本公開(kāi)是名稱為無(wú)熱量甜味劑的PCT申請(qǐng)。本申請(qǐng)要求于2014年5月5日提交的美國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?4/269,435的優(yōu)先權(quán)，其以引用方式全文并入本文。

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發(fā)明背景

本公開(kāi)整體涉及天然甜味劑。更具體地講，本公開(kāi)涉及無(wú)熱量甜味劑以及用于合成所述無(wú)熱量甜味劑的方法。

甜菊醇糖苷是分離自甜菊葉的天然產(chǎn)物。甜菊醇糖苷被廣泛用作高強(qiáng)度、低熱量的甜味劑，并且明顯甜于蔗糖。天然存在的甜菊醇糖苷具有相同的基本甜菊醇結(jié)構(gòu)，但在位于C13和C19的糖類殘基（例如，葡萄糖、鼠李糖和木糖殘基）的含量上有所不同。結(jié)構(gòu)已知的甜菊醇糖苷包括：甜菊醇、甜菊苷、萊鮑迪苷A、萊鮑迪苷B、萊鮑迪苷C、萊鮑迪苷D、萊鮑迪苷E、萊鮑迪苷F和杜克苷A（參見(jiàn)例如，表1）。

按干重計(jì)，甜菊苷、萊鮑迪苷A、萊鮑迪苷C和杜克苷A，分別占葉片中甜菊醇糖苷總重量的9.1、3.8、0.6和0.3%，而其它甜菊醇糖苷則以低得多的量存在。來(lái)自甜菊植株的提取物可商購(gòu)獲得，其通常含有甜菊苷和萊鮑迪苷A作為主要化合物。其它甜菊醇糖苷通常在甜菊提取物中作為次要成分存在。例如，商業(yè)制備物中萊鮑迪苷A的量可以在總甜菊醇糖苷含量的約20%至超過(guò)90%之間變化，而萊鮑迪苷B的量可以是約1-2%，萊鮑迪苷C的量可以是約7-15%，而萊鮑迪苷D的量可以是總甜菊醇糖苷的約2%。

甜菊醇糖苷不僅在分子結(jié)構(gòu)上彼此不同，在其味覺(jué)特性上也彼此不同。例如，不同的甜菊醇糖苷具有不同程度的甜度和余味。例如，甜菊苷比蔗糖甜100-150倍，但具有苦澀的余味。例如，萊鮑迪苷A和萊鮑迪苷E比蔗糖甜250-450倍并具有弱于甜菊苷的余味。萊鮑迪苷C比蔗糖甜40-60倍。杜克苷A比蔗糖甜約30倍。

大部分的甜菊醇糖苷通過(guò)甜菊醇的若干糖基化反應(yīng)而形成，這些反應(yīng)通常由UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶(UGT)催化并使用尿苷5'-二磷酸葡萄糖(UDP-葡萄糖)作為糖類部分的供體。植物中的UGT構(gòu)成了一組非常多樣化的酶，其將葡萄糖殘基從UDP-葡萄糖轉(zhuǎn)移至甜菊醇。例如，甜菊苷的C-13-O-葡萄糖的C-3'的糖基化得到萊鮑迪苷A；而甜菊苷的19-O-葡萄糖的C-2'的糖基化得到萊鮑迪苷E。萊鮑迪苷A(在C-19-O-葡萄糖處)或萊鮑迪苷E(在C-13-O-葡萄糖處)的進(jìn)一步糖基化生成萊鮑迪苷D。(圖1)。

由于意識(shí)到許多疾病與高糖食物和飲料的攝入相關(guān)，替代的甜味劑正受到越來(lái)越多的關(guān)注。盡管存在可用的人工甜味劑，但由于對(duì)其安全性的顧慮，許多人工甜味劑如甘素、環(huán)己氨基磺酸鈉和糖精已經(jīng)被一些國(guó)家禁止或限制使用。因此，天然來(lái)源的無(wú)熱量甜味劑正變得日益流行。甜菊甜味劑的廣泛使用的主要障礙之一是其不佳的味覺(jué)屬性。因此，需要開(kāi)發(fā)替代的甜味劑及其生產(chǎn)方法以提供甜度與風(fēng)味屬性的最佳組合。

發(fā)明簡(jiǎn)述

本公開(kāi)整體涉及天然甜味劑。更具體地講，本公開(kāi)涉及無(wú)熱量甜味劑以及用于合成所述無(wú)熱量甜味劑的方法。本公開(kāi)還涉及可以被用于制備所述無(wú)熱量甜味劑的酶。

甜菊醇糖苷 - 合成的萊鮑迪苷D2。在一個(gè)方面，本公開(kāi)涉及合成的萊鮑迪苷（萊鮑迪苷D2），其化學(xué)結(jié)構(gòu)為：

。

從萊鮑迪苷E生產(chǎn)萊鮑迪苷D2的方法。在另一方面，本公開(kāi)涉及從萊鮑迪苷E合成萊鮑迪苷D2的方法。所述方法包括：制備反應(yīng)混合物，所述反應(yīng)混合物包含：萊鮑迪苷E、底物（選自蔗糖、尿苷二磷酸(UDP)和尿苷二磷酸-葡萄糖(UDP-葡萄糖)）以及尿苷二磷酸糖基轉(zhuǎn)移酶(UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶)（選自尿苷二磷酸糖基轉(zhuǎn)移酶和UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶融合酶，所述融合酶包含偶聯(lián)至蔗糖合成酶結(jié)構(gòu)域的尿苷二磷酸糖基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域）；并將所述反應(yīng)混合物溫育足夠的時(shí)間以生成萊鮑迪苷D2，其中葡萄糖被共價(jià)偶聯(lián)至所述萊鮑迪苷E以生成萊鮑迪苷D2。

從甜菊苷生產(chǎn)萊鮑迪苷E和萊鮑迪苷D2的方法。在另一方面，本公開(kāi)涉及從甜菊苷合成萊鮑迪苷E和萊鮑迪苷D2的方法。所述方法包括：制備反應(yīng)混合物，所述反應(yīng)混合物包含：甜菊苷、底物（選自蔗糖、尿苷二磷酸(UDP)和尿苷二磷酸-葡萄糖(UDP-葡萄糖)）以及尿苷二磷酸糖基轉(zhuǎn)移酶(UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶)（選自尿苷二磷酸糖基轉(zhuǎn)移酶和UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶融合酶，所述融合酶包含偶聯(lián)至蔗糖合成酶結(jié)構(gòu)域的尿苷二磷酸糖基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域）；并將所述反應(yīng)混合物溫育足夠的時(shí)間以生成萊鮑迪苷E和萊鮑迪苷D2，其中葡萄糖被共價(jià)偶聯(lián)至所述甜菊苷以生成萊鮑迪苷E中間體，并且其中葡萄糖被共價(jià)偶聯(lián)至所述萊鮑迪苷E中間體以生成萊鮑迪苷D2。

UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶融合酶("EUS")。在另一方面，本公開(kāi)涉及UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶融合酶（在本文中稱為“EUS”）。所述UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶融合酶包含偶聯(lián)至蔗糖合成酶結(jié)構(gòu)域的尿苷二磷酸糖基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域。所述UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶融合酶具有1,2-β糖苷鍵和1,6-β糖苷鍵酶活性以及蔗糖合成酶活性。

從萊鮑迪苷A生產(chǎn)萊鮑迪苷D的方法。在另一方面，本公開(kāi)涉及從萊鮑迪苷A合成萊鮑迪苷D的方法。所述方法包括：制備反應(yīng)混合物，所述反應(yīng)混合物包含：萊鮑迪苷A、底物（選自蔗糖、尿苷二磷酸(UDP)和尿苷二磷酸-葡萄糖(UDP-葡萄糖)）以及UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶（選自尿苷二磷酸糖基轉(zhuǎn)移酶和UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶融合酶(EUS)，所述EUS包含偶聯(lián)至蔗糖合成酶結(jié)構(gòu)域的尿苷二磷酸糖基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域）；并將所述反應(yīng)混合物溫育足夠的時(shí)間以生成萊鮑迪苷D，其中葡萄糖被共價(jià)偶聯(lián)至所述萊鮑迪苷A以生成萊鮑迪苷D。

在另一方面，本公開(kāi)涉及包含增甜量的萊鮑迪苷D2的可口服產(chǎn)品，所述產(chǎn)品選自飲料產(chǎn)品和可食用產(chǎn)品。

在另一方面，本公開(kāi)涉及包含增甜量的萊鮑迪苷D2的飲料產(chǎn)品。萊鮑迪苷D2以約5 ppm至約100 ppm的濃度存在于所述飲料產(chǎn)品中。在一些實(shí)施方案中，低濃度的萊鮑迪苷D2，例如，低于100 ppm，與濃度為10,000至30,000 ppm的蔗糖溶液具有等同的甜度。

在另一方面，本公開(kāi)涉及包含增甜量的萊鮑迪苷D2的可食用產(chǎn)品。萊鮑迪苷D2以約5 ppm至約100 ppm的濃度存在于所述可食用產(chǎn)品中。在一些實(shí)施方案中，低濃度的萊鮑迪苷D2，例如，低于100 ppm，與濃度為10,000至30,000 ppm的蔗糖溶液具有等同的甜度。

在另一方面，本公開(kāi)涉及甜味劑，其化學(xué)結(jié)構(gòu)為：

。

在可以與任一前述實(shí)施方案結(jié)合的某些實(shí)施方案中，萊鮑迪苷D2是唯一的甜味劑，并且所述產(chǎn)品與約1%至約4% (w/v-%)的蔗糖溶液具有等同的甜味強(qiáng)度。在可與任一前述實(shí)施方案結(jié)合的某些實(shí)施方案中，所述可口服產(chǎn)品還包含另外的甜味劑，其中所述產(chǎn)品與約1%至約10% (w/v-%)的蔗糖溶液具有等同的甜味強(qiáng)度。在可與任一前述實(shí)施方案結(jié)合的某些實(shí)施方案中，所述產(chǎn)品中的每種增甜成分均是高強(qiáng)度甜味劑。在可與任一前述實(shí)施方案結(jié)合的某些實(shí)施方案中，所述產(chǎn)品中的每種增甜成分均是天然的高強(qiáng)度甜味劑。在可與任一前述實(shí)施方案結(jié)合的某些實(shí)施方案中，所述另外的甜味劑包括選自以下的一種或多種甜味劑：甜菊提取物、甜菊醇糖苷、甜菊苷、萊鮑迪苷A、萊鮑迪苷B、萊鮑迪苷C、萊鮑迪苷D、萊鮑迪苷E、萊鮑迪苷F、杜克苷A、甜茶苷、甜菊雙糖苷、蔗糖、高果糖玉米糖漿、果糖、葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、鼠李糖、赤蘚糖醇、木糖醇、甘露糖醇、山梨糖醇、肌醇、AceK、阿斯巴甜、紐甜、三氯蔗糖、糖精、柚皮苷二氫查爾酮(arDHC)、新橙皮苷二氫查耳酮(NDHC)、甜茶苷、羅漢果苷IV、

賽門苷I、羅漢果苷V、莫納甜、奇異果甜蛋白、應(yīng)樂(lè)果甜蛋白、布那珍、L-丙氨酸、甘氨酸、羅漢果（Lo Han Guo）、hernandulcin、葉甜素、trilobtain及其組合。在可與任一前述實(shí)施方案結(jié)合的某些實(shí)施方案中，所述飲料產(chǎn)品和可食用產(chǎn)品還包含選自以下的一種或多種添加劑：碳水化合物、多元醇、氨基酸或其鹽、聚氨基酸或其鹽、糖酸或其鹽、核苷酸、有機(jī)酸、無(wú)機(jī)酸、有機(jī)鹽、有機(jī)酸鹽、有機(jī)堿鹽、無(wú)機(jī)鹽、苦味化合物、風(fēng)味料、風(fēng)味成分、收斂化合物、蛋白質(zhì)、蛋白水解產(chǎn)物、表面活性劑、乳化劑、類黃酮、酒精、聚合物及其組合。在可與任一前述實(shí)施方案結(jié)合的某些實(shí)施方案中，在其被添加到所述產(chǎn)品中之前，萊鮑迪苷D2具有按重量計(jì)約50%至約100%的純度。在可與任一前述實(shí)施方案結(jié)合的某些實(shí)施方案中，所述產(chǎn)品中的萊鮑迪苷D2是萊鮑迪苷D2多晶型物或非晶萊鮑迪苷D2。在可與任一前述實(shí)施方案結(jié)合的某些實(shí)施方案中，所述產(chǎn)品中的萊鮑迪苷D2是萊鮑迪苷D2立體異構(gòu)體。

本公開(kāi)的其它方面涉及制備飲料產(chǎn)品和可食用產(chǎn)品的方法，其通過(guò)在所述產(chǎn)品中或在用于制造所述飲料產(chǎn)品和所述可食用產(chǎn)品的成分中包含經(jīng)純化的萊鮑迪苷D2而實(shí)現(xiàn)，其中萊鮑迪苷D2以約5 ppm至約100 ppm的濃度存在于所述產(chǎn)品中。本公開(kāi)的其它方面涉及用于提高飲料產(chǎn)品和可食用產(chǎn)品的甜度的方法，其通過(guò)將約5 ppm至約100 ppm的經(jīng)純化的萊鮑迪苷D2添加到所述飲料產(chǎn)品和所述可食用產(chǎn)品中而實(shí)現(xiàn)，其中相比對(duì)應(yīng)的不含所述經(jīng)純化的萊鮑迪苷D2的飲料產(chǎn)品和可食用產(chǎn)品，所添加的萊鮑迪苷D2提高所述飲料產(chǎn)品和所述可食用產(chǎn)品的甜度。

在可與任一前述實(shí)施方案結(jié)合的某些實(shí)施方案中，萊鮑迪苷D2是唯一的甜味劑，并且所述產(chǎn)品與約1%至約4% (w/v-%)的蔗糖溶液具有等同的甜味強(qiáng)度。在可與任一前述實(shí)施方案結(jié)合的某些實(shí)施方案中，所述方法還包括添加另外的甜味劑，其中所述產(chǎn)品與約1%至約10% (w/v-%)的蔗糖溶液具有等同的甜味強(qiáng)度。

本公開(kāi)的其它方面涉及用于制備增甜飲料產(chǎn)品或增甜可食用產(chǎn)品的方法，其通過(guò)如下實(shí)現(xiàn)：a) 提供含有一種或多種甜味劑的飲料產(chǎn)品或可食用產(chǎn)品；并且 b) 向所述飲料產(chǎn)品或所述可食用產(chǎn)品中添加約5 ppm至約100 ppm的經(jīng)純化的萊鮑迪苷D2。

