本發(fā)明屬于醫(yī)藥領(lǐng)域，且涉及免疫學(xué)。本發(fā)明涉及結(jié)合T細(xì)胞的免疫球蛋白。本發(fā)明尤其涉及結(jié)合人Vγ9Vδ2T細(xì)胞受體的免疫球蛋白。本發(fā)明提供結(jié)合人Vγ9Vδ2T細(xì)胞受體的免疫球蛋白分子，例如抗體、單鏈抗體或單域抗體，其中所述人Vγ9Vδ2T細(xì)胞是可調(diào)節(jié)的。
背景技術(shù)：
：成人中的大多數(shù)γδ外周血淋巴細(xì)胞(PBLs)表達(dá)包含Vγ9區(qū)和Vδ2區(qū)的T細(xì)胞受體(TCR)。Vγ9Vδ2T細(xì)胞可與廣泛的病原體和腫瘤細(xì)胞反應(yīng)。這種廣泛的反應(yīng)性被理解為由能夠以TCR依賴性方式特異性地激活該T細(xì)胞亞群的磷酸抗原賦予。Vγ9Vδ2T細(xì)胞的廣譜抗微生物和抗腫瘤反應(yīng)性表明直接參與癌癥和感染的免疫控制。除了抗擊疾病之外，在一些疾病或醫(yī)學(xué)治療中Vγ9Vδ2T細(xì)胞可能被過(guò)度刺激或無(wú)意激活。因此，因?yàn)榭杉せ頥γ9Vδ2T細(xì)胞的試劑可以促進(jìn)Vγ9Vδ2T細(xì)胞對(duì)病原體或感染的細(xì)胞或癌癥的反應(yīng)性，所以這些試劑可用于治療感染或癌癥。此外，阻斷Vγ9Vδ2T細(xì)胞激活的試劑可用于其中有利于減少Vγ9Vδ2T細(xì)胞激活的疾病或醫(yī)學(xué)治療，即其中Vγ9Vδ2T細(xì)胞被過(guò)度刺激或無(wú)意激活。最后，可結(jié)合Vγ9Vδ2T細(xì)胞但對(duì)Vγ9Vδ2T細(xì)胞(磷酸抗原)激活沒(méi)有作用的試劑可用于標(biāo)記細(xì)胞，例如用于篩選或鑒定Vγ9Vδ2T細(xì)胞。因此，本領(lǐng)域需要提供可結(jié)合Vγ9Vδ2T細(xì)胞的試劑，以及可以阻斷Vγ9Vδ2T細(xì)胞的磷酸抗原激活或可激活Vγ9Vδ2T細(xì)胞的試劑。發(fā)明概述本發(fā)明現(xiàn)提供可結(jié)合Vγ9Vδ2T細(xì)胞的新試劑。所提供的試劑為免疫球蛋白。所提供的免疫球蛋白結(jié)合Vγ9Vδ2T細(xì)胞受體。意外地發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明提供的免疫球蛋白具有實(shí)質(zhì)的序列同一性。因此，在本發(fā)明的第一方面，提供了結(jié)合人Vγ9Vδ2T細(xì)胞受體的免疫球蛋白分子，其包含CDR1區(qū)和CDR2區(qū)，其中，CDR1區(qū)包含與SEQIDNO.31的氨基酸序列GRTFSNYAMG具有至少40％序列同一性的氨基酸序列；和其中CDR2區(qū)包含與SEQIDNO.32的氨基酸序列AISWSGGSTYYADSVKG具有至少60％序列同一性的氨基酸序列；其中，優(yōu)選地免疫球蛋白分子為單域抗體。此外，該免疫球蛋白包含CDR3區(qū)，其中，CDR3區(qū)有助于Vγ9Vδ2T細(xì)胞受體結(jié)合并且可對(duì)免疫球蛋白分子的作用具有影響。在不受理論約束的情況下，這可以使CDR3序列涉及免疫球蛋白分子的功能，即調(diào)控類型，例如阻斷Vγ9Vδ2T細(xì)胞的激活、誘導(dǎo)Vγ9Vδ2T細(xì)胞的激活或既不阻斷也不誘導(dǎo)Vγ9Vδ2T細(xì)胞的激活。本發(fā)明的免疫球蛋白尤其用于醫(yī)學(xué)治療和用于涉及Vγ9Vδ2T細(xì)胞的測(cè)定中。優(yōu)選地，本發(fā)明的免疫球蛋白分子包含CDR3區(qū)，其中CDR3區(qū)包含選自氨基酸序列SEQIDNO.3、6、9、11、14、17、20、22、25、27、29、30、33、35、37、40、43和46的組的氨基酸序列。如下文詳細(xì)討論的，提供這些與CDR1和CDR2序列結(jié)合的CDR3區(qū)用于結(jié)合和功能。附圖說(shuō)明圖1：VHH序列的比對(duì)，其中顯示框架區(qū)(1、2、3和4)以及CDR1、CDR2和CDR3。還顯示每個(gè)VHH的編碼(即5C7是VHH5C7的序列)。圖2：VHH5E7和VHH6F6不激活Vγ9Vδ2T細(xì)胞。數(shù)據(jù)通過(guò)健康供體來(lái)源的Vγ9Vδ2T細(xì)胞與陽(yáng)性對(duì)照(表達(dá)磷酸抗原(pAg+)的HeLa細(xì)胞)比較來(lái)表明激活標(biāo)記CD25、促炎性細(xì)胞因子IFN-γ和細(xì)胞毒性分子顆粒酶B的相對(duì)表達(dá)。圖3：VHH5E7中和了健康供體來(lái)源的Vγ9Vδ2T細(xì)胞的磷酸抗原誘導(dǎo)的激活。一個(gè)典型的實(shí)例證明了使用VHH5E7磷酸化Ag誘導(dǎo)的Vγ9Vδ2T細(xì)胞激活的劑量依賴性中和，而非特異性VHH(陰性對(duì)照)不能中和磷酸化Ag誘導(dǎo)的Vγ9Vδ2T細(xì)胞激活?？v軸表示通過(guò)CD25表達(dá)評(píng)估Vγ9Vδ2T細(xì)胞的激活，橫軸表示不同的VHH濃度。使用表達(dá)磷酸抗原的HeLa細(xì)胞進(jìn)行Vγ9Vδ2T細(xì)胞刺激，表達(dá)磷酸抗原的HeLa細(xì)胞通過(guò)用遞增劑量的氨基雙膦酸帕米膦酸鹽(aminobisphosphonatepamidronate)(其導(dǎo)致HeLa細(xì)胞的磷酸抗原表達(dá)水平增加)預(yù)處理HeLa細(xì)胞而產(chǎn)生。圖4：Vγ9Vδ2TCR特異性VHH能夠在健康供體來(lái)源的Vγ9Vδ2T細(xì)胞中誘導(dǎo)激活和細(xì)胞因子產(chǎn)生。數(shù)據(jù)通過(guò)健康供體來(lái)源的Vγ9Vδ2T細(xì)胞與陽(yáng)性對(duì)照(表達(dá)磷酸抗原(pAg+)的HeLa細(xì)胞；標(biāo)準(zhǔn)化為1)和陰性對(duì)照VHH比較來(lái)表明激活標(biāo)記CD25和促炎性細(xì)胞因子IFN-γ的相對(duì)表達(dá)。每個(gè)條代表單個(gè)Vγ9Vδ2TCR特異性VHH；在Vγ9Vδ2T細(xì)胞中單個(gè)VHH在誘導(dǎo)激活和細(xì)胞因子產(chǎn)生的能力方面不同。圖5：健康供體來(lái)源的Vγ9Vδ2T細(xì)胞的劑量依賴性激活。數(shù)據(jù)表示用遞增濃度(10-100-500nM)的非激活的抗-Vγ9Vδ2TCRVHH或激活的抗-Vγ9Vδ2TCRVHH刺激24小時(shí)后的CD25表達(dá)(MFI)的變化。圖6：當(dāng)與作為雙特異性分子的腫瘤抗原特異性VHH融合時(shí)，Vγ9Vδ2TCR特異性VHH可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞死亡。在實(shí)驗(yàn)的典型實(shí)例中，在存在(有)或不存在(沒(méi)有)雙特異性納米抗體構(gòu)建體的情況下，Vγ9Vδ2T細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞系A(chǔ)431共培養(yǎng)過(guò)夜，雙特異性納米抗體構(gòu)建體由與激活抗-Vγ9Vδ2TCRVHH融合的腫瘤抗原特異性VHH組成。數(shù)據(jù)表明Vγ9Vδ2T細(xì)胞和7AAD+腫瘤細(xì)胞(表明腫瘤細(xì)胞死亡)的CD25表達(dá)(激活)和CD107a表達(dá)(脫粒)。圖7：使用流式細(xì)胞計(jì)數(shù)法測(cè)定的T細(xì)胞受體Vγ9和/或Vδ2結(jié)合特異性：典型的流式細(xì)胞計(jì)數(shù)法直方圖表明Vγ9Vδ2TCR特異性VHH(空心直方圖)和陰性對(duì)照VHH(填充的直方圖)與Vγ9Vδ2TCR表達(dá)細(xì)胞的結(jié)合。圖8：克隆VHH5C7不激活健康供體來(lái)源的Vγ9Vδ2T細(xì)胞，也不中和磷酸抗原誘導(dǎo)的健康供體來(lái)源的Vγ9Vδ2T細(xì)胞的激活。典型的實(shí)例證明VHH5C7對(duì)磷酸Ag誘導(dǎo)的Vγ9Vδ2T細(xì)胞激活沒(méi)有抑制和激活作用?？v軸表示通過(guò)CD25表達(dá)評(píng)估的Vγ9Vδ2T細(xì)胞的激活，橫軸表示不同的VHH濃度。使用表達(dá)磷酸抗原的HeLa細(xì)胞進(jìn)行Vγ9Vδ2T細(xì)胞刺激，表達(dá)磷酸抗原的HeLa細(xì)胞通過(guò)用遞增劑量的氨基雙膦酸帕米膦酸鹽(其導(dǎo)致HeLa細(xì)胞的磷酸抗原表達(dá)水平增加)預(yù)處理HeLa細(xì)胞而產(chǎn)生。圖9：免疫球蛋白的示意圖。A)由兩條重鏈和兩條輕鏈組成的人抗體；B)由可通過(guò)二硫橋鍵二聚化的兩條單鏈(或兩條重鏈)組成的單鏈抗體(或僅重鏈抗體)，其中每條鏈含有可變結(jié)構(gòu)域。這種單鏈抗體(或僅重鏈抗體)可以是美洲駝抗體；C)單域抗體含有一個(gè)可變抗體結(jié)構(gòu)域，例如單鏈抗體(或僅重鏈抗體)。單域抗體可僅由所描述的結(jié)合區(qū)組成。可變結(jié)構(gòu)域用灰色表示，而恒定區(qū)用白色表示。輕鏈的可變結(jié)構(gòu)域用黑色表示。定義：在下面的描述和實(shí)施例中，使用了多個(gè)術(shù)語(yǔ)。為了提供對(duì)說(shuō)明書、權(quán)利要求和條款的清楚和一致的理解，包括給予這些術(shù)語(yǔ)的范圍，提供以下定義。除非本文另有定義，否則所使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的相同的含義。所有出版物、專利申請(qǐng)、專利和其它參考文獻(xiàn)的公開(kāi)內(nèi)容通過(guò)引用整體并入本文。實(shí)施本發(fā)明的方法中使用的常規(guī)技術(shù)的方法對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見(jiàn)的。分子生物學(xué)、生物化學(xué)、計(jì)算化學(xué)、細(xì)胞培養(yǎng)、重組DNA、生物信息學(xué)、基因組學(xué)、測(cè)序和相關(guān)領(lǐng)域中的常規(guī)技術(shù)的實(shí)踐是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，并且例如在下列參考文獻(xiàn)中討論：Sambrooketal.,MolecularCloning.ALaboratoryManual,2ndEdition,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.,1989；Ausubeletal.,CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley&Sons,NewYork,1987和定期更新；以及MethodsinEnzymology,AcademicPress,SanDiego系列。在本文檔及其權(quán)利要求和條款中，動(dòng)詞“包括”及其變形以其非限制性意義使用，意味著包括該詞之后的項(xiàng)，但是不排除未具體提及的項(xiàng)。它涵蓋了動(dòng)詞“基本上由...組成”以及“由...組成”。如本文所使用的，除非上下文另有明確說(shuō)明，單數(shù)形式“一”，“一個(gè)”和“該”包括復(fù)數(shù)個(gè)指代物。