專利名稱：通過耐受誘導抗原遞呈細胞誘導抗原呈遞治療自身免疫性疾病的方法
技術領域：
發(fā)展并且恢復針對自身抗原的天然免疫耐受以治療或者預防自身免疫疾病。
背景技術：
T細胞介導的疾病胰島素依賴的糖尿病(“T1DM”)是影響超過一百五十萬美國人的主要健康問題。這種自身免疫性疾病源于胰腺內(nèi)胰島產(chǎn)生胰島素的β-細胞由T細胞介導的破壞。盡管用胰島素進行治療，源于T1 DM的死亡在過去的20年中還是增加了，而癌癥、心血管疾病以及中風的死亡率卻降低了(Hurlbert等，2001)。此外，用外源胰島素治療引起的并發(fā)癥包括腎病，神經(jīng)病以及視網(wǎng)膜病使人變得更加虛弱。
T1DM被認為是Th1介導的疾病，并且例如通過系統(tǒng)施用IL-4改變針對Th2型免疫應答的早期干預可以預防疾病的發(fā)生(Cameron等，1997)。效應T細胞Th1以及Th2的平衡對于保持免疫耐受是非常重要的，并且平衡的改變可以引起自身免疫。然而，預防自身免疫性疾病并非Th2細胞的固有特性，因為來自NOD小鼠的Th2細胞系也已經(jīng)顯示出轉(zhuǎn)移疾病(Pakkala等，1997)。
免疫系統(tǒng)以復雜的方式進化保持自身耐受性。胸腺提供了T細胞的重要初始選擇。這種選擇引起耐受存在于胸腺中的自身抗原的T-細胞排至外周。然而，許多組織特異性的蛋白并不能充分表達來誘導耐受。例如，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)胰島反應性的T細胞在健康的受試者體內(nèi)存在，盡管可能親和性較低(Lohman等1996)。幾個外圍耐受機制補充胸腺中的中心耐受機制以使自身反應性T細胞受到控制。外周耐受的一個關鍵介質(zhì)是抗原遞呈細胞(“APC”)。諸如樹狀細胞(“DCs”)以及巨噬細胞的APCs從其它的細胞捕捉自體抗原并且將它們呈遞給自身反應性T細胞，通過缺失，無細胞免疫反應性和/或產(chǎn)生調(diào)控T細胞誘導T細胞耐受(Heath & Carbone，2001)。目前的假設是不成熟的APCs，諸如穩(wěn)態(tài)免疫系統(tǒng)中的APCs耐受而非激活T細胞，可能是由于缺少共-激活分子。Hawiger等已經(jīng)利用針對DEC-205，DC-限制性細胞內(nèi)受體的抗體將抗原靶向DCs的主要組織相容性II類(“MHC II”)途徑(Hawiger等，2001)。由這些DCs進行的抗原呈遞促使CD4+T細胞增殖的短暫爆發(fā)，隨后缺失并且接受者被賦予了針對抗原的耐受性，如因缺乏針對隨后的肽免疫的應答所顯示的。相反，當抗原靶向伴隨有強DC成熟刺激物諸如抗-CD40產(chǎn)生時，免疫性得以誘導。
樹狀細胞還可以通過產(chǎn)生經(jīng)由抑制細胞因子或者接觸依賴的機制影響效應T細胞功能的調(diào)節(jié)T細胞誘導外周耐受(Roncarolo等，2001；Jonuleit等，2000；Dhodapkar & Steinman，2001)。已經(jīng)通過通?！按蝺?yōu)的”T細胞刺激開發(fā)了大量用于誘導調(diào)節(jié)T細胞的不同方法。次優(yōu)的T細胞刺激可以在缺少共-刺激條件下通過抗原呈遞或者炎癥，或者通過部分阻斷T細胞受體或者其共-受體CD4以及CD8實現(xiàn)。調(diào)節(jié)T細胞的表現(xiàn)型以及作用機理是異源的。許多抑制性細胞為CD4+CD25+，然而日益清楚的是在許多情況下CD4+CD25-細胞同樣有效。在調(diào)節(jié)T細胞群中鑒定的其它標記包括CD62L，GITR以及CD103(Lafaille & Lafaille，2002)，并且已經(jīng)報道了CD8+調(diào)節(jié)T細胞(Dhodapkar & Steinman，2002)。一些調(diào)節(jié)T細胞已經(jīng)顯示出產(chǎn)生免疫抑制的細胞因子白介素(“IL”)-10(Wakkach等，2001；Barrat等，2002)，而通過口腔耐受誘導的調(diào)節(jié)T細胞已被鑒定為除了產(chǎn)生Th2型細胞因子IL-4以及IL-10外產(chǎn)生轉(zhuǎn)化生長因子-β(“TGF-β”)。接觸依賴的抑制性細胞在TGF-β存在的情況下通過激活CD4+CD45RA+人外周T細胞產(chǎn)生(Yamigawa等，2001)。雖然誘導調(diào)節(jié)T細胞需要經(jīng)由T細胞受體進行刺激，但是他們的抑制效果好象是非-抗原特異性的(Thorton &Shevach，2000)。
免疫調(diào)節(jié)的T細胞已經(jīng)顯示出在下調(diào)NOD小鼠體內(nèi)病原性自身反應性T細胞中起一定的作用。有證據(jù)顯示糖尿病前癥小鼠具有免疫調(diào)節(jié)的T細胞而且它們數(shù)目的減少或者功能的降低是疾病發(fā)展的主要決定性事件(Sempe等，1994)。共-轉(zhuǎn)移實驗顯示來自糖尿病前癥小鼠的CD4+T脾細胞徹底阻止疾病由致糖尿病細胞轉(zhuǎn)移至無免疫能力的接受者(Boitard等，1989；Hutchings & Cooke，1990)。同樣，由不成熟的DCs誘導的調(diào)節(jié)T細胞也與NOD小鼠模型的疾病預防有關(Huges等，2002)。
人體內(nèi)，應答胰島素，谷氨酸脫羧酶(“GAD”)，熱休克蛋白(“HSP”)60，或者蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶類分子(“IA-2”)，及其他不明確的β-細胞抗原的自身反應性T細胞已經(jīng)得以描述(Roep等，1990；Atkinson等，1992；Honeyman等，1993；Rejjonen等，2002)。
GAD是抑制性神經(jīng)遞質(zhì)γ氨基丁酸的生物合成酶(Baekkeskov等，1990)。已經(jīng)克隆了兩種具有65％同源性的不同的同種型，GAD65以及GAD67。盡管GAD65是人體內(nèi)的主要同種型，而GAD67是NOD小鼠體內(nèi)的主要形式，在人體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了抗這兩種同種型的抗體(Kaufman等，1992)。在NOD小鼠體內(nèi)，在胰島炎之前或者同時，以及產(chǎn)生其它β-細胞抗原的抗體之前測定到抗-GAD抗體。這個時間暗示GAD是起始該模型的β-細胞自身免疫的初級抗原(Tisch等，1993)。GAD在糖尿病中起重要作用的其它證據(jù)來自于許多實驗室觀察到從糖尿病小鼠的脾或者胰腺分離的GAD-特異性T細胞可以將疾病轉(zhuǎn)移給天然動物(Rohane等，1995；Wen等，1998；Zekzer等，1998)。盡管仍然存在有關GAD在T1DM致病中起主要作用的爭論，動物試驗的根據(jù)表明這種蛋白至少起到了重要的作用，用純化的GAD65在幼年經(jīng)胸腺內(nèi)或者靜脈內(nèi)免疫可以使NOD小鼠的T細胞耐受胰腺β-細胞，由此預防胰島炎以及糖尿病(Tian等，1996；Ma等，1997)。對GAD的耐受還可以預防針對諸如HSP65的其它抗原的免疫反應的發(fā)育發(fā)展。更進一步的研究是針對哪種GAD肽能夠誘導耐受(Tisch等，2001；Tisch等，1999；Zechel等，1998)。對糖尿病發(fā)病的預防還可以通過經(jīng)由靜脈注射，皮下注射，口腔或者鼻途徑的胰島素或者HSP65治療實現(xiàn)(Elias等，1991；Elias & Cohen，1994；Elias等，1997；Atkinson等，1990)。雖然抗原特異性治療當早期施用時對預防疾病是卓有成效的，僅僅少數(shù)嘗試對控制正在進行的疾病是奏效的(Elias & Cohen，1994；Tian等，1996)。