在可與任一前述實(shí)施方案結(jié)合的某些實(shí)施方案中，所述方法還包括向所述飲料產(chǎn)品或所述可食用產(chǎn)品中添加一種或多種添加劑。在可與任一前述實(shí)施方案結(jié)合的某些實(shí)施方案中，所述可口服產(chǎn)品還含有一種或多種添加劑。在可與任一前述實(shí)施方案結(jié)合的某些實(shí)施方案中，所述一種或多種添加劑選自：碳水化合物、多元醇、氨基酸或其鹽、聚氨基酸或其鹽、糖酸或其鹽、核苷酸、有機(jī)酸、無(wú)機(jī)酸、有機(jī)鹽、有機(jī)酸鹽、有機(jī)堿鹽、無(wú)機(jī)鹽、苦味化合物、風(fēng)味料、風(fēng)味成分、收斂化合物、蛋白質(zhì)、蛋白水解產(chǎn)物、表面活性劑、乳化劑、類黃酮、酒精、聚合物及其組合。在可與任一前述實(shí)施方案結(jié)合的某些實(shí)施方案中，所述產(chǎn)品中的每種增甜成分均是高強(qiáng)度甜味劑。在可與任一前述實(shí)施方案結(jié)合的某些實(shí)施方案中，所述產(chǎn)品中的每種增甜成分均是天然的高強(qiáng)度甜味劑。在可與任一前述實(shí)施方案結(jié)合的某些實(shí)施方案中，所述甜味劑選自：甜菊提取物、甜菊醇糖苷、甜菊苷、萊鮑迪苷A、萊鮑迪苷B、萊鮑迪苷C、萊鮑迪苷D、萊鮑迪苷E、萊鮑迪苷F、杜克苷A、甜茶苷、甜菊雙糖苷、蔗糖、高果糖玉米糖漿、果糖、葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、鼠李糖、赤蘚糖醇、木糖醇、甘露糖醇、山梨糖醇、肌醇、AceK、阿斯巴甜、紐甜、三氯蔗糖、糖精、柚皮苷二氫查爾酮(arDHC)、新橙皮苷二氫查耳酮(NDHC)、甜茶苷、羅漢果苷IV、賽門苷I、羅漢果苷V、莫納甜、奇異果甜蛋白、應(yīng)樂(lè)果甜蛋白、布那珍、L-丙氨酸、甘氨酸、羅漢果（Lo Han Guo）、hernandulcin、葉甜素、trilobtain及其組合。在可與任一前述實(shí)施方案結(jié)合的某些實(shí)施方案中，在其被添加到所述產(chǎn)品中之前，萊鮑迪苷D2具有按重量計(jì)約50%至約100%的純度。在可與任一前述實(shí)施方案結(jié)合的某些實(shí)施方案中，所述產(chǎn)品中的萊鮑迪苷D2是萊鮑迪苷D2多晶型物或非晶萊鮑迪苷D2。

附圖簡(jiǎn)述

當(dāng)考慮到以下詳細(xì)說(shuō)明時(shí)，將更好地理解本公開(kāi)，并且除上述那些以外的特征、方面和優(yōu)點(diǎn)將變得顯而易見(jiàn)。此類詳細(xì)說(shuō)明參考了以下附圖，其中：

圖1A-1C是說(shuō)明從甜菊苷生物合成甜菊醇糖苷的途徑的示意圖。

圖2A和2B示出了經(jīng)純化的重組UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶(EUGTl 1)和經(jīng)純化的重組UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶融合酶(EUS)的SDS-PAGE分析，如實(shí)施例1中所述。

圖3A-3G是顯示下列物質(zhì)的HPLC保留時(shí)間的曲線圖：甜菊苷("Ste")、萊鮑迪苷A("Reb A")和萊鮑迪苷D("Reb D")標(biāo)準(zhǔn)品(圖3A)；在14小時(shí)由EUS酶促產(chǎn)生的萊鮑迪苷D(圖3B)；在14小時(shí)由EUGT11酶促產(chǎn)生的萊鮑迪苷D(圖3C)；在14小時(shí)由UGT-SUS(EUGTl 1-AtSUS1)偶聯(lián)系統(tǒng)酶促產(chǎn)生的萊鮑迪苷D(圖3D)；在24小時(shí)由EUS酶促產(chǎn)生的萊鮑迪苷D(圖3E)；在24小時(shí)由EUGT11酶促產(chǎn)生的萊鮑迪苷D(圖3F)；以及在24小時(shí)由UGT-SUS(EUGTl 1-AtSUS1)偶聯(lián)系統(tǒng)酶促產(chǎn)生的萊鮑迪苷D(圖3G)，如實(shí)施例2中所述。

圖4A-4G是顯示下列物質(zhì)的HPLC保留時(shí)間的曲線圖：甜菊苷("Ste")、萊鮑迪苷A("Reb A")和萊鮑迪苷D("Reb D")標(biāo)準(zhǔn)品(圖4A)；在14小時(shí)由EUS酶促產(chǎn)生的萊鮑迪苷D2("Reb D2")(圖4B)；在14小時(shí)由EUGT11酶促產(chǎn)生的萊鮑迪苷E("Reb E")(圖4C)；在14小時(shí)由UGT-SUS(EUGTl 1-AtSUS1)偶聯(lián)系統(tǒng)酶促產(chǎn)生的萊鮑迪苷D2(圖4D)；在24小時(shí)由EUS酶促產(chǎn)生的萊鮑迪苷D2("Reb D2")(圖4E)；在24小時(shí)由EUGTl 1酶促產(chǎn)生的萊鮑迪苷E("Reb E")(圖4F)；以及在24小時(shí)由UGT-SUS(EUGTl 1-AtSUS1)偶聯(lián)系統(tǒng)酶促產(chǎn)生的萊鮑迪苷D2(圖4G)，如實(shí)施例3中所述。

圖5A-5J是顯示下列物質(zhì)的HPLC保留時(shí)間的曲線圖：萊鮑迪苷D("Reb-D")標(biāo)準(zhǔn)品(圖5A)；萊鮑迪苷E("Reb-E")標(biāo)準(zhǔn)品(圖5B)；在12小時(shí)由EUGT11酶促產(chǎn)生的萊鮑迪苷D2("Reb D2")(圖5C)；在12小時(shí)由UGT-SUS(EUGTl 1-SUS l)偶聯(lián)系統(tǒng)(圖5D)以及在12小時(shí)由EUS(圖5E)；在12小時(shí)由UGT76G1-AtSUS1偶聯(lián)系統(tǒng)酶促產(chǎn)生的萊鮑迪苷D("Reb D")(圖5F)；在24小時(shí)由EUGTl 1酶促產(chǎn)生的萊鮑迪苷D2(圖5G)；在24小時(shí)由UGT-SUS(EUGTl 1-SUS1)偶聯(lián)系統(tǒng)酶促產(chǎn)生的萊鮑迪苷D2(圖5H)；在24小時(shí)由EUS酶促產(chǎn)生的萊鮑迪苷D2(圖5I)；在24小時(shí)由UGT76G1-AtSUS1偶聯(lián)系統(tǒng)酶促產(chǎn)生的萊鮑迪苷D(圖5J)，如實(shí)施例4中所述。

圖6A-6B示出了萊鮑迪苷D2和萊鮑迪苷E的化學(xué)結(jié)構(gòu)，如實(shí)施例5中所述。

圖7是萊鮑迪苷D2的化學(xué)結(jié)構(gòu)，其示出了關(guān)鍵的TOCSY和HMBC相關(guān)性，如實(shí)施例5中所述。

圖8A-8C示出了萊鮑迪苷D2、萊鮑迪苷E和萊鮑迪苷D的化學(xué)結(jié)構(gòu)，如實(shí)施例5中所述。

雖然本公開(kāi)容易有各種修改和替代形式，但已經(jīng)在附圖中以舉例的方式示出了特定的實(shí)施方案并在下文中詳述。然而，應(yīng)當(dāng)理解，對(duì)特定實(shí)施方案的說(shuō)明并非意圖限制本公開(kāi)，其所有修改形式、等同形式和替代形式均落入如所附權(quán)利要求書限定的本公開(kāi)的精神和范圍內(nèi)。

發(fā)明詳述

除非另行定義，否則本文中所用的全部技術(shù)與科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有與本公開(kāi)所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常所理解的相同的含義。盡管與本文所述那些類似或等同的方法和材料可用于實(shí)踐或測(cè)試本公開(kāi)，但仍然在下文中描述了優(yōu)選的材料和方法。

術(shù)語(yǔ)“互補(bǔ)的”依其本領(lǐng)域普通技術(shù)人員普遍和慣常所理解的意思使用，并且被不加限制地用于描述能夠彼此雜交的核苷酸堿基之間的關(guān)系。例如，就DNA而言，腺嘌呤與胸腺嘧啶互補(bǔ)，而胞嘧啶與鳥嘌呤互補(bǔ)。因此，所討論的技術(shù)還包括分離的核酸片段，其與如所附序列表中報(bào)道的完整序列以及那些基本上相似的核酸序列互補(bǔ)。

術(shù)語(yǔ)“核酸”和“核苷酸”依其相應(yīng)的本領(lǐng)域普通技術(shù)人員普遍和慣常所理解的意思使用，并且被不加限制地用于指代單鏈或雙鏈形式的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其聚合物。除非特別限定，否則該術(shù)語(yǔ)涵蓋含有天然核苷酸的已知類似物的核酸，其具有與參照核酸相似的結(jié)合特性，并且以類似于天然存在的核苷酸的方式被代謝。除非另外指明，否則具體的核酸序列還默認(rèn)涵蓋其經(jīng)保守修飾或簡(jiǎn)并的變體（例如，簡(jiǎn)并密碼子置換）和互補(bǔ)序列以及所明示的序列。

術(shù)語(yǔ)“分離的”依其本領(lǐng)域普通技術(shù)人員普遍和慣常所理解的意思使用，并且當(dāng)用在分離的核酸或分離的多肽的上下文中時(shí)，被不加限制地用于指代通過(guò)人工脫離其原生環(huán)境而存在并因此不是自然產(chǎn)物的核酸或多肽。分離的核酸或多肽可以純化形式存在或可以存在于非原生環(huán)境中，如例如，在轉(zhuǎn)基因宿主細(xì)胞中。

如本文中所用的術(shù)語(yǔ)“溫育”（"incubating"和"incubation"）指代這樣的方法：將兩種或更多種化學(xué)或生物實(shí)體（如化學(xué)化合物和酶）混合并允許其在有利于產(chǎn)生甜菊醇糖苷組合物的條件下相互反應(yīng)。

術(shù)語(yǔ)“簡(jiǎn)并變體”指代這樣的核酸序列，其由于一個(gè)或多個(gè)簡(jiǎn)并密碼子置換而具有不同于參照核酸序列的殘基序列。簡(jiǎn)并密碼子置換可以通過(guò)生成如下序列而實(shí)現(xiàn)，其中一個(gè)或多個(gè)選定（或全部）密碼子的第三位被混合的堿基和/或脫氧肌苷殘基置換。核酸序列及其所有簡(jiǎn)并變體將表達(dá)相同的氨基酸或多肽。

術(shù)語(yǔ)“多肽”、“蛋白質(zhì)”和“肽”依其相應(yīng)的本領(lǐng)域普通技術(shù)人員普遍和慣常所理解的意思使用；這三個(gè)術(shù)語(yǔ)有時(shí)可互換使用，并且被不加限制地用于指代氨基酸或氨基酸類似物的聚合物，而無(wú)論其大小或功能。雖然“蛋白質(zhì)”通常用于指代相對(duì)大的多肽，而“肽”通常用于指代小的多肽，但在本領(lǐng)域中這些術(shù)語(yǔ)的使用有重疊和差異。除非另有說(shuō)明，否則如本文中所用的術(shù)語(yǔ)“多肽”指代肽、多肽和蛋白質(zhì)。當(dāng)指代多核苷酸產(chǎn)物時(shí)，術(shù)語(yǔ)“蛋白質(zhì)”、“多肽”和“肽”在本文中可互換使用。因此，示例性多肽包括多核苷酸產(chǎn)物、天然存在的蛋白質(zhì)及其同源物、直系同源物、旁系同源物、片段和其它等同物、變體以及類似物。

術(shù)語(yǔ)“多肽片段”和“片段”，當(dāng)用于指代參照多肽時(shí)，依其本領(lǐng)域普通技術(shù)人員普遍和慣常所理解的意思使用，并且被不加限制地用于指代這樣的多肽，其相比該參照多肽自身存在氨基酸殘基缺失，但其中剩余的氨基酸序列通常與該參照多肽中的對(duì)應(yīng)位置相同。此類缺失可以發(fā)生在該參照多肽的氨基末端或羧基末端，或作為另外一種選擇同時(shí)在這兩處發(fā)生。

術(shù)語(yǔ)多肽或蛋白質(zhì)的“功能性片段”指代這樣的肽片段，其是全長(zhǎng)多肽或蛋白質(zhì)的一部分，并且與全長(zhǎng)多肽或蛋白質(zhì)具有基本上相同的生物活性，或執(zhí)行基本上相同的功能（例如，進(jìn)行相同的酶促反應(yīng)）。

可互換使用的術(shù)語(yǔ)“變體多肽”、“經(jīng)修飾的氨基酸序列”或“經(jīng)修飾的多肽”指代這樣的氨基酸序列，其例如通過(guò)一個(gè)或多個(gè)氨基酸置換、缺失和/或添加而與參照多肽有一個(gè)或多個(gè)氨基酸不同。在一方面，變體是保持了參照多肽的部分或全部能力的“功能性變體”。

術(shù)語(yǔ)“功能性變體”還包括經(jīng)過(guò)保守置換的變體。術(shù)語(yǔ)“經(jīng)過(guò)保守置換的變體”指代這樣的肽，其由于一個(gè)或多個(gè)保守氨基酸置換而具有不同于參照肽的氨基酸序列，并且保持了該參照肽的部分或全部活性?！氨Ｊ匕被嶂脫Q”是用功能上相似的殘基置換氨基酸殘基。保守置換的實(shí)例包括：非極性（疏水性）殘基如異亮氨酸、纈氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸間的相互置換；帶電荷或極性（親水性）殘基間的相互置換如精氨酸與賴氨酸之間、谷氨酰胺與天冬酰胺之間、蘇氨酸與絲氨酸之間；堿性殘基如賴氨酸或精氨酸間的相互置換；或酸性殘基如天冬氨酸或谷氨酸間的相互置換；或芳香族殘基如苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸間的相互置換。預(yù)計(jì)此類置換對(duì)蛋白質(zhì)或多肽的表觀分子量或等電點(diǎn)具有輕微影響或沒(méi)有影響。短語(yǔ)“經(jīng)過(guò)保守置換的變體”還包括這樣的肽，其中殘基被化學(xué)衍生的殘基所替換，前提條件是所得到的肽保持如本文所述的參照肽的部分或全部活性。