例如，如上所用的用于分離“一個(gè)”DNA分子的方法包括分離多個(gè)分子(例如10、100、1000、成千個(gè)10、成千個(gè)100、數(shù)百萬(wàn)個(gè)或更多分子)。對(duì)齊(aligning)和比對(duì)(alignment)：術(shù)語(yǔ)“對(duì)齊”和“比對(duì)”是指基于相同或相似氨基酸的短或長(zhǎng)延伸的存在的兩個(gè)或更多氨基酸序列的比較。用于比對(duì)氨基酸序列的幾種方法是本領(lǐng)域已知的，如下文將進(jìn)一步解釋的。術(shù)語(yǔ)“對(duì)齊”和“比對(duì)”也意指基于相同或相似核苷酸的短或長(zhǎng)延伸的存在的兩個(gè)或更多核苷酸序列的比較。用于比對(duì)核苷酸序列的幾種方法是本領(lǐng)域已知的，如下文將進(jìn)一步解釋的?！盎虻谋磉_(dá)”或“蛋白質(zhì)的表達(dá)”是指這樣的過(guò)程，其中可操作地連接到合適的調(diào)節(jié)區(qū)特別是啟動(dòng)子的DNA區(qū)域被轉(zhuǎn)錄成RNA，其能夠通過(guò)機(jī)械翻譯將細(xì)胞轉(zhuǎn)化成由核苷酸序列編碼或其本身具有活性(例如在轉(zhuǎn)錄后基因沉默或RNAi中)的蛋白質(zhì)或肽(或活性肽片段)。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“可操作地連接”是指功能關(guān)系中的多核苷酸單元的連接。當(dāng)核酸與另一核酸序列置于功能關(guān)系中時(shí)，其是“可操作地連接的”。例如，如果啟動(dòng)子或者轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列影響編碼序列的轉(zhuǎn)錄，則其可操作地連接于編碼序列?？刹僮鞯剡B接是指被連接的DNA序列通常是連續(xù)的，并且在必要時(shí)連接連續(xù)的并且在閱讀框中的兩個(gè)或多個(gè)蛋白質(zhì)編碼區(qū)。術(shù)語(yǔ)“遺傳構(gòu)建體”是指包含可操作地連接到合適的調(diào)節(jié)區(qū)(例如啟動(dòng)子)的區(qū)域(轉(zhuǎn)錄區(qū))的DNA序列，轉(zhuǎn)錄區(qū)在細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄成RNA分子(例如mRNA)。因此，遺傳構(gòu)建體可以包含幾個(gè)可操作地連接的序列，例如啟動(dòng)子，包含例如參與翻譯起始的序列的5'前導(dǎo)序列、(蛋白質(zhì))編碼區(qū)、剪接供體和受體位點(diǎn)、內(nèi)含子和外顯子序列，以及包含例如轉(zhuǎn)錄終止序列位點(diǎn)的3'非翻譯序列(也稱為3'未翻譯序列或3'UTR)?！靶蛄型恍浴笔呛塑账嵝蛄谢虬被嵝蛄械耐恍缘牧慷?。一般來(lái)說(shuō)，對(duì)序列進(jìn)行比對(duì)，以便獲得最高階匹配?！巴恍浴北旧砭哂斜绢I(lǐng)域公認(rèn)的含義，并且可以使用公開(kāi)的技術(shù)計(jì)算。參見(jiàn)例如：(COMPUTATIONALMOLECULARBIOLOGY(計(jì)算分子生物學(xué)),Lesk,A.M.,ed.,OxfordUniversityPress,NewYork,1988；BIOCOMPUTING:INFORMATICSANDGENOMEPROJECTS(生物計(jì)算：信息學(xué)和基因組工程),Smith,D.W.,ed.,AcademicPress,NewYork,1993；COMPUTERANALYSISOFSEQUENCEDATA(序列數(shù)據(jù)的計(jì)算分析),PARTI,Griffin,A.M.,andGriffin,H.G.,eds.,HumanaPress,NewJersey,1994；SEQUENCEANALYSISINMOLECULARBIOLOGY(分子生物學(xué)中的序列分析),vonHeinje,G.,AcademicPress,1987；以及SEQUENCEANALYSISPRIMER(序列分析引物)；Gribskov,M.andDevereux,J.,eds.,MStocktonPress,NewYork,1991)。盡管存在多種方法測(cè)量?jī)蓚€(gè)多核苷酸或多肽序列之間的同一性，術(shù)語(yǔ)“同一性”是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的(Carillo,H.,andLipton,D.,SIAMJ.AppliedMath(1988)48:1073)。通常用于確定兩個(gè)序列之間的同一性或相似性的方法包括但不限于在GUIDETOHUGECOMPUTERS(大型計(jì)算機(jī)指南),MartinJ.Bishop,ed.,AcademicPress,SanDiego,1994,和Carillo,H.,andLipton,D.,SIAMJ.AppliedMath(1988)48:1073中所公開(kāi)的。用于確定同一性和相似性的方法編碼在計(jì)算機(jī)程序中。確定兩個(gè)序列之間的同一性和相似性的優(yōu)選計(jì)算機(jī)程序方法包括但不限于GCS程序包(Devereux,J.,etal.,NucleicAcidsResearch(1984)12(1):387)、BLASTP、BLASTN、FASTA(Atschul,S.F.etal.,J.Molec.Biol.(1990)215:403)。作為說(shuō)明，通過(guò)與SEQIDNO：31的參考氨基酸序列具有至少例如70％“序列同一性”的氨基酸序列，意指除了多肽序列可以包括SEQIDNO：31的參考氨基酸的10個(gè)氨基酸中每個(gè)的最多3個(gè)氨基酸改變外，氨基酸序列與參考序列相同。因此，氨基酸序列與參考氨基酸序列的同一性百分比為在參考氨基酸序列的全長(zhǎng)上計(jì)算。換句話說(shuō)，為了獲得包含與參考氨基酸序列至少70％相同的氨基酸序列，參考序列中高達(dá)30％的氨基酸殘基可以缺失或替代為另一個(gè)氨基酸或多個(gè)可以插入?yún)⒖夹蛄兄懈哌_(dá)總氨基酸殘基的30％的氨基酸。參考序列的這些改變可發(fā)生在參考氨基酸序列的氨基或羧基末端位置或在那些末端位置之間的任何位置，單獨(dú)地散布在參考序列的殘基之間或參考序列內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)鄰接基團(tuán)中。本發(fā)明的“核酸”或“核酸序列”可以分別包括嘧啶和嘌呤堿基優(yōu)選胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶、以及腺嘌呤和鳥嘌呤的任何聚合物或寡聚物(參見(jiàn)AlbertL.Lehninger,PrinciplesofBiochemistry,at793-800(WorthPub.1982)，其通過(guò)引用整體并入本文用于所有目的)。本發(fā)明涵蓋任何脫氧核糖核苷酸、核糖核苷酸或肽核酸組分及其任何化學(xué)變體，例如這些堿基的甲基化、羥甲基化或糖基化形式等。聚合物或低聚物在組成上可以是異質(zhì)的或均質(zhì)的，并且可以從天然存在的來(lái)源分離或可以人工或合成產(chǎn)生。此外，核酸可以是DNA或RNA或其混合物，并且可以以單鏈或雙鏈形式永久或過(guò)渡地存在，包括同源雙鏈、異源雙鏈和雜交狀態(tài)。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“癌癥”是指或描述哺乳動(dòng)物中通常特征在于不受調(diào)節(jié)的細(xì)胞生長(zhǎng)的生理狀況。癌癥的實(shí)例包括但不限于乳腺癌、結(jié)腸癌、肺癌、前列腺癌、肝細(xì)胞癌、胃癌、胰腺癌、宮頸癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、泌尿道癌、甲狀腺癌、腎癌、癌、皮膚癌、血癌、白血病、黑素瘤、頭頸癌和腦癌。如本文所用，“癌癥”也稱為惡性腫瘤。術(shù)語(yǔ)“氨基酸序列”或“蛋白質(zhì)”或“肽”是指由氨基酸鏈組成的分子，不指具體的作用模式、大小、3維結(jié)構(gòu)或來(lái)源。因此，其“片段”或“部分”仍可稱為“氨基酸序列”或“蛋白質(zhì)”或“肽”?！胺蛛x的氨基酸序列”用于指不再處于其原始天然環(huán)境中的氨基酸序列，例如在體外或在重組細(xì)菌或人宿主細(xì)胞中。“T細(xì)胞”或“T淋巴細(xì)胞”屬于一組名為淋巴細(xì)胞的白血細(xì)胞，其在細(xì)胞介導(dǎo)的免疫中起作用。T細(xì)胞來(lái)源于骨髓中的造血干細(xì)胞，在胸腺中成熟(即T的來(lái)源)，并在外周淋巴組織中獲得其全部功能。在T細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中，作為初始β或δTCR基因重排的結(jié)果，CD4－CD8－T細(xì)胞(對(duì)于CD4和CD8共受體均為陰性)致力于αβ或γδ命運(yùn)。經(jīng)歷早期β鏈重排的細(xì)胞表達(dá)由細(xì)胞表面上的完整β鏈和前TCRα鏈組成的前TCR結(jié)構(gòu)。這樣的細(xì)胞被轉(zhuǎn)換為CD4+CD8+狀態(tài)，重排TCRα鏈基因座，并在表面上表達(dá)成熟的αβTCR。在β基因重排之前成功完成γ基因重排的CD4-CD8-T細(xì)胞表達(dá)功能性γδTCR并保留CD4－CD8－。(ClaudioTripodoetal.GammadeltaTcelllymphomasNatureReviewsClinicalOncology6,707-717(December2009))。T細(xì)胞受體與CD3蛋白復(fù)合體結(jié)合。成熟T細(xì)胞，即表達(dá)αβTCR或γδTCR，在細(xì)胞表面上表達(dá)T細(xì)胞受體復(fù)合體。構(gòu)成人外周血中T細(xì)胞總?cè)后w的約1-5％的γδT細(xì)胞可以在另外的亞群中分開(kāi)。γδT細(xì)胞亞群構(gòu)成Vγ9Vδ2T細(xì)胞，其表達(dá)Vγ9Vδ2TCR。在T細(xì)胞受體的胞外結(jié)構(gòu)域中，定位了互補(bǔ)決定區(qū)(CDR1，CDR2，CDR3)。這些區(qū)域通常是最可變的結(jié)構(gòu)域，并且對(duì)TCR中的多樣性有顯著貢獻(xiàn)。CDR區(qū)在T細(xì)胞發(fā)育期間組成，其中所謂的可變-(V)、分化-(D)和連接-(J)-基因片段隨機(jī)組合以產(chǎn)生不同的TCR。“Vγ9Vδ2T細(xì)胞”是可以在功能上定義的細(xì)胞，因?yàn)樗鼈儽灰唤M非肽磷酸化的類異戊二烯前體(統(tǒng)稱為磷酸抗原)特異性、快速激活。磷酸抗原幾乎由所有活細(xì)胞產(chǎn)生。在動(dòng)物和人類細(xì)胞(包括癌細(xì)胞)中發(fā)現(xiàn)的最常見(jiàn)的磷酸抗原是異戊烯基焦磷酸(IPP)及其異構(gòu)體二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)。IPP是來(lái)自甲羥戊酸途徑的代謝物。(E)-4-羥基-3-甲基-丁-2-烯基焦磷酸(HMBPP或HMB-PP)是類異戊二烯生物合成的非甲羥戊酸途徑的中間體。HMBPP是大多數(shù)致病細(xì)菌(包括結(jié)核分枝桿菌)以及寄生原生動(dòng)物(例如瘧原蟲(導(dǎo)致瘧疾)和弓形蟲)中的必需代謝物。