相關申請的交叉引用本申請要求來自2011年4月1日提交的美國臨時申請?zhí)?1/470,635和2011年5月31日提交的美國臨時申請?zhí)?1/491,392的優(yōu)先權。這些臨時申請在此通過引用的方式完整并入本公開中作為參考。聯(lián)邦資助研究的權利聲明本發(fā)明借助美國政府支持在美國國家健康研究所資助的基金P01CA23766和R01CA55349下做出。美國政府享有本發(fā)明中的某些權利。序列表本申請含有2012年3月29日創(chuàng)建的序列表；將處于ASCII格式的該文件命名為3314013AWO_SequenceListing_ST25.txt。該文件在此通過引用方式完整地并入本申請中作為參考。
技術領域：
：本發(fā)明總體上涉及針對胞質蛋白的抗體。更具體地，本發(fā)明涉及針對維爾姆斯瘤癌基因蛋白(WT1)的抗體，特別地是識別與主要組織相容性抗原結合的WT1肽的抗體。發(fā)明背景維爾姆斯瘤癌基因蛋白(WT1)是針對大多數(shù)白血病和廣泛類型癌癥的吸引人的免疫治療靶。WT1是胚發(fā)生期間正常情況下在中胚層組織中表達的鋅指轉錄因子。在正常成年組織中，WT1表達限于CD34+造血干細胞中的低水平，但是在多個譜系的白血病和廣泛類型的實體瘤中過量表達(1-2)。最近，已經(jīng)報道WT1表達成為最小殘留疾病的標志物。處于形態(tài)學緩解的急性髓樣白血病(AML)患者中增加的轉錄物水平已經(jīng)預示明顯的臨床復發(fā)(3，4)。另外，在患有造血系統(tǒng)惡性腫瘤和實體瘤的患者中檢測到針對WT1的抗體，這表明WT1是一種高度免疫原性抗原(7)。就絕大部分而言，臨床批準的治療性單克隆抗體(mAb)識別細胞表面蛋白的結構。然而，WT1是一種核蛋白并且因此是經(jīng)典抗體療法不可接近的。直至現(xiàn)在，靶向WT1的免疫療法限于細胞方法，排他地旨在產(chǎn)生識別由MHCI類分子在細胞表面上呈遞的肽的WT1特異性細胞毒CD8T細胞(CTL)反應。為了誘導CTL反應，胞內蛋白通常由蛋白酶體或內體/溶酶體降解，并且所產(chǎn)生的肽片段與MHCI或II類分子結合。這些肽-MHC復合體展示在細胞表面，在細胞表面它們通過肽-MHC(pMHC)-T細胞受體(TCR)相互作用為T細胞識別提供靶(8，9)。用源自WT1蛋白的肽接種誘導HLA限制型細胞毒CD8T細胞，后者能夠殺傷腫瘤細胞。為了改善功效，可以采用單克隆抗體療法靶向癌抗原。單克隆抗體(mAb)療法已經(jīng)顯示通過多種機制產(chǎn)生強有力的抗腫瘤作用，所述機制包括補體依賴的細胞毒性(CDC)、抗體依賴的細胞毒性(ADCC)和直接細胞抑制或凋亡誘導針對過量表達靶分子的腫瘤細胞的作用。另外，mAb可以用作向腫瘤細胞特異性遞送細胞毒部分如放射性核素、細胞毒藥物或毒素的載體(18)。如果除細胞免疫療法方案之外，還能獲得體液免疫療法方案來靶向非細胞表面腫瘤抗原，將存在巨大的益處。因此，模擬T細胞受體的單克隆抗體(mAb)將單獨是一種新穎和有效的治療藥或作為能夠遞送強力抗癌劑如藥物、毒素和放射性元素的運載體，原因在于所述單克隆抗體是對包含與MHC分子結合的胞內蛋白片段的靶(例如，WT1肽/HLA-A2復合體)特異的。這類種mAb也將可用作診斷工具或預測工具。發(fā)明概述本公開鑒定并表征了能夠靶向胞質/胞內蛋白(例如，WT1癌蛋白)的抗原結合蛋白，如抗體。所公開的抗體靶向肽/MHC復合體，因為在WT1蛋白由細胞進行抗原加工和呈遞后，它一般將出現(xiàn)在細胞的表面上。在這個方面，抗體模擬T細胞受體，原因在于該抗體具有特異性識別并結合于MHC限制形式的肽(即，該肽與MHC抗原結合時)的能力。肽/MHC復合體重現(xiàn)抗原，因為在WT1蛋白受到抗原加工和呈遞給細胞后，它一般將出現(xiàn)在細胞的表面上。所公開的抗體特異性識別并結合至肽/HLA-A2復合體、尤其WT1/HLA-A0201復合體的表位。由本發(fā)明的抗原結合蛋白作為HLA-肽復合體的部分所識別的肽的例子包括但不限于表7中顯示的那些，例如，具有氨基酸序列RMFPNAPYL(SEQIDNO：1)的肽。因此，在一個方面，當具有氨基酸序列RMFPNAPYL的肽與MHC抗原如HLA-A2結合時，本發(fā)明涉及與所述肽結合的分離抗體或其抗原結合片段。在另一個方面，本發(fā)明涉及分離的抗原結合蛋白、抗體、或其抗原結合片段，包含：(A)(i)重鏈(HC)可變區(qū)和輕鏈(LC)可變區(qū)，所述重鏈(HC)可變區(qū)包含分別含有氨基酸序列SEQIDNOS：2、3和4的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，所述輕鏈(LC)可變區(qū)包含分別含有氨基酸序列SEQIDNOS：8、9和10的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3；(ii)重鏈(HC)可變區(qū)和輕鏈(LC)可變區(qū)，所述重鏈(HC)可變區(qū)包含分別含有氨基酸序列SEQIDNOS：20、21和22的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，所述輕鏈(LC)可變區(qū)包含分別含有氨基酸序列SEQIDNOS：26、27和28的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3；(iii)重鏈(HC)可變區(qū)和輕鏈(LC)可變區(qū)，所述重鏈(HC)可變區(qū)包含分別含有氨基酸序列SEQIDNOS：38、39和40的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，所述輕鏈(LC)可變區(qū)包含分別含有氨基酸序列SEQIDNOS：44、45和46的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3；(iv)重鏈(HC)可變區(qū)和輕鏈(LC)可變區(qū)，所述重鏈(HC)可變區(qū)包含分別含有氨基酸序列SEQIDNOS：56、57和58的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，所述輕鏈(LC)可變區(qū)包含分別含有氨基酸序列SEQIDNOS：62、63和64的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3；(v)重鏈(HC)可變區(qū)和輕鏈(LC)可變區(qū)，所述重鏈(HC)可變區(qū)包含分別含有氨基酸序列SEQIDNOS：74、75和76的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，所述輕鏈(LC)可變區(qū)包含分別含有氨基酸序列SEQIDNOS：80、81和82的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3；或(vi)重鏈(HC)可變區(qū)和輕鏈(LC)可變區(qū)，所述重鏈(HC)可變區(qū)包含分別含有氨基酸序列SEQIDNOS：92、93和94的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，所述輕鏈(LC)可變區(qū)包含分別含有氨基酸序列SEQIDNOS：98、99和100的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。在另一個方面，本發(fā)明涉及分離的抗原結合蛋白、抗體、或其抗原結合片段，其包含分別含有選自SEQIDNOS：14和16；32和34；50和52；68和70；86和88；以及104和106的第一和第二氨基酸序列的VH和VL。在又一個方面，本發(fā)明涉及分離的抗原結合蛋白、抗體、或其抗原結合片段，其包含選自SEQIDNOS：18、36、54、72、90和108的氨基酸序列。在一個相關方面，分離的抗原結合蛋白包含如表1-8的任一個中公開的抗原結合區(qū)域?？乖Y合蛋白可以是融合蛋白。在另一個方面，本發(fā)明涉及包含第一組分的免疫綴合物，所述第一組分是如本文中公開的抗原結合蛋白、抗體或其抗原結合片段。免疫綴合物包含第二組分，所述第二組分是細胞毒素、可檢測標記物、放射性同位素、治療藥、結合蛋白或具有第二氨基酸序列的分子。在第二組分是結合蛋白或第二抗體的情況下，結合蛋白或第二抗體對靶具有結合特異性，其中所述靶是與第一組分特異的HLA-肽復合體不同的靶。因此，在一個相關方面，本發(fā)明涉及包含如本文所述的抗原結合蛋白或其功能性片段的雙特異性抗體。在又一個方面，本發(fā)明涉及核酸，所述核酸編碼抗原結合蛋白，包括對WT1肽/HLA復合體、尤其WT1肽RMFPNAPYL/HLA-A0201復合體特異的抗體和嵌合抗原受體。在另一個相關方面，本發(fā)明涉及包含本文中公開的核酸或抗原結合蛋白的細胞，包括重組免疫效應細胞，如，經(jīng)遺傳修飾以表達包含本公開的抗原結合區(qū)的嵌合抗原受體的T細胞。本發(fā)明也包括已經(jīng)被工程化以產(chǎn)生本公開的抗體的細胞。在一個相關方面，本發(fā)明涉及載體，所述載體包含編碼本文中公開的抗原結合蛋白的核酸，包括利于抗原結合蛋白(如本公開的抗體或嵌合抗原受體)表達和/或分泌的載體。在一個相關方面，本發(fā)明涉及藥物組合物，所述藥物組合物包含本文中公開的抗原結合蛋白、抗體、核酸、包含所述核酸或抗原結合蛋白的載體或細胞，以及可藥用載體。在另一個方面，本發(fā)明涉及一種使用本發(fā)明的WT1抗體檢測細胞或組織的表面上WT1的方法。在又一個方面，本發(fā)明涉及用于治療患有WT1陽性疾病的受試者的方法，包括向所述受試者施用治療有效量的如本文中公開的抗原結合蛋白、抗體或其抗原結合片段、編碼所述抗原結合蛋白或抗體的核酸或包含所述核酸或蛋白質的細胞。WT1陽性疾病是慢性白血病、急性白血病或選自慢性髓細胞白血病、多發(fā)性骨髓瘤(MM)、急性淋巴母細胞白血病(ALL)、急性髓樣/骨髓性白血病(AML)、骨髓增生異常綜合征(MDS)、間皮瘤、卵巢癌、胃腸道癌、乳腺癌、前列腺癌和成膠質細胞瘤的WT1+癌癥。在一些實施方案中，抗原結合蛋白或抗體是具有與抗原結合蛋白或抗體連接的細胞毒部分的綴合物。