術(shù)語(yǔ)“變體”，結(jié)合所討論的技術(shù)的多肽，還包括功能活性多肽，其具有與參照多肽的氨基酸序列至少75%、至少76%、至少77%、至少78%、至少79%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%和甚至100%相同的氨基酸序列。

術(shù)語(yǔ)“同源的”以其所有語(yǔ)法形式和拼寫變型指代具有“共同進(jìn)化起源”的多核苷酸或多肽之間的關(guān)系，包括來(lái)自超家族的多核苷酸或多肽以及來(lái)自不同物種的同源多核苷酸或蛋白質(zhì)(Reeck 等人，Cell 50:667, 1987)。此類多核苷酸或多肽具有序列同源性，正如其序列相似性所反映的，無(wú)論是就百分比同一性而言或是在保守位置上存在特定氨基酸或基序。例如，兩個(gè)同源多肽可以具有至少75%、至少76%、至少77%、至少78%、至少79%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%和甚至100%相同的氨基酸序列。

相對(duì)于所討論的技術(shù)的變體多肽序列的“百分比（%）氨基酸序列同一性”指代與參照多肽（如例如，SEQ ID NO:6）的氨基酸殘基相同的候選序列中氨基酸殘基的百分比，在比對(duì)序列并（如果需要）引入空位后，以實(shí)現(xiàn)最大百分比序列同一性，并且不將任何保守置換視為序列同一性的一部分。

出于確定百分比氨基酸序列同一性的目的的比對(duì)可以本領(lǐng)域技術(shù)范圍內(nèi)的各種方式實(shí)現(xiàn)，例如，使用公開(kāi)獲得的計(jì)算機(jī)軟件如BLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2或Megalign(DNASTAR)軟件。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以確定用于測(cè)量比對(duì)的合適參數(shù)，包括實(shí)現(xiàn)在被比較序列的全長(zhǎng)上的最大比對(duì)所需的任何算法。例如，可使用序列比較程序NCBI-BLAST2確定%氨基酸序列同一性。NCBI-BLAST2序列比較程序可從ncbi.nlm.nih.gov上下載。NCBI BLAST2使用若干個(gè)搜索參數(shù)，其中將所有這些搜索參數(shù)均設(shè)為默認(rèn)值，包括，例如，無(wú)遮蔽 是，核酸鏈=全部，期望事件 10, 最小低復(fù)雜度長(zhǎng)度=15/5，多通e-值=0.01，多通常數(shù)=25，最終空位比對(duì)的衰減值=25 和 評(píng)分矩陣=BLOSUM62。在采用NCBI-BLAST2進(jìn)行氨基酸序列比較的情況下，給定氨基酸序列A相對(duì)于、與或針對(duì)給定氨基酸序列B的%氨基酸序列同一性（其或者可以描述為相對(duì)于、與或針對(duì)給定氨基酸序列B具有某一%氨基酸序列同一性的給定氨基酸序列A）的計(jì)算如下：100乘以分?jǐn)?shù)X/Y，其中X是在由序列比對(duì)程序NCBI-BLAST2進(jìn)行的A和B的比對(duì)中被評(píng)分為相同匹配的氨基酸殘基的數(shù)量，而其中Y是B中的氨基酸殘基總數(shù)。應(yīng)當(dāng)理解，當(dāng)氨基酸序列A的長(zhǎng)度與氨基酸序列B的長(zhǎng)度不相等時(shí)，A相對(duì)于B的%氨基酸序列同一性將不等于B相對(duì)于A的%氨基酸序列同一性。

從這個(gè)意義上講，用于確定氨基酸序列“相似性”的技術(shù)是本領(lǐng)域眾所周知的。通常，“相似性”指代兩個(gè)或更多個(gè)多肽在合適位置的精確的氨基酸對(duì)氨基酸比較，其中氨基酸是相同的或具有相似化學(xué)和/或物理性質(zhì)如電荷或疏水性。然后可確定所比較多肽序列間所謂的“百分比相似性”。用于確定核酸和氨基酸序列同一性的技術(shù)也是本領(lǐng)域眾所周知的，并且包括確定該基因的mRNA的核苷酸序列（通常經(jīng)由cDNA中間體）以及確定其所編碼的氨基酸序列，并且將該氨基酸序列與第二氨基酸序列進(jìn)行比較。通常，“同一性”指代兩個(gè)多核苷酸或多肽序列分別的精確的核苷酸對(duì)核苷酸或氨基酸對(duì)氨基酸對(duì)應(yīng)。兩個(gè)或更多個(gè)多核苷酸序列可以通過(guò)確定其“百分比同一性”進(jìn)行比較，兩個(gè)或更多個(gè)氨基酸序列亦可。威斯康辛序列分析包，第8版（可得自Genetics Computer Group, Madison, Wis.）中擁有的這些程序，例如，GAP程序，能夠分別計(jì)算兩個(gè)多核苷酸間的同一性以及兩個(gè)多肽序列間的同一性和相似性。用于計(jì)算序列間同一性或相似性的其它程序是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。

“對(duì)應(yīng)于”參照位置的氨基酸位置指代與參照序列對(duì)齊的位置，正如通過(guò)比對(duì)氨基酸序列所識(shí)別出的。此類比對(duì)可以通過(guò)手動(dòng)或通過(guò)使用眾所周知的序列比對(duì)程序如ClustalW2、Blast 2等完成。

除非另外指明，否則兩個(gè)多肽或多核苷酸序列的百分比同一性指代在所述兩個(gè)序列中較短一方的整個(gè)長(zhǎng)度上相同氨基酸殘基或核苷酸的百分比。

“編碼序列”依其本領(lǐng)域普通技術(shù)人員普遍和慣常所理解的意思使用，并且被不加限制地用于指代編碼特定氨基酸序列的DNA序列。

“合適的調(diào)控序列”依其本領(lǐng)域普通技術(shù)人員普遍和慣常所理解的意思使用，并且被不加限制地用于指代位于編碼序列上游(5'非編碼序列)、內(nèi)或下游(3'非編碼序列)的核苷酸序列，并且其影響該相關(guān)編碼序列的轉(zhuǎn)錄、RNA加工或穩(wěn)定性、或翻譯。調(diào)控序列可包括啟動(dòng)子、翻譯前導(dǎo)序列、內(nèi)含子和多腺苷酸化識(shí)別序列。

“啟動(dòng)子”依其本領(lǐng)域普通技術(shù)人員普遍和慣常所理解的意思使用，并且被不加限制地用于指代能夠控制編碼序列或功能性RNA的表達(dá)的DNA序列。通常，編碼序列位于啟動(dòng)子序列的3’。啟動(dòng)子可整個(gè)來(lái)源于天然基因，或由來(lái)源于天然存在的不同啟動(dòng)子的不同元件構(gòu)成，或甚至包含合成的DNA節(jié)段。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，不同的啟動(dòng)子可指導(dǎo)基因在不同細(xì)胞類型中，或在發(fā)育的不同階段，或響應(yīng)于不同環(huán)境條件的表達(dá)。引起基因于大多數(shù)時(shí)間在大多數(shù)細(xì)胞類型中表達(dá)的啟動(dòng)子通常被稱為“組成型啟動(dòng)子”。還認(rèn)識(shí)到，由于在大多數(shù)情況下，調(diào)控序列的準(zhǔn)確界限尚未完全明確，所以不同長(zhǎng)度的DNA片段可能具有相同的啟動(dòng)子活性。

術(shù)語(yǔ)“可操作地連接”指代單個(gè)核酸片段上核酸序列間的關(guān)聯(lián)，使得其中一個(gè)的功能受到另一個(gè)的影響。例如，當(dāng)啟動(dòng)子能夠影響編碼序列的表達(dá)時(shí)，則該啟動(dòng)子與該編碼序列可操作地連接（即，所述編碼序列處于所述啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄控制之下）。編碼序列可以有義或反義取向而被可操作地連接至調(diào)控序列。

如本文所用的術(shù)語(yǔ)“表達(dá)”依其本領(lǐng)域普通技術(shù)人員普遍和慣常所理解的意思使用，并且被不加限制地用于指代來(lái)源于所討論技術(shù)的核酸片段的有義(mRNA)或反義RNA的轉(zhuǎn)錄和穩(wěn)定積聚?！斑^(guò)表達(dá)”指代基因產(chǎn)物在轉(zhuǎn)基因或重組生物體中的產(chǎn)量超過(guò)在正?；蚍寝D(zhuǎn)化生物體中的生產(chǎn)水平。

“轉(zhuǎn)化”依其本領(lǐng)域普通技術(shù)人員普遍和慣常所理解的意思使用，并且被不加限制地用于指代將多核苷酸轉(zhuǎn)移到靶細(xì)胞中。所述被轉(zhuǎn)移的多核苷酸可以被并入靶細(xì)胞的基因組或染色體DNA中，得到基因上穩(wěn)定的遺傳，或其可以獨(dú)立于該宿主染色體而復(fù)制。含有轉(zhuǎn)化的核酸片段的宿主生物體被稱為“轉(zhuǎn)基因的”或“重組的”或“轉(zhuǎn)化的”生物體。

術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)化的”、“轉(zhuǎn)基因的”和“重組的”，當(dāng)在本文中結(jié)合宿主細(xì)胞使用時(shí)，依其本領(lǐng)域普通技術(shù)人員普遍和慣常所理解的意思使用，并且被不加限制地用于指代其中已經(jīng)引入了異源核酸分子的宿主生物體的細(xì)胞，如植物或微生物細(xì)胞。所述核酸分子可以被穩(wěn)定地整合到所述宿主細(xì)胞的基因組中，或所述核酸分子可以作為染色體外的分子存在。此類染色體外的分子可以是自主復(fù)制的。經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞、組織或?qū)ο髴?yīng)當(dāng)被理解為不僅涵蓋轉(zhuǎn)化過(guò)程的最終產(chǎn)物，還涵蓋其轉(zhuǎn)基因子代。

術(shù)語(yǔ)“重組的”、“異源的”和“外源的”，當(dāng)在本文中結(jié)合多核苷酸使用時(shí)，依其本領(lǐng)域普通技術(shù)人員普遍和慣常所理解的意思使用，并且被不加限制地用于指代這樣的多核苷酸（例如，DNA序列或基因），其相對(duì)于該具體宿主細(xì)胞而言起源于外部來(lái)源，或者如果來(lái)自相同來(lái)源，則在其原始形式上經(jīng)過(guò)修飾。因此，宿主細(xì)胞中的異源基因包括這樣的基因，其相對(duì)于該具體宿主細(xì)胞而言是內(nèi)源的，但已經(jīng)通過(guò)例如使用定點(diǎn)誘變或其它重組技術(shù)進(jìn)行了修飾。該術(shù)語(yǔ)還包括天然存在的DNA序列的非天然存在的多個(gè)拷貝。因此，該術(shù)語(yǔ)指代這樣的DNA節(jié)段，其相對(duì)于細(xì)胞而言是外來(lái)的或異源的，或相對(duì)于細(xì)胞而言是同源的但所述元件處在不常見(jiàn)于該宿主細(xì)胞內(nèi)的位置或形式。

類似地，術(shù)語(yǔ)“重組的”、“異源的”和“外源的”，當(dāng)在本文中結(jié)合多肽或氨基酸序列使用時(shí)，意指這樣的多肽或氨基酸序列，其相對(duì)于該具體宿主細(xì)胞而言起源于外部來(lái)源，或者如果來(lái)自相同來(lái)源，則在其原始形式上經(jīng)過(guò)修飾。因此，可以在宿主細(xì)胞中表達(dá)重組DNA節(jié)段以生產(chǎn)重組多肽。

術(shù)語(yǔ)“質(zhì)?！?、“載體”和“盒”依其本領(lǐng)域普通技術(shù)人員普遍和慣常所理解的意思使用，并且被不加限制地用于指代染色體外的元件，其通常攜帶并非細(xì)胞的核心代謝的一部分的基因，并通常處于環(huán)狀雙鏈DNA分子的形式。此類元件可能是任何來(lái)源的自主復(fù)制序列、基因組整合序列、噬菌體或核苷酸序列、線性或環(huán)狀的單鏈或雙鏈DNA或RNA，其中大量核苷酸序列已經(jīng)被接合或重組成獨(dú)特的構(gòu)造，其能夠?qū)⑦x定的基因產(chǎn)物的啟動(dòng)子片段和DNA序列連同適當(dāng)?shù)?’非翻譯序列引入到細(xì)胞中?！稗D(zhuǎn)化盒”指代特定的載體，其含有外來(lái)基因并具有除該外來(lái)基因以外的、有利于具體宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)化的元件。“表達(dá)盒”指代特定的載體，其含有外來(lái)基因并具有除該外來(lái)基因以外的、允許該基因在外來(lái)宿主中的增強(qiáng)表達(dá)的元件。

本文中所用的標(biāo)準(zhǔn)重組DNA和分子克隆技術(shù)是本領(lǐng)域眾所周知的，并且在以下文獻(xiàn)中有述，例如：Sambrook, J., Fritsch, E. F. 和 Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第2版；Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, N.Y., 1989 (在下文中稱為"Maniatis"); 和 Silhavy, T. J., Bennan, M. L. 和 Enquist, L. W. Experiments with Gene Fusions; Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, N.Y., 1984; 以及 Ausubel, F. M. 等人，In Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley-Interscience 出版, 1987; 這些文獻(xiàn)以與本文保持一致的程度各自通過(guò)引用全文并入本文中。

如本文所用，“合成的”或“有機(jī)合成的”或“化學(xué)合成的”或“有機(jī)合成”或“化學(xué)合成”（"organically synthesizing" 或 "chemically synthesizing" 或 "organic synthesis" 或 "chemical synthesis"）被用于指代通過(guò)一系列化學(xué)反應(yīng)制備化合物；這不包括例如從天然來(lái)源提取化合物。

如本文所用的術(shù)語(yǔ)“可口服產(chǎn)品”指代與人或動(dòng)物的口接觸的并且當(dāng)以通?？山邮艿臐舛确秶褂脮r(shí)對(duì)于人或動(dòng)物消費(fèi)是安全的任何飲料、食物產(chǎn)品、膳食補(bǔ)充劑、保健品、藥物組合物、牙科衛(wèi)生組合物和化妝產(chǎn)品，包括：放入并隨后從口中吐出的物質(zhì)和飲用、食用、吞咽或以其它方式攝取的物質(zhì)。