Vγ9Vδ2T細(xì)胞的激活包括克隆擴(kuò)增、細(xì)胞毒性活性和細(xì)胞因子的表達(dá)。“Vγ9Vδ2T細(xì)胞”也通過(guò)Vγ9Vδ2T細(xì)胞受體的表達(dá)來(lái)定義。例如，可以使用對(duì)Vγ9Vδ2T細(xì)胞受體特異的抗體選擇細(xì)胞，如下所述。這些選擇的細(xì)胞經(jīng)歷了γ和δ基因的重排，并編碼Vγ9T細(xì)胞受體鏈和Vδ2T細(xì)胞受體鏈。從這些選擇的細(xì)胞，可以確定對(duì)應(yīng)于Vγ9T細(xì)胞受體鏈和Vδ2T細(xì)胞受體鏈的核酸(或氨基酸)序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠很好地選擇和/或鑒定特征在于在細(xì)胞表面上表達(dá)抗原或受體的細(xì)胞群體，如本文全文所述。應(yīng)當(dāng)理解，關(guān)于在細(xì)胞表面上的表達(dá)，例如CD3、CD4、CD8、CD25、CD69、γδTCR和Vγ9Vδ2TCR，這通常在細(xì)胞群中進(jìn)行，其中當(dāng)與具有較低表達(dá)水平的細(xì)胞相比時(shí)，細(xì)胞的一部分具有高得多的抗原或受體的表達(dá)水平。因此，術(shù)語(yǔ)陽(yáng)性或陰性應(yīng)理解為是相對(duì)的，即陽(yáng)性細(xì)胞與陰性細(xì)胞相比具有高得多的表達(dá)水平。因此，在這個(gè)意義上為陰性的細(xì)胞仍然可以具有可檢測(cè)的表達(dá)水平?？梢允褂脽晒饧せ罴?xì)胞分選(FACS)分析細(xì)胞表面上的表達(dá)，并且許多特異性抗體是可商購(gòu)的，例如適用于這樣的FACS分析的CD3、CD4、CD8、CD25、CD69、γδTCR、Vγ9TCR鏈和Vδ2TCR鏈，如實(shí)施例中所述和可用的。這種特異性抗體是與它們各自的抗原或受體結(jié)合的免疫球蛋白。因此，Vγ9Vδ2T細(xì)胞也可以在FACS中被定義和選擇為對(duì)Vγ9Vδ2TCR是陽(yáng)性的。適合于FACS或類似分離技術(shù)的抗體(例如與磁珠綴合的抗體)可廣泛獲得。選擇條件，例如由允許選擇陰性和/或陽(yáng)性細(xì)胞的抗體制造商提供的條件?？梢赃m合于選擇Vγ9Vδ2T細(xì)胞或工程化的Vγ9Vδ2T細(xì)胞(例如可從BD單抗(Pharmingen)(BD,1BectonDrive,FranklinLakes,NJUSA)獲得)的抗體的實(shí)例是Vγ9-PE(克隆B3，#555733)、Vδ2-FITC(克隆B6，#555738)、γδTCR-APC(克隆B1，#555718)或諸如可從BeckmanCoulter獲得的pan-γδTCR-PE(克隆IMMU510，#IM1418U)?？蛇m用于檢測(cè)CD25和CD69的抗體的實(shí)例是可從BD單抗獲得的CD25-PE(克隆M-A251，#555432)和CD69-FITC(克隆L78，#347823)。發(fā)明詳述在本發(fā)明的第一方面，提供了人Vγ9Vδ2T細(xì)胞受體結(jié)合免疫球蛋白分子，其包含CDR1區(qū)和CDR2區(qū)，其中CDR1區(qū)包含與SEQIDNO.31的氨基酸序列GRTFSNYAMG具有至少40％序列同一性的氨基酸序列；其中CDR2區(qū)包含與SEQIDNO.32的氨基酸序列AISWSGGSTYYADSVKG具有至少60％序列同一性的氨基酸序列；其中優(yōu)選地免疫球蛋白分子為單域抗體。本發(fā)明的人Vγ9Vδ2T細(xì)胞受體結(jié)合免疫球蛋白分子是例如結(jié)合到諸如SEQIDNO.71和72所列的Vγ9和Vδ2T細(xì)胞受體鏈的氨基酸序列所定義的Vγ9Vδ2T細(xì)胞受體的免疫球蛋白分子。例如，通過(guò)FACS分析可以檢測(cè)與這樣的T細(xì)胞受體的結(jié)合，如實(shí)施例部分中所述。例如，表達(dá)Vγ9Vδ2T細(xì)胞受體例如SEQIDNO.71和72的細(xì)胞與對(duì)照免疫球蛋白分子或結(jié)合Vγ9Vδ2T細(xì)胞受體的免疫球蛋白分子接觸。或者，可將來(lái)自實(shí)施例中描述的健康人供體的Vγ9Vδ2T細(xì)胞與對(duì)照免疫球蛋白分子或結(jié)合Vγ9Vδ2T細(xì)胞受體的免疫球蛋白分子接觸。當(dāng)將特異性免疫球蛋白分子與不結(jié)合Vγ9Vδ2T細(xì)胞受體的對(duì)照免疫球蛋白分子進(jìn)行比較時(shí)，與細(xì)胞結(jié)合的免疫球蛋白的量增加(參見(jiàn)例如圖7)。本發(fā)明的人Vγ9Vδ2T細(xì)胞受體結(jié)合免疫球蛋白分子可以被定義為，例如導(dǎo)致相對(duì)于對(duì)照免疫球蛋白平均熒光強(qiáng)度(MFI)增加最小2倍(由流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定)的免疫球蛋白。MFI是選擇的熒光通道中的熒光強(qiáng)度的平均值(FITC，PE，PerCP等)。作為陰性對(duì)照抗體，可以使用針對(duì)偶氮染料反應(yīng)性紅6(RR6)的單域抗體(或VHH，納米抗體)(SpinelliSetal,Biochemistry2000；39:1217-1222)。因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠很好地選擇適當(dāng)?shù)臈l件以確定免疫球蛋白分子與Vγ9Vδ2T細(xì)胞受體的結(jié)合。免疫球蛋白結(jié)合可以根據(jù)特異性和親和力表達(dá)。特異性決定了哪種抗原或其表位被免疫球蛋白分子結(jié)合。如本文所用的“免疫球蛋白分子”(縮寫為“Ig”)是本領(lǐng)域熟知的并且包括術(shù)語(yǔ)“抗體”。本文使用的術(shù)語(yǔ)“免疫球蛋白”是指包含具有互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)的抗原結(jié)合位點(diǎn)的任何多肽。該術(shù)語(yǔ)包括但不限于抗體、單克隆抗體、單特異性抗體、多特異性抗體、人源化抗體、嵌合抗體、人抗體、單鏈抗體、僅重鏈抗體、美洲駝抗體、單域抗體和納米抗體(例如VHH)。術(shù)語(yǔ)“免疫球蛋白分子”還可以包括免疫球蛋白片段，例如Fab、F(ab')2、Fv、scFv、Fd、dAb和其他抗體片段或包含保留抗原結(jié)合功能的CDR的其他構(gòu)建體。通常，此類片段包含抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域。免疫球蛋白分子或其片段可以是任何已知的抗體同種型及其構(gòu)象，例如IgA(例如IgA1或IgA2)、IgD、IgE、IgG(例如IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgG4)或IgM類，或可以構(gòu)成任何組合的其混合物，例如來(lái)自IgG1和IgG2a類的抗體的混合物。免疫球蛋白是免疫系統(tǒng)相關(guān)蛋白。人抗體由四種多肽組成-兩條重鏈和兩條輕鏈連接形成“Y”形分子(參見(jiàn)圖9A)?！癥”的末端中的氨基酸序列在不同抗體之間變化很大。每個(gè)末端具有結(jié)合抗原的特異性。人抗體的可變區(qū)包括輕鏈和重鏈的末端，即輕鏈和重鏈的可變結(jié)構(gòu)域。恒定區(qū)決定用于例如激活免疫系統(tǒng)的機(jī)理。根據(jù)其重鏈恒定區(qū)結(jié)構(gòu)和免疫功能，將抗體分為五個(gè)主要類別，IgM、IgG、IgA、IgD和IgE。重鏈的亞類也是已知的。例如，人IgG重鏈可以是IgG1、IgG2、IgG3和IgG4亞型中的任一種。每條鏈，即免疫球蛋白分子，都具有可變結(jié)構(gòu)域。免疫球蛋白分子的可變結(jié)構(gòu)域被細(xì)分為高變(HV)區(qū)和框架(FR)區(qū)。HV區(qū)在給定位置相對(duì)于該位置中最常見(jiàn)的氨基酸具有高比例的不同氨基酸。高變區(qū)稱為互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)。免疫球蛋白分子具有三個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)(CDR1、CDR2和CDR3)。具有更少可變氨基酸序列的四個(gè)框架區(qū)分隔CDR區(qū)。CDR區(qū)可以直接結(jié)合抗原，例如Vγ9Vδ2T細(xì)胞受體(參見(jiàn)例如圖1，其中框架區(qū)和CDR區(qū)由所選VHH指示)?？蚣軈^(qū)形成β-片層結(jié)構(gòu)，其用作支架以定位CDR區(qū)以接觸抗原。美洲駝抗體由兩條重鏈組成(參見(jiàn)圖9B)。每條重鏈都是具有單個(gè)可變結(jié)構(gòu)域的免疫球蛋白分子。這樣的抗體稱為單鏈抗體，即其包含一種類型的鏈。這樣的抗體也可以稱為僅重鏈抗體。單域抗體是含有單個(gè)單體可變結(jié)構(gòu)域的免疫球蛋白分子(參見(jiàn)圖9C)。單域抗體因此含有單個(gè)CDR1、單個(gè)CDR2和單個(gè)CDR3。單域抗體可以衍生自單鏈抗體(或僅重鏈抗體)。與完整抗體一樣，單域抗體能夠選擇性地結(jié)合特異性抗原。單域抗體可以僅包含具有CDR1、CDR2和CDR3的免疫球蛋白鏈的可變結(jié)構(gòu)域和框架區(qū)，這樣的抗體也可以稱為VHH或納米抗體。由于分子量?jī)H為約12-15kDa，納米抗體比由兩條重鏈和兩條輕鏈組成的常見(jiàn)抗體(150-160kDa)小得多。CDR1、CDR2和CDR3序列可以在物種之間交換。例如，從美洲駝免疫球蛋白分子，可以選擇CDR序列并與人免疫球蛋白分子中的CDR序列交換，以獲得具有源自美洲駝CDR序列的特異性的人免疫球蛋白分子。這可能是有利的，因?yàn)榕c原始美洲駝框架序列相比，人序列對(duì)人類免疫原性較低。CDR序列的這種交換稱為人源化。因此，本發(fā)明的免疫球蛋白分子、單鏈抗體和單域抗體可以具有人源免疫球蛋白序列或美洲駝來(lái)源的免疫球蛋白序列，并且CDR1、CDR2和CDR3序列被替換為本發(fā)明的CDR序列，以提供用于人Vγ9Vδ2T細(xì)胞受體結(jié)合。例如，單鏈人抗體可以包含對(duì)應(yīng)于人重鏈序列但已經(jīng)突變的序列，例如，其具有缺失的CH1結(jié)構(gòu)域，從而形成美洲駝樣單鏈抗體(參見(jiàn)例如圖9B)，并且所述人重鏈序列的CDR區(qū)被替換為本發(fā)明的CDR序列。因此，人免疫球蛋白、人單鏈抗體或人單域抗體是指框架區(qū)和/或恒定區(qū)的來(lái)源，而不是本發(fā)明的CDR1區(qū)、CDR2區(qū)和CDR3區(qū)的來(lái)源。如實(shí)施例部分所述，通過(guò)使用涉及用人供體來(lái)源的Vγ9Vδ2T細(xì)胞免疫美洲駝和噬菌體展示的策略選擇人Vγ9Vδ2T細(xì)胞受體結(jié)合免疫球蛋白分子。對(duì)選擇的VHH序列進(jìn)行測(cè)序，列于表3中并描述于圖1中。所選VHH的CDR1區(qū)、CDR2區(qū)和CDR3區(qū)列于下表1中。每個(gè)CDR與相應(yīng)的SEQIDNO也列于表3中。表1.在所選的20種VHH中，列出了CDR1、CDR2和CDR3序列。參考CDR1和CDR2如上所列(分別對(duì)應(yīng)于SEQIDNO.31和SEQIDNO.32)，并且也列出了每個(gè)CDR1區(qū)和CDR2區(qū)與各自的參考CDR1和CDR2的序列同一性(％)。