通常，肽免疫不能控制抗原遞呈細胞是在誘導免疫性的階級還是通過可以將免疫應答轉(zhuǎn)變?yōu)槟褪艿目乖f呈細胞呈遞肽，因此可以引起免疫刺激或者免疫抑制。
免疫系統(tǒng)的損害可以預防糖尿病的發(fā)展。大量的抑制T細胞功能的通用因子諸如FK506，抗-CD4，抗-CD8，抗-CTLA-4及其他已經(jīng)顯示出預防或者延緩NOD小鼠糖尿病的發(fā)病(參考Atkinson & Leiter，1999)。然而，這些試劑對致糖尿病T細胞都不是特異性的，并且大多數(shù)的這些試劑可以預防疾病的發(fā)生，但是一旦疾病已經(jīng)發(fā)生就無效了。通常臨床試驗中檢驗的諸如環(huán)孢素的免疫抑制劑可以短期有效(Feutren等，1988；Skyler & Rabinovitch，1992)。然而，免疫抑制的中止可以導致對復發(fā)的促進，并且諸如腎臟毒性的副作用排斥長期治療(Parving等，1999)。
已經(jīng)開始了臨床試驗以評價抗原特異性治療對糖尿病的療效。在糖尿病發(fā)病早期檢測到HSP60 p277肽(DiaPep277)(Raz等，2001)。用肽的多重免疫使疾病的發(fā)展減緩并且已經(jīng)開始了大規(guī)模的研究以證實以及延伸結(jié)果。利用人胰島素β-鏈連同弗氏不完全佐劑的臨床試驗，正在開發(fā)胰島素B9-23以及GAD的改性肽配體。然而，用口服胰島素對新近診斷的糖尿病進行試驗治療失敗(Pozzili等2000；Chaillous等2000)并且胃腸外胰島素施用不能成功預防高危糖尿病前癥(DiabetesPrevention Trial-Type 1(DPT)Study Group，2002)。失敗可能是由于包括選擇抗原，抗原劑量(Kurts等，1999)，給藥時間以及途徑的幾個因素。而且，抗原治療不能控制什么類型的免疫細胞可以攝取抗原。雖然小鼠處于控制的不含病原體的狀態(tài)下，人體試驗就不是這樣的結(jié)果。當并發(fā)細菌或者病毒感染時，可以發(fā)生致敏而非耐受。動物體內(nèi)，糖尿病可以通過在一定條件下的抗原免疫進行誘導(Blana等，1996；Bellmann等，1998)。
因為在過去的十年間對免疫系統(tǒng)如何維持對自身抗原的耐受的理解顯著地加深，目前預防或者治療T1DM的治療策略瞄準了恢復針對β-細胞抗原的免疫耐受。目前的免疫治療策略是針對通過直接滅活自身反應性T細胞和/或誘導具有調(diào)節(jié)能力的T細胞誘導針對β-細胞抗原的耐受。誘導調(diào)節(jié)的T細胞好象是治療大量自身免疫疾病的有前途的方法。
發(fā)明概述本公開涉及通過誘導免疫耐受治療自身免疫性疾病的方法。免疫耐受通過將自身抗原呈遞在抗原呈遞細胞上進行誘導。自身抗原與識別抗原內(nèi)在化受體的抗體連接。自身抗原通過抗原呈遞細胞內(nèi)在化并且呈遞于其上，引起自身反應性T細胞的抑制。
在尤其有用的實施方案中，本發(fā)明描述的方法以及化合物可以通過誘導針對自身抗原的免疫耐受用于治療糖尿病，所述自身抗原可以尤其為β細胞抗原，GAD或者其表位，胰島素或者其表位，HSP或者其表位。自身抗原與識別DC-SIGNR，或者DC-SIGNR變體的抗體連接，所述DC-SIGNR為抗原內(nèi)在化受體。自身抗原內(nèi)在化于靶肝竇狀隙內(nèi)皮細胞中或者其它的表面上表達DC-SIGNR的耐受APC′s中。自身抗原存在于靶肝竇狀隙內(nèi)皮細胞上并且抑制自身反應性T細胞的增殖。
在另一個方面，描述了抗體/肽構(gòu)建體，其含有與肽相連的抗原遞呈細胞上受體的抗體。優(yōu)選地肽為抗原，更優(yōu)選地為自身抗原。在尤其有用的實施方案中，抗體/自身抗原構(gòu)建體或者其部分通過抗原遞呈細胞內(nèi)在化并且實現(xiàn)對于自身抗原的免疫耐受。有時，毒素可以與本發(fā)明公開的抗體結(jié)合并且施用于患者。當毒素是針對例如腫瘤細胞時，本發(fā)明公開的抗體可以用于將毒素引入腫瘤細胞并且由此將毒素集中施用于腫瘤細胞。
在另一個方面，描述了重組產(chǎn)生含有受體的抗體或者與自身抗原相連的抗原遞呈細胞的工程抗體的方法。
本發(fā)明也涉及DC-SIGNR的抗體，其參與DC-SIGNR表達細胞和ICAM-表達細胞諸如T細胞的相互作用。
在另一方面，DC-SIGNR的抗體阻止病毒進入肝細胞諸如肝竇狀隙細胞以及感染其它的細胞。在有些實施方案中，本發(fā)明包括DC-SIGNR抗體在疫苗中的應用。
在某些實施方案中，本發(fā)明的DC-SIGNR的抗體可以為人源化抗體。在其它的實施方案中，本發(fā)明的DC-SIGNR的抗體可以為scFv。
本發(fā)明進一步的實施方案涉及利用如上所述組合物和/或?qū)嵤┓椒ǖ念A防技術以及診斷技術。本發(fā)明也提供了在藥用載體中含有本發(fā)明的DC-SIGNR的抗體的組合物。


圖1圖示本發(fā)明的抗體/自身抗原構(gòu)建體與抗原遞呈細胞(APC)以及T細胞的相互作用。
圖2A顯示了兔抗-mSIGNR1 scFV抗體的輕鏈氨基酸序列(SEQ.ID NOS1-6)以及重鏈氨基酸序列。
圖2B顯示了兔抗-mSIGNR1 scFV抗體的重鏈氨基酸序列(SEQ.ID NOS7-12)。
圖3為用于抗體肽構(gòu)建體產(chǎn)生的一部分載體的示意圖。
圖4為顯示IgG1克隆與人DC-SIGNR的反應性的本發(fā)明體外試驗結(jié)果的圖。
圖5為顯示IgG2a克隆與人DC-SIGNR的反應性的本發(fā)明體外試驗結(jié)果的圖。
圖6為顯示IgG1克隆與人DC-SIGNR以及DC-SIGN的反應性的本發(fā)明體外試驗結(jié)果的圖。
圖7為顯示IgG2a克隆與人DC-SIGNR以及DC-SIGN的反應性的本發(fā)明體外試驗結(jié)果的圖。
圖8A-8C顯示了與人DC-SIGNR(SEQ.ID NOS.17-36)反應的重鏈克隆的氨基酸序列。
圖9A-9B顯示了與人DC-SIGNR(SEQ.ID NOS.37-55)反應的輕鏈克隆的氨基酸序列。
圖10顯示了與人DC-SIGNR(SEQ.ID NOS.63-82)反應的重鏈克隆的附加的氨基酸序列。
圖11顯示了與DC-SIGNR(SEQ.ID NOS.46-226)反應的輕鏈克隆的附加的氨基酸序列。
圖12顯示了與DC-SIGNR(SEQ.ID NOS.133-154)反應的重鏈克隆的附加的氨基酸序列。
圖13顯示了與DC-SIGNR(SEQ.ID NOS.169-189)反應的輕鏈克隆的附加的氨基酸序列。
發(fā)明詳述本發(fā)明的方法誘導針對參與自身免疫性疾病的自身抗原，自我肽的免疫耐受。
根據(jù)本發(fā)明通過給受試者施用抗體/自身抗原構(gòu)建體(有時在這里稱為“工程抗體”)誘導免疫耐受。抗體/自身抗原構(gòu)建體包括與抗體連接的自身抗原。
抗體組分可以為與任一抗原遞呈細胞上任一受體結(jié)合的抗體。本領域技術人員將理解，抗原遞呈細胞的類型包括樹狀細胞，巨噬細胞，內(nèi)皮細胞枯否細胞以及B細胞。在目前已知的受體或者抗原遞呈細胞為DEC-205，甘露糖受體，DC-SIGN，DC-SIGNR，MHC，toll受體，langerin，脫唾液酸糖蛋白受體，β-葡聚糖受體，C-型凝集素受體以及樹狀細胞免疫受體。在尤其有用的實施方案中，受體為將內(nèi)在化STT抗體的受體。內(nèi)在化是否發(fā)生在特定的受體可以利用本領域技術人員已知的技術通過實驗決定。目前已知提供抗體內(nèi)在化的受體或者抗原遞呈細胞包括DEC-205，甘露糖受體，DC-SIGN以及DC-SIGNR。