如本文所用的術(shù)語(yǔ)“食物產(chǎn)品”指代水果、蔬菜、果汁、肉制品（如火腿、熏肉和香腸）；蛋制品、水果濃縮液、明膠及明膠類產(chǎn)品（如果醬、果凍、蜜餞等）；奶制品（如冰淇淋、酸奶油、酸奶和冰凍果子露）；糖衣、糖漿（包括糖蜜）；玉米、小麥、裸麥、大豆、燕麥、水稻和大麥制品、谷物制品、堅(jiān)果仁及堅(jiān)果制品、蛋糕、餅干、糖食（如糖果、口香糖、果味滴露以及巧克力、橡皮糖、薄荷糖、奶油、糖衣、冰淇淋、餡餅和面包）。“食物產(chǎn)品”還指代調(diào)味品（如草本香料、香料和佐料）、增味劑（如谷氨酸一鈉）?！笆澄锂a(chǎn)品”還指代包括預(yù)包裝產(chǎn)品如限糖甜味劑、液態(tài)甜味劑、桌上調(diào)味料、粒狀風(fēng)味混合物，其與水重構(gòu)而提供非碳酸飲料、速溶布丁混合物、速溶咖啡和茶、咖啡伴侶、麥芽牛奶混合物、寵物食品、牲畜飼料、煙草，以及用于烘焙應(yīng)用的材料，如用于制備面包、餅干、蛋糕、煎餅、面包圈等的粉狀烘焙混合物?！笆澄锂a(chǎn)品”還指代減肥或低熱量食物以及含有少量蔗糖或不含蔗糖的飲料。

如本文所用，術(shù)語(yǔ)“立體異構(gòu)體”是對(duì)個(gè)體分子的僅在其原子的空間取向上有所不同的所有異構(gòu)體的統(tǒng)稱?！傲Ⅲw異構(gòu)體”包括對(duì)映異構(gòu)體和具有不止一個(gè)手性中心的化合物的彼此非鏡像對(duì)稱的異構(gòu)體（非對(duì)映異構(gòu)體）。

如本文所用，術(shù)語(yǔ)“非晶萊鮑迪苷D2”指代非晶態(tài)固體形式的萊鮑迪苷D2。

如本文所用，術(shù)語(yǔ)“甜味強(qiáng)度”指代個(gè)體（例如，人）所觀察到或經(jīng)歷的甜味感覺(jué)的相對(duì)強(qiáng)度，或品嘗者所檢測(cè)到的甜味的程度或量（例如在Brix量度上）。

如本文所用，術(shù)語(yǔ)“提高甜度”指代相比對(duì)應(yīng)的不含萊鮑迪苷D2的可口服產(chǎn)品，萊鮑迪苷D2在增加、加強(qiáng)、強(qiáng)化、強(qiáng)調(diào)、放大和/或增強(qiáng)本公開(kāi)的飲料產(chǎn)品或可食用產(chǎn)品的一種或多種甜味特性的感知而不改變其本質(zhì)或品質(zhì)上的效果。

如本文所用，術(shù)語(yǔ)“異味”指代一定量或程度的并非典型或通常存在于本公開(kāi)的飲料產(chǎn)品或可食用產(chǎn)品中的味道。例如，異味是消費(fèi)者可食用的增甜產(chǎn)品的不期望的味道，如苦味、類似甘草的味道、金屬味、令人厭惡的味道、澀味、延遲出現(xiàn)的甜味、悠長(zhǎng)的甜的余味等。

如本文所用，術(shù)語(yǔ)“w/v-%”指代化合物（如糖）在每100 ml含有該化合物的本公開(kāi)的液態(tài)可口服產(chǎn)品中的重量（按克計(jì)）。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“w/w-%”指代化合物（如糖）在每克含有該化合物的本公開(kāi)的可口服產(chǎn)品中的重量（按克計(jì)）。

如本文所用，術(shù)語(yǔ)“ppm”指代按重量計(jì)的份/百萬(wàn)份，例如，化合物（如萊鮑迪苷D2）在每千克含有該化合物的本公開(kāi)的可口服產(chǎn)品中的重量（按毫克計(jì)）（即，mg/kg），或化合物（如萊鮑迪苷D2）在每升含有該化合物的本公開(kāi)的可口服產(chǎn)品中的重量（按毫克計(jì)）（即，mg/L）；或按體積計(jì)，例如，化合物（如萊鮑迪苷D2）在每升含有該化合物的本公開(kāi)的可口服產(chǎn)品中的體積（按毫升計(jì)）（即，ml/L）。

根據(jù)本公開(kāi)，公開(kāi)了無(wú)熱量甜味劑及用于合成所述無(wú)熱量甜味劑的方法。根據(jù)本公開(kāi)，還公開(kāi)了酶及使用該酶制備所述無(wú)熱量甜味劑的方法。

合成的無(wú)熱量甜味劑：合成的萊鮑迪苷D2

在一個(gè)方面，本公開(kāi)涉及合成的無(wú)熱量甜味劑。所述合成的無(wú)熱量甜味劑是合成的萊鮑迪苷型甜菊醇糖苷，并且已被命名為“萊鮑迪苷D2”。如以下化學(xué)結(jié)構(gòu)(I)所示，萊鮑迪苷D2("Reb D2")是具有類似于甜菊醇糖苷萊鮑迪苷D的五個(gè)糖苷殘基的五個(gè)糖苷殘基的甜菊醇糖苷。

萊鮑迪苷D2具有分子式C₅₀H₈₀O₂₈和IUPAC名稱，13-[(2-0-β-D-吡喃葡萄糖基-6-0-β-D-吡喃葡萄糖基-6-D-吡喃葡萄糖基)氧基] ent-16-貝殼杉烯-19-酸-(2-0-β-D-吡喃葡萄糖基-β-D-吡喃葡萄糖基)酯。

如萊鮑迪苷D2、萊鮑迪苷E和萊鮑迪苷D的化學(xué)結(jié)構(gòu)所示，萊鮑迪苷D2和萊鮑迪苷D的結(jié)構(gòu)中具有五個(gè)β-D-葡萄糖基單元連接至無(wú)糖基甜菊醇，而萊鮑迪苷E含有四個(gè)D-糖苷殘基（參見(jiàn)，例如，表1和圖8）。合成的萊鮑迪苷D2在甜菊醇的C19處含有兩個(gè)糖苷殘基并在C13處含有三個(gè)糖苷殘基。相比之下，萊鮑迪苷D也包含五個(gè)糖苷殘基；在無(wú)糖基甜菊醇的C19處含有兩個(gè)糖苷殘基并在C13處含有三個(gè)糖苷殘基。萊鮑迪苷D2的第五個(gè)糖苷殘基(“糖V”)通過(guò)1,6 β 糖苷鍵而位于Reb E的C13 O-葡萄糖的C-6’，而萊鮑迪苷D的第五個(gè)糖苷殘基(“糖V”)通過(guò)1,3 β 糖苷鍵而位于Reb E的C13 O-葡萄糖的C-3’(參見(jiàn)，圖8）。然而，萊鮑迪苷E在C19處含有兩個(gè)糖苷殘基并在C13處含有兩個(gè)糖苷殘基。不受理論的約束，據(jù)信，具有5個(gè)糖苷殘基的甜菊醇糖苷（萊鮑迪苷D）和具有4個(gè)糖苷殘基的甜菊醇糖苷（萊鮑迪苷A和萊鮑迪苷E）相比具有更少的糖苷殘基的甜菊醇糖苷（甜菊苷和甜茶苷）有著明顯更好的味道品質(zhì)。

生產(chǎn)萊鮑迪苷D2的方法

在另一方面，本公開(kāi)涉及從萊鮑迪苷E合成萊鮑迪苷D2的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括：制備反應(yīng)混合物，所述反應(yīng)混合物包含：萊鮑迪苷E、底物（選自蔗糖、尿苷二磷酸(UDP)和尿苷二磷酸-葡萄糖(UDP-葡萄糖)）以及UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶（選自尿苷二磷酸糖基轉(zhuǎn)移酶和UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶融合酶（EUS），所述EUS包含偶聯(lián)至蔗糖合成酶結(jié)構(gòu)域的尿苷二磷酸（UDP）糖基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域）；并將所述反應(yīng)混合物溫育足夠的時(shí)間以生成萊鮑迪苷D2，其中葡萄糖被共價(jià)偶聯(lián)至所述萊鮑迪苷E以生成萊鮑迪苷D2。

特別合適的尿苷二磷酸（UDP）糖基轉(zhuǎn)移酶可以是，例如，EUGT11(如WO 2013022989中所述)。EUGT11是尿苷5'-二磷酸-依賴性糖基轉(zhuǎn)移酶("UGT")，其具有1,2-19-O-葡萄糖和1,2-13-O-葡萄糖糖基化活性。已知EUGT11催化甜菊苷至萊鮑迪苷E以及萊鮑迪苷A至萊鮑迪苷D的生產(chǎn)。然而，令人驚奇且出乎意料的是，已發(fā)現(xiàn)，尿苷二磷酸（UDP）糖基轉(zhuǎn)移酶可以被用于將萊鮑迪苷E體外轉(zhuǎn)化成萊鮑迪苷D2。

合適的尿苷二磷酸糖基轉(zhuǎn)移酶可以是，例如，稻尿苷二磷酸糖基轉(zhuǎn)移酶EUGT11。特別合適的尿苷二磷酸糖基轉(zhuǎn)移酶具有SEQ ID NO: l的氨基酸序列。

所述方法還可以包括向所述含有尿苷二磷酸(UDP)糖基轉(zhuǎn)移酶的反應(yīng)混合物中添加蔗糖合成酶。向所述含有尿苷二磷酸糖基轉(zhuǎn)移酶的反應(yīng)混合物中添加蔗糖合成酶構(gòu)建起“UGT-SUS偶聯(lián)系統(tǒng)”。在所述UGT-SUS偶聯(lián)系統(tǒng)中，可以從UDP和蔗糖再生UDP-葡萄糖，這允許省略掉向所述反應(yīng)混合物中添加額外的UDP-葡萄糖或允許在所述反應(yīng)混合物中使用UDP。

合適的蔗糖合成酶結(jié)構(gòu)域可以是例如，擬南芥屬蔗糖合成酶1、擬南芥屬蔗糖合成酶3和綠豆蔗糖合成酶。特別合適的蔗糖合成酶結(jié)構(gòu)域可以是，例如，擬南芥屬蔗糖合成酶1。特別合適的擬南芥屬蔗糖合成酶1是擬南芥蔗糖合成酶1(AtSUS1)。特別合適的蔗糖合成酶1可以是，例如，具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的蔗糖合成酶1。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶可以是UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶融合酶(在本文中也稱為“EUS”)，其包含偶聯(lián)至蔗糖合成酶結(jié)構(gòu)域的尿苷二磷酸糖基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域。所述UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶融合酶在下文中有更詳細(xì)的描述。

在反應(yīng)中，所述UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶(例如，EUGT11和EUS)具有1,6-13 O 葡萄糖糖基化活性，并且在一個(gè)實(shí)施方案中，可以將葡萄糖分子轉(zhuǎn)移至萊鮑迪苷E以形成萊鮑迪苷D2。所述UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶(例如，EUGT11和EUS)還具有1,2-19 O-葡萄糖和1,2-13-O-葡萄糖糖基化活性。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶可以將葡萄糖分子轉(zhuǎn)移至甜菊苷以形成萊鮑迪苷E，并且還可以將葡萄糖分子轉(zhuǎn)移至萊鮑迪苷A以形成萊鮑迪苷D。另外，所述EUS融合酶具有蔗糖合成酶活性，并因而可以從UDP和蔗糖再生UDP-葡萄糖。

特別合適的實(shí)施方案涉及使用UGT-SUS偶聯(lián)系統(tǒng)從萊鮑迪苷E生產(chǎn)萊鮑迪苷D2的方法。所述方法包括：制備反應(yīng)混合物，所述反應(yīng)混合物包含：萊鮑迪苷E、蔗糖、尿苷二磷酸（UDP）、尿苷二磷酸糖基轉(zhuǎn)移酶和蔗糖合成酶；并將所述反應(yīng)混合物溫育足夠的時(shí)間以生成萊鮑迪苷D2，其中葡萄糖被共價(jià)偶聯(lián)至所述萊鮑迪苷E以生成萊鮑迪苷D2。

用于此實(shí)施方案的方法中的合適的UDP糖基轉(zhuǎn)移酶與以上所述的相同。用于此實(shí)施方案的方法中的合適的蔗糖合成酶與以上所述的相同。

另一個(gè)特別合適的實(shí)施方案涉及使用UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶融合酶從萊鮑迪苷E生產(chǎn)萊鮑迪苷D2的方法，所述融合酶包含偶聯(lián)至蔗糖合成酶結(jié)構(gòu)域的尿苷二磷酸糖基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域。所述方法包括：制備反應(yīng)混合物，所述反應(yīng)混合物包含：萊鮑迪苷E、蔗糖、尿苷二磷酸（UDP）、尿苷二磷酸糖基轉(zhuǎn)移酶融合酶，所述融合酶包含偶聯(lián)至蔗糖合成酶結(jié)構(gòu)域的尿苷二磷酸糖基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域；并將所述反應(yīng)混合物溫育足夠的時(shí)間以生成萊鮑迪苷D2，其中葡萄糖被共價(jià)偶聯(lián)至所述萊鮑迪苷E以生成萊鮑迪苷D2。

特別合適的UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶融合酶在下文中有更詳細(xì)的描述。

在另一方面，本公開(kāi)涉及從甜菊苷合成萊鮑迪苷D2的方法。所述從甜菊苷合成萊鮑迪苷D2的方法包括：制備反應(yīng)混合物，所述反應(yīng)混合物包含：甜菊苷、底物（選自蔗糖、尿苷二磷酸(UDP)和尿苷二磷酸-葡萄糖(UDP-葡萄糖)）以及UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶（選自尿苷二磷酸糖基轉(zhuǎn)移酶和UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶融合酶，所述融合酶包含偶聯(lián)至蔗糖合成酶結(jié)構(gòu)域的尿苷二磷酸糖基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域）；并將所述反應(yīng)混合物溫育足夠的時(shí)間以生成萊鮑迪苷D2，其中葡萄糖被共價(jià)偶聯(lián)至所述甜菊苷以生成萊鮑迪苷E中間體，并且其中葡萄糖被共價(jià)偶聯(lián)至所述萊鮑迪苷E中間體以生成萊鮑迪苷D2。

最初，用于此實(shí)施方案的方法中的UDP糖基轉(zhuǎn)移酶與以上所述的相同。如上所述，所述方法還可包括向所述含有尿苷二磷酸糖基轉(zhuǎn)移酶的反應(yīng)混合物中添加蔗糖合成酶以構(gòu)建UGT-SUS偶聯(lián)系統(tǒng)。