CDR1％CDR2％CDR3Nr參考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發(fā)明人選擇的用于結(jié)合人Vγ9Vδ2T細(xì)胞受體的免疫球蛋白令人驚訝地與CDR1和CDR2具有實(shí)質(zhì)的序列同一性。不受理論的約束，這樣的CDR1和CDR2序列實(shí)質(zhì)上有助于Vγ9Vδ2T細(xì)胞受體的結(jié)合。對(duì)于CDR3區(qū)發(fā)現(xiàn)更大的可變性，不受理論的約束，其可以在免疫球蛋白分子的功能中牽涉CDR3序列，即調(diào)控類型，例如阻斷Vγ9Vδ2T細(xì)胞的激活、誘導(dǎo)Vγ9Vδ2T細(xì)胞的激活、或既不阻斷Vγ9Vδ2T細(xì)胞的激活也不誘導(dǎo)Vγ9Vδ2T細(xì)胞的激活。因此，免疫球蛋白分子包含CDR1區(qū)和CDR2區(qū)，其中CDR1區(qū)包含與SEQIDNO.31的氨基酸序列GRTFSNYAMG具有至少40％序列同一性的氨基酸序列，并且其中CDR2區(qū)包含與SEQIDNO.32的氨基酸序列AISWSGGSTYYADSVKG具有至少60％序列同一性的氨基酸序列。優(yōu)選地，CDR2區(qū)包含與SEQIDNO.32的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列。優(yōu)選地，免疫球蛋白分子是單鏈抗體。如所述，免疫球蛋白衍生自美洲駝。美洲駝產(chǎn)生具有通過(guò)二硫橋二聚化的單一重鏈的抗體，即美洲駝抗體具有來(lái)自兩條鏈的兩個(gè)單可變結(jié)構(gòu)域(參見(jiàn)圖9B)。在一個(gè)實(shí)施方案中，CDR2區(qū)包含與SEQIDNO.32AISWSGGSTYYADSVKG具有至少60％序列同一性的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列在位置9具有T，在位置12具有A，在位置15具有V。當(dāng)比較所選CDR2區(qū)的序列時(shí)，在這些位置的氨基酸不顯示變異。因此，不受理論的約束，這些位置似乎對(duì)結(jié)合Vγ9Vδ2T細(xì)胞受體是重要的。應(yīng)當(dāng)理解的是，所提及的位置涉及參考序列中的位置，并且不是指整個(gè)免疫球蛋白分子中的位置。因此，CDR2區(qū)在指定位置具有與SEQIDNO.32相同的氨基酸。如實(shí)施例部分所述，CDR1區(qū)、CDR2區(qū)和CDR3區(qū)選自美洲駝抗體。因此，本發(fā)明的單鏈抗體可以包含源自美洲駝的免疫球蛋白分子序列。應(yīng)當(dāng)理解的是，在這樣的美洲駝單鏈抗體中，原始CDR序列被替換CDR序列替代，例如表1所列，以得到具有對(duì)替換CDR序列特異性的美洲駝單鏈。類似地，可以用人重鏈序列進(jìn)行相同的操作。人單鏈抗體具有由替換CDR序列支配的特異性。將CDR1區(qū)、CDR2區(qū)和CDR3區(qū)轉(zhuǎn)移到其它框架，例如轉(zhuǎn)移到其他物種，例如本領(lǐng)域熟知的人框架。在一個(gè)實(shí)施方案中，單鏈抗體是單域抗體。單鏈抗體包含框架區(qū)。因此，人單域抗體可以具有人框架區(qū)，例如，衍生自人重鏈和/或人輕鏈序列以及本發(fā)明的CDR1、CDR2和CDR3序列。美洲駝單域抗體具有美洲駝框架區(qū)。在一個(gè)實(shí)施方案中，一個(gè)或多個(gè)框架區(qū)選自氨基酸序列SEQIDNO.67-701的組。這些框架區(qū)是來(lái)自分離的VHH克隆之一的框架區(qū)。可以觀察到，來(lái)自20個(gè)分離的克隆的框架區(qū)基本上不改變。在一個(gè)實(shí)施方案中，免疫球蛋白分子、單鏈抗體或單域抗體包含CDR3區(qū)，其中CDR3區(qū)包含選自氨基酸序列SEQIDNO.3、6、9、11、14、17、20、22、25、27、29、30、33、35、37、40、43和46的組的氨基酸序列。如下所述，提供這些與CDR1和CDR2序列結(jié)合的CDR3區(qū)用于結(jié)合和功能。在一個(gè)實(shí)施方案中，免疫球蛋白分子、單鏈抗體或單域抗體具有來(lái)自如表1中所列的抗體的CDR1區(qū)、CDR2區(qū)和CDR3區(qū)的氨基酸序列的組合。在一個(gè)實(shí)施方案中，免疫球蛋白分子、單鏈抗體或單域抗體包含選自氨基酸序列SEQIDNO.47-66的組的氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供如上公開(kāi)的本發(fā)明的免疫球蛋白分子用于醫(yī)學(xué)治療。應(yīng)當(dāng)理解的是，當(dāng)人Vγ9Vδ2T細(xì)胞受體結(jié)合免疫球蛋白分子在體內(nèi)結(jié)合人Vγ9Vδ2T細(xì)胞時(shí)，例如，在醫(yī)學(xué)治療中，可能不期望免疫球蛋白分子是完全功能性的免疫球蛋白分子，因?yàn)楫?dāng)與人Vγ9Vδ2T細(xì)胞結(jié)合時(shí)，其可觸發(fā)針對(duì)人Vγ9Vδ2T細(xì)胞的免疫應(yīng)答。因此，在這種情況下，優(yōu)選不具有功能性恒定區(qū)，即失活或缺失的免疫球蛋白分子，例如納米抗體和VHH。當(dāng)在體內(nèi)需要人Vγ9Vδ2T細(xì)胞的作用時(shí)，這可能是特別有用的。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了編碼本發(fā)明的免疫球蛋白分子的核苷酸序列。本文公開(kāi)的序列涉及氨基酸序列。因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠提供編碼氨基酸序列的核苷酸序列，因?yàn)槠鋬H需要使用密碼子表將氨基酸序列轉(zhuǎn)化為核苷酸序列。這樣的核苷酸序列可以用于將其可操作地連接到啟動(dòng)子序列、polyA信號(hào)等，以提供利用其可以表達(dá)抗體的遺傳構(gòu)建體。這種包含核苷酸序列的遺傳構(gòu)建體可以包含在宿主細(xì)胞中。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了制備本發(fā)明免疫球蛋白分子的方法，包括：-培養(yǎng)本發(fā)明的宿主細(xì)胞，其包含編碼本發(fā)明免疫球蛋白分子的核苷酸序列；-允許宿主細(xì)胞表達(dá)免疫球蛋白；-獲得免疫球蛋白。此外，本發(fā)明還提供了人Vγ9Vδ2T細(xì)胞受體結(jié)合免疫球蛋白分子，其中免疫球蛋白分子是阻斷人Vγ9Vδ2T細(xì)胞激活的免疫球蛋白分子。阻斷人Vγ9Vδ2T細(xì)胞的激活在其中不期望激活人Vγ9Vδ2T細(xì)胞的條件和/或治療中是有利的。Vγ9Vδ2T細(xì)胞可以被小的非肽磷酸化中間體(稱為來(lái)自哺乳動(dòng)物甲羥戊酸途徑或微生物脫氧木酮糖磷酸途徑的磷酸抗原(pAg))強(qiáng)烈和特異性激活。然后可以利用Vγ9Vδ2T細(xì)胞通過(guò)pAg和膜結(jié)合的丁酰膽堿3A1/CD277分子之間的相互作用來(lái)特異性識(shí)別(導(dǎo)致激活)磷酸抗原。如實(shí)施例中所示，Vγ9Vδ2T細(xì)胞受體結(jié)合免疫球蛋白分子可以阻斷磷酸抗原誘導(dǎo)的Vγ9Vδ2T細(xì)胞的激活。優(yōu)選地，人Vγ9Vδ2T細(xì)胞受體結(jié)合免疫球蛋白分子是包含CDR1區(qū)和CDR2區(qū)的人Vγ9Vδ2T細(xì)胞受體結(jié)合免疫球蛋白分子，其中該免疫球蛋白分子是阻斷人Vγ9Vδ2T細(xì)胞激活的免疫球蛋白分子，其中CDR1區(qū)包含與SEQIDNO.31的氨基酸序列GRTFSNYAMG具有至少40％序列同一性的氨基酸序列；并且其中CDR2區(qū)包含與SEQIDNO.32的氨基酸序列AISWSGGSTYYADSVKG具有至少60％序列同一性的氨基酸序列；并且其中優(yōu)選地免疫球蛋白分子是單鏈抗體。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述免疫球蛋白分子的CDR2區(qū)包含與SEQIDNO.2AISWSGGSTYYADSVKG具有至少60％序列同一性的氨基酸序列；其中所述氨基酸序列在位置9具有T，在位置12具有A，在位置15具有V。在另一個(gè)實(shí)施方案中，免疫球蛋白分子是單域抗體，優(yōu)選地其中單域抗體衍生自美洲駝單鏈抗體或人單鏈抗體。在又一個(gè)實(shí)施方案中，免疫球蛋白分子是單鏈抗體或單域抗體。在其他實(shí)施方案中，免疫球蛋白分子或單鏈抗體或單域抗體包含一個(gè)或多個(gè)選自SEQIDNO.67-70的氨基酸序列的組的框架區(qū)。在一個(gè)實(shí)施方案中，阻斷人Vγ9Vδ2T細(xì)胞激活的所述人Vγ9Vδ2T細(xì)胞受體結(jié)合免疫球蛋白分子用于醫(yī)學(xué)治療。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所述免疫球蛋白分子用于醫(yī)學(xué)治療，其中醫(yī)學(xué)治療包括使用甲羥戊酸途徑的抑制劑或其中醫(yī)學(xué)治療包括治療癌癥。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述免疫球蛋白分子用于醫(yī)學(xué)治療，其中醫(yī)學(xué)治療包括治療傳染病。在pAg產(chǎn)生的下游起作用的甲羥戊酸途徑的抑制劑，包括通常臨床規(guī)定的氨基二膦酸鹽(aminobisphosphonates)，例如帕米膦酸鹽(pamidronate)、阿侖膦酸鹽(alendronate)、利塞膦酸鹽(risedronate)、伊班膦酸鹽(ibandronate)和唑來(lái)膦酸鹽(zoledronate)。另一類化合物包括烷基胺，例如異丁胺、異戊胺和正丁胺。這樣的化合物可用于治療佩吉特(Paget’s)疾病、骨質(zhì)疏松癥、高鈣血癥以及預(yù)防在惡性骨轉(zhuǎn)移的情況下的骨骼事件。這導(dǎo)致內(nèi)源性pAg異戊烯基-焦磷酸(IPP)的胞內(nèi)積累以及隨后的Vγ9Vδ2T細(xì)胞的選擇性激活和擴(kuò)增。施用氨基二膦酸鹽(aminobisphosphonate)通常伴隨由于Vγ9Vδ2T細(xì)胞的這種選擇性激活導(dǎo)致的急性發(fā)熱反應(yīng)。該急性期反應(yīng)具有1天的發(fā)病高峰(peakonset)和3天的中值持續(xù)時(shí)間，并且主要由發(fā)熱、寒顫(chills)、潮紅(flushes)、急性肌肉骨骼癥狀、疼痛、涉及背部、頸部、胸部或肩部的廣義的不適和局部抱怨、惡心、嘔吐和腹瀉組成。因此，在醫(yī)學(xué)治療中，阻斷人Vγ9Vδ2T細(xì)胞激活的所述人Vγ9Vδ2T細(xì)胞受體結(jié)合免疫球蛋白分子可以預(yù)防由例如在患有佩吉特氏病、骨質(zhì)疏松癥、骨轉(zhuǎn)移和高鈣血癥的患者中給藥氨基二膦酸鹽誘導(dǎo)的急性期反應(yīng)。此外，這樣的免疫球蛋白分子在體內(nèi)Vγ9Vδ2T細(xì)胞的過(guò)度激活的醫(yī)學(xué)治療中也是有利的，其可以發(fā)生在例如Vγ9Vδ2T細(xì)胞被過(guò)度刺激或長(zhǎng)期刺激的感染期間，或在某些癌性病癥中，其中腫瘤細(xì)胞中甲羥戊酸途徑的慢性過(guò)度活性可導(dǎo)致Vγ9Vδ2T細(xì)胞耗盡?？