抗體組分可以為天然抗體(利用傳統(tǒng)方法分離的)或者通過本領域技術人員知識能力內(nèi)的重組體方法合成制備的抗體。抗體可以為例如，完全人抗體，非-人抗體，人源化抗體，嵌合抗體或者以任一方法(例如，位點特異性的修飾或者脫免疫)操作的任一上述抗體類型?？贵w可以優(yōu)選地利用本領域技術人員已知的技術，諸如，例如噬菌體展示以及淘選從抗體文庫選擇。
一旦選擇，編碼抗體的核酸可以利用本領域技術人員已知的技術，諸如，例如常規(guī)的PCR或者分別在2002年9月19日提交的美國專利申請10/251,085以及2001年12月10日提交的美國專利申請10/014,012描述的擴增技術進行擴增，其內(nèi)容在此處引入作為參考。
將自身抗原與抗體連接制各本發(fā)明公開的抗體/自身抗原構(gòu)建體，可以使用任一的自身抗原。自身抗原可以為天然發(fā)生的并且利用本領域技術人員已知的技術分離的。或者，如果已知自身抗原的氨基酸序列，它可以利用已知的技術合成制備。合適的自身抗原包括胰島素，GAD，Hsp，核抗原，乙酰膽堿受體，髓鞘堿性蛋白，髓鞘少突膠質(zhì)細胞糖蛋白，蛋白脂質(zhì)蛋白，髓鞘相關糖蛋白，glomular基底膜蛋白以及促甲狀腺素受體。在尤其有用的實施方案中，自身抗原為在經(jīng)抗原遞呈細胞呈遞后誘導免疫耐受的自身抗原。
自身抗原可以通過任一合適的方法與抗體連接。一個特定的方法描述在下列的實施例中，然而本發(fā)明的公開不限于制備抗體/自身抗原構(gòu)建體的任一特定的方法。
本發(fā)明誘導針對自身抗原的免疫耐受的方法靶向抗原呈遞細胞(“APCs”)并且經(jīng)由抗體將自身抗原引向那些細胞。圖1圖示了本發(fā)明的抗體/自身抗原構(gòu)建體與抗原遞呈細胞(APC)以及T細胞的相互作用?？贵w識別靶細胞上的受體。為了通過抗體直接遞送自身抗原，將二者相連。這些連接可以通過任一方法實現(xiàn)，盡管本發(fā)明描述了載體克隆的應用?？贵w僅僅靶向并且結(jié)合于特定的抗原-內(nèi)在化受體，由此保證自身抗原向期望的細胞類型的遞送。
抗體結(jié)合于靶向抗原內(nèi)在化受體后，連接的自身抗原以及抗體內(nèi)在化在抗原遞呈細胞中。大概經(jīng)由自身抗原與細胞內(nèi)主要組織相容性復合體(“MHC”)的相互作用將自身抗原呈遞在APCs的表面上。一旦自身抗原表達在具有共-激活潛能的APCs表面上，天然自身反應性T細胞可以被激活并且與它們的特異性自身抗原靶向以及反應。共-激活分子在APCs表面的缺失很可能參與限制T細胞應答。自身反應性效應T細胞僅僅可以殺死有限量的表達抗原的組織細胞。殺死少量靶細胞后，效應細胞死亡。然后耐受自身抗原呈遞細胞。
本發(fā)明的抗體/自身抗原構(gòu)建體可以根據(jù)已知的方法施用，例如，通過靜脈，腹腔內(nèi)，腦內(nèi)，肌內(nèi)，皮下，眼內(nèi)，動脈內(nèi)，鞘內(nèi)的注射或者灌注，吸入或者損害內(nèi)途徑，局部的或者通過持續(xù)釋放系統(tǒng)進行施用，如下所述?？贵w/自身抗原構(gòu)建體優(yōu)選地通過灌注或者通過彈丸注射連續(xù)地施用?？梢跃植炕蛘呦到y(tǒng)的方式施用抗體/自身抗原構(gòu)建體。
抗體/自身抗原構(gòu)建體可以與藥用載體混合制備。配制并且施用本申請化合物的技術參見“Remington′s Pharmaceutical Sciences，”MackPublishing Co.，Easton，PA，最近的版本。這種治療的組合物可以靜脈內(nèi)或者經(jīng)由鼻子或者肺，優(yōu)選地作為液體或者粉末氣霧劑(冷凍干燥)施用。組合物也可以根據(jù)需要非腸道或者皮下施用。當系統(tǒng)施用時，治療組合物應該無菌，無熱原并且在具有所需pH，等滲性以及穩(wěn)定性的非腸道用溶液中。這些條件是本領域技術人員已知的。
簡要地，本發(fā)明的抗體/自身抗原構(gòu)建體的制劑通過將具有理想純度的化合物與生理上可接受的載體、賦形劑或穩(wěn)定劑混合進行制備用于保存以及施用。這種材料在所使用的劑量和濃度對接受者是無毒的，并且可包括緩沖液諸如TRIS HCl，磷酸鹽，檸檬酸鹽，醋酸鹽及其它有機酸鹽；抗氧化劑諸如抗壞血酸；低分子量(小于約十個殘基)肽諸如聚精氨酸，蛋白諸如血清白蛋白，動物膠或免疫球蛋白；親水聚合物諸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸諸如甘氨酸，谷氨酸，天冬氨酸，或精氨酸；單糖，二糖，及其它的碳水化合物包括纖維素或其衍生物，葡萄糖，甘露糖，或糊精；螯合劑諸如EDTA；糖醇諸如甘露糖醇或山梨糖醇；平衡離子諸如鈉和/或非離子型表面活性劑諸如TWEEN，PLURONICS或聚乙二醇。
當體內(nèi)施用時，抗體/自身抗原構(gòu)建體制劑必須是無菌的且可根據(jù)常規(guī)的藥物實踐來配制。這些通過在冷凍干燥和重構(gòu)之前或之后經(jīng)由無菌濾膜過濾，很容易完成。抗體通常以冷凍干燥形式或在溶液中進行儲存。其它的載體諸如天然產(chǎn)生的植物油如芝麻，花生或棉子油或合成的脂肪載體像油酸乙酯等是理想的。緩沖液，防腐劑，抗氧化劑等可根據(jù)藥物實踐結(jié)合使用。
適用的藥物組合物包括組合物其中含有有效量的一或多種抗體/自身抗原構(gòu)建體來實現(xiàn)它們的目的。更具體地，治療有效量是指有效預防、緩解或改善病癥或延長治療受試者存活時間的抗體的量。治療有效量的確定在本領域技術人員的能力范圍之內(nèi)，尤其是參照本發(fā)明在這里提供的具體內(nèi)容。治療有效量可通過利用體外和體內(nèi)方法來確定。
治療使用的抗體/自身抗原構(gòu)建體的有效量取決于，例如治療的目的，給藥途徑，和患者的情況。此外，主治醫(yī)師考慮到各種已知因素來改變藥物的作用包括疾病的嚴重性和類型，體重，性別，飲食，給藥的時間和途徑，其它的治療藥物及其它相關的臨床因素。因此，對于臨床醫(yī)學家來說，根據(jù)需要滴定藥物劑量和改變給藥途徑來獲得最佳的治療效果是必需的。一般地，臨床醫(yī)生將施用抗體/自身抗原構(gòu)建體直至劑量達到實現(xiàn)預期的效果。這些治療的進展通過常規(guī)的試驗很容易監(jiān)控。
對于任一抗體/自身抗原構(gòu)建體而言，可由細胞培養(yǎng)物試驗來估計治療的有效劑量。例如，可在動物模型中確定劑量來獲得循環(huán)濃度范圍，其包括在細胞培養(yǎng)物中測定的EC50(例如，促進或抑制細胞增殖或分化的測試分子的濃度)。這種信息可用于更精確地測定在人體中的有效劑量。
在這里描述的抗體/自身抗原構(gòu)建體的毒性和治療效果可通過在細胞培養(yǎng)物或?qū)嶒瀯游镏羞M行的標準藥物方法，例如，測定LD50(致死50％群體的劑量)和ED50(50％群體中有效的治療劑量)。毒性和治療效果之間的劑量比率是治療指數(shù)且其可以表示為LD50和ED50之間的比率。顯示高治療指數(shù)的分子是優(yōu)選的。獲自這些細胞培養(yǎng)物試驗和動物研究的數(shù)據(jù)可用于制定供人類應用的劑量范圍。這種分子的劑量優(yōu)選地在循環(huán)濃度的范圍中，其包括具有很少或沒有毒性的ED50。劑量可根據(jù)所使用的劑型和給藥途徑在此范圍內(nèi)變化。每個醫(yī)生可根據(jù)病人情況選擇確切的制劑，給藥途徑和劑量。(參見例如，F(xiàn)ingl等，1975，“The Pharmacological Basis of Therapeutics”，Ch.1 p.1.)。