特別合適的實(shí)施方案涉及使用UGT-SUS偶聯(lián)系統(tǒng)從甜菊苷生產(chǎn)萊鮑迪苷D2的方法。所述方法包括：制備反應(yīng)混合物，所述反應(yīng)混合物包含：甜菊苷、蔗糖、尿苷二磷酸（UDP）、尿苷二磷酸糖基轉(zhuǎn)移酶和蔗糖合成酶；并將所述反應(yīng)混合物溫育足夠的時(shí)間以生成萊鮑迪苷D2，其中葡萄糖被共價(jià)偶聯(lián)至所述甜菊苷以生成萊鮑迪苷E中間體，并且其中葡萄糖被共價(jià)偶聯(lián)至所述萊鮑迪苷E中間體以生成萊鮑迪苷D2。

用于此實(shí)施方案的方法中的合適的UDP糖基轉(zhuǎn)移酶與以上所述的相同。用于此實(shí)施方案的方法中的合適的蔗糖合成酶與以上所述的相同。

另一個(gè)特別合適的實(shí)施方案涉及使用UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶融合酶從甜菊苷生產(chǎn)萊鮑迪苷D2的方法，所述融合酶包含偶聯(lián)至蔗糖合成酶結(jié)構(gòu)域的尿苷二磷酸糖基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域。所述方法包括：制備反應(yīng)混合物，所述反應(yīng)混合物包含：甜菊苷、底物（選自蔗糖、尿苷二磷酸(UDP)）以及UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶融合酶，所述融合酶包含偶聯(lián)至蔗糖合成酶結(jié)構(gòu)域的尿苷二磷酸糖基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域；并將所述反應(yīng)混合物溫育足夠的時(shí)間以生成萊鮑迪苷D2，其中葡萄糖被共價(jià)偶聯(lián)至所述甜菊苷以生成萊鮑迪苷E中間體，并且其中葡萄糖被共價(jià)偶聯(lián)至所述萊鮑迪苷E中間體以生成萊鮑迪苷D2。

特別合適的UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶融合酶在下文中有更詳細(xì)的描述。

UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶融合酶

在另一方面，本公開(kāi)涉及UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶融合酶（在本文中也稱為“EUS”）。具體地講，所述UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶融合酶包含偶聯(lián)至蔗糖合成酶結(jié)構(gòu)域的尿苷二磷酸糖基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域。所述EUS融合酶具有1,2-19 O-葡萄糖糖基化活性。令人驚奇且出乎意料的是，所述EUS融合酶還具有1,6-13 O-葡萄糖糖基化活性，其可以將葡萄糖分子轉(zhuǎn)移至萊鮑迪苷E以形成萊鮑迪苷D2。另外，所述EUS融合酶具有蔗糖合成酶活性，并因而可以從UDP和蔗糖再生UDP-葡萄糖。

所述UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶融合酶可以具有與SEQ ID NO:5中所示的氨基酸序列至少70%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%和甚至100%相同的多肽序列。合適地，所述UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶融合酶的氨基酸序列與SEQ ID No:5具有至少80%的同一性。更合適地，所述UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶融合酶的氨基酸序列可以與SEQ ID NO:5中所示的氨基酸序列具有至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%和甚至100%的氨基酸序列同一性。

在另一方面，本公開(kāi)涉及分離的核酸，其具有編碼本文所述的UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶融合酶的核苷酸序列。例如，所述分離的核酸可以包含這樣的核苷酸序列，其編碼UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶融合酶的多肽，所述多肽的核酸序列與SEQ ID NO: 6中所示的核酸序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%和甚至100%的序列同源性。合適地，所述分離的核酸包含這樣的核苷酸序列，其編碼UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶融合酶的多肽，所述多肽的氨基酸序列與SEQ ID NO:5中所示的氨基酸序列具有至少80%的序列同一性。更合適地，所述分離的核酸包含這樣的核苷酸序列，其編碼UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶融合酶的多肽，所述多肽的氨基酸序列與SEQ ID NO:5中所示的氨基酸序列具有至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%和甚至100%的序列同一性。因此，所述分離的核酸包含這樣的核苷酸序列，其編碼SEQ ID NO:5的功能性片段、SEQ ID NO:5的功能性變體或其它同源多肽，所述同源多肽與SEQ ID NO:5具有例如至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%和甚至100%的序列同一性。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，所述編碼UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶的核酸序列可以經(jīng)過(guò)密碼子優(yōu)化以在合適的宿主生物體（如例如細(xì)菌和酵母）中表達(dá)。

合適的尿苷二磷酸糖基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域可以是稻尿苷二磷酸糖基轉(zhuǎn)移酶EUGT11(GenBank登錄號(hào)AC133334)。特別合適的尿苷二磷酸糖基轉(zhuǎn)移酶EUGT11可以是，例如，具有SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的尿苷二磷酸糖基轉(zhuǎn)移酶EUGT11結(jié)構(gòu)域。

合適的蔗糖合成酶結(jié)構(gòu)域可以是例如，擬南芥屬蔗糖合成酶1、擬南芥屬蔗糖合成酶3和綠豆蔗糖合成酶。特別合適的蔗糖合成酶結(jié)構(gòu)域可以是，例如，擬南芥屬蔗糖合成酶1。特別合適的擬南芥屬蔗糖合成酶1是擬南芥蔗糖合成酶1(AtSUS1)。特別合適的蔗糖合成酶1結(jié)構(gòu)域可以是，例如，具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的蔗糖合成酶1。

蔗糖合成酶催化NDP-葡萄糖與D-果糖之間的化學(xué)反應(yīng)以生成NDP和蔗糖。蔗糖合成酶是糖基轉(zhuǎn)移酶。此類酶的系統(tǒng)命名是NDP-葡萄糖:D-果糖 2-α-D-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶。其它常用名稱包括：UDP葡萄糖-果糖葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶、蔗糖合成酶、蔗糖-UDP葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶、蔗糖-尿苷二磷酸葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶以及尿苷二磷酸葡萄糖-果糖葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶。

生產(chǎn)萊鮑迪苷D的方法

在另一方面，本公開(kāi)涉及合成萊鮑迪苷D的方法。所述方法包括：制備反應(yīng)混合物，所述反應(yīng)混合物包含：萊鮑迪苷A、底物（選自蔗糖、尿苷二磷酸(UDP)和尿苷二磷酸-葡萄糖(UDP-葡萄糖)）以及UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶（選自尿苷二磷酸糖基轉(zhuǎn)移酶和UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶融合酶（EUS），所述EUS包含偶聯(lián)至蔗糖合成酶結(jié)構(gòu)域的尿苷二磷酸糖基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域）；并將所述反應(yīng)混合物溫育足夠的時(shí)間以生成萊鮑迪苷D，其中葡萄糖被共價(jià)偶聯(lián)至所述萊鮑迪苷A以生成萊鮑迪苷D。

在其中所述UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶是尿苷二磷酸糖基轉(zhuǎn)移酶的實(shí)施方案中，合適的尿苷二磷酸糖基轉(zhuǎn)移酶可以是稻尿苷二磷酸糖基轉(zhuǎn)移酶EUGT11(GenBank登錄號(hào)AC133334)。特別合適的尿苷二磷酸糖基轉(zhuǎn)移酶可以是，例如，具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的尿苷二磷酸糖基轉(zhuǎn)移酶。

在其中所述UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶是尿苷二磷酸糖基轉(zhuǎn)移酶的實(shí)施方案中，所述方法還可以包括向所述反應(yīng)混合物中添加蔗糖合成酶。合適的蔗糖合成酶可以是例如，擬南芥屬蔗糖合成酶1、擬南芥屬蔗糖合成酶3和綠豆蔗糖合成酶。特別合適的蔗糖合成酶可以是，例如，擬南芥屬蔗糖合成酶1。特別合適的擬南芥屬蔗糖合成酶1是擬南芥蔗糖合成酶1(AtSUS1)。特別合適的蔗糖合成酶1可以是，例如，具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的蔗糖合成酶1。

在其中所述UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶是UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶融合酶(EUS)（如上所述，其包含偶聯(lián)至蔗糖合成酶結(jié)構(gòu)域的尿苷二磷酸糖基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域）的實(shí)施方案中，合適的尿苷二磷酸糖基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域可以是稻尿苷二磷酸糖基轉(zhuǎn)移酶EUGT11(GenBank登錄號(hào)AC133334)。特別合適的尿苷二磷酸糖基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域可以是，例如，具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的尿苷二磷酸糖基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域。特別合適的蔗糖合成酶1結(jié)構(gòu)域可以具有，例如，SEQ ID NO:3的氨基酸序列。特別合適的UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶融合酶(EUS)可以具有，例如，SEQ ID NO:5的氨基酸序列。

特別合適的實(shí)施方案涉及使用UGT-SUS偶聯(lián)系統(tǒng)合成萊鮑迪苷D的方法。所述方法包括：制備反應(yīng)混合物，所述反應(yīng)混合物包含：萊鮑迪苷A、蔗糖、尿苷二磷酸（UDP）、UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶和蔗糖合成酶；并將所述反應(yīng)混合物溫育足夠的時(shí)間以生成萊鮑迪苷D，其中葡萄糖被共價(jià)偶聯(lián)至所述萊鮑迪苷A以生成萊鮑迪苷D。

用于此實(shí)施方案的方法中的合適的UDP糖基轉(zhuǎn)移酶與以上所述的相同。用于此實(shí)施方案的方法中的合適的蔗糖合成酶與以上所述的相同。

特別合適的實(shí)施方案涉及使用UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶融合酶合成萊鮑迪苷D的方法。所述方法包括：制備反應(yīng)混合物，所述反應(yīng)混合物包含：萊鮑迪苷A、蔗糖、尿苷二磷酸（UDP）以及UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶融合酶(EUS)，所述EUS包含偶聯(lián)至蔗糖合成酶結(jié)構(gòu)域的尿苷二磷酸糖基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域；并將所述反應(yīng)混合物溫育足夠的時(shí)間以生成萊鮑迪苷D，其中葡萄糖被共價(jià)偶聯(lián)至所述萊鮑迪苷A以生成萊鮑迪苷D。

特別合適的UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶融合酶在上文中有更詳細(xì)的描述。

可口服產(chǎn)品

在另一方面，本公開(kāi)涉及包含增甜量的萊鮑迪苷D2的可口服產(chǎn)品，所述產(chǎn)品選自飲料產(chǎn)品和可食用產(chǎn)品。

所述可口服產(chǎn)品可以與約1% (w/v-%)至約4% (w/v-%)的蔗糖溶液具有等同的甜味強(qiáng)度。

所述可口服產(chǎn)品可以含有約5 ppm至約100 ppm的萊鮑迪苷D2。

萊鮑迪苷D2可以是所述可口服產(chǎn)品中唯一的甜味劑。

所述可口服產(chǎn)品還可以含有至少一種另外的甜味劑。所述至少一種另外的甜味劑可以是例如，天然的高強(qiáng)度甜味劑。所述另外的甜味劑可以選自：甜菊提取物、甜菊醇糖苷、甜菊苷、萊鮑迪苷A、萊鮑迪苷B、萊鮑迪苷C、萊鮑迪苷D、萊鮑迪苷E、萊鮑迪苷F、杜克苷A、甜茶苷、甜菊雙糖苷、蔗糖、高果糖玉米糖漿、果糖、葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、鼠李糖、赤蘚糖醇、木糖醇、甘露糖醇、山梨糖醇、肌醇、AceK、阿斯巴甜、紐甜、三氯蔗糖、糖精、柚皮苷二氫查爾酮(arDHC)、新橙皮苷二氫查耳酮(NDHC)、甜茶苷、羅漢果苷IV、賽門苷I、羅漢果苷V、莫納甜、奇異果甜蛋白、應(yīng)樂(lè)果甜蛋白、布那珍、L-丙氨酸、甘氨酸、羅漢果（Lo Han Guo）、hernandulcin、葉甜素、trilobtain及其組合。

所述可口服產(chǎn)品還可以含有至少一種添加劑。所述添加劑可以是，例如：碳水化合物、多元醇、氨基酸或其鹽、聚氨基酸或其鹽、糖酸或其鹽、核苷酸、有機(jī)酸、無(wú)機(jī)酸、有機(jī)鹽、有機(jī)酸鹽、有機(jī)堿鹽、無(wú)機(jī)鹽、苦味化合物、風(fēng)味料、風(fēng)味成分、收斂化合物、蛋白質(zhì)、蛋白水解產(chǎn)物、表面活性劑、乳化劑、類黃酮、酒精、聚合物及其組合。

在一個(gè)方面，本公開(kāi)涉及包含增甜量的萊鮑迪苷D2的飲料產(chǎn)品。

所述飲料產(chǎn)品可以是，例如，碳酸飲料產(chǎn)品和非碳酸飲料產(chǎn)品。所述飲料產(chǎn)品還可以是，例如：軟飲料、噴泉飲料、冰凍飲料；即飲型飲料；冷凍且即飲型飲料、咖啡、茶、乳飲料、粉狀軟飲料、濃縮液、加味水、強(qiáng)化水、果汁、果汁調(diào)味飲料、運(yùn)動(dòng)飲料和能量飲料。

在一些實(shí)施方案中，本公開(kāi)的飲料產(chǎn)品可以包含一種或多種飲料成分，如例如：酸化劑、果汁和/或蔬菜汁、果肉等、風(fēng)味劑、著色劑、防腐劑、維生素、礦物質(zhì)、電解質(zhì)、赤蘚糖醇、塔格糖、甘油和二氧化碳。此類飲料產(chǎn)品可以任何合適形式提供，如飲料濃縮液和碳酸即飲型飲料。

在某些實(shí)施方案中，本公開(kāi)的飲料產(chǎn)品可以具有眾多不同特定配方或組成中的任一種。本公開(kāi)的飲料產(chǎn)品的配方可以在某種程度上變化，這取決于如下因素：該產(chǎn)品的預(yù)期細(xì)分市場(chǎng)、其需要的營(yíng)養(yǎng)特性、風(fēng)味屬性等。例如，在某些實(shí)施方案中，向具體的飲料產(chǎn)品中添加另外的成分通?？梢允且粋€(gè)選項(xiàng)。例如，可以添加另外的（即，更多的和/或其它的）甜味劑，通?？蓪L(fēng)味劑、電解質(zhì)、維生素、果汁或其它水果產(chǎn)品、增味劑、掩蔽劑等、風(fēng)味增強(qiáng)劑和/或碳酸化添加至任何此類配方中以改變味道、口感、營(yíng)養(yǎng)特性等。在實(shí)施方案中，所述飲料產(chǎn)品可以是可樂(lè)飲料，其含有水、約5 ppm至約100 ppm的萊鮑迪苷D2、酸化劑和風(fēng)味劑。示例性風(fēng)味劑可以是，例如，可樂(lè)風(fēng)味劑、柑橘風(fēng)味劑和香料風(fēng)味劑。在一些實(shí)施方案中，可以二氧化碳的形式添加碳酸化用于泡騰。在其它實(shí)施方案中，可以根據(jù)其它成分、生產(chǎn)技術(shù)、所需保質(zhì)期等添加防腐劑。在某些實(shí)施方案中，可以添加咖啡因。在一些實(shí)施方案中，所述飲料產(chǎn)品可以是可樂(lè)味碳酸飲料，特征在于含有碳酸水、甜味劑、可樂(lè)果提取物和/或其它風(fēng)味劑、焦糖色、一種或多種酸和任選的其它成分。