梢栽诨颊咧袦y(cè)量這種(過(guò)度)刺激，例如通過(guò)測(cè)量Vγ9Vδ2T細(xì)胞與基線水平相比的增加，或通過(guò)測(cè)量Vγ9Vδ2T細(xì)胞的超常水平(例如超過(guò)5％的T細(xì)胞是Vγ9Vδ2T細(xì)胞)，與Vγ9Vδ2T細(xì)胞上的表面標(biāo)志物例如CD69(早期激活標(biāo)志物)或CD25(晚期激活標(biāo)志物)的上調(diào)相組合。應(yīng)當(dāng)理解，由于Vγ9Vδ2T細(xì)胞從血液遷移到組織，測(cè)量Vγ9Vδ2T細(xì)胞的超常水平不是必需的。另一方面，在慢性過(guò)度刺激中，Vγ9Vδ2T細(xì)胞可能不太好地被激活，并且也可能是過(guò)度刺激的跡象。細(xì)胞因子產(chǎn)生(IFN-γ，TNF-α)和細(xì)胞毒性顆粒含量也可以通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)在細(xì)胞內(nèi)測(cè)量。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，阻斷人Vγ9Vδ2T細(xì)胞激活的所述人Vγ9Vδ2T細(xì)胞受體結(jié)合免疫球蛋白分子是包含CDR3區(qū)的免疫球蛋白分子，其中CDR3區(qū)包含選自氨基酸序列SEQIDNO.27和30的組的氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，阻斷人Vγ9Vδ2T細(xì)胞激活的所述人Vγ9Vδ2T細(xì)胞受體結(jié)合免疫球蛋白分子用于阻斷人Vγ9Vδ2T細(xì)胞的激活。根據(jù)該實(shí)施方案，將所述免疫球蛋白分子(其包括單鏈抗體或單域抗體)用于測(cè)定中，例如，如實(shí)施例中描述的，以阻斷激活。本發(fā)明還提供了激活人Vγ9Vδ2T細(xì)胞的免疫球蛋白分子，其為人Vγ9Vδ2T細(xì)胞受體結(jié)合免疫球蛋白分子，其包含CDR1區(qū)和CDR2區(qū)，其中CDR1區(qū)包含與SEQIDNO.31的氨基酸序列GRTFSNYAMG具有至少40％序列同一性的氨基酸序列；并且其中CDR2區(qū)包含與SEQIDNO.32的氨基酸序列AISWSGGSTYYADSVKG具有至少60％序列同一性的氨基酸序列；并且其中優(yōu)選地免疫球蛋白分子是單鏈抗體。在一個(gè)實(shí)施方案中，CDR2區(qū)包含與SEQIDNO.2AISWSGGSTYYADSVKG具有至少60％序列同一性的氨基酸序列；其中所述氨基酸序列在位置9具有T，在位置12具有A，在位置15具有V。在另一個(gè)實(shí)施方案中，免疫球蛋白分子是單域抗體，優(yōu)選地其中單域抗體是美洲駝單鏈抗體或人單鏈抗體。在又一個(gè)實(shí)施方案中，單鏈抗體是單域抗體。在其他實(shí)施方案中，免疫球蛋白分子或單鏈抗體或單域抗體包含一個(gè)或多個(gè)選自SEQIDNO.67-70的氨基酸序列的組的框架區(qū)。優(yōu)選地，激活人Vγ9Vδ2T細(xì)胞的所述免疫球蛋白分子包含CDR3區(qū)，其中CDR3區(qū)包含選自氨基酸序列SEQIDNO.6、9、11、14、17、20、22、25、29、33、35和46的組的氨基酸序列。旨在開(kāi)發(fā)Vγ9Vδ2T細(xì)胞的目前策略取決于它們的系統(tǒng)性激活(例如通過(guò)氨基二膦酸鹽或合成的磷酸抗原如BrHPP)或例如Vγ9Vδ2T細(xì)胞的過(guò)繼轉(zhuǎn)移。已經(jīng)證明這些方法對(duì)患者具有良好的耐受性，并且已經(jīng)記載了抗腫瘤活性的跡象。然而，結(jié)果不足夠一致以允許廣泛的臨床應(yīng)用。描述的策略導(dǎo)致Vγ9Vδ2T細(xì)胞的系統(tǒng)性激活，但不導(dǎo)致這些細(xì)胞特異性募集至腫瘤，其中假定它們發(fā)揮其抗腫瘤作用。激活人Vγ9Vδ2T細(xì)胞并優(yōu)選連接到試劑的所述免疫球蛋白分子可用于在臨床環(huán)境中激活Vγ9Vδ2T細(xì)胞。優(yōu)選地，激活人Vγ9Vδ2T細(xì)胞的所述免疫球蛋白分子與試劑連接。優(yōu)選地所述試劑可與靶結(jié)合，靶例如癌細(xì)胞或受感染細(xì)胞如病毒感染的細(xì)胞，或非宿主細(xì)胞例如細(xì)菌。優(yōu)選地，所述試劑是免疫球蛋白分子。更優(yōu)選地，所述免疫球蛋白分子是單鏈抗體或單域抗體。通過(guò)連接到試劑，試劑可以在需要人Vγ9Vδ2T細(xì)胞的作用的位點(diǎn)募集并激活人Vγ9Vδ2T細(xì)胞，與系統(tǒng)性激活相反。例如，激活人Vγ9Vδ2T細(xì)胞的所述免疫球蛋白分子可以連接到腫瘤特異性抗體、抗病毒抗體或抗細(xì)菌抗體。這樣的腫瘤特異性抗體可以是任何抗體。這種與另一種抗體連接的免疫球蛋白分子可以稱為雙特異性抗體。雙特異性抗體還可以由包含本發(fā)明的CDR1區(qū)、CDR2區(qū)和CDR3區(qū)的第一免疫球蛋白分子組成，第一免疫球蛋白分子是包含在單鏈抗體中的鏈，其中第一免疫球蛋白鏈與第二免疫球蛋白分子配對(duì)，第二免疫球蛋白分子也是包含在單鏈抗體中的鏈，其中第二免疫球蛋白結(jié)合靶。因此形成具有兩條鏈(類似于圖9B所示)的雙特異性抗體，每條鏈具有不同的單一結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中一個(gè)結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含本發(fā)明的CDR1、CDR2和CDR3，并且另一個(gè)結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合靶。激活人Vγ9Vδ2T細(xì)胞并連接到試劑的所述免疫球蛋白分子也可以是包含兩個(gè)單域抗體的雙特異性抗體，第一單域抗體包含本發(fā)明的CDR1區(qū)、CDR2區(qū)和CDR3區(qū)，其中第一單域抗體與第二單域抗體連接，其中第二單域抗體結(jié)合靶。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，激活人Vγ9Vδ2T細(xì)胞并且優(yōu)選連接于試劑的所述免疫球蛋白分子用于醫(yī)學(xué)治療。優(yōu)選地，醫(yī)學(xué)治療是癌癥或感染的治療。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了激活人Vγ9Vδ2T細(xì)胞的所述免疫球蛋白分子用于激活人Vγ9Vδ2T細(xì)胞的用途。這種用途例如可用于如實(shí)施例中所述的測(cè)定。在另一個(gè)實(shí)施方案中，激活人Vγ9Vδ2T細(xì)胞的所述免疫球蛋白分子包含標(biāo)記。這些免疫球蛋白分子特別用于表達(dá)人Vγ9Vδ2T細(xì)胞受體的細(xì)胞的流式細(xì)胞術(shù)。免疫球蛋白分子可以包含標(biāo)簽，例如，如實(shí)施例中所述的myc標(biāo)簽或his-標(biāo)簽或熒光蛋白序列，或者其可以偶聯(lián)至合適的成像染料。此外，當(dāng)偶聯(lián)至例如磁珠時(shí)，這些免疫球蛋白分子可用于從包括來(lái)自外周血的細(xì)胞的細(xì)胞懸浮液中分離和純化這些細(xì)胞。作為激活人Vγ9Vδ2T細(xì)胞的這些免疫球蛋白，這些免疫球蛋白分子特別用于在激活和擴(kuò)增細(xì)胞群體的同時(shí)選擇這些細(xì)胞。因此，進(jìn)一步提供了這些免疫球蛋白分子用于標(biāo)記和/或選擇和激活人Vγ9Vδ2T細(xì)胞的用途。在本發(fā)明的另一方面，提供了免疫球蛋白分子，其中免疫球蛋白分子為不阻斷人Vγ9Vδ2T細(xì)胞激活并且不激活人Vγ9Vδ2T細(xì)胞的免疫球蛋白分子；并且其中其是包含CDR1區(qū)和CDR2區(qū)的人Vγ9Vδ2T細(xì)胞受體結(jié)合免疫球蛋白分子，其中CDR1區(qū)包含與SEQIDNO.31的氨基酸序列GRTFSNYAMG具有至少40％序列同一性的氨基酸序列；并且其中CDR2區(qū)包含與SEQIDNO.32的氨基酸序列AISWSGGSTYYADSVKG具有至少60％序列同一性的氨基酸序列；并且其中優(yōu)選地免疫球蛋白分子是單鏈抗體。在一個(gè)實(shí)施方案中，CDR2區(qū)包含與SEQIDNO.2AISWSGGSTYYADSVKG具有至少60％序列同一性的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列在位置9具有T，在位置12具有A，在位置15具有V。在另一個(gè)實(shí)施方案中，免疫球蛋白分子是單域抗體，其中單域抗體優(yōu)選是美洲駝單鏈抗體或人單鏈抗體。在又一個(gè)實(shí)施方案中，單鏈抗體是單域抗體。在其他實(shí)施方案中，免疫球蛋白分子或單鏈抗體或單域抗體包含一個(gè)或多個(gè)選自SEQIDNO.67-70的氨基酸序列的組的框架區(qū)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述免疫球蛋白分子包含CDR3區(qū)，其中免疫球蛋白分子是不阻斷人Vγ9Vδ2T細(xì)胞的激活并且也不激活人Vγ9Vδ2T細(xì)胞的免疫球蛋白分子，其中CDR3區(qū)包含選自SEQIDNO.3、37、40及43的組的氨基酸序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述免疫球蛋白分子包含標(biāo)記，其中免疫球蛋白分子是不阻斷人Vγ9Vδ2T細(xì)胞激活的免疫球蛋白分子。這些免疫球蛋白分子特別用于表達(dá)人Vγ9Vδ2T細(xì)胞受體的細(xì)胞的流式細(xì)胞術(shù)或免疫組織化學(xué)檢測(cè)。免疫球蛋白分子可以包含標(biāo)簽，例如，如實(shí)施例中所述的myc標(biāo)簽或his-標(biāo)簽或熒光蛋白序列，或者其可以偶聯(lián)至合適的成像染料。此外，當(dāng)偶聯(lián)至例如磁珠時(shí)，這些免疫球蛋白分子可用于從包括來(lái)自外周血的細(xì)胞的細(xì)胞懸浮液中分離和純化這些細(xì)胞。這些Vγ9Vδ2T細(xì)胞受體結(jié)合免疫球蛋白分子可被開(kāi)發(fā)為用于在免疫組織化學(xué)、流式細(xì)胞術(shù)、成像中的檢測(cè)和用于從細(xì)胞懸浮液磁性純化的研究工具。因?yàn)檫@些對(duì)人Vγ9Vδ2T細(xì)胞沒(méi)有影響，所以這些免疫球蛋白分子尤其可用于選擇這些細(xì)胞用于進(jìn)一步的用途。因此，進(jìn)一步提供了這些免疫球蛋白分子用于標(biāo)記或選擇人Vγ9Vδ2T細(xì)胞的用途。在本發(fā)明的另一方面，提供了免疫球蛋白分子，其中免疫球蛋白分子是包含CDR1區(qū)和CDR2區(qū)的免疫球蛋白，其中CDR1區(qū)包含與SEQIDNO.31的氨基酸序列GRTFSNYAMG具有至少40％序列同一性的氨基酸序列；并且其中CDR2區(qū)包含與SEQIDNO.32的氨基酸序列AISWSGGSTYYADSVKG具有至少60％序列同一性的氨基酸序列；并且其中優(yōu)選地免疫球蛋白分子是單鏈抗體。在一個(gè)實(shí)施方案中，CDR2區(qū)包含與SEQIDNO.2AISWSGGSTYYADSVKG具有至少60％序列同一性的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列在位置9具有T，在位置12具有A，在位置15具有V。