附圖簡述圖1顯示維爾姆斯瘤蛋白的氨基酸序列(GenBank登錄號P19544)，其中一些HLA限制型肽以粗體表示。121-140肽進一步包括9聚物(加下劃線)，為RMFPNAPYL(SEQIDNO：1)，所述9聚物和其類似物也已經(jīng)顯示誘導WT1特異性細胞毒T細胞活性。圖2是顯示W(wǎng)T1肽接種誘導針對WT1+白血病細胞的細胞毒T細胞的圖。圖3顯示W(wǎng)T1/A2(WA)相對于PBS對照或R3/HLAA0201(R3)而言特異性結合的噬菌體ELISA的結果。圖4顯示僅選擇與WT1A肽脈沖的T2細胞結合的WT1噬菌體抗體的特異性結合。圖5顯示W(wǎng)T1抗體的全長IgG1針對RMF/A0201復合體的結合親和力，所述結合親和力通過滴定處于各種濃度的抗體進行測試。顯示了用50μg/mlRMF脈沖的T2細胞的結果(上部小圖)。下部小圖中顯示對照抗體。圖6顯示對T2細胞上由WT1抗體識別的RMF/HLA-A0201復合體的密度的依賴性，其中所述T2細胞用RMF(上部小圖)或對照RHAMM-R3(下部小圖)脈沖。圖7顯示表達人抗體的表達載體。圖8顯示在還原和非還原條件下SDS-PAGE分析WT1/A2抗體的結果。圖9顯示了對WT1/A2展示抗體親和力的WT1/A2抗體的動力學結合分析的結果。圖10顯示與WT1/A2復合體結合的抗體的親和力(KD)。圖11顯示借助流式細胞術時，對一些實施方案：mAb克隆5(上部小圖)、克隆15(中部小圖)和對照(下部小圖)與活T2細胞結合的肽滴定的平均熒光強度(MFI)，所述的活T2細胞用不同濃度的肽：WT1-A、WT1-A1或對照脈沖。圖12顯示對WT1抗體、mAb5(上部小圖)、mAb15(下部小圖)與活T2細胞結合的肽滴定的結果，所述的活T2細胞用不同濃度的WT1A肽脈沖。圖13顯示一個實施方案mAb5在不同濃度(50μg/ml上部小圖；25μg/ml中部小圖；和12.5μg/ml下部小圖)的肽(R3、WT1-A1、WT1-A或無肽)時的結合特異性。圖14顯示一個實施方案mAb15在不同濃度(50μg/ml上部小圖；25μg/ml下部小圖)的肽(R3、WT1-A1、WT1-A或無肽)時的結合特異性。圖15顯示mAb5(上部小圖)和15(下部小圖)與WT1-A，WT1-A1或RHAMM-R3肽脈沖的T2細胞的劑量依賴性結合。圖16顯示mA5和15與骨髓瘤細胞系U266的結合。圖17顯示mAb15與源自患有(Ph1)陽性急性白血病的個體的細胞系BV173的結合。圖18顯示W(wǎng)T1肽脈沖的T2細胞的表面上ESK1(#13)與WT1/A2復合體的特異性結合。圖19和圖20顯示，WT1抗體能夠識別其中用丙氨酸置換RMF肽的不同位置的RMF肽(也見表10)并且隨丙氨酸(WT1-A1-B)或酪氨酸(WT1-A1)置換位置1所見到的結合作用喪失不歸因于針對HLA-A2分子的肽結合親和力降低，因為在使用HLA-A2分子特異的mAb，即克隆BB7的T2穩(wěn)定測定法中，兩種肽均顯示最強烈結合。圖21顯示W(wǎng)T1抗體識別在人間皮瘤細胞系JMN(WT1+/A0201+)的表面上天然呈遞的RMF/HLA-A0201復合體，但不識別MSTO(WT1+/HLA-A0201-)呈遞的復合體。圖22顯示W(wǎng)T1抗體與人CML衍生的細胞系BV173結合。圖23是基于WT1抗體與JMN細胞結合的斯卡查德分析并且顯示約0.2nM的親合力常數(shù)。圖24顯示W(wǎng)T1抗體與一組間皮瘤細胞和白血病細胞結合。圖25顯示對來自HLA-A2陽性患者的CD33和CD34雙陽性AML母細胞設門的流式細胞分析結果。ESK1與白血病母細胞結合。圖26顯示對來自HLA-A2陰性患者的CD33和CD34雙陽性AML母細胞設門的流式細胞分析結果。WT1mAbESK1不與母細胞結合。圖27顯示W(wǎng)T1mAbESK1介導的針對RMF肽脈沖的T2細胞的ADCC。圖28顯示W(wǎng)T1抗體借助人效應子在JMN和白血病細胞系BV173(下部小圖)中但是不在MSTO細胞中介導ADCC的能力。圖29顯示W(wǎng)T1mAb有效對抗人白血病細胞系BV173，但是未有效對抗不是HLA-A2+的HL60細胞。圖30顯示W(wǎng)T1抗體誘導針對來自HLA-A2陽性患者的原代AML母細胞的ADCC。圖31顯示使用本發(fā)明的抗體治療NSG小鼠中人BV173的結果。圖32顯示在較晚時間點，僅用WT1抗體治療的小鼠開始復發(fā)，而使用抗體加效應子治愈5只小鼠中的2只。圖33顯示W(wǎng)T1抗體以劑量依賴性方式顯著地降低腫瘤負荷。圖34顯示在Fc(MAGE)中具有糖改變的抗體比原始抗體在ADCC方面更有效。本發(fā)明的詳細描述本文所援引的全部出版物、專利和其他參考文獻均通過引用的方式完整地并入本公開。在實施本發(fā)明中，使用分子生物學、微生物學、細胞生物學、生物化學和免疫學中的許多常規(guī)技術，它們處于本領域技術人員的能力范圍內。這些技術更詳細地在例如MolecularCloning：aLaboratoryManual第3版，J.F.Sambrook和D.W.Russell編著.ColdSpringHarborLaboratoryPress2001；RecombinantAntibodiesforImmunotherapy，MelvynLittle編著,CambridgeUniversityPress2009；"OligonucleotideSynthesis"(M.J.Gait編著，1984)；"AnimalCellCulture"(R.I.Freshney編著，1987)；"MethodsinEnzymology"(AcademicPress，Inc.)；"CurrentProtocolsinMolecularBiology"(F.M.Ausubel等人編著，1987及定期更新)；"PCR：ThePolymeraseChainReaction"，(Mullis等人編著，1994)；"APracticalGuidetoMolecularCloning"(PerbalBernardV.，1988)；"PhageDisplay：ALaboratoryManual"(Barbas編著，2001)中描述。這些參考文獻的內容和含有本領域技術人員廣泛已知并遵循的標準方案的其他參考資料，包括制造商的說明書，因而通過引用方式作為本公開的部分并入作為參考。在本申請通篇范圍內使用以下縮寫：Ab：抗體ADCC：抗體依賴的細胞毒性ALL：急性淋巴細胞白血病AML：急性髓樣白血病APC：抗原呈遞細胞β2M：β2微球蛋白BiTE：雙特異性T細胞結合抗體CAR：嵌合抗原受體CDC：補體依賴的細胞毒性CMC：補體介導的細胞毒性CDR：互補決定區(qū)(也見下文HVR)CL：輕鏈的恒定域CH1：重鏈的第一恒定域CH1、2、3：重鏈的第一、第二和第三恒定域CH2、3：重鏈的第二和第三恒定域CHO：中國倉鼠卵巢細胞CTL：細胞毒T細胞E:T比率：效應子:靶比率Fab：抗體結合片段FACS：流式輔助細胞術的細胞分選FBS：胎牛血清FR：構架區(qū)HC：重鏈HLA：人白細胞抗原HVR-H：高變區(qū)-重鏈(也見CDR)HVR-L：高變區(qū)-輕鏈(也見CDR)Ig：免疫球蛋白IRES：內部核糖體進入位點KD：解離常數(shù)koff：解離速率kon：結合速率MHC：主要組織相容性復合體MM：多發(fā)性骨髓瘤scFv：單鏈可變片段TCR：T細胞受體VH：可變重鏈包括重鏈高變區(qū)和重鏈可變構架區(qū)域VL：可變輕鏈包括輕鏈高變區(qū)和輕鏈可變構架區(qū)域WT1：維爾姆斯瘤蛋白1在隨后的描述中，將就術語使用方面遵循某些慣例?？傮w上，本文所用的術語意在按照與本領域技術人員已知的那些術語的含義相一致的方式解釋?！翱乖Y合蛋白”是包含抗原結合區(qū)域或抗原結合部分的蛋白質或多肽，即其對與之結合的另一個分子具有強親和力?？乖Y合蛋白包括抗體、嵌合抗原受體(CAR)和融合蛋白?！翱贵w”作為本領域已知的那些術語，指免疫系統(tǒng)的抗原結合蛋白。如本文提到的術語“抗體”包括具有抗原結合區(qū)域的完整的全長抗體及其中“抗原結合部分”或“抗原結合區(qū)域”保留的其任何片段、或其單鏈例如單鏈可變片段(scFv)。天然存在的“抗體”是包含由二硫鍵相互連接的至少兩條重鏈(H)和兩條輕鏈(L)的糖蛋白。每條重鏈包含重鏈可變區(qū)(本文中縮寫為VH)和重鏈恒定區(qū)(CH)。重鏈恒定區(qū)包含3個結構域CH1、CH2和CH3。每條輕鏈包含輕鏈可變區(qū)(本文中縮寫為VL)和輕鏈恒定區(qū)CL。輕鏈恒定區(qū)包含一個結構域CL。VH和VL區(qū)可以進一步再劃分為超變區(qū)，命名為互補決定區(qū)(CDR)，其間插入較保守的區(qū)域，名為構架區(qū)(FR)。每個VH和VL由從氨基端至羧基端按以下順序：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4排列的3個CDR和4個FR的組成。重鏈的可變區(qū)和輕鏈的可變區(qū)含有與抗原相互作用的結合結構域。抗體的恒定區(qū)可以介導免疫球蛋白與宿主組織或因子(包括免疫系統(tǒng)的各種細胞(例如，效應細胞)和經(jīng)典補體系統(tǒng)的第一組分(C1q))結合。如本文所用，術語抗體的“抗原結合部分”或“抗原結合區(qū)域”指抗體中與抗原結合并且向抗體賦予抗原特異性的區(qū)域或部分；抗原結合蛋白(例如，抗體)的片段包括保留與抗原(例如，肽/HLA復合體)特異性結合的能力的一個或多個抗體片段。已經(jīng)顯示抗體的抗原結合功能可以由全長抗體的片段執(zhí)行。在術語抗體的“抗體片段”中所涵蓋的抗原結合片段的例子包括Fab片段，一種由VL、VH、CL和CH1結構域組成的單價片段；F(ab)2片段，一種包含由二硫鍵在鉸鏈區(qū)連接的兩個Fab片段的雙價片段；由VH和CH1結構域組成的Fd片段；由抗體單臂的VL和VH結構域組成的Fv片段；由VH結構域組成的dAb片段(Ward等人，1989Nature341:544-546)；和分離的互補決定區(qū)(CDR)。另外，雖然Fv片段的兩個結構域VL和VH由獨立的基因編碼，但是使用重組方法，可以將它們通過能夠使這兩個結構域作為單條蛋白鏈產(chǎn)生的合成性接頭連接，在所述單條蛋白鏈中VL區(qū)和VH區(qū)配對以形成單價分子。