存在于所述飲料產(chǎn)品中的萊鮑迪苷D2的合適的量可以是，例如，約5 ppm至約100 ppm。在一些實(shí)施方案中，低濃度的萊鮑迪苷D2，例如，低于100 ppm，與濃度為10,000至30,000 ppm的蔗糖溶液具有等同的甜度。所述最終濃度的范圍是：約5 ppm至約100 ppm、約5 ppm至約95 ppm、約5 ppm至約90 ppm、約5 ppm至約85 ppm、約5 ppm至約80 ppm、約5 ppm至約75 ppm、約5 ppm至約70 ppm、約5 ppm至約65 ppm、約5 ppm至約60 ppm、約5 ppm至約55 ppm、約5 ppm至約50 ppm、約5 ppm至約45 ppm、約5 ppm至約40 ppm、約5 ppm至約35 ppm、約5 ppm至約30 ppm、約5 ppm至約25 ppm、約5 ppm至約20 ppm、約5 ppm至約15 ppm、或約5 ppm至約10 ppm。作為另外一種選擇，萊鮑迪苷D2可以范圍如下的最終濃度存在于本公開(kāi)的飲料產(chǎn)品中：約5 ppm至約100 ppm、約10 ppm至約100 ppm、約15 ppm至約100 ppm、約20 ppm至約100 ppm、約25 ppm至約100 ppm、約30 ppm至約100 ppm、約35 ppm至約100 ppm、約40 ppm至約100 ppm、約45 ppm至約100 ppm、約50 ppm至約100 ppm、約55 ppm至約100 ppm、約60 ppm至約100 ppm、約65 ppm至約100 ppm、約70 ppm至約100 ppm、約75 ppm至約100 ppm、約80 ppm至約100 ppm、約85 ppm至約100 ppm、約90 ppm至約100 ppm、或約95 ppm至約100 ppm。

在另一方面，本公開(kāi)涉及包含增甜量的萊鮑迪苷D2的可食用產(chǎn)品。所述可食用產(chǎn)品可以是，例如：食物產(chǎn)品、保健品、藥物、膳食補(bǔ)充劑、牙科衛(wèi)生組合物、可食用凝膠組合物、化妝產(chǎn)品和桌上調(diào)味料。

如本文所用，“膳食補(bǔ)充劑”指代旨在補(bǔ)充膳食并提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)（如維生素、礦物質(zhì)、纖維、脂肪酸、氨基酸等）的化合物，其可能缺失或可能未在飲食中攝入足夠的量?？墒褂帽绢I(lǐng)域已知的任何合適的膳食補(bǔ)充劑。合適的膳食補(bǔ)充劑的實(shí)例可以是，例如，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、維生素、礦物質(zhì)、纖維、脂肪酸、藥草、植物制劑、氨基酸和代謝物。

如本文所用，“保健品”指代這樣的化合物，其包括可提供醫(yī)藥或健康益處的任何食物或食物的一部分，所述益處包括預(yù)防和/或治療疾病或障礙（例如，疲勞、失眠、衰老、記憶喪失、心境障礙、心血管疾病和血液中高水平的膽固醇、糖尿病、骨質(zhì)疏松、炎癥、自身免疫性疾病等）?？墒褂帽绢I(lǐng)域已知的任何合適的保健品。在一些實(shí)施方案中，保健品可以被用作對(duì)食物和飲料的補(bǔ)充以及作為用于腸內(nèi)或腸外應(yīng)用的藥物制劑，其可能是固體制劑（如膠囊或片劑）或液體制劑（如溶液或懸浮液）。

在一些實(shí)施方案中，膳食補(bǔ)充劑和保健品還可以含有：保護(hù)性水解膠體（例如樹膠、蛋白質(zhì)、改性淀粉）、粘結(jié)劑、成膜劑、膠囊包封劑/材料、壁/殼材料、基質(zhì)化合物、包衣、乳化劑、表面活性劑、增溶劑（油、脂肪、蠟、卵磷脂等）、吸附劑、載體、填充劑、共化合物、分散劑、潤(rùn)濕劑、加工助劑（溶劑）、流化劑、掩味劑、增重劑、果凍化劑、凝膠形成劑、抗氧化劑和抗菌劑。

如本文所用，“凝膠”指代膠態(tài)體系，其中顆粒的網(wǎng)絡(luò)散布于液體介質(zhì)的整個(gè)體積中。盡管凝膠主要由液體構(gòu)成，并因而具有類似于液體的密度，但是由于散布于液體介質(zhì)中的顆粒網(wǎng)絡(luò)，使得凝膠具有固體的結(jié)構(gòu)連貫性。因此，凝膠通?？雌饋?lái)是固態(tài)、果凍狀的材料。凝膠可以被用于許多應(yīng)用中。例如，凝膠可以被用于食品、油漆和粘接劑。可以食用的凝膠被稱為“可食用凝膠組合物”?？墒秤媚z組合物通常作為零食、甜品、主食的一部分食用，或伴著主食一起食用。合適的可食用凝膠組合物的實(shí)例可以是，例如：凝膠甜品、布丁、果醬、果凍、糊醬、乳脂松糕、肉凍、棉花軟糖、橡皮糖等。在一些實(shí)施方案中，可食用凝膠混合物通常是粉末狀或顆粒狀固體，可向其中加入液體以形成可食用凝膠組合物。合適的液體的實(shí)例可以是，例如：水、乳液、類乳液體、果汁、酒精、酒精性飲料及其組合。合適的乳液的實(shí)例可以是，例如：奶、發(fā)酵奶、奶油、液體乳清及其混合物。合適的類乳液體的實(shí)例可以是，例如：豆奶和非乳制咖啡伴侶。

如本文所用，術(shù)語(yǔ)“膠凝成分”指代可以在液體介質(zhì)內(nèi)形成膠態(tài)體系的任何材料。合適的膠凝成分的實(shí)例可以是，例如：明膠、藻酸鹽、角叉菜膠、樹膠、果膠、魔芋、瓊脂、食品酸、凝乳酶、淀粉、淀粉衍生物及其組合。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的是，可食用凝膠混合物或可食用凝膠組合物中所用膠凝成分的量可以根據(jù)許多因素而有很大差異，所述因素如例如，所用的具體膠凝成分、所用的具體液體基質(zhì)以及該凝膠的所需特性。

本公開(kāi)的凝膠混合物和凝膠組合物可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的任何合適的方法制備。在一些實(shí)施方案中，本公開(kāi)的可食用凝膠混合物和可食用凝膠組合物可以使用除萊鮑迪苷D2和所述膠凝劑以外的其它成分制備。其它合適的成分的實(shí)例可以是，例如：食品酸、食品酸的鹽、緩沖系統(tǒng)、增量劑、多價(jià)螯合劑、交聯(lián)劑、一種或多種香精、一種或多種色素及其組合。

可使用本領(lǐng)域已知的任何合適的藥物組合物。在某些實(shí)施方案中，本公開(kāi)的藥物組合物可以含有約5 ppm至約100 ppm的萊鮑迪苷D2和一種或多種藥學(xué)上可接受的賦形劑。在一些實(shí)施方案中，本公開(kāi)的藥物組合物可以被用于配制含有一種或多種發(fā)揮生物效應(yīng)的活性試劑的藥品。因此，在一些實(shí)施方案中，本公開(kāi)的藥物組合物可以含有一種或多種發(fā)揮生物效應(yīng)的活性試劑。合適的活性試劑是本領(lǐng)域眾所周知的（例如，The Physician's Desk Reference）。此類組合物可以根據(jù)本領(lǐng)域熟知的程序制備，例如，如在Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa., USA中所述的。

萊鮑迪苷D2可以與本領(lǐng)域已知的任何合適的牙科和口腔衛(wèi)生組合物一起使用。合適的牙科和口腔衛(wèi)生組合物的實(shí)例可以是，例如：牙膏、牙齒拋光劑、牙線、洗口藥、漱口水、牙粉、口噴劑、口腔清新劑、牙斑沖洗液、牙科止痛藥等。

存在于所述可食用產(chǎn)品中的萊鮑迪苷D2的合適的量可以是，例如，約5份/百萬(wàn)份(ppm)至約100份/百萬(wàn)份(ppm)。在一些實(shí)施方案中，低濃度的萊鮑迪苷D2，例如，低于100 ppm，與濃度為10,000至30,000 ppm的蔗糖溶液具有等同的甜度。所述最終濃度的范圍是：約5 ppm至約100 ppm、約5 ppm至約95 ppm、約5 ppm至約90 ppm、約5 ppm至約85 ppm、約5 ppm至約80 ppm、約5 ppm至約75 ppm、約5 ppm至約70 ppm、約5 ppm至約65 ppm、約5 ppm至約60 ppm、約5 ppm至約55 ppm、約5 ppm至約50 ppm、約5 ppm至約45 ppm、約5 ppm至約40 ppm、約5 ppm至約35 ppm、約5 ppm至約30 ppm、約5 ppm至約25 ppm、約5 ppm至約20 ppm、約5 ppm至約15 ppm、或約5 ppm至約10 ppm。作為另外一種選擇，萊鮑迪苷D2可以范圍如下的最終濃度存在于本公開(kāi)的可食用產(chǎn)品中：約5 ppm至約100 ppm、約10 ppm至約100 ppm、約15 ppm至約100 ppm、約20 ppm至約100 ppm、約25 ppm至約100 ppm、約30 ppm至約100 ppm、約35 ppm至約100 ppm、約40 ppm至約100 ppm、約45 ppm至約100 ppm、約50 ppm至約100 ppm、約55 ppm至約100 ppm、約60 ppm至約100 ppm、約65 ppm至約100 ppm、約70 ppm至約100 ppm、約75 ppm至約100 ppm、約80 ppm至約100 ppm、約85 ppm至約100 ppm、約90 ppm至約100 ppm、或約95 ppm至約100 ppm。

在某些實(shí)施方案中，食物產(chǎn)品組合物中存在約5 ppm至約100 ppm的萊鮑迪苷D2。如本文所用，“食物產(chǎn)品組合物”指代任何固態(tài)或液態(tài)的可服用材料，其可以（但不必）具有營(yíng)養(yǎng)價(jià)值并旨在用于人類和動(dòng)物的食用。

合適的食物產(chǎn)品組合物的實(shí)例可以是，例如：糖果組合物，如糖果、薄荷糖、果味滴露、可可制品、巧克力等；調(diào)味品，如番茄醬、芥末醬、奶黃醬等；口香糖；谷物組合物；烘焙制品，如面包、蛋糕、餡餅、餅干等；乳制品，如奶、奶酪、奶油、冰淇淋、酸奶油、酸奶、冰凍果子露等；桌上甜味劑組合物；湯；燉菜；方便食品；肉類，如火腿、熏肉、香腸、肉干等；明膠及明膠類產(chǎn)品，如果醬、果凍、蜜餞等；水果；蔬菜；蛋制品；糖衣；糖漿，包括糖蜜；零食；堅(jiān)果仁及堅(jiān)果制品；以及動(dòng)物飼料。

食物產(chǎn)品組合物還可以是草本香料、香料和佐料、天然及合成的香精、以及增味劑，如谷氨酸一鈉。在一些實(shí)施方案中，食物產(chǎn)品組合物可以是，例如：預(yù)包裝產(chǎn)品，如限糖甜味劑、液態(tài)甜味劑、粒狀風(fēng)味混合物、寵物食品、牲畜飼料、煙草，以及用于烘焙應(yīng)用的材料，如用于制備面包、餅干、蛋糕、煎餅、面包圈等的粉狀烘焙混合物。在其它實(shí)施方案中，食物產(chǎn)品組合物還可以是減肥及低熱量食物以及含有少量蔗糖或不含蔗糖的飲料。

在可與任一前述實(shí)施方案結(jié)合的某些實(shí)施方案中，萊鮑迪苷D2是唯一的甜味劑，并且所述產(chǎn)品與約1%至約4% (w/v-%)的蔗糖溶液具有等同的甜味強(qiáng)度。在可以與任一前述實(shí)施方案結(jié)合的某些實(shí)施方案中，所述可食用產(chǎn)品和飲料產(chǎn)品還可以包含另外的甜味劑，其中所述產(chǎn)品與約1%至約10% (w/v-%)的蔗糖溶液具有等同的甜味強(qiáng)度。在可以與任一前述實(shí)施方案結(jié)合的某些實(shí)施方案中，所述產(chǎn)品中的每種增甜成分均是高強(qiáng)度甜味劑。在可以與任一前述實(shí)施方案結(jié)合的某些實(shí)施方案中，所述產(chǎn)品中的每種增甜成分均可以是天然的高強(qiáng)度甜味劑。在可以與任一前述實(shí)施方案結(jié)合的某些實(shí)施方案中，所述另外的甜味劑包括選自以下的一種或多種甜味劑：甜菊提取物、甜菊醇糖苷、甜菊苷、萊鮑迪苷A、萊鮑迪苷B、萊鮑迪苷C、萊鮑迪苷D、萊鮑迪苷F、杜克苷A、甜茶苷、甜菊雙糖苷、蔗糖、高果糖玉米糖漿、果糖、葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、鼠李糖、赤蘚糖醇、木糖醇、甘露糖醇、山梨糖醇、肌醇、AceK、阿斯巴甜、紐甜、三氯蔗糖、糖精、柚皮苷二氫查爾酮(arDHC)、新橙皮苷二氫查耳酮(NDHC)、甜茶苷、羅漢果苷IV、賽門苷I、羅漢果苷V、莫納甜、奇異果甜蛋白、應(yīng)樂(lè)果甜蛋白、布那珍、L-丙氨酸、甘氨酸、羅漢果（Lo Han Guo）、hernandulcin、葉甜素、trilobtain及其組合。在可以與任一前述實(shí)施方案結(jié)合的某些實(shí)施方案中，所述可食用產(chǎn)品和飲料產(chǎn)品還可以包含選自以下的一種或多種添加劑：碳水化合物、多元醇、氨基酸或其鹽、聚氨基酸或其鹽、糖酸或其鹽、核苷酸、有機(jī)酸、無(wú)機(jī)酸、有機(jī)鹽、有機(jī)酸鹽、有機(jī)堿鹽、無(wú)機(jī)鹽、苦味化合物、風(fēng)味料、風(fēng)味成分、收斂化合物、蛋白質(zhì)、蛋白水解產(chǎn)物、表面活性劑、乳化劑、類黃酮、酒精、聚合物及其組合。在可以與任一前述實(shí)施方案結(jié)合的某些實(shí)施方案中，在其被添加到所述產(chǎn)品中之前，萊鮑迪苷D2具有按重量計(jì)約50%至約100%的純度。

