列的經(jīng)遺傳修飾生物體，該異源核酸序列編碼3-酮脂酰輔酶A合酶、酮脂酰輔酶A還原酶、羥酰輔酶A脫水酶、或烯酰輔酶A還原酶；并且其中所述微生物能夠生產(chǎn)碳鏈長度為C4或C4以上的脂肪酸或脂肪酸衍生產(chǎn)物。在一些實(shí)施例中，3-酮脂酰輔酶A合酶包括NphT7。在一些實(shí)施例中，3-酮脂酰輔酶A合酶的氨基酸序列與SEQIDNO.1-120中任一序列的同源性為至少70％。在一些實(shí)施例中，酮脂酰輔酶A還原酶選自3-酮丁酰輔酶A還原酶、3-羥丁酰輔酶A脫氫酶、3-酮戊酰輔酶A還原酶以及3-羥戊酰輔酶A脫氫酶。在一些實(shí)施例中，酮脂酰輔酶A還原酶的氨基酸序列與SEQIDNO183和SEQIDNO271中任一序列的同源性為至少70％。在一些實(shí)施例中，羥酰輔酶A脫水酶選自3-羥丁酰輔酶A脫水酶和烯酰輔酶A水合酶。在一些實(shí)施例中，羥酰輔酶A脫水酶的氨基酸序列與SEQIDNO183和SEQIDNO272中任一序列的同源性為至少70％。在一些實(shí)施例中，烯酰輔酶A還原酶為反式-2-烯酰還原酶。在一些實(shí)施例中，烯酰輔酶A還原酶的氨基酸序列與SEQIDNO275的同源性為至少70％。在一些實(shí)施例中，3-酮脂酰輔酶A合酶包含經(jīng)修飾NphT7多肽，該經(jīng)修飾NphT7多肽包含一種或多種氨基酸置換，選自將第86至89位氨基酸從PDRP置換為HFLQ，F(xiàn)217A、F217E、F217G、F217I、F217L、F217M、F21i7P、F217S、F217T、F217V、F217W、G288S、G309S、I147A、I147C、I147D、I147E、I147F、I147G、I147H、I147K、I147L、I147M、I147N、I147P、I147Q、I147R、I147S、I147T、I147V、I147W、I147Y、V157F、V196G和Y144L。在一些實(shí)施例中，3-酮脂酰輔酶A合酶包含經(jīng)修飾NphT7多肽，該經(jīng)修飾NphT7多肽包含兩種氨基酸置換，選自I147T和F217V、I147T和Y144L、I147T和V196G、I147F和F217V、I147M和F217V、I147S和F217V、I147T和HFLQ、I147T和V157F、I147T和F217G、I147T和F217A、I147T和F217L、I147T和F217I、I147T和F217M、I147T和F217P、I147T和F217S、I147T和F217E、I147S和F217G、I147S和F217A、I147S和F217L、I147S和F217I、I147S和F217M、I147S和F217W、I147S和F217S、I147S和F217E、I147S和F217K、I147F和F217A、I147F和F217L、I147F和F217I、I147F和F217M、I147F和F217P、I147F和F217E、I147M和F217G、I147M和F217A、I147M和F217L、I147M和F217I、I147M和F217M、I147M和F217P、I147M和F217S、I147M和F217E，以及I147M和F217K。在一些實(shí)施例中，3-酮脂酰輔酶A合酶包含經(jīng)修飾NphT7多肽，該經(jīng)修飾NphT7多肽包含三種氨基酸置換，選自Y144L、I147T和F217V；I147T、F217V和HFLQ；I147T、V147F和F217V；以及Y144L、I147T和V157F。在一些實(shí)施例中，3-酮脂酰輔酶A合酶包含經(jīng)修飾NphT7多肽，該經(jīng)修飾NphT7多肽在選自下列的位置具有一種或多種氨基酸置換：Ser84、Val114、Gly288、Ile194、Gly318、Thr85、Gln90、Val196、Tyr144、Phe159、Ile147和Phe217。在一些實(shí)施例中，酮脂酰輔酶A還原酶選自3-酮脂酰輔酶A還原酶和3-羥酰輔酶A脫氫酶。在一些實(shí)施例中，酮脂酰輔酶A還原酶的氨基酸序列與SEQIDNO183和SEQIDNO271中任一序列的同源性為至少70％。在一些實(shí)施例中，羥酰輔酶A脫水酶選自3-羥酰輔酶A脫水酶和烯酰輔酶A水合酶。在一些實(shí)施例中，羥酰輔酶A脫水酶的氨基酸序列與SEQIDNO183和SEQIDNO272中任一序列的同源性為至少70％。在一些實(shí)施例中，烯酰輔酶A還原酶為反式-2-烯酰還原酶。在一些實(shí)施例中，烯酰輔酶A還原酶的氨基酸序列與SEQIDNO275的同源性為至少70％。在一些實(shí)施例中，經(jīng)遺傳修飾生物體還包含編碼硫酯酶或蠟酯合酶的異源核酸序列。在一些實(shí)施例中，經(jīng)遺傳修飾生物體還包含編碼終止酶的異源核酸序列，該終止酶催化生產(chǎn)脂肪酸衍生產(chǎn)物，這些產(chǎn)物選自脂肪醇、脂肪醛、脂肪烯烴、脂肪酰胺、脂肪烷烴和脂肪二酸。在一些實(shí)施例中，硫酯酶為?；o酶A酯酶，并且生物體能夠產(chǎn)生脂肪酸。在一些實(shí)施例中，硫酯酶選自tesA、'tesA、tesB、yciA、ybgC、ybfF、fadM、AtTE、CpTE、CperfTE、LpTE和PA2801TE。在一些實(shí)施例中，硫酯酶的氨基酸序列與SEQIDNO277、SEQIDNO278、SEQIDNO279、SEQIDNO280、SEQIDNO281、SEQIDNO282、SEQIDNO283、SEQIDNO284、SEQIDNO285、SEQIDNO286、SEQIDNO287和SEQIDNO288中任一序列的同源性為至少70％。在一些實(shí)施例中，蠟酯合酶選自Maq1、Pcry1、Rjos1和Abork1，并且其中所述生物體能夠產(chǎn)生脂肪酯。在一些實(shí)施例中，蠟酯合酶的氨基酸序列與SEQIDNO289、SEQIDNO290、SEQIDNO291和SEQIDNO292中任一序列的同源性為至少70％，并且其中所述生物體能夠產(chǎn)生脂肪酯。在一些實(shí)施例中，3-酮脂酰輔酶A合酶為NphT7；酮基輔酶A還原酶選自hbd和fadB；3-羥酰輔酶A脫水酶選自crt和fadB；烯酰輔酶A還原酶為ter；硫酯酶選自CpTE、fadM、PA2801TE、tesB、ybgC、ybfF和yciA；并且其中由所述多核苷酸編碼的蛋白質(zhì)能夠產(chǎn)生四碳或五碳脂肪酸或脂肪酸衍生產(chǎn)物。在一些實(shí)施例中，硫酯酶選自tesB和yciA。在一些實(shí)施例中，一種或多種3-酮脂酰輔酶A合酶選自NphT7、NphT7I147T、NphT7F217V和NphT7I147TF217V；酮基輔酶A還原酶為fadB；3-羥酰輔酶A脫水酶為fadB；烯酰輔酶A還原酶為ter；并且硫酯酶選自AtTE、CpTE、CperfTE、PA2801TE、tesA、tesB、ybfF、ybgC和yciA；并且其中由所述多核苷酸編碼的蛋白質(zhì)能夠產(chǎn)生六碳或七碳脂肪酸或脂肪酸衍生產(chǎn)物。在一些實(shí)施例中，硫酯酶選自PA2801TE、tesB和yciA。在一些實(shí)施例中，一種或多種3-酮脂酰輔酶A合酶選自NphT7、NphT7I147T、NphT7F217V、NphT7I147T與F217V、Npth7I147S、Npth7I147S與F217V以及合酶III；酮基輔酶A還原酶選自fadB和fabG；3-羥酰輔酶A脫水酶選自fadB、ech和ech2；烯酰輔酶A還原酶為ter；并且硫酯酶選自AtTE、CpTE、CperfTE、fadM、PA2801TE、tesA、tesB、ybfF、ybgC和yciA；并且其中由所述多核苷酸編碼的蛋白質(zhì)能夠產(chǎn)生八碳或九碳脂肪酸或脂肪酸衍生產(chǎn)物。在一些實(shí)施例中，硫酯酶選自PA2801TE、tesB和yciA。在一些實(shí)施例中，一種或多種3-酮脂酰輔酶A合酶選自NphT7、NphT7I147T、NphT7F217V、NphT7I147T與F217V、Npth7I147S、Npth7I147S與F217V、合酶III、合酶IV以及合酶V；酮基輔酶A還原酶選自fadB和fabG；3-羥酰輔酶A脫水酶選自fadB、ech和ech2；烯酰輔酶A還原酶為ter；并且硫酯酶選自AtTE、CpTE、fadM、PA2801TE、tesA、tesB、ybfF、ybgC和yciA；并且其中由所述多核苷酸編碼的蛋白質(zhì)能夠產(chǎn)生十碳或十一碳脂肪酸或脂肪酸衍生產(chǎn)物。在一些實(shí)施例中，硫酯酶選自tesB和yciA。在一些實(shí)施例中，一種或多種3-酮脂酰輔酶A合酶選自NphT7、NphT7I147T、NphT7F217V、NphT7I147T與F217V、Npth7I147S、Npth7I147S與F217V、合酶III、合酶IV、合酶V以及合酶VI；酮基輔酶A還原酶選自fadB、fabG和fadJ；3-羥酰輔酶A脫水酶選自fadB、ech和fadJ；烯酰輔酶A還原酶為ter；并且硫酯酶選自AtTE、CpTE、CperfTE、fadM、LpTE、PA2801TE、tesA、tesB、ybfF、ybgC和yciA；并且其中由所述多核苷酸編碼的蛋白質(zhì)能夠產(chǎn)生十二碳或十三碳脂肪酸或脂肪酸衍生產(chǎn)物。在一些實(shí)施例中，硫酯酶選自fadM、PA2801TE、tesA、tesB和yciA。在一些實(shí)施例中，一種或多種3-酮脂酰輔酶A合酶選自NphT7、NphT7I147T、NphT7F217V、NphT7I147T與F217V、Npth7I147S、Npth7I147S與F217V、合酶III、合酶IV、合酶V以及合酶VI；酮基輔酶A還原酶選自fadB和fadJ；3-羥酰輔酶A脫水酶選自fadB和fadJ；烯酰輔酶A還原酶選自ter、ydiO和fadE；并且硫酯酶選自AtTE、CpTE、CperfTE、fadM、LpTE、PA2801TE、tesA、tesB、ybfF、ybgC和yciA；并且其中由所述多核苷酸編碼的蛋白質(zhì)能夠產(chǎn)生碳鏈長度為至少十四個碳的脂肪酸。在一些實(shí)施例中，硫酯酶選自fadM、tesA、tesB和yciA，并且由所述多核苷酸編碼的蛋白質(zhì)能夠產(chǎn)生十四碳或十五碳脂肪酸或脂肪酸衍生產(chǎn)物。在一些實(shí)施例中，硫酯酶選自AtTE、CpTE、CperfTE、fadM、Pa2801TE、tesA、tesB、ybfF、ybgC和yciA，并且由所述多核苷酸編碼的蛋白質(zhì)能夠產(chǎn)生十六碳或十七碳脂肪酸或脂肪酸衍生產(chǎn)物。在一些實(shí)施例中，硫酯酶選自AtTE、fadM、tesA、tesB、ybfF、ybgC和yciA，并且由所述多核苷酸編碼的蛋白質(zhì)能夠產(chǎn)生十六碳或十七碳脂肪酸或脂肪酸衍生產(chǎn)物。在一些實(shí)施例中，生物體能夠?qū)⒁阴］o酶A用作引物，將丙二酰輔酶A用作延伸分子，產(chǎn)生碳鏈長度選自4、6、8、10、12、14、16、18和20個碳的脂肪酸或脂肪酸衍生產(chǎn)物。在一些實(shí)施例中，生物體能夠?qū)⒈］o酶A用作引物，將丙二酰輔酶A用作延伸分子，產(chǎn)生碳鏈長度選自5、7、9、11、13、15、17、19和21個碳的脂肪酸或脂肪酸衍生產(chǎn)物。在一個方面，本發(fā)明提供了經(jīng)修飾NphT7多肽，該經(jīng)修飾NphT7多肽的氨基酸序列與SEQIDNO:1的同源性為至少70％，并包含一種或多種氨基酸置換、缺失或插入，其中該經(jīng)修飾NphT7多肽能夠接受碳鏈長度為C4或C4以上的酰基輔酶A底物。在一些實(shí)施例中，經(jīng)修飾NphT7多肽能夠催化縮合反應(yīng)，使酰基輔酶A底物與丙二酰輔酶A縮合，產(chǎn)生碳鏈長度為C6或C6以上的3-酮脂酰輔酶A。在一些實(shí)施例中，經(jīng)修飾NphT7多肽包含一種或多種氨基酸置換，選自I147T、F217V、Y144L、V157F、G309S、G288S、將第86至89位氨基酸從PDRP置換為HFLQ、I147F、I147M、I147Q、I147S、I147C、I147E、I147N、I147W、I147D、I147R、I147P、I147L、V196G、I147G、I147H、I147K、I147V、I147A、I147Y、F217G、F217A、F217L、F217I、F217M、F217T、F217P、F217S、F217E、F217L、F217W，以及這些置換的任意組合。在一些實(shí)施例中，經(jīng)修飾NphT7多肽包含一種氨基酸置換，選自I147V、I147F、I147M、I147Q、I147S、I147C、I147E、I147N、I147W、I147D、I147R、I147P、I147L、I147G、I147H、I147K、I147A、I147Y和F217V。在一些實(shí)施例中，經(jīng)修飾NphT7多肽包含兩種氨基酸置換，選自I147T和F217V、I147T和Y144L、I147T和V196G、I147F和F217V、I147M和F217V、I147S和F217V、I147T和HFLQ、I147T和V157F、I147T和F217G、I147T和F217A、I147T和F217L、I147T和F217I、I147T和F217M、I147T和F217P、I147T和F217S、I147T和F217E、I147S和F217G、I147S和F217A、I147S和F217L、I147S和F217I、I147S和F217M、I147S和F217W、I147S和F217S、I147S和F217E、I147S和F217K、I147F和F217A、I147F和F217L、I147F和F217I、I147F和F217M、I147F和F217P、I147F和F217E、I147M和F217G、I147M和F217A、I147M和F217L、I147M和F217I、I147M和F217M、I147M和F217P、I147M和F217S、I147M和F217E，以及I147M和F217K。在一些實(shí)施例中，經(jīng)修飾NphT7多肽包含三種氨基酸置換，選自(Y144L、I147T和F217V)；(I147T、F217V和HFLQ)；(I147T、V147F和F217V)；以及(Y144L、I147T和V157F)。在一些實(shí)施例中，經(jīng)修飾NphT7多肽在選自下列的位置具有一種或多種氨基酸置換：Ser84、Val114、Gly288、Ile194、Gly318、Thr85、Gln90、Val196、Tyr144、Phe159、Ile147、Phe217，以及這些位置的任意組合。在一些實(shí)施例中，經(jīng)修飾NphT7多肽包含I147T氨基酸置換。在一些實(shí)施例中，經(jīng)修飾NphT7多肽包含F(xiàn)217V氨基酸置換。在一些實(shí)施例中，經(jīng)修飾NphT7多肽包含兩種或兩種以上氨基酸置換、缺失或插入。在一些實(shí)施例中，經(jīng)修飾NphT7多肽包含I147T氨基酸置換和F217V氨基酸置換。在一些實(shí)施例中，經(jīng)修飾多肽為分離并純化過的。在一個方面，本發(fā)明提供了編碼本發(fā)明的經(jīng)修飾NphT7多肽的分離并純化過的多核苷酸。在一個方面，本發(fā)明提供的分離并純化過的多核苷酸的核酸序列與SEQIDNO:2的同源性或互補(bǔ)性為至少70％但不到100％或?yàn)榧s100％，其中這種多核苷酸編碼具有一種或多種氨基酸置換的SEQIDNO:1的經(jīng)修飾NphT7多肽，其中經(jīng)修飾NphT7多肽能夠接受碳鏈長度為C4或C4以上的?；o酶A底物。在一些實(shí)施例中，分離并純化過的多核苷酸編碼的經(jīng)修飾NphT7多肽能夠催化縮合反應(yīng)，使?；o酶A底物與丙二酰輔酶A縮合，產(chǎn)生碳鏈長度為C6或C6以上的3-酮脂酰輔酶A。在一些實(shí)施例中，分離并純化過的多核苷酸編碼的經(jīng)修飾NphT7多肽包含一種或多種氨基酸置換，選自I147T、F217V、Y144L、V157F、G309S、G288S、將第86至89位氨基酸從PDRP置換為HFLQ、I147F、I147M、I147Q、I147S、I147C、I147E、I147N、I147W、I147D、I147R、I147P、I147L、V196G、I147G、I147H、I147K、I147V、I147A、I147Y、F217G、F217A、F217L、F217I、F217M、F217T、F217P、F217S、F217E、F217L、F217W，以及這些置換的任意組合。在一些實(shí)施例中，分離并純化過的多核苷酸編碼的經(jīng)修飾NphT7多肽包含一種氨基酸置換，選自I147V、I147F、I147M、I147Q、I147S、I147C、I147E、I147N、I147W、I147D、I147R、I147P、I147L、I147G、I147H、I147K、I147A、I147Y和F217V。在一些實(shí)施例中，分離并純化過的多核苷酸編碼的經(jīng)修飾NphT7多肽包含兩種氨基酸置換，選自I147T和F217V、I147T和Y144L、I147T和V196G、I147F和F217V、I147M和F217V、I147S和F217V、I147T和HFLQ、I147T和V157F、I147T和F217G、I147T和F217A、I147T和F217L、I147T和F217I、I147T和F217M、I147T和F217P、I147T和F217S、I147T和F217E、I147S和F217G、I147S和F217A、I147S和F217L、I147S和F217I、I147S和F217M、I147S和F217W、I147S和F217S、I147S和F217E、I147S和F217K、I147F和F217A、I147F和F217L、I147F和F217I、I147F和F217M、I147F和F217P、I147F和F217E、I147M和F217G、I147M和F217A、I147M和F217L、I147M和F217I、I147M和F217M、I147M和F217P、I147M和F217S、I147M和F217E，以及I147M和F217K。在一些實(shí)施例中，分離并純化過的多核苷酸編碼的經(jīng)修飾NphT7多肽包含三種氨基酸置換，選自(Y144L、I147T和F217V)；(I147T、F217V和HFLQ)；(I147T、V147F和F217V)；以及(Y144L、I147T和V157F)。在一些實(shí)施例中，分離并純化過的多核苷酸編碼的經(jīng)修飾NphT7多肽在選自下列的位置具有一種或多種氨基酸置換：Ser84、Val114、Gly288、Ile194、Gly318、Thr85、Gln90、Val196、Tyr144、Phe159、Ile147、Phe217，以及這些位置的任意組合。在一些實(shí)施例中，分離并純化過的多核苷酸編碼的經(jīng)修飾NphT7多肽包含I147T氨基酸置換。在一些實(shí)施例中，分離并純化過的多核苷酸編碼的經(jīng)修飾NphT7多肽包含F(xiàn)217V氨基酸置換。在一些實(shí)施例中，分離并純化過的多核苷酸編碼的經(jīng)修飾NphT7多肽包含兩種或兩種以上氨基酸置換。在一些實(shí)施例中，分離并純化過的多核苷酸編碼的經(jīng)修飾NphT7多肽包含I147T氨基酸置換和F217V氨基酸置換。在一些實(shí)施例中，分離并純化過的多核苷酸為RNA。在一些實(shí)施例中，分離并純化過的多核苷酸為mRNA。在一些實(shí)施例中，分離并純化過的多核苷酸為DNA。在一些實(shí)施例中，分離并純化過的多核苷酸為cDNA。在一些實(shí)施例中，載體包含本發(fā)明的多核苷酸。在一些實(shí)施例中，質(zhì)粒包含本發(fā)明的多核苷酸。在一個方面，本發(fā)明提供了選擇3-酮脂酰輔酶A合酶作為候選物，來縮合丙二酰輔酶A與碳鏈長度為C2以上的?；o酶A的方法，包括：識別氨基酸序列與SEQIDNO:1的同源性為至少70％但不到100％或?yàn)榧s100％的3-酮脂酰輔酶A合酶多肽；選擇3-酮脂酰輔酶A合酶作為候選物，來縮合丙二酰輔酶A與碳鏈長度為C2以上的?；o酶A，前提是這種3-酮脂酰輔酶A合酶具有選自下列的一種或多種特征：(A/G)GGSR序列基序，缺少STPDXPQ序列基序，底物結(jié)合位點(diǎn)中只有疏水殘基。在一些實(shí)施例中，該方法包括選擇至少兩種3-酮脂酰輔酶A合酶，其中每種合酶III占據(jù)系統(tǒng)發(fā)育樹的不同分枝。在一個方面，本發(fā)明提供了利用本發(fā)明的方法選擇的NphT7同源物的文庫。在一個方面，本發(fā)明提供了分離的NphT7同源物，該分離的NphT7同源物的氨基酸序列與SEQIDNO.1-120中任一序列的同源性為至少70％、但不到100％。在一個方面，本發(fā)明提供了分離的多核苷酸，該分離的多核苷酸編碼本發(fā)明的所選3-酮脂酰輔酶A合酶。在一個方面，本發(fā)明提供了經(jīng)遺傳修飾生物體，該經(jīng)遺傳修飾生物體表達(dá)本發(fā)明的所選3-酮脂酰輔酶A合酶。在一個方面，本發(fā)明提供了產(chǎn)生經(jīng)遺傳修飾生物體的方法，該經(jīng)遺傳修飾生物體表達(dá)本發(fā)明的所選3-酮脂酰輔酶A合酶，該方法包括用本發(fā)明的多核苷酸轉(zhuǎn)化微生物。在一個方面，本發(fā)明提供了經(jīng)遺傳修飾生物體，該經(jīng)遺傳修飾生物體能夠以超過缺少遺傳修飾的對照生物體的速率或滴度，產(chǎn)生碳鏈長度為C6或C6以上的脂肪酸或脂肪酸衍生產(chǎn)物，其中該經(jīng)遺傳修飾生物體不包含SEQIDNO:121、SEQIDNO:122和SEQIDNO:123中任一序列。在一些實(shí)施例中，經(jīng)遺傳修飾生物體包含本發(fā)明的載體或質(zhì)粒。在一些實(shí)施例中，用載體或質(zhì)粒轉(zhuǎn)化經(jīng)遺傳修飾生物體。在一些實(shí)施例中，經(jīng)遺傳修飾生物體包含本發(fā)明的多核苷酸。在一些實(shí)施例中，經(jīng)遺傳修飾生物體表達(dá)本發(fā)明的經(jīng)修飾多肽和/或多核苷酸。在一些實(shí)施例中，經(jīng)遺傳修飾生物體表達(dá)本發(fā)明的NphT7同源物或經(jīng)修飾NphT7多肽。在一些實(shí)施例中，經(jīng)遺傳修飾生物體包含異源多肽，該異源多肽能夠縮合丙二酰輔酶A與碳鏈長度為C2以上的酰基輔酶A，產(chǎn)生碳鏈長度為C4以上的3-酮脂酰輔酶A。在一些實(shí)施例中，?；o酶A為乙酰輔酶A，并且3-酮脂酰輔酶A為3-酮丁酰輔酶A。在一些實(shí)施例中，?；o酶A為乙酰輔酶A，并且3-酮脂酰輔酶A為3-酮丁酰輔酶A。在一些實(shí)施例中，酰基輔酶A為丙酰輔酶A，并且3-酮脂酰輔酶A為3-酮戊酰輔酶A。在一些實(shí)施例中，經(jīng)遺傳修飾生物體能夠產(chǎn)生碳鏈長度為C6、C8、C10、C12、C14、C16、C18、C20或C20以上，且純度高于20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的游離脂肪酸或脂肪酸衍生產(chǎn)物。在一些實(shí)施例中，經(jīng)遺傳修飾生物體能夠以約0.1g/gDCW*h、約0.2g/gDCW*h或更大的速率產(chǎn)生游離脂肪酸或脂肪酸衍生產(chǎn)物。在一些實(shí)施例中，經(jīng)遺傳修飾生物體還包含額外的遺傳修飾，用于增大?；o酶A的產(chǎn)生速率。在一些實(shí)施例中，經(jīng)遺傳修飾生物體還包含額外的遺傳修飾，用于增大丙二酰輔酶A的產(chǎn)生速率。在一些實(shí)施例中，經(jīng)遺傳修飾生物體還包含額外的遺傳修飾，用于抑制丙二酰ACP脂肪酸合成途徑。在一些實(shí)施例中，經(jīng)遺傳修飾生物體還包含額外的遺傳修飾，用于降低丙二酰輔酶A向丙二酰ACP的轉(zhuǎn)化。在一些實(shí)施例中，經(jīng)遺傳修飾生物體還包含額外的遺傳修飾，用于減慢丙二酰ACP與乙酰ACP縮合的速率。在一些實(shí)施例中，經(jīng)遺傳修飾生物體還包含一種或多種額外的遺傳修飾，用于完全或部分地抑制選自下列的一種或多種反應(yīng)：葡萄糖向甲基乙二醛轉(zhuǎn)化、丙酮酸鹽向乳酸鹽轉(zhuǎn)化、乙酰輔酶A向乙酸鹽轉(zhuǎn)化、乙酰輔酶A向乙醇轉(zhuǎn)化、脂肪酰輔酶A向乙酰輔酶A轉(zhuǎn)化，以及這些反應(yīng)的任意組合。在一些實(shí)施例中，經(jīng)遺傳修飾生物體包含編碼3-酮脂酰輔酶A合酶的多核苷酸，該3-酮脂酰輔酶A合酶的氨基酸序列與SEQIDNO.1-120中任一序列的同源性為至少70％但不到100％，或?yàn)榧s100％。在一些實(shí)施例中，經(jīng)遺傳修飾生物體包含一種或多種異源多肽，選自酮基輔酶A還原酶(KCR)、3-羥酰輔酶A脫水酶(3HDh)、烯酰輔酶A還原酶(EnCR)、硫酯酶，以及這些酶的任意組合。在一些實(shí)施例中，經(jīng)遺傳修飾生物體包含一種或多種異源KCR，選自fadB、fabG、fadJ、ech2、PhaB、PaFabG，以及這些酶的任意組合。在一些實(shí)施例中，經(jīng)遺傳修飾生物體包含一種或多種異源3HDh，選自fadB、fadJ、ech、ech2、crt，以及這些酶的任意組合。在一些實(shí)施例中，經(jīng)遺傳修飾生物體包含一種或多種異源EnCR，選自ter、ccr、fadE、ydiO，以及這些酶的任意組合。在一些實(shí)施例中，經(jīng)遺傳修飾生物體包含一種或多種異源硫酯酶，選自yciA、PA2801TE、ATTE、YbgC、tesA、YbfF、fadM、LpTE、CpTE(或CperfTE)，以及這些酶的任意組合。在一些實(shí)施例中，經(jīng)遺傳修飾生物體包含一種或多種異源3-酮脂酰輔酶A合酶，選自野生型NphT7、具有I147T突變的NphT7、具有I147T和F217V突變的NphT7，以及這些酶的任意組合；此外，還包含下列酶中的至少一種：異源fadB；異源ter；和/或一種或多種硫酯酶，選自tesA、yciA、PA2801TE和它們的任意組合。在一些實(shí)施例中，經(jīng)遺傳修飾生物體包含一種或多種異源3-酮脂酰輔酶A合酶，選自野生型NphT7、具有I147T突變的NphT7、具有I147T和F217V突變的NphT7、合酶III以及這些酶的任意組合；此外，還包含下列酶中的至少一種：一種或多種異源KCR，選自fadB和fabG；一種或多種異源3HDh，選自fadB、ech和ech2；異源ter；和/或一種或多種硫酯酶，選自tesA、yciA、PA2801TE和它們的任意組合。在一些實(shí)施例中，經(jīng)遺傳修飾生物體包含一種或多種異源3-酮脂酰輔酶A合酶，選自野生型NphT7、具有I147T突變的NphT7、具有I147T和F217V突變的NphT7、合酶III、合酶IV、合酶V以及這些酶的任意組合；此外，還包含下列酶中的至少一種：一種或多種異源KCR，選自fadB和fabG；一種或多種異源3HDh，選自fadB、ech和ech2；異源ter；和/或一種或多種硫酯酶，選自tesA、ATTE、YbgC和它們的任意組合。在一些實(shí)施例中，經(jīng)遺傳修飾生物體包含一種或多種異源3-酮脂酰輔酶A合酶，選自野生型NphT7、具有I147T突變的NphT7、具有I147T和F217V突變的NphT7、合酶III、合酶IV、合酶V、合酶VI以及這些酶的任意組合；此外，還包含下列酶中的至少一種：一種或多種異源KCR，選自fadB、fabG、fadJ和它們的任意組合；一種或多種異源3HDh，選自fadB、fadJ、ech和它們的任意組合；異源ter；和/或一種或多種硫酯酶，選自tesA、ybgC、ybFF和它們的任意組合。在一些實(shí)施例中，經(jīng)遺傳修飾生物體包含一種或多種異源3-酮脂酰輔酶A合酶，選自野生型NphT7、具有I147T突變的NphT7、具有I147T和F217V突變的NphT7、合酶III、合酶IV、合酶V、合酶VI以及這些酶的任意組合；此外，還包含下列酶中的至少一種：一種或多種異源KCR，選自fadB和fadJ；一種或多種異源3HDh，選自fadB和fadJ；一種或多種異源EnCR，選自ter、ydiO和fadE；和/或一種或多種硫酯酶，選自tesA、fadM和它們的任意組合。在一些實(shí)施例中，經(jīng)遺傳修飾生物體還包含額外的遺傳修飾，用于降低選自下列的一種或多種內(nèi)源多肽的活性：KCR、hbd、烯酰輔酶A還原酶、硫酯酶，以及這些酶的任意組合。在一些實(shí)施例中，經(jīng)遺傳修飾生物體還包含額外的遺傳修飾，用于降低一種或多種溫度敏感性內(nèi)源多肽的活性。在一些實(shí)施例中，經(jīng)遺傳修飾生物體包含一個或多個載體，所述載體編碼本發(fā)明的第二遺傳修飾。在一些實(shí)施例中，經(jīng)遺傳修飾生物體包含異源轉(zhuǎn)運(yùn)體，該異源轉(zhuǎn)運(yùn)體可轉(zhuǎn)運(yùn)碳鏈長度為C6或C6以上的游離脂肪酸穿過細(xì)胞膜。在一些實(shí)施例中，經(jīng)遺傳修飾生物體包含異源轉(zhuǎn)運(yùn)體，該異源轉(zhuǎn)運(yùn)體為ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體。在一些實(shí)施例中，經(jīng)遺傳修飾生物體包含脂肪酸衍生產(chǎn)物，該脂肪酸衍生產(chǎn)物為脂肪醇、脂肪醛、脂肪烯烴、脂肪酰胺、脂肪酯、脂肪烷烴或脂肪二酸。在一些實(shí)施例中，一種或多種硫酯酶被完全或部分敲除，所述硫酯酶選自tesB、YciA、AtTE、CpTE和它們的任意組合。在一些實(shí)施例中，經(jīng)遺傳修飾生物體為分離并純化過的。在一個方面，本發(fā)明提供了經(jīng)遺傳修飾生物體，這種經(jīng)遺傳修飾生物體具有選自下列的遺傳修飾：F-、Δ(araD-araB)567、ΔlacZ4787(::rrnB-3)、LAM-、rph-1、Δ(rhaD-rhaB)568、hsdR514、ΔldhA::frt、ΔpflB::frt、ΔmgsA::frt、ΔpoxB::frt、Δpta-ack::frt、fabI(ts)-(S241F)-zeoR、Δtig::frt、ΔatoDAEB::frt和ΔfadD::frt；以及額外的遺傳修飾，用于增強(qiáng)從輔酶A底物合成脂肪酸。在一些實(shí)施例中，經(jīng)遺傳修飾生物體包含宿主基因缺失，其中該缺失導(dǎo)致丙二酰輔酶A產(chǎn)量增加。在一些實(shí)施例中，經(jīng)遺傳修飾生物體包含選自下列的一個或多個基因的缺失：乳酸脫氫酶基因、丙酮酸甲酸裂解酶基因、甲基乙二醛合酶基因、丙酮酸氧化酶基因、磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶基因、乙酸激酶基因、雙功能乙酰輔酶A還原酶/乙醇脫氫酶基因，以及這些基因的任意組合。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的經(jīng)遺傳修飾生物體還包含額外的遺傳修飾，這種額外的遺傳修飾與選自下列的一種或多種酶有關(guān)：ACP、fabI、fabB、fabH、fabD、fabF、fabG、fabA、fabZ、fabR，以及這些酶的任意組合。