可調(diào)整個體的劑量和間隔來提供抗體/自身抗原構(gòu)建體充分促進或抑制增殖或分化或的血漿水平或最小的有效濃度(MEC)。MEC可根據(jù)每一抗體/自身抗原構(gòu)建體而變化，但是可以利用所描述的試驗由體外數(shù)據(jù)來估計。獲得MEC所必需的劑量取決于個體的特性和給藥途徑。然而，HPLC試驗或生物測定可用于測定血漿濃度。
劑量間隔還可以利用MEC值來確定?？贵w/自身抗原構(gòu)建體分子應利用維持血漿水平在MEC以上10-90％的時間，優(yōu)選地30-90％之間且最優(yōu)選地在50-90％之間的給藥方案進行施用。
在局部施用或選擇吸收時，抗體自身抗原構(gòu)建體的有效局部濃度可能與血漿濃度不相關。
典型的日劑量可以為1μg/kg到1000mg/kg或更多，取決于上述的因素。一般地，臨床醫(yī)生將施用抗體/自身抗原構(gòu)建體直至劑量達到實現(xiàn)預期的效果。這些治療的進展通過常規(guī)的試驗很容易監(jiān)控。
取決于疾病的類型和嚴重性，將由約0.001mg/kg到約1000mg/kg，更優(yōu)選地約0.01mg到100mg/kg，更優(yōu)選地約0.010到20mg/kg的抗體/自身抗原構(gòu)建體的初始候選劑量施用于患者，例如，通過一或多次單獨施用，或通過連續(xù)輸注。對于重復施用幾天或更長時間的情況，根據(jù)病癥，重復治療直至獲得期望的病征抑制或期望的病情改善。然而，其它的劑量方式也可能有效的。
在一個尤其有效的實施方案中，公開的方法可通過誘導對胰腺中胰島的產(chǎn)胰島素β細胞的免疫耐受用于治療糖尿病。這些細胞的自身抗原與識別目的抗原內(nèi)在化受體的抗體連接。本說明書使用的合適的自身抗原為β細胞抗原，胰島素的表位或者肽呈遞表位，谷氨酸脫羧酶(“GAD”)和熱休克蛋白(“HSP”)。一組來自胰島素，GAD和hsp的肽覆蓋表位與抗-DC-SIGNR抗體的連接具有誘導對所有與T1DM有關的所有主要抗原的耐受的潛能。其它的自身抗原可以是本領域技術人員已知的和應用的，或發(fā)現(xiàn)的和應用的。
抗原-內(nèi)在化受體位于特化的APCs上。對于該方法而言，所選擇的抗原-內(nèi)在化受體為DC-SIGNR(樹狀細胞特異性細胞間粘著分子3-抓取的非整聯(lián)蛋白相關受體)。DC-SIGNR通過肝竇狀隙內(nèi)皮細胞(“LSEC”)表達，其是肝-固有的抗原呈遞細胞。(Pohlmann等，2001)。DC-SIGNR屬于病原體內(nèi)在化受體的家族，內(nèi)在化受體結(jié)合蛋白以及促進抗原呈遞。(1Geijtenbeek等，2002)。已經(jīng)表明抗原通過LSECs的呈遞產(chǎn)生抗原-特異耐受性(Limmer等，2000)。相比其它的樹突狀細胞類型可由不成熟的致耐受性狀態(tài)成熟為激活狀態(tài)，肝竇狀隙細胞不能被誘導來發(fā)展成為激活的抗原呈遞細胞(2Knolle等，1999)。人DG-SIGNR(也稱為L-SiGN)同系物與人DC-SIGN在氨基酸水平顯示出77％的同一性并且具有內(nèi)在化受體的典型區(qū)域(Bashirova等，2001；Soilleux等，2000)。DC-SIGNR通過LSEC高度表達并且也被發(fā)現(xiàn)在淋巴結(jié)巨噬細胞-樣細胞的亞-群上，但是不由DCs表達。
對本發(fā)明的目的來說，術語“DC-SIGNR”和“L-SIGN”可互換使用。
C-型凝集素小鼠DC-SIGN(CD209)最近被確定為DC-特異性受體。DC-SIGN介導DCs的跨內(nèi)皮遷移，其通過啟動瞬時的DC-T細胞相互作用啟動初級免疫應答(3Geijtenbeek等，2000；2geijenbeek等，2000)。DC-SIGN也充當通過碳水化合物結(jié)構(gòu)識別病原體的內(nèi)在化抗原受體。除其在DC-T細胞簇中的重要作用和啟動T細胞應答之外，DC-SIGN是與DC的傳染有關的主要受體并且隨后傳輸至病毒的T細胞，諸如HIV-1，HIV-2，SIV-1，丙型肝炎病毒(HCV)，埃博拉病毒，巨細胞病毒(CMV)，和登革熱病毒；細菌諸如幽門螺旋桿菌，Klebsiellapneumonae，和結(jié)核分枝桿菌；酵母諸如變白色酵母；和寄生蟲諸如Leishmania pifanoi和曼氏血吸蟲。DC-SIGNR的鼠同系物，mSIGNRI，捕捉抗原快速地內(nèi)在化并且靶向作用中的裂解酶(1Geijtenbeek等，2002)?；诎被嵝蛄?，鼠SIGNR1與人DC-SIGNR是相同同源的，如同其與人DC-SIGN且因此可用于動物模型研究。
在某些實施方案中，DC-SIGNR的抗體調(diào)節(jié)，即抑制或增強，DC-SIGNR表達細胞與ICAM-表達細胞的相互作用。在一個實施方案中，抗-DC-SIGNR抗體結(jié)合于抗原呈遞細胞諸如LSEC表面上的DC-SIGNR受體部位，并阻止LSEC和T細胞之間的相互作用。更具體地說，DC-SIGN的抗體通過干擾DC-SIGNR和T細胞表面上的ICAM受體之間的粘連來降低LSEC和T細胞之間的粘連。
在這里使用的術語“ICAM受體”是指ICAM-2和ICAM-3兩種受體，尤其是ICAM-3受體。
在某些實施方案中，本發(fā)明的DC-SIGNR的抗體不結(jié)合DC-SIGN。
在其它的實施方案中，本發(fā)明的DC-SIGNR的抗體阻斷病毒進入肝細胞諸如肝竇狀隙細胞的入口以及阻斷它們傳染進入其它的細胞。
通過妨礙T細胞與抗原呈遞細胞的粘連，抗體DC-SIGNR的使用將影響抗原呈遞細胞-T細胞簇，T細胞激活及其它依靠抗原呈遞細胞和T細胞之間接觸的相互作用。這些其它的相互作用包括直接的細胞-與-細胞接觸或抗原呈遞細胞和T細胞的親密接近。
在其它的實施方案中，本發(fā)明的抗-SIGNR抗體連接于肽諸如自體抗原，或自身抗原，肽。
這些肽可通過任意合適的方法連接抗-DC-SIGNR抗體，包括移植載體至抗體片段和克隆連接的載體/抗體，或化學連接。連接載體，克隆或化學連接的方法是本領域技術人員公知的。
肽，優(yōu)選為自身抗原，與連接的抗體一起，然后內(nèi)在化到LSEC中。LSECs具有抗原呈遞所必需的表面分子諸如MHCII，CD80和CD86(Lohse等，1996；Rubinstein等，1986)。除了誘導天然CD4+T細胞中的調(diào)控的表現(xiàn)型之外(Knolle等，1999)，LSECs可通過交叉呈遞外源性抗原誘導CD8+T細胞中的耐受(Limmer等，2000)。LSECs通過MHC的下調(diào)對刺激物如TNF-α和內(nèi)毒素進行應答，以及阻礙內(nèi)涵體作用(2Knolle等，1999)。此外，LSECs不能從肝臟中移出至淋巴器管。
這些內(nèi)在化通過MHC相互作用介導促進自身抗原肽呈遞至LSECs的表面。一旦自身抗原在LSECs的表面上表達，具有共刺激潛力的，天然自動反應的T細胞可變成激活的。T細胞靶向以及與連接的自身抗原反應。效應T細胞殺死少數(shù)的LSECs并且衰減不共-刺激的分子。此種自身抗原通過LSEC的呈遞產(chǎn)生了自身抗原-特異耐受性。