甜味劑

在另一方面，本公開(kāi)涉及甜味劑，其化學(xué)結(jié)構(gòu)為：

。

所述甜味劑還可以包含下列中的至少一種：填充劑、增量劑和防結(jié)塊劑。合適的填充劑、增量劑和防結(jié)塊劑是本領(lǐng)域已知的。

在某些實(shí)施方案中，萊鮑迪苷D2甜味劑可以被包含在所述可食用產(chǎn)品和飲料產(chǎn)品中并且/或者以足以給所述可食用產(chǎn)品和飲料產(chǎn)品增甜和/或提高其甜度的最終濃度添加。萊鮑迪苷D2的“最終濃度”指代存在于所述最終可食用產(chǎn)品和飲料產(chǎn)品中的萊鮑迪苷D2的濃度（即，在已經(jīng)添加了所有成分和/或化合物以生產(chǎn)所述可食用產(chǎn)品和飲料產(chǎn)品之后）。因此，在某些實(shí)施方案中，萊鮑迪苷D2被包含在所述可食用產(chǎn)品和飲料產(chǎn)品中并且/或者被添加到用于制備所述可食用產(chǎn)品和飲料產(chǎn)品的化合物或成分中。萊鮑迪苷D2可能存在于單一化合物或成分中，或存在于多種化合物和成分中。在其它實(shí)施方案中，萊鮑迪苷D2被包含在所述可食用產(chǎn)品和飲料產(chǎn)品中并且/或者被添加到其中。在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，萊鮑迪苷D2以范圍如下的最終濃度被包含和/或被添加：約5 ppm至約100 ppm、約5 ppm至約95 ppm、約5 ppm至約90 ppm、約5 ppm至約85 ppm、約5 ppm至約80 ppm、約5 ppm至約75 ppm、約5 ppm至約70 ppm、約5 ppm至約65 ppm、約5 ppm至約60 ppm、約5 ppm至約55 ppm、約5 ppm至約50 ppm、約5 ppm至約45 ppm、約5 ppm至約40 ppm、約5 ppm至約35 ppm、約5 ppm至約30 ppm、約5 ppm至約25 ppm、約5 ppm至約20 ppm、約5 ppm至約15 ppm、或約5 ppm至約10 ppm。作為另外一種選擇，萊鮑迪苷D2以范圍如下的最終濃度被包含和/或被添加：約5 ppm至約100 ppm、約10 ppm至約100 ppm、約15 ppm至約100 ppm、約20 ppm至約100 ppm、約25 ppm至約100 ppm、約30 ppm至約100 ppm、約35 ppm至約100 ppm、約40 ppm至約100 ppm、約45 ppm至約100 ppm、約50 ppm至約100 ppm、約55 ppm至約100 ppm、約60 ppm至約100 ppm、約65 ppm至約100 ppm、約70 ppm至約100 ppm、約75 ppm至約100 ppm、約80 ppm至約100 ppm、約85 ppm至約100 ppm、約90 ppm至約100 ppm、或約95 ppm至約100 ppm。例如，萊鮑迪苷D2可以如下的最終濃度被包含和/或添加：約5 ppm、約10 ppm、約15 ppm、約20 ppm、約25 ppm、約30 ppm、約35 ppm、約40 ppm、約45 ppm、約50 ppm、約55 ppm、約60 ppm、約65 ppm、約70 ppm、約75 ppm、約80 ppm、約85 ppm、約90 ppm、約95 ppm、或約100 ppm，包括這些值之間的任何范圍。

在某些實(shí)施方案中，萊鮑迪苷D2是被包含在所述可食用產(chǎn)品和所述飲料產(chǎn)品中并且/或者被添加到其中的唯一的甜味劑。在此類實(shí)施方案中，所述可食用產(chǎn)品和所述飲料產(chǎn)品與約1%至約4% (w/v-%)的蔗糖溶液、約1%至約3% (w/v-%)的蔗糖溶液、或約1%至約2% (w/v-%)的蔗糖溶液具有等同的甜味強(qiáng)度。作為另外一種選擇，所述可食用產(chǎn)品和所述飲料產(chǎn)品與約1%至約4% (w/v-%)的蔗糖溶液、約2%至約4% (w/v-%)的蔗糖溶液、約3%至約4% (w/v-%)的蔗糖溶液、或約4%的蔗糖溶液具有等同的甜味強(qiáng)度。例如，所述可食用產(chǎn)品和所述飲料產(chǎn)品可與約1%、約2%、約3%或約4% (w/v-%)（包括這些值之間的任何范圍）的蔗糖溶液具有等同的甜味強(qiáng)度。

本公開(kāi)的可食用產(chǎn)品和飲料產(chǎn)品可以包含萊鮑迪苷D2與本公開(kāi)的一種或多種甜味劑的以一定比率的混合物，所述比率足以實(shí)現(xiàn)所需甜味強(qiáng)度、營(yíng)養(yǎng)特性、味道屬性、口感或其它感官因素。

參考下列非限制性實(shí)施例將更加充分地理解本公開(kāi)。

實(shí)施例

實(shí)施例1

在本實(shí)施例中，合成了所有候選UGT基因的全長(zhǎng)DNA片段。

具體地講，cDNA經(jīng)過(guò)密碼子優(yōu)化而用于大腸桿菌表達(dá)(Genscript, Piscataway, NJ)。將合成的DNA克隆到細(xì)菌表達(dá)載體，pETite N-His SUMO Kan Vector (Lucigen)中。對(duì)于編碼UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶融合酶(EUS)的核苷酸序列(參見(jiàn)，SEQ ID NO:6)，將GSG-接頭(由核苷酸序列：ggttctggt 編碼)插入到編碼稻尿苷二磷酸糖基轉(zhuǎn)移酶(EUGT11)結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列(參見(jiàn)，SEQ ID NO:2)與編碼擬南芥蔗糖合成酶1(AtSUS1)結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列(參見(jiàn)，SEQ ID NO:4)之間的框架中。表2匯總了蛋白質(zhì)和序列識(shí)別號(hào)。

將各表達(dá)構(gòu)建體分別轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)中，然后在含有50 μg/mL 卡那霉素的LB培養(yǎng)液中于37℃生長(zhǎng)直至OD₆₀₀達(dá)到0.8-1.0。通過(guò)加入1 mM 異丙基 β-D-l-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，并使培養(yǎng)物在16℃再生長(zhǎng)22小時(shí)。通過(guò)離心(3,000 x g; 10 min; 4℃)收獲細(xì)胞。收集細(xì)胞團(tuán)塊并立即使用或保存在-80℃。

將細(xì)胞團(tuán)塊重懸浮于裂解緩沖液(50 mM 磷酸鉀緩沖液，pH 7.2、25 μg/ml l溶菌酶、5 μg/ml DNase I、20 mM 咪唑、500 mM NaCl、10% 甘油 和 0.4% TRITON X-100)中。在4℃通過(guò)超聲處理破壞細(xì)胞，并通過(guò)離心(18,000 x g; 30 min)澄清細(xì)胞碎片。將上清液上樣到經(jīng)過(guò)平衡的(平衡緩沖液：50 mM 磷酸鉀緩沖液，pH 7.2、20 mM 咪唑、500 mM NaCl、10% 甘油)Ni-NTA(Qiagen)親和層析柱上。在上樣蛋白樣品后，將柱用平衡緩沖液洗滌以去除未結(jié)合的污染蛋白。用含有250mM 咪唑的平衡緩沖液洗脫His-標(biāo)簽的UGT重組多肽。純化后，通過(guò)SDS-PAGE分析重組EUGT11蛋白(圖2A中箭頭所指示的62kD條帶)和EUS融合酶(圖2B中箭頭所指示的155kD條帶)。在各個(gè)SDS凝膠圖像的左側(cè)標(biāo)明了分子量標(biāo)準(zhǔn)。

實(shí)施例2

在本實(shí)施例中，使用萊鮑迪苷A作為甜菊醇糖苷底物測(cè)定了重組EUGT11蛋白和重組EUS融合酶的1,2-19 O-葡萄糖糖基化活性。

在200 μL的體外反應(yīng)系統(tǒng)中測(cè)試了所述重組多肽(10 μg)。所述反應(yīng)系統(tǒng)含有50 mM 磷酸鉀緩沖液，pH 7.2、3 mM MgCl₂、1 mg/ml 甜菊醇糖苷底物 和 1 mM UDP-葡萄糖。反應(yīng)在30℃進(jìn)行并通過(guò)加入200 μL的1-丁醇終止。用200 μL的1-丁醇萃取樣品三次。將匯集的級(jí)分干燥并溶于70 μL的80% 甲醇中用于高效液相色譜(HPLC)分析。萊鮑迪苷A（純度 99%）被用作底物。萊鮑迪苷A得自Blue California (Rancho Santa Margarita, CA)。體外反應(yīng)進(jìn)行了14小時(shí)和24小時(shí)。圖3A示出了萊鮑迪苷D(標(biāo)記為“Reb D”)的峰用于比較。

將UGT催化的糖基化反應(yīng)與由蔗糖合成酶(例如，AtSUS1)催化的UDP-葡萄糖生成反應(yīng)偶聯(lián)起來(lái)(在本文中稱為“UGT-SUS偶聯(lián)系統(tǒng)”)。具體地講，合成了擬南芥蔗糖合成酶1(AtSUS1)序列(Bieniawska 等人，Plant J. 2007, 49: 810-828)并將其插入到細(xì)菌表達(dá)載體中。表達(dá)重組AtSUS1蛋白并通過(guò)親和層析純化。將AtSUS1蛋白加入到EUGT11蛋白中以形成體外反應(yīng)混合物，在本文中稱為EUGT11-AtSUS1偶聯(lián)系統(tǒng)。在所得到的UGT-SUS(例如，EUGT11-AtSUS1)偶聯(lián)系統(tǒng)中，從蔗糖和UDP生成了UDP-葡萄糖，從而省略掉添加另外的UDP-葡萄糖。

使用Dionex UPLC ultimate 3000 系統(tǒng)(Sunnyvale, CA)進(jìn)行HPLC分析，該系統(tǒng)包括四元泵、溫控柱室、自動(dòng)采樣器和UV吸光度檢測(cè)器。帶保護(hù)柱的Phenomenex Luna NH2（150 x 3.0 mm, 3 μm (100 A)）被用于表征甜菊醇糖苷。72% 乙腈水溶液在HPLC分析中被用于等梯度洗脫。

如圖3中所示，在所有反應(yīng)條件下，EUS和EUGT11均將糖類部分轉(zhuǎn)移至萊鮑迪苷A以生成萊鮑迪苷D。EUS融合酶(圖3B和3E)和UGT-SUS(即，EUGT11-AtSUS1)偶聯(lián)反應(yīng)系統(tǒng)(圖5D和5G)以14小時(shí)和24小時(shí)的溫育時(shí)間將萊鮑迪苷A全部轉(zhuǎn)化成萊鮑迪苷D。然而，單憑EUGT11酶在14小時(shí)(圖3C)和24小時(shí)(圖3F)僅將萊鮑迪苷A部分轉(zhuǎn)化成萊鮑迪苷D。此外，相同分子數(shù)量的EUS相比EUGT11具有更高的酶活性，并以14小時(shí)(圖3B)和24小時(shí)(圖3E)的溫育時(shí)間將全部萊鮑迪苷A轉(zhuǎn)化成萊鮑迪苷D。這些結(jié)果表明，可以使用EUS融合酶實(shí)現(xiàn)UGT-SUS(即，EUGT11-AtSUS1)偶聯(lián)系統(tǒng)的反應(yīng)。另外，這些結(jié)果表明，EUGT11顯示出1,2-19 O-葡萄糖糖基化活性以從萊鮑迪苷A生成萊鮑迪苷D(圖3C和3F)，并且AtSUS1提高了EUGT11在UGT-SUS偶聯(lián)系統(tǒng)中的轉(zhuǎn)化效率(圖3B、3D、3E和3G)。圖3A示出了甜菊苷(標(biāo)記為“Ste”)、萊鮑迪苷A(標(biāo)記為“Reb A”)和萊鮑迪苷D(標(biāo)記為“Reb D”)的峰用于比較。

實(shí)施例3

在本實(shí)施例中，使用甜菊苷作為甜菊醇糖苷底物以14小時(shí)和24小時(shí)的溫育時(shí)間測(cè)定EUGT11和EUS的1,2-19 O-葡萄糖糖基化活性，如實(shí)施例2中所述。

除了如以上實(shí)施例2中所述EUGT11將萊鮑迪苷A轉(zhuǎn)化成萊鮑迪苷D之外，EUGT11還將甜菊苷轉(zhuǎn)化成萊鮑迪苷E(在圖4中標(biāo)記為“Reb E”)。令人驚訝的是，在所有反應(yīng)中，EUGT11和EUS均生成了預(yù)料之外的化合物，萊鮑迪苷D2(在圖4中標(biāo)記為“Reb D2”），其具有約7.28分鐘的HPLC保留時(shí)間。當(dāng)AtSUS1被添加到EUGT11反應(yīng)混合物中以構(gòu)建UGT-SUS偶聯(lián)系統(tǒng)(圖4D和4G)時(shí)以及當(dāng)使用了EUS(圖4B和4E)時(shí)，生成了更多的萊鮑迪苷D2。隨著萊鮑迪苷D2產(chǎn)量的增加，生成的萊鮑迪苷E(在圖4C和4F中標(biāo)記為“Reb E”)在生產(chǎn)萊鮑迪苷D2的過(guò)程中被消耗。這些結(jié)果表明，EUGT11可以催化從萊鮑迪苷E生成萊鮑迪苷（萊鮑迪苷D2）的反應(yīng)。圖4A示出了甜菊苷(標(biāo)記為“Ste”)、萊鮑迪苷A(標(biāo)記為“Reb A”)和萊鮑迪苷D(標(biāo)記為“Reb D”)的峰用于比較。

實(shí)施例4

在本實(shí)施例中，為了確認(rèn)萊鮑迪苷E至萊鮑迪苷D2的體外轉(zhuǎn)化，使用萊鮑迪苷E作為甜菊醇糖苷底物測(cè)定了EUGT11和EUS，如實(shí)施例2中所述。