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的經(jīng)遺傳修飾生物體還包含額外的遺傳修飾，這種額外的遺傳修飾與選自下列的一種或多種酶有關(guān)：udhA、pntAB、PDH、CoAA、panD、aceA、aceB、aceK、GAPDH、pyk、pyk、gltA、CS、bicA、GOGAT、gdh、can、cynT、cynS、puuC、aldA、aldB、yieP、yibD、pstS、BAAT、rhtA、mdtM、yddG、yebS、yeeO、dedA、ycaP、ytfL、ybbP、yegH、ykgH、ytfF、eamB、ydhP、ypjD、mdlB、acrD、ydcO、emrD、citT、citS、citM、citH，以及這些酶的任意組合。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的經(jīng)遺傳修飾生物體還包含與乙酰輔酶A羧化酶(ACCase)有關(guān)的額外遺傳修飾。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的經(jīng)遺傳修飾生物體還包含額外的遺傳修飾，這種額外的遺傳修飾與選自下列的一種或多種酶有關(guān)：cscA、cscB、cscK、galP、galKf，以及這些酶的任意組合。在一些實(shí)施例中，經(jīng)遺傳修飾生物體還包含額外的遺傳修飾，這種額外的遺傳修飾與選自下列的一種或多種酶有關(guān)：fadE、fadD、fadA、fadB、fadI、fadJ、ydiO、paaJ、yqeF、tig、atoD、atoA、atoE、atoB，以及這些酶的任意組合。在一些實(shí)施例中，經(jīng)遺傳修飾生物體還包含額外的遺傳修飾，這種額外的遺傳修飾與選自下列的一種或多種酶有關(guān)：NphT7、SaFabH、BsFabH、PaFabH、MtFabH、FabH、PaFabG、fabG、hbd、crt、ech、ech2、ter、ccr，以及這些酶的任意組合。在一些實(shí)施例中，經(jīng)遺傳修飾生物體還包含引起異源硫酯酶表達(dá)的額外遺傳修飾。在一些實(shí)施例中，受任一權(quán)利要求保護(hù)的經(jīng)遺傳修飾生物體包含一種或多種異源硫酯酶，選自tesA、'tesA、tesB、yciA、ybgC、ybfF、fadM、AtTE、CpTE(或CperfTE)、LpTE、Pa2801TE以及這些酶的任意組合。在一些實(shí)施例中，經(jīng)遺傳修飾生物體還包含引起異源蠟酯合酶表達(dá)的額外遺傳修飾。在一些實(shí)施例中，經(jīng)遺傳修飾生物體包含一種或多種異源蠟酯合酶，選自Maq1、Pcry1、Rjos1、Abork1以及這些酶的任意組合。在一些實(shí)施例中，經(jīng)遺傳修飾生物體還包含額外的遺傳修飾，這種額外的遺傳修飾引起選自下列的一種或多種異源蛋白質(zhì)的表達(dá)：prpE、phaA、phaB、phaC、THNS、THNS"和它們的任意組合。在一些實(shí)施例中，經(jīng)遺傳修飾生物體為微生物。在一些實(shí)施例中，經(jīng)遺傳修飾生物體為大腸桿菌(E.Coli)。在一個方面，本發(fā)明提供了由丙二酰輔酶A生產(chǎn)碳鏈長度為C6或C6以上的游離脂肪酸的方法，包括用碳進(jìn)料源培養(yǎng)經(jīng)轉(zhuǎn)化微生物，從而產(chǎn)生游離脂肪酸。在一個方面，本發(fā)明提供了由丙二酰輔酶A生產(chǎn)碳鏈長度為C6或C6以上的游離脂肪酸的方法，包括：誘導(dǎo)微生物表達(dá)多肽；然后用碳進(jìn)料源培養(yǎng)經(jīng)轉(zhuǎn)化微生物，從而產(chǎn)生游離脂肪酸。在一個方面，本發(fā)明提供了由丙二酰輔酶A生產(chǎn)碳鏈長度為C6或C6以上的游離脂肪酸的方法，包括：提供經(jīng)遺傳修飾微生物；然后用碳進(jìn)料源培養(yǎng)經(jīng)轉(zhuǎn)化微生物，從而產(chǎn)生游離脂肪酸。在一個方面，本發(fā)明提供了生產(chǎn)碳鏈長度為C6或C6以上的游離脂肪酸的方法，包括：將微生物置于足以增加?；o酶A和丙二酰輔酶A產(chǎn)量的條件下培養(yǎng)。在一個方面，本發(fā)明提供了生產(chǎn)碳鏈長度為C6或C6以上的游離脂肪酸的方法，包括：將微生物置于足以讓丙二酰輔酶A與碳鏈長度為C2或C2以上的?；o酶A縮合的條件下培養(yǎng)，從而縮合得到鏈長為C6或C6以上的酮脂酰輔酶A產(chǎn)物。在一個方面，本發(fā)明提供了生產(chǎn)碳鏈長度為C6或C6以上的游離脂肪酸的方法，包括：將微生物置于足以還原碳鏈長度為C6或C6以上的酮脂酰輔酶A產(chǎn)物中的酮基的條件下培養(yǎng)，從而產(chǎn)生碳鏈長度為C6或C6以上的羥脂酰輔酶A產(chǎn)物。在一個方面，本發(fā)明提供了生產(chǎn)碳鏈長度為C6或C6以上的游離脂肪酸的方法，包括：將微生物置于足以讓碳鏈長度為C6或C6以上的羥脂酰輔酶A產(chǎn)物與脫水酶反應(yīng)的條件下培養(yǎng)，從而產(chǎn)生碳鏈長度為C6或C6以上的烯脂酰輔酶A產(chǎn)物。在一個方面，本發(fā)明提供了生產(chǎn)碳鏈長度為C6或C6以上的游離脂肪酸的方法，包括：將微生物置于足以還原碳鏈長度為C6或C6以上的烯脂酰輔酶A產(chǎn)物的烯?；鶊F(tuán)的條件下培養(yǎng)，從而產(chǎn)生碳鏈長度為C6或C6以上的?；o酶A產(chǎn)物。在一個方面，本發(fā)明提供了生產(chǎn)碳鏈長度為C6或C6以上的游離脂肪酸的方法，包括：將微生物置于足以從碳鏈長度為C6或C6以上的酰基輔酶A產(chǎn)物移除輔酶A基團(tuán)的條件下培養(yǎng)，從而產(chǎn)生碳鏈長度為C6或C6以上的游離脂肪酸或脂肪酸衍生產(chǎn)物。在一個方面，本發(fā)明提供了由丙二酰輔酶A生產(chǎn)碳鏈長度為C6或C6以上的游離脂肪酸或脂肪酸衍生產(chǎn)物的方法，包括：將經(jīng)遺傳修飾生物體置于足以增加?；o酶A和丙二酰輔酶A產(chǎn)量的條件下培養(yǎng)，在經(jīng)遺傳修飾生物體中縮合?；o酶A和丙二酰輔酶A，產(chǎn)生碳鏈長度為C6或C6以上的酮脂酰輔酶A產(chǎn)物；還原酮脂酰輔酶A產(chǎn)物中的酮基，產(chǎn)生碳鏈長度為C6或C6以上的羥脂酰輔酶A產(chǎn)物；讓羥脂酰輔酶A產(chǎn)物與脫水酶反應(yīng)，產(chǎn)生碳鏈長度為C6或C6以上的烯脂酰輔酶A產(chǎn)物；還原烯脂酰輔酶A產(chǎn)物的烯?；鶊F(tuán)，產(chǎn)生碳鏈長度為C6或C6以上的?；o酶A產(chǎn)物；以及從?；o酶A產(chǎn)物移除輔酶A基團(tuán)，得到碳鏈長度為C6或C6以上的游離脂肪酸或脂肪酸衍生產(chǎn)物。在一些實(shí)施例中，經(jīng)遺傳修飾生物體產(chǎn)生的游離脂肪酸的至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％具有C6或C6以上的碳鏈長度。在一些實(shí)施例中，該方法包括培養(yǎng)經(jīng)遺傳修飾生物體，這種經(jīng)遺傳修飾生物體包含一種或多種異源3-酮脂酰輔酶A合酶，選自野生型NphT7、具有I147T突變的NphT7、具有I147T和F217V突變的NphT7，以及這些酶的任意組合；此外，還包含下列酶中的至少一種：異源fadB；異源ter；和/或一種或多種硫酯酶，選自yciA和PA2801TE。在一些實(shí)施例中，經(jīng)遺傳修飾生物體產(chǎn)生的游離脂肪酸的至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％具有C8或C8以上的碳鏈長度。在一些實(shí)施例中，該方法還包括培養(yǎng)經(jīng)遺傳修飾生物體，這種經(jīng)遺傳修飾生物體包含一種或多種異源3-酮脂酰輔酶A合酶，選自野生型NphT7、具有I147T突變的NphT7、具有I147T和F217V突變的NphT7、合酶III以及這些酶的任意組合；此外，還包含下列酶中的至少一種：一種或多種異源KCR，選自fadB和fabG；一種或多種異源3HDh，選自fadB、ech和ech2；異源ter；和/或一種或多種硫酯酶，選自tesA、yciA、PA2801TE和它們的任意組合。在一些實(shí)施例中，經(jīng)遺傳修飾生物體產(chǎn)生的游離脂肪酸的至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％具有C10或C10以上的碳鏈長度。在一些實(shí)施例中，該方法還包括培養(yǎng)經(jīng)遺傳修飾生物體，這種經(jīng)遺傳修飾生物體包含一種或多種異源3-酮脂酰輔酶A合酶，選自野生型NphT7、具有I147T突變的NphT7、具有I147T和F217V突變的NphT7、合酶III、合酶IV、合酶V以及這些酶的任意組合；此外，還包含下列酶中的至少一種：一種或多種異源KCR，選自fadB和fabG；一種或多種異源3HDh，選自fadB、ech和ech2；異源ter；和/或一種或多種硫酯酶，選自tesA、ATTE、YbgC和它們的任意組合。在一些實(shí)施例中，經(jīng)遺傳修飾生物體產(chǎn)生的游離脂肪酸的至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％具有C12的碳鏈長度。在一些實(shí)施例中，該方法還包括培養(yǎng)經(jīng)遺傳修飾生物體，這種經(jīng)遺傳修飾生物體包含一種或多種異源3-酮脂酰輔酶A合酶，選自野生型NphT7、具有I147T突變的NphT7、具有I147T和F217V突變的NphT7、合酶III、合酶IV、合酶V、合酶VI以及這些酶的任意組合；此外，還包含下列酶中的至少一種：一種或多種異源KCR，選自fadB、fabG、fadJ和它們的任意組合；一種或多種異源3HDh，選自fadB、fadJ、ech和它們的任意組合；異源ter；和/或一種或多種硫酯酶，選自tesA、ybgC、ybFF和它們的任意組合。在一些實(shí)施例中，經(jīng)遺傳修飾生物體產(chǎn)生的游離脂肪酸的至少50％、60％、70％、80％或90％具有C14或C16的碳鏈長度。在一些實(shí)施例中，該方法還包括培養(yǎng)經(jīng)遺傳修飾生物體，這種經(jīng)遺傳修飾生物體包含一種或多種異源3-酮脂酰輔酶A合酶，選自野生型NphT7、具有I147T突變的NphT7、具有I147T和F217V突變的NphT7、合酶III、合酶IV、合酶V、合酶VI以及這些酶的任意組合；此外，還包含下列酶中的至少一種：一種或多種異源KCR，選自fadB和fadJ；一種或多種異源3HDh，選自fadB和fadJ；一種或多種異源EnCR，選自ter、ydiO和fadE；和/或一種或多種硫酯酶，選自tesA、fadM和它們的任意組合。在一些實(shí)施例中，該方法還包括含有多個反應(yīng)的循環(huán)，其中該循環(huán)包括的反應(yīng)采用了NphT7、KCR、3HDh和EnCR，其中執(zhí)行了至少一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個或九個循環(huán)，并且NphT7、KCR、3HDh和/或EnCR中的至少一者經(jīng)修飾。在一個方面，本發(fā)明提供了經(jīng)遺傳修飾生物體產(chǎn)生的游離脂肪酸或脂肪酸衍生產(chǎn)物。在一個方面，本發(fā)明提供了利用本發(fā)明的方法產(chǎn)生的游離脂肪酸或脂肪酸衍生產(chǎn)物。在一些實(shí)施例中，脂肪酸衍生產(chǎn)物為脂肪醇、脂肪酰胺、脂肪酯、脂肪醛、脂肪烯烴、脂肪烷烴或脂肪二酸，這些產(chǎn)物中的每一種為取代或未取代的。在一個方面，本發(fā)明提供了經(jīng)遺傳修飾生物體用于產(chǎn)生碳鏈長度為C6或C6以上的脂肪酸的用途。在一個方面，本發(fā)明提供了用于生產(chǎn)碳鏈長度為C6或C6以上的游離脂肪酸或脂肪酸衍生產(chǎn)物的系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括：一種或多種經(jīng)遺傳修飾生物體和/或經(jīng)修飾多肽；以及培養(yǎng)箱，該培養(yǎng)箱被構(gòu)造成用于培養(yǎng)一種或多種經(jīng)遺傳修飾生物體。在一些實(shí)施例中，該系統(tǒng)包括培養(yǎng)基，培養(yǎng)基包含碳進(jìn)料源。在一些實(shí)施例中，該系統(tǒng)包括純化系統(tǒng)，用于純化游離脂肪酸或脂肪酸衍生產(chǎn)物。在一些實(shí)施例中，該系統(tǒng)包括經(jīng)遺傳修飾生物體的至少兩種菌株。在一些實(shí)施例中，該系統(tǒng)包括經(jīng)遺傳修飾生物體的至少三種菌株。在一些實(shí)施例中，該系統(tǒng)能夠以約5g/L、約10g/L或更大的滴度產(chǎn)生游離脂肪酸或脂肪酸衍生產(chǎn)物。在一些實(shí)施例中，該系統(tǒng)能夠以約0.5g/L或更大的濃度產(chǎn)生碳鏈長度為C6或C6以上的游離脂肪酸或脂肪酸衍生產(chǎn)物。在一些實(shí)施例中，該系統(tǒng)能夠以約0.7g/L或更大的濃度產(chǎn)生碳鏈長度為C12的游離脂肪酸或脂肪酸衍生產(chǎn)物。在一些實(shí)施例中，該系統(tǒng)能夠以約0.7g/L或更大的濃度產(chǎn)生碳鏈長度為C14的游離脂肪酸或脂肪酸衍生產(chǎn)物。在一些實(shí)施例中，該系統(tǒng)能夠以約0.8g/L或更大的濃度產(chǎn)生碳鏈長度為C16的游離脂肪酸或脂肪酸衍生產(chǎn)物。在一些實(shí)施例中，該系統(tǒng)能夠以約0.125g/g、約0.16g/g或更大的收率產(chǎn)生游離脂肪酸或脂肪酸衍生產(chǎn)物。在一些實(shí)施例中，該系統(tǒng)還包括混合裝置。在一些實(shí)施例中，該系統(tǒng)還包括加熱裝置，其中培養(yǎng)箱包括加熱裝置。在一些實(shí)施例中，該系統(tǒng)還包括貯存器。在一些實(shí)施例中，該系統(tǒng)還包括泵。在一些實(shí)施例中，該系統(tǒng)的貯存器可操作地連接到培養(yǎng)箱，并且其中泵被可操作地構(gòu)造成將材料從貯存器泵送至培養(yǎng)箱。在一些實(shí)施例中，該系統(tǒng)還包括裂解裝置。在一些實(shí)施例中，該系統(tǒng)還包括提取裝置。在一些實(shí)施例中，該系統(tǒng)還包括蒸餾裝置。在一個方面，本發(fā)明提供了經(jīng)遺傳修飾生物體，所述經(jīng)遺傳修飾生物體為梭菌屬(Clostridium)、發(fā)酵單胞菌屬(Zymomonas)、埃希桿菌屬(Escherichia)、沙門氏菌屬(Salmonella)、紅球菌屬(Rhodococcus)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、鏈霉菌屬(Streptomyces)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、腸球菌屬(Enterococcus)、產(chǎn)堿桿菌屬(Alcaligenes)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella)、類芽孢桿菌屬(Paenibacillus)、節(jié)桿菌屬(Arthrobacter)、棒狀桿菌屬(Corynebacterium)、短桿菌屬(Brevibacterium)、畢赤酵母屬(Pichia)、念珠菌屬(Candida)、漢遜酵母屬(Hansenula)、破囊壺菌(Thraustochytrids)、噬菌體或酵母屬(Saccharomyces)。在一些實(shí)施例中，經(jīng)遺傳修飾生物體為原核細(xì)胞。在一些實(shí)施例中，經(jīng)遺傳修飾生物體為真核細(xì)胞。在一些實(shí)施例中，經(jīng)遺傳修飾生物體為酵母細(xì)胞。在一些實(shí)施例中，經(jīng)遺傳修飾生物體為細(xì)菌細(xì)胞。在一些實(shí)施例中，經(jīng)遺傳修飾生物體為真菌細(xì)胞。在一些實(shí)施例中，經(jīng)遺傳修飾生物體為微藻類細(xì)胞。在一些實(shí)施例中，經(jīng)遺傳修飾生物體為藻類細(xì)胞。在一個方面，本發(fā)明提供的碳源包括C6碳源。在一些實(shí)施例中，碳源包括C3碳源。在一些實(shí)施例中，碳源包括一種或多種纖維素糖。在一些實(shí)施例中，碳源包括葡萄糖、蔗糖、果糖、右旋葡萄糖、乳糖、木糖，或這些物質(zhì)的任意組合。在一些實(shí)施例中，碳源包含按質(zhì)量計(jì)小于約50％、40％、30％、20％、10％或5％甘油。在一個方面，本發(fā)明提供了包含經(jīng)遺傳修飾生物體的生物質(zhì)。在一些實(shí)施例中，生物質(zhì)包含裂解的經(jīng)遺傳修飾生物體。在一些實(shí)施例中，生物質(zhì)包含經(jīng)修飾NphT7多肽。在一些實(shí)施例中，生物質(zhì)包含經(jīng)修飾多肽。在一些實(shí)施例中，生物質(zhì)包含多核苷酸。在一些實(shí)施例中，生物質(zhì)包含游離脂肪酸或脂肪酸衍生產(chǎn)物。在一些實(shí)施例中，生物質(zhì)為脫水的。在一個方面，本發(fā)明提供了包含經(jīng)遺傳修飾生物體的發(fā)酵液。在一個方面，本發(fā)明提供了包含裂解的經(jīng)遺傳修飾生物體的發(fā)酵液。在一個方面，本發(fā)明提供了包含經(jīng)修飾NphT7多肽的發(fā)酵液。在一個方面，本發(fā)明提供了包含經(jīng)修飾多肽的發(fā)酵液。在一個方面，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明的多核苷酸的發(fā)酵液。在一個方面，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明的游離脂肪酸或脂肪酸衍生產(chǎn)物的發(fā)酵液。在一個方面，本發(fā)明提供了?；o酶A產(chǎn)物，該?；o酶A產(chǎn)物包含按質(zhì)量計(jì)約15％至50％的碳鏈長度為C4的酰基輔酶A。在一個方面，本發(fā)明提供了酰基輔酶A產(chǎn)物，該?；o酶A產(chǎn)物包含按質(zhì)量計(jì)約40％至50％的碳鏈長度為C6的酰基輔酶A。在一個方面，本發(fā)明提供了酰基輔酶A產(chǎn)物，該酰基輔酶A產(chǎn)物包含按質(zhì)量計(jì)約5％至30％的碳鏈長度為C8的?；o酶A。在一個方面，本發(fā)明提供了?；o酶A產(chǎn)物，該?；o酶A產(chǎn)物包含按質(zhì)量計(jì)約1％至20％的碳鏈長度為C12的?；o酶A。在一個方面，本發(fā)明提供了?；o酶A產(chǎn)物，其中碳鏈長度為C4的?；o酶A、碳鏈長度為C6的?；o酶A、碳鏈長度為C8的?；o酶A與碳鏈長度為C12的?；o酶A的質(zhì)量比為約2:4:2:1。在一個方面，本發(fā)明提供了?；o酶A產(chǎn)物，其中碳鏈長度為C4的?；o酶A、碳鏈長度為C6的酰基輔酶A與碳鏈長度為C8的?；o酶A的質(zhì)量比為約7:8:1。在一個方面，本發(fā)明提供了?；o酶A產(chǎn)物，其中碳鏈長度為C4的酰基輔酶A、碳鏈長度為C6的酰基輔酶A、碳鏈長度為C8的酰基輔酶A與碳鏈長度為C12的?；o酶A的質(zhì)量比為約2:1:1:1。在一個方面，本發(fā)明提供了?；o酶A產(chǎn)物，其中碳鏈長度為C4的?；o酶A、碳鏈長度為C6的?；o酶A、碳鏈長度為C8的?；o酶A與碳鏈長度為C12的?；o酶A的質(zhì)量比為約8:2:3:1。在一些實(shí)施例中，?；o酶A產(chǎn)物選自3-酮脂酰輔酶A、3-羥酰輔酶A和烯酰輔酶A。在一個方面，本發(fā)明提供了游離脂肪酸或脂肪酸衍生產(chǎn)物，其包含按質(zhì)量計(jì)約15％至50％的碳鏈長度為C4的游離脂肪酸或脂肪酸衍生物。在一個方面，本發(fā)明提供了游離脂肪酸或脂肪酸衍生產(chǎn)物，其包含按質(zhì)量計(jì)約40％至50％的碳鏈長度為C6的游離脂肪酸或脂肪酸衍生物。在一個方面，本發(fā)明提供了游離脂肪酸或脂肪酸衍生產(chǎn)物，其包含按質(zhì)量計(jì)約5％至30％的碳鏈長度為C8的游離脂肪酸或脂肪酸衍生物。在一個方面，本發(fā)明提供了游離脂肪酸或脂肪酸衍生產(chǎn)物，其包含按質(zhì)量計(jì)約1％至20％的碳鏈長度為C12的游離脂肪酸或脂肪酸衍生物。在一個方面，本發(fā)明提供了游離脂肪酸或脂肪酸衍生產(chǎn)物，其中碳鏈長度為C4的游離脂肪酸或脂肪酸衍生物、碳鏈長度為C6的游離脂肪酸或脂肪酸衍生物、碳鏈長度為C8的游離脂肪酸或脂肪酸衍生物與碳鏈長度為C12的酰基輔酶A的質(zhì)量比為約2:4:2:1。在一個方面，本發(fā)明提供了游離脂肪酸或脂肪酸衍生產(chǎn)物，其中碳鏈長度為C4的游離脂肪酸或脂肪酸衍生物、碳鏈長度為C6的游離脂肪酸或脂肪酸衍生物與碳鏈長度為C8的游離脂肪酸或脂肪酸衍生物的質(zhì)量比為約7:8:1。在一個方面，本發(fā)明提供了游離脂肪酸或脂肪酸衍生產(chǎn)物，其中碳鏈長度為C4的游離脂肪酸或脂肪酸衍生物、碳鏈長度為C6的游離脂肪酸或脂肪酸衍生物、碳鏈長度為C8的游離脂肪酸或脂肪酸衍生物與碳鏈長度為C12的游離脂肪酸或脂肪酸衍生物的質(zhì)量比為約2:1:1:1。在一個方面，本發(fā)明提供了游離脂肪酸或脂肪酸衍生產(chǎn)物，其中碳鏈長度為C4的游離脂肪酸或脂肪酸衍生物、碳鏈長度為C6的游離脂肪酸或脂肪酸衍生物、碳鏈長度為C8的游離脂肪酸或脂肪酸衍生物與碳鏈長度為C12的游離脂肪酸或脂肪酸衍生物的質(zhì)量比為約8:2:3:1。在一個方面，本發(fā)明提供了游離脂肪酸或脂肪酸衍生產(chǎn)物，其包含按質(zhì)量計(jì)約16％或16％以上的碳鏈長度為C14的游離脂肪酸或脂肪酸衍生物。在一個方面，本發(fā)明提供了游離脂肪酸或脂肪酸衍生產(chǎn)物，其包含按質(zhì)量計(jì)約20％或20％以上的碳鏈長度為C16的游離脂肪酸或脂肪酸衍生物。在一個方面，本發(fā)明提供了游離脂肪酸或脂肪酸衍生產(chǎn)物，其包含按質(zhì)量計(jì)約36％或36％以上的碳鏈長度為C14或C16的游離脂肪酸或脂肪酸衍生物。在一個方面，本發(fā)明提供了游離脂肪酸或脂肪酸衍生產(chǎn)物，其包含按質(zhì)量計(jì)約60％或60％以上的碳鏈長度為C14或C16的游離脂肪酸或脂肪酸衍生物。在一個方面，本發(fā)明提供了游離脂肪酸或脂肪酸衍生產(chǎn)物，其中碳鏈長度為C4的游離脂肪酸或脂肪酸衍生物、碳鏈長度為C6的游離脂肪酸或脂肪酸衍生物、碳鏈長度為C8的游離脂肪酸或脂肪酸衍生物、碳鏈長度為C10的游離脂肪酸或脂肪酸衍生物、碳鏈長度為C12的游離脂肪酸或脂肪酸衍生物、碳鏈長度為C14的游離脂肪酸或脂肪酸衍生物、碳鏈長度為C16的游離脂肪酸或脂肪酸衍生物與碳鏈長度為C18的游離脂肪酸或脂肪酸衍生物的質(zhì)量比為約10:20:12:7:8:16:20:7，或?yàn)榧s1:2:1:1:1:2:2:1。在一個方面，本發(fā)明提供了酰基輔酶A產(chǎn)物、游離脂肪酸產(chǎn)物或脂肪酸衍生產(chǎn)物，這些產(chǎn)物都是分離并純化過的。在一個方面，本發(fā)明提供了生產(chǎn)選自下列的一種或多種脂肪酸衍生產(chǎn)物的方法：脂肪酯、脂肪酰胺、脂肪醇、脂肪醛、脂肪烯烴、脂肪烷烴、脂肪二酸和它們的任意組合；該方法包括：讓碳源與微生物接觸，形成碳鏈長度為C6或C6以上的游離脂肪酸；將這種游離脂肪酸轉(zhuǎn)化成脂肪酸衍生產(chǎn)物，其中脂肪酸衍生產(chǎn)物具有C6或C6以上的碳鏈長度。在一個方面，本發(fā)明提供了生產(chǎn)脂肪酸酯的方法，該方法包括將經(jīng)遺傳修飾生物體產(chǎn)生的脂肪酸酯化。在一個方面，本發(fā)明提供了生產(chǎn)脂肪酸酰胺的方法，該方法包括形成本發(fā)明的經(jīng)遺傳修飾生物體所產(chǎn)生脂肪酸的酰胺。在一個方面，本發(fā)明提供了生產(chǎn)脂肪醇的方法，該方法包括由本發(fā)明的經(jīng)遺傳修飾生物體所產(chǎn)生的脂肪酸形成脂肪醇。在一個方面，本發(fā)明提供了生產(chǎn)脂肪酸醛的方法，該方法包括形成本發(fā)明的經(jīng)遺傳修飾生物體所產(chǎn)生脂肪酸的醛。在一個方面，本發(fā)明提供了燃料，該燃料包含本發(fā)明的?；o酶A產(chǎn)物、游離脂肪酸產(chǎn)物或脂肪酸衍生產(chǎn)物。在一個方面，本發(fā)明提供了洗劑，該洗劑包含本發(fā)明的?；o酶A產(chǎn)物、游離脂肪酸產(chǎn)物或脂肪酸衍生產(chǎn)物。在一個方面，本發(fā)明提供了肥皂，該肥皂包含本發(fā)明的酰基輔酶A產(chǎn)物、游離脂肪酸產(chǎn)物或脂肪酸衍生產(chǎn)物。在一個方面，本發(fā)明提供了食品，該食品包含本發(fā)明的?；o酶A產(chǎn)物、游離脂肪酸產(chǎn)物或脂肪酸衍生產(chǎn)物。在一個方面，本發(fā)明提供了霜膏，該霜膏包含本發(fā)明的?；o酶A產(chǎn)物、游離脂肪酸產(chǎn)物或脂肪酸衍生產(chǎn)物。在一個方面，本發(fā)明提供了洗發(fā)劑，該洗發(fā)劑包含本發(fā)明的?；o酶A產(chǎn)物、游離脂肪酸產(chǎn)物或脂肪酸衍生產(chǎn)物。在一個方面，本發(fā)明提供了調(diào)理劑，該調(diào)理劑包含本發(fā)明的?；o酶A產(chǎn)物、游離脂肪酸產(chǎn)物或脂肪酸衍生產(chǎn)物。在一個方面，本發(fā)明提供了清潔劑，該清潔劑包含本發(fā)明的酰基輔酶A產(chǎn)物、游離脂肪酸產(chǎn)物或脂肪酸衍生產(chǎn)物。在一個方面，本發(fā)明提供了洗滌劑，該洗滌劑包含本發(fā)明的?；o酶A產(chǎn)物、游離脂肪酸產(chǎn)物或脂肪酸衍生產(chǎn)物。在一個方面，本發(fā)明提供了潤滑劑，該潤滑劑包含本發(fā)明的酰基輔酶A產(chǎn)物、游離脂肪酸產(chǎn)物或脂肪酸衍生產(chǎn)物。在一個方面，本發(fā)明提供了油漆，該油漆包含本發(fā)明的?；o酶A產(chǎn)物、游離脂肪酸產(chǎn)物或脂肪酸衍生產(chǎn)物。在一個方面，本發(fā)明提供了染色劑，該染色劑包含本發(fā)明的酰基輔酶A產(chǎn)物、游離脂肪酸產(chǎn)物或脂肪酸衍生產(chǎn)物。在一個方面，本發(fā)明提供了油墨，該油墨包含本發(fā)明的?；o酶A產(chǎn)物、游離脂肪酸產(chǎn)物或脂肪酸衍生產(chǎn)物。在一個方面，本發(fā)明提供了藥物制劑，該藥物制劑包含本發(fā)明的?；o酶A產(chǎn)物、游離脂肪酸產(chǎn)物或脂肪酸衍生產(chǎn)物。在一些實(shí)施例中，產(chǎn)物還包含一種或多種活性劑。在一些實(shí)施例中，產(chǎn)物還包含賦形劑。在一個方面，本發(fā)明提供了一種或多種分離并純化過的包含外源核酸分子的多核苷酸，所述外源核酸分子編碼下列蛋白質(zhì)：乙酰乙酰輔酶A合酶、酮基輔酶A還原酶、3-羥酰輔酶A脫水酶、烯酰輔酶A還原酶和硫酯酶；其中3-酮脂酰輔酶A合酶選自NphT7、NphT7I147T、NphT7F217V、NphT7I147T與F217V、Npth7I147S、Npth7I147S與F217V、合酶III、合酶IV、合酶V和合酶VI；酮基輔酶A還原酶選自hbd、fadB、fabG和fadJ；3-羥酰輔酶A脫水酶選自crt、ech、fadB和fadJ；烯酰輔酶A還原酶選自ter、ydiO和fadE；并且硫酯酶選自AtTE、CpTE(或CperfTE)、fadM、LpTE、PA2801TE、tesA、tesB、ybfF、ybgC和yciA。在一些實(shí)施例中，3-酮脂酰輔酶A合酶為NphT7；酮基輔酶A還原酶選自hbd和fadB；3-羥酰輔酶A脫水酶選自crt和fadB；烯酰輔酶A還原酶為ter；并且硫酯酶為yciA；并且其中由所述多核苷酸編碼的蛋白質(zhì)能夠產(chǎn)生四碳脂肪酸或脂肪酸衍生產(chǎn)物。在一些實(shí)施例中，硫酯酶選自tesB和yciA。在一些實(shí)施例中，3-酮脂酰輔酶A合酶為NphT7，并且其中由所述多核苷酸編碼的蛋白質(zhì)能夠產(chǎn)生四碳脂肪酸或脂肪酸衍生產(chǎn)物。在一些實(shí)施例中，酮基輔酶A還原酶選自hbd和fadB，并且其中由所述多核苷酸編碼的蛋白質(zhì)能夠產(chǎn)生四碳脂肪酸或脂肪酸衍生產(chǎn)物。在一些實(shí)施例中，3-羥酰輔酶A脫水酶選自crt和fadB，并且其中由所述多核苷酸編碼的蛋白質(zhì)能夠產(chǎn)生四碳脂肪酸或脂肪酸衍生產(chǎn)物。在一些實(shí)施例中，烯酰輔酶A還原酶為ter，并且其中由所述多核苷酸編碼的蛋白質(zhì)能夠產(chǎn)生四碳脂肪酸或脂肪酸衍生產(chǎn)物。在一些實(shí)施例中，硫酯酶選自CpTE、fadM、PA2801TE、tesB、ybgC、ybfF和yciA，并且其中由所述多核苷酸編碼的蛋白質(zhì)能夠產(chǎn)生四碳脂肪酸或脂肪酸衍生產(chǎn)物。在一些實(shí)施例中，硫酯酶選自tesB和yciA，并且其中由所述多核苷酸編碼的蛋白質(zhì)能夠產(chǎn)生四碳脂肪酸或脂肪酸衍生產(chǎn)物。在一些實(shí)施例中，一種或多種3-酮脂酰輔酶A合酶選自NphT7、NphT7I147T、NphT7F217V以及NphT7I147TF217V；酮基輔酶A還原酶為fadB；3-羥酰輔酶A脫水酶為fadB；烯酰輔酶A還原酶為ter；并且硫酯酶選自AtTE、CpTE(或CperfTE)、PA2801TE、tesA、tesB、ybfF、ybgC和yciA，并且其中由所述多核苷酸編碼的蛋白質(zhì)能夠產(chǎn)生六碳脂肪酸或脂肪酸衍生產(chǎn)物。在一些實(shí)施例中，硫酯酶選自PA2801TE、tesB和yciA。在一些實(shí)施例中，一種或多種3-酮脂酰輔酶A合酶選自NphT7、NphT7I147T、NphT7F217V以及NphT7I147T與F217V，并且其中由所述多核苷酸編碼的蛋白質(zhì)能夠產(chǎn)生六碳脂肪酸或脂肪酸衍生產(chǎn)物。在一些實(shí)施例中，酮基輔酶A還原酶為fadB，并且其中由所述多核苷酸編碼的蛋白質(zhì)能夠產(chǎn)生六碳脂肪酸或脂肪酸衍生產(chǎn)物。在一些實(shí)施例中，3-羥酰輔酶A脫水酶為fadB，并且其中由所述多核苷酸編碼的蛋白質(zhì)能夠產(chǎn)生六碳脂肪酸或脂肪酸衍生產(chǎn)物。在一些實(shí)施例中，烯酰輔酶A還原酶為ter，并且其中由所述多核苷酸編碼的蛋白質(zhì)能夠產(chǎn)生六碳脂肪酸或脂肪酸衍生產(chǎn)物。在一些實(shí)施例中，硫酯酶選自AtTE、CpTE(或CperfTE)、PA2801TE、tesA、tesB、ybfF、ybgC和yciA，并且其中由所述多核苷酸編碼的蛋白質(zhì)能夠產(chǎn)生六碳脂肪酸或脂肪酸衍生產(chǎn)物。在一些實(shí)施例中，硫酯酶選自PA2801TE、tesB和yciA，并且其中由所述多核苷酸編碼的蛋白質(zhì)能夠產(chǎn)生六碳脂肪酸或脂肪酸衍生產(chǎn)物。在一些實(shí)施例中，一種或多種3-酮脂酰輔酶A合酶選自NphT7、NphT7I147T、NphT7F217V、NphT7I147T與F217V、Npth7I147S、Npth7I147S與F217V以及合酶III；并且酮基輔酶A還原酶選自fadB和fabG；3-羥酰輔酶A脫水酶選自fadB、ech和ech2；烯酰輔酶A還原酶為ter；并且硫酯酶選自AtTE、CpTE(或CperfTE)、fadM、PA2801TE、tesA、tesB、ybfF、ybgC和yciA；并且其中由所述多核苷酸編碼的蛋白質(zhì)能夠產(chǎn)生八碳脂肪酸或脂肪酸衍生產(chǎn)物。