肝臟具有獨特的微環(huán)境，具有豐富的致耐受性的介體諸如IL-10和TGF-β和特異性APCs，其有利于免疫耐受性的發(fā)展(1Knolle &Gerken，2000)。通過發(fā)現(xiàn)異源肝移植可跨越MHC障礙物被接受支持了肝臟的致耐受性特性(Calne，1969)。此外，抗原通過門靜脈的應用比抗原的全身性應用更有可能導致耐受(Kamei等，1990)。通過肝臟排泄已被報道是口服耐受誘導的必要條件(Yang等，1994)。血液透過肝血管首先接觸到枯否細胞和LSECs。血流通過肝竇狀隙是緩慢的，允許肝臟竇狀隙細胞群體之間的接觸和通過白血球。LSECs具有抗原呈遞所必需的表面分子諸如MHCII，CD80和CD86(Lohse等，1996；Rubinstein等，1986)。除了誘導天然CD4+T細胞中的調(diào)控的表現(xiàn)型之外(3Knolle等，1999)，LSECs可通過交叉呈遞外源性抗原誘導CD8+T細胞中的耐受(Limmer等，2000)。Klugewitz等(Klugewitz等，2002)證明了在靜脈注射蛋白免疫之后將產(chǎn)生Th1，IFN-γ的TCR-轉(zhuǎn)基因細胞注射到小鼠中導致由這些在肝臟中的細胞產(chǎn)生IFN-γ的抑制并且促進Th2-細胞的產(chǎn)生。與可將不成熟的，致耐受性的階段與成熟期起始的免疫性區(qū)別開的特定骨髓APC相反，LSECs通過下調(diào)MHC和阻礙內(nèi)涵體作用對刺激物諸如TNF-α和內(nèi)毒素的應答(2Knolle等，1999)。此外，LSECs不能從肝臟中移出至淋巴器管。LSECs可能不是僅僅對誘導耐受度有特異性的APC。Pugliese等最近鑒定了脾DCs的小亞型，其通過呈遞內(nèi)源性表達的自身抗原誘導耐受(Puglise等，2001)。總之，LSECs看起來像是以耐受誘導為目的對呈遞β-細胞抗原有利的細胞類型。
本發(fā)明方法的實施，包括其它優(yōu)選的方面及其實施方案，將通過下面的實施例被更全面的理解，其僅僅用于解釋的作用而不應被理解為任何方式的限制。
實施例1-獲得抗-mSIGNR1抗體利用噬菌體展示技術，鑒定了一組識別mSIGNR1的單鏈抗體(scFv)。scFvs含有通過接頭連接的可變的輕和重鏈區(qū)域。它們的短的長度使得這些抗體片段非常適于抗原連接，并且結(jié)合于受體的能力是保守的。用重組mSIGNR1免疫兔，以及利用噬菌體展示載體pRL4構(gòu)建scFv抗體文庫，所述的載體pRL4描述在2002年6月13日出版的國際申請No.WO02/46436 A2中，其內(nèi)容在這里整體引入作為參考。在此系統(tǒng)中的抗體片段被顯示在噬菌體的基因III外殼蛋白上。通過在重組mSIGNR1上4循環(huán)的固相淘選分離識別mSIGNR1的抗體。鑒定了六個不同的抗體。這些六個抗體的氨基酸序列顯示于圖2A和B(分別為SEQ.ID NOS1-6和7-12)中。固相ELISA中所有mSIGNR1識別的抗體，觀察到與mDC-SIGN，人DC-SIGN的鼠同系物沒有交叉-活性。抗體用HA和HIS6標記表位。通過3T3EBNA細胞和通過鎳柱純化產(chǎn)生mSIGNR1和DC SIGNHIS。
實施例2-鑒定結(jié)合于細胞表面受體后內(nèi)在化的抗-mSIGNR1抗體篩選表達mSIGNR1的細胞系通過RT-PCR標準方法篩選一組鼠巨噬細胞細胞系(P388D1，1-13.35，WEHI-3和J774)來用于mSIGNR1的表達。根據(jù)mSIGNR1Genbank序列設計引物以及將這些引物應用在鼠器官的RT-PCR中。鑒定在mRNA水平表達mSIGNR1的細胞系以及通過FACS分析證實表面表達。5×105細胞與1μg抗-mSIGNR1抗體一起培養(yǎng)在冰上含有1％BSA和0.1％NaN3的PBS中15分鐘，條件不允許抗體內(nèi)在化。用含有1％BSA和0.1％NaN3的PBS沖洗兩次之后，結(jié)合的抗-mSIGNR1通過生物素?；目?HA(Roche)然后通過PE-共軛連接的鏈霉親和素(Becton Dickenson)測定以及利用FACS Calibur(Becton Dickinson)分析細胞。任選地，通過已知表達mSIGNR1的初級細胞諸如肝竇狀隙內(nèi)皮細胞測定內(nèi)在化。mSIGNR1在LSECs上的表達還可以如上所述通過FACS來證實，但是每一反應僅僅添加1×105個細胞。
內(nèi)在化的測定一旦mSIGNR1-表達細胞系或初級細胞類型被鑒定，則通過FACS分析評價抗體組的內(nèi)在化。為顯示內(nèi)在化是基于mSIGNR1的結(jié)合，不表達mSIGNR1的細胞系諸如JAWS1鼠樹狀細胞被包含在內(nèi)。利用生物素?；目?HA抗體然后PE-共軛鏈霉親和素在完整的和滲透性細胞上進行的抗-mSIGNR1檢測被如用DEC-205抗體所述的進行比較(Mahnke等，2000)。細胞系的1.5×106個細胞或初級細胞的3×105個細胞被與3μg的mSIGNR1一起培養(yǎng)在含有1％牛血清白蛋白(BSA)的PBS中4℃下20分鐘來允許抗體結(jié)合于沒有內(nèi)在化的表面。通過在4℃用含有1％BSA的PBS沖洗兩次除去未結(jié)合的抗體。每一樣品被分成3份。三分之一用4％仲甲醛固定且如上所述測定表面抗體。其余的三分之二進一步地在37℃培養(yǎng)30分鐘從而在固定之前內(nèi)在化。一半用抗-HA和鏈霉親和素直接測定，另一半通過將細胞與含有0.1％(vol/wt)皂苷(Sigma-Aldrich)的PBS一起培養(yǎng)進行滲透。通過由用固定和滲透性細胞的記錄中減去固定細胞中平均的熒光強度來計算內(nèi)在化抗體的量。30分鐘內(nèi)具有最高的內(nèi)在化百分比的抗體被選擇用于進一步地研究肽和抗體的連接。存在的無關兔scFv用作陰性對照，最近被表明結(jié)合mSIGNR1的市售的ER-TR9抗體(1Geijtenbeek等，2002)用作陽性對照。同樣，ER-TR9的Fab片段通過木瓜酶降解來產(chǎn)生并且測定內(nèi)在化來證實其二聚作用不是內(nèi)在化所必需的。如果需要，scFvs可以被轉(zhuǎn)化為Fab’2或IgG。
在其它的實施方案中，mSIGNR1文庫是內(nèi)在化抗體的組合，如James D.Marks小組的描述(Poul等，2000)。用于此實施方案的合適的方法描述如下。
從mSIGNR1噬菌體文庫選擇內(nèi)在化抗體如上所述測定的表達mSIGNR1的5×106個細胞與來自呈遞抗體片段融合到它們表面上的基因3蛋白的mSIGNR1文庫的1×1012個集落形成單位一起在4℃培養(yǎng)1.5個小時來使噬菌體非內(nèi)在化結(jié)合。噬菌體結(jié)合之后，用磷酸緩沖鹽水沖洗細胞5次來除去非-特異性或微弱結(jié)合的噬菌體。細胞然后在37℃培養(yǎng)15分鐘來內(nèi)吞表面-結(jié)合的噬菌體，但是避免噬菌體在細胞內(nèi)裂解。為除去結(jié)合于細胞表面的噬菌體，通過用低pH甘氨酸緩沖液沖洗細胞3次。然后細胞被胰蛋白酶化并且在用高pH三乙胺裂解之前用PBS沖洗。含有噬菌體的細胞裂解物用于感染大腸桿菌來制備用于下一輪篩選的噬菌體。篩選總共進行三輪。監(jiān)控每一輪中結(jié)合于細胞表面的噬菌體(第一次低pH沖洗中發(fā)現(xiàn)的)的滴度以及由細胞內(nèi)回收的噬菌體的數(shù)目。內(nèi)吞噬菌體數(shù)目的增加顯示內(nèi)在化噬菌體抗體的成功篩選。
為測定是否任意內(nèi)在化的scFv抗體片段都結(jié)合于mSIGNR1，利用robotic Qpix(Genetix)系統(tǒng)由第3輪中選擇500個克隆并且過夜培養(yǎng)在HiGrow振蕩器(Gene Machines)中的96-孔平皿的SB培養(yǎng)基中。第二天，平皿被減慢旋轉(zhuǎn)并且在利用robotic Genesis freedom 200(Tecan)系統(tǒng)的固相mSIGNR1ELISA中測定上清液。用1μgmSIGNR1/ml PBS在4℃隔夜來涂敷96-孔ELISA平皿。次日，平皿用1％BSA阻斷，然后用含有0.05％Tween的PBS沖洗3次。對照平皿用1％BSA涂布。含有抗體的上清液以在含有1％BSA中的0.05-5μg/ml濃度添加至mSIGNR1或單獨的BSA微孔中。室溫下在振蕩器上2小時，用含有0.05％吐溫的PBS沖洗平皿3次。為檢測結(jié)合的scFv，以1∶1,000的稀釋度在具有1％BSA的PBS中添加抗-HA抗體(12CA5鼠腹水，StrategicBiosolutions，DE)。室溫下在振蕩器上振蕩2小時后，再次沖洗平皿并添加堿性的-磷酸酶-共軛的抗-小鼠IgG(Sigma)2小時。沖洗3或更多次后，利用Sigma 104_底物測定結(jié)合的抗體。在不同的時間點用ELSA平皿讀數(shù)器(Molecular Devices)在OD405對平皿進行讀數(shù)。