在另一個(gè)實(shí)施方案中，免疫球蛋白分子是單域抗體，其中單域抗體優(yōu)選是美洲駝單鏈抗體或人單鏈抗體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，單鏈抗體是單域抗體。在其他實(shí)施方案中，免疫球蛋白分子或單鏈抗體或單結(jié)構(gòu)域抗體包含一個(gè)或多個(gè)選自SEQIDNO.67-70的氨基酸序列的組的框架區(qū)。在本發(fā)明該方面的另一個(gè)實(shí)施方案中，免疫球蛋白分子、單鏈抗體或單結(jié)構(gòu)域抗體包含CDR3區(qū)，其中CDR3區(qū)包含選自氨基酸序列SEQIDNO.3、6、9、11、14、17、20、22、25、27、29、30、33、35、37、40、43和46的組的氨基酸序列。在本發(fā)明的另一方面，提供了免疫球蛋白分子，其中免疫球蛋白分子包含CDR3區(qū)，其中CDR3區(qū)包含選自氨基酸序列SEQIDNO.3、6、9、11、14、17、20、22、25、27、29、30、33、35、37、40、43和46的組的氨基酸序列。具體實(shí)施方式供體來(lái)源的Vγ9Vδ2T細(xì)胞的產(chǎn)生按前述(SchneidersFL,etal.ClinImmunol2012；142:194-200)生成并培養(yǎng)健康的供體來(lái)源的(人)Vγ9Vδ2T細(xì)胞。JurkatVγ9Vδ2T細(xì)胞系和JurmaVγ9Vδ2T細(xì)胞系的產(chǎn)生根據(jù)先前描述的方法合成表達(dá)Vγ9Vδ2TCR的Jurkat和JurMa細(xì)胞系(ScholtenKB,etal.ClinImmunol2006；119:135-45)。簡(jiǎn)言之，通過(guò)小核糖核酸病毒來(lái)源的2A序列分離的克隆G9Vγ9-和Vδ2-鏈的蛋白序列(AllisonTJetal.Nature2001；411:820-4,DavodeauFetal.EurJImmunol1993；23:804-8)經(jīng)過(guò)密碼子修飾用于產(chǎn)生最佳蛋白質(zhì)，并通過(guò)GeneART(Lifetechnologies)合成，隨后克隆至LZRS。轉(zhuǎn)染到Phoenix-A包裝細(xì)胞系后，收集逆轉(zhuǎn)錄病毒上清液以轉(zhuǎn)導(dǎo)Jurkat或Jurma細(xì)胞?？筕γ9Vδ2TCRVHH的選擇2只美洲駝在無(wú)菌PBS中用1×108人供體來(lái)源的Vγ9Vδ2T細(xì)胞在六周的時(shí)間內(nèi)各免疫四次。按照描述(RooversRCetal.CancerImmunolImmunother.2007；56:303-17)從分離自美洲駝PBMC的提取的RNA構(gòu)建噬菌體文庫(kù)，并連接到噬菌粒載體pUR8100中。通過(guò)兩輪噬菌體展示選擇產(chǎn)生Vγ9Vδ2T細(xì)胞受體(TCR)特異性VHH。在第1輪中，來(lái)自兩個(gè)文庫(kù)的噬菌體在4℃下與轉(zhuǎn)導(dǎo)以穩(wěn)定表達(dá)Vγ9Vδ2TCR(JurkatVγ9Vδ2)的Jurkat細(xì)胞一起孵育2小時(shí)。孵育后，洗滌細(xì)胞，并用100mMHCl洗脫噬菌體。在4℃下孵育7分鐘后，除去未結(jié)合的噬菌體并用Tris-HCl中和，之后將它們感染大腸桿菌(E.coli)。回收選擇的噬菌體后，第二輪噬菌體首先在4℃下對(duì)Jurkat細(xì)胞進(jìn)行1小時(shí)的2次反選(counterselected)，然后將未結(jié)合的噬菌體與JurkatVγ9Vδ2孵育1小時(shí)。如第一輪選擇所述，洗脫噬菌體并感染大腸桿菌。將細(xì)菌接種在LB/2％葡萄糖/氨芐青霉素(ampicillin)平板上以產(chǎn)生編碼洗脫的VHHDNA的單一細(xì)菌菌落。VHH的產(chǎn)生和純化來(lái)自單個(gè)克隆的VHHDNA用Sfi1/BstEII消化，并克隆到質(zhì)粒pMEK219，將HC-V盒加入至來(lái)自pHen1的衍生物(Hoogenboometal.NucleicAcidsRes1991)以能夠進(jìn)行Sfi1/BstEII克隆，加入了缺失genIII序列的C-末端myc-和6xHIS-標(biāo)簽。將pMEK219-VHH轉(zhuǎn)化到TG1細(xì)菌。使用過(guò)夜培養(yǎng)以接種2xTY培養(yǎng)基加上0.1％葡萄糖和100μg/ml氨芐青霉素。當(dāng)OD600達(dá)到0.5時(shí)，加入IPTG至終濃度為1mM。允許2-5小時(shí)的蛋白質(zhì)產(chǎn)生。所有培養(yǎng)物的生長(zhǎng)在37℃下在200-220rpm的搖動(dòng)下進(jìn)行。通過(guò)在4℃下旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)物15分鐘來(lái)停止蛋白質(zhì)產(chǎn)生。將細(xì)菌沉淀(pellet)懸浮在PBS中并冷凍至少1小時(shí)。將細(xì)菌懸浮液解凍，在4℃下輕微搖動(dòng)1小時(shí)，并以4500rpm旋轉(zhuǎn)30分鐘。將上清液用經(jīng)洗滌的Talon樹脂(Clontech,1290TerraBellaAve.MountainView,CA,USA)在室溫下培養(yǎng)1小時(shí)。Talon樹脂用PBS洗滌3次，用pH7的15mM咪唑/PBS洗滌1次，并用pH7的150mM咪唑/PBS洗脫。將洗脫部分用PBS透析2次。用考馬斯(coomassie)染色的蛋白凝膠檢查純化的VHH的純度。VHH與供體來(lái)源的Vγ9Vδ2T細(xì)胞或JurkatVγ9Vδ2T細(xì)胞的結(jié)合用FACS緩沖液洗滌5×104個(gè)供體來(lái)源的Vγ9Vδ2T細(xì)胞。所有孵育在FACS緩沖液中在4℃下進(jìn)行30分鐘。將細(xì)胞與25μl500nMVHH一起孵育。洗滌后，將細(xì)胞與10μl1:500抗myc標(biāo)簽抗體克隆4A6(MerckMillipore,290CocordRoadBillerica,MA,USA)一起孵育。洗滌后，將細(xì)胞與10μl1:200山羊-抗鼠F(ab)2APC(BeckmanCoulter,Fullerton,CA,USA)在4℃孵育30分鐘。在最后的洗滌步驟后，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)(FACSCalibur,BDBiosciences)測(cè)量與細(xì)胞結(jié)合的VHH。通過(guò)VHH激活供體來(lái)源的Vγ9Vδ2T細(xì)胞將平底96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(Costar)在4℃下用50μl4μg/ml小鼠抗myc克隆9E10(室內(nèi)制備)包覆過(guò)夜。用PBS洗滌孔，并在室溫下用200μl4％BSA/PBS封閉30分鐘。去封閉，并將孔與在PBS中的30μl500nMVHH在室溫下孵育2小時(shí)。洗滌孔，每孔加入在200μlIMDM+(SchneidersFL,etal.ClinImmunol2012；142:194-200)中的1×104Vγ9Vδ2T，并在golgiplug(1:500)(BDBiosciences)的存在下在37℃下在具有潮濕氣氛的CO2培養(yǎng)箱中孵育過(guò)夜，用于細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子的保留。然后使用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定CD25、IFN-γ和粒酶(Granzyme)B表達(dá)(如所述；SchneidersFL,etal.ClinImmunol2012；142:194-200(CD25-PE(克隆M-A251，#555432)、IFN-γAPC(克隆B27#554702)均購(gòu)自BDPharmingen。GranzymeBPE(克隆GB-12#M2289)可從Sanquin，Amsterdam，TheNetherlands獲得))。通過(guò)VHH中和供體來(lái)源的Vγ9Vδ2T細(xì)胞將HeLa細(xì)胞與指定量的氨基二膦酸鹽(NBP；ABPPamidronaat-DiNatrium,Pharmachemie,Haarlem,TheNetherlands)在37℃下在具有潮濕氣氛的CO2培養(yǎng)箱中孵育2小時(shí)。然后洗滌細(xì)胞，并以5×104的每孔100μlIMDM+接種在平底96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(Costar)中，并在37℃下在具有潮濕氣氛的CO2培養(yǎng)箱中粘附2小時(shí)。用PBS洗滌細(xì)胞，并在100μlIMDM+中培養(yǎng)。將供體來(lái)源的Vγ9Vδ2T細(xì)胞用指定的VHH濃度在4℃孵育1小時(shí)。將75×103個(gè)VHH孵育的Vγ9Vδ2T細(xì)胞加入到NBP處理的HeLa細(xì)胞包被的孔中，并在37℃下在具有潮濕氣氛的CO2培養(yǎng)箱中孵育。用胰蛋白酶將細(xì)胞收獲到96孔圓底板中，加入Golgiplug(1:500,BDBiosciences)用于細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子的保留。使用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定CD25、IFN-γ和粒酶B表達(dá)(如所述；SchneidersFL,etal.ClinImmunol2012；142:194-200)。VHH鏈特異性用鼠抗人Vδ2-FITC和鼠抗人Vγ9-PE(均為BDBiosciences)對(duì)供體來(lái)源的Vγ9Vδ2T細(xì)胞系染色并用FACSAria(BDBiosciences)分選群體：?jiǎn)我籚δ2陽(yáng)性γδT細(xì)胞、單一Vγ9陽(yáng)性γδT細(xì)胞、Vγ9Vδ2雙陽(yáng)性γδT細(xì)胞和Vγ9Vδ2雙陰性γδT細(xì)胞。以與供體來(lái)源的Vγ9Vδ2T細(xì)胞系相同的方式培養(yǎng)分選的細(xì)胞。對(duì)于測(cè)定VHH特異性，將所得純化的分選細(xì)胞系中的104個(gè)細(xì)胞用VHH染色，以類似于所描述的將VHH與供體來(lái)源的Vγ9Vδ2T細(xì)胞的結(jié)合的方法，同時(shí)調(diào)整為10μl1:80山羊抗小鼠-F(ab)2RPE(#R0480，來(lái)自Dako,Glostrup,Denmark)用于抗myc抗體檢測(cè)。結(jié)果如上所述，測(cè)試選擇的VHH的特異性，所有20個(gè)VHH(參見(jiàn)表2)顯示與表達(dá)Jurkat細(xì)胞以及原始的Vγ9Vδ2T細(xì)胞的Vγ9Vδ2T細(xì)胞受體結(jié)合，而它們不結(jié)合不表達(dá)Vγ9Vδ2T細(xì)胞受體的Jurkat細(xì)胞。阻斷磷酸抗原誘導(dǎo)激活的免疫球蛋白分子克隆6F6和5E7被表征為阻斷Vγ9Vδ2T細(xì)胞的磷酸抗原誘導(dǎo)刺激的納米抗體?？