在一些實(shí)施例中，硫酯酶選自PA2801TE、tesB和yciA。在一些實(shí)施例中，一種或多種3-酮脂酰輔酶A合酶選自NphT7、NphT7I147T、NphT7F217V、NphT7I147T與F217V、Npth7I147S、Npth7I147S與F217V以及合酶III，并且由其中所述多核苷酸編碼的蛋白質(zhì)能夠產(chǎn)生八碳脂肪酸或脂肪酸衍生產(chǎn)物。在一些實(shí)施例中，酮基輔酶A還原酶選自fadB和fabG，并且其中由所述多核苷酸編碼的蛋白質(zhì)能夠產(chǎn)生八碳脂肪酸或脂肪酸衍生產(chǎn)物。在一些實(shí)施例中，3-羥酰輔酶A脫水酶選自fadB、ech和ech2，并且其中由所述多核苷酸編碼的蛋白質(zhì)能夠產(chǎn)生八碳脂肪酸或脂肪酸衍生產(chǎn)物。在一些實(shí)施例中，烯酰輔酶A還原酶為ter，并且其中由所述多核苷酸編碼的蛋白質(zhì)能夠產(chǎn)生八碳脂肪酸或脂肪酸衍生產(chǎn)物。在一些實(shí)施例中，硫酯酶選自AtTE、CpTE(或CperfTE)、fadM、PA2801TE、tesA、tesB、ybfF、ybgC和yciA，并且其中由所述多核苷酸編碼的蛋白質(zhì)能夠產(chǎn)生八碳脂肪酸或脂肪酸衍生產(chǎn)物。在一些實(shí)施例中，硫酯酶選自PA2801TE、tesB和yciA，并且其中由所述多核苷酸編碼的蛋白質(zhì)能夠產(chǎn)生八碳脂肪酸或脂肪酸衍生產(chǎn)物。在一些實(shí)施例中，一種或多種3-酮脂酰輔酶A合酶選自NphT7、NphT7I147T、NphT7F217V、NphT7I147T與F217V、Npth7I147S、Npth7I147S與F217V、合酶III、合酶IV以及合酶V；酮基輔酶A還原酶選自fadB和fabG；3-羥酰輔酶A脫水酶選自fadB、ech和ech2；烯酰輔酶A還原酶為ter；并且硫酯酶選自AtTE、CpTE、fadM、PA2801TE、tesA、tesB、ybfF、ybgC和yciA；并且其中由所述多核苷酸編碼的蛋白質(zhì)能夠產(chǎn)生十碳脂肪酸或脂肪酸衍生產(chǎn)物。在一些實(shí)施例中，硫酯酶選自tesB和yciA。在一些實(shí)施例中，一種或多種3-酮脂酰輔酶A合酶選自NphT7、NphT7I147T、NphT7F217V、NphT7I147T與F217V、Npth7I147S、Npth7I147S與F217V、合酶III、合酶IV以及合酶V；并且其中由所述多核苷酸編碼的蛋白質(zhì)能夠產(chǎn)生十碳脂肪酸或脂肪酸衍生產(chǎn)物。在一些實(shí)施例中，酮基輔酶A還原酶選自fadB和fabG，并且其中由所述多核苷酸編碼的蛋白質(zhì)能夠產(chǎn)生十碳脂肪酸或脂肪酸衍生產(chǎn)物。在一些實(shí)施例中，3-羥酰輔酶A脫水酶選自fadB、ech和ech2，并且其中由所述多核苷酸編碼的蛋白質(zhì)能夠產(chǎn)生十碳脂肪酸或脂肪酸衍生產(chǎn)物。在一些實(shí)施例中，烯酰輔酶A還原酶為ter，并且其中由所述多核苷酸編碼的蛋白質(zhì)能夠產(chǎn)生十碳脂肪酸或脂肪酸衍生產(chǎn)物。在一些實(shí)施例中，硫酯酶選自AtTE、CpTE、fadM、PA2801TE、tesA、tesB、ybfF、ybgC和yciA，并且其中由所述多核苷酸編碼的蛋白質(zhì)能夠產(chǎn)生十碳脂肪酸或脂肪酸衍生產(chǎn)物。在一些實(shí)施例中，硫酯酶選自tesB和yciA，并且其中由所述多核苷酸編碼的蛋白質(zhì)能夠產(chǎn)生十碳脂肪酸或脂肪酸衍生產(chǎn)物。在一些實(shí)施例中，一種或多種3-酮脂酰輔酶A合酶選自NphT7、NphT7I147T、NphT7F217V、NphT7I147T與F217V、Npth7I147S、Npth7I147S與F217V、合酶III、合酶IV、合酶V以及合酶VI；酮基輔酶A還原酶選自fadB、fabG和fadJ；3-羥酰輔酶A脫水酶選自fadB、ech和fadJ；烯酰輔酶A還原酶為ter；并且硫酯酶選自AtTE、CpTE(或CperfTE)、fadM、LpTE、PA2801TE、tesA、tesB、ybfF、ybgC和yciA；并且其中由所述多核苷酸編碼的蛋白質(zhì)能夠產(chǎn)生十二碳脂肪酸或脂肪酸衍生產(chǎn)物。在一些實(shí)施例中，硫酯酶選自fadM、PA2801TE、tesA、tesB和yciA。在一些實(shí)施例中，一種或多種3-酮脂酰輔酶A合酶選自NphT7、NphT7I147T、NphT7F217V、NphT7I147T與F217V、Npth7I147S、Npth7I147S與F217V、合酶III、合酶IV、合酶V以及合酶VI；并且其中由所述多核苷酸編碼的蛋白質(zhì)能夠產(chǎn)生十二碳脂肪酸或脂肪酸衍生產(chǎn)物。在一些實(shí)施例中，酮基輔酶A還原酶選自fadB、fabG和fadJ，并且其中由所述多核苷酸編碼的蛋白質(zhì)能夠產(chǎn)生十二碳脂肪酸或脂肪酸衍生產(chǎn)物。在一些實(shí)施例中，3-羥酰輔酶A脫水酶選自fadB、ech和fadJ，并且其中由所述多核苷酸編碼的蛋白質(zhì)能夠產(chǎn)生十二碳脂肪酸或脂肪酸衍生產(chǎn)物。在一些實(shí)施例中，烯酰輔酶A還原酶為ter，并且其中由所述多核苷酸編碼的蛋白質(zhì)能夠產(chǎn)生十二碳脂肪酸或脂肪酸衍生產(chǎn)物。在一些實(shí)施例中，硫酯酶選自AtTE、CpTE(或CperfTE)、fadM、LpTE、PA2801TE、tesA、tesB、ybfF、ybgC和yciA，并且其中由所述多核苷酸編碼的蛋白質(zhì)能夠產(chǎn)生十二碳脂肪酸或脂肪酸衍生產(chǎn)物。在一些實(shí)施例中，硫酯酶選自fadM、PA2801TE、tesA、tesB和yciA，并且其中由所述多核苷酸編碼的蛋白質(zhì)能夠產(chǎn)生十二碳脂肪酸或脂肪酸衍生產(chǎn)物。在一些實(shí)施例中，一種或多種3-酮脂酰輔酶A合酶選自NphT7、NphT7I147T、NphT7F217V、NphT7I147T與F217V、Npth7I147S、Npth7I147S與F217V、合酶III、合酶IV、合酶V以及合酶VI；酮基輔酶A還原酶選自fadB和fadJ；3-羥酰輔酶A脫水酶選自fadB和fadJ；烯酰輔酶A還原酶選自ter、ydiO和fadE；并且硫酯酶選自AtTE、CpTE(或CperfTE)、fadM、LpTE、PA2801TE、tesA、tesB、ybfF、ybgC和yciA；并且其中由所述多核苷酸編碼的蛋白質(zhì)能夠產(chǎn)生碳鏈長度為至少十四個碳的脂肪酸。在一些實(shí)施例中，硫酯酶選自fadM、tesA、tesB和yciA，并且由所述多核苷酸編碼的蛋白質(zhì)能夠產(chǎn)生十四碳脂肪酸或脂肪酸衍生產(chǎn)物。在一些實(shí)施例中，硫酯酶選自AtTE、CpTE(或CperfTE)、fadM、Pa2801TE、tesA、tesB、ybfF、ybgC和yciA，并且由所述多核苷酸編碼的蛋白質(zhì)能夠產(chǎn)生十六碳脂肪酸或脂肪酸衍生產(chǎn)物。在一些實(shí)施例中，硫酯酶選自AtTE、fadM、tesA、tesB、ybfF、ybgC和yciA，并且由所述多核苷酸編碼的蛋白質(zhì)能夠產(chǎn)生十六碳脂肪酸或脂肪酸衍生產(chǎn)物。在一些實(shí)施例中，一種或多種3-酮脂酰輔酶A合酶選自NphT7、NphT7I147T、NphT7F217V、NphT7I147T與F217V、Npth7I147S、Npth7I147S與F217V、合酶III、合酶IV、合酶V以及合酶VI；并且其中由所述多核苷酸編碼的蛋白質(zhì)能夠產(chǎn)生碳鏈長度大于或等于十四個碳的脂肪酸。在一些實(shí)施例中，酮基輔酶A還原酶選自fadB和fadJ，并且其中由所述多核苷酸編碼的蛋白質(zhì)能夠產(chǎn)生碳鏈長度大于或等于十四個碳的脂肪酸。在一些實(shí)施例中，3-羥酰輔酶A脫水酶選自fadB和fadJ，并且其中由所述多核苷酸編碼的蛋白質(zhì)能夠產(chǎn)生碳鏈長度大于或等于十四個碳的脂肪酸。在一些實(shí)施例中，烯酰輔酶A還原酶選自ter、ydiO和fadE，并且其中由所述多核苷酸編碼的蛋白質(zhì)能夠產(chǎn)生碳鏈長度大于或等于十四個碳的脂肪酸。在一些實(shí)施例中，硫酯酶選自AtTE、CpTE(或CperfTE)、fadM、LpTE、PA2801TE、tesA、tesB、ybfF、ybgC和yciA，并且其中由所述多核苷酸編碼的蛋白質(zhì)能夠產(chǎn)生碳鏈長度大于或等于十四個碳的脂肪酸。在一個方面，本發(fā)明提供了一種或多種分離并純化過的包含外源核酸分子的多核苷酸，所述外源核酸分子編碼多種蛋白質(zhì)，包括來自選自下列的物種的3-氧?；?(?；d體蛋白)合酶III：潮汐別樣希瓦氏菌(Alishewanellaaestuarii)B11、布氏弓形桿菌(Arcobacterbutzleri)ED-1、梭菌目(Clostridiales)細(xì)菌1_7_47_FAA、木葡糖酸醋桿菌(Gluconacetobacteroboediens)174Bp2、愛知戈登氏菌(Gordoniaaichiensis)NBRC108223、中慢生根瘤菌屬(Mesorhizobium)物種STM4661、PelosinusfermentansDSM17108、加利西亞褐色桿菌(Phaeobactergallaeciensis)2.10、青枯勞爾氏菌(Ralstoniasolanacearum)Po82、運(yùn)青糖單孢菌(Saccharomonosporaazurea)NA-128、青色糖單孢菌(Saccharomonosporaglauca)K62以及海洋疣孢菌(Verrucosisporamaris)AB-18-032，其中由所述多核苷酸編碼的蛋白質(zhì)能夠產(chǎn)生脂肪酸。在一些實(shí)施例中，3-氧?；?(?；d體蛋白)合酶III來自選自下列的物種：PelosinusfermentansDSM17108、青色糖單孢菌K62、海洋疣孢菌AB-18-032以及梭菌目細(xì)菌1_7_47_FAA，并且其中由所述多核苷酸編碼的蛋白質(zhì)能夠產(chǎn)生乙酰輔酶A。在一些實(shí)施例中，3-氧酰基-(?；d體蛋白)合酶III來自選自下列的物種：青色糖單孢菌K62、運(yùn)青糖單孢菌NA-128、中慢生根瘤菌屬物種STM4661以及梭菌目細(xì)菌1_7_47_FAA，并且其中由所述多核苷酸編碼的蛋白質(zhì)能夠產(chǎn)生四碳脂肪酸或脂肪酸衍生產(chǎn)物。在一些實(shí)施例中，3-氧?；?(?；d體蛋白)合酶III來自選自下列的物種：愛知戈登氏菌NBRC108223、布氏弓形桿菌ED-1、梭菌目細(xì)菌1_7_47_FAA、青色糖單孢菌K62以及青枯勞爾氏菌Po82，并且其中由所述多核苷酸編碼的蛋白質(zhì)能夠產(chǎn)生六碳脂肪酸或脂肪酸衍生產(chǎn)物。在一些實(shí)施例中，3-氧?；?(酰基載體蛋白)合酶III來自選自下列的物種：愛知戈登氏菌NBRC108223、木葡糖酸醋桿菌174Bp2、布氏弓形桿菌ED-1、青枯勞爾氏菌Po82以及加利西亞褐色桿菌2.10，并且其中由所述多核苷酸編碼的蛋白質(zhì)能夠產(chǎn)生八碳脂肪酸或脂肪酸衍生產(chǎn)物。在一些實(shí)施例中，3-氧酰基-(?；d體蛋白)合酶III來自潮汐別樣希瓦氏菌B11，并且其中由所述多核苷酸編碼的蛋白質(zhì)能夠產(chǎn)生十碳脂肪酸或脂肪酸衍生產(chǎn)物。在一些實(shí)施例中，由所述多核苷酸編碼的蛋白質(zhì)還包括來自鏈霉菌屬(菌株CL190)的3-酮脂酰輔酶A合酶。以引用方式并入此案本文的所有出版物、專利和專利申請按等同程度以引用方式并入本文，如同明確指明每篇出版物、專利或?qū)＠暾埗吉?dú)立地以引用方式并入。如果本文的術(shù)語和并入供參考的文獻(xiàn)的術(shù)語有沖突，以本文的術(shù)語為準(zhǔn)。附圖說明圖1是圖表，示出了用于生產(chǎn)脂肪酸和脂肪酸衍生物的油脂化學(xué)品原料中的碳鏈長度分布。圖2是示意圖，示出了本發(fā)明的多種完整生物生產(chǎn)途徑，并提供了多種碳源向C10脂肪酸或C10脂肪酯轉(zhuǎn)化的代表性例子。圖3是示意圖，示出了將乙酰輔酶A用作引物并將丙二酰輔酶A(MCA)用作延伸分子，來生產(chǎn)鏈長為偶數(shù)的脂肪酸的流程。圖4是示意圖，示出了將乙酰輔酶A用作引物并將丙二酰輔酶A(MCA)用作延伸分子，來生產(chǎn)鏈長為偶數(shù)的脂肪酸酯的流程。圖5是示意圖，示出了將丙酰輔酶A用作引物并將丙二酰輔酶A(MCA)用作延伸分子，來生產(chǎn)鏈長為奇數(shù)的脂肪酸的流程。圖6是示意圖，示出了將丙酰輔酶A用作引物并將丙二酰輔酶A(MCA)用作延伸分子，來生產(chǎn)鏈長為奇數(shù)的脂肪酸酯的流程。圖7至圖14為根據(jù)本發(fā)明的一系列不同反應(yīng)途徑。圖15為條形圖，示出了用NphT7變體和NphT7突變體產(chǎn)生的?；o酶A產(chǎn)物的濃度，其中NphT7變體和NphT7突變體(100μg，30min測定法)在存在羥酰輔酶A還原酶PaFabG時，作用于丙二酰輔酶A和C4-、C6-或C10-輔酶A，產(chǎn)生對應(yīng)的C6-、C8-和C12-羥酰輔酶A。圖16為條形圖，示出了硫酯酶對不同碳鏈長度的?；o酶A底物的活性。圖17為條形圖，示出了不同細(xì)菌菌株產(chǎn)生C8-C18游離脂肪酸的速率。圖18為條形圖，示出了不同細(xì)菌菌株產(chǎn)生C6-C18游離脂肪酸的滴度。圖19為餅形圖，示出了菌株樣品3產(chǎn)生的游離脂肪酸的鏈長度特異性分布。圖20為條形圖，示出了不同3HDh的鏈長度特異性偏好。圖21為坐標(biāo)圖，示出了根據(jù)本發(fā)明、利用多種微生物產(chǎn)生的脂肪酸碳鏈長度分布。圖22包括一系列餅形圖，示出了根據(jù)本發(fā)明、利用多種微生物產(chǎn)生的脂肪酸碳鏈長度分布。圖23為條形圖，示出了根據(jù)本發(fā)明、利用多種經(jīng)遺傳修飾微生物產(chǎn)生的C4、C6和C8游離脂肪酸的量。圖24為條形圖，示出了根據(jù)本發(fā)明、利用多種經(jīng)遺傳修飾微生物產(chǎn)生的總脂肪酸(C4-C18)的量。圖25包括一系列餅形圖，示出了根據(jù)本發(fā)明、利用多種經(jīng)遺傳修飾微生物產(chǎn)生的游離脂肪酸的分布。圖26示出了包括四個步驟的脂肪酸途徑，其利用的途徑與細(xì)菌利用的II型脂肪酸合成(FAS)系統(tǒng)類似。圖26示出了這兩種脂肪酸合成途徑。A.在步驟1中，3-酮脂酰輔酶A合酶催化?；o酶A(或在鏈延伸開始步驟時，乙酰輔酶A)與丙二酰輔酶A縮合，產(chǎn)生β-酮脂酰輔酶A。在后續(xù)步驟中，β-酮脂酰輔酶A被β-酮脂酰輔酶A還原酶還原(步驟2)、在β-羥酰輔酶A脫水酶作用下脫水(步驟3)，最后被烯酰輔酶A還原酶還原(步驟4)。讓反應(yīng)重復(fù)進(jìn)行，每循環(huán)一次向?；o酶A鏈添加兩個碳。(B)II型FAS系統(tǒng)由β-酮脂酰ACP合酶(KASIII)引發(fā)脂肪酸合成(步驟1a)，其中β-酮脂酰ACP合酶(KASIII)催化乙酰輔酶A與丙二酰ACP縮合，產(chǎn)生β-酮脂酰ACP。在后續(xù)步驟中，β-酮脂酰ACP經(jīng)歷還原(步驟2)、脫水(步驟3)，以及與輔酶A特異性途徑類似的還原(步驟4)。進(jìn)一步的延伸步驟由KASI或KASII引發(fā)(步驟1b)，其中KASI或KASII催化?；鵄CP與丙二酰ACP縮合。圖27示出新型輔酶A依賴性脂肪酸途徑和相關(guān)的關(guān)鍵酶。圖27示出新型輔酶A依賴性脂肪酸途徑和相關(guān)的關(guān)鍵酶。具體實(shí)施方式在本文附圖、權(quán)利要求和說明書部分示出了一個或多個本發(fā)明實(shí)施例的詳情。除非明確排除，否則本文公開和設(shè)想的本發(fā)明實(shí)施例的其他特征、目標(biāo)和優(yōu)點(diǎn)可與任何其他實(shí)施例結(jié)合。本發(fā)明整體涉及多種化學(xué)產(chǎn)品的多種生產(chǎn)方法和/或可用于發(fā)酵生產(chǎn)多種化學(xué)產(chǎn)品的經(jīng)遺傳修飾微生物，涉及利用容器中的這類微生物的群體生產(chǎn)此類化學(xué)產(chǎn)品的方法，還涉及采用這些微生物和方法生產(chǎn)化學(xué)產(chǎn)品的系統(tǒng)。本發(fā)明利用這類微生物在發(fā)酵事件或發(fā)酵循環(huán)期間生產(chǎn)化學(xué)產(chǎn)品，一個好處是比生產(chǎn)率(specificproductivity)增大。本發(fā)明提供了生產(chǎn)技術(shù)和/或經(jīng)遺傳修飾微生物，用來生產(chǎn)感興趣的化學(xué)產(chǎn)品，例如脂肪酸或脂肪酸衍生產(chǎn)物。本發(fā)明提供了一種或多種用于調(diào)節(jié)丙二酰輔酶A向脂肪酰分子轉(zhuǎn)化的裝置，其中生產(chǎn)途徑包括丙二酰輔酶A依賴性途徑，該丙二酰輔酶A依賴性途徑包括將丙二酰輔酶A用作底物的酶轉(zhuǎn)化步驟。根據(jù)某些實(shí)施例，丙二酰輔酶A依賴性途徑也是丙二酰ACP非依賴性途徑，可以將該途徑與抑制微生物天然的丙二酰ACP依賴性脂肪酸合酶途徑結(jié)合起來。根據(jù)本發(fā)明的某些其他實(shí)施例，生產(chǎn)脂肪酸或脂肪酸衍生產(chǎn)物的方式取決于丙二酰輔酶A依賴性途徑和丙二酰ACP依賴性途徑。本發(fā)明的經(jīng)遺傳修飾微生物被代謝改造為，增加至少部分為丙二酰輔酶A依賴性的代謝途徑對丙二酰輔酶A的利用率，從而產(chǎn)生更多脂肪酸或脂肪酸衍生產(chǎn)物。脂肪酸衍生產(chǎn)物可包括去飽和及鏈支化程度各異的酯、醛、醇、烷烴、烯烴和二酸，以及由這些化學(xué)產(chǎn)物進(jìn)一步制成的下游產(chǎn)物。另外，可進(jìn)行遺傳修飾，以產(chǎn)生一種或多種化學(xué)產(chǎn)物。本發(fā)明還涉及經(jīng)遺傳工程改造的微生物，這種微生物在其中編碼獨(dú)特的酶和酶的組合，所述獨(dú)特的酶和酶的組合在丙二酰輔酶A依賴性途徑中起作用而產(chǎn)生特定鏈長度的脂肪酸或脂肪酸衍生產(chǎn)物。所述微生物和方法提供了有成本競爭力的手段來生產(chǎn)濃度相對較高的下列產(chǎn)物：特定鏈長度的脂肪酸或脂肪酸衍生產(chǎn)物，或具有相對較窄碳鏈長度分布的產(chǎn)物(即，脂肪酸產(chǎn)物內(nèi)的2種、3種、4種或不到5種不同碳鏈長度，例如C8/C10或C8/C10/C12)。I.定義/命名本文使用的開放術(shù)語，比如“包含”、“含有”、“包括”等，除非另外指明，都意味著“包括但不限于”。本文的一些實(shí)施例設(shè)想了數(shù)值范圍。當(dāng)提供數(shù)值范圍時，該范圍包括范圍的端點(diǎn)。數(shù)值范圍包括其中所有的值和子范圍，如同將這些值和子范圍明確寫出。本文使用的冠詞“一個/種”，除非另外明確指明，都意味著一個或多個/一種或多種。本文使用的單字母縮寫A、R、N、C、D、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y和V，代表自然界中合成的肽內(nèi)常見的二十種氨基酸，除非另外指明。如本文所用，除非另外指明，否則約定“第1字母數(shù)字第2字母”在應(yīng)用于多肽時表示多肽內(nèi)該數(shù)字位置處，具有第1字母這一單字母代碼的氨基酸被具有第2字母這一單字母代碼的氨基酸置換。例如，I147T意味著肽中第147位處存在的氨基酸I被氨基酸T置換。本文使用的符號C數(shù)字，除非另外指明，都意味著碳主鏈的鏈長度為示出的碳原子數(shù)。例如，C20意味著化學(xué)主鏈的鏈長度為20個碳。應(yīng)當(dāng)注意，碳主鏈所含的碳原子數(shù)不包括附接在主鏈上的功能單元(例如，脂肪酸衍生產(chǎn)物中的功能單元)中所含的碳原子數(shù)。本文使用“酶活性降低”、“降低酶活性”等表述來表明，微生物細(xì)胞的酶或分離得到的酶展示的活性水平低于在相同物種的可比細(xì)胞或其天然酶中測得的酶活性水平。也就是說，該酶在已知標(biāo)準(zhǔn)條件下、將指出的底物轉(zhuǎn)化為指出的產(chǎn)物的酶活性，比天然(未修飾的)酶在指定的標(biāo)準(zhǔn)條件下發(fā)揮同一生物化學(xué)轉(zhuǎn)化作用的酶活性低至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％。這些術(shù)語也可涵蓋酶活性被消除?？刹捎帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的多種方式降低酶活性，包括(例如)基因破壞或基因缺失。酶活性降低可能是暫時的，可通過各種遺傳因子的表達(dá)來控制，或者可響應(yīng)細(xì)胞的培養(yǎng)條件而降低。可使用本領(lǐng)域已知的任何方法來識別酶活性降低的細(xì)胞。例如，可使用酶活性測定法來識別酶活性降低的細(xì)胞。參見例如EnzymeNomenclature,AcademicPress,Inc.,NewYork2007(《酶命名法》，紐約學(xué)術(shù)出版社，2007年)。本文使用“酶活性增加”、“增加酶活性”等表述來表明，微生物細(xì)胞的酶或分離得到的酶展示的活性水平高于在相同物種的可比細(xì)胞或其天然酶中測得的酶活性水平。也就是說，該酶在已知標(biāo)準(zhǔn)條件下、將指出的底物轉(zhuǎn)化為指出的產(chǎn)物的酶活性，比天然(未修飾的)酶在指定的標(biāo)準(zhǔn)條件下發(fā)揮同一生物化學(xué)轉(zhuǎn)化作用的酶活性高至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％。這些術(shù)語也可涵蓋增加外源酶活性。酶活性增加可能是暫時的，可通過各種遺傳因子的表達(dá)來控制，或者可響應(yīng)細(xì)胞的培養(yǎng)條件而增加?？墒褂帽绢I(lǐng)域已知的任何方法來識別酶活性增加的細(xì)胞，包括上文指出的用于識別酶活性降低的細(xì)胞的酶活性測定法。本文使用術(shù)語“基因破壞”或其語法等同物(并包括“破壞酶功能”等)來指對微生物的遺傳修飾，這種遺傳修飾致使編碼的基因產(chǎn)物的多肽活性與未這樣修飾的微生物細(xì)胞中的多肽活性、或來自未這樣修飾的微生物細(xì)胞的多肽活性相比降低。遺傳修飾可為(例如)整個基因缺失，轉(zhuǎn)錄或翻譯所需的調(diào)控序列缺失或該調(diào)控序列上的其他修飾，產(chǎn)生截短基因產(chǎn)物(例如酶)的基因部分缺失，或者降低所編碼基因產(chǎn)物的活性(包括降至無法檢出的活性水平)的各種突變策略中的任一種。廣義的破壞可包括編碼酶的核酸序列全部或部分缺失，還包括但不限于其他類型的遺傳修飾，例如引入終止密碼子、移碼突變，引入或移除基因的一部分，以及引入降解信號，這些遺傳修飾會影響mRNA轉(zhuǎn)錄水平和/或穩(wěn)定性，并改變編碼該酶的基因上游的啟動子或阻遏子。在各種語境中，“基因破壞”是指任何導(dǎo)致多肽活性降低的對DNA、由該DNA編碼的mRNA和對應(yīng)氨基酸序列的遺傳修飾?？墒褂迷S多不同的方法來產(chǎn)生多肽活性降低的細(xì)胞。例如，可使用常用的誘變或敲除技術(shù)，將細(xì)胞改造成具有被破壞的調(diào)控序列或編碼多肽的序列。參見例如MethodsinYeastGenetics(1997edition),Adamsetal.,ColdSpringHarborPress(1998)(《酵母遺傳學(xué)方法》，1997年版，Adams等人，冷泉港出版社，1998年)。一種特別有用的基因破壞方法是完全缺失基因，因?yàn)檫@會降低或消除本發(fā)明的經(jīng)遺傳修飾微生物發(fā)生遺傳回復(fù)。因此，破壞產(chǎn)物為酶的基因，就破壞了酶功能?；蛘?，可使用反義技術(shù)來降低特定多肽的活性。例如，可將細(xì)胞改造成含有編碼阻止多肽翻譯的反義分子的cDNA。另外，可使用基因沉默來降低特定多肽的活性。術(shù)語“異源的”本意包括術(shù)語“外源的”，因?yàn)楸绢I(lǐng)域時常使用術(shù)語“外源的”。異源可以指宿主細(xì)胞通常不會產(chǎn)生的多肽和/或核酸。因此，這類異源多肽和/或核酸可包括與宿主細(xì)胞所產(chǎn)生蛋白質(zhì)的氨基酸序列實(shí)質(zhì)上沒有同源性的多肽，或可包括與宿主細(xì)胞或衍生宿主細(xì)胞的細(xì)胞系所產(chǎn)生蛋白質(zhì)實(shí)質(zhì)上有同源性但不完全同源的多肽。本文使用的術(shù)語“異源DNA”、“異源核酸序列”等，是指符合至少一種下述情況的核酸序列：(a)此核酸序列是給定宿主微生物的外來序列(也就是說，并非天然存在于給定宿主微生物中)；(b)此序列可能天然存在于給定宿主微生物中，但含量反常(例如，大于預(yù)期含量)或位置異常；或者(c)此核酸序列包含的兩種或更多種子序列彼此間的關(guān)系不同于自然情況下的這種關(guān)系。例如，就情況(c)來說，重組產(chǎn)生的異源核酸序列將具有源自排列為產(chǎn)生新的功能性核酸的不相關(guān)基因的兩種或更多種序列。本文使用的術(shù)語“反義分子”，涵蓋含有與內(nèi)源多肽的編碼鏈對應(yīng)的序列的任何核酸分子或核酸類似物(例如肽核酸)。反義分子也可具有旁側(cè)序列(例如調(diào)控序列)。所以，反義分子可為核糖酶或反義寡核苷酸。本文使用的核糖酶可具有任一種一般結(jié)構(gòu)，包括但不限于發(fā)夾結(jié)構(gòu)、錘頭結(jié)構(gòu)或斧頭結(jié)構(gòu)，只要酶分子能切斷RNA即可。本文使用的生物生產(chǎn)過程可以是需氧過程、微需氧過程或厭氧過程。本文使用的表述“充分同源”是指，與本申請?zhí)峁┑亩喾N氨基酸序列(包括多個SEQIDNO.或序列表)中的某一氨基酸序列相比，蛋白質(zhì)或其部分的氨基酸序列包含最少數(shù)量相同或相當(dāng)?shù)陌被釟埢?，使得蛋白質(zhì)或其部分能夠?qū)崿F(xiàn)各自的酶反應(yīng)和/或其他功能。可利用酶活性測定法(例如本領(lǐng)域公知的那些)來確定特定蛋白質(zhì)或其部分是否充分同源。關(guān)于序列同一性和同源性的描述和方法是示例性的，并且公認(rèn)的是，這些概念是本領(lǐng)域熟知的。此外應(yīng)當(dāng)理解，核酸序列可以變化，但仍可編碼顯現(xiàn)所需功能的酶或其他多肽，而且此類變化屬于本發(fā)明的范圍。此外對于核酸序列而言，“雜交”是指兩種單鏈多核苷酸非共價(jià)結(jié)合形成穩(wěn)定的雙鏈多核苷酸的過程。術(shù)語“雜交”還可以指三鏈雜交。所得(通常情況下)雙鏈多核苷酸為“雜交體”或“雙鏈體”?！半s交條件”通常包括鹽濃度低于約1M，更通常低于約500mM，以及低于約200mM。雜交溫度可低至5℃，但通常高于22℃、更通常高于約30℃，并時常超過約37℃。雜交通常在嚴(yán)格條件下進(jìn)行，所謂嚴(yán)格條件，就是探針會與其靶子序列雜交的條件。嚴(yán)格條件取決于序列，并在不同的情況下存在差異。較長的片段可能需要較高的雜交溫度才能特異性雜交。由于其他因素(包括互補(bǔ)鏈的堿基組成和長度，存在有機(jī)溶劑，以及堿基錯配的程度)可能影響雜交的嚴(yán)格度，所以，多個參數(shù)的組合比任一個單獨(dú)參數(shù)的絕對度量更重要。一般來講，選擇的嚴(yán)格條件比規(guī)定了離子強(qiáng)度和pH值的特定序列的Tm(在該溫度下，半數(shù)DNA以單鏈(變性)形式存在)大約低5℃。示例性嚴(yán)格條件包括pH值為7.0至8.3、溫度至少25℃時，鈉鹽(或其他鹽)濃度為至少0.01M、但不超過1MNa離子濃度。例如，溫度為25至30℃，5XSSPE(750mMNaCl，50mM磷酸鈉，5mMEDTA，pH7.4)這樣的條件適合等位基因特異性探針雜交。要了解更多的嚴(yán)格條件，可參見(例如)SambrookandRussellandAnderson“NucleicAcidHybridization”1stEd.,BIOSScientificPublishersLimited(1999)(Sambrook、Russell和Anderson，《核酸雜交》，第1版，BIOS科學(xué)出版社，1999年)，該文獻(xiàn)中講述雜交方案的章節(jié)以引用方式并入本文?！疤禺愋噪s交”、“與……特異性雜交”或類似表述是指，當(dāng)一種或多種特定核苷酸序列以(例如全細(xì)胞)DNA或RNA這一復(fù)雜混合物形式存在時，分子在嚴(yán)格條件下顯著與該特定核苷酸序列結(jié)合、與該特定核苷酸序列形成雙鏈或與該特定核苷酸序列雜交，或者只與該特定核苷酸序列結(jié)合、只與該特定核苷酸序列形成雙鏈或只與該特定核苷酸序列雜交。本文使用的短語“所關(guān)注片段”包括所關(guān)注的基因和任何其他核酸序列片段。用來獲得所關(guān)注片段的方法的一個例子是采集微生物的培養(yǎng)物，其中該微生物的基因組包含所關(guān)注的基因或核酸序列片段。本文(包括權(quán)利要求書)在提及對基因產(chǎn)物(即，酶)的遺傳修飾時，應(yīng)當(dāng)理解，這種遺傳修飾是對通常編碼規(guī)定基因產(chǎn)物(即，酶)的核酸序列(例如基因，或包括基因)的遺傳修飾。在一些實(shí)施例中，截短多肽具有編碼相應(yīng)天然酶的核酸序列所編碼多肽全長的至少約90％、或至少約91％、或至少約92％、或至少約93％、或至少約94％、或至少約95％、或至少約96％、或至少約97％、或至少約98％或至少約99％，更具體地講，具有編碼相應(yīng)天然酶的核酸序列所編碼多肽全長的至少95％。所謂多肽的氨基酸序列至少與多肽的參考氨基酸序列(例如)95％“相同”，是指受權(quán)利要求書保護(hù)的多肽的氨基酸序列與該多肽的參考氨基酸序列的每一百個氨基酸只有不超過五個氨基酸發(fā)生改變，除此之外都與參考序列相同。換句話講，要獲得氨基酸序列至少與參考氨基酸序列95％相同的多肽，可使參考序列中不超過5％的氨基酸殘基缺失、或可將參考序列中不超過5％的氨基酸殘基置換為另一種氨基酸，或者可將數(shù)量不超過參考序列中氨基酸殘基總數(shù)5％的氨基酸插入?yún)⒖夹蛄小⒖夹蛄械倪@些改變可發(fā)生在參考氨基酸序列的氨基或羧基末端位置或這兩個末端位置間的任意位置，要么散布在參考序列的多個殘基處，要么以連續(xù)成組的形式分布于參考序列內(nèi)一段或多段位置。在其他實(shí)施例中，截短幅度可更大，本文在其他章節(jié)講述這一點(diǎn)。根據(jù)微生物學(xué)領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的分類法識別菌種和其他系統(tǒng)發(fā)育標(biāo)志。如果本文所述的方法和步驟表示按某種順序發(fā)生的某些事件，則本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員會認(rèn)識到，他們可以依據(jù)本發(fā)明的變型形式，更改某些步驟的順序。