在ELISA中產(chǎn)生陽性信號的克隆具有限制性酶降解譜的特性。利用Qiagen′s miniprep試劑盒分離DNA。用5U的EcoRII在37℃降解2μg的DNA兩個小時，然后將樣品在4％NuSieve瓊脂糖凝膠上跑電泳。比較譜圖以及純化少量的序列(約100-300μg)。scFvs在細菌的周質(zhì)間隙中正確地裝配并分泌。scFvs可分離自上清液或周質(zhì)間隙?？寺≡?升的SB中培養(yǎng)至0.8的OD600并用1mM的異丙基-p-D-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)在30℃誘導3-4小時來產(chǎn)生scFv的最佳量。為由周質(zhì)間隙分離單鏈抗體，細胞顆粒被再懸浮在添加的Complete Mini(Roche)蛋白酶抑制劑的冷PBS中并且利用Sonics Vibra-cell VC75進行超聲處理。細胞碎屑然后顆粒化并且上清液利用Akta FPLC(Pharmacia)上樣至Qiagen NiNTA柱。用咪唑洗脫抗體。這種方法通常產(chǎn)生約100-300μg的純化抗體/升。通過Sartorius Q15過濾器過濾除去內(nèi)毒素，通常產(chǎn)生按照LAL測驗(Bio Whittaker市售)測定的含有小于10U/ml內(nèi)毒素的抗體制劑。再次如上所述分析抗體的內(nèi)在化以及在固相ELISA中與重組mSIGNR1的結(jié)合。30分鐘內(nèi)具有最高內(nèi)在化百分比以及在固相ELISA中具有優(yōu)良信號(在1μg/ml 1小時后＞10D)的抗體被選擇用于制備肽-抗體構(gòu)建體。
實施例3-連接GAD肽與抗體載體和克隆策略鑒定最好的細菌產(chǎn)生的scFv后，使其轉(zhuǎn)化到哺乳動物表達系統(tǒng)中。哺乳動物表達可以進行肽的合適的二級修飾并且無內(nèi)毒素的產(chǎn)生。應用具有如圖3所示適合的限制性位點的載體(例如，US專利No.6,355,245中描述的，其內(nèi)容在此引入作為參考)。用Sfi由pRL4中的目的抗體切除DNA并插入到含有CMV啟動子和哺乳動物抗體前導序列的Apex 3P載體中。為插入編碼目的肽的核苷酸，由并不包含在抗體序列中的有效的位點(MCS＝Nae1，F(xiàn)se1，Xba1，EcoR1，Pst1，EcoRV，BSABI，BstX1，Not1，BsrBI，Xho，Pbv1O1，Sph1，Nsi1，Xba1)選擇限制性位點。通過在每一末端具有合適限制性位點的操縱子合成編碼肽的寡核苷酸并且利用T4DNA連接酶插入。產(chǎn)生的構(gòu)建體包含scFv繼之以通過選擇的限制性內(nèi)切酶測定的間隔臂，繼之以肽和HIS-標記(圖3)。在轉(zhuǎn)染DNA到393EBNA細胞來產(chǎn)生抗體之前利用標準方法確定序列。
肽的選擇雖然可以理解已知糖尿病自身抗原胰島素，hsp和GAD 65和67的任意肽可用于在此處描述的方法，以下實驗中選擇GAD用作肽。GAD反應的T細胞是在NOD鼠中檢測的第一個自身反應T細胞(Tisch等1993；Kaufman等，1993)且已被證明在疾病過程中是重要的。此外，人和鼠的GAD是95％同源的。脾NOD T細胞識別的表位已被廣泛地鑒定(Kaufman等，1993；Tisch等，1999；Zechel等，1998)且許多的免疫顯性肽在NOD鼠和T1DM病人中是類似的且已經(jīng)可交換地應用在體外T細胞試驗中(Kaufman等，1993)。NOD鼠中的初始免疫應答直接抗GAD65的羧基-末端區(qū)域中的限定區(qū)域(肽509-528，肽524-543(Kaufman等，1993)。隨后T細胞應答同樣抗200-300之間的其它區(qū)域以及其它的自身抗原。早期CD4 GAD65 T細胞表位中的一種，肽524-543(SRLSKVAPVIKARMMEYGGT(SEQ.ID NO13)，小鼠和人中的序列相同)和兩個后來出現(xiàn)的鼠GAD65表位，肽247-266(NMYAMLIARYKMFPEVKEKG(SEQ.ID NO14)，在人和鼠之間有1個氨基酸差異，下劃線)，以及肽290-309(ALGIGTDSVILIKCDERGK(SEQ.ID NO15)，鼠和人中的序列相同)被選選擇用作此實驗中的肽。所有的三個表位可誘導NOD脾細胞中的自發(fā)增殖反應。此外，用肽247-266以及肽290-309免疫肽已經(jīng)表明延緩NOD鼠中的糖尿病發(fā)病(Ma等，1997；Tisch等，1999；Zechel等，1998)。除了CD4T細胞表位，對CD8T細胞表位的耐受同樣被報道是重要的(Quinn等，2001；Bercovici等，2000)。作為陰性對照，抗體構(gòu)建體用母雞蛋溶菌酶肽116-124(KGTDVQAWI)(SEQ.IDNO16)產(chǎn)生。來自這些體外試驗的最有效的肽然后被已不同的組合與抗體構(gòu)建體連接以及在NOD糖尿病模型中進行測試。
實施例4-抗體-肽構(gòu)建體制備和純化為進行T-細胞實驗，在EBNA293人胚腎細胞中制備約300μg的各種抗體構(gòu)建體。細胞培養(yǎng)在具有10％FCS，2mM谷氨酸鹽和250U/mlG418(Sigma)的DMEM中。在T175瓶中用DNA利用Qiagen′sEffectine試劑根據(jù)生產(chǎn)商的說明轉(zhuǎn)染細胞。三天后將培養(yǎng)基換成無血清培養(yǎng)基。在第4和第8天收集上清液，通過離心除去細胞碎片并且將清澈的上清液上樣在利用Akta-FPLC的鎳-柱上。用咪唑洗脫抗體，透析到PBS中并且在SDS凝膠上電泳1μg驗證正確的大小。
實施例5-抗體肽構(gòu)建體通過LSEC的內(nèi)在化導致肽呈遞以及此呈遞對T細胞的作用肝竇狀隙細胞被肽-抗體構(gòu)建體體外靶向并且測定是否這些細胞可誘導來源于年輕的NOD或Balb Ic鼠的T細胞的表型變化。
鼠竇狀隙內(nèi)皮細胞的分離肝竇狀隙內(nèi)皮細胞分離自三周齡的NOD或4-6周齡的Balb/c小鼠。如Kretz-Rommel所描述的，通過首先用EGTA入口灌注來螯合鈣和疏松細胞間接觸繼之以用在Hank′s緩沖液中的0.05％膠原酶A灌注來降解胞間基質(zhì)獲得細胞(Kretz-Rommel & Boelsterli，1995)。切除小鼠的灌注的肝，用一對角形鉗子輕輕地進行。通過一系列金屬篩子(30，50，80網(wǎng)孔)過濾產(chǎn)生的粗細胞懸液來除去大的組織片段。在甲泛葡胺梯度(1.089g/cm3)上通過密度梯度離心由實質(zhì)細胞分離竇狀隙細胞，然后通過兩個沖洗步驟來除去細胞碎片(3Knolle等，1999)。在此，獲得了枯否細胞和肝竇狀隙細胞的混合物。對于FACS實驗這些是充分的，因為可利用識別枯否細胞而不識別肝竇狀隙細胞的F4/80抗體來區(qū)別肝竇狀隙內(nèi)皮細胞和枯否細胞。然而，為與T細胞和肽一起進行共培養(yǎng)，通過用PE-共軛的F4/80(BD Pharmingen)然后Miltenyi′s抗-PE微珠標記細胞以及利用MACS柱和分離器根據(jù)生產(chǎn)商的說明磁選標記的細胞來除去枯否細胞。剩余的細胞群體播種在96孔組織培養(yǎng)平皿上的補充有10％胎牛血清和2％谷氨酸鹽的Dulbecco改進的Eagle培養(yǎng)基(DMEM)。通過利用抗-mSIGNR1和抗-F4/80的表面標記FACS染色三天后研究細胞群體的純度?？莘窦毎喜淮嬖趍SIGNR1(1Geijtenbeek等，2002)。90％純度被認為足以繼續(xù)進行實驗。每一預計產(chǎn)生約2×107個細胞的試驗應用兩個小鼠肝(Knook & Sleyster，1976，extrapolated formouse)。