這些單價分子稱作單鏈Fv(scFv)；見例如，Bird等人，1988Science242:423-426；和Huston等人，1988Proc.Natl.Acad.Sci.85:5879-5883。使用本領域技術人員已知的常規(guī)技術，獲得這些抗體片段，并且按照與完整抗體相同的方式篩選所述片段來應用。“分離的抗體”或“分離的抗原結合蛋白”是已經(jīng)鑒定過并且從其天然環(huán)境的組分中分離和/或回收的。“合成抗體”或“重組抗體”通常使用重組技術或使用本領域技術人員已知的肽合成技術產(chǎn)生。常規(guī)地，MHC-肽復合體僅可由T細胞受體(TCR)識別，這限制了我們使用基于T細胞的讀出測定法檢測目的表位的能力。在本公開中，描述了具有基于scFv的抗原結合區(qū)域的抗原結合蛋白，包括抗體，其中使用重組HLA-肽復合體，從人scFv噬菌體展示文庫選擇scFv。這些分子展示精細的特異性，例如，如采用僅識別HLA-A2-RMFPNAPYL復合體的抗WT1抗體所顯示。此外，連同它們不能與含有其他肽的HLA-復合體結合，所述分子還不能與肽本身結合，這進一步展示它們的TCR樣特異性。最初測試了通過噬菌體展示所選擇的本公開scFv與HLA陽性細胞表面上呈遞的肽結合的能力。在肽存在下溫育T2細胞后，使用流式細胞術，熒光標記的抗體可以用來選擇性地識別抗原脈沖的細胞。在一些實施方案中，本發(fā)明包括具有scFv序列的抗體，所述scFv序列與一個或多個重鏈恒定域融合以形成具有人免疫球蛋白Fc區(qū)的抗體以產(chǎn)生雙價蛋白，從而增加抗體的總體親合力和穩(wěn)定性。此外，F(xiàn)c部分允許將其他分子(包括但不限于熒光染料、細胞毒素、放射性同位素等)與例如用于抗原定量研究中的抗體直接綴合，以便固定抗體用于親和力測量、用于定向遞送治療藥、使用免疫效應細胞測試Fc介導的細胞毒性和許多其他應用。本文提供的結果突出本發(fā)明抗體在靶向MHC-肽復合體時的特異性、靈敏性和效用。本發(fā)明的分子基于使用噬菌體展示鑒定和選擇單鏈可變片段(scFv)，所述單鏈可變片段的氨基酸序列賦予分子針對目的MHC限制型肽的特異性并且形成本公開的全部抗原結合蛋白的基礎。因此，所述scFv可以用來設計一系列不同“抗體”分子，包括例如全長抗體、其片段如Fab和F(ab')2、微型抗體、融合蛋白(包括scFv-Fc融合物)、多價抗體，即，具有針對相同抗原或不同抗原的多于一種特異性的抗體，例如，雙特異性T細胞接合抗體(BiTe)、三體抗體等(見Cuesta等人，Multivalentantibodies：whendesignsurpassesevolution，TrendsinBiotechnology28:355-3622010)。在抗原結合蛋白是全長抗體的一個實施方案中，本發(fā)明抗體的重鏈和輕鏈可以是全長(例如，抗體可以包括至少一條并優(yōu)選地兩條完整重鏈，和至少一條并優(yōu)選地兩條完整輕鏈)或可以包括抗原結合部分(Fab、F(ab')2、Fv或單鏈Fv片段(“scFv”))。在其他實施方案中，抗體重鏈恒定區(qū)選自例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgD和IgE。在一些實施方案中，免疫球蛋白同種型選自IgG1、IgG2、IgG3和IgG4，更具體地選自IgG1(例如，人IgG1)?？贵w類型的選擇將取決于所設計的抗體欲引發(fā)的免疫效應子功能。在構建重組免疫球蛋白時，各種免疫球蛋白同種型的恒定區(qū)的適宜氨基酸序列和用于產(chǎn)生廣泛種類抗體的方法是本領域技術人員已知的。在一個實施方案中，抗體或其他抗原結合蛋白是抗WT1/HLA-A2scFv或其具有抗原結合區(qū)的抗原結合片段，其包含氨基酸序列SEQIDNO：18并且與綴合有HLA-A0201的具有氨基酸序列RMFPNAPYL(SEQIDNO：1)的肽特異性結合。在一些實施方案中，抗WT1抗體是具有選自表1的VH和VL區(qū)或CDR的scFv-Fc融合蛋白或全長人IgG。表1在另一個實施方案中，抗體或抗原結合蛋白是抗WT1scFv或其具有抗原結合區(qū)的抗原結合片段，其包含氨基酸序列SEQIDNO：36并且與綴合有HLA-A0201的具有氨基酸序列RMFPNAPYL(SEQIDNO：1)的肽特異性結合。在其他實施方案中，抗WT-1抗體是具有選自表2的VH和VL區(qū)或CDR的scFv-Fc融合蛋白或全長人IgG。表2在另一個實施方案中，抗體或抗原結合蛋白是抗WT1scFv或其具有抗原結合區(qū)的抗原結合片段，其包含氨基酸序列SEQIDNO：54并且與綴合有HLA-A0201的具有氨基酸序列RMFPNAPYL(SEQIDNO：1)的肽特異性結合。在其他實施方案中，抗WT-1抗體是具有選自表3的VH和VL區(qū)或CDR的scFv-Fc融合蛋白或全長人IgG。表3在另一個實施方案中，抗體或抗原結合蛋白是抗WT1scFv或其具有抗原結合區(qū)的抗原結合片段，其包含氨基酸序列SEQIDNO：72并且與綴合有HLA-A0201的具有氨基酸序列RMFPNAPYL(SEQIDNO：1)的肽特異性結合。在其他實施方案中，抗WT-1抗體是具有選自表4的VH和VL區(qū)或CDR的scFv-Fc融合蛋白或全長人IgG。表4在另一個實施方案中，抗體或抗原結合蛋白是抗WT1scFv或其具有抗原結合區(qū)的抗原結合片段，其包含氨基酸序列SEQIDNO：90并且與綴合有HLA-A0201的具有氨基酸序列RMFPNAPYL(SEQIDNO：1)的肽特異性結合。在其他實施方案中，抗WT-1抗體是具有選自表5的VH和VL區(qū)或CDR的scFv-Fc融合蛋白或全長人IgG。表5在另一個實施方案中，抗體或抗原結合蛋白是抗WT1scFv或其具有抗原結合區(qū)的抗原結合片段，其包含氨基酸序列SEQIDNO：108并且與綴合有HLA-A0201的具有氨基酸序列RMFPNAPYL(SEQIDNO：1)的肽特異性結合。在其他實施方案中，抗WT-1抗體是具有選自表6的VH和VL區(qū)或CDR的scFv-Fc融合蛋白或全長人IgG。表6公開的抗體和抗原結合蛋白的其他實施方案包括包含輕鏈和重鏈的高變區(qū)和恒定區(qū)(例如表7(重鏈)、8(輕鏈)和9(恒定區(qū))中所顯示的那些抗體和抗原結合蛋白。表7表8表9本發(fā)明涉及特異性識別衍生自胞內蛋白的肽/蛋白質片段和MHCI類分子的復合體的表位的重組抗原結合蛋白、抗體和其抗原結合片段，例如，當所述復合體可能在抗原呈遞期間展示在細胞表面處。本發(fā)明抗體的重鏈和輕鏈可以是全長(例如，抗體可以包括至少一條并優(yōu)選地兩條完整重鏈，和至少一條并優(yōu)選地兩條完整輕鏈)或可以包括抗原結合部分(Fab、F(ab')2、Fv或單鏈Fv片段(“scFv”))。在其他實施方案中，抗體重鏈恒定區(qū)選自例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgD和IgE，特別地選自例如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4，更特別地IgG1(例如，人IgG1)。在另一個實施方案中，抗體輕鏈恒定區(qū)選自例如κ或λ，尤其κ。本發(fā)明的抗體和抗原結合蛋白意在包括雙特異性抗體，包括雙特異性T細胞接合抗體，即，在單條多肽鏈上包含能夠結合兩種獨立抗原的兩個抗體可變域的抗體。在雙特異性抗體的第一部分例如結合腫瘤細胞上的抗原并且雙特異性抗體的第二部分識別人免疫效應細胞表面上的抗原的情況下，該抗體能夠通過與人免疫效應細胞上的效應抗原特異性結合而召集這種效應細胞的活性。因此，在一些情況下，雙特異性抗體能夠在效應細胞例如T細胞和腫瘤細胞之間形成連接，由此增強效應子功能。在一個實施方案中，改變恒定區(qū)/構架區(qū)，例如通過氨基酸置換，以修飾抗體的特性(例如，以增加或減少以下的一項或多項：抗原結合親和力、Fc受體結合作用、抗體糖類，例如糖基化，巖藻糖基化等、半胱氨酸殘基數(shù)目、效應細胞功能、效應細胞功能、補體功能或引入綴合位點)。另外，也構思抗體與藥物、毒素、放射性同位素、細胞因子、炎性肽或細胞毒性劑綴合。在一個實施方案中，抗體是抗WT1/A2抗體并且包含表9中顯示的人IgG1恒定區(qū)和Fc結構域。在一個實施方案中，抗WT1/A2抗體包含具有表9中所述序列的人κ序列或人λ序列。表1-8中顯示本發(fā)明抗體的一些互補決定區(qū)(CDR)的氨基酸序列。本發(fā)明基于鑒定到了抗原特異性結合序列，由其可以產(chǎn)生多種抗原結合蛋白。除對抗原特異的抗體之外，所述抗原代表與蛋白質的抗原加工和呈遞至T細胞后一般由T細胞受體識別的復合體相似的蛋白質片段(肽)/HLA復合體，為制備抗體而鑒定如本文中公開的氨基酸和核酸序列也可以用來產(chǎn)生其他抗原結合分子，包括對蛋白質片段(肽)/HLA復合體具有特異性的嵌合抗原受體(CAR)。可以將這些抗原結合分子摻入細胞中，以使得這些細胞對表達抗原的細胞具有特異細胞毒性。本發(fā)明采用新方案以獲得針對任何蛋白質(包括因為在細胞表面上不表達而不可及的那些蛋白質)的治療性抗體。幾乎任何胞質內或核內蛋白質(除細胞表面蛋白之外)均是本文所述方案的潛在靶。這包括但不限于致癌蛋白、轉錄因子、酶等。為了靶向衍生自胞內或核蛋白質的腫瘤抗原，需要開發(fā)作為不同尋常方案的治療性抗體。這種方案旨在產(chǎn)生以與T細胞受體(TCR)相同的特異性識別細胞表面上表達的肽/MHC復合體的重組mAb。這類mAb與TCR共有關于靶識別的功能同源性，但是賦予更高親和力和武裝抗體表征的強力細胞毒性劑的能力。在技術上，TCR樣mAb可以通過本領域技術人員已知的常規(guī)的雜交瘤技術產(chǎn)生，以產(chǎn)生人抗體、人源化抗體或嵌合抗體。另外，對于人類中的治療性使用，全長人mAb是優(yōu)選的，因為鼠抗體引起免疫原性反應，稱作HAMA(人抗小鼠抗體)應答(24，25)，當施用至人時，造成嚴重副作用，包括過敏反應和超敏反應。這種免疫原性反應由通過人免疫系統(tǒng)將鼠抗體識別為外來物觸發(fā)，原因在于與天然人抗體略微不同的氨基酸序列?？梢允褂帽绢I域已知的人源化方法(26，27)減少鼠衍生抗體的免疫原性(28)。