寺?F6和5E7都是結(jié)合Vγ9Vδ2T細(xì)胞受體的Vδ2鏈的納米抗體。GrB、CD25和IFN-γ表達(dá)與未刺激的對(duì)照相似，而陽(yáng)性對(duì)照顯示相對(duì)高的表達(dá)水平(參見(jiàn)圖2)。在劑量反應(yīng)曲線中，在暴露于磷酸抗原時(shí)，顯示了磷酸抗原誘導(dǎo)的Vγ9Vδ2T細(xì)胞激活的劑量依賴性中和(參見(jiàn)圖3)。進(jìn)一步顯示，VHH5E7納米抗體通過(guò)氨基二膦酸(ABP)以劑量依賴性方式抑制Vγ9Vδ2T細(xì)胞的激活，即較高劑量的5E7導(dǎo)致CD25和CD107a表達(dá)的相對(duì)更強(qiáng)烈的減少，以及干擾素-γ和TNF-α產(chǎn)生也相對(duì)更強(qiáng)烈地減少。還顯示5E7納米抗體通過(guò)Vγ9Vδ2T細(xì)胞以劑量依賴性方式抑制Daudi細(xì)胞的自發(fā)裂解，而對(duì)照納米抗體不顯示任何顯著的效果。在相同的測(cè)定中，使用含氮雙膦酸帕米膦酸鹽激活Vγ9Vδ2T細(xì)胞，導(dǎo)致Daudi細(xì)胞的裂解增強(qiáng)。同樣，5E7納米抗體以劑量依賴性方式減少Daudi細(xì)胞的裂解。這表明可通過(guò)使用阻斷Vγ9Vδ2T細(xì)胞激活的納米抗體來(lái)減少Vγ9Vδ2T細(xì)胞的任何不希望的激活。這種阻斷Vγ9Vδ2T細(xì)胞激活的抗體可以是結(jié)合Vγ9Vδ2T細(xì)胞受體的Vδ2鏈的抗體。誘導(dǎo)激活的免疫球蛋白分子顯示各種VHH通過(guò)所示的CD25表達(dá)的增加和IFN-γ表達(dá)的增加激活Vγ9Vδ2T細(xì)胞(參見(jiàn)圖4)。此外，這種VHH顯示典型的劑量反應(yīng)，因?yàn)閂HH劑量的增加導(dǎo)致CD25表達(dá)的增加(參見(jiàn)圖5，右側(cè)部分)。這種VHH也與免疫球蛋白分子偶聯(lián)，并研究了對(duì)腫瘤細(xì)胞凋亡的影響(參見(jiàn)圖6)。雙特異性VHH(抗癌細(xì)胞結(jié)合以及Vγ9Vδ2T細(xì)胞結(jié)合和激活)顯示出對(duì)殺死腫瘤細(xì)胞的有效的活性。通過(guò)抗-Vγ9Vδ2納米抗體6H4與抗腫瘤的納米抗體的偶聯(lián)制備雙特異性VHH。作為雙特異性對(duì)照，將抗-Vγ9Vδ2納米抗體與對(duì)照納米抗體偶聯(lián)，并將抗腫瘤納米抗體與對(duì)照納米抗體偶聯(lián)。在最高劑量(10nM)的測(cè)試中，對(duì)照組僅誘導(dǎo)約22％的腫瘤細(xì)胞裂解。結(jié)合Vγ9Vδ2T細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的雙特異性VHH(或納米抗體)誘導(dǎo)由Vγ9Vδ2T細(xì)胞介導(dǎo)的約85％的腫瘤細(xì)胞裂解。在劑量反應(yīng)曲線中，通過(guò)Vγ9Vδ2T細(xì)胞的裂解的百分比隨劑量的降低(1nM約80％，100pM約78％，10pM約50％，1pM約23％和0約24％)而降低。在沒(méi)有(雙特異性)納米抗體僅使用雙膦酸鹽的對(duì)照實(shí)驗(yàn)中，觀察到約80％的腫瘤細(xì)胞裂解。這些結(jié)果顯示，可通過(guò)使用雙特異性VHH(或納米抗體)可以增強(qiáng)通過(guò)Vγ9Vδ2T細(xì)胞的腫瘤特異性裂解，其中腫瘤和Vγ9Vδ2T細(xì)胞均被靶向，并且其中Vγ9Vδ2T細(xì)胞的特異性腫瘤靶向還誘導(dǎo)Vγ9Vδ2T細(xì)胞的激活。不誘導(dǎo)激活并且不阻斷磷酸抗原激活的免疫球蛋白分子幾個(gè)VHH(5D7、5C7、5B11和6C4)顯示沒(méi)有人Vγ9Vδ2T細(xì)胞的激活，它也沒(méi)有阻斷磷酸抗原人Vγ9Vδ2T細(xì)胞激活的效果(圖8和圖5，左側(cè)部分)。這樣的VHH例如用于FACS分選中(參見(jiàn)圖7)。磁珠分離將抗-Vδ2(例如6H4)或Vγ9納米抗體(例如6H1)生物素化并與PBMC混合。洗滌細(xì)胞以除去未結(jié)合的納米抗體。將具有抗生蛋白鏈菌素(streptavidin)(例如可得自MiltenyiBiotec)的磁珠加入到混合物中并使用磁性分離柱將通過(guò)生物素化的納米抗體結(jié)合至珠的細(xì)胞與未結(jié)合的細(xì)胞分離。關(guān)于Vγ9和Vδ2表達(dá)，對(duì)PBMC進(jìn)行FACS分析。用抗Vδ2和Vγ9納米抗體都獲得了優(yōu)異的純化。例如，對(duì)于納米抗體6H4，4.5％的PBMC表達(dá)兩條鏈，在磁珠分離后，97.4％的細(xì)胞對(duì)Vγ9和Vδ2鏈都是陽(yáng)性的。不結(jié)合磁珠的細(xì)胞部分對(duì)于Vγ9和Vδ2鏈(0％)都是陰性的。表2.VHH與表達(dá)Vγ9Vδ2或不表達(dá)Vγ9Vδ2或者表達(dá)單一Vγ9或Vδ2鏈的γδT細(xì)胞的結(jié)合。表3.序列。(B＝結(jié)合，不激活，不阻斷磷酸抗原激活(PA)；A＝激活；PA＝阻斷PA激活)序列表<110>StichtingVU-VUmc<120>免疫球蛋白結(jié)合人Vγ9Vδ2T細(xì)胞受體<130>P31885PC00<160>72<170>PatentInversion3.5<210>1<211>10<212>PRT<213>美洲駝<400>1GlyArgThrPheSerArgTyrThrMetGly1510<210>2<211>17<212>PRT<213>美洲駝<400>2AlaIleSerTrpSerGlyGlyArgThrAsnPheAlaGlySerValLys151015Gly<210>3<211>13<212>PRT<213>美洲駝<400>3AspTrpLeuProValProGlyArgGluSerTyrAspTyr1510<210>4<211>10<212>PRT<213>美洲駝<400>4GlyArgThrPheSerSerTyrAlaMetGly1510<210>5<211>17<212>PRT<213>美洲駝<400>5AlaIleSerTrpSerGlyGlyThrThrTyrTyrAlaAspSerValLys151015Gly<210>6<211>16<212>PRT<213>美洲駝<400>6SerLeuAspCysSerGlyProGlyCysHisThrAlaGluTyrAspTyr151015<210>7<211>10<212>PRT<213>美洲駝<400>7GlyArgThrPheSerGluTyrAlaMetGly1510<210>8<211>17<212>PRT<213>美洲駝<400>8AlaIleSerTrpThrGlySerLysThrTyrTyrAlaAspSerValLys151015Gly<210>9<211>16<212>PRT<213>美洲駝<400>9SerSerAspCysSerGlyProGlyCysHisThrGluGluTyrAspTyr151015<210>10<211>17<212>PRT<213>美洲駝<400>10AlaValSerTrpSerGlyGlySerThrTyrTyrAlaAspSerValLys151015Gly<210>11<211>16<212>PRT<213>美洲駝<400>11SerGlnAspCysSerGlyProGlyCysTyrThrAsnGluTyrAspSer151015<210>12<211>10<212>PRT<213>美洲駝<400>12GlySerIlePheSerAsnTyrAlaMetAla1510<210>13<211>17<212>PRT<213>美洲駝<400>13AlaValSerTrpSerGlyGlyArgThrTyrTyrAlaAspSerValLys151015Gly<210>14<211>16<212>PRT<213>美洲駝<400>14SerLeuSerCysSerGlyProGlyCysSerLeuGluGluTyrAspTyr151015<210>15<211>10<212>PRT<213>美洲駝<400>15GlyArgProPheSerAsnTyrAlaMetGly1510<210>16<211>17<212>PRT<213>美洲駝<400>16ValIleSerTrpSerGlyGlySerThrTyrTyrAlaAspSerValLys151015Gly<210>17<211>18<212>PRT<213>美洲駝<400>17GlnPheSerGlyAlaSerThrValValAlaGlyThrAlaLeuAspTyr151015AspTyr<210>18<211>10<212>PRT<213>美洲駝<400>18GlyArgProPheSerAsnTyrGlyMetGly1510<210>19<211>17<212>PRT<213>美洲駝<400>19GlyIleSerTrpSerGlyGlySerThrAspTyrAlaAspSerValLys151015Gly<210>20<211>17<212>PRT<213>美洲駝<400>20ValPheSerGlyAlaGluThrAlaTyrTyrProSerAspAspTyrAsp151015Tyr<210>21<211>17<212>PRT<213>美洲駝<400>21GlyIleThrTrpSerGlyGlySerThrHisTyrAlaAspLeuValLys151015Gly<210>22<211>17<212>PRT<213>美洲駝<400>22ValPheSerGlyAlaGluThrAlaTyrTyrProSerThrGluTyrAsp151015Tyr<210>23<211>10<212>PRT<213>美洲駝<400>23GlyArgProPheAsnAsnTyrGlyMetGly1510<210>24<211>17<212>PRT<213>美洲駝<400>24GlyIleSerTrpSerGlyGlySerThrTyrTyrAlaAspSerValLys151015Gly<210>25<211>17<212>PRT<213>美洲駝<400>25ValPheSerGlyAlaGluThrAlaGlnTyrProSerTyrAspTyrAsp151015Tyr<210>26<211>17<212>PRT<213>美洲駝<400>26AlaValThrTrpSerGlyGlySerThrTyrTyrAlaAspSerValLys151015Gly<210>27<211>20<212>PRT<213>美洲駝<400>27GlnPheAsnGlyAlaGluAsnIleValProAlaThrThrThrProThr151015SerTyrAspTyr20<210>28<211>17<212>PRT<213>美洲駝<400>28AlaIleSerTrpSerGlyGlySerThrSerTyrAlaAspSerValLys151015Gly<210>29<211>21<212>PRT<213>美洲駝<400>29GlnPheSerGlyAlaAspTyrGlyPheGlyArgLeuGlyIleArgGly151015TyrGluTyrAspTyr20<210>30<211>21<212>PRT<213>美洲駝<400>30GlnPheSerGlyAlaAspTyrGlyPheGlyArgLeuGlyIleGlnGly151015TyrGluTyrAspTyr20<210>31<211>10<212>PRT<213>美洲駝<400>31GlyArgThrPheSerAsnTyrAlaMetGly1510<210>32<211>17<212>PRT<213>美洲駝<400