T細胞表型試驗T細胞試驗證明是否肽-抗體構(gòu)建體通過肝竇狀隙內(nèi)皮細胞導致肽的呈遞以及是否肽呈遞可誘導T細胞的表型變化。肝竇狀隙內(nèi)皮細胞以1×105細胞/孔的濃度培養(yǎng)在平底微量滴定板中。維持竇狀隙細胞三天后，可由3-周齡的和8-周齡NOD小鼠或4-6周齡Balb/c小鼠如上所述純化CD4+T細胞并且以104或105細胞/孔添加。同樣，以0.1-5pg/孔的濃度添加各抗體-肽構(gòu)建體。作為陽性對照，單獨地包括各GAD和對照肽。肽通過SynPep(Dublin，CA)合成。陰性對照孔包括單獨的T細胞或者單獨的肝竇狀隙細胞。
通過LSECs到T細胞的肽呈遞有4種可能的結(jié)果1)以TGF-P和/或IL-10和IL-4的產(chǎn)生或CD4+CD25+CD62L的表達為特征的調(diào)節(jié)T細胞的誘導，2)T細胞的缺失或3)完全的缺少或應答。4)同樣可以理解肽呈遞代替誘導耐受導致刺激Th1細胞產(chǎn)生IL-2。為區(qū)分這些可能性，在24和48小時收集培養(yǎng)物上清液(各100pl)并且如下所述分析細胞因子的產(chǎn)生。3-周齡的T細胞應答與8-周齡NOD小鼠以及與來源于Balb/c小鼠不顯示對GAD的自發(fā)應答的T細胞相比較。分析設置為一式三份并且重復兩次。因為應用T細胞的混合物，上清液中的細胞因子應答可能不容易被看到。然而，細胞的混合物反映體內(nèi)情況并且GAD-特異性T細胞應答被利用總脾細胞觀察到(Tisch等，1993)。
作為調(diào)節(jié)T細胞誘導更靈敏的測定，在培養(yǎng)物中3天后通過FACS分析評價細胞的典型表面標記諸如CD25，CD4和CD62L(Lafaille&lafaille，2002)的表達。所有的試劑獲自BD-Pharmingen。同樣，通過FACS分析IL-4的產(chǎn)生。如下所述的LSEC/肽暴露T細胞的潛在免疫調(diào)節(jié)特性的功能性試驗是在此系統(tǒng)耐受誘導的極限試驗。利用Roche′s細胞死亡ELISA試劑盒根據(jù)生產(chǎn)商的說明評價培養(yǎng)物上清液中肽通過LSEC呈遞誘導細胞死亡的可能性。
脾細胞和CD4+T細胞的分離如通常在我們的實驗室中進行的，在無菌環(huán)境中切除來自Balb/c小鼠NOD的脾并放置在PBS中。利用18-21規(guī)格針分離細胞，并且允許大的碎片沉淀。除去上清液并在200g離心7分鐘每一脾臟用5ml0.83％NH4Cl裂解紅血球。在PBS中沖洗細胞兩次然后再懸浮在培養(yǎng)基中。某些實驗中應用總的脾細胞。為進行其它的實驗，利用Miltenyi′s(Auburn，CA)CD4+T細胞分離試劑盒根據(jù)的說明分離CD4+T細胞。不同細胞群體的磁性分離是本領域技術人員公知的。在一個過程中，分離基于非-CD4+T細胞利用抗CD8a，CDI 1b，CD45R，DX5和Ter-1 19的生物素-共軛的單克隆抗體的損耗。通過FITC-共軛抗-CD4，PE-共軛的抗-CD8，APC-共軛的抗-CD11 b和cy-5-共軛的CD45R的混合物的染色進行評價分離群體的純度。期望的純度為90-95％與70％產(chǎn)率。因為至少可從一個小鼠脾臟中獲得1×108個細胞并且可獲得約25％的脾細胞為CD4+，約1.75×107的細胞，對175個96-孔微量滴定板孔是足夠的。
細胞因子產(chǎn)生的測定通過如(Kretz-Rommel & Rubin，1997)描述的標準三明治ELISA測定T細胞/LSEC共培養(yǎng)物上清液中IL-10，TGF-P，IFN-γ，IL-4和IL-2的存在。所有的抗體都獲自BD Pharmingen。細胞因子捕獲抗體被涂敷在在PBS中的平皿上4℃過夜。用PBS/0.05％吐溫沖洗3次后，添加培養(yǎng)物上清液和標準曲線的小鼠重組細胞因子并且在振蕩器上室溫下培養(yǎng)2個小時。再次沖洗平皿并且用堿性的-磷酸酶共軛的抗-細胞因子抗體測定結(jié)合的細胞因子。沖洗3次后，添加Sigma 104TM底物以及不同的時間點在OD405用ELISA平皿讀數(shù)器(Molecular Devices)對平皿進行讀數(shù)。
實施例6-評價是否暴露于在LSECs上呈遞的GAD肽的T細胞可隨后預防自身反應T細胞通過專門APCs呈遞的GAD的激活在進一步的實驗中，測試是否暴露于肝竇狀隙內(nèi)皮細胞上的肽三天時間的T細胞，可負調(diào)節(jié)自身反應T細胞通過脾專門APCs上呈遞的肽進行的激活。具有體外調(diào)節(jié)特性的T細胞誘導的可能性已被大量的實驗室證明(Wakkach等，2001；Barrat等，2002；Thorton & Shevach，1998)。通過添加調(diào)節(jié)T細胞到通常觀察到免疫刺激的培養(yǎng)系統(tǒng)中可測試免疫抑制的特性。將GAD肽添加至來自含有APCs和T細胞的7周齡NOD小鼠的脾臟細胞提供了具有強增殖應答的免疫刺激系統(tǒng)。調(diào)節(jié)的T細胞的添加消除了這些應答。添加105或106脾細胞，0.1，1，或10μm肽的包含T細胞的每孔暴露于LSEC和肽-連接的抗體。對照孔包括脾細胞與單獨的肽和單獨的LSEC+T細胞。此外，為排除假定的調(diào)節(jié)T細胞的增殖的顯著影響，對照孔同樣包含照射的脾細胞(600RAD，在Joe Aguilera的UCSD照射裝置上進行)和暴露于LSEC和肽-抗體構(gòu)建體之前的T細胞。照射的脾細胞可呈遞抗原，但是不增殖。在72小時培養(yǎng)期的最后16小時期間將1μCi3H-胸苷添加至各孔來標記新合成的DNA作為增殖的讀出數(shù)據(jù)。利用Packard′s通用細胞收集器收集細胞以及利用Topcount(Packard)評價結(jié)合的3H-胸苷。如果含有脾細胞和暴露于LSEC+肽之前的T細胞的培養(yǎng)物中3H-胸苷的結(jié)合與脾細胞培養(yǎng)物相比降低了，則T細胞已經(jīng)成功地用調(diào)節(jié)特性誘導。同樣可測試是否肽-共軛抗-mSIGNR1抗體可誘導NOD小鼠中的調(diào)節(jié)T細胞，以及是否疾病可以被中止。
實施例7利用重組噬菌體技術鑒定小鼠抗人L-SIGN抗體。通過WO03/025202中公開的方法來源于用重組人SIGN免疫小鼠的重的和輕鏈組合的小鼠文庫(IgG1k和IgG2ak)，其內(nèi)容在此引入作為參考。一旦制備成，文庫首先在人DC-SIGN上組合來除去與DC-SIGN雜交反應的抗體。未結(jié)合的上清液被用于篩選僅僅與L-SIGN反應的克隆。兩個文庫(IgG1&IgG2a)的總共95個菌落(36/輪)被誘導并且通過捕獲ELISA測定抗體產(chǎn)生以及它們與L-SIGN的反應性。簡要地，抗-人Fc(Caltag)被以500ng/mI涂敷在平皿上過夜。用含有1％BSA的PBS然后添加2μg/ml的重組L-SIGN阻斷平皿。用PBS沖洗平皿后，添加上清液。在室溫下培養(yǎng)12小時后，沖洗平皿三次并且添加堿性的-磷酸酶-共軛的抗-Fab抗體持續(xù)2小時時間。利用ELISA讀數(shù)器(MolecularDevices)評價SigmaS底物添加后的信號。