最近，噬菌體展示文庫的使用已經(jīng)使得針對很好定義的表位選擇龐大數(shù)目的Ab庫以得到獨特和罕見Ab成為可能(關于噬菌體展示的更多細節(jié)，參見McCafferty等人，Phageantibodies：filamentousphagedisplayingantibodyvariabledomains(噬菌體抗體：展示抗體可變域的絲狀噬菌體).Nature，348：552-554)?？焖勹b定對腫瘤抗原衍生的肽-MHC復合體分子高度特異的人Fab或單鏈Fv(scFv)片段因此已經(jīng)變得可能(19-22)。最近，已經(jīng)顯示通過對黑素瘤AgMART-126-35/A2或gp100280-288/A2特異的TCR樣Fab與截短形式的假單胞菌(Pseudomonas)內毒素融合所產(chǎn)生的免疫毒素抑制人黑素瘤體外和體內生長(23)。此外，通過使用Fab片段工程化設計全長mAb，可能直接產(chǎn)生治療性人mAb，繞過正常情況下開發(fā)治療性mAb所需要的耗時多月的工作。本發(fā)明涉及開發(fā)識別例如WT1肽/HLA-A2復合體(RMFPNAPYL(SEQIDNO：1)的TCR樣、全長人mAb用于癌癥療法。具有TCR樣特異性的重組抗體代表一種用于腫瘤免疫學和免疫療法中研究和治療性應用的新且有價值的工具。WT1是已經(jīng)在世界上作為標記物、預后因子和治療靶研究的充分建立和驗證過的腫瘤抗原。最近NCI任務組將它優(yōu)先劃歸為頂級優(yōu)先腫瘤抗原(29)。鑒定與HLA分子預示高結合的肽在一個實施方案中，本發(fā)明涉及一種用于產(chǎn)生與HLA限制型肽特異性結合的抗體的方法，當作為肽/MHC復合體的部分呈遞時，所述抗體能夠引發(fā)特異性細胞毒T細胞反應。HLAI類分子呈遞約8-12個氨基酸長度的內源衍生肽至CD8+細胞毒T淋巴細胞。待用于本發(fā)明方法中的肽通常是約6-22個氨基酸長度，并且在一些實施方案中，在約9和20個氨基酸之間并且包含衍生自目的蛋白(例如，人WT1蛋白(GenBank登錄號P19544)或其類似物)的氨基酸序列。可以使用本領域技術人員已知的計算機預測模型，基于HLA-A0201結合基序以及蛋白酶體和免疫蛋白酶體切割位點的存在確定適用于根據(jù)本發(fā)明方法產(chǎn)生抗體的肽。為預測MHCI類結合位點，這類模型包括但不限于ProPred1(在Singh和Raghava，ProPred：predictionofHLA-DRbindingsites(ProPred：HLA-DR結合位點的預測).BIOINFORMATICS17(12):1236-12372001)和SYFPEITHI(見Schuler等人，SYFPEITHI，DatabaseforSearchingandT-CellEpitopePrediction(用于檢索和T細胞表位預測的數(shù)據(jù)庫SYFPEITHI)，引自ImmunoinformaticsMethodsinMolecularBiology，vol409(1)：75-932007)。HLA-A*0201在39-46％的全部高加索人中表達并且因此代表用于本發(fā)明方法中的MHC抗原的適合選項。為制備WT1肽抗原的一個實施方案，使用SYFPEITHI數(shù)據(jù)庫的預測性算法鑒定針對HLA-A0201分子的推定性CD84+表位的氨基酸序列和預測結合作用(見Schuler等人，SYFPEITHI，DatabaseforSearchingandT-CellEpitopePrediction(用于檢索和T細胞表位預測的數(shù)據(jù)庫SYFPEITHI)，引自ImmunoinformaticsMethodsinMolecularBiology，vol409(1)：75-932007)。一旦已經(jīng)鑒定到適宜的肽，可以根據(jù)本領域技術人員熟知的方案進行肽合成。因為它們的尺寸相對小，所以本發(fā)明的肽可以根據(jù)常規(guī)的肽合成技術在溶液中或在固相支持物上直接合成。多種自動的合成儀是可商業(yè)獲得的并且可以根據(jù)已知的方案使用。溶液相中的肽合成已經(jīng)成為充分建立的用于大規(guī)模生產(chǎn)合成肽的方法并且同樣是制備本發(fā)明肽的合適備選方法(見例如JohnMorrowStewart和Martin等人的SolidPhasePeptideSynthesis，ApplicationofAlmez-mediatedAmidationReactionstoSolutionPhasePeptideSynthesis，TetrahedronLettersVol.39，第1517-1520頁，1998)。用于本文所述的方案中的每種肽均購自GenemedSynthesis，Inc.(SanAntonio，TX)并由該公司使用芴基甲氧羰基化學和固相合成法合成和通過高壓液相色譜純化。通過高效液相色譜分析評估肽的質量，并且使用基質輔助激光解吸附質譜法觀察預期的分子量。肽是無菌的并且純度70％至90％。將肽溶解于DMSO中并于PBS(pH7.4)或鹽水中稀釋為5mg/ml和貯存在-80℃。肽選擇后，使用抗原加工缺陷型T2細胞系測試所選擇肽的結合活性，其中當HLA-A被抗原呈遞溝的肽穩(wěn)定時，所述細胞系增加HLA-A的表達。簡而言之，用肽脈沖T2細胞足以誘導HLA-A表達的時間。隨后通過用熒光標記的對HLA-A特異的單克隆抗體(例如，BB7.2)免疫染色和流式細胞術測量T2細胞的HLA-A表達。使用式FI＝(MFI[具有肽的T2細胞])/MFI[不具有肽的T2細胞]-1，將熒光指數(shù)(FI)計算為如通過熒光激活細胞分選分析所測定的HLA-A0201在T2細胞上的平均熒光強度(MFI)。使用本文中公開的方法，產(chǎn)生了針對維爾姆斯瘤癌基因蛋白(WT1)的全長人T細胞受體(TCR)樣抗體。通過噬菌體展示技術產(chǎn)生的TCR樣抗WT1抗體是對與誘導HLA限制型細胞毒CD8T細胞的復合體相似的WT1肽/HLA復合體特異的。使用SYFPEITHI算法篩選WT1蛋白序列并且鑒定到預測與高加索人群中高度表達的多種HLA分子以高親和力結合的WT1肽(例如，命名為428、328和122的肽)。肽428涵蓋WT1氨基酸428-459，肽328涵蓋WT1氨基酸328-349，并且肽122涵蓋WT1氨基酸122-140(參見圖1)。也可以通過保守性氨基酸置換MHC結合殘基設計不規(guī)則(heteroclitic)肽，其中期望保守性氨基酸置換增強針對MHCI類等位基因的親和力，如通過預測算法預測的那樣。WT1肽122在其內部包含一個已知的CD8+表位(126-134)。在一個實施方案中，因此，可以使用下述肽的修飾肽，所述肽涵蓋WT1氨基酸殘基126-134并在多個位置含有修飾的氨基酸。用于丙氨酸誘變WT1A的肽(另外命名為RFM)基于產(chǎn)生置換的位置命名。表10中顯示可以使用的WT1肽的例子以及無關肽RHAMM-R3和EW。表10一旦已經(jīng)鑒定合適的肽，通過使肽和組織相容性抗原在溶液中一起形成復合體，制備待用于噬菌體展示文庫篩選的靶抗原，即，肽/HLA復合體(例如，WT1肽/HLA-A0201)。選擇針對WT1肽的高親和力scFv下一個步驟是將以高親和力與目的靶抗原結合的噬菌體與人噬菌體展示文庫中不結合或以較低親和力結合的噬菌體分選開。這通過噬菌體與結合于固相支持物(例如，珠或哺乳動物細胞)的抗原反復結合，隨后移除未結合的噬菌體和洗脫特異性結合的噬菌體來實現(xiàn)。在一個實施方案中，將抗原首先生物素酰化用于固定至例如鏈霉親和素綴合的DynabeadsM-280。將噬菌體文庫與細胞、珠或其他固相支持物溫育并且通過洗滌移除未結合的噬菌體。選擇和測試結合的克隆。一旦選出，則通過間接流式細胞術對陽性scFv克隆測試它們與活T2細胞表面上的HLA-A2/肽復合體的結合。簡而言之，噬菌體克隆與已經(jīng)用Wt1-A肽或無關肽(對照)脈沖的T2細胞溫育。將細胞洗滌并隨后與小鼠抗M13外殼蛋白mAb溫育。將細胞再次洗滌并且用FITC-山羊(Fab)2抗小鼠Ig標記，之后進行流式細胞術。在其他實施方案中，抗WT1/A抗體可以包含設計成改善蛋白質穩(wěn)定性、抗體結合、表達水平或引入治療劑綴合位點的一個或多個構架區(qū)氨基酸置換。這些scFv隨后用來根據(jù)本領域技術人員已知的方法產(chǎn)生重組人單克隆Ig。也包括用于減少白血病細胞增殖的方法，所述方法包括使白血病細胞與本發(fā)明的WT1抗體接觸。在一個相關方面，本發(fā)明的抗體可以用于白血病的預防或治療。治療性抗體的施用是本領域已知的。具有抗癌劑的抗體綴合物單克隆抗體代表定向遞送生物活性物質至癌癥部位的優(yōu)選運載體，所述定向遞送包括基于抗體遞送細胞毒物質、放射性核素或免疫調節(jié)細胞因子。本發(fā)明涵蓋本發(fā)明抗體與治療劑的綴合物，所述治療劑包括但不限于藥物(如卡里奇霉素(calecheamicin)、aureastatin、多柔比星)或毒素(如蓖麻毒蛋白、白喉毒素、多花白樹毒蛋白)或發(fā)射α或β粒子的放射性同位素(如90Y、131I、225Ac、213Bi、223Ra和227Th)、炎性肽(如IL2、TNF、IFN-γ)。藥物組合物和治療方法可以將本發(fā)明的WT1抗體以足以防止、抑制或減少腫瘤或病理學疾病的進展的量施用至患有腫瘤或WT1相關病理學疾病的患者用于治療性治療。進展包括例如腫瘤或病理學疾病的生長、侵襲、轉移和/或復發(fā)。有效用于這個用途的量將取決于疾病的嚴重性和患者自身免疫系統(tǒng)的總體狀態(tài)。給藥方案將也隨疾病狀態(tài)和患者狀態(tài)變動并且一般將范圍從單次快速濃注(bolus)劑量或連續(xù)輸注至每天多次施用(例如，每4-6個小時)，或如治療醫(yī)師和患者狀況所指示。可由本發(fā)明WT1抗體治療的醫(yī)學疾病的鑒定完全處于本領域技術人員的能力和知識范圍內。例如，正患有臨床明顯的白血病或存在形成臨床明顯癥狀的風險的人類個體適合施用本發(fā)明的WT1抗體。本領域熟練的臨床醫(yī)生可以例如通過利用臨床試驗、體格檢查和就醫(yī)/家族史，輕易地確定某個體是否為這種治療的候選者。以WT1表達為特征的病理學疾病的非限制性例子包括慢性髓細胞白血病、急性淋巴母細胞白血病(ALL)、急性髓樣/骨髓性白血病(AML)和骨髓增生異常綜合征(MDS)。