另外，除可循序執(zhí)行某些步驟外，如果有條件，還可平行執(zhí)行這些步驟?？s寫的意義如下：“℃”代表攝氏度，其用法清楚表明這一點(diǎn)；DCW代表干細(xì)胞重量；“s”代表秒；“min”代表分鐘；“h”或“hr”代表小時；“psi”代表磅每平方英寸；“nm”代表納米；“d”代表日；“μL”、“uL”或“ul”代表微升；“mL”代表毫升；“L”代表升；“mm”代表毫米；“nm”代表納米；“mM”代表毫摩爾濃度；“μM”或“uM”代表微摩爾濃度；“M”代表摩爾濃度；“mmol”代表毫摩爾；“μmol”或“uMol”代表微摩爾；“g”代表克；“μg”或“ug”代表微克；“ng”代表納克；“PCR”代表聚合酶鏈反應(yīng)；“OD”代表光密度；“OD600”代表在600nm光子波長處測得的光密度；“kDa”代表千道爾頓；“g”代表萬有引力常數(shù)；“bp”代表堿基對；“kbp”代表千堿基對；“％w/v”代表重量體積百分比；“％v/v”代表體積體積百分比；“IPTG”代表異丙基-μ-D-硫代半乳糖吡喃糖苷；“RBS”代表核糖體結(jié)合位點(diǎn)；“rpm”代表每分鐘轉(zhuǎn)數(shù)；“HPLC”代表高效液相色譜法；“UPLC”代表超高效液相色譜法；“GC”代表氣相色譜法。所謂“調(diào)節(jié)手段”，是指以下任一項(xiàng)：1)在微生物細(xì)胞中提供至少一種多核苷酸，其編碼至少一種具有特定酶活性的多肽，其中這樣編碼的多肽的酶活性為以下三種情況中的任一種：(a)外源酶活性，(b)天然酶活性，但比天然形式多肽的酶活性低或高(例如，由于存在突變和/或啟動子置換等)，或(c)在發(fā)酵過程中任意時刻經(jīng)調(diào)節(jié)而具有降低或增大的酶活性(例如，憑借溫度敏感性啟動子、誘導(dǎo)型啟動子等)；或者2)向裝有微生物細(xì)胞或微生物細(xì)胞群體的容器中添加抑制劑，用以抑制酶活性；或添加補(bǔ)充劑，用以增大酶活性。這些調(diào)節(jié)手段可彼此結(jié)合提供。本文提及“合酶III”、“合酶IV”、“合酶V”和“合酶VI”(表中FASTA標(biāo)頭項(xiàng)下特定酶序列名稱這一語境中除外)，分別是指一組合酶中包括的第三種、第四種、第五種和第六種合酶。合酶III、合酶IV、合酶V和合酶VI可為本文公開的任一種3-酮脂酰輔酶A合酶。例如，本文提及包含異源核酸序列的經(jīng)遺傳修飾生物體，其中異源核酸序列編碼選自合酶III和合酶IV的3-酮脂酰輔酶A合酶，是指下述任一種生物體：(1)包含編碼至少三種3-酮脂酰輔酶A合酶的異源核酸序列的經(jīng)遺傳修飾生物體，其中這些3-酮脂酰輔酶A合酶中至少有一種為本文公開的3-酮脂酰輔酶A合酶；或者(2)包含編碼至少四種3-酮脂酰輔酶A合酶的異源核酸序列的經(jīng)遺傳修飾生物體，其中這些3-酮脂酰輔酶A合酶中至少有一種為本文公開的3-酮脂酰輔酶A合酶。II.本發(fā)明的生物生產(chǎn)途徑A.輔酶A依賴性途徑本發(fā)明涉及包括四個步驟的脂肪酸途徑，其所利用的途徑與細(xì)菌利用的II型脂肪酸合成(FAS)系統(tǒng)類似。下文的方案1示出了這兩種脂肪酸合成。如描繪方案1的圖26所示，這兩種途徑都是涉及下述步驟的循環(huán)過程：1)?；溈s合，2)縮合產(chǎn)物還原，3)脫水，4)還原產(chǎn)生鏈長增加兩個碳原子的?；湥辉撨^程重復(fù)進(jìn)行，每循環(huán)一次向?；溙砑觾蓚€碳。考慮到這兩種過程類似，II型FAS系統(tǒng)用到的大多數(shù)酶也可以在推薦使用的脂肪酸途徑中發(fā)揮作用。然而，涉及?；糠宙溠由斓年P(guān)鍵步驟截然不同。根據(jù)本發(fā)明，推薦使用的脂肪酸途徑的縮合步驟特別采用了酮脂酰輔酶A合酶，來催化?；o酶A與丙二酰輔酶A縮合；而II型FAS系統(tǒng)則利用酮脂酰ACP合酶，來催化?；鵄CP與丙二酰ACP縮合。以前就知道，這種輔酶A依賴性途徑可延伸碳鏈，得到較長的脂肪酸鏈長度(例如，延伸到C14至C16，或更長)。然而根據(jù)本發(fā)明，申請人發(fā)現(xiàn)了一些新型經(jīng)遺傳修飾微生物，它們能夠經(jīng)由方案1A示出的延伸途徑生產(chǎn)脂肪酸，還能夠經(jīng)由該途徑延伸得到較短的碳鏈長度(例如，延伸得到C4至C6、C6至C8、C8至C10、C10至C12、C12至C14)。(應(yīng)當(dāng)注意，β-酮脂酰和3-酮脂酰是同義詞。)圖27示出了新型輔酶A依賴性脂肪酸途徑和相關(guān)的關(guān)鍵酶，用于生產(chǎn)C6脂肪酸。本領(lǐng)域的技術(shù)人員會認(rèn)識到，該途徑本質(zhì)上是循環(huán)進(jìn)行的；其中在每個循環(huán)期間都添加丙二酰輔酶A，直到獲得所需碳鏈長度。錯誤！未找到引用源。至圖6進(jìn)一步說明該新型途徑本質(zhì)上是循環(huán)進(jìn)行的。錯誤！未找到引用源。示出了將乙酰輔酶A用作引物并將丙二酰輔酶A(MCA)用作延伸分子，來生產(chǎn)鏈長為偶數(shù)的脂肪酸的流程。0示出了將乙酰輔酶A用作引物并將丙二酰輔酶A(MCA)用作延伸分子，來生產(chǎn)鏈長為偶數(shù)的脂肪酸酯的流程。圖5示出了將丙酰輔酶A用作引物并將丙二酰輔酶A(MCA)用作延伸分子，來生產(chǎn)鏈長為奇數(shù)的脂肪酸的流程。圖6示出了將丙酰輔酶A用作引物并將丙二酰輔酶A(MCA)用作延伸分子，來生產(chǎn)鏈長為奇數(shù)的脂肪酸酯的流程。根據(jù)本發(fā)明，生產(chǎn)脂肪酸或脂肪酸衍生產(chǎn)物的方式至少部分取決于丙二酰輔酶A依賴性途徑。根據(jù)某些實(shí)施例，丙二酰輔酶A依賴性途徑也是丙二酰ACP非依賴性脂肪酸生產(chǎn)途徑，可以將該途徑與抑制微生物的丙二酰ACP依賴性脂肪酸合酶途徑結(jié)合起來。根據(jù)本發(fā)明的某些其他實(shí)施例，經(jīng)由部分為丙二酰輔酶A依賴性、部分為丙二酰ACP依賴性的微生物途徑來生產(chǎn)脂肪酸或脂肪酸衍生產(chǎn)物。根據(jù)本發(fā)明的某些其他實(shí)施例，丙二酰輔酶A和乙酰輔酶A經(jīng)由輔酶A依賴性途徑反應(yīng)，由該反應(yīng)引發(fā)微生物途徑，繼而生產(chǎn)脂肪酸或脂肪酸衍生產(chǎn)物。參見圖7至圖14，示出了各種丙二酰輔酶A依賴性途徑的例子。示出的途徑是生產(chǎn)碳鏈長度為4、6、8或10的脂肪酸或脂肪酸酯的例子。本領(lǐng)域的技術(shù)人員會認(rèn)識到，鑒于這些途徑本質(zhì)上是循環(huán)進(jìn)行的，所以可延長這些途徑，繪出更長的碳鏈長度。根據(jù)本發(fā)明，提供的經(jīng)遺傳修飾微生物包含各種酶組合，用于確定：(1)由該生物體產(chǎn)生的碳鏈長度，以及(2)途徑依賴輔酶A或依賴輔酶A和ACP兩者的程度。此外，如果將引發(fā)圖7錯誤！未找到引用源。至圖14所示途徑的乙酰輔酶A前體變成丙酰輔酶A，則經(jīng)由這些途徑產(chǎn)生的會是碳鏈長度為奇數(shù)(即，5、7、9或11)的脂肪酸或脂肪酸酯。III.對微生物的遺傳修飾本發(fā)明提供了經(jīng)遺傳修飾微生物，其中的遺傳修飾使微生物能夠至少部分經(jīng)由丙二酰輔酶A依賴性途徑產(chǎn)生脂肪酸和/或脂肪酸衍生物，并且/或者可改善微生物至少部分經(jīng)由丙二酰輔酶A依賴性途徑產(chǎn)生脂肪酸和/或脂肪酸衍生物的能力。丙二酰輔酶A依賴性途徑可能與丙二酰ACP途徑相互獨(dú)立，也可與丙二酰ACP途徑相結(jié)合。一般來講，本文所述的經(jīng)遺傳修飾生物體可為梭菌屬、發(fā)酵單胞菌屬、埃希桿菌屬、沙門氏菌屬、紅球菌屬、假單胞菌屬、鏈霉菌屬、芽孢桿菌屬、乳桿菌屬、腸球菌屬、產(chǎn)堿桿菌屬、克雷伯氏菌屬、類芽孢桿菌屬、節(jié)桿菌屬、棒狀桿菌屬、短桿菌屬、畢赤酵母屬、念珠菌屬、漢遜酵母屬、破囊壺菌、噬菌體、酵母屬；可為原核細(xì)胞；可為真核細(xì)胞；并且/或者可為細(xì)菌、酵母、真菌、微藻類細(xì)胞或藻類細(xì)胞。經(jīng)遺傳修飾生物體優(yōu)選大腸桿菌。本發(fā)明設(shè)想的遺傳修飾包括增強(qiáng)生物體在本文設(shè)想的輔酶A依賴性脂肪酸途徑的三個階段中的功能，這三個階段分別為：(1)引發(fā)脂肪酸途徑；(2)延長(或延伸)鏈長度；以及(3)一旦獲得需要的鏈長度，便終止該過程。圖7至圖14舉例說明了這三個階段。A.用來驅(qū)動第一階段(反應(yīng)引發(fā)階段)的遺傳修飾丙二酰輔酶A依賴性途徑的第一階段為反應(yīng)引發(fā)階段。用來產(chǎn)生鏈長為偶數(shù)的脂肪酸產(chǎn)物的反應(yīng)由乙酰輔酶A+丙二酰輔酶A向3-酮丁酰輔酶A轉(zhuǎn)化來引發(fā)。該轉(zhuǎn)化過程需要合酶，即酮丁酰輔酶A合酶。如圖7所示，酮丁酰輔酶A在三種酶作用下轉(zhuǎn)化為丁酰輔酶A，反應(yīng)引發(fā)階段即告完成，這三種酶分別是：酮脂酰輔酶A還原酶(“KCR”)、羥酰輔酶A脫水酶(“3HDh”)和烯酰輔酶A還原酶(“EnCr”)。用來產(chǎn)生鏈長為奇數(shù)的脂肪酸產(chǎn)物的反應(yīng)，引發(fā)階段為丙酰輔酶A+丙二酰輔酶A向3-酮戊酰輔酶A轉(zhuǎn)化，后續(xù)在KCR、3HDh和EnCr催化下還原并脫水。因此，本發(fā)明的經(jīng)遺傳修飾微生物包含其中編碼的提供這些功能的天然酶或外源酶。(1)第一階段(反應(yīng)引發(fā)階段)―合酶根據(jù)本發(fā)明的一個方面，用NphT7這種來自鏈霉菌屬菌株CL190的3-酮脂酰輔酶A合酶充當(dāng)酮丁酰輔酶A合酶，來引發(fā)脂肪酸合成，途徑為催化乙酰輔酶A與丙二酰輔酶A縮合，得到3-酮丁酰輔酶A，再還原→脫水→還原為丁酰輔酶A(C4輔酶A)。根據(jù)本發(fā)明的一個方面，用NphT7充當(dāng)3-酮戊酰輔酶A合酶，來引發(fā)脂肪酸合成，途徑為催化丙酰輔酶A與丙二酰輔酶A縮合，得到3-酮戊酰輔酶A，再還原→脫水→還原為戊酰輔酶A(C5輔酶A)。下文提供了NphT7的蛋白質(zhì)序列(BAJ10048.1GI:299758082)及其核苷酸序列(AB540131.1GI:299758081)(分別為SEQIDNO:1，SEQIDNO:2)。SEQIDNO:1MTDVRFRIIGTGAYVPERIVSNDEVGAPAGVDDDWITRKTGIRQRRWAADDQATSDLATAAGRAALKAAGITPEQLTVIAVATSTPDRPQPPTAAYVQHHLGATGTAAFDVNAVCSGTVFALSSVAGTLVYRGGYALVIGADLYSRILNPADRKTVVLFGDGAGAMVLGPTSTGTGPIVRRVALHTFGGLTDLIRVPAGGSRQPLDTDGLDAGLQYFAMDGREVRRFVTEHLPQLIKGFLHEAGVDAADISHFVPHQANGVMLDEVFGELHLPRATMHRTVETYGNTGAASIPITMDAAVRAGSFRPGELVLLAGFGGGMAASFALIEWSEQIDNO:2在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的3-酮丁酰輔酶A合酶是蛋白質(zhì)序列為SEQIDNO.1-120中任一序列的合酶(如下表1所示)的同源物。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的3-酮丁酰輔酶A合酶是氨基酸序列與SEQIDNO.1-120中任一序列的同源性為至少約70％、約75％、約80％、約85％、約90％、約92％、約94％、約96％、約98％或約99％、但不到100％或?yàn)榧s100％的3-酮脂酰輔酶A合酶。在一些實(shí)施例中，本文的方法包括選擇至少兩種3-酮脂酰輔酶A合酶，其中每種合酶占據(jù)系統(tǒng)發(fā)育樹的不同分枝。在一個方面，本發(fā)明提供了利用本文的方法選擇的NphT7同源物的文庫。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的3-酮戊酰輔酶A合酶是蛋白質(zhì)序列為SEQIDNO.1-120中任一序列的合酶(如下表1所示)的同源物。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的3-酮戊酰輔酶A合酶是氨基酸序列與SEQIDNO.1-120中任一序列的同源性為至少約70％、約75％、約80％、約85％、約90％、約92％、約94％、約96％、約98％或約99％、但不到100％或?yàn)榧s100％的3-酮脂酰輔酶A合酶。在一些實(shí)施例中，本文的方法包括選擇至少兩種3-酮脂酰輔酶A合酶，其中每種合酶占據(jù)系統(tǒng)發(fā)育樹的不同分枝。在一個方面，本發(fā)明提供了利用本文的方法選擇的本文NphT7同源物的文庫。表1：合酶序列(2)第一階段(反應(yīng)引發(fā)階段)―酮脂酰輔酶A還原酶、3-羥酰輔酶A脫水酶和烯酰輔酶A還原酶如上文所指出，3-酮丁酰輔酶A在三種酶作用下轉(zhuǎn)化為丁酰輔酶A，用來產(chǎn)生鏈長為偶數(shù)的脂肪酸產(chǎn)物的反應(yīng)的引發(fā)階段即告完成，這三種酶分別是：酮脂酰輔酶A還原酶、羥酰輔酶A脫水酶和烯酰輔酶A還原酶。就該階段來說，酮脂酰輔酶A還原酶可選自3-酮丁酰輔酶A還原酶(例如雙功能酶fadB―SEQIDNO183)和3-羥丁酰輔酶A脫氫酶(例如hbd―SEQIDNO271)；羥酰輔酶A脫水酶可選自3-羥丁酰輔酶A脫水酶(例如雙功能酶fadB―SEQIDNO183)和烯酰輔酶A水合酶(例如crt―SEQIDNO272)；烯酰輔酶A還原酶可為反式-2-烯酰還原酶(例如ter―SEQIDNO275)。優(yōu)選的是，雙功能fadB既為酮脂酰輔酶A還原酶，又為羥酰輔酶A脫水酶；或者酮脂酰輔酶A還原酶為hbd，羥酰輔酶A脫水酶為crt。如上文所指出，3-酮戊酰輔酶A在三種酶作用下轉(zhuǎn)化為戊酰輔酶A，用來產(chǎn)生鏈長為奇數(shù)的脂肪酸產(chǎn)物的反應(yīng)的引發(fā)階段即告完成，這三種酶分別是：酮脂酰輔酶A還原酶、羥酰輔酶A脫水酶和烯酰輔酶A還原酶。就該階段來說，酮脂酰輔酶A還原酶可選自3-酮戊酰輔酶A還原酶(例如雙功能酶fadB―SEQIDNO183)和3-羥戊酰輔酶A脫氫酶(例如hbd―SEQIDNO271)；羥酰輔酶A脫水酶可選自3-羥戊酰輔酶A脫水酶(例如雙功能酶fadB―SEQIDNO183)和烯酰輔酶A水合酶(例如crt―SEQIDNO272)；烯酰輔酶A還原酶可為反式-2-烯酰還原酶(例如ter―SEQIDNO275)。優(yōu)選的是，雙功能fadB既為酮脂酰輔酶A還原酶，又為羥酰輔酶A脫水酶；或者酮脂酰輔酶A還原酶為hbd，羥酰輔酶A脫水酶為crt。(3)第一階段(反應(yīng)引發(fā)階段)―丙二酰ACP途徑根據(jù)可供選擇的實(shí)施例，如圖12和圖13所示，可利用丙二酰ACP依賴性途徑實(shí)現(xiàn)反應(yīng)引發(fā)階段，而一個或多個后續(xù)階段(即延伸階段和/或終止階段)的至少一部分依賴丙二酰輔酶A依賴性途徑。根據(jù)該實(shí)施例，用來產(chǎn)生鏈長為偶數(shù)的脂肪酸產(chǎn)物的反應(yīng)由乙酰輔酶A+丙二酰ACP向3-酮丁酰ACP轉(zhuǎn)化來引發(fā)。根據(jù)該實(shí)施例，用來產(chǎn)生鏈長為偶數(shù)的脂肪酸產(chǎn)物的反應(yīng)由丙酰輔酶A+丙二酰ACP向3-酮戊酰ACP轉(zhuǎn)化來引發(fā)。根據(jù)該實(shí)施例，提供的經(jīng)遺傳修飾微生物具有在其中編碼的本文所述的一種或多種酶，這些酶沿丙二酰輔酶A依賴性途徑催化反應(yīng)，并且其中天然酶經(jīng)由天然丙二酰ACP途徑推進(jìn)引發(fā)階段。(4)第一階段―輔酶A/ACP或ACP/輔酶A轉(zhuǎn)變到延伸如果ACP依賴性引發(fā)階段后緊跟著輔酶A依賴性延伸階段(參見例如圖13)，則微生物還必須編碼轉(zhuǎn)酰酶，例如丁酰ACP:輔酶A轉(zhuǎn)酰酶，用來將丁酰ACP轉(zhuǎn)化為丁酰輔酶A；或戊酰ACP:輔酶A轉(zhuǎn)酰酶，用來將戊酰ACP轉(zhuǎn)化為戊酰輔酶A。與此類似，如果輔酶A依賴性引發(fā)階段后緊跟著ACP依賴性延伸階段(參見例如圖11)，則微生物還必須編碼轉(zhuǎn)酰酶，例如丁酰輔酶A:ACP轉(zhuǎn)酰酶，用來將丁酰輔酶A轉(zhuǎn)化為丁酰ACP；或戊酰輔酶A:ACP轉(zhuǎn)酰酶，用來將戊酰輔酶A轉(zhuǎn)化為戊酰ACP。合適的丁酰輔酶A:ACP轉(zhuǎn)酰酶包括優(yōu)選來自大腸桿菌的fabH、優(yōu)選來自智人的FASN、優(yōu)選來自釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的FAS1。另外的轉(zhuǎn)酰酶包括例如來自芥菜(Brassicajuncea)、小眼蟲(Euglenagracilis)的2.3.1.38類酶，和來自山丘鏈霉菌(Streptomycescollinus)的ACT?；蛘?，經(jīng)遺傳修飾微生物可編碼一種基因，這種基因經(jīng)由將任一種ACP中間體轉(zhuǎn)化成對應(yīng)的輔酶A中間體、或?qū)⑷我环N輔酶A中間體轉(zhuǎn)化成對應(yīng)的ACP中間體，而將脂肪酸生產(chǎn)途徑從ACP依賴性途徑轉(zhuǎn)變成輔酶A依賴性途徑，或反之，從輔酶A依賴性途徑轉(zhuǎn)變成ACP依賴性途徑。例如，經(jīng)遺傳修飾微生物可編碼優(yōu)選來自惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)KT2440的phaG基因，其中phaG將3-羥酰ACP轉(zhuǎn)化成3-羥酰輔酶A。B.用來驅(qū)動第二階段―鏈長度延長(延伸)的遺傳修飾丙二酰輔酶A依賴性途徑的第二階段涉及循環(huán)過程，其中每循環(huán)一次，碳鏈長度便延長兩個碳。如圖7所示，該階段需要酮脂酰輔酶A合酶、酮脂酰輔酶A還原酶、羥酰輔酶A脫水酶和烯酰輔酶A還原酶。因此，本發(fā)明的經(jīng)遺傳修飾微生物包含其中編碼的提供這些功能的天然酶或外源酶。(1)第二階段(延伸)―酮脂酰輔酶A合酶NphT7對于在引發(fā)階段充當(dāng)引物的乙酰輔酶A和丙酰輔酶A表現(xiàn)出顯著的特異性，而且在延伸階段期間對于較長的?；o酶A鏈顯示極小活性。能夠催化較長的?；o酶A鏈縮合的大多數(shù)3-酮脂酰輔酶A合酶可以在植物、哺乳動物、酵母和其他低等真核生物體內(nèi)找到。如果沒有對于較長的?；o酶A具有特異性的3-酮脂酰輔酶A合酶，則比C4輔酶A或C5輔酶A長的?；o酶A鏈不會延伸；因此，可能需要對于較長的酰基輔酶A具有特異性的3-酮脂酰輔酶A合酶。在一個方面，本發(fā)明提供了在丙二酰輔酶A依賴性途徑的延伸階段期間充當(dāng)酮脂酰輔酶A合酶的經(jīng)修飾NphT7多肽。這種經(jīng)修飾NphT7的氨基酸序列與SEQIDNO:1的同源性為至少70％、但不到100％或?yàn)榧s100％，并包含一種或多種氨基酸置換、缺失或插入，其中這種經(jīng)修飾NphT7多肽能夠接受碳鏈長度為C4或C4以上(例如C5、C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12、C13、C14、C15、C16、C17、C18、C19、C20、C21或C22)的酰基輔酶A底物。在一些實(shí)施例中，這種經(jīng)修飾NphT7多肽能夠催化?；o酶A底物與丙二酰輔酶A縮合，產(chǎn)生碳鏈長度為C6或C6以上(例如C7、C8、C9、C10、C11、C12、C13、C14、C15、C16、C17、C18、C19、C20、C21或C22)的3-酮脂酰輔酶A。在一些實(shí)施例中，這種經(jīng)修飾NphT7多肽包含一種或多種氨基酸置換，選自I147T、F217V、Y144L、V157F、G309S、G288S、將第86至89位氨基酸從PDRP置換為HFLQ、I147F、I147M、I147Q、I147S、I147C、I147E、I147N、I147W、I147D、I147R、I147P、I147L、V196G、I147G、I147H、I147K、I147V、I147A、I147Y、F217G、F217A、F217L、F217I、F217M、F217T、F217P、F217S、F217E、F217L、F217W，以及這些置換的任意組合。在一些實(shí)施例中，這種經(jīng)修飾NphT7多肽包含一種氨基酸置換，選自I147V、I147F、I147M、I147Q、I147S、I147C、I147E、I147N、I147W、I147D、I147R、I147P、I147L、I147G、I147H、I147K、I147A、I147Y和F217V。在一些實(shí)施例中，這種經(jīng)修飾NphT7多肽包含兩種氨基酸置換，選自I147T和F217V、I147T和Y144L、I147T和V196G、I147F和F217V、I147M和F217V、I147S和F217V、I147T和HFLQ、I147T和V157F、I147T和F217G、I147T和F217A、I147T和F217L、I147T和F217I、I147T和F217M、I147T和F217P、I147T和F217S、I147T和F217E、I147S和F217G、I147S和F217A、I147S和F217L、I147S和F217I、I147S和F217M、I147S和F217W、I147S和F217S、I147S和F217E、I147S和F217K、I147F和F217A、I147F和F217L、I147F和F217I、I147F和F217M、I147F和F217P、I147F和F217E、I147M和F217G、I147M和F217A、I147M和F217L、I147M和F217I、I147M和F217M、I147M和F217P、I147M和F217S、I147M和F217E，以及I147M和F217K。在一些實(shí)施例中，任意實(shí)施例的這種經(jīng)修飾NphT7多肽包含三種氨基酸置換，選自(Y144L、I147T和F217V)；(I147T、F217V和HFLQ)；(I147T、V147F和F217V)；以及(Y144L、I147T和V157F)。在一些實(shí)施例中，這種經(jīng)修飾NphT7多肽在選自下列的位置具有一種或多種氨基酸置換：Ser84、Val114、Gly288、Ile194、Gly318、Thr85、Gln90、Val196、Tyr144、Phe159、Ile147、Phe217，以及這些位置的任意組合。在一些實(shí)施例中，這種經(jīng)修飾NphT7多肽包含I147T氨基酸置換。在一些實(shí)施例中，這種經(jīng)修飾NphT7多肽包含F(xiàn)217V氨基酸置換。在一些實(shí)施例中，這種經(jīng)修飾NphT7多肽包含兩種或兩種以上氨基酸置換、缺失或插入，例如I147T氨基酸置換和F217V氨基酸置換。在一些實(shí)施例中，這種經(jīng)修飾多肽為分離并純化過的。在一個方面，本發(fā)明提供了編碼經(jīng)修飾NphT7多肽的分離并純化過的多核苷酸。在一些實(shí)施例中，這種分離并純化過的多核苷酸的核酸序列與SEQIDNO:2的同源性或互補(bǔ)性為至少70％、但不到100％或?yàn)榧s100％，其中該多核苷酸編碼具有一種或多種氨基酸置換、缺失或插入的SEQIDNO:1的經(jīng)修飾NphT7多肽，其中經(jīng)修飾NphT7多肽能夠接受碳鏈長度為C4或C4以上(例如C5、C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12、C13、C14、C15、C16、C17、C18、C19、C20、C21或C22)的?；o酶A底物。在一些實(shí)施例中，這種分離并純化過的多核苷酸編碼的經(jīng)修飾NphT7多肽能夠催化縮合反應(yīng)，使?；o酶A底物與丙二酰輔酶A縮合，產(chǎn)生碳鏈長度為C6或C6以上(例如C7、C8、C9、C10、C11、C12、C13、C14、C15、C16、C17、C18、C19、C20、C21或C22)的3-酮脂酰輔酶A。任意實(shí)施例的這種分離并純化過的多核苷酸編碼的經(jīng)修飾NphT7多肽包含一種或多種氨基酸置換，選自I147T、F217V、Y144L、V157F、G309S、G288S、將第86至89位氨基酸從PDRP置換為HFLQ、I147F、I147M、I147Q、I147S、I147C、I147E、I147N、I147W、I147D、I147R、I147P、I147L、V196G、I147G、I147H、I147K、I147V、I147A、I147Y、F217G、F217A、F217L、F217I、F217M、F217T、F217P、F217S、F217E、F217L、F217W，以及這些置換的任意組合。在一些實(shí)施例中，這種分離并純化過的多核苷酸編碼的經(jīng)修飾NphT7多肽包含一種氨基酸置換，選自I147V、I147F、I147M、I147Q、I147S、I147C、I147E、I147N、I147W、I147D、I147R、I147P、I147L、I147G、I147H、I147K、I147A、I147Y和F217V。在一些實(shí)施例中，這種分離并純化過的多核苷酸編碼的經(jīng)修飾NphT7多肽包含兩種氨基酸置換，選自I147T和F217V、I147T和Y144L、I147T和V196G、I147F和F217V、I147M和F217V、I147S和F217V、I147T和HFLQ、I147T和V157F、I147T和F217G、I147T和F217A、I147T和F217L、I147T和F217I、I147T和F217M、I147T和F217P、I147T和F217S、I147T和F217E、I147S和F217G、I147S和F217A、I147S和F217L、I147S和F217I、I147S和F217M、I147S和F217W、I147S和F217S、I147S和F217E、I147S和F217K、I147F和F217A、I147F和F217L、I147F和F217I、I147F和F217M、I147F和F217P、I147F和F217E、I147M和F217G、I147M和F217A、I147M和F217L、I147M和F217I、I147M和F217M、I147M和F217P、I147M和F217S、I147M和F217E，以及I147M和F217K。在一些實(shí)施例中，本文的這種分離并純化過的多核苷酸編碼的經(jīng)修飾NphT7多肽包含三種氨基酸置換，選自(Y144L、I147T和F217V)；(I147T、F217V和HFLQ)；(I147T、V147F和F217V)；以及(Y144L、I147T和V157F)。在一些實(shí)施例中，本文的這種分離并純化過的多核苷酸編碼的經(jīng)修飾NphT7多肽在選自下列的位置具有一種或多種氨基酸置換：Ser84、Val114、Gly288、Ile194、Gly318、Thr85、Gln90、Val196、Tyr144、Phe159、Ile147、Phe217，以及這些位置的任意組合。在一些實(shí)施例中，本文的這種分離并純化過的多核苷酸編碼的經(jīng)修飾NphT7多肽包含I147T氨基酸置換。在一些實(shí)施例中，本文的這種分離并純化過的多核苷酸編碼的經(jīng)修飾NphT7多肽包含F(xiàn)217V氨基酸置換。在一些方面，本文的這種分離并純化過的多核苷酸編碼的經(jīng)修飾NphT7多肽包含兩種或兩種以上氨基酸置換、缺失或插入。在一些方面，本文的這種分離并純化過的多核苷酸編碼的經(jīng)修飾NphT7多肽包含I147T氨基酸置換和F217V氨基酸置換。在一些實(shí)施例中，本文的這種分離并純化過的多核苷酸為RNA、mRNA、DNA或cDNA。在一些實(shí)施例中，本文的這種分離并純化過的多核苷酸為合成的多核苷酸。在一些實(shí)施例中，本文的這種分離并純化過的多核苷酸為合成的RNA、mRNA、DNA或cDNA。在一個方面，本發(fā)明提供了在丙二酰輔酶A依賴性途徑的延伸階段期間有活性的酮脂酰輔酶A合酶，其中這種酮脂酰輔酶A合酶選自npht7F217V、npht7I147T、合酶III、合酶IV、合酶V以及合酶VI；其中npht7F217V和/或npht7I147T在延伸階段催化添加第5個和/或第6個碳的反應(yīng)，npht7F217V、npht7I147T和/或合酶III在延伸階段催化添加第7個和/或第8個碳的反應(yīng)，npht7F217V、npht7I147T、合酶III、合酶IV和/或合酶V在延伸階段催化添加第9個和/或第10個碳的反應(yīng)，或者其中npht7F217V、npht7I147T、合酶III、合酶IV、合酶V和/或合酶VI在延伸階段催化添加第9個和/或序數(shù)更高的碳的反應(yīng)。(2)第二階段(延伸)―酮脂酰輔酶A還原酶、3-羥酰輔酶A脫水酶和烯酰輔酶A還原酶再次參見圖7，丙二酰輔酶A依賴性延伸階段的每個循環(huán)除需要3-酮脂酰輔酶A合酶外，還需要3-酮脂酰輔酶A還原酶(“KCR”)、羥酰輔酶A脫水酶(“3HDh”)和烯酰輔酶A還原酶(“EnCr”)。就延伸階段來說，酮脂酰輔酶A還原酶可選自3-酮脂酰輔酶A還原酶(例如雙功能酶fadB―SEQIDNO183)和3-羥酰輔酶A脫氫酶(例如hbd―SEQIDNO271)；羥酰輔酶A脫水酶可選自3-羥酰輔酶A脫水酶(例如雙功能酶fadB―SEQIDNO183)和烯酰輔酶A水合酶(例如crt―SEQIDNO272)；并且烯酰輔酶A還原酶可為反式-2-烯酰還原酶(例如ter―SEQIDNO275)。優(yōu)選的是，雙功能fadB既為酮脂酰輔酶A還原酶，又為羥酰輔酶A脫水酶；或者酮脂酰輔酶A還原酶為hbd，羥酰輔酶A脫水酶為crt。C.用來驅(qū)動第三階段―鏈長度終止的遺傳修飾一旦獲得需要的鏈長度，就用終止步驟結(jié)束延伸階段。在本發(fā)明的一個方面，經(jīng)遺傳修飾微生物編碼一種酶，這種酶能夠在以下位置終止?；由煅h(huán)：基本上在需要的鏈長度處，或基本上位于較窄鏈長度分布(即，2至4個碳的分布，例如C8至C10、C8至C12、C10至C12、C10至C14等)內(nèi)。在本發(fā)明的另一方面，終止酶為硫酯酶(例如?；o酶A酯酶)，微生物產(chǎn)生脂肪酸。合適的硫酯酶包括tesA―SEQIDNO277、'tesA―SEQIDNO278、tesB―SEQIDNO279、yciA―SEQIDNO280、ybgC―SEQIDNO281、ybfF―SEQIDNO282、fadM―SEQIDNO283、AtTE―SEQIDNO284、CpTE―SEQIDNO285、CperfTE―SEQIDNO286、LpTE―SEQIDNO287和PA2801TE―SEQIDNO288，以及這些酶的組合?；蛘?，終止酶為蠟酯合酶，微生物產(chǎn)生脂肪酯。合適的蠟酯合酶包括Maq1―SEQIDNO289、Pcry1―SEQIDNO290、Rjos1―SEQIDNO291和Abork1―SEQIDNO292?；蛘撸瑢儆诒绢I(lǐng)域技術(shù)范疇的是，添加其他已知的終止酶來使經(jīng)遺傳修飾微生物產(chǎn)生可選的脂肪酸衍生物，例如脂肪醇、脂肪醛、脂肪烯烴、脂肪酰胺、脂肪烷烴或脂肪二酸。舉例來說，終止酶可為催化產(chǎn)生脂肪醇或脂肪醛的脂肪酸或酰基輔酶A還原酶，或催化產(chǎn)生脂肪醛的醛脫羧酶，或與?；鵄CP還原酶或酰基輔酶A還原酶一道催化產(chǎn)生烷烴的醛脫羧酶。D.