作為比較，還測(cè)定了另一種UGT(UGT76G1)的酶活性。UGT76G1（來(lái)自甜菊）已經(jīng)被鑒別為這樣的酶，其將糖類殘基轉(zhuǎn)移至甜菊苷的C13 O-葡萄糖的C-3'以形成萊鮑迪苷A。如圖5F和5J中所示，當(dāng)UGT76G1被用在UGT-SUS偶聯(lián)系統(tǒng)中時(shí)，糖類殘基被轉(zhuǎn)移至萊鮑迪苷E的C13 O-葡萄糖的C-3'以形成萊鮑迪苷D。圖5A和5B示出了經(jīng)純化的萊鮑迪苷D("Reb D")和萊鮑迪苷E("Reb-E")用于比較。

如以上實(shí)施例3中所述并如圖5C和5G中所示，單憑EUGT11可以將一個(gè)葡萄糖分子轉(zhuǎn)移至萊鮑迪苷E以形成不同于萊鮑迪苷D和E的萊鮑迪苷(在本文中稱為“萊鮑迪苷D2”并在圖5C和5G中標(biāo)記為“Reb D2”)(分別在圖5A和圖5B中比較了峰)。UGT-SUS偶聯(lián)系統(tǒng)中的EUGT11(圖5D和5H)和EUS(圖5E和5I)提高了從萊鮑迪苷E至萊鮑迪苷D2的轉(zhuǎn)化。

這些結(jié)果表明，EUGT11是具有1,2-19 O-葡萄糖糖基化活性的UGT以生產(chǎn)相關(guān)的甜菊醇糖苷。EUGT11可以催化從甜菊苷作為底物生成Reb-E以及從Reb A作為底物生成Reb D的反應(yīng)。令人驚訝的是，在以甜菊苷作為底物的體外反應(yīng)中出乎意料地合成了化合物(Reb D2)。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)確認(rèn)，Reb D2是從Reb E直接合成。根據(jù)Reb D2的結(jié)構(gòu)，在體外反應(yīng)中，EUGT11將D-葡萄糖轉(zhuǎn)移至Reb-E的C13 O-葡萄糖的C-6’以生成1,6-β-糖苷鍵。

實(shí)施例5

在本實(shí)施例中，從擴(kuò)大的體外反應(yīng)中純化萊鮑迪苷(萊鮑迪苷D2)并將其制備用于液相色譜/質(zhì)譜法(LC/MS)以及核磁共振(NMR)分析。

從擴(kuò)大的體外反應(yīng)中純化萊鮑迪苷(萊鮑迪苷D2)。通過(guò)HPLC分析監(jiān)測(cè)該體外反應(yīng)。在所需時(shí)間點(diǎn)，Reb D2化合物通過(guò)層析柱純化并通過(guò)真空干燥濃縮。經(jīng)純化的Reb D2是具有95%純度的白色粉末。將收集的Reb D2化合物用于高分辨質(zhì)譜(HRMS)分析。HRMS數(shù)據(jù)由LTQ Orbitrap Discovery HRMS儀器生成，其中其分辨率設(shè)為30k，并以正離子電噴模式從 m/z 150至1500掃描數(shù)據(jù)。針電壓設(shè)為4 kV；其它源條件為：屏蔽氣 = 25、輔助氣 = 0、吹掃氣 = 5 (所有氣流采用任意單位)、毛細(xì)管電壓 = 30V、毛細(xì)管溫度 = 300℃ 和 管透鏡電壓 = 75。將樣品用2:2: 1的乙腈:甲醇:水(與輸注液相同)稀釋，并注入50微升樣品。使用Bruker Avance DRX 500 MHz儀器或Varian INOVA 600 MHz儀器、使用標(biāo)準(zhǔn)脈沖序列采集核磁共振(NMR)光譜。1D(¹H和¹³C)和2D(TOCSY、HMQC和HMBC)NMR光譜在吡啶-d5(也稱為C₅D₅N)中進(jìn)行。

Reb D2的分子式根據(jù)其正高分辨質(zhì)譜(HRMS)而被推斷為C₅₀H₈₀O₂₈，其顯示出分別在 m/z 1 146.5169 和 1151.4721對(duì)應(yīng)于[M+ NH₄]⁺ 和 [M+ Na]⁺ 的加合離子；此組成得到¹³C NMR光譜數(shù)據(jù)的支持。Reb D2的¹H NMR光譜數(shù)據(jù)顯示出存在位于δ1.10和1.44的兩個(gè)甲基單峰、位于δ5.09和5.72的環(huán)外雙鍵的兩個(gè)烯烴質(zhì)子單峰、位于δ0.74-2.80之間的九個(gè)sp3亞甲基和兩個(gè)sp3次甲基質(zhì)子，這是分離自甜菊屬的ent-貝殼杉烷型二萜的特征。

ent-貝殼杉烷型二萜的基本骨架得到TOCSY研究的支持，其顯示出關(guān)鍵的相關(guān)性：H-l/H-2; H-2/H-3; H-5/H-6; H-6/H-7; H-9/H-l l; H-l l/H-12。Reb D2的¹H NMR光譜還顯示出存在位于δ5.04、5.10、5.21、5.48和6.30的端基質(zhì)子共振；表明其結(jié)構(gòu)中有五個(gè)糖類單位。用5% H₂S0₄酸水解Reb D2得到D-葡萄糖，其通過(guò)由TLC與真實(shí)樣品直接比較而被鑒別出。在δ5.04(d, J=7.5 Hz)、5.10(d, J=7.4 Hz)、5.21(d, J=7.9 Hz)、5.48(d, J=7.9 Hz)和6.30(d, J=7.9 Hz)觀察到的葡萄糖部分的五個(gè)端基質(zhì)子的大的耦合常數(shù)表明其如其它甜菊醇糖苷所報(bào)道的β-取向。Reb D2的¹H和¹³C NMR值是根據(jù)TOCSY、HMQC和HMBC數(shù)據(jù)分配的并匯總于表3中。

根據(jù)充分的1D(¹H和¹³C)、2D NMR(TOCSY、HMQC和HMBC)和高分辨質(zhì)譜(HRMS)數(shù)據(jù)，鑒別出Reb D2的結(jié)構(gòu)并將其與萊鮑迪苷E的結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較(參見(jiàn)，圖6)。

根據(jù)Reb D2的NMR光譜數(shù)據(jù)和水解實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，結(jié)論是：其結(jié)構(gòu)中存在連接至無(wú)糖基甜菊醇的五個(gè)β-D-葡萄糖基單元。Reb D2與萊鮑迪苷E的¹H和¹³C NMR值的仔細(xì)比較（參見(jiàn)，表2）表明存在這樣的甜菊醇無(wú)糖基部分，其在C13以醚鍵的形式具有2-O-β-D-葡萄二糖基單元并在C19以酯鍵的形式具有另一個(gè)2-O-β-D-葡萄二糖基單元，而留下額外的β-D-葡萄糖基單元未分配。此外，Reb D2的¹³C NMR光譜數(shù)據(jù)顯示糖類部分的五個(gè)氧化次甲基（oxymethine）碳之一出現(xiàn)在位于δ69.8的低場(chǎng)（downfield），表明該額外的β-D-葡萄糖基單元位于此位置。Reb D2和Reb E中兩個(gè)糖I和IV的相同質(zhì)子和碳光譜數(shù)據(jù)表明該額外的β-D-葡萄糖基單元位于糖II或糖III的6-位置。β-D-葡萄糖基部分的糖II的6-位置處的¹H和¹³C化學(xué)位移的同時(shí)低場(chǎng)位移表明該額外的β-D-葡萄糖基單元被附接至此位置。所述結(jié)構(gòu)得到關(guān)鍵TOCSY和HMBC相關(guān)性的進(jìn)一步支持，如圖7中所示。

根據(jù)NMR和質(zhì)譜數(shù)據(jù)以及水解研究的結(jié)果，通過(guò)萊鮑迪苷E的酶轉(zhuǎn)化產(chǎn)生的Reb D2的結(jié)構(gòu)被推斷為：13-[(2-O-β-D-吡喃葡萄糖基-6-O-β-D-吡喃葡萄糖基-β-D-吡喃葡萄糖基)氧基] ent-16-貝殼杉烯-19-酸-(2-0-β-D-吡喃葡萄糖基-β-D-吡喃葡萄糖基)酯。

13-[(2-0-β-D-吡喃葡萄糖基-6-0-β-D-吡喃葡萄糖基-β-D-吡喃葡萄糖基)氧基]ent-16-貝殼杉烯-19-酸-(2-0-β-D-吡喃葡萄糖基-β-D-吡喃葡萄糖基)酯(Reb D2)。白色粉末；¹H-NMR (600 MHz, C₅D₅N, δ ppm) 和 ¹³C-NMR (150 MHz, C₅D₅N, δ ppm) 光譜數(shù)據(jù)參見(jiàn)表2；HRMS (M+NH₄)⁺m/z 1146.5169 (針對(duì)C₅₀H₈₄O₂₈N計(jì)算為：1146.5180)、(M+Na)⁺m/z 1151.4721 (針對(duì)C₅₀H₈₀0₂₈Na計(jì)算為：1151.4734)。

向Reb D2(5 mg)的MeOH溶液(10 ml)中加入3 ml的5% H₂SO₄，并使混合物回流24小時(shí)。然后用飽和碳酸鈉中和反應(yīng)混合物并用乙酸乙酯(EtOAc)(2 x 25 ml)萃取以得到含有糖的水性級(jí)分和含有無(wú)糖基部分的EtOAc級(jí)分。將水相濃縮并使用TLC系統(tǒng)EtOAc/正丁醇/水(2:7: 1)和CH₂Cl₂/MeOH/水(10:6: 1)將其與標(biāo)準(zhǔn)品糖進(jìn)行比較；所述糖被鑒別為D-葡萄糖。

根據(jù)充分的1D(¹H和¹³C)和2D NMR(TOCSY、HMQC和HMBC)以及高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)和水解研究，將Reb D2的結(jié)構(gòu)確認(rèn)為13-[(2-0-β-D-吡喃葡萄糖基-6-0-β-D-吡喃葡萄糖基-β-D-吡喃葡萄糖基)氧基] ent-16-貝殼杉烯-19-酸-(2-0-β-D-吡喃葡萄糖基-β-D-吡喃葡萄糖基)酯。

實(shí)施例6

在本實(shí)施例中，將萊鮑迪苷(萊鮑迪苷D2)的結(jié)構(gòu)與Reb-E和Reb-D進(jìn)行了比較。

根據(jù)甜菊醇糖苷數(shù)據(jù)庫(kù)，僅Reb-D在其結(jié)構(gòu)中含有連接至無(wú)糖基甜菊醇的五個(gè)β-D-葡萄糖基單元：兩個(gè)糖苷殘基位于無(wú)糖基甜菊醇的C19位置，而三個(gè)糖苷殘基位于C13位置。來(lái)自甜菊的UGT76G1已經(jīng)被鑒別為這樣的酶，其將糖類殘基轉(zhuǎn)移至Reb E的C13 O-葡萄糖的C-3'以形成萊鮑迪苷D（參見(jiàn)，圖5F和5J）。Reb D2是也含有五個(gè)D-糖苷殘基的甜菊醇糖苷，其與萊鮑迪苷D相比具有不同的結(jié)構(gòu)(參見(jiàn)，圖8)。萊鮑迪苷D2的第五個(gè)糖苷殘基(“糖V”)通過(guò)1,6 β 糖苷鍵而位于Reb E的C-13-O 葡萄糖的C-6’，而萊鮑迪苷D的第五個(gè)糖苷殘基(“糖V”)通過(guò)1,3 β 糖苷鍵而位于Reb E的C13 O-葡萄糖的C-3’(參見(jiàn)，圖8)。如本文所述，EUGT11和EUG均可以直接將Reb E體外轉(zhuǎn)化成Reb D2。

實(shí)施例7

在本實(shí)施例中，對(duì)Reb D2進(jìn)行了味道測(cè)試。

使用蔗糖作為對(duì)照，進(jìn)行了Reb D2的感官評(píng)價(jià)。蔗糖樣品購(gòu)自Sigma-Aldrich，并于室溫下在瓶裝水中被制備成三種不同濃度的對(duì)照樣品：1.0%、3.0%和6.0%的蔗糖。通過(guò)向1000 mL的瓶裝水中添加對(duì)應(yīng)的質(zhì)量制備了300和600 ppm的甜菊醇糖苷Reb D2用于感官評(píng)價(jià)。將混合物在室溫下攪拌并隨后由九名志愿者組成的評(píng)審團(tuán)針對(duì)若干種對(duì)照蔗糖樣品（1.0%、3.0%和6.0%）評(píng)價(jià)了所述甜菊醇糖苷樣品。

盲測(cè)結(jié)果顯示九名志愿者中的大多數(shù)在兩種不同濃度的(300和600 ppm)Reb D2上得到一致結(jié)果；總的%甜度當(dāng)量(SE)平均值分別是約2.4和5.4。該結(jié)果表明，萊鮑迪苷D2比蔗糖甜約80-90倍。

實(shí)施例8

在本實(shí)施例中，將Reb D2的溶解度與Reb D進(jìn)行了比較。

將Reb D2和Reb D加入水中以制備含0.25 mM、0.5 mM、1 mM、1.5 mM、2 mM、5 mM和10 mM Reb D2和Reb D的溶液。Reb D2粉末立刻完全溶解在水中，然而僅0.25 mM Reb D完全溶解在水中。另外，當(dāng)在30℃加熱72小時(shí)，濃度為0.5 mM、1 mM、1.5 mM、2 mM、5 mM和10 mM的Reb D溶液不溶解。

這些結(jié)果表明，Reb D2在水中具有高于Reb D的溶解度。

根據(jù)上文，可以看出實(shí)現(xiàn)了本公開(kāi)的若干優(yōu)點(diǎn)并且獲得了其它的有利結(jié)果?？梢栽谏鲜龇椒ê拖到y(tǒng)中做出各種改動(dòng)而不脫離本公開(kāi)的范圍，在上述說(shuō)明中包含的以及在附圖中所示的所有內(nèi)容旨在應(yīng)當(dāng)被解釋為示例性而非限制性的。

當(dāng)引入本公開(kāi)的要素或其各種版本、實(shí)施方案或方面時(shí)，冠詞“一個(gè)（種）”、“該”和“所述”旨在表示存在一個(gè)（種）或多個(gè)（種）要素。術(shù)語(yǔ)“包含”、“包括”和“具有”旨在是包容性的并表示可能存在所列舉要素以外的額外的要素。