額外地，實體瘤，總體上并且尤其地是與間皮瘤、卵巢癌、胃腸道癌、乳腺癌、前列腺癌和成膠質細胞瘤相關的腫瘤，是使用WT1抗體可治療的。因此，在另一個實施方案中，本發(fā)明提供通過施用與一種或多種其他藥劑組合的本發(fā)明WT1抗體治療醫(yī)學疾病的方法。例如，本發(fā)明的實施方案提供通過施用本發(fā)明WT1抗體連同抗腫瘤劑或抗血管生成劑來治療醫(yī)學疾病的方法。WT1抗體可以與一種或多種抗腫瘤劑或抗血管生成劑化學地或生物合成地連接。可以用任何適合的方法或途徑施用本發(fā)明的WT1抗體，并且任選地，用來共施用抗腫瘤劑和/或其他受體的拮抗劑。施用途徑包括例如經(jīng)口、靜脈內、腹內、皮下或肌內施用。然而，應當強調本發(fā)明不限于任何特定方法或施用途徑。應指出本發(fā)明的WT1抗體可以作為綴合物施用，所述綴合物與受體特異性結合并在配體-毒素內化后遞送有毒的、致死性有效載荷(payload)?？梢岳斫獗景l(fā)明的WT1抗體將以額外包含可藥用載體的組合物形式施用。適合的可藥用載體包括包括例如水、鹽水、磷酸鹽緩沖鹽水、右旋糖、甘油、乙醇等中的一種或多種以及其組合。可藥用載體可以還包含增強結合蛋白的貨架期或有效性的少量輔助物質，如潤濕劑或乳化劑、防腐劑或緩沖劑。如本領域熟知，可以配制注射組合物，從而在施用至哺乳動物后提供有效成分的快速、持續(xù)或延遲釋放。本發(fā)明的其他方面包括但不限于抗體和編碼它們的核酸用于治療WT1相關疾病、用于診斷和預后應用以及用作檢測細胞和組織中WT1的研究工具的用途。本發(fā)明涵蓋包含所公開的抗體和核酸的藥物組合物。本發(fā)明也構思了通過采用載體的免疫療法，包含本發(fā)明核酸的載體用于基于抗體的治療。載體包括使抗體表達和分泌成為可能的表達載體以及涉及抗原結合蛋白(如嵌合抗原受體)的細胞表面表達的載體。本公開也涵蓋包含所述核酸的細胞，例如已經(jīng)用本發(fā)明載體轉染的細胞。為了診斷和研究應用，也提供了試劑盒，其含有本發(fā)明的WT1抗體或核酸、測試試劑、緩沖劑等。本發(fā)明的方法現(xiàn)在將在下文就代表性實施方案更詳細地描述。材料細胞樣品、細胞系和抗體：在知情同意MemorialSloan-Kettering癌癥中心機制審查委員會批準的操作方案后，通過Ficoll密度離心從HLA分型的健康供體和患者獲得外周血單個核細胞(PBMC)。先前描述過獲得人間皮瘤細胞系的來源(29)。細胞系包括：H-Meso1A、JMN、VAMT、H2452、H2373、H28、MSTO、Meso11、Meso34、Meso37、Meso47和Meso56。全部細胞均由位于MemorialSloan-Kettering癌癥中心的細胞免疫學系進行HLA分型。白血病細胞系LAMA81、BV173、和697(WT1+，A0201+)由H.J.Stauss博士(倫敦大學，倫敦，英國)饋贈。黑素瘤細胞系Mewo(WT1-，A201+)，SKLY16(B細胞淋巴瘤；WT1-，A0201+)；K562、RwLeu4和HL60、全部WT1+白血病以及TAP缺陷型T2細胞系從美國典型培養(yǎng)物保藏中心獲得。細胞系在補充有5％FCS、青霉素、鏈霉素、2mmol/L谷氨酰胺、和2-巰基乙醇的RPMI1640中于37℃/5％CO2培養(yǎng)。購買了針對人或小鼠CD3、CD19、CD56、CD33、CD34的與FITC或APC綴合的針對人HLA-A2的單克隆Ab(克隆BB7.2)及其同種型對照小鼠IgG2b/FITC或APC(BDBiosciences，SanDiego)、綴合了PE或FITC的山羊F(ab)2抗人IgG和與熒光素綴合的山羊F(ab)2抗小鼠Ig(InVitrogen，City)。從MSKCC單克隆抗體CoreFacility獲得針對HLAI類的小鼠mAb(W6/32)。肽：全部肽均購自GenemedSynthesis，Inc.(SanAntonio，TX)并由其合成。肽純度是>90％。(表1)將肽溶解于DMSO中并于鹽水中稀釋為5mg/ml并冷凍在-180℃。生物素酰化的單鏈WT1肽/HLA-A0201和RHAMM-3/HLA-A0201復合體通過在MSKCC的Tetramer機構，將所述肽與重組HLA-A2和β2-微球蛋白(β2M)一起再折疊來合成。動物：8至10周齡NOD.Cg-PrkdcscidIL2rgtm1Wjl/SzJ小鼠(稱作NODscidγ(NSG))購自Jackson實驗室(BarHarbor，ME)或從MSKCC動物繁育機構獲得。方法流式細胞術分析：對于細胞表面染色，將細胞與適宜的mAb在冰上溫育30分鐘，洗滌，并且當需要時，與第二抗體試劑溫育。流式細胞術數(shù)據(jù)在FACSCalibur(BectonDickinson)上采集并且用FlowJoV8.7.1和9.4.8軟件分析。選擇和表征對WT1肽/HLA-A0201復合體特異的scFv：將人scFv抗體噬菌體展示文庫用于選擇mAb克隆。為了減少因固定至塑料表面所引入的MHC1復合體的構象變化，使用溶液淘選方法替代常規(guī)平板淘選法。簡言之，將生物素?；目乖紫扰c人scFv噬菌體文庫混合，隨后抗原-scFv抗體復合體通過磁性分離架鏈霉被親和素綴合的DynabeadsM-280拉下。隨后將結合的克隆洗脫并用來感染大腸桿菌XL1-Blue。純化細菌中表達的scFv噬菌體克隆(35，36)。將淘選進行3-4個循環(huán)以富集與HLA-A0201/WT1復合體特異性結合的scFv噬菌體克隆。通過針對生物素酰化的單鏈HLA-A0201/WT1肽復合體的標準ELISA方法確定陽性克隆。進一步使用TAP缺陷型HLA-A0201+細胞系T2，通過流式細胞術對陽性克隆測試它們與活細胞表面上的HLA-A2/肽復合體的結合。T2細胞在無血清RPMI1640培養(yǎng)基中在20μg/mlβ2MON存在下用肽(50μg/ml)脈沖。將細胞洗滌，并且在后續(xù)步驟中進行染色。細胞首先用純化的scFv噬菌體克隆染色，并且隨后用小鼠抗M13mAb染色，并最后用與FITC綴合的山羊F(ab)2抗小鼠Ig染色。每個染色步驟在冰上進行30-60分鐘并且在每個染色步驟之間洗滌細胞2次。使用選擇的scFv片段工程化全長mAb：如所述那樣，在HEK293和中國倉鼠卵巢(CHO)細胞系中產(chǎn)生選擇的噬菌體克隆的全長人IgG1(37)。簡言之，將抗體可變區(qū)亞克隆至哺乳動物表達載體中，所述表達載體具有匹配的人λ或κ輕鏈恒定區(qū)和人IgG1恒定區(qū)序列。通過電泳在還原和非還原條件下測量純化的全長IgG抗體的分子量。工程化嵌合抗原受體和免疫效應細胞：編碼本文鑒定的抗體和抗原結合蛋白的核酸可以用來工程化重組免疫效應細胞。例如產(chǎn)生基因修飾的T細胞的方法和載體是本領域已知的(見Brentjens等人，SafetyandpersistenceofadoptivelytransferredautologousCD19-targetedTcellsinpatientswithrelapsedorchemotherapyrefractoryB-cellleukemias(過繼轉移的靶向自體CD19的T細胞在復發(fā)性或化療難治性B細胞白血病患者中的安全性和持續(xù)性)，引自Blood118(18):4817-4828，2011年11月)。針對WT1p/A2復合體的全長人IgG1的表征：起初，通過將采用或不采用RMF或RHAMM-R3對照肽脈沖的T2細胞染色，隨后用與PE或FITC綴合的第二山羊F(ab)2抗人IgGmAb染色，確定針對WT1肽/A2復合體的全長人IgG1mAb的特異性。通過流式細胞術測量熒光強度。相同方法用來測定mAb與新鮮腫瘤細胞和細胞系的結合。放射免疫測定法：使用氯胺-T方法，將WT1ab1用125-I標記(PerkinElmer)(38)。100μg抗體與1mCi125-I和20μg氯胺-T反應，用200μg偏亞硫酸氫鈉猝滅，隨后使用10DG柱(公司)與游離125-I分離，所述10DG柱用PBS中的2％牛血清白蛋白平衡。產(chǎn)物的比活性處于7-8mCi/mg范圍內。如所述那樣從正常供體和AML患者獲得造血細胞系、貼壁細胞系(用非酶促細胞剝離器(名稱)收獲)、PBMC。將細胞用PBS洗滌1次并且以107個細胞/ml在0℃重懸在2％人血清的PBS中。將細胞(106個細胞/管，一式兩份)與25-I-標記的WT1AB1(1μg/mL)在冰上溫育45分鐘，隨后在0℃用含1％牛血清白蛋白的PBS充分洗滌。為確定特異性結合，將重復組的細胞在50倍過量的未標記WT1AB1存在下于冰上預溫育20分鐘后測定。通過γ計數(shù)器測量結合的放射性活度，測定特異性結合，并且從比活性計算結合抗體數(shù)目/細胞。抗體依賴的細胞毒性(ADCC)：用于ADCC的靶細胞是采用或不采用WT1或RHAAM-3肽脈沖的T2細胞和不采用肽脈沖的腫瘤細胞系。處于各種濃度的WT1ab1或其同種型對照人IgG1與靶細胞和新鮮的PBMC以不同的效應子:靶(E:T)比率溫育16小時。收獲上清液并且使用來自Promega的Cytotox96非放射活性試劑盒，遵照其說明書，通過LDH釋放測定法測量細胞毒性。還通過標準的4小時51Cr-釋放測定法測量細胞毒性。螢光素酶/GFP陽性細胞的轉導和選擇：使用含有編碼luc/GFP的質粒的慢病毒載體，將BV173細胞和JMN細胞經(jīng)工程化以表達高水平GFP-螢光素酶融合蛋白(39)。使用單細胞克隆法，通過流式細胞術分析選擇僅顯示高水平GFP表達的細胞并且將這些細胞維持并用于動物研究。WT1ab1在人白血病異種移植NSG模型中的治療性試驗：將兩百萬個BV173人白血病細胞靜脈內注射至NSG小鼠中。在第5日，通過在待治療的全部小鼠中的螢火蟲螢光素酶成像證實腫瘤移入作用；隨后將小鼠隨機分入不同的治療組。在第6日和第10日，靜脈內注射mAbWT1ab1或同種型對照mAb。在mAb存在或不存在的情況下還接受人效應細胞的動物中，將細胞(CD34和CD3耗盡的健康供體人PBMC)在mAb注射之前4小時靜脈內注射至小鼠(107個細胞/小鼠)中。通過一周發(fā)光成像1至2次評估腫瘤生長，并且每日評估臨床活動。選擇和表征對WT1肽/HLA-A0201復合體特異的scFv：使用包含WT1的氨基酸126-134(RMFPNAPYL(SEQIDNO：1)的9聚物WT1衍生肽實現(xiàn)WT1特異性scFv的選擇。