與特定鏈長度相關(guān)的遺傳修飾根據(jù)本發(fā)明的一個方面，將經(jīng)遺傳修飾微生物改造成能夠產(chǎn)生脂肪酸或脂肪酸衍生產(chǎn)物，這種脂肪酸或脂肪酸衍生產(chǎn)物具有基本上特定的鏈長度，或具有基本上較窄的鏈長度分布(即，2至4個碳)。優(yōu)選地，本發(fā)明的經(jīng)遺傳修飾微生物產(chǎn)生的脂肪酸或脂肪酸衍生物的至少50％、60％、70％、80％或90％具有需要的鏈長度，或位于所需的較窄鏈長度分布內(nèi)。申請人已確定，改造微生物，使其編碼將導(dǎo)致產(chǎn)生鏈長度特定的脂肪酸和脂肪酸衍生物的各種基因組合，就可實(shí)現(xiàn)這種特異性。下表2示出了導(dǎo)致產(chǎn)生表2所示碳鏈長度的產(chǎn)物的某些獨(dú)特基因組合。表2：在多種脂肪酸途徑中使用酶組合獲得的脂肪酸產(chǎn)物的鏈長度特異性根據(jù)本發(fā)明的一個方面，提供了一種經(jīng)遺傳修飾微生物，該微生物其中編碼了表2中包括的某一給定途徑的基因，其中這種微生物能夠按這一給定途徑產(chǎn)生具有表2所示碳鏈長度的脂肪酸或脂肪酸衍生物。還提供了一種經(jīng)遺傳修飾微生物，該微生物其中編碼了上表2中包括的多條途徑的組合的基因，其中這種微生物能夠按多條途徑的這種組合，產(chǎn)生碳鏈長度基本上位于與表2所示碳鏈長度對應(yīng)的較窄分布內(nèi)的脂肪酸或脂肪酸衍生物。例如，提供了包含NphT7、fadB、ter、AtTE和tesA(C10途徑A和C12途徑A)的經(jīng)遺傳修飾微生物，其中所述微生物能夠產(chǎn)生包含C10和C12脂肪酸的脂肪酸組合物。在另一方面，申請人已發(fā)現(xiàn)，可使用來自某些特定物種生物體的某些酶來控制鏈長度特異性。因此，本發(fā)明提供了一種或多種分離并純化過的包含外源核酸分子的多核苷酸，所述外源核酸分子編碼多種蛋白質(zhì)，包括來自選自下列的物種的3-氧?；?(酰基載體蛋白)合酶III：潮汐別樣希瓦氏菌B11、布氏弓形桿菌ED-1、梭菌目細(xì)菌1_7_47_FAA、木葡糖酸醋桿菌174Bp2、愛知戈登氏菌NBRC108223、中慢生根瘤菌屬物種STM4661、PelosinusfermentansDSM17108、加利西亞褐色桿菌2.10、青枯勞爾氏菌Po82、運(yùn)青糖單孢菌NA-128、青色糖單孢菌K62以及海洋疣孢菌AB-18-032，其中由所述多核苷酸編碼的蛋白質(zhì)能夠產(chǎn)生脂肪酸。在一些實(shí)施例中，3-氧酰基-(?；d體蛋白)合酶III來自選自下列的物種：PelosinusfermentansDSM17108、青色糖單孢菌K62、海洋疣孢菌AB-18-032以及梭菌目細(xì)菌1_7_47_FAA，并且其中由所述多核苷酸編碼的蛋白質(zhì)能夠產(chǎn)生乙酰輔酶A。在一些實(shí)施例中，3-氧?；?(?；d體蛋白)合酶III來自選自下列的物種：青色糖單孢菌K62、運(yùn)青糖單孢菌NA-128、中慢生根瘤菌屬物種STM4661以及梭菌目細(xì)菌1_7_47_FAA，并且其中由所述多核苷酸編碼的蛋白質(zhì)能夠產(chǎn)生四碳脂肪酸。在一些實(shí)施例中，3-氧酰基-(?；d體蛋白)合酶III來自選自下列的物種：愛知戈登氏菌NBRC108223、布氏弓形桿菌ED-1、梭菌目細(xì)菌1_7_47_FAA、青色糖單孢菌K62以及青枯勞爾氏菌Po82，并且其中由所述多核苷酸編碼的蛋白質(zhì)能夠產(chǎn)生六碳脂肪酸。在一些實(shí)施例中，3-氧酰基-(?；d體蛋白)合酶III來自選自下列的物種：愛知戈登氏菌NBRC108223、木葡糖酸醋桿菌174Bp2、布氏弓形桿菌ED-1、青枯勞爾氏菌Po82以及加利西亞褐色桿菌2.10，并且其中由所述多核苷酸編碼的蛋白質(zhì)能夠產(chǎn)生八碳脂肪酸。在一些實(shí)施例中，3-氧?；?(?；d體蛋白)合酶III來自潮汐別樣希瓦氏菌B11，并且其中由所述多核苷酸編碼的蛋白質(zhì)能夠產(chǎn)生十碳脂肪酸。E.用來將丙二酰輔酶A從天然丙二酰ACP依賴性脂肪酸合成途徑重定向到丙二酰輔酶A依賴性脂肪酸合成途徑的遺傳修飾如上所述，本發(fā)明的某些方面涉及經(jīng)遺傳修飾為經(jīng)由丙二酰輔酶A依賴性途徑產(chǎn)生脂肪酸和脂肪酸衍生物的微生物，其中丙二酰輔酶A依賴性途徑也是丙二酰ACP非依賴性途徑。本發(fā)明的該方面可與通過一種或多種遺傳修飾抑制微生物的丙二酰ACP依賴性脂肪酸合酶途徑結(jié)合使用，以便降低由微生物的丙二酰ACP依賴性脂肪酸合酶系統(tǒng)中的一種或多種基因編碼的酶的活性。可以在本發(fā)明的方法和系統(tǒng)中使用所述組合物。在微生物的許多細(xì)胞中，脂肪酸合酶系統(tǒng)包含具有以下酶活性的多肽：丙二酰輔酶A-?；d體蛋白(ACP)轉(zhuǎn)酰酶活性、3-酮脂酰ACP合酶活性、3-酮脂酰ACP還原酶活性、3-羥酰ACP脫水酶活性、3-羥酰ACP脫水酶活性以及烯酰ACP還原酶活性。在各種實(shí)施例中，可引入編碼這些多肽的溫度敏感型的核酸序列來代替天然酶；并且在將這類經(jīng)遺傳修飾微生物置于高溫下培養(yǎng)時(在這些溫度下，蛋白結(jié)構(gòu)改變或蛋白完全變性，所以這些不耐熱多肽被部分或完全滅活)，觀察到丙二酰輔酶A依賴性途徑的通量增加，而丙二酰ACP依賴性途徑的通量減小。大腸桿菌中的這些溫度敏感性突變基因可包括fabIts(S241F)、fabBts(A329V)或fabDts(W257Q)。在其他實(shí)施例中，可執(zhí)行其他類型的遺傳修飾，從而以其他方式調(diào)節(jié)(比如降低)這些多肽中的一種或多種的酶活性。在各種實(shí)施例中，此類遺傳修飾的結(jié)果是改變丙二酰輔酶A的利用率，從而減少丙二酰輔酶A經(jīng)由天然途徑向脂肪酸的轉(zhuǎn)化，繼而減少總生物質(zhì)，并成比例增大碳源經(jīng)由丙二酰輔酶A依賴性途徑(在一些情況下，經(jīng)由丙二酰ACP非依賴性途徑)向包括脂肪酸或脂肪酸衍生產(chǎn)物在內(nèi)的化學(xué)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化率。在各種實(shí)施例中，微生物產(chǎn)生化學(xué)產(chǎn)物的比生產(chǎn)率高得出乎意料。另外，可以在某些實(shí)施例中執(zhí)行額外的遺傳修飾，以便(例如)增大丙二酰輔酶A的產(chǎn)量。烯酰-?；d體蛋白還原酶(ECNo.1.3.1.9，也稱烯酰ACP還原酶)這種酶，是由丙二酰輔酶A生物合成脂肪酸會用到的關(guān)鍵酶。大腸桿菌中的這種酶(FabI)由基因fabI編碼(參見“Enoyl-AcylCarrierProtein(fabI)PlaysaDeterminantRoleinCompletingCyclesofFattyAcidElongationinEscherichiacoli，”RichardJ.HeathandCharlesO.Rock,J.Biol.Chem.270:44,pp.26538-26543(1995)(“烯?；??；d體蛋白(fabI)在完成大腸桿菌的脂肪酸延伸循環(huán)中發(fā)揮決定性作用”，RichardJ.Heath和CharlesO.Rock，《生物化學(xué)雜志》，第270期，第44卷，第26538-26543頁，1995年)，該論文中論述fabI和脂肪酸合酶系統(tǒng)的章節(jié)以引用方式并入本文)。本發(fā)明可利用微生物，這種微生物的核酸序列(多核苷酸)編碼的多肽具有可以在發(fā)酵事件期間調(diào)節(jié)的烯酰ACP還原酶活性。例如，可提供編碼溫度敏感性烯酰ACP還原酶的核酸序列來替代天然的烯酰ACP還原酶，以便可通過升高培養(yǎng)溫度來降低酶活性，繼而改變丙二酰輔酶A的利用率，得到所需的化學(xué)產(chǎn)物。一種這樣的序列是大腸桿菌的突變型溫度敏感性fabI(fabITS)或fabIts(S241F)(SEQIDNO141)。這種酶在溫度高于30℃時可表現(xiàn)出酶活性降低，但在30℃時表現(xiàn)出正常的酶活性。因此，將培養(yǎng)溫度升至(例如)34℃、35℃、36℃、37℃或甚至42℃，便可降低烯酰ACP還原酶的酶活性。在這種情況下，更多的丙二酰輔酶A在30℃時經(jīng)由本發(fā)明的非天然途徑轉(zhuǎn)化成脂肪酸或脂肪酸衍生產(chǎn)物或另一種化學(xué)產(chǎn)物；其中，由于烯酰ACP還原酶活性下降，便阻礙了丙二酰輔酶A經(jīng)由其天然脂肪酸途徑向脂肪酸轉(zhuǎn)化。應(yīng)當(dāng)理解，在已知的基因組學(xué)數(shù)據(jù)庫比如BLASTN和BLASTP中進(jìn)行同源性搜索，便很容易獲得大腸桿菌以外物種的烯酰ACP還原酶的核酸和氨基酸序列。本文描述了獲得其他物種中的同源物和功能等同序列的方法。因此，應(yīng)當(dāng)理解，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對許多有商業(yè)價(jià)值的微生物物種實(shí)施本發(fā)明。可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的除利用溫度敏感性烯酰ACP還原酶之外的方法，例如但不限于將天然的烯酰ACP或烯酰輔酶A還原酶替換為包含這種酶的誘導(dǎo)型啟動子的核酸序列，使得初始誘導(dǎo)后無需再誘導(dǎo)，從而在達(dá)到選擇的細(xì)胞密度后降低烯酰ACP或烯酰輔酶A還原酶的酶活性。例如，可執(zhí)行遺傳修飾以降低烯酰ACP還原酶基因(例如大腸桿菌中的fabI)的酶活性。在該例中，可以在本文所述方法的第一階段期間誘導(dǎo)啟動子(例如用異丙基-μ-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo))，并在IPTG耗盡、將其除去或稀釋掉后，可以開始降低烯酰ACP還原酶活性的第二步驟?？墒褂闷渌椒?例如本文所述的方法和/或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法)控制酶的表達(dá)和活性。例如，可使用那些響應(yīng)于磷酸鹽耗盡而開啟的啟動子可控制地表達(dá)所需基因。這種啟動子可包括大腸桿菌(E.coli)中的yibD或pstS基因啟動子。不囿于特定理論，據(jù)信降低微生物中烯酰-ACP還原酶(和/或脂肪酸合酶系統(tǒng)的其他酶)的酶活性將導(dǎo)致丙二酰輔酶A(一種酶的上游代謝中間產(chǎn)物)積累和/或進(jìn)入其他代謝途徑，并且由于微生物細(xì)胞中包含一種能利用丙二酰輔酶A的代謝途徑，隨后可將這種丙二酰輔酶A轉(zhuǎn)化成一種化學(xué)產(chǎn)物。在本發(fā)明的一些組合物、方法和系統(tǒng)中，烯酰-ACP還原酶(或者更一般地說，脂肪酸合酶系統(tǒng))的酶活性的降低是在遺傳修飾微生物達(dá)到一定的細(xì)胞密度后進(jìn)行的。這種雙相培養(yǎng)方法平衡了維持特定生產(chǎn)速率的細(xì)胞生物量中生物催化劑的所需量與產(chǎn)量，這一點(diǎn)可部分地歸因于當(dāng)烯酰-ACP還原酶活性(和/或脂肪酸合酶系統(tǒng)的其他酶的活性)降低后，使得更少的碳流向細(xì)胞物質(zhì)。這使得丙二酰輔酶A的凈利用率發(fā)生變化，從而為所需化學(xué)產(chǎn)物提供更多的碳通量。一旦這種降低所述酶活性的調(diào)節(jié)生效，相較于天然未調(diào)節(jié)的酶活性(例如細(xì)胞中或分離得到的)，進(jìn)行過這種調(diào)節(jié)的各相應(yīng)酶活性可降低至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％。同理，相較于未調(diào)節(jié)的細(xì)胞或其他系統(tǒng)的轉(zhuǎn)化率，丙二酰輔酶A到脂肪酰-ACP分子的轉(zhuǎn)化率可降低至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％。同樣，相較于未調(diào)節(jié)的細(xì)胞或其他系統(tǒng)的轉(zhuǎn)化率，丙二酰輔酶A通過其天然途徑形成脂肪酸分子的轉(zhuǎn)化率可降低至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％。F.其他遺傳修飾本文上述遺傳修飾可與各種其他遺傳修飾結(jié)合以進(jìn)一步提高所需化學(xué)產(chǎn)物的產(chǎn)量。這些額外的遺傳修飾可帶來多種有益的特性，例如提高葡萄糖攝取、減少會產(chǎn)生非期望副產(chǎn)物的替代反應(yīng)途徑中關(guān)鍵中間產(chǎn)物的消耗，以及驅(qū)使碳通量流向丙二酰輔酶A。表3中示出了部分此類額外遺傳修飾。表3：遺傳修飾除上述遺傳修飾外，在各種實(shí)施例中還提供了能夠增加輔因子NADPH庫及其可用性，并且/或者因此提高NADPH/NADP+比率的遺傳修飾。例如，在各種大腸桿菌的實(shí)施例中，這可通過提高以下一種或多種基因的活性(如通過遺傳修飾)來完成：pgi(突變形式)、過表達(dá)的pntAB、gapA:gapN置換/替換，以及可溶性轉(zhuǎn)氫酶(如sthA)的破壞或修飾和/或zwf、gnd和edd中一種或多種的遺傳修飾。本文所述的任何遺傳修飾可提供給不具備這種功能，或該功能小于所需水平的菌株。更一般地說，根據(jù)選擇用于遺傳修飾的微生物的具體代謝途徑，可用遺傳修飾來降低其細(xì)胞生產(chǎn)的發(fā)酵產(chǎn)物的任何亞組選自：乙酸酯、乙偶姻、丙酮、丙烯酸、蘋果酸酯、脂肪酸乙酯、甘油糖脂、脂質(zhì)、類異戊二烯、甘油、乙二醇、乙烯、丙烯、丁烯、異丁烯、乙酸乙酯、乙酸乙烯酯、其他乙酸酯、1,4-丁二醇、2,3-丁二醇、丁醇、異丁醇、仲丁醇、丁酸酯、異丁酸酯、2-OH-異丁酸酯、3-OH-丁酸酯、乙醇、異丙醇、D-乳酸、L-乳酸、丙酮酸酯、衣康酸酯、乙酰丙酸酯、葡糖二酸酯、戊二酸酯、己內(nèi)酰胺、己二酸、丙醇、異丙醇、雜醇和1,2-丙二醇、1,3-丙二醇、甲酸酯、富馬酸、丙酸、琥珀酸、戊酸和順丁烯二酸。通?？筛鶕?jù)本文公開的內(nèi)容產(chǎn)生基因缺失，但也可使用其他方法實(shí)現(xiàn)所選發(fā)酵產(chǎn)物的所需減少的細(xì)胞生產(chǎn)。在一些實(shí)施例中，額外遺傳修飾與選自下表4至表13中所列的組的基因型或酶相關(guān)。這些酶的氨基酸序列示于表14中。表4：基礎(chǔ)菌株大腸桿菌K12BW25113(Datsenko,K.A.,andWanner,B.L.,Proc.Natl.,Acad.Sci.USA97:6640-6645,2000(DatsenkoK.A.和WannerB.L.，《美國國家科學(xué)院院刊》，第97卷，第6640-6645頁，2000年))表5：用于增加產(chǎn)量/去除副產(chǎn)物的宿主修飾表6：脂肪酸合成(包括用于提高丙二酰輔酶A可用性的溫度敏感性等位基因)表7：丙二酰輔酶A合成以及其他與優(yōu)化通量有關(guān)的基因表8：糖轉(zhuǎn)運(yùn)和利用表9：用于脂肪酸產(chǎn)物的宿主修飾表10：脂肪酸途徑3-酮脂酰輔酶A合酶表11：硫酯酶表12：蠟酯合酶表13：其他表14：涉及遺傳修飾的酶的蛋白質(zhì)序列。(以粗體和下劃線列出的氨基酸表示對申請人的等位基因作出的修飾)IV.關(guān)于基因、核苷酸序列和氨基酸序列的方法和修飾技術(shù)A.氨基酸序列變體氨基酸序列中的一些氨基酸可發(fā)生變化，而不會顯著影響蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)或功能。只要所示的酶活性不受到顯著的不利影響，包含的變體可含有缺失、插入、倒位、重復(fù)和類型置換。關(guān)于哪些氨基酸的改變可能發(fā)生表型沉默的指導(dǎo)尤其可見于Bowie,J.U.,etal.，“DecipheringtheMessageinProteinSequences:TolerancetoAminoAcidSubstitutions，”Science247:1306-1310(1990)(Bowie,J.U.等人，“破譯蛋白序列信息：對氨基酸置換的耐受性”，《科學(xué)》，第247卷，第1306-1310頁，1990年)中。在各種實(shí)施例中，通過表達(dá)本發(fā)明多核苷酸分子獲得的多肽與由本文所述基因和/或核酸序列編碼的一種或多種氨基酸序列可具有至少約50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性，所述一種或多種氨基酸序列用于脂肪酸或脂肪酸衍生產(chǎn)物耐受性相關(guān)的生物合成途徑。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，與本文所述氨基酸同源的氨基酸也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。應(yīng)當(dāng)理解，氨基酸“同源性”包括保守置換，也就是說，用另一種特征相似的氨基酸置換多肽中的給定氨基酸的那些取代。典型地，把以下替換視作保守置換：將如Ala、Val、Leu和Ile的脂族氨基酸替換為另一種脂族氨基酸；用Thr替換Ser，反之亦然；將如Asp或Glu的酸性殘基替換為另一種酸性殘基；將如Asn或Gln的含有酰胺基的殘基替換為另一種含有酰胺基的殘基；將如Lys或Arg的堿性殘基替換為另一種堿性殘基；將如Phe或Tyr的芳族殘基替換為另一種芳族殘基。對于本文提供的所有核酸和氨基酸序列，應(yīng)當(dāng)理解，還包括這些序列的保守修飾變體，并且這些變體在本發(fā)明的各種實(shí)施例的范圍內(nèi)?？砂ūＪ匦揎椬凅w和更廣泛多樣的序列且在本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的技術(shù)范圍內(nèi)的功能等同的核酸和氨基酸序列(功能變體)，以及含有這些序列的微生物，還有包括這種序列和/或微生物的方法和系統(tǒng)，也在本發(fā)明各種實(shí)施例的范圍內(nèi)。在各種實(shí)施例中，編碼充分同源的蛋白或其一部分的核酸序列都在本發(fā)明的范圍內(nèi)。更一般地講，編碼用于本發(fā)明的特定氨基酸序列的核酸序列可由于遺傳密碼簡并性而變化，并且仍然在本發(fā)明的范圍內(nèi)。表15提供了對氨基酸之間相似性的匯總，基于這些相似性可進(jìn)行保守的和較不保守的置換，還提供了反映這種簡并性的各種密碼子冗余。表15：氨基酸保守置換氨基酸關(guān)系DNA密碼子丙氨酸N，AliGCT、GCC、GCA、GCG脯氨酸NCCT、CCC、CCA、CCG纈氨酸N，AliGTT、GTC、GTA、GTG亮氨酸N，AliCTT、CTC、CTA、CTG、TTA、TTG異亮氨酸N，AliATT、ATC、ATA甲硫氨酸NATG苯丙氨酸N，AroTTT、TTC色氨酸NTGG甘氨酸PUGGT、GGC、GGA、GGG絲氨酸PUTCT、TCC、TCA、TCG、AGT、AGC蘇氨酸PUACT、ACC、ACA、ACG天冬酰胺PU，AmiAAT、AAC谷氨酰胺PU，AmiCAA、CAG半胱氨酸PUTGT、TGC天冬氨酸NEG，AGAT、GAC谷氨酸NEG，AGAA、GAG精氨酸POS，BCGT、CGC、CGA、CGG、AGA、AGG賴氨酸POS，BAAA、AAG組氨酸POSCAT、CAC酪氨酸AroTAT、TAC終止密碼子TAA、TAG、TGA說明：側(cè)基及其他相關(guān)特性：A＝酸性；B＝堿性；Ali＝脂族；Ami＝胺；Aro＝芳族；N＝非極性；PU＝無電荷極性；NEG＝帶負(fù)電；POS＝帶正電。此外，當(dāng)這種核苷酸序列變體和/或部分包含與本文所引用的核酸序列中示出的任意15核苷酸序列相同的15核苷酸序列時，本文引用的特定核酸序列及其編碼的氨基酸序列的變體和部分可具有期望的功能，例如所選水平的酶活性，所述任意15核苷酸序列包括但不限于，開始于第1位核苷酸且結(jié)束于第15位核苷酸的序列、開始于第2位核苷酸且結(jié)束于第16位核苷酸的序列、開始于第3位核苷酸且結(jié)束于第17位核苷酸的序列，以此類推。應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明還提供了分離的核酸，所述分離的核酸包含長度大于15個核苷酸(例如，16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或更多個核苷酸)且與本文所引用核酸序列中示出的序列的任何部分相同的核苷酸序列。例如，本發(fā)明提供了分離的核酸，所述分離的核酸包含與本文所引用的任何一個或多個核酸序列(包括它們的任何組合)中示出的任意25核苷酸序列相同的25核苷酸序列，所述任意25核苷酸序列包括但不限于，開始于第1位核苷酸且結(jié)束于第25位核苷酸的序列、開始于第2位核苷酸且結(jié)束于第26位核苷酸的序列、開始于第3位核苷酸且結(jié)束于第27位核苷酸的序列，以此類推。另外的例子包括但不限于，包含長度為50個或更多個核苷酸(例如，100、150、200、250、300或更多個核苷酸)且與本文所公開的任一序列的任何部分相同的核苷酸序列的分離核酸。這種分離的核酸可包括但不限于，包含討論和/或例子的任一部分中所述的核酸序列的分離核酸，所述討論和/或例子例如關(guān)于脂肪酸或脂肪酸衍生產(chǎn)物生產(chǎn)途徑、編碼脂肪酸合酶系統(tǒng)中的酶的核酸序列、或者脂肪酸或脂肪酸衍生產(chǎn)物耐受性。例如，本發(fā)明提供了包含本文所列出的核酸序列的分離核酸，所述核酸序列包含單個插入、單個缺失、單個置換、多個插入、多個缺失、多個置換或它們的任意組合(例如，同時包含單個缺失與多個插入)。這種分離核酸分子可與本文所列出(即序列表中)的核酸序列具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％的序列同一性。另外的例子包括但不限于分離的核酸，所述分離的核酸包含編碼氨基酸序列的核酸序列，所述氨基酸序列有50個或更多個氨基酸殘基(例如，100、150、200、250、300個或更多個氨基酸殘基)長且與本文所列出或以其他方式公開的氨基酸序列的任何部分相同。此外，本發(fā)明提供了分離的核酸，所述分離的核酸包含編碼氨基酸序列的核酸序列，所述氨基酸序列具有本文所列出或以其他方式公開的氨基酸序列的變化。例如，本發(fā)明提供了包含核酸序列的分離的核酸，所述核酸序列編碼本文所列出或以其他方式公開的氨基酸序列且包含單個插入、單個缺失、單個置換、多個插入、多個缺失、多個置換或它們的任意組合(例如，同時包含單個缺失與多個插入)。這種分離核酸分子可含有編碼氨基酸序列的核酸序列，所述氨基酸序列與本文所列出或以其他方式公開的氨基酸序列具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％的序列同一性。為保守置換和其他氨基酸置換提供依據(jù)的特性的例子示于表15中。因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員可進(jìn)行多種置換，以獲得具有所需功能的氨基酸序列變體?？墒褂肂LASTP、CLUSTALP和其他比對和比較工具來評估可進(jìn)行較少置換的高度保守區(qū)域(除非涉及改變活性至所選水平，這可能需要多個置換)?？稍谧R別或確信為不涉及活性位點(diǎn)或其他結(jié)合或結(jié)構(gòu)基序的區(qū)域進(jìn)行較多的置換。根據(jù)表15，例如，可使用一個無電荷極性(PU)氨基酸置換所示序列的無電荷極性氨基酸，任選地考慮尺寸/分子量(即，使用絲氨酸置換蘇氨酸)。關(guān)于哪些氨基酸的改變可能發(fā)生表型沉默的指導(dǎo)尤其可見于Bowie,J.U.,etAl.，“DecipheringtheMessageinProteinSequences:TolerancetoAminoAcidSubstitutions，”Science247:1306-1310(1990)(Bowie,J.U.等人，“破譯蛋白序列信息：對氨基酸置換的耐受性”，《科學(xué)》，第247卷，第1306-1310頁，1990年)中。該參考文獻(xiàn)以引用方式并入以用于此類教導(dǎo)內(nèi)容，所述教導(dǎo)內(nèi)容也是本領(lǐng)域技術(shù)人員普遍已知的。公認(rèn)的氨基酸保守置換包括(可置換氨基酸緊跟著一組的每個冒號)：ala:ser；arg:lys；asn:gln或his；asp:glu；cys:ser；gln:asn；glu:asp；gly:pro；his:asn或gln；ile:leu或val；leu:ile或val；lys:arg或gln或glu；met:leu或ile；phe:met或leu或tyr；ser:thr；thr:ser；trp:tyr；tyr:trp或phe；val:ile或leu。應(yīng)當(dāng)指出，可使用針對特定物種的密碼子偏好和密碼子用法表來改造分離的核酸分子，使其利用該特定物種的密碼子使用偏好。例如，可將本文提供的分離核酸設(shè)計(jì)成具有可被所關(guān)注的特定微生物優(yōu)先利用的密碼子。許多軟件和測序服務(wù)可用于這種序列的密碼子優(yōu)化。本發(fā)明提供了包含本文所列出或以其他方式公開的氨基酸序列的完整氨基酸序列的多肽。此外，本發(fā)明提供了包含本文所列出或以其他方式公開的一部分氨基酸序列的多肽。例如，本發(fā)明提供的多肽包含與本文所列出或以其他方式公開的氨基酸序列中任意15氨基酸序列相同的15氨基酸序列，所述任意15氨基酸序列包括但不限于，開始于第1位氨基酸殘基且結(jié)束于第15位氨基酸殘基的序列、開始于第2位氨基酸殘基且結(jié)束于第16位氨基酸殘基的序列、開始于第3位氨基酸殘基且結(jié)束于第17位氨基酸殘基的序列，以此類推。應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明還提供了多肽，所述多肽包含長度大于15個氨基酸殘基(例如，16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或更多個氨基酸殘基)且與本文所列出或以其他方式公開的氨基酸序列的任何部分相同的氨基酸序列。例如，本發(fā)明提供的多肽包含與本文所列出或以其他方式公開的氨基酸序列中任意25氨基酸序列相同的25氨基酸序列，所述任意25氨基酸序列包括但不限于，開始于第1位氨基酸殘基且結(jié)束于第25位氨基酸殘基的序列、開始于第2位氨基酸殘基且結(jié)束于第26位氨基酸殘基的序列、開始于第3位氨基酸殘基且結(jié)束于第27位氨基酸殘基的序列，以此類推。另外的例子包括但不限于包含氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列有50個或更多個氨基酸殘基(例如，100、150、200、250、300個或更多個氨基酸殘基)長且與本文所列出或以其他方式公開的氨基酸序列的任何部分相同。此外應(yīng)當(dāng)理解，根據(jù)上述內(nèi)容，15核苷酸序列將提供5氨基酸序列，使得后者以及更大長度的氨基酸序列可由與本文所提供序列具有同一性的上述核苷酸序列長度限定。此外，本發(fā)明提供的多肽的氨基酸序列具有本文所列出或以其他方式公開的氨基酸序列所示的氨基酸序列變化。例如，本發(fā)明提供了包含本文所列出或以其他方式公開的氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列包含單個插入、單個缺失、單個置換、多個插入、多個缺失、多個置換或它們的任意組合(例如，同時包含單個缺失與多個插入)。這種多肽可含有與本文所列出或以其他方式公開的氨基酸序列具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％的序列同一性的氨基酸序列。具體的變體氨基酸序列可包含任何數(shù)量的變化以及變化類型的任意組合。如本文所指出的那樣，具有變體氨基酸序列的多肽可保留酶活性?？墒褂脴?biāo)準(zhǔn)方法，例如定點(diǎn)誘變或各種PCR技術(shù)，通過操縱編碼多肽的核苷酸序列來生成這種多肽。正如本文所提到的，一種修飾類型包括使用一種或多種氨基酸殘基置換具有相似的化學(xué)特性和/或生物化學(xué)特性的氨基酸殘基。例如，多肽可具有如本文所列出或以其他方式公開的包含一種或多種保守置換的氨基酸序列所示的氨基酸序列?？赏ㄟ^選擇較不保守的置換和/或可能更關(guān)鍵的序列區(qū)域的置換獲得更具實(shí)質(zhì)性的改變，例如選擇在下列項(xiàng)的維持效果方面具有更顯著的差異的殘基：(a)置換區(qū)域中的多肽主鏈的結(jié)構(gòu)，例如折疊或螺旋構(gòu)象；(b)靶位點(diǎn)處多肽的電荷或疏水性；或(c)側(cè)鏈體積。通常預(yù)期會產(chǎn)生最大的多肽功能改變的置換是：(a)親水殘基(如絲氨酸或蘇氨酸)置換(或置換為)疏水殘基(如亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、纈氨酸或丙氨酸)；(b)半胱氨酸或脯氨酸置換(或置換為)任何其他殘基；(c)具有正電性側(cè)鏈的殘基(如賴氨酸、精氨酸或組氨酸)置換(或置換為)負(fù)電殘基(如谷氨酸或天冬氨酸)；或(d)具有大體積側(cè)鏈的殘基(如苯丙氨酸)置換(或置換為)不具有側(cè)鏈的殘基(如甘氨酸)。對于具有酶活性的多肽而言，這些氨基酸置換(或其他缺失或添加)的影響可通過如下方式評估：分析該多肽催化與相關(guān)天然多肽相同的底物轉(zhuǎn)化為與相關(guān)天然多肽相同的產(chǎn)物的能力。因此，本發(fā)明提供了具有5、10、20、30、40、50個或更少的保守置換的多肽。B.測定氨基酸序列同一性在實(shí)際情況中，無論任何特定多肽與本文所述任何多肽的任何參考氨基酸序列(其可與本文所述特定核酸序列對應(yīng))具有50％、60％、70％、80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％還是99％的同一性，通常都可使用已知的計(jì)算機(jī)程序如Bestfit程序(Wisconsin序列分析軟件包(用于Unix)，第8版，遺傳學(xué)計(jì)算機(jī)組，大學(xué)研究園，威斯康星州麥迪遜市ScienceDrive575號，郵編53711(WisconsinSequenceAnalysisPackage,Version8forUnix,GeneticsComputerGroup,UniversityResearchPark,575ScienceDrive,Madison,Wis.53711))來測定這種特定多肽序列。當(dāng)使用Bestfit或任何其他序列比對程序測定特定序列與根據(jù)本發(fā)明的參考序列是否具有例如95％的同一性時，對參數(shù)進(jìn)行設(shè)置以使得根據(jù)參考氨基酸序列全長來計(jì)算同一性百分比，并且允許存在同源性最大達(dá)到參考序列總氨基酸殘基數(shù)的5％的空位。例如，在一個具體實(shí)施例中，可根據(jù)Brutlag等人(Comp.App.Biosci.6:237-245(1990)(《計(jì)算機(jī)在生物科學(xué)中的應(yīng)用》，第6卷，第237-245頁，1990年))的算法，使用FASTDB計(jì)算機(jī)程序測定參考序列(查詢序列，即本發(fā)明的一個序列)和目標(biāo)序列之間的同一性，也稱為全局序列比對。