>32AlaIleSerTrpSerGlyGlySerThrTyrTyrAlaAspSerValLys151015Gly<210>33<211>21<212>PRT<213>美洲駝<400>33MetPheSerGlySerGluSerGlnLeuValValValIleThrAsnLeu151015TyrGluTyrAspTyr20<210>34<211>17<212>PRT<213>美洲駝<400>34ThrIleSerTrpSerGlyGlySerThrTyrTyrAlaAspSerValLys151015Gly<210>35<211>18<212>PRT<213>美洲駝<400>35AlaPheSerGlySerAspTyrAlaAsnThrLysLysGluValGluTyr151015AspTyr<210>36<211>17<212>PRT<213>美洲駝<400>36AlaIleSerTrpSerGlyGlyMetThrAspHisAlaAspSerValLys151015Gly<210>37<211>21<212>PRT<213>美洲駝<400>37AlaPheAlaGlyAspIleProTyrGlySerSerTrpTyrGlyAspPro151015ThrThrTyrAspTyr20<210>38<211>10<212>PRT<213>美洲駝<400>38GlyArgThrSerSerThrPheSerMetAla1510<210>39<211>17<212>PRT<213>美洲駝<400>39AlaIleAsnTrpSerGlyGlySerThrArgTyrAlaAspSerValSer151015Asp<210>40<211>15<212>PRT<213>美洲駝<400>40ArgArgGlyGlyIleTyrTyrSerThrGlnAsnAspTyrAspTyr151015<210>41<211>10<212>PRT<213>美洲駝<400>41ValArgThrPheSerAspTyrArgMetGly1510<210>42<211>17<212>PRT<213>美洲駝<400>42ThrIleSerTrpSerGlyGlyLeuThrTyrTyrAlaAspSerValLys151015Gly<210>43<211>14<212>PRT<213>美洲駝<400>43GlyGlyGlyTyrAlaGlyGlyThrTyrTyrHisProGluGlu1510<210>44<211>10<212>PRT<213>美洲駝<400>44GlyPheThrPheAspAspTyrCysIleAla1510<210>45<211>17<212>PRT<213>美洲駝<400>45CysIleThrThrSerAspGlySerThrTyrTyrAlaAspSerValLys151015Gly<210>46<211>18<212>PRT<213>美洲駝<400>46TyrPheGlyTyrGlyCysTyrGlyGlyAlaGlnAspTyrArgAlaMet151015AspTyr<210>47<211>122<212>PRT<213>美洲駝<400>47GluValGlnLeuValGluSerGlyGlyGlyLeuValGlnAlaGlyAsp151015SerLeuArgLeuSerCysAlaAlaSerGlyArgThrPheSerArgTyr202530ThrMetGlyTrpPheArgGlnAlaProGlyLysGluArgGluPheVal354045AlaAlaIleSerTrpSerGlyGlyArgThrAsnPheAlaGlySerVal505560LysGlyArgPheThrIleSerArgAspAsnAlaLysAsnThrValTyr65707580LeuGlnMetAsnSerLeuLysProGluAspThrAlaValTyrTyrCys859095AlaAlaAspTrpLeuProValProGlyArgGluSerTyrAspTyrTrp100105110GlyGlnGlyThrGlnValThrValSerSer115120<210>48<211>125<212>PRT<213>美洲駝<400>48GluValGlnLeuValGluSerGlyGlyGlyLeuValGlnAlaGlyGly151015SerLeuArgLeuSerCysThrAlaSerGlyArgThrPheSerSerTyr202530AlaMetGlyTrpPheArgGlnAlaProGlyLysGluArgGluPheVal354045AlaAlaIleSerTrpSerGlyGlyThrThrTyrTyrAlaAspSerVal505560LysGlyArgPheThrIleSerArgAspAsnAlaLysAsnThrValSer65707580LeuGlnMetAsnSerLeuLysProGluAspThrAlaValTyrPheCys859095AlaAlaSerLeuAspCysSerGlyProGlyCysHisThrAlaGluTyr100105110AspTyrTrpGlyGlnGlyThrGlnValThrValSerSer115120125<210>49<211>125<212>PRT<213>美洲駝<400>49GluValGlnLeuValGluSerGlyGlyGlyLeuValGlnAlaGlyGly151015SerLeuArgLeuSerCysAlaAlaThrGlyArgThrPheSerGluTyr202530AlaMetGlyTrpPheArgGlnAlaProGlyLysGluArgGluPheAla354045AlaAlaIleSerTrpThrGlySerLysThrTyrTyrAlaAspSerVal505560LysGlyArgPheThrIleSerArgAspAsnAlaLysAsnThrValTyr65707580LeuGlnMetAsnSerLeuLysProGluAspThrAlaValTyrTyrCys859095AlaAlaSerSerAspCysSerGlyProGlyCysHisThrGluGluTyr100105110AspTyrTrpGlyGlnGlyThrGlnValThrValSerSer115120125<210>50<211>125<212>PRT<213>美洲駝<400>50GluValGlnLeuValGluSerGlyGlyGlyLeuValGlnAlaGlyGly151015SerLeuArgLeuSerCysAlaAlaSerGlyArgThrPheSerSerTyr202530AlaMetGlyTrpPheArgGlnAlaProGlyLysGluArgGluPheVal354045AlaAlaValSerTrpSerGlyGlySerThrTyrTyrAlaAspSerVal505560LysGlyArgPheThrIleSerArgAspAsnAlaArgAsnThrValTyr65707580LeuGlnMetAsnSerLeuAsnProGluAspThrAlaValTyrTyrCys859095AlaAlaSerGlnAspCysSerGlyProGlyCysTyrThrAsnGluTyr100105110AspSerTrpGlyGlnGlyThrGlnValThrValSerSer115120125<210>51<211>125<212>PRT<213>美洲駝<400>51GluValGlnLeuValGluSerGlyGlyGlyLeuValGlnProGlyGly151015SerLeuArgLeuSerCysAlaAlaSerGlySerIlePheSerAsnTyr202530AlaMetAlaTrpPheArgGlnAlaProGluLysGluArgAspPheLeu354045AlaAlaValSerTrpSerGlyGlyArgThrTyrTyrAlaAspSerVal505560LysGlyArgPheThrIleSerArgAspAsnAlaLysAsnThrValAsn65707580LeuGlnMetAsnSerLeuLysProGluAspThrAlaValTyrTyrCys859095AlaAlaSerLeuSerCysSerGlyProGlyCysSerLeuGluGluTyr100105110AspTyrTrpGlyGlnGlyThrGlnValThrValSerSer115120125<210>52<211>127<212>PRT<213>美洲駝<400>52GluValGlnLeuValGluSerGlyGlyGlyLeuValGlnAlaGlyGly151015SerLeuArgLeuSerCysAlaAlaSerGlyArgProPheSerAsnTyr202530AlaMetGlyTrpPheArgGlnAlaProGlyLysGluArgGluPheVal354045ThrValIleSerTrpSerGlyGlySerThrTyrTyrAlaAspSerVal505560LysGlyArgPheThrIleSerArgAspAsnAlaLysAsnThrValTyr65707580LeuGlnMetAsnSerLeuLysProGluAspThrAlaValTyrTyrCys859095AlaAlaGlnPheSerGlyAlaSerThrValValAlaGlyThrAlaLeu100105110AspTyrAspTyrTrpGlyGlnGlyThrArgValThrValSerSer115120125<210>53<211>126<212>PRT<213>美洲駝<400>53GluValGlnLeuValGluSerGlyGlyGlyLeuValGlnAlaGlyGly151015SerLeuArgLeuSerCysAlaAlaSerGlyArgProPheSerAsnTyr202530GlyMetGlyTrpPheArgGlnAlaProGlyLysLysArgGluPheVal354045AlaGlyIleSerTrpSerGlyGlySerThrAspTyrAlaAspSerVal505560LysGlyArgLeuThrIleSerArgAspAsnAlaLysAsnThrValTyr65707580LeuGlnMetAsnSerLeuLysProGluAspThrAlaValTyrTyrCys859095AlaAlaValPheSerGlyAlaGluThrAlaTyrTyrProSerAspAsp100105110TyrAspTyrTrpGlyGlnGlyThrGlnValThrValSerSer115120125<210>54<211>126<212>PRT<213>美洲駝<400>54GluValGlnLeuValGluSerGlyGlyGlyLeuValGlnAlaGlyGly151015SerLeuArgLeuSerCysAlaAlaSerGlyArgProPheSerAsnTyr202530GlyMetGlyTrpPheArgGlnAlaProGlyLysLysArgGluPheVal354045AlaGlyIleSerTrpSerGlyGlySerThrAspTyrAlaAspSerVal505560LysGlyArgPheThrIleSerArgAspAsnAlaLysAsnThrValTyr65707580LeuGlnMetAsnSerLeuLysProGluAspThrAlaValTyrTyrCys859095AlaAlaValPheSerGlyAlaGluThrAlaTyrTyrProSerAspAsp100105110TyrAspTyrTrpGlyGlnGlyThrGlnValThrValSerSer115120125<210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