已經(jīng)顯示這種肽由HLA-A0201加工并呈遞以誘導能夠殺傷WT1陽性腫瘤細胞的細胞毒CD8+T細胞。圖2中顯示來自用WT1RMF肽接種6次后的AML患者的代表性數(shù)據(jù)作為WT1肽在人類中有免疫原性的證據(jù)。以WT1-A肽(氨基酸126-134)刺激CD3T細胞并使用標準51Cr釋放測定法針對697(A0201+WT1+)或SKLY-16(A0201+WT1-)細胞系測量細胞毒性。使用以WT1-A或無關肽EW脈沖的SKLY-16細胞作為殺傷作用特異性的陽性對照和陰性對照。效應子：靶(E:T)比率在X-軸上顯示。數(shù)據(jù)表明，T細胞以HLA-A0201限制型方式殺傷WT1+腫瘤細胞。將本領域技術人員已知的充分建立的噬菌體展示文庫和篩選方法用來選擇對WT1-A肽/HLA-A2復合體高度特異的scFv片段。在一個實施方案中，將人scFv抗體噬菌體展示文庫(7x1010個克隆)用于選擇mAb克隆。為了減少因固定至塑料表面所引入的MHC1復合體的構象變化，使用溶液淘選方法替代常規(guī)平板淘選法。簡言之，將生物素?；目乖紫扰c人scFv噬菌體文庫混合，隨后抗原-scFv噬菌體抗體復合體通過磁性分離架被鏈霉親和素綴合DynabeadsM-280拉下。隨后將結合的克隆洗脫并用來感染大腸桿菌XL1-Blue。純化細菌中表達的scFv噬菌體克隆(35，36)。將淘選進行3-4個循環(huán)以富集與HLA-A0201/WT1復合體特異性結合的scFv噬菌體克隆。通過針對生物素?；膯捂淗LA-A0201/WT1肽復合體的標準ELISA方法確定陽性克隆(圖3)。進一步使用TAP缺陷型HLA-A0201+細胞系T2，通過流式細胞術對陽性克隆測試它們與活細胞表面上的HLA-A2/肽復合體的結合。T2細胞在無血清RPMI1640培養(yǎng)基中在20μg/mlβ2M存在下用肽(50μg/ml)脈沖過夜。將細胞洗滌，并且如下進行染色。細胞首先用純化的scFv噬菌體克隆染色，隨后用小鼠抗M13mAb染色，并且最后用與FITC綴合的山羊F(ab)2抗小鼠Ig染色。每個染色步驟在冰上進行30-60分鐘。在每個染色步驟之間洗滌細胞2次。在圖4中顯示結果。顯示W(wǎng)T1ab1的噬菌體克隆與僅用WT1-A肽(RMFPNAPYL：下文縮寫為RMF)脈沖的T2細胞結合，但是不與單獨的T2細胞、用對照EW肽或不規(guī)則肽WT1-A脈沖的T2細胞結合。通過以所示濃度滴定WT1ab1測試全長IgG1WT1ab1與肽/A0201復合體的結合親和力。將T2細胞用50μg/ml或10μg/ml脈沖，隨后用第二山羊F(ab)抗人IgG/PE脈沖。在圖5中顯示結果。圖6顯示由WT1ab識別的肽/HLA-A0201復合體的密度。將T2細胞用RMF(上部小圖)或RHAMM-R3(下部小圖)肽以所示濃度脈沖過夜(ON)，并且通過流式細胞術分析1μg/ml濃度的WT1ab1、WT1ab3和WT1ab5的結合。表11：噬菌體淘選WTI/A2的總結通過間接流式細胞術在以下細胞上測試陽性scFv克隆與活細胞表面上HLA-A2/肽復合體的結合：(i)用WT1肽或無關肽脈沖的TAP缺陷型HLA-A0201+T2細胞；(ii)WT1+HLA-A0201+細胞系如BV173、U266和對照WTI-HLA-A0201+細胞系SKLY16，或WT1+HLA-A0201-細胞系、K562，不采用肽脈沖。后者測定scFv對腫瘤細胞上天然地加工的WT1p/A2復合體的識別和結合親和力。總計對28個噬菌體克隆篩選它們產(chǎn)生對WTI-A肽/A2復合體特異的mAb的能力。通過噬菌體scFv與用WTI-A肽和其他HLA-A2結合肽(50μg/ml)脈沖的T2細胞的結合測量對活細胞上WT1p/A2復合體的識別。這些包括：單獨的T2細胞；用WTI-A肽脈沖的T2細胞；用不規(guī)則肽WT1-A1脈沖的T2細胞；用無關EW肽(結合HLA-A0201的9聚物肽，源自Ewing肉瘤)或RHAMM-R3脈沖的T2細胞(圖4)。表12：使用選擇的scFv片段工程化全長mAb噬菌體展示技術允許快速選擇和產(chǎn)生抗原特異性scFv和Fab片段，所述抗原特異性scFv和Fab片段本身有用或可以經(jīng)進一步開發(fā)以提供完整抗體、抗原結合蛋白或其抗原結合片段。具有Fc結構域的完整mAb具有勝出scFv和Fab抗體的眾多優(yōu)點。首先，僅全長Ab產(chǎn)生借助Fc結構域介導的免疫功能，如CDC和ADCC。其次，雙價mAb比單體FabAb提供更強的抗原結合親和力。第三，F(xiàn)ab和雙價mAb血漿半壽期和腎清除率是不同的。各自的具體特征和優(yōu)點可以匹配于計劃的效應子策略。第四，雙價mAb可以按照不同于scFv和Fab的速率內化，從而改變免疫功能或載體功能。例如，α發(fā)射體不需要內化以殺傷靶，但是許多藥物和毒素將得益于免疫復合體的內化。因此，在一個實施方案中，一旦從噬菌體展示文庫獲得對WT1p/A2特異的scFv克隆，則使用scFv片段產(chǎn)生全長IgGmAb。為了在中國倉鼠卵巢(CHO)細胞中產(chǎn)生重組人單克隆IgG，基于本領域技術人員已知的方法將全長IgGmAb工程化(Tomomatsu等人，ProductionofhumanmonoclonalantibodiesagainstFceRIabyamethodcombininginvitroimmunizationwithphagedisplay(通過組合體外免疫與噬菌體展示的方法產(chǎn)生針對FceRIa的人單克隆抗體).BiosciBiotechnolBiochem73(7)：1465-14692009)。簡言之，將抗體可變區(qū)亞克隆至哺乳動物表達載體中，所述表達載體具有匹配的λ或κ輕鏈恒定區(qū)序列和IgG1亞類Fc(例如見表9)(33，34)。純化的全長IgG抗體在還原和非還原條件下顯示預期的分子量(圖8)。動力學結合分析(35)證實全長IgG與WT1/A2以納摩爾范圍的KD特異性結合(圖9和10)。實施例1使用全長人噬菌體展示文庫選擇對WT1p/A2復合體特異的scFv。將針對HLA-A0201/WT1肽復合體的噬菌體展示進行3-4輪淘選以富集與HLA-A0201/WT1肽復合體特異性結合的scFv噬菌體克隆。通過ELISA確定針對WT1肽/A2復合體陽性的各個scFv噬菌體克隆并且對擁有獨特DNA編碼序列的克隆進行進一步表征。為了測試scFv是否與活細胞上的WT1p/A2復合體結合，對陽性噬菌體克隆測試與TAP缺陷型HLA-A0201陽性細胞系T2的結合。T2細胞僅可以呈遞外源肽并且因此已經(jīng)廣泛用于檢測HLA-A2分子呈遞的特定表位。在T2細胞上篩選總計35個噬菌體并且15個克隆顯示與僅用WT1RMF肽脈沖的T2細胞特異性結合，但是不與單獨的T2細胞或用對照RHAMM-3肽脈沖的T2細胞結合(圖4)。scFv噬菌體克隆不能與WT1-和HLA-A2陽性的幾個腫瘤細胞系結合，顯示與全長雙價mAb相比，scFv的親和力弱。實施例2全長人IgG1的產(chǎn)生。免疫功能如CDC和ADCC依賴于雙價IgG的Fc結構域。此外，雙價mAb比單體scFvAb提供更強的抗原結合親合力。因此，選擇15陽性噬菌體克隆中的6個scFv噬菌體克隆以在HEK293和中國倉鼠卵巢(CHO)細胞中產(chǎn)生全長人單克隆IgG1。簡言之，將mAb的可變區(qū)亞克隆至哺乳動物表達載體中，所述表達載體具有連同匹配的人λ或κ輕鏈恒定區(qū)和人IgG1恒定區(qū)序列。純化的全長IgG抗體在還原和非還原條件下顯示預期的分子量(圖8)。5個克隆成功地工程化為人IgG1。實施例3IgG1mAb的特異性和結合親合力與人細胞系結合用或不用RMF或RHAMM-3肽脈沖的T2細胞起初用來確定mAb的結合特異性。5種人IgG1(包括WT1ab1)中有三種顯示與僅用WT1肽脈沖的T2細胞特異性結合，但是不與單獨的T2結合或用對照肽RHAMM-R3脈沖的T2結合。所述mAb的結合親合力與其親本scFv噬菌體克隆相比大幅度增強(50至100倍)。5種mAb中的兩種mAb顯示與單獨的或用對照肽RHAMM-R3脈沖的T2細胞結合，不過這種結合作用通過采用RMF肽脈沖細胞而大大增強。這表明，這兩種mAb也對僅HLA-A2分子上的表位具有高親合力并且因此從進一步的研究中排除。這并不出乎意料，因為鑒于MHCI類分子表位在復合體內部占據(jù)優(yōu)勢，這已經(jīng)是針對肽/MHC復合體產(chǎn)生這種mAb的常見問題。這還表明，mAb對復合體的精確特異性可能在scFv階段不容易確定，原因在于與雙價IgG1mAb相比親和力較低。首先在用或不用RMF和對照RHAMM-R3肽(50μg/mL)脈沖的T2細胞上通過滴定mAb研究對WT1p/A2復合體特異的剩余三種mAb的結合親和力。MabWT1ab1顯示最強的結合作用，低至濃度0.01μg/ml。同種型對照人IgG1在測試的任何濃度均不顯示結合(圖5)。除WT1ab1之外，其他兩種mAb即WT1ab3和WT1ab5在<1μg/mL所用mAb濃度的范圍顯示特異性結合。mAb的特異性識別也取決于細胞表面上的抗原性密度。T2細胞用RMF或R3肽以50、25、12.5、6.25、3.13和1.6μg/mL脈沖；并且對于T2結合測定法，受試mAb以1μg/ml使用。WT1ab1可以在低至1.6μg/mL的濃度以濃度依賴性方式檢測到T2細胞上的RMF肽/A2復合體，熒光強度顯著高于其他2種mAb(圖6)。這些結果進一步證實WT1ab1針對RMFp/A0201復合體擁有最高親合力。實施例4表位定位為了以更高精度研究WT1ab1識別的表位，將RMF肽在位置1、3、4、5、6、7和8用丙氨酸置換并且對T2細胞脈沖和測試WT1ab1的結合。完整留下RMF的位置2和9，因為這些位置是肽與HLA-A0201分子結合的錨殘基。與天然RMF肽相比，除了位置1之外，在其他位置處的丙氨酸置換均不明顯影響WT1ab1的結合(圖19)。然而，丙氨酸(WT1-A1-B)或酪氨酸(WT1-A1)置換位置1徹底地取消WT1ab1的結合。結合作用的喪失不歸因于針對HLA-A2分子的肽結合親和力降低，因為在使用HLA-A2分子特異的mAb克隆BB7的T2穩(wěn)定測定法中，兩種肽均顯示最強烈結合(圖20)。這些結果顯示在RMF肽的位置1處的精氨酸是對WT1ab1識別作用最重要的一種殘基。不能評估在位置#2和9處殘基的作用。