在一個狹義理解同一性的具體實(shí)施例中，F(xiàn)ASTDB氨基酸比對中使用的優(yōu)選參數(shù)為：評分方案＝PAM(可接受突變百分比(PercentAcceptedMutations))0，k-tuple＝2，錯配罰分＝1，連接罰分＝20，隨機(jī)組長＝0，截止得分＝1，窗口大?。叫蛄虚L度，空位罰分＝5，空位大小罰分＝0.05，窗口大小＝500或目標(biāo)氨基酸序列長度，取其中較短者。根據(jù)該實(shí)施例，如果由于N端或C端缺失而非由于內(nèi)部缺失，使得目標(biāo)序列短于查詢序列，將對結(jié)果進(jìn)行手動校正，以考慮FASTDB程序在計(jì)算全局同一性百分比時未計(jì)入目標(biāo)序列的N端和C端截短的事實(shí)。對于相對于查詢序列在N端和C端截?cái)嗟哪繕?biāo)序列，通過計(jì)算側(cè)向于目標(biāo)序列N端和C端且未與對應(yīng)目標(biāo)殘基匹配/對齊的查詢序列的殘基數(shù)來校正同一性百分比，以查詢序列總殘基的百分比計(jì)。關(guān)于殘基是否匹配/對齊的測定取決于FASTDB序列比對的結(jié)果。然后，從使用指定參數(shù)通過FASTDB程序計(jì)算的同一性百分比中減去這一百分比，得到最終的同一性百分比的得分。此最終同一性百分比的得分即是用于本實(shí)施例的得分。僅考慮將那些不與查詢序列匹配/對齊的目標(biāo)序列N端和C端的殘基用于手動調(diào)整同一性百分比得分。也就是說，僅考慮將目標(biāo)序列最遠(yuǎn)N端和C端殘基之外的查詢殘基位置用于此手動校正。例如，將90個氨基酸殘基的目標(biāo)序列與100個殘基的查詢序列比對，以測定同一性百分比。在目標(biāo)序列N端發(fā)生缺失，因此FASTDB比對不顯示N端前10個殘基的匹配/對齊。10個未配對的殘基代表序列的10％(不匹配的N端和C端殘基數(shù)/查詢序列的總殘基數(shù))，因此要從FASTDB程序計(jì)算的同一性百分比得分中減去10％。如果剩余90個殘基完全匹配，那么最終的同一性百分比為90％。在另一個例子中，將90個殘基的目標(biāo)序列與100個殘基的查詢序列進(jìn)行比較。這時缺失為內(nèi)部缺失，因此目標(biāo)序列的N端或C端不存在與查詢序列不匹配/對齊的殘基。在這種情況下，由FASTDB計(jì)算的同一性百分比無需手動校正。再次，如FASTDB比對所顯示的，僅對目標(biāo)序列的N端和C端外的與查詢序列不匹配/對齊的殘基位置進(jìn)行手動校正。C.用于進(jìn)行遺傳修飾和制備核酸構(gòu)建體的技術(shù)可根據(jù)本發(fā)明使用各種方法和技術(shù)來修飾微生物。要實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的實(shí)施例，需要向宿主微生物中引入表達(dá)載體，其中所述表達(dá)載體包含編碼酶的核酸序列，所述酶通常存在于宿主微生物中或通常不存在于宿主微生物中。對宿主細(xì)胞進(jìn)行遺傳修飾的能力對于任何經(jīng)遺傳修飾(重組)的微生物的生產(chǎn)而言至關(guān)重要。轉(zhuǎn)基因技術(shù)的模式可通過電穿孔、接合、轉(zhuǎn)導(dǎo)或天然轉(zhuǎn)化實(shí)現(xiàn)?？墒褂枚喾N多樣的宿主接合質(zhì)粒和藥物抗性標(biāo)記。根據(jù)可在宿主中發(fā)揮功能的抗生素抗性標(biāo)記的性質(zhì)，為宿主微生物設(shè)計(jì)克隆載體。另外如本文所公開的，經(jīng)遺傳修飾(重組)的微生物可包括除通過質(zhì)粒引入以外的其他修飾，包括對其基因組DNA的修飾。更一般地說，可制備包含分離的多核苷酸的核酸構(gòu)建體，該分離的多核苷酸編碼具有酶活性的多肽，所述分離的多核苷酸有效連接至在與控制序列相容的條件下引導(dǎo)微生物(如大腸桿菌)中編碼序列的表達(dá)的一個或多個(數(shù)個)控制序列?？刹倏v該分離的多核苷酸，從而得到多肽的表達(dá)。在插入載體前對多核苷酸序列的操縱可以是所需的或必要的，具體取決于表達(dá)載體。使用重組DNA方法修飾多核苷酸序列的技術(shù)是本領(lǐng)域沿用已久的。控制序列可以是適當(dāng)?shù)膯幼有蛄?，一種被宿主細(xì)胞識別用于表達(dá)編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸的核苷酸序列。啟動子序列包括介導(dǎo)多肽表達(dá)的轉(zhuǎn)錄控制序列。啟動子可以是在所選宿主細(xì)胞中顯示轉(zhuǎn)錄活性的任何核苷酸序列，包括突變、截?cái)嗪碗s交啟動子，并且可得自與宿主細(xì)胞同源或異源的編碼胞外或胞內(nèi)多肽的基因。引導(dǎo)核酸構(gòu)建體(特別是在大腸桿菌宿主細(xì)胞中)轉(zhuǎn)錄的合適啟動子的例子為lac啟動子(Gronenborn,1976,Mol.Gen.Genet.148:243-250(Gronenborn，1976年，《分子遺傳學(xué)與普通遺傳學(xué)》，第148卷，第243-250頁))、tac啟動子(DeBoereta/.,1983,ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA80:21-25(DeBoer等人，1983年，《美國國家科學(xué)院院刊》，第80卷，第21-25頁))、trc啟動子(Brosiusetal,1985,J.Biol.Chem.260:3539-3541(Brosius等人，1985年，《生物化學(xué)雜志》，第260卷，第3539-3541頁))、T7RNA聚合酶啟動子(StudierandMoffatt,1986,J.MoI.Biol.189:113-130(Studier和Moffatt，1986年，《分子生物學(xué)雜志》，第189卷，第113-130頁))、噬菌體啟動子pL(Elvinetal.,1990,Gene87:123-126(Elvin等人，1990年，《基因》，第87卷，第123-126頁))、tetA啟動子(Skerra,1994,Gene151:131-135(Skerra，1994年，《基因》，第151卷，第131-135頁))、araBAD啟動子(Guzmanetal.,1995,J.Bacteriol.177:4121-4130(Guzman等人，1995年，《細(xì)菌學(xué)雜志》，第177卷，第4121-4130頁))和rhaPBAD啟動子(Haldimannetal.,1998,J.Bacteriol.180:1277-1286(Haldimann等人，1998年，《細(xì)菌學(xué)雜志》，第180卷，第1277-1286頁))。其他啟動子在“Usefulproteinsfromrecombinantbacteria”inScientificAmerican,1980,242:74-94(“來自重組細(xì)菌的有用蛋白”，《科學(xué)美國人》，1980年，第242卷，第74-94頁)；以及SambrookandRussell，“MolecularCloning:ALaboratoryManual，”ThirdEdition2001(volumes1-3),ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y(Sambrook和Russell，“分子克隆實(shí)驗(yàn)指南”，第三版，2001年(第1-3卷)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，紐約冷泉港)中有所描述?？刂菩蛄羞€可以是合適的轉(zhuǎn)錄終止子序列，一種被宿主細(xì)胞識別用于終止轉(zhuǎn)錄的序列。終止序列有效連接至編碼多肽的核苷酸序列的3'端。在大腸桿菌細(xì)胞中發(fā)揮功能的任何終止子都可用于本發(fā)明。也可能有利的是添加調(diào)控序列，該調(diào)控序列可調(diào)節(jié)與宿主細(xì)胞生長有關(guān)的多肽的表達(dá)。調(diào)控系統(tǒng)的例子是那些響應(yīng)于化學(xué)或物理刺激(包括在存在調(diào)控化合物的情況下)而開啟或關(guān)閉基因表達(dá)的調(diào)控系統(tǒng)。原核系統(tǒng)中的調(diào)控系統(tǒng)包括lac、tac和trp操縱子系統(tǒng)。對于本發(fā)明的各種實(shí)施例，遺傳操作和/或修飾可被描述為包括各種遺傳操作，其包括涉及改變在任何相應(yīng)途徑中鑒定的酶或酶活性的調(diào)控，并因此改變酶的最終活性的那些操作。此類遺傳修飾以及本文引用的任何調(diào)節(jié)基因的操作可涉及轉(zhuǎn)錄、翻譯和翻譯后修飾，這些操作會使得酶活性和/或選擇性在選定和/或確定的培養(yǎng)條件下改變，以及/或者涉及提供其他核酸序列，例如以便增大與脂肪酸或脂肪酸衍生產(chǎn)物生產(chǎn)相關(guān)的酶的拷貝數(shù)和/或突變體。實(shí)現(xiàn)此類遺傳修飾和/或調(diào)節(jié)的具體方式和方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，包括但不限于：提高內(nèi)源性遺傳因子的表達(dá)；減弱阻遏子基因的功能；引入異源遺傳因子；增大編碼多肽的核酸序列的拷貝數(shù)，該多肽催化酶轉(zhuǎn)化步驟以生成脂肪酸或脂肪酸衍生產(chǎn)物；使遺傳因子突變以提供突變蛋白來增大酶的比活性；過表達(dá)；低表達(dá)；過表達(dá)伴侶；敲除蛋白酶；改變或修飾反饋抑制；提供酶變體，其包含一個或多個用于結(jié)合阻遏子和/或競爭性抑制因子的受損結(jié)合位點(diǎn)；敲除阻遏子基因；進(jìn)化、選擇和/或其他提高mRNA穩(wěn)定性的方法以及使用具有有效拷貝數(shù)和啟動子的質(zhì)粒實(shí)現(xiàn)有效改善程度的方法?？蓪?shí)施隨機(jī)誘變以提供遺傳修飾，所述遺傳修飾可分成這些或其他規(guī)定方法中的任何方法。遺傳修飾和/或調(diào)節(jié)廣義上還分成所關(guān)注的核酸中一個或多個核酸的添加(包括插入)、缺失(例如，通過突變實(shí)現(xiàn))和置換。在各種實(shí)施例中，遺傳修飾和/或調(diào)節(jié)導(dǎo)致改善的酶比活性和/或酶代謝轉(zhuǎn)換數(shù)。不受限制地，可通過以下中的一者或多者來測量變化：KM、Kcat和K親合力。在各種實(shí)施例中，為了更有效地發(fā)揮功能，微生物可包含一個或多個基因缺失。例如，在大腸桿菌中，編碼乳酸脫氫酶(ldhA)、磷酸乙酰轉(zhuǎn)移酶(pta)、丙酮酸氧化酶(poxB)和丙酮酸甲酸裂解酶(pflB)的基因可能被破壞(包括缺失)。此類基因破壞(包括缺失)并不意味著進(jìn)行限制，并且可在各個實(shí)施例中以各種組合實(shí)現(xiàn)?；蛉笔Э梢酝ㄟ^突變的基因缺失的方法實(shí)現(xiàn)，和/或從這些酶中一者或多者的表達(dá)降低或不表達(dá)的突變株著手，和/或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其他方法。可通過多種已知的具體方法中的任何方法來實(shí)現(xiàn)基因缺失，所述方法包括但不限于使用基因橋公司(GeneBridges)(德國薩克森州德累斯頓的基因橋公司(GeneBridgesGmbH,Dresden,Germany)，<<www.genebridges.com>>)出售的試劑盒和其他試劑進(jìn)行的RED/ET方法。更具體地講，后一種方法，即，使用Red/ET重組的方法，是本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員已知的，并在授予Stewart等人的美國專利No.6,355,412和No.6,509,156中有所描述，所述專利以引用方式并入本文，用于該方法的教導(dǎo)內(nèi)容。上述方法所用的材料和試劑盒可得自基因橋公司(GeneBridges)(德國薩克森州德累斯頓的基因橋公司(GeneBridgesGmbH,Dresden,Germany)，《www.genebridges.com》)，并且可按制造商的說明執(zhí)行該方法。該方法涉及在λ噬菌體的重組酶的作用下進(jìn)行同源重組，從而將靶基因替換為選擇性標(biāo)記。用編碼選擇性標(biāo)記的線狀DNA產(chǎn)物轉(zhuǎn)化表達(dá)λ-Red重組酶的宿主微生物，所述選擇性標(biāo)記兩側(cè)是與靶基因同源的末端區(qū)域(一般含～50bp，或者至多含約～300bp)。隨后該標(biāo)記可通過由攜帶FLP重組酶或另一種重組酶(如，Cre)的質(zhì)粒載體執(zhí)行的另一重組步驟除去?？啥ㄏ蛉コ⑸锶旧wDNA的部分或向微生物染色體添加外來遺傳物質(zhì)，以改變宿主細(xì)胞的代謝，從而減少或消除非預(yù)期代謝產(chǎn)物的生成。在這種一般例子中，這可與其他遺傳修飾(例如本文所述的遺傳修飾)聯(lián)合使用。該具體實(shí)施方式參考了多種實(shí)施例和附圖，在附圖中以舉例說明的方式示出了具體的示例性實(shí)施例，本發(fā)明可通過這些實(shí)施例實(shí)施。這些實(shí)施例已進(jìn)行了充分詳細(xì)的描述，使本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠?qū)嵤┍景l(fā)明，并且應(yīng)當(dāng)理解，技術(shù)人員可對所公開的各種實(shí)施例作出修改。多肽和編碼多肽的核酸可通過標(biāo)準(zhǔn)的DNA誘變技術(shù)(例如，M13引物誘變)制備。SambrookandRussell,2001(Sambrook和Russell，2001年)中提供了這些技術(shù)的細(xì)節(jié)。核酸分子可包含編碼區(qū)的變化，以符合其中將引入該分子的特定微生物的密碼子使用偏好性?；蛘?，利用遺傳密碼的簡并性，使得在核酸序列大幅改變時，其編碼的多肽仍然具有與天然氨基酸序列相同或基本上類似的氨基酸序列，可通過這種方式改變編碼序列，以此改變編碼區(qū)。例如，在開放閱讀框中，核苷酸三聯(lián)體密碼子GCT編碼丙氨酸。由于遺傳密碼的簡并性，其他三個核苷酸三聯(lián)體密碼子(GCA、GCC和GCG)也編碼丙氨酸。因此，在該位置處，開放閱讀框的核酸序列可改變?yōu)檫@三種密碼子中的任一種，而不影響所編碼的多肽的氨基酸序列或該多肽的特性?；谶z傳密碼的簡并性，可使用本文所述的標(biāo)準(zhǔn)DNA誘變技術(shù)或者通過合成核酸序列，從本文所公開的核酸序列獲得核酸變體。因此，對于各種實(shí)施例，本發(fā)明涵蓋了編碼相同多肽卻因遺傳密碼的簡并性而具有不同核酸序列的核酸分子。本發(fā)明還提供了分離的核酸，所述分離的核酸有至少約12個堿基長(例如，至少約13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、50、60、100、250、500、750、1000、1500、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、11000、12000、13000、14000、15000、16000、17000、18000、19000或20000個堿基長)，并在雜交條件下將其與具有本文所列出或以其他方式公開的序列的核酸的正義鏈或反義鏈雜交。所述雜交條件可為適度或高度嚴(yán)格的雜交條件。V.發(fā)酵工藝根據(jù)本發(fā)明，通過本文所述的生物生產(chǎn)途徑，本文所述的微生物被用于生產(chǎn)所需化學(xué)產(chǎn)物(如脂肪酸或脂肪酸衍生物)的發(fā)酵工藝中。不受限制地，可通過向容器(如培養(yǎng)皿或生物反應(yīng)器容器)中加入以下組合物來舉例說明這種工藝：(1)生物生產(chǎn)培養(yǎng)基，(2)營養(yǎng)培養(yǎng)基，例如本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的基本培養(yǎng)基，以及(3)經(jīng)遺傳修飾的微生物的接種物，用于獲得這種微生物(例如細(xì)菌，更具體地講是腸桿菌科的成員，如大腸桿菌)的群體。根據(jù)本發(fā)明的一個方面，所述經(jīng)遺傳修飾的微生物具有將丙二酰輔酶A轉(zhuǎn)化成所選化學(xué)產(chǎn)物的代謝途徑。在容器中培養(yǎng)接種物，以使得細(xì)胞密度增至適于達(dá)到脂肪酸或脂肪酸衍生產(chǎn)物生產(chǎn)水平的細(xì)胞密度，所述生產(chǎn)水平符合所需的整體生產(chǎn)率指標(biāo)。在各種可供選擇的實(shí)施例中，可在第一制備容器中將這些經(jīng)遺傳修飾的微生物群培養(yǎng)至達(dá)到第一細(xì)胞密度，然后將其轉(zhuǎn)移到所述容器中，以獲得所選的細(xì)胞密度。多種多容器培養(yǎng)策略是本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的。A.生物生產(chǎn)培養(yǎng)基(碳源)在本發(fā)明中用于重組微生物的生物生產(chǎn)培養(yǎng)基可包含適于預(yù)期代謝途徑的碳源或底物，所述重組微生物具有脂肪酸或脂肪酸衍生產(chǎn)物的生物合成途徑。合適的底物可包括但不限于：單糖，如葡萄糖和果糖；低聚糖，如乳糖和蔗糖；多糖，如淀粉、纖維素或它們的混合物，以及來自可再生原料(如去蛋白干乳酪清、玉米漿、甜菜糖蜜和大麥芽)的未純化混合物。此外，碳底物也可為一碳底物，如二氧化碳、一氧化碳或甲醇，已證明這些一碳底物能被代謝轉(zhuǎn)化為關(guān)鍵生化中間產(chǎn)物。除了一碳和二碳底物，已知甲基營養(yǎng)微生物還利用多種其他含碳化合物，如甲胺、葡糖胺以及多種參與代謝活動的氨基酸。雖然預(yù)期所有上述碳底物及其混合物均適合在本發(fā)明中作為碳源，但常見的用作碳源的碳底物是各種單體糖和低聚糖，例如葡萄糖、果糖和蔗糖，以及任何這些糖的混合物。其他合適的底物包括木糖、阿拉伯糖、其他纖維素基C5糖、高果糖玉米糖漿，以及各種可商購獲得的其他糖類和糖類混合物?？蓮闹T如甘蔗、甜菜、木薯、香蕉或其他水果以及甜高粱等原料獲得蔗糖。葡萄糖和右旋糖可通過使淀粉基原料(包括谷物，如玉米、小麥、裸麥、大麥和燕麥)糖化來獲得。另外，在一些實(shí)施例中，全部或一部分碳源可為甘油。或者，可將甘油作為附加碳源排除在外。在一個實(shí)施例中，碳源選自葡萄糖、果糖、蔗糖、右旋糖、乳糖、甘油，以及它們的混合物。碳源中這些組分的量可各自不同且獨(dú)立地大于該碳源的約50％、大于約60％、大于約70％、大于約80％、大于約90％或者更多，最高至100％或者基本上100％。此外，已知甲基營養(yǎng)微生物利用多種其他含碳化合物，如甲胺、葡糖胺以及多種參與代謝活動的氨基酸。例如，已知甲基營養(yǎng)型酵母利用來自甲胺的碳生成海藻糖或甘油(Bellionetal.,Microb.GrowthC1Compd.(Int.Symp.),7th(1993),415-32.Editor(s):Murrell,J.Collin；Kelly,DonP.Publisher:Intercept,Andover,UK(Bellion等人，《微生物在C1化合物中的生長》(國際學(xué)術(shù)研討會論文集)，1993年第7版第415-432頁。編輯：Murrell,J.Collin；Kelly,DonP。出版者：英國安多弗Intercept公司))。類似地，假絲酵母屬的各種菌種將代謝丙氨酸或油酸(Sulteretal.,Arch.Microbiol.153:485-489(1990)(Sulter等人，《微生物學(xué)文獻(xiàn)集》，1990年第153卷第485-489頁))。因此，預(yù)期本發(fā)明的實(shí)施例中利用的碳源可涵蓋多種含碳底物。此外，可通過如例如美國專利公布No.2007/0031918A1所述的預(yù)處理和糖化工藝，從纖維素類和木質(zhì)纖維素類生物質(zhì)獲得可發(fā)酵性糖，該專利公布以引用方式并入本文。生物質(zhì)是指任何纖維素或木質(zhì)纖維素材料，包括含有纖維素、并且任選地還含有半纖維素、木質(zhì)素、淀粉、低聚糖和/或單糖的材料。生物質(zhì)還可包含附加組分，例如蛋白質(zhì)和/或脂質(zhì)。生物質(zhì)可來自單一來源，或者生物質(zhì)可包含來自一個以上來源的混合物；例如，生物質(zhì)可包含玉米穗軸和玉米秸稈的混合物，或者禾草和樹葉的混合物。生物質(zhì)包括但不限于：生物能源作物、農(nóng)業(yè)殘余物、城市固體廢棄物、工業(yè)固體廢棄物、造紙污泥、庭院廢棄物、木材和林業(yè)廢棄物。生物質(zhì)的例子包括但不限于：玉米籽粒、玉米穗軸、作物殘余物如玉米苞葉、玉米秸稈、禾草、小麥、小麥秸稈、大麥、大麥秸稈、干草、稻稈、柳枝稷、廢紙、蔗渣、高粱、大豆、由碾磨谷物獲得的組分、樹木、樹枝、根、葉、木片、木屑、灌木和草叢、蔬菜、水果、花和畜肥?？稍谏锷a(chǎn)方法或系統(tǒng)中利用任何此類生物質(zhì)來提供碳源。將纖維素類生物質(zhì)分解成更多可用且可利用的碳分子(包括糖)的混合物的各種方法包括：在存在濃酸或稀酸(如<1％的硫酸)的情況下加熱；用氨處理；用離子鹽處理；酶促降解；以及這些方法的組合。這些方法通常在機(jī)械分離和碾磨之后進(jìn)行，然后則實(shí)施適當(dāng)?shù)姆蛛x過程。在各種實(shí)施例中，向例如在包含反應(yīng)器容器的工業(yè)系統(tǒng)中的微生物提供多種糖(包括但不限于蔗糖、葡萄糖、木糖、纖維素或半纖維素)中的任一種，可在該反應(yīng)器容器中混合確定成分培養(yǎng)基(例如低鹽培養(yǎng)基，包括但不限于M9基本培養(yǎng)基、硫酸鉀基本培養(yǎng)基、酵母合成基本培養(yǎng)基，以及許多其他培養(yǎng)基或這些培養(yǎng)基的變化形式)、提供一種或多種脂肪酸或脂肪酸衍生生物合成替代途徑的微生物接種物、以及碳源。碳源進(jìn)入細(xì)胞并且通過熟知且常見的代謝途徑發(fā)生分解代謝，產(chǎn)生常見的代謝中間產(chǎn)物，包括磷酸烯醇丙酮酸(PEP)。(參見MolecularBiologyoftheCell,3rdEd.,B.Albertsetal.GarlandPublishing,NewYork,1994,pp.42-45,66-74(《細(xì)胞分子生物學(xué)》第3版，B.Alberts等人，紐約加蘭出版社，1994年，第42-45頁，第66-74頁)，該書以引用方式并入，涉及糖的基礎(chǔ)代謝分解途徑的教導(dǎo)內(nèi)容；PrinciplesofBiochemistry,3rdEd.,D.L.Nelson&M.M.Cox,WorthPublishers,NewYork,2000,pp527-658(《生物化學(xué)原理》第3版，D.L.Nelson和M.M.Cox，紐約沃斯出版社，2000年，第527-658頁)，該書以引用方式并入，涉及主要代謝途徑的教導(dǎo)內(nèi)容；以及Biochemistry,4thEd.,L.Stryer,W.H.FreemanandCo.,NewYork,1995,pp.463-650(《生物化學(xué)》第4版，L.Stryer，W.H.弗里曼公司，紐約，1995年，第463-650頁)，該書也以引用方式并入，涉及主要代謝途徑的教導(dǎo)內(nèi)容)。可根據(jù)多種方法(包括但不限于ASTMD6866，或各種其他技術(shù))辨別生物基碳與石油基碳。例如，生物基碳源與石油基碳源相比，其碳14和碳12比例不同，其中生物基碳源中的碳14比例更高。在各種實(shí)施例中，碳源不是石油基的，或者不是石油基為主的。在各種實(shí)施例中，非石油基的碳源比例為大于約50％、大于約60％、大于約70％、大于約80％、大于約90％，或者更多。在各種實(shí)施例中，碳源的碳14與碳12比例為約1.0×10-14或更大，例如，2.0×10-14或更大、3.0×10-14或更大、4.0×10-14或更大、5.0×10-14或更大、6.0×10-14或更大、7.0×10-14或更大、8.0×10-14或更大、9.0×10-14或更大，或者10.0×10-14或更大。任何實(shí)施例的碳源包括C6碳源或C3碳源。任何實(shí)施例的碳源包括一種或多種纖維素糖，如葡萄糖、蔗糖、果糖、右旋糖、乳糖、木糖，或者它們的任意組合。任何實(shí)施例的碳源包含按質(zhì)量計(jì)小于約50％、40％、30％、20％、10％或5％的甘油。B.接種物(微生物)根據(jù)本發(fā)明的發(fā)酵生物生產(chǎn)過程可利用接種物，該接種物包含上文所述的經(jīng)遺傳修飾微生物中的任一種?？稍谶x自本文列表的微生物或另一種合適的微生物中提供本文所述并受權(quán)利要求書保護(hù)的特征，所述微生物還具有一種或多種天然的、引入的或增強(qiáng)的脂肪酸或脂肪酸衍生產(chǎn)物生物生產(chǎn)途徑。因此，在一些實(shí)施例中，所述微生物具有內(nèi)源性脂肪酸或脂肪酸衍生產(chǎn)物生產(chǎn)途徑(在一些此類實(shí)施例中，該途徑可被增強(qiáng))，而在其他實(shí)施例中，所述微生物不具有內(nèi)源性脂肪酸或脂肪酸衍生產(chǎn)物生產(chǎn)途徑。各種各樣的這些經(jīng)遺傳修飾微生物可具有遺傳修飾和/或其他系統(tǒng)變化，正如可能在本發(fā)明人中一位或多位的其他專利申請和/或被轉(zhuǎn)讓給本發(fā)明專利申請所有者的其他專利申請中所描述的那樣。例子描述了對某些細(xì)菌和酵母微生物的具體修改形式和評估。本發(fā)明的范圍并不意味著局限于這些物種，而是普遍適用于多種合適的微生物。一般來講，用于本發(fā)明的微生物可選自細(xì)菌、藍(lán)細(xì)菌、絲狀真菌和酵母。對于一些實(shí)施例，最初為所選化學(xué)產(chǎn)物的生物生產(chǎn)而選定的微生物宿主應(yīng)當(dāng)也能高效率地利用糖類，包括葡萄糖。大多數(shù)細(xì)菌能夠利用碳水化合物。然而，某些環(huán)境微生物不能高效利用碳水化合物，因此對于葡萄糖或其他碳水化合物作為主要附加碳源的實(shí)施例而言，這些環(huán)境微生物不適合作為宿主。隨著各種物種的基因組為人們所知，本發(fā)明可容易地應(yīng)用于越來越多的合適微生物。另外，考慮到遺傳測序的成本相對較低，可容易地測定所關(guān)注物種的遺傳序列，使本發(fā)明所述方面的應(yīng)用更易于實(shí)現(xiàn)(基于遺傳修飾能容易地應(yīng)用于具有已知基因組序列的微生物)。更具體地講，根據(jù)本文所述的各種標(biāo)準(zhǔn)，用于化學(xué)產(chǎn)物的生物生產(chǎn)的合適微生物宿主通?？砂ǖ幌抻冢喝魏胃锾m氏陰性微生物，更具體地講腸桿菌科的成員，如大腸桿菌、食羧寡養(yǎng)菌(Oligotrophacarboxidovorans)或假單胞菌屬物種(Pseudomononassp.)；任何革蘭氏陽性微生物，例如枯草芽孢桿菌、乳桿菌屬物種(Lactobaccilussp)或乳球菌屬物種(Lactococcussp)；酵母，例如釀酒酵母、畢赤酵母(Pichiapastoris)或樹干畢赤酵母(Pichiastipitis)；以及其他種群或微生物物種。更具體地講，用于脂肪酸或脂肪酸衍生產(chǎn)物的生物生產(chǎn)的合適微生物宿主通常包括但不限于這些屬的成員：梭菌屬、發(fā)酵單胞菌屬、埃希桿菌屬、沙門氏菌屬、紅球菌屬、假單胞菌屬、芽孢桿菌屬、乳桿菌屬、腸球菌屬、產(chǎn)堿桿菌屬、克雷伯氏菌屬、類芽孢桿菌屬、節(jié)桿菌屬、棒狀桿菌屬、短桿菌屬、畢赤酵母屬、念珠菌屬、漢遜酵母屬以及酵母屬?？商貏e關(guān)注的宿主包括：食羧寡養(yǎng)菌(如菌株OM5)、大腸桿菌、富養(yǎng)產(chǎn)堿菌(Alcaligeneseutrophus)(鉤蟲貪銅菌(Cupriavidusnecator))、地衣芽孢桿菌、浸麻類芽孢桿菌、紅平紅球菌、惡臭假單胞菌、植物乳桿菌、屎腸球菌、鶉雞腸球菌、糞腸球菌、枯草芽孢桿菌以及釀酒酵母。更具體地講，用于脂肪酸或脂肪酸衍生產(chǎn)物的生物生產(chǎn)的合適微生物宿主通常包括但不限于這些屬的成員：梭菌屬、發(fā)酵單胞菌屬、埃希桿菌屬、沙門氏菌屬、紅球菌屬、假單胞菌屬、芽孢桿菌屬、乳桿菌屬、腸球菌屬、產(chǎn)堿桿菌屬、克雷伯氏菌屬、類芽孢桿菌屬、節(jié)桿菌屬、棒狀桿菌屬、短桿菌屬、畢赤酵母屬、念珠菌屬、漢遜酵母屬以及酵母屬。可特別關(guān)注的宿主包括：食羧寡養(yǎng)菌(如菌株OM5T)、大腸桿菌、富養(yǎng)產(chǎn)堿菌(鉤蟲貪銅菌)、地衣芽孢桿菌、浸麻類芽孢桿菌、紅平紅球菌、惡臭假單胞菌、植物乳桿菌、屎腸球菌、鶉雞腸球菌、糞腸球菌、枯草芽孢桿菌以及釀酒酵母。另外，可將這些物種的任何已知菌株用作起始微生物，如可以是以下物種中的任一種，包括其各自的菌株：巴塞爾貪銅菌(Cupriavidusbasilensis)、肯彭貪銅菌(Cupriaviduscampinensis)、吉拉迪貪銅菌(Cupriavidusgilardi)、Cupriaviduslaharsis、耐重金屬貪銅菌(Cupriavidusmetallidurans)、草酸鹽貪銅菌(Cupriavidusoxalaticus)、偶發(fā)貪銅菌(Cupriaviduspauculus)、Cupriaviduspinatubonensis、呼吸系統(tǒng)貪銅菌(Cupriavidusrespiraculi)以及臺灣貪銅菌(Cupriavidustaiwanensis)。在一些實(shí)施例中，重組微生物為革蘭氏陰性菌。在一些實(shí)施例中，重組微生物選自這些屬：發(fā)酵單胞菌屬、埃希氏菌屬、假單胞菌屬、產(chǎn)堿桿菌屬和克雷伯氏菌屬。在一些實(shí)施例中，重組微生物選自這些種：大腸桿菌、鉤蟲貪銅菌、食羧寡養(yǎng)菌和惡臭假單胞菌。在一些實(shí)施例中，重組微生物為大腸桿菌菌株。在一些實(shí)施例中，重組微生物為革蘭氏陽性菌。在一些實(shí)施例中，重組微生物選自這些屬：梭菌屬、沙門氏菌屬、紅球菌屬、芽孢桿菌屬、乳桿菌屬、腸球菌屬、類芽孢桿菌屬、節(jié)桿菌屬、棒狀桿菌屬以及短桿菌屬。在一些實(shí)施例中，重組微生物選自這些種：地衣芽孢桿菌、浸麻類芽孢桿菌、紅平紅球菌、植物乳桿菌、屎腸球菌、鶉雞腸球菌、糞腸球菌以及枯草芽孢桿菌。在特定實(shí)施例中，重組微生物為枯草芽孢桿菌菌株。在一些實(shí)施例中，重組微生物為酵母。在一些實(shí)施例中，重組微生物選自這些屬：畢赤酵母屬、假絲酵母屬、漢遜酵母屬、克雷伯氏菌屬、伊薩酵母屬(Issatchenkia)以及酵母屬。在特定實(shí)施例中，重組微生物為釀酒酵母。根據(jù)本發(fā)明，還應(yīng)當(dāng)理解，上述微生物中的任一種都可以用于生產(chǎn)除脂肪酸或脂肪酸衍生產(chǎn)物以外的化學(xué)產(chǎn)物。對宿主細(xì)胞進(jìn)行遺傳修飾的能力對于任何重組微生物的生產(chǎn)而言至關(guān)重要。轉(zhuǎn)基因技術(shù)的模式可通過電穿孔、接合、轉(zhuǎn)導(dǎo)或天然轉(zhuǎn)化實(shí)現(xiàn)?？墒褂枚喾N多樣的宿主接合質(zhì)粒和藥物抗性標(biāo)記。根據(jù)可在宿主中發(fā)揮功能的抗生素抗性標(biāo)記的性質(zhì)，為宿主微生物設(shè)計(jì)克隆載體。C.