下一個重要問題在于WT1ab1是否能夠識別由HLA-A0201分子在細胞表面上呈遞的天然加工的WT1表位RMF?；赪T1mRNA的表達和HLA基因分型選擇一組細胞系(表12)。表12：根據(jù)先前研究(Rena)，通過定量RT-PCR估計WT1mRNA表達水平。在對HLA-A0201和WT1mRNA均為陽性的7種人間皮瘤細胞系中，WT1ab1與7種細胞系中的6種結合，但是不與HLA-A0201陰性(MSTO和VAMT)或WT1mRNA陰性的細胞(如黑素瘤細胞系Mewo)結合(圖21)。類似地，在測試的9種白血病細胞系當中，WT1ab1與WT1mRNA和HLA-A0201均陽性的3種細胞系BV173(圖22)、BA25和ALL-3結合，但是不與已經(jīng)在眾多研究中展示表達高水平WT1轉錄物的HLA-A2陰性細胞系HL60和K562結合。如預期的那樣，WT1AB1結合的強度似乎也與HLA-A0201分子的表達水平直接相關，如間皮瘤細胞H2373、白血病細胞系697和LAMA、以及骨髓瘤細胞系U266中所顯示。雖然這些細胞系是WT1轉錄物陽性和HLA-A2陽性，但是HLA-A2的表達水平低(表12)并且mAb不顯示結合作用。在另一方面，采用T2細胞獲得的結果反對WT1ab1與單獨HLA-A0201結合的可能性，因為T2細胞表達高水平的HLA-A2分子。值得注意地，WT1ab1的確不與單獨的T2細胞或用R3和其他結合HLA-A0201的肽(如Ewing肉瘤(EW)衍生肽或RMF肽的不規(guī)則肽WT1-A1)脈沖的T2細胞結合；已經(jīng)顯示這兩種肽在T2穩(wěn)定測定法中對HLA-A0201分子具有較高親和力(28)。這些結果提供有力證據(jù)：WT1ab1識別作用是對復合體中包含RMF肽和A0201分子聯(lián)合的表位特異的。其他兩種mAb即WT1ab3和WT1ab5與BV173和JMN細胞的結合作用也弱于WT1ab1。實施例5對細胞上WT1ab1結合位點的定量使用125I-標記的WT1ab1的放射免疫測定法用來證實針對WT1+HLA-A0201+細胞系的抗體的特異性，用來確定親和力常數(shù)并且用來評估一組細胞系上每個細胞的抗體結合位點數(shù)目?；谂cJMN細胞結合的斯卡查德分析顯示約0.2nM的親合力常數(shù)(圖23)。使用ForteBio裝置，通過干涉測定法(interferometry)證實這個數(shù)值。125I-標記的WT1ab1用來證實針對WT1+HLA-A0201+細胞系的抗體的特異性，并且用來評估一組細胞系上的抗體結合位點數(shù)目(圖24)。因為我們不能確定雙價mAb是否與表面上的1或2種復合體結合，所以每細胞的總表位數(shù)可以高達mAb結合位點數(shù)目的2倍。再次，WT1ab1與HLA-A0201和WT1mRNA均為陽性的JMN、ALL-3、BA25、BV173結合，但是不與HLA-A0201陰性(HL60)或WT1mRNA陰性(SKLY-16)細胞結合。WT1ab1不與HLA-A0201和WT1陽性，但是含有低水平HLA-A0201的697細胞結合(表12)，這證實需要某個水平的總MHC復合體呈遞足夠的WT1肽用于WT1ab1結合。用RMF脈沖的T2結合最高數(shù)目的mAb(50,000個/細胞)，隨后是JMN細胞，其結合每個細胞約6x103個WT1ab1分子，轉換成6x103個和1.2x104個之間的RMF肽/A2復合體/細胞，分別推定為是一價或雙價抗體結合。三種陽性白血病細胞系結合1x103個和2x103個之間的WT1ab1分子或2x103個－4x103個結合位點(圖24)。這些結果由定量流式細胞術證實。實施例6與白血病患者樣品結合的WT1ab1我們接下來研究WT1ab1是否能夠檢測原代AML細胞上的RMF表位。放射免疫測定法顯示W(wǎng)T1AB1與HLA-A2陽性和WT1mRNA+的患者1的AML母細胞明顯結合。WT1ab1與占據(jù)整個細胞群體多于83％的CD33+和CD34+雙陽性細胞結合(圖25)。WT1ab1不與呈現(xiàn)HLA-A2陽性但是mRNA陰性的或者呈現(xiàn)HLA-A2陰性的3位其他患者的細胞結合。WT1ab1不與來自HLA-A2陽性或陰性健康供體的PBMC結合。結果由流式細胞術分析證實。WT1AB1不與來自A0201陰性患者的母細胞顯著結合(圖26)。結果與存在細胞mRNA表達時獲得的結果一致。這些數(shù)據(jù)證實，RMFp/HLA-A0201在白血病細胞表面上的水平足以允許與WT1ab1的反應性并且在WT1陰性健康細胞上的水平是不顯著的。實施例7WT1AB1介導針對腫瘤細胞的ADCC認為ADCC是人類治療性mAb的主要效應子機制之一。在人PBMC存在的情況下，WT1ab1介導針對荷有RMF肽的T2細胞的劑量依賴性PBMCADCC，但是不介導針對單獨T2細胞或用對照R3肽脈沖的T2細胞的劑量依賴性PBMCADCC(圖27)。重要地，WT1ab1能夠介導針對腫瘤細胞(如間皮瘤細胞系JMN(圖33)和白血病細胞系BV173(圖34))上由HLA-A0201分子天然呈遞的RMF表位的ADCC，但是不介導HLA-A2陰性細胞MSTO(圖28)或HL-60(圖29)上的ADCC。使用來自多位健康供體的PBMC作為效應細胞，在1μg/ml或以下的WT1ab1上一致地觀察到殺傷作用。重要地，WT1ab1也殺傷對WT1ab1結合為陽性的原代A0201陽性AML母細胞，但是不殺傷呈現(xiàn)HLA-A0201陰性的母細胞(圖30)。這些結果顯示，WT1ab1介導針對以生理水平天然表達RMF和HLA-A0201復合體的細胞以及細胞系的特異性ADCC。實施例8WT1AB1消除NSG小鼠中的人白血病細胞在事先靜脈內異種移植BV173bcr/abl陽性急性淋巴母細胞性白血病6日的NODSCIDγ(NSG)小鼠中測試WT1ab1體內功效。在治療時，小鼠在肝、脾和BM中具有通過螢光素酶成像法可看見的白血病。NSG小鼠缺少成熟B細胞、T細胞和NK細胞，并且我們假設引入人效應細胞(CD3-，CD34-，PBMCs)連同WT1ab1治療一起將重現(xiàn)體外觀察到的ADCC介導的體內抗腫瘤作用。與對照相比，注射效應子連同兩個100μg劑量的WT1ab1幾乎消除腫瘤生長(圖31)。這種作用在整個實驗過程期間是持久的(圖32)。有趣地，在試驗早期，單獨或與對照IgG組合的效應細胞似乎相對于注射單獨白血病的小鼠而促進白血病的更快速增長，表明這種抗腫瘤作用與效應子本身不相關。幾只給予效應子的小鼠(在對照MAb存在或不存在的情況下)在實驗中早期死亡，存在BV173的大量浸潤。令人驚訝地，不伴有人效應子的WT1ab1治療也大幅度降低腫瘤負荷以及與效應子組合的WT1ab1大幅度降低腫瘤負荷大約30日(圖32)，盡管相比于與效應子組合的WT1ab1組時，腫瘤最終在單獨WT1ab1組中遠更迅速地復發(fā)(圖32)。我們證實單獨的WT1ab1的作用并且滴定劑量以評價效力。單獨的WT1ab1在早期時間點在測試的全部劑量(25-100μgx2劑量)上均導致明顯的腫瘤負荷降低。全部治療組中的腫瘤均在抗體療法停止后緩慢復發(fā)；和在第23日(最后一次抗體注射后13日)，與100μg劑量組相比，可以在25μg組中觀察到明顯更多的腫瘤復發(fā)，這顯示針對WT1ab1療法的劑量-反應(圖33)。在治療之前，小鼠在肝臟中顯示最大腫瘤負荷，所述腫瘤負荷由WT1ab1迅速清除。當復發(fā)時，最高劑量組中的腫瘤似乎主要在骨髓中形成，而腫瘤在用最低劑量治療的小鼠中更迅速地返回肝臟。實施例9使抗體工程化以增強它們的細胞毒能力如所述(43，44)構建了具有人IgG1Fc的識別免疫T細胞上的WT1/A2復合體和CD3的雙特異性抗體。雙特異性抗體預期招募細胞毒T細胞并且將其靶向至WT1/A2陽性癌細胞，同時維持Fc效應子功能和體內長半壽期。三種機制參與雙特異性抗體介導的癌細胞的特異性殺傷：i)由活化的T細胞殺傷；ii)ADCC活性；iii)CDC活性?？梢詷嫿ㄆ渌问降碾p特異性抗體，如串聯(lián)scFv分子(taFv)、雙體抗體(Db)或單鏈雙體抗體(scDb)和與人血清白蛋白的融合蛋白(45，46，47，48)，但是缺少Fc效應子功能，具有不同的藥物代謝動力學持性。如美國專利8,025,879；8,080,415；和8,084,022中所述，通過在乙二醇工程化的CHO細胞中重組表達抗體而增強WT1/A2靶特異的ADCC活性。在Asn297上修飾的低聚糖N-聚糖改變如下效應子功能：1)與CD16/FcRIIIa更高的親和力結合作用，以改進人天然殺傷細胞介導的ADCC活性；2)對CD32b/FcRIIb(一種在多個類型免疫細胞(NK細胞除外)中表達的抑制性受體)降低的結合親和力，以便改進效應細胞如嗜中性粒細胞介導的ADCC活性和由巨噬細胞和DC細胞進行的抗原呈遞(50，51，52)。增強的抗體預期實現(xiàn)更好的體內癌癥治療功效?？梢允褂妹绹鴮＠?,025,879；8,080,415；和8,084,022中所述的宿主表達細胞和方法產(chǎn)生IgGFc的糖基化(尤其巖藻糖基化)變體，所述文獻的內容通過引用的方式并入作為參考。簡而言之，通過使用標準RNA分離純化技術獲得編碼本文中公開的抗體重鏈或輕鏈的信使RNA(mRNA)，并且將它們任選地基于大小分離。隨后使用本領域已知的技術(如cDNA文庫構建、噬菌體文庫構建和篩選或使用特異性相關引物的RT-PCR)產(chǎn)生并分離與編碼重鏈或輕鏈的mRNA相對應的cDNA。在一些實施方案中，cDNA序列可以完全或部分使用產(chǎn)生特定所需cDNA的已知體外DNA操作技術制造。所述cDNA序列可以隨后安置在載體中，所述載體含有與基因處于可讀框連接并且與低巖藻糖修飾的宿主細胞相容的啟動子。含有適宜啟動子、控制序列、核糖體結合位點和轉錄終止位點以及任選地便利標記物的眾多質粒是本領域已知的，這些質粒包括但不限于美國專利號4,663,283和4,456,748中所述的載體。在一個實施方案中，可以將編碼輕鏈和編碼重鏈的cDNA插入分別的表達質粒中。在一個備選實施方案中，可以將編碼輕鏈和編碼重鏈的cDNA一起插入相同的質粒中，只要每個cDNA處于適合的啟動子和翻譯控制下。在圖34中顯示結果。