發(fā)酵營養(yǎng)培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件除了合適的碳源(例如選自本文所公開類型之一)以外，生物生產(chǎn)培養(yǎng)基還必須包含合適的礦物質(zhì)、鹽、輔因子、緩沖液和其他組分，這些組分是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，適于培養(yǎng)物生長，并適用于促進(jìn)本發(fā)明化學(xué)產(chǎn)物生物生產(chǎn)所必需的酶途徑。本發(fā)明的另一方面涉及培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，所述培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件包含本發(fā)明的經(jīng)遺傳修飾的微生物和任選的補(bǔ)充物。細(xì)胞通常在約25℃至約40℃的溫度范圍內(nèi)生長于合適的培養(yǎng)基中，對于嗜熱微生物來說，溫度也可高至70℃。本發(fā)明中的合適生長培養(yǎng)基為常見的商業(yè)制備培養(yǎng)基，例如LuriaBertani(LB)肉湯、Terrific肉湯(TB)、M9基本培養(yǎng)基、Sabouraud右旋糖(SD)肉湯、酵母培養(yǎng)基(YM)肉湯、(Ymin)酵母合成基本培養(yǎng)基，以及如本文所述的基本培養(yǎng)基，如M9基本培養(yǎng)基。也可使用其他確定成分的或合成的生長培養(yǎng)基，并且用于特定微生物生長的合適培養(yǎng)基將是微生物學(xué)或生物生產(chǎn)科學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的。在各種實(shí)施例中，可開發(fā)并使用一種基本培養(yǎng)基，該基本培養(yǎng)基不包含各種組分或包含低添加水平的各種組分，例如小于10、5、2或1g/L的復(fù)合氮源，所述復(fù)合氮源包括但不限于酵母提取物、蛋白胨、胰蛋白胨、大豆粉、玉米漿或酪蛋白。這些基本培養(yǎng)基也可具有有限補(bǔ)充的維生素混合物，所述維生素混合物包括生物素、維生素B12和維生素B12衍生物、硫胺素、泛酸以及其他維生素。基本培養(yǎng)基也可具有有限的簡單無機(jī)營養(yǎng)物源，所述簡單無機(jī)營養(yǎng)物源包含：小于28、17或2.5mM的磷酸鹽，小于25或4mM的硫酸鹽，以及小于130或50mM的總氮。用于生物生產(chǎn)的合適pH范圍為pH3.0至pH10.0，其中pH6.0至pH8.0為初始條件的典型pH范圍。例如，pH可為2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0或10.0。然而，這些pH范圍并非意在限制用于特定實(shí)施例的實(shí)際培養(yǎng)條件。生物生產(chǎn)可在有氧條件、微氧條件或無氧條件下進(jìn)行，伴隨或不伴隨攪拌。在各種實(shí)施例中，還可向包含此類微生物群體的生物反應(yīng)器容器中加入特定補(bǔ)充物，以進(jìn)一步改進(jìn)所述方法和系統(tǒng)。D.生物生產(chǎn)反應(yīng)器和系統(tǒng)利用根據(jù)本發(fā)明的方法和/或組合物的發(fā)酵系統(tǒng)也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)?？蓪⑷绫疚乃龊?或提及的任何重組微生物引入工業(yè)生物生產(chǎn)系統(tǒng)，在該系統(tǒng)中，微生物通過商業(yè)上可行的操作將碳源轉(zhuǎn)化為脂肪酸或脂肪酸衍生產(chǎn)物。生物生產(chǎn)系統(tǒng)包括將此類重組微生物引入生物反應(yīng)器容器(該生物反應(yīng)器容器具有適合該重組微生物生長的碳源底物和生物生產(chǎn)培養(yǎng)基)，并且將該生物生產(chǎn)系統(tǒng)維持在合適的溫度范圍內(nèi)(并且如果反應(yīng)在有氧或微氧條件下進(jìn)行，還要將生物生產(chǎn)系統(tǒng)維持在合適的溶解氧濃度范圍內(nèi))持續(xù)合適的時間，以獲得將底物分子的一部分轉(zhuǎn)化為所選化學(xué)產(chǎn)物的期望結(jié)果。工業(yè)生物生產(chǎn)系統(tǒng)及其操作是化學(xué)工程和生物工藝工程領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知的。生物生產(chǎn)可在有氧條件、微氧條件或無氧條件下進(jìn)行，伴隨或不伴隨攪拌。為實(shí)現(xiàn)有氧、微氧和無氧條件而對培養(yǎng)物和微生物群體進(jìn)行的操作是本領(lǐng)域已知的，并且可以監(jiān)控包含營養(yǎng)培養(yǎng)基和此類微生物群體的液體培養(yǎng)物的溶解氧水平，以維持或確認(rèn)所需的有氧、微氧或無氧條件。當(dāng)使用合成氣作為原料時，可利用有氧、微氧或無氧條件。當(dāng)使用糖時，可在各種實(shí)施例中實(shí)現(xiàn)厭氧、有氧或微氧條件。可將如本文所述和/或提及的任何重組微生物引入工業(yè)生物生產(chǎn)系統(tǒng)，在該系統(tǒng)中微生物通過商業(yè)上可行的操作將碳源轉(zhuǎn)化為選定化學(xué)產(chǎn)物。生物生產(chǎn)系統(tǒng)包括將此類重組微生物引入生物反應(yīng)器容器(該生物反應(yīng)容器具有適合該重組微生物生長的碳源底物和生物生產(chǎn)培養(yǎng)基)，并且將該生物生產(chǎn)系統(tǒng)維持在合適的溫度范圍內(nèi)(并且如果反應(yīng)在有氧或微氧條件下進(jìn)行，還將生物生產(chǎn)系統(tǒng)維持在合適的溶解氧濃度范圍內(nèi))持續(xù)合適的時間，以獲得將底物分子的一部分轉(zhuǎn)化為選定化學(xué)產(chǎn)物的期望結(jié)果。在各種實(shí)施例中，向例如在包含反應(yīng)器容器的工業(yè)系統(tǒng)中的微生物提供合成氣組分或糖，可在該反應(yīng)器容器中混合確定成分培養(yǎng)基(例如包括但不限于M9基本培養(yǎng)基、硫酸鉀基本培養(yǎng)基、酵母合成基本培養(yǎng)基以及許多其他培養(yǎng)基或這些培養(yǎng)基的變型形式的基本鹽培養(yǎng)基)、提供本文所提出生物合成途徑的實(shí)施例的微生物接種物和碳源。碳源進(jìn)入細(xì)胞并且通過熟知且常見的代謝途徑發(fā)生分解代謝，產(chǎn)生常見的代謝中間產(chǎn)物，包括磷酸烯醇丙酮酸(PEP)或乙酰輔酶A。(參見MolecularBiologyoftheCell,3rdEd.,B.Albertsetal.GarlandPublishing,NewYork,1994,pp.42-45,66-74(《分子細(xì)胞生物學(xué)》第3版，B.Alberts等人，紐約加蘭出版社，1994年，第42-45頁，第66-74頁)，該書以引用方式并入，涉及糖的基礎(chǔ)代謝分解途徑的教導(dǎo)內(nèi)容；PrinciplesofBiochemistry,3rdEd.,D.L.Nelson&M.M.Cox,WorthPublishers,NewYork,2000,pp.527-658(《生物化學(xué)原理》第3版，D.L.Nelson和M.M.Cox，紐約沃斯出版社，2000年，第527-658頁)，該書以引用方式并入，涉及主要代謝途徑的教導(dǎo)內(nèi)容；以及Biochemistry,4thEd.,L.Stryer,W.H.FreemanandCo.,NewYork,1995,pp.463-650(《生物化學(xué)》第4版，L.Stryer，W.H.弗里曼公司，紐約，1995年，第463-650頁)，該書也以引用方式并入，涉及主要代謝途徑的教導(dǎo)內(nèi)容)。此外對于各種類型的工業(yè)生物生產(chǎn)而言，本發(fā)明的各種實(shí)施例可使用分批式的工業(yè)生物反應(yīng)器。經(jīng)典的分批生物反應(yīng)器系統(tǒng)被認(rèn)為是“封閉”的，意味著在相應(yīng)的生物生產(chǎn)事件開始時培養(yǎng)基組成就已確定，并且在隨生物生產(chǎn)事件結(jié)束而基本結(jié)束的這段時間內(nèi)，不人為改變培養(yǎng)基組成或添加培養(yǎng)基。因此，生物生產(chǎn)事件開始時，用所需的一種或多種微生物接種培養(yǎng)基，然后生物生產(chǎn)即可在不向系統(tǒng)中添加任何物質(zhì)的情況下進(jìn)行。但是，“分批”式生物生產(chǎn)事件通常分批添加碳源，并且經(jīng)常試圖控制例如pH和氧濃度之類的因素。在分批系統(tǒng)中，系統(tǒng)的代謝物和生物質(zhì)組合物不斷變化，直到生物生產(chǎn)事件停止。在分批培養(yǎng)物內(nèi)，細(xì)胞從靜態(tài)停滯期緩慢上升到高速生長對數(shù)期，最終達(dá)到穩(wěn)定期，此時生長速率減緩或停止。如果不加處理，穩(wěn)定期中的細(xì)胞將最終死亡。對數(shù)期的細(xì)胞一般負(fù)責(zé)產(chǎn)生大部分的所需終產(chǎn)物或中間體。標(biāo)準(zhǔn)分批系統(tǒng)的變型形式是補(bǔ)料分批系統(tǒng)。補(bǔ)料分批生物生產(chǎn)工藝也適用于本發(fā)明并且包括典型的分批系統(tǒng)，不同的是隨著生物生產(chǎn)的進(jìn)行遞增地添加營養(yǎng)物質(zhì)(包括底物)。當(dāng)分解代謝物抑制趨于抑制細(xì)胞的代謝并且人們期望在培養(yǎng)基中維持有限量底物的情況下，補(bǔ)料分批系統(tǒng)是有用的。可例如通過在不同時間分析樣品直接測定補(bǔ)料分批系統(tǒng)中的實(shí)際營養(yǎng)物質(zhì)濃度，或根據(jù)可測定因素(例如pH、溶解氧和廢氣(例如CO2)的分壓)的變化來估計(jì)補(bǔ)料分批系統(tǒng)中的實(shí)際營養(yǎng)物質(zhì)濃度。分批方法和補(bǔ)料分批方法是本領(lǐng)域中常用且熟知的方法，其例子可見于如下文獻(xiàn)：ThomasD.BrockinBiotechnology:ATextbookofIndustrialMicrobiology,SecondEdition(1989)SinauerAssociates,Inc.,Sunderland,Mass(ThomasD.Brock，《生物技術(shù)：工業(yè)微生物學(xué)教材》第2版，1989年，由位于馬薩諸塞州桑德蘭的SinauerAssociates有限公司出版)、Deshpande,MukundV.,Appl.Biochem.Biotechnol.,36:227,(1992)(Deshpande和MukundV，《生物技術(shù)與應(yīng)用生物化學(xué)》，第36卷，第227頁，1992年)以及BiochemicalEngineeringFundamentals,2ndEd.J.E.BaileyandD.F.Ollis,McGrawHill,NewYork,1986(《生物化學(xué)工程基礎(chǔ)》第2版，J.E.Bailey和D.F.Ollis，紐約麥格勞-希爾出版社，1986年)，這些文獻(xiàn)均以引用方式并入本文，用于生物生產(chǎn)的一般性指導(dǎo)。盡管本發(fā)明的實(shí)施例可用分批模式或補(bǔ)料分批模式進(jìn)行，但設(shè)想本發(fā)明將適用于連續(xù)生物生產(chǎn)方法。連續(xù)生物生產(chǎn)被視為“開放”系統(tǒng)，在該系統(tǒng)中，將確定成分的生物生產(chǎn)培養(yǎng)基連續(xù)加入生物反應(yīng)器中，同時移出等量的條件培養(yǎng)基以供加工。連續(xù)生物生產(chǎn)一般將培養(yǎng)物維持在可控的密度范圍內(nèi)，在這種情況下細(xì)胞主要呈對數(shù)期生長。連續(xù)生物反應(yīng)器操作有兩種類型，包括恒化器，其中將新鮮培養(yǎng)基送入容器，同時以相同速率移出容器內(nèi)容物。這種方法的局限性在于會損失細(xì)胞，并且一般不能達(dá)到高細(xì)胞密度。實(shí)際上，通常人們可通過補(bǔ)料分批工藝獲得高得多的細(xì)胞密度。另一種連續(xù)生物反應(yīng)器采用灌注培養(yǎng)，灌注培養(yǎng)類似于恒化器方法，不同之處在于用分離技術(shù)處理從容器中移出的料流，通過該分離技術(shù)將活細(xì)胞回收至容器中。這種類型的連續(xù)生物反應(yīng)器操作經(jīng)證實(shí)能產(chǎn)生顯著高于補(bǔ)料分批的細(xì)胞密度，并且可以連續(xù)操作。連續(xù)生物生產(chǎn)特別有利于工業(yè)操作，因?yàn)槠涔?jié)省了與進(jìn)行下一次生物生產(chǎn)事件所需的排空、清潔和準(zhǔn)備設(shè)備相關(guān)的停工時間。此外，相對于以分批模式運(yùn)行下游的單元操作(例如，蒸餾)而言，連續(xù)操作通常更經(jīng)濟(jì)。連續(xù)生物生產(chǎn)允許調(diào)節(jié)影響細(xì)胞生長或終產(chǎn)物濃度的一個因素或任何數(shù)目的因素。例如，一種方法將限制性營養(yǎng)物質(zhì)(例如，碳源或氮水平)維持在固定速率，并允許適度調(diào)節(jié)所有其他參數(shù)。在其他系統(tǒng)中，影響生長的許多因素可以連續(xù)改變，而通過培養(yǎng)基濁度測量的細(xì)胞濃度保持不變。調(diào)節(jié)連續(xù)生物生產(chǎn)工藝中的營養(yǎng)物質(zhì)和生長因素的方法以及使產(chǎn)物形成的速率最大化的技術(shù)是工業(yè)微生物領(lǐng)域熟知的，Brock(見上文)詳述了多種方法。設(shè)想可通過分批、補(bǔ)料分批或連續(xù)工藝來實(shí)施本發(fā)明的實(shí)施例，并且任何已知的生物生產(chǎn)模式均適用。設(shè)想可將細(xì)胞固定在惰性支架上作為全細(xì)胞催化劑并且經(jīng)受適合生物生產(chǎn)化學(xué)產(chǎn)物的生物生產(chǎn)條件，或可在容器(例如培養(yǎng)容器)中的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞。因此，此類工藝中所用的實(shí)施例以及使用這些工藝的生物生產(chǎn)系統(tǒng)中所用的實(shí)施例包括，本發(fā)明的經(jīng)遺傳修飾的微生物群體、在培養(yǎng)基(包含用于此類群體的營養(yǎng)物質(zhì))中包含此類群體的培養(yǎng)系統(tǒng)以及制備選定化學(xué)產(chǎn)物的方法。本發(fā)明的實(shí)施例包括在生物生產(chǎn)系統(tǒng)中制備選定化學(xué)產(chǎn)物的方法，其中一些方法可包括在此類生物生產(chǎn)事件后獲得脂肪酸或脂肪酸衍生產(chǎn)物。例如，制備脂肪酸或脂肪酸衍生產(chǎn)物的方法可包括：向培養(yǎng)容器提供包含合適營養(yǎng)物質(zhì)的培養(yǎng)基；向培養(yǎng)容器提供包含本文所述遺傳修飾的經(jīng)遺傳修飾微生物的接種物，使得微生物從合成氣和/或糖分子中產(chǎn)生選定化學(xué)產(chǎn)物；以及將培養(yǎng)容器維持在合適的條件下，以便經(jīng)遺傳修飾微生物產(chǎn)生選定化學(xué)產(chǎn)物。在生物生產(chǎn)方法和系統(tǒng)(包括用于產(chǎn)生選定化學(xué)產(chǎn)物的工業(yè)生物生產(chǎn)系統(tǒng))中，產(chǎn)生經(jīng)遺傳工程改造的重組微生物并利用其來修飾一個或多個方面，從而相比于缺少該一種或多種修飾的對照微生物，使化學(xué)產(chǎn)物的生物產(chǎn)量有效增加至少20％，這也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。在各種實(shí)施例中，本發(fā)明涉及用于生物生產(chǎn)如本文所述化學(xué)產(chǎn)物的系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包括：適用于微生物細(xì)胞培養(yǎng)的發(fā)酵罐、用于將內(nèi)容物從發(fā)酵罐排放至萃取和/或分離容器的管線以及適用于從細(xì)胞培養(yǎng)廢液中移出化學(xué)產(chǎn)物的萃取和/或分離容器。在各種實(shí)施例中，該系統(tǒng)包括一個或多個預(yù)發(fā)酵罐、蒸餾塔、離心器、反萃取塔、混合容器或它們的組合。以下已發(fā)表資源以引用方式并入本文，其相應(yīng)教導(dǎo)內(nèi)容表示這些相關(guān)領(lǐng)域中的技術(shù)水平，并且根據(jù)需要為如下公開內(nèi)容提供支持，所述公開內(nèi)容指導(dǎo)如何在工業(yè)系統(tǒng)中于本發(fā)明生產(chǎn)條件下由糖源工業(yè)生物生產(chǎn)化學(xué)產(chǎn)物的制備和使用方法，所述工業(yè)系統(tǒng)可用于通過本發(fā)明的任何重組微生物來實(shí)現(xiàn)這種轉(zhuǎn)化(BiochemicalEngineeringFundamentals,2ndEd.J.E.BaileyandD.F.Ollis,McGrawHill,NewYork,1986(《生物化學(xué)工程基礎(chǔ)》第2版，J.E.Bailey和D.F.Ollis，紐約麥格勞-希爾出版社，1986年)，全書用作指示性目的并且第9章第533-657頁特別涉及生物反應(yīng)器設(shè)計(jì)；UnitOperationsofChemicalEngineering,5thEd.,W.L.McCabeetal.,McGrawHill,NewYork1993(《化學(xué)工程單元操作》第5版，W.L.McCabe等人，紐約麥格勞-希爾出版社，1993年)，全書用作指示性目的并特別涉及對處理和分離技術(shù)的分析；EquilibriumStagedSeparations,P.C.Wankat,PrenticeHall,EnglewoodCliffs,NJUSA,1988(《平衡級分離》，P.C.Wankat，美國新澤西州恩格爾伍德克利夫斯普倫蒂斯霍爾出版社，1988年)，全書涉及分離技術(shù)教導(dǎo)內(nèi)容)。F.生產(chǎn)指標(biāo)在一些實(shí)施例中，該遺傳修飾使微生物合成選定脂肪酸或脂肪酸衍生化學(xué)產(chǎn)物的速率或滴度增加超過缺少所述至少一種遺傳修飾的對照微生物產(chǎn)生選定化學(xué)產(chǎn)物的速率或滴度。在一些實(shí)施例中，該遺傳修飾能有效增加酶轉(zhuǎn)化成選定化學(xué)產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化率，相比于缺少該遺傳修飾的對照微生物的酶轉(zhuǎn)化率增加至少約5％、至少約10％、至少約20％、至少約30％或至少約50％。在各種實(shí)施例中，例如使用本文所公開的方法之一，選定化學(xué)產(chǎn)物的生物產(chǎn)量可達(dá)到至少1、至少2、至少5、至少10、至少20、至少30、至少40和至少50克/升的滴度。由于本文所公開的進(jìn)展涉及選定化學(xué)產(chǎn)物的商業(yè)發(fā)酵，可通過理解這些進(jìn)展來實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的實(shí)施例，因此可將本發(fā)明的實(shí)施例與其他遺傳修飾和/或方法或系統(tǒng)調(diào)節(jié)結(jié)合，以便獲得能有效產(chǎn)生化學(xué)產(chǎn)物(例如，脂肪酸或脂肪酸衍生物)的微生物(以及相應(yīng)的方法)，所產(chǎn)生的化學(xué)產(chǎn)物為每升最終發(fā)酵液(例如，用過的發(fā)酵液)至少10、至少20、至少30、至少40、至少45、至少50、至少80、至少100或至少120克，該產(chǎn)率用本文所公開的比生產(chǎn)率和/或體積生產(chǎn)率實(shí)現(xiàn)。生物生產(chǎn)培養(yǎng)基中所產(chǎn)生的化學(xué)產(chǎn)物量一般可采用本領(lǐng)域已知的多種方法來測定，例如高效液相色譜法(HPLC)、氣相色譜法(GC)或氣質(zhì)聯(lián)用法(GC/MS)。經(jīng)遺傳修飾微生物群體的比生產(chǎn)率的意外增加可通過以下方法和系統(tǒng)來實(shí)現(xiàn)，其中，微生物除了具有增加的丙二酰輔酶A依賴性脂肪酰輔酶A生產(chǎn)途徑的活性之外，還具有從丙二酰輔酶A轉(zhuǎn)化為選定化學(xué)產(chǎn)物的微生物生產(chǎn)途徑，以及降低的脂肪酸合酶系統(tǒng)的選定酶(更具體地講，為其丙二酰-ACP依賴性脂肪酸延長酶)的酶活性。在一些實(shí)施例中，使用本文所述的經(jīng)遺傳修飾微生物來進(jìn)行微生物化學(xué)生物生產(chǎn)事件(即使用培養(yǎng)的微生物群體來進(jìn)行的發(fā)酵事件)，其中比生產(chǎn)率為每克微生物細(xì)胞(以干重計(jì))每小時產(chǎn)生0.01和0.60克之間的選定化學(xué)產(chǎn)物(g化學(xué)產(chǎn)物/gDCW-hr)。在各種實(shí)施例中，比生產(chǎn)率大于0.01、大于0.05、大于0.10、大于0.15、大于0.20、大于0.25、大于0.30、大于0.35、大于0.40、大于0.45或大于0.50g化學(xué)產(chǎn)物/gDCW-hr。在特定的微生物化學(xué)生產(chǎn)事件中，可在2、4、6、8、12或24小時內(nèi)評估比生產(chǎn)率。更具體地講，化學(xué)產(chǎn)物的比生產(chǎn)率介于0.05g和0.10g之間、0.10g和0.15g之間、0.15g和0.20g之間、0.20g和0.25g之間、0.25g和0.30g之間、0.30g和0.35g之間、0.35g和0.40g之間、0.40g和0.45g之間或0.45g和0.50g之間的化學(xué)產(chǎn)物/gDCW-hr、0.50g和0.55g之間或0.55g和0.60g之間的化學(xué)產(chǎn)物/gDCW-hr。各實(shí)施例均包括表現(xiàn)出這種生產(chǎn)率的培養(yǎng)系統(tǒng)。另外，在本發(fā)明的各種實(shí)施例中，所達(dá)到的體積生產(chǎn)率可為約0.25g脂肪酸(或其他化學(xué)產(chǎn)物)/升/小時(g(化學(xué)產(chǎn)物)/L-hr)，可大于約0.25g脂肪酸(或其他化學(xué)產(chǎn)物)/L-hr，可大于約0.50g脂肪酸(或其他化學(xué)產(chǎn)物)/L-hr，可大于約1.0g脂肪酸(或其他化學(xué)產(chǎn)物)/L-hr，可大于約1.50g脂肪酸(或其他化學(xué)產(chǎn)物)/L-hr，可大于約2.0g脂肪酸(或其他化學(xué)產(chǎn)物)/L-hr，可大于約2.50g脂肪酸(或其他化學(xué)產(chǎn)物)/L-hr，可大于約3.0g脂肪酸(或其他化學(xué)產(chǎn)物)/L-hr，可大于約3.50g脂肪酸(或其他化學(xué)產(chǎn)物)/L-hr，可大于約4.0g脂肪酸(或其他化學(xué)產(chǎn)物)/L-hr，可大于約4.50g脂肪酸(或其他化學(xué)產(chǎn)物)/L-hr，可大于約5.0g脂肪酸(或其他化學(xué)產(chǎn)物)/L-hr，可大于約5.50g脂肪酸(或其他化學(xué)產(chǎn)物)/L-hr，可大于約6.0g脂肪酸(或其他化學(xué)產(chǎn)物)/L-hr，可大于約6.50g脂肪酸(或其他化學(xué)產(chǎn)物)/L-hr，可大于約7.0g脂肪酸(或其他化學(xué)產(chǎn)物)/L-hr，可大于約7.50g脂肪酸(或其他化學(xué)產(chǎn)物)/L-hr，可大于約8.0g脂肪酸(或其他化學(xué)產(chǎn)物)/L-hr，可大于約8.50g脂肪酸(或其他化學(xué)產(chǎn)物)/L-hr，可大于約9.0g脂肪酸(或其他化學(xué)產(chǎn)物)/L-hr，可大于約9.50g脂肪酸(或其他化學(xué)產(chǎn)物)/L-hr，可大于約10.0g脂肪酸(或其他化學(xué)產(chǎn)物)/L-hr。在一些實(shí)施例中，24小時的發(fā)酵(培養(yǎng))時間內(nèi)所測得的比生產(chǎn)率可大于約0.01g、0.05g、0.10g、0.20g、0.5g、1.0g、2.0g、3.0g、4.0g、5.0g、6.0g、7.0g、8.0g、9.0g、10.0g、11.0g或12.0g化學(xué)產(chǎn)物/gDCW的微生物(基于24小時結(jié)束時的最終DCW)。在本發(fā)明的各個方面和各種實(shí)施例中，微生物的比生產(chǎn)率獲得了大幅度的增加，這推動了微生物化學(xué)生產(chǎn)(例如，脂肪酸(但不限于脂肪酸))在發(fā)酵領(lǐng)域中的發(fā)展并提高了其商業(yè)經(jīng)濟(jì)可行性。換言之，在各種實(shí)施例中，比生產(chǎn)率超過(至少為)0.01g化學(xué)產(chǎn)物/gDCW-hr，超過(至少為)0.05g化學(xué)產(chǎn)物/gDCW-hr，超過(至少為)0.10g化學(xué)產(chǎn)物/gDCW-hr，超過(至少為)0.15g化學(xué)產(chǎn)物/gDCW-hr，超過(至少為)0.20g化學(xué)產(chǎn)物/gDCW-hr，超過(至少為)0.25g化學(xué)產(chǎn)物/gDCW-hr，超過(至少為)0.30g化學(xué)產(chǎn)物/gDCW-hr，超過(至少為)0.35g化學(xué)產(chǎn)物/gDCW-hr，超過(至少為)0.40g化學(xué)產(chǎn)物/gDCW-hr，超過(至少為)0.45g化學(xué)產(chǎn)物/gDCW-hr，超過(至少為)0.50g化學(xué)產(chǎn)物/gDCW-hr，超過(至少為)0.60g化學(xué)產(chǎn)物/gDCW-hr。根據(jù)本發(fā)明的某些實(shí)施例，化學(xué)產(chǎn)物為脂肪酸或脂肪酸衍生產(chǎn)物。更一般地說，基于本文所述的遺傳修飾的各種組合，可選地結(jié)合本文所述的補(bǔ)充劑，本文所述的脂肪酸或脂肪酸衍生產(chǎn)物以及其他化學(xué)產(chǎn)物的比生產(chǎn)率值可超過0.01g化學(xué)產(chǎn)物/gDCW-hr，可超過0.05g化學(xué)產(chǎn)物/gDCW-hr，可超過0.10g化學(xué)產(chǎn)物/gDCW-hr，可超過0.15g化學(xué)產(chǎn)物/gDCW-hr，可超過0.20g化學(xué)產(chǎn)物/gDCW-hr，可超過0.25g化學(xué)產(chǎn)物/gDCW-hr，可超過0.30g化學(xué)產(chǎn)物/gDCW-hr，可超過0.35g化學(xué)產(chǎn)物/gDCW-hr，可超過0.40g化學(xué)產(chǎn)物/gDCW-hr，可超過0.45g化學(xué)產(chǎn)物/gDCW-hr，并且可超過0.50g或0.60g化學(xué)產(chǎn)物/gDCW-hr。在特定的微生物化學(xué)生產(chǎn)事件中，可在2、4、6、8、12或24小時內(nèi)評估這種比生產(chǎn)率。通過本發(fā)明的實(shí)施例實(shí)現(xiàn)的改進(jìn)可由與缺少本文所提出的特定遺傳修飾組合的合適對照微生物(含有或不含有本文所提出的補(bǔ)充劑，該補(bǔ)充劑被添加至含有該微生物群體的容器中)相比時，比生產(chǎn)率增加的百分比或體積生產(chǎn)率增加的百分比來確定。對于具體實(shí)施例和具體實(shí)施例組而言，這種比生產(chǎn)率和/或體積生產(chǎn)率改進(jìn)為超過此類合適對照微生物的相應(yīng)比生產(chǎn)率和/或體積生產(chǎn)率至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少100％、至少200％、至少300％、至少400％和至少500％。以引用方式并入的特定方法、說明書教導(dǎo)內(nèi)容和/或引用的參考文獻(xiàn)可并入實(shí)例中。另外，在各種實(shí)施例中，化學(xué)產(chǎn)物的產(chǎn)量可達(dá)到至少1、至少2、至少5、至少10、至少20、至少30、至少40和至少50g/L的滴度。這些指標(biāo)可適用于任何組成部分，例如產(chǎn)生化學(xué)產(chǎn)物的經(jīng)遺傳修飾微生物、方法，以及系統(tǒng)(例如，利用本文所公開的經(jīng)遺傳修飾微生物和/或方法的發(fā)酵系統(tǒng))。應(yīng)當(dāng)理解，使用本文所提供的策略和方法以及基于途徑和途徑部分的相互關(guān)系的發(fā)現(xiàn)而產(chǎn)生的迭代改進(jìn)，可在生物生產(chǎn)事件結(jié)束時獲得甚至更大的化學(xué)產(chǎn)物生物產(chǎn)量。VI.所產(chǎn)生的產(chǎn)物―化學(xué)產(chǎn)物本文所述的新型生物生產(chǎn)途徑、發(fā)酵工藝和經(jīng)遺傳修飾微生物經(jīng)工程改造用于產(chǎn)生各種所關(guān)注的化學(xué)產(chǎn)物。其中一種化學(xué)產(chǎn)物可以是從4個到大于18個碳(例如，5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個碳原子或更多碳原子)的任意鏈長的脂肪酸。這組化學(xué)產(chǎn)物包括：丁酸鹽或丁酸、戊酸鹽或戊酸、己酸鹽或己酸、庚酸鹽或庚酸、辛酸鹽或辛酸、壬酸鹽或壬酸、癸酸鹽或癸酸、十一酸鹽或十一酸、十二酸鹽或十二酸、十三酸鹽或十三酸、十四酸鹽或十四酸、十五酸鹽或十五酸、十六酸鹽或十六酸、十七酸鹽或十七酸、十八酸鹽或十八酸、十九酸鹽或十九酸、二十酸鹽或二十酸。這些脂肪酸產(chǎn)物可利用脂肪酰輔酶A硫酯酶或蠟酯合酶的活性由脂肪酰輔酶A中間體產(chǎn)生?；蛘?，這些脂肪酸還可如下由脂肪酰輔酶A中間體產(chǎn)生：首先利用脂肪酰輔酶A磷酸轉(zhuǎn)移酶的協(xié)同活性產(chǎn)生脂肪酰基磷酸酯，然后利用脂肪酸激酶的活性由脂肪酰基磷酸酯產(chǎn)生脂肪酸。另一種化學(xué)產(chǎn)物可以是從4個到大于18個碳(例如5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個碳原子或更多碳原子)的任意鏈長的脂肪醛。這組化學(xué)產(chǎn)物包括：丁醛、戊醛、己醛、庚醛、辛醛、壬醛、癸醛、十一醛、十二醛、十三醛、十四醛、十五醛、十六醛、十七醛、十八醛、十九醛和二十醛。這些醛產(chǎn)物可利用脂肪酰輔酶A還原酶或酰基輔酶A還原酶的活性由脂肪酰輔酶A中間體產(chǎn)生。形成脂肪酸的生產(chǎn)菌株也可用于產(chǎn)生脂肪醛。另一種化學(xué)產(chǎn)物可以是從4個到大于18個碳(例如5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個碳原子或更多碳原子)的任意鏈長的脂肪醇。