參考文獻：1.MundlosS等人，NuclearlocalizationoftheproteinencodedbytheWilms’tumorgeneWT1inembryonicandadulttissues(胚組織和成年組織中由維爾姆斯瘤基因WT1編碼的蛋白質的核定位).Development1993；119：1329-41.2.KeilholzU等人，Wilms'tumorgene1(WT1)inhumanneoplasia(人瘤形成中的維爾姆斯瘤基因1(WT1)).Leukemia2005；19：1318-1323.3.InoueK等人，WT1asanewprognosticfactorandanewmarkerforthedetectionofminimalresidualdiseaseinacuteleukemia(WT1作為檢測急性白血病中最小殘留病情的新預后因子和新標記).Blood1994；84(9)：3071-3079.4.OgawaH等人，TheusefulnessofmonitoringWT1genetranscriptsforthepredictionandmanagementofrelapsefollowingallogeneicstemcelltransplantationinacutetypeleukemia(監(jiān)測WT1基因轉錄物用于預測和管理在急性類型白血病中同種異體干細胞移植后復發(fā)的效能).Blood2003；101(5)：1698-1704.5.YarnagarniT等人，GrowthInhibitionofHumanLeukemicCellsbyWT1(WilmsTumorGene)AntisenseOligodeoxynucleotides：ImplicationsfortheInvolvementofWT1inLeukemogenesis(通過WT1(維爾姆斯瘤基因)反義寡脫氧核苷酸對人白血病細胞的生長抑制：WT1參與白血病生成中的意義).Blood1996；87：2878-2884.6.BellantuonoI等人，TwodistinctHLA-A0201-presentedepitopesofthWilmstumorantigen1canfunctionastargetsforleukemia-reactiveCTL(HLA-A0201呈遞的兩種不同維爾姆斯瘤抗原1表位可以作為白血病反應性CTL的靶).Blood2002；100(10)：3835-3837.7.GaigerA等人，WT1-specificserumantibodiesinpatientswithleukemia(白血病患者中的WT1-特異性血清抗體).Clin.CancerRes.2001；7(suppl3)：761-765.8.OkaY等人，WT1peptidecancervaccineforpatientswithhematopoieticmalignanciesandsolidcancers(用于造血系統(tǒng)惡性腫瘤和實體癌患者的WT1肽癌疫苗).TheScientificWorldJournal2007；7：649-665.9.KobayashiH等人，DefiningMHCclassIIThelperepitopesfromWT1antigen(確定來自WT1抗原的MHCII類T輔助細胞表位).CancerImmunol.Immunother.2006；55(7)：850-860.10.Pinilla-IbarzJ等人，ImprovedhumanT-cellresponsesagainstsyntheticHLA-A0201analogpeptidesderivedfromtheWT1oncoprotein(針對源自WT1癌蛋白的合成HLA-A0201類似肽的改進人T細胞反應).Leukemia2006；20(11)：2025-2033.11.MayRJ等人，PeptideepitopesfromtheWilmstumor1oncoproteinstimulateCD4+andCD8+Tcellsthatrecognizeandkillhumanmalignantmesotheliomatumorcells(來自維爾姆斯瘤1癌蛋白的肽表位刺激識別并殺傷人惡性間皮瘤腫瘤細胞的CD4+和CD8+T細胞).ClinCancerRes.2007；13:4547-4555.12.KeiholzU等人，Aclinicalandimmunologicphase2trialofWilstumorgeneproduct(WT1)peptidevaccinationinpatientswithAMLandMDS(AML和MDS患者中的臨床和免疫II期試驗Wils腫瘤基因產(chǎn)物(WT1)肽接種).Blood2009；113：6541-6548.13.RezwaniK等人，Leukemia-associatedantigen-specificT-cellresponsesfollowingcombinedPR1andWT1peptidevaccinationinpatientswithmyeloidmalignancies(在髓樣惡性腫瘤患者中PR1和WT1肽聯(lián)合接種后的白血病相關抗原特異性T細胞反應).Blood2008；111(1)：236-242.14.MaslakP等人，VaccinationwithsyntheticanalogpeptidesderivedfromWT1oncoproteininducesTcellresponsesinpatientswithcompleteremissionfromacutemyeloidleukemia(用源自WT1癌蛋白合成類似物肽接種在急性髓樣白血病完全緩解的患者中誘導T細胞反應).Blood2010；AccptMinorrev.15.KrugLM等人，WT1peptidevaccinationsinduceCD4andCD8Tcellimmuneresponsesinpatientswithmesotheliomaandnon-smallcelllungcancer(WT1肽接種在中間皮瘤和非小細胞肺癌患者中誘導CD4和CD8T細胞免疫反應).CancerImmunolImmunother2010；修訂中.16.MorrisE等人，Generationoftumor-specificT-celltherapies(腫瘤特異性T細胞療法的產(chǎn)生).BloodReviews2006；20：61-69.17.HoughtonAN等人，Monoclonalantibodytherapies-a“constant”threattocancer(單克隆抗體療法-癌癥的“恒定”威脅).NatMed2000；6:373-374.18.MiedererM等人，RealizingthepotentialoftheActinium-225radionuclidegeneratorintargetedalphaparticletherapyapplications(實現(xiàn)錒-225放射性核素發(fā)生器在定向α粒子療法應用中的潛力).AdvDrugDelivRev2008；60(12)：1371-1382.19.NoyR，T-cell-receptor-likeantibodies：novelreagentsforclinicalcancerimmunologyandimmunotherapy(T細胞受體樣抗體：用于臨床癌癥免疫學和免疫療法的新試劑).ExpertRevAnticancerTher2005：5(3)：523-536.20.ChamesP等人，DirectselectionofahumanantibodyfragmentdirectedagainstthetumorT-cellepitopeHLA-A1-MAGE-A1fromanonimmunizedphage-Fablibrary(直接選擇針對來自非免疫噬菌體-Fab文庫的腫瘤T細胞表位HLA-A1-MAGE-A1的人抗體片段).ProcNaltAcadSciUSA2000；97：7969-7974.21.HeldG等人，DissectingcytotoxicTcellresponsestowardstheNY-ESO-1proteinbypeptide/MHC-specificantibodyfragments(通過肽/MHC-特異性抗體片段剖析針對NY-ESO-1蛋白的細胞毒T細胞反應).EurJImmunol.2004：34:2919-2929.22.LevA等人，Isolationandcharacterizationofhumanrecombinantantibodiesendowedwiththeantigen-specific，majorhistocompatibilitycomplex-restrictedspecificityofTcellsdirectedtowardthewidelyexpressedtumorTcell-epitopesofthetelomerasecatalyticsubunit(分離和表征借助針對端粒酶催化亞基的廣泛表達的腫瘤T細胞表位的抗原特異性主要組織相容性復合體限制型T細胞特異性所賦予的人重組抗體).CancerRes2002；62：3184-3194.23.KlechevskyE等人，AntitumoractivityofimmunotoxinswithT-cellreceptor-likespecificityagainsthumanmelanomaxenografts(具有針對人黑素瘤異種移植物的T細胞受體樣特異性的免疫毒素的抗腫瘤活性).CancerRes2008；68(15)：6360-6367.24.AzinovicI等人，Survivalbenefitassociatedwithhumananti-mouseantibody(HAMA)inpatientswithB-cellmalignancies(B細胞惡性腫瘤患者中與人抗小鼠抗體(HAMA)相關的存活益處).CancerImmunolImmunother2006；55(12):1451-8.25.TjandraJJ等人，Developmentofhumananti-murineantibody(HAMA)responseinpatients(患者中人抗鼠抗體(HAMA)反應的形成).ImmunolCellBiol1990；68(6):367-76.26.RiechmannL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