這組化學(xué)產(chǎn)物包括：丁醇、戊醇、己醇、庚醇、辛醇、壬醇、癸醇、十一醇、十二醇、十三醇、十四醇、十五醇、十六醇、十七醇、十八醇、十九醇和二十醇。這些脂肪酸產(chǎn)物可利用醛還原酶的活性由脂肪醛產(chǎn)生。形成脂肪酸的生產(chǎn)菌還可用于通過表達(dá)編碼將脂肪酰輔酶A或游離脂肪酸轉(zhuǎn)化為脂肪醇的酶的基因來產(chǎn)生脂肪醇。這些酶的例子包括形成醇的?；o酶A還原酶(EC1.2.1.-)、長鏈脂肪酰輔酶A還原酶(EC1.2.1.50)、醇脫氫酶(EC1.1.1.1)或醛脫氫酶(EC1.2.1.-)和醇脫氫酶的組合。不動桿菌屬物種ADP1的fabG基因(登錄號為YP_047869)提供了具有脂肪酰輔酶A還原酶活性的多肽。家蠶(Bombyxmori)的FAR-N_SDR_e基因(登錄號為BAC79425)提供了具有脂肪酰還原酶活性的多肽。嗜熱脫氮芽孢桿菌(Geobacillusthermodenitrificans)NG80-2的ALDH基因(登錄號為YP_001125970)提供了具有醛脫氫酶的多肽。大腸桿菌的yqhD基因(登錄號為AP_003562.1)提供了具有醇脫氫酶活性的多肽。這些活性的其他來源是本領(lǐng)域已知的，并且可結(jié)合用于生成產(chǎn)生脂肪醇的生產(chǎn)菌株。另一種化學(xué)產(chǎn)物可以是從4個到大于18個碳(例如5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個碳原子或更多碳原子)的任意鏈長的α-烯烴。另一種化學(xué)產(chǎn)物可以是從4個到大于18個碳(例如5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個碳原子或更多碳原子)的任意鏈長的烷烴。另一種化學(xué)產(chǎn)物可以是從4個到大于18個碳(例如5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個碳原子或更多碳原子)的任意鏈長的二元酸。這些脂肪酸衍生產(chǎn)物可利用本領(lǐng)域已知的酶所催化的ω-氧化作用或末端氧化作用由脂肪酸產(chǎn)生。這些產(chǎn)物中的任何一者都可在本文中描述為選定化學(xué)產(chǎn)物或所關(guān)注的化學(xué)產(chǎn)物，或描述為脂肪酸產(chǎn)物、脂肪酸衍生物或脂肪酸產(chǎn)物衍生物。另外，以上列出的任何分組(包括任何子組)可被認(rèn)為是“選定化學(xué)產(chǎn)物”、“所關(guān)注的化學(xué)產(chǎn)物”等等所指代的內(nèi)容。對于這些化學(xué)產(chǎn)物中的任何一者，微生物可固有地包括合成這種化學(xué)產(chǎn)物的生物合成途徑，以及/或者可需要添加一種或多種異源核酸序列，以提供或完成這種生物合成途徑，以便獲得這種化學(xué)產(chǎn)物的所需產(chǎn)量。VII.所公開的實(shí)施例為非限制性的雖然本文已經(jīng)示出并描述了本發(fā)明的多個實(shí)施例，但應(yīng)強(qiáng)調(diào)的是，此類實(shí)施例僅以舉例的方式提供。在不脫離本發(fā)明的前提下，可對本文的各種實(shí)施例進(jìn)行多種變型、改變和替換。特別地，無論出于何種理由，對于本文在列表、表中所述或以其他方式提出的化合物、核酸序列、包括特定蛋白(包括功能酶、代謝途徑酶或中間體)的多肽、元素、其他組合物或所述濃度的分組，或其他分組(例如，在方案中示出的代謝途徑酶)，除非另有明確說明，否則每個此類分組的意圖是為各子集實(shí)施例提供依據(jù)，以及用于鑒別各子集實(shí)施例，其中所述子集實(shí)施例從廣義上說包括這些分組中的每個子集，但排除單獨(dú)說明的分組的一個或多個成員(或子集)。此外，除非另有明確說明，否則本文所述的任何范圍包括其中的所有值和其中的所有子范圍。另外，更廣義地講，根據(jù)本文的公開內(nèi)容、討論、實(shí)例和實(shí)施例，可采用本領(lǐng)域的技術(shù)范圍內(nèi)常規(guī)的分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、微生物學(xué)和重組DNA技術(shù)。此類技術(shù)在文獻(xiàn)中有充分的說明。(參見，例如SambrookandRussell，“MolecularCloning:ALaboratoryManual，”ThirdEdition2001(volumes1-3),ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.(Sambrook和Russell，《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》第3版，2001年，第1-3卷，紐約冷泉港冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社)；AnimalCellCulture,R.I.Freshney,ed.,1986.(《動物細(xì)胞培養(yǎng)》，R.I.Freshney編輯，1986年)。)這些已發(fā)表資源以引用方式并入本文，涉及文中可找到的標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室方法的相應(yīng)教導(dǎo)內(nèi)容。這種并入至少用于具體教導(dǎo)內(nèi)容和/或其他目的，本文在引用這些參考文獻(xiàn)時可對這些目的加以說明。如果未對具體教導(dǎo)內(nèi)容和/或其他目的加以說明，那么專門并入這些已發(fā)表資源用于該參考文獻(xiàn)的標(biāo)題、摘要和/或綜述中的一者或多者所表明的教導(dǎo)內(nèi)容。如果專門指定的教導(dǎo)內(nèi)容和/或其他目的的相關(guān)性不大，那么并入這些已發(fā)表資源是為了更全面地描述本發(fā)明所屬領(lǐng)域的情況，以及/或者提供可適用領(lǐng)域的技術(shù)人員公知的教導(dǎo)內(nèi)容。但是，需要特別說明的是，本文中已發(fā)表資源的引用不應(yīng)理解為承認(rèn)這些發(fā)表資源為本發(fā)明的現(xiàn)有技術(shù)。另外，如果一篇或多篇引入的發(fā)表資源與本申請不同或矛盾(包括但不限于所定義的術(shù)語、術(shù)語的用法、所述的技術(shù)等等)，以本申請為準(zhǔn)。實(shí)例中的主題未體現(xiàn)的部分并入本節(jié)內(nèi)容。實(shí)例實(shí)例1―NphT7突變體酶NphT7為3-酮脂酰輔酶A合酶，在以乙酰輔酶A作為引物和以丙二酰輔酶A作為延伸供體的情況下，該酶被激活以生成3-酮基-C4-輔酶A產(chǎn)物；該天然酶在較長鏈的引物上不具有可檢測的活性。對NphT7進(jìn)行殘基修飾，以改變?；o酶A結(jié)合口袋，使其接受鏈長大于或等于4個碳的底物。這些修飾為單個氨基酸變化、單個氨基酸變化的組合以及靶向的結(jié)構(gòu)環(huán)修飾，可允許鏈長大于或等于4個碳的酰基輔酶A(例如，C4-輔酶A和C6-輔酶A)與丙二酰輔酶A發(fā)生縮合反應(yīng)。根據(jù)以下標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行修飾：(a)檢查來源于結(jié)核分支桿菌的相關(guān)酶fabH的晶體結(jié)構(gòu)(蛋白數(shù)據(jù)庫中為結(jié)構(gòu)1U6S)，鑒定表16中接觸?；湹臍埢?。基于同源性鑒定NphT7中對應(yīng)的殘基。表16：與底物中的酰基鏈接觸的mtFabH殘基1U6S(mtFabH)AsnB81ThrB82LeuB142ThrB145PheB157IleB189SerB276ValB205GlnA86ThrA87IleA196Tyr304(b)蓋交換突變體。對mtFabH和NphT7之間的序列和結(jié)構(gòu)同源性進(jìn)行比較，結(jié)果表明NphT7中預(yù)測的L9環(huán)包含第167至201位殘基。氨基酸序列：GGLTDLIRVPAGGSRQPLDTDGLDAGLQYFAMD，其構(gòu)成與?；o酶A蓋對應(yīng)的L9環(huán)結(jié)構(gòu)。蓋的飽和突變(蓋中每個氨基酸轉(zhuǎn)化為每個其他氨基酸以及蓋內(nèi)突變的組合)可改變蓋結(jié)構(gòu)，以接受更大的?；o酶A鏈。突變體nphT7基因通過寡核苷酸定向突變來構(gòu)建，所有突變體通過DNA測序驗(yàn)證為正確的。將親本和突變體nphT7基因克隆到pET28b載體中并與6個His殘基一起位于讀框內(nèi)，然后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)中，37℃下將培養(yǎng)物在含有35μg/ml卡那霉素的Terrific肉湯中孵育至OD600為0.4。加入0.1mMIPTG誘導(dǎo)表達(dá)。在18℃下孵育細(xì)胞18小時，然后在4000rpm和4℃下離心10分鐘收獲細(xì)胞。-80℃下保存細(xì)胞團(tuán)，以備裂解之用。制備溶胞產(chǎn)物：在50mL裂解緩沖液(25mMpH8.0的Tris、300mMNaCl、5mMβ-巰基乙醇和全能核酸酶)中重懸細(xì)胞，并用微流化器裂解(裂解兩遍)。在12,000RPM和4℃下離心30分鐘，分離可溶性級分。用SDS-PAGE(考馬斯亮藍(lán)染色)和抗His蛋白質(zhì)印跡(4μg可溶物/泳道，保持可溶/不溶級分體積相同)分析表達(dá)。用Ni-NTA層析法純化NphT7酶。環(huán)突變體mtloop1和mtloop2額外地用DEAE-瓊脂糖凝膠層析法純化。使用5,5'-二硫基雙-(2-硝基苯甲酸)(DTNB)試劑測定游離輔酶A-SH的釋放，并測定作為供體底物的丙二酰輔酶A和各種引物底物(乙酰輔酶A、C4-輔酶A、C6-輔酶A或C10-輔酶A)，以此監(jiān)測3-酮脂酰輔酶A合酶的活性。使用37℃下和412nm處的吸光度增加(TNB產(chǎn)物形成；在pH8.0的磷酸鹽緩沖液中，□＝14.14mM-1cm-1)來測定酶活性。通過純化的PaFabG和NADPH將3-酮脂酰輔酶A的產(chǎn)生與3-羥酰輔酶A產(chǎn)物的隨后形成結(jié)合，也可監(jiān)測3-酮脂酰輔酶A合酶的活性。反應(yīng)在室溫下進(jìn)行30分鐘，然后加入乙腈至20％并在冰上孵育15分鐘以終止反應(yīng)，通過UPLC-MS/MS分析反應(yīng)。表17示出了各種經(jīng)工程改造的NphT7突變體的比活性。另外，通過用UPLC-質(zhì)譜測定反應(yīng)產(chǎn)物，證明了具有I147T和F217V突變的NphT7變體使用丙二酰輔酶A作為延伸供體從C4-輔酶A產(chǎn)生3-酮基-C6-輔酶A、從C6-輔酶A產(chǎn)生3-酮基-C8-輔酶A以及從C10-輔酶A產(chǎn)生3-酮基-C12-輔酶A(見圖15；PaFabG將NphT7的反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為3-OH-?；o酶A，以便通過UPLC-MS進(jìn)行定量分析)。如從這些結(jié)果中所見，對NphT7的選定殘基進(jìn)行修飾使底物偏好從在野生型酶中幾乎只偏好乙酰輔酶A改變?yōu)槠脤4-輔酶A有顯著活性的變體(例如，變體I147F、F217V和I147S、F217V)。表17：各種NphT7突變體的比活性“ND”＝未測定實(shí)例2―鑒定3-酮脂酰輔酶A合酶候選物的策略NphT7是制定鑒定其他3-酮脂酰輔酶A合酶候選物的策略的理想出發(fā)點(diǎn)，因?yàn)椴煌谑褂帽?ACP作為延伸物的II型FAS3-酮脂酰ACP合酶(KAS)，NphT7能使用丙二酰輔酶A進(jìn)行靶向反應(yīng)，因此NphT7的同源物很可能保持對丙二酰輔酶A的特異性。另外，已通過晶體結(jié)構(gòu)和生化檢測對不同生物體的KASIII進(jìn)行了表征，確定其底物結(jié)合位點(diǎn)和底物特異性。與NphT7不同的是，不同生物體的KASIII對長鏈或支鏈?；o酶A表現(xiàn)出不同的特異性。有相似信息可供KASI和KASII使用，但與利用?；o酶A作為底物進(jìn)行縮合反應(yīng)的KASIII不同的是，KASI和KASII需要?；?ACP作為底物。因此，已知KASIII的晶體結(jié)構(gòu)以及其生化數(shù)據(jù)可在鑒定識別酰基輔酶A的保守殘基時提供指導(dǎo)，并且有助于鑒定利用更長鏈的酰基輔酶A的NphT7同源物。表18：不同生物體的KASIII的底物特異性匯總a由酶活性所測定的底物特異性*底物包括支鏈酰基輔酶AOkamuraetal.(PNAS,2010)(Okamura等人，《美國國家科學(xué)院院刊》，2010年)確定了NphT7的生化功能，并且將其氨基酸序列與其他NphT7同源物和大腸桿菌KASIIIFabH(ecFabH)進(jìn)行比較。充分表征的ecFabH主要用于描述所有NphT7(NphT7和6個NphT7同源物)之間的相似性以及與KASIII的主要區(qū)別。Okaramura等人提供的信息以及描述其他KASIII的其他報(bào)告將用于確定鑒定可能的3-酮脂酰輔酶A候選物的規(guī)則。使用以下5個策略來鑒定3-酮脂酰輔酶A候選物：1.BLASTp，用于鑒定NphT7同源物基本原理：a.最可能利用丙二酰輔酶A作為延伸物進(jìn)行縮合反應(yīng)2.鑒定含有(A/G)GGSR序列基序的同源物基本原理：a.NphT7同源物中預(yù)測的L9環(huán)與額外的序列一起插入，它們共用(A/G)GGSR序列基序b.Okamura等人表明(A/G)GGSR基序可用作識別位點(diǎn)之一，用于識別延伸底物丙二酰輔酶A的輔酶A部分c.未在KASIII同源物中發(fā)現(xiàn)(A/G)GGSR基序和額外的序列，從而表明該序列基序?qū)phT7同源物是特異的d.參考文獻(xiàn)i.Okamuraetal.,PNAS2010(Okamura等人，《美國國家科學(xué)院院刊》，2010年)3.選擇不含有STPDXPQ序列基序的NphT7同源物基本原理：a.在NphT7同源物中，用Gln替換在ecFabH(KASIII)中指示引物底物特異性的Phe87殘基。b.所有NphT7同源物共用STPDXPQ序列基序，其中Gln是該序列基序的一部分。c.KASIII同源物不具有保守STPDXPQ基序。d.參考文獻(xiàn)i.Okamuraetal.,PNAS2010(Okamura等人，《美國國家科學(xué)院院刊》，2010年)4.鑒定在底物結(jié)合位點(diǎn)只包含疏水殘基的同源物基本原理：a.ecFabH的Phe87、Leu142、Phe157、Leu188和Leu205形成用于識別乙酰輔酶A的乙酰甲基基團(tuán)的疏水袋，這些氨基酸在NphT7同源物中不保守i.NphT7中3/5的氨基酸為疏水殘基b.大多數(shù)疏水殘基在KASIII同源物中是保守的c.參考文獻(xiàn)i.Okamuraetal.,PNAS2010(Okamura等人，《美國國家科學(xué)院院刊》，2010年)ii.Quietal.,ProteinScience2005(Qui等人，《蛋白質(zhì)科學(xué)》，2005年)iii.Scarsdaleetal.,JBC2001(Scarsdale等人，《生物化學(xué)雜志》，2001年)iv.Quietal.,JBC1999(Qui等人，《生物化學(xué)雜志》，1999年)5.鑒定NphT7同源物的不同家族基本原理：a.由滿足以上要求的NphT7同源物的多重序列比對(MSA)構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹將用于選擇候選物，該候選物代表由不同祖先進(jìn)化而來的NphT7同源物的最多樣化群組。i.該多樣化使找出NphT7同源物的可能性最高，所述同源物由于由不同祖先進(jìn)化而來而具有不同的特異性結(jié)果/成果下文總結(jié)了鑒定上文概述的3-酮脂酰輔酶A候選物的5個策略的結(jié)果：1.NphT7的同源性檢索a.以NphT7作為參考序列，最大序列目標(biāo)設(shè)為10,000，不設(shè)E值的截止值，進(jìn)行BLAST檢索。i.BLAST檢索獲得7141個NphT7的同源物2.選擇具有(A/G)GGSR基序的NphT7同源物a.309個NphT7同源物具有(A/G)GGSR基序。3.去除具有STPDXPQ序列基序的同源物a.288個NphT7同源物不具有STPDXPQ基序4.基于底物結(jié)合袋中的疏水殘基的保守性進(jìn)行選擇a.288個同源物中，144個NphT7同源物在KASIII之間保守的5個殘基處具有疏水殘基5.基于NphT7和已知KASIII的進(jìn)化距離進(jìn)行選擇a.由具有(A/G)GGSR序列基序的NphT7同源物、NphT7、ecFabH、mtFabH、bsFabH1、bsFabH2、saFabH、spFabH的MSA構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹表明，NphT7同源物分為6個不同的家族(表17)。b.選擇涵蓋所有6個家族的22個3-酮脂酰輔酶A合酶候選物i.10個3-酮脂酰輔酶A合酶候選物1.具有(A/G)GGSR序列基序2.不具有STPDXPQ序列基序3.具有保守的疏水殘基ii.11個3-酮脂酰輔酶A合酶候選物1.具有(A/G)GGSR序列基序2.不具有STPDXPQ序列基序iii.1個3-酮脂酰輔酶A合酶候選物1.具有(A/G)GGSR序列基序3-酮脂酰輔酶A合酶候選物列表列出了根據(jù)上述標(biāo)準(zhǔn)選擇的3-酮脂酰輔酶A合酶。另外，將每個合酶與NphT7、ecFabH、mtFabH和saFabH進(jìn)行比對，以確定序列同一性、相似性和空位的百分比?；跐M足所有標(biāo)準(zhǔn)選擇合酶1至合酶10。基于滿足所有標(biāo)準(zhǔn)(除了保守的疏水殘基外)選擇合酶11至合酶21?；诰哂?A/G)GGSR序列基序選擇合酶22表193-酮脂酰輔酶A合酶列表實(shí)例3―組合使用NphT7變體和/或fabH同源物與硫酯酶，以產(chǎn)生具有特定鏈長的脂肪酸雖然NphT7的突變體經(jīng)工程改造為能夠延長鏈長C4、C6和C10的酰基輔酶A，但是這些酶的比活性對于較長鏈長來說相對較低。將?；o酶A延長2個碳長度而形成3-酮脂酰輔酶A，這個反應(yīng)也可利用酮脂酰輔酶A合酶(稱為KASIII酶，由fabH基因同源物編碼)來進(jìn)行。許多這類基因同源物由商業(yè)DNA合成供應(yīng)商(DNA2.0)使用在大腸桿菌中最適表達(dá)的密碼子來合成，并且在N端與6個His殘基融合，以便通過親和層析對蛋白進(jìn)行純化?；蛟诖竽c桿菌中表達(dá)并使用DTNB測定法測定KAS活性，具體分析丙二酰輔酶A和不同鏈長的?；o酶A縮合引起的輔酶A-SH的釋放。表20列出了酶同源物，這些酶同源物具有足夠高水平的KAS活性，可使這些酶延長表中所注明的不同鏈長的?；o酶A。如從表20中的結(jié)果可見，不同來源的FabH酶具有不同的底物鏈長偏好。表20：高水平KAS活性另一種實(shí)現(xiàn)鏈長特異性的方法是，可靶向脂肪酸從酰基輔酶A前體的釋放。編碼各種硫酯酶的基因由商業(yè)DNA合成供應(yīng)商(DNA2.0)使用在大腸桿菌中優(yōu)化表達(dá)的密碼子來合成，并且表達(dá)所述基因。基于N端的6個His親和標(biāo)簽，通過親和層析對酶進(jìn)行純化。評估各種硫酯酶作用于不同鏈長的?；o酶A的活性(圖16)。因此，雖然硫酯酶PA2801TE具有從C6-輔酶A到C16-輔酶A的廣譜特異性，但是硫酯酶'tesA對短于C10的?；o酶A沒有可檢測的活性，并且對C10-輔酶A幾乎沒有活性。因此，將NphT7變體、具有表20所示的所需特異性的FabH以及圖16所示的合適硫酯酶以及包含經(jīng)工程改造脂肪酸途徑的酶結(jié)合到重組生物體中，使靶向生產(chǎn)具有特定鏈長的脂肪酸成為可能。實(shí)例4―搖瓶生產(chǎn)游離脂肪酸(FFA)評估多種經(jīng)遺傳修飾的大腸桿菌菌株的游離脂肪酸產(chǎn)量。這些菌株包括基于菌株BW25113而被工程改造的宿主，并且具有以下額外遺傳修飾：ΔldhA::frt、ΔpflB::frt、ΔmgsA::frt、ΔpoxB::frt、Δpta-ack::frt；fabI的溫度敏感等位基因(fabItsS241F)；以及額外修飾：Δtig::frt、ΔatoDAEB::frt和ΔfadD::frt，這些修飾可將酰基輔酶A底物或脂肪酸產(chǎn)物的轉(zhuǎn)移降至最低。質(zhì)粒上還提供有編碼NphT7、一種或多種硫酯酶、酮基輔酶A還原酶(KCR)、3-羥酰輔酶A脫水酶(3HDh)以及烯酰輔酶A還原酶(EnCr)的基因。表21示出了存在于樣品1至樣品5中的基因。表21：存在于樣品1至樣品5中的基因圖17示出了由這些樣品產(chǎn)生C8至C18FFA的速率，圖18示出了C6至C18FFA產(chǎn)量的滴度。圖19示出了用菌株樣品3產(chǎn)生的鏈長特異性的分布，其中36％的產(chǎn)物為C14至C16FFA。這些結(jié)果表明，這些經(jīng)工程改造的菌株增加了脂肪酸的產(chǎn)量，其中樣品3的滴度為4.07g/L?？晒┻x擇的KCR、3HDh和EnCr酶可用于提供必要活性，用于將NphT7、NphT7突變體或fabH的同源物的酮脂酰輔酶A產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為延長2個碳的完全飽和產(chǎn)物，即通過KCR將酮脂酰輔酶A還原為3-羥酰輔酶A、通過3HDh將3-羥酰輔酶A脫水為烯酰輔酶A以及通過EnCr將烯酰輔酶A還原為?；o酶A。例如，可供選擇的KCR包括FadIJ、Hbd和FadB。FadB作為KCR的活性足夠高，直至C16也有活性(見下表22)。表22：FadB對不同鏈長的3-羥酰輔酶A的活性底物比活性(U/mg)3-OH-C4-輔酶A0.43213-OH-C6-輔酶A0.5853-OH-C8-輔酶A0.12553-OH-C10-輔酶A0.17773-OH-C12-輔酶A0.19353-OH-C14-輔酶A0.25643-OH-C16-輔酶A測試了可供選擇的3HDh(包括雙功能的FadB、FabG、FadJ和Hbd)的活性和產(chǎn)物特異性。圖20示出了測試結(jié)果，結(jié)果表示為用最偏好底物所得的活性百分比。為了防止脂肪酸產(chǎn)物的消耗并維持鏈長特異性，可能需要額外的宿主遺傳修飾來除去硫酯酶。這些修飾包括tesB、yciA、fadM、ybgC和ybfF的缺失或調(diào)節(jié)。實(shí)例5.3-酮基-C5-輔酶A的產(chǎn)量已證明，使用本發(fā)明的經(jīng)遺傳修飾酶和方法可產(chǎn)生奇數(shù)鏈長的脂肪酸。具體地講，證明了在以丙酰輔酶A作為引物和以丙二酰輔酶A作為延伸供體的情況下，酶NphT7和NphT7突變體被激活以生成C5酮脂酰輔酶A。本文所述的NphT7變體和fabH將進(jìn)一步延伸C5酮脂酰輔酶A，以形成更長鏈的奇數(shù)脂肪酸產(chǎn)物。新純化的His6-NphT7、His6-NphT7(I147T,F217V)、His6-NphT7(I147S,F217V)和His6-Hbd用于本實(shí)例中的所有實(shí)驗(yàn)。NphT7反應(yīng)物(200μL)包含100mMTris-HCl(pH8)、5mMMgCl2、1mM丙二酰輔酶A、1mM引物輔酶A(C2-或C3-輔酶A)以及不同濃度的野生型NphT7或突變酶。同時也進(jìn)行了不含有任何引物輔酶A、但含有丙二酰輔酶A的反應(yīng)。37℃下，在303nm處監(jiān)測Mg2+-3-酮脂酰輔酶A加合物的形成，持續(xù)15分鐘。NphT7-Hbd偶聯(lián)反應(yīng)物(200μL)包含100mMTris-HCl(pH8)、0.75mMNADH、1mM丙二酰輔酶A、1mM引物輔酶A(C2或C3-輔酶A)、10μg部分純化的Hbd以及不同濃度的野生型NphT7或突變酶。同時也進(jìn)行了不含有任何引物輔酶A、但含有丙二酰輔酶A的反應(yīng)。然后在37℃下，在340nm處進(jìn)行NADH的氧化反應(yīng)，持續(xù)15分鐘。在15分鐘酶反應(yīng)結(jié)束時，從每個反應(yīng)物中移出100μL樣品，并立即與25μL乙腈混合，終止酶反應(yīng)。將混合物在冰上孵育至少15分鐘，然后在3,220×g和4℃下離心15分鐘。保留上清液以供通過UPLC-MS/MS分析檢測3-酮脂酰輔酶A和3-OH-C4輔酶A以及C5-輔酶A。在某些實(shí)驗(yàn)批次中，也使用Hbd酶來確定所產(chǎn)生的酮基輔酶A是否可被還原為羥酰輔酶A。表23示出了實(shí)驗(yàn)結(jié)果。表23：實(shí)驗(yàn)中所用底物和酶的匯總只有在C3-輔酶A和丙二酰輔酶A同時存在的情況下，可由NphT7產(chǎn)生3-酮基-C5-輔酶A(表23中的實(shí)驗(yàn)批次2)。當(dāng)NphT7偶聯(lián)到Hbd時，大部分3-酮基-C5-輔酶A被還原為3-OH-C5-輔酶A。這些結(jié)果表明，野生型NphT7在合成3-酮基-C5-輔酶A中能夠利用C3-輔酶A作為引物，而來源于丙酮丁醇梭桿菌的Hbd能夠還原3-酮基-C5-輔酶A。使用NphT7(I147T,F217V)或NphT7(I147S,F217V)突變體的反應(yīng)結(jié)果與在野生型NphT7反應(yīng)中獲得的結(jié)果相似。這兩種突變體都可使用C3-輔酶A作為引物來產(chǎn)生3-酮基-C5-輔酶A，在Hbd和NADH存在的情況下，產(chǎn)生的3-酮基-C5-輔酶A進(jìn)一步被還原為3-OH-C5-輔酶A(表23中的實(shí)驗(yàn)批次7至18)。在乙酰輔酶A和丙二酰輔酶A共同存在或丙二酰輔酶A單獨(dú)存在的情況下，通過這些酶只生成了3-酮基-C4-輔酶A。在NphT7(I147T,F217V)或NphT7(I147S,F217V)中檢測到更高濃度的產(chǎn)物，因?yàn)樵谶@兩個反應(yīng)中使用的酶多于野生型NphT7的反應(yīng)中使用的酶。根據(jù)3-酮基-C5-輔酶A濃度與每個反應(yīng)中的酶量的關(guān)系作圖，NphT7、NphT7(I147T,F217V)和NphT7(I147S,F217V)的比活性(15分鐘內(nèi)的平均值)分別為0.3、0.2和0.27U/mg?？赏ㄟ^構(gòu)建重組菌株來產(chǎn)生奇數(shù)鏈脂肪酸(例如，長度為C5、C7、C9、C11、C13、C15和C17的脂肪酸)，所述重組菌株攜帶表達(dá)以下蛋白的基因：NphT7和/或NphT7突變體、具有所需鏈長特異性的fabH、KCR、3HDh和EnCr以及終止酶(例如，具有所需鏈長特異性的硫酯酶或酯合酶)，所述重組菌株還提供作為引物的丙酰輔酶A和作為延伸物的丙二酰輔酶A的來源。實(shí)例7.C4和C6脂肪酸的產(chǎn)量已證明，使用本發(fā)明的經(jīng)遺傳修飾酶和方法可產(chǎn)生C4和C6脂肪酸。具體地講，證明了可通過經(jīng)遺傳修飾而編碼某些NphT7突變酶以及PA2801TE硫酯酶的微生物來產(chǎn)生C4和C6脂肪酸。這些氨基酸修飾可使?；o酶A(C4-輔酶A和C6-輔酶A)與丙二酰輔酶A發(fā)生縮合反應(yīng)。具體地講，經(jīng)遺傳修飾微生物包含一種或多種異源3-酮脂酰輔酶A合酶，這些合酶選自野生型NphT7、具有I147T和F217V突變的NphT7變體、或具有I147S和F217V突變的NphT7變體以及它們的任意組合，并且包含以下中的至少一者：a)異源KCR，例如fadB；b)異源3HDh，例如fadB；c)異源EnCr，例如ter；以及d)硫酯酶PA2801TE。評估以下經(jīng)遺傳修飾的大腸桿菌菌株的游離脂肪酸產(chǎn)量：表24：測試菌株的遺傳修飾30℃下，單個菌落在150mlSM11(含有35μg/ml卡那霉素和20μg/ml氯霉素)中孵育20小時。將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移至50mL錐形管中，4,000RPM下離心15分鐘。在新配制的SM11(含磷酸鹽)培養(yǎng)基中重懸細(xì)胞團(tuán)，使其光密度為20。合并每個菌株的重懸液，使用2.5ml(5％)合并的重懸液接種50ml不含磷酸鹽的SM11培養(yǎng)基。將培養(yǎng)物在30℃下孵育4小時，然后將溫度改變?yōu)?7℃。再孵育20小時后，取出樣品并分析其中存在的游離脂肪酸量。圖21示出了所產(chǎn)生的C4、C6脂肪酸量和總游離脂肪酸(測定為C4至C18)量。另外，溫度改變后第18個小時將樣品取出，分析游離脂肪酸的分布。圖22示出了該分析的結(jié)果。實(shí)例8.C4、C6和C8脂肪酸的產(chǎn)量使用本發(fā)明的經(jīng)遺傳修飾酶和方法產(chǎn)生C4、C6和C8脂肪酸。具體地講，可通過經(jīng)遺傳修飾而編碼某些NphT7突變酶以及硫酯酶的微生物來產(chǎn)生C4、C6和C8脂肪酸。這些氨基酸修飾可使酰基輔酶A(C2-輔酶A、C4-輔酶A和C6-輔酶A)與丙二酰輔酶A發(fā)生縮合反應(yīng)。經(jīng)遺傳修飾微生物包含一種或多種異源3-酮脂酰輔酶A合酶，這些合酶選自野生型NphT7、或具有I147S和F217V突變的NphT7變體以及它們的任意組合，并且包含以下中的至少一者：a)異源KCR，例如fadB；b)異源3HDh，例如fadB；c)異源EnCr，例如ter；以及d)硫酯酶'tesA。評估以下經(jīng)遺傳修飾的大腸桿菌菌株的游離脂肪酸產(chǎn)量：表25：測試菌株的遺傳修飾coaA*表示抗反饋抑制的coaA(泛酸激酶)的等位基因。使用實(shí)例7中概述的相同方法，但將培養(yǎng)物在溫度改變后發(fā)酵68小時，取出樣品并分析其中存在的游離脂肪酸量。圖23示出了所產(chǎn)生的C4、C6和C8游離脂肪酸量，圖24示出了所產(chǎn)生的總脂肪酸(C4至C18)量。圖25示出了各種菌株所產(chǎn)生的游離脂肪酸的分布。這些結(jié)果表明，菌株J和K產(chǎn)生了具有高特異性的C6脂肪酸。可通過構(gòu)建重組菌株來產(chǎn)生鏈長大于C8的脂肪酸(例如，長度為C10、C12、C14、C16和C18的高特異性脂肪酸)，所述重組菌株攜帶表達(dá)以下蛋白的基因：NphT7和/或NphT7突變體、具有所需鏈長特異性的fabH、KCR、3HDh和EnCr以及終止酶(例如，具有所需特異性的硫酯酶或酯合酶)，所述重組菌株還提供作為引物的乙酰輔酶A和作為延伸物的丙二酰輔酶A的來源。雖然本文已經(jīng)示出并描述了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，但對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言顯而易見的是，此類實(shí)施例僅以舉例的方式提供。在不脫離本發(fā)明的情況下，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以進(jìn)行多種修改、改變和替換。應(yīng)當(dāng)理解，可以采用本文所述的本發(fā)明實(shí)施例的各種替代形式來實(shí)施本發(fā)明。當(dāng)前第1頁1 2 3