大多數(shù)的克隆顯示出在噬菌體上與抗體具有良好的結(jié)合(OD405＞1.0)。來自IgG1和IgG2a文庫的若干克隆與人L-SIGN顯示出陽性反應。結(jié)果顯示在圖4和5中圖4顯示IgG1克隆與人L-SIGN；圖5顯示IgG2a克隆與人L-SIGN的反應性。
實施例8為鑒定僅與人L-SIGN反應的克隆，選擇所有來自實施例7具有高于背景OD值五倍的克隆來通過ELISA測試它們與人DC-SIGN的反應性?？?人Fc(Caltag)被以500ng/ml涂敷在平皿上過夜。用含有1％BSA的PBS然后添加2μg/ml的重組DC-SIGN阻斷平皿。用PBS沖洗平皿后，添加上清液。在室溫下培養(yǎng)12小時后，沖洗平皿三次并且添加堿性的-磷酸酶-共軛的抗-Fab抗體持續(xù)2小時時間。利用ELISA讀數(shù)器(Molecular Devices)評價SigmaS底物添加后的信號。
發(fā)現(xiàn)來自IgG1文庫的十個克隆和來自IgG2a文庫的三個克隆僅與人L-SIGN反應(OD值高于DC-SIGN五到十倍)。結(jié)果顯示在圖6和7中圖6顯示IgG1陽性克隆與L-SIGN的反應；圖7顯示IgG2a克隆與L-SIGN和DC-SIGN的反應。
實施例9對如實施例8中鑒定的13個僅僅與人L-SIGN反應的克隆和9個與L-SIGN和DC-SIGN二者強烈反應的克隆進行測序來測定獨特克隆的數(shù)目。
通過本領域技術人員已知的方法測定序列。這些克隆的序列顯示在圖8和9中；重鏈克隆的序列顯示在圖8A-8C(SEQ.ID NOS.17-36)中；輕鏈克隆的序列顯示在圖9A-9B(SEQ.ID NOS37-55)中。
測序結(jié)果證明與輕鏈相比重鏈的組更多。抗體克隆的多樣性同樣通過不同的輕鏈與相同重鏈的交叉配對被增強?？偣参鍌€獨特的與L-SIGN反應的克隆被鑒定且克隆基于它們氨基酸序列的相似性被分組(參見下表1)。
表1基于氨基酸序列相似性對與人L-SIGN反應的抗體克隆進行分組

a僅僅與L-SIGN反應的抗體克隆b與L-和DC-SIGN都反應的抗體克隆c2.1...2.3表示相似的輕鏈但是獨特的重鏈選擇用于測序的克隆與L-SIGN和DC-SIGN的反應性(OD值)列于下表2中。
表2

*＝選擇用于L-SIGN和DC-SIGN測序的那些克隆如圖8所示，結(jié)合于人DC-SIGNR的抗體的重鏈CDR3區(qū)域被發(fā)現(xiàn)具有下列氨基酸序列中的一個LGGL(SEQ.ID NO56)；EFTTKAMD(SEQ.ID NO57)；GLFYGYAWFN(SEQ.ID NO58)。如圖9所示，結(jié)合于人DC-SIGNR的抗體的輕鏈CDR3區(qū)域具有下列氨基酸序列中的一個QQYSSYPLT(SEQ.ID NO59)；QQSNEDPRT(SEQ.ID NO60)；QQNNEDPYT(SEQ.ID NO61)；LQNNEDPYT(SEQ.ID NO62)。
實施例10利用如上所述實施例7中的方法檢驗來自上面實施例7的另外的克隆結(jié)合于L-SIGN的能力。通過本領域已知的技術進行測序。這些另外克隆的序列顯示在圖10中(SEQ.ID NOS63-82)。如圖10所示，結(jié)合于人DCSIGNR的抗體的五個其它的重鏈CDR3區(qū)域被發(fā)現(xiàn)具有下列氨基酸序列中的一個PSDNSYAWFA(SEQ.ID NO83)；QATTTAFD(SEQ.ID NO84)；TATALSTMD(SEQ.ID NO85)；NDYYWGFG(SEQ.ID NO86)；TATALYTMD(SEQ.ID NO87)；和EFTTKALD(SEQ.ID NO88)。這些結(jié)合于人DC-SIGNR的克隆的CDR2區(qū)域被發(fā)現(xiàn)具有下列氨基酸序列之一MIDPSNSEARLNQRFKD(SEQ.ID NO89)；TISSGGSFTFYPDSVKG(SEQ.ID NO90)；NIDPYYGGTSYNQKFKG(SEQ.ID NO91)；VIWRGGNTDYNAAFMS(SEQ.ID NO92)；NFDPYYGVITYNQKFKG(SEQ.ID NO93)；NIDPYYGGSSYNQKFKG(SEQ.ID NO94)；和TISSGGSFTYYPDNVKG(SEQ.ID NO95)。
表3顯示了基于它們與表達L-SIGN的細胞反應性選擇的其它IgG1 k抗體克隆表3


表4顯示另外的1gG1k抗體克隆與表達LSIGN的細胞(幾何平均熒光)以及重組L-SIGN和DC-SIGN蛋白(OD值)的反應性表4

如圖11所示，結(jié)合人DC-SIGNR的其它克隆被鑒定(SEQ.ID NOS96-115)。這些克隆被發(fā)現(xiàn)具有有下列氨基酸序列之一的IgG1輕鏈CDR3區(qū)域QYHRSPQT(SEQ.ID NO116)；CQQFTSSPS(SEQ.IDNO117)；QQYSGYPLT(SEQ.ID NO118)；QQYSGYPGT(SEQ.DNO119)；HQYHRSPPMT(SEQ.ID NO120)；QQRSSYPFT(SEQ.IDNO121)；QQYSSYPFT(SEQ.ID NO122)；QQNNEDPPT(SEQ.IDNO123)；QQYSGYSLT(SEQ.ID NO124)；QQYSGYPLMLT(SEQ.ID NO125)；QQYGGYPLT(SEQ.ID NO126)；QQNNEDPYT(SEQ.ID NO127)；QQYSGSPLT(SEQ.ID NO128)。這些結(jié)合于人DC-SIGNR的克隆的CDR2區(qū)域被發(fā)現(xiàn)具有下列氨基酸序列之一STSNLASG(SEQ.ID NO129)；LASNLESG(SEQ.ID NO130)；STSNQAPG (SEQ.ID NO131)；WASTRHTG(SEQ.ID NO132)。
表5表示基于它們與表達L-SIGN的細胞的反應性選擇的其它IgG12ak抗體克隆表5


*這些序列含有終止密碼子表6顯示另外的IgG2ak抗體克隆與表達LSIGN的細胞(幾何平均熒光)以及重組L-SIGN和DC-SIGN蛋白(OD值)的反應性表6

如圖12所示，結(jié)合人DC-SIGNR的其它重鏈克隆被鑒定(SEQ.IDNOS133-154)。這些克隆被發(fā)現(xiàn)具有下列氨基酸序列之一的IgG2ak重鏈CDR3區(qū)域TREFTTKALD(SEQ.ID NO155)；TREFTTKAMD(SEQ.ID NO156)；ARTATALYTMD(SEQ.ID NO157)；LRTLPCI(SEQ.ID NO158)；SREFTTKAMD(SEQ.ID NO159)；ARQLXXYFXMD(SEQ.ID NO160)。這些結(jié)合于人DC-SIGNR的克隆的CDR2區(qū)域被發(fā)現(xiàn)具有下列氨基酸序列之一TISSGGSFTYYPDNVKG(SEQ.IDNO161)；NIDPYYDSISYNQKFKG(SEQ.ID NO162)；NFDPYYGVITYNQKFKG(SEQ.ID NO163)；TISSGGSYTYYPDNVKG(SEQ.IDNO164)；XFXTDW.FYXT(SEQ.ID NO165)；NFDPYYGVISYNQKFKG(SEQ.ID NO166)；TISSGGGFTYYPDNVKG(SEQ.ID NO167)；XIYPGTDNTYYNEXFKG(SEQ.ID NO168)。
如圖13所示，結(jié)合人DC-SIGNR的其它輕鏈克隆被鑒定(SEQ.IDNOS169-189)。這些克隆被發(fā)現(xiàn)具有下列氨基酸序列之一的IgG2ak輕鏈CDR3區(qū)域QQNNEDPYT(SEQ.ID NO190)；SGYPLTFGS(SEQ.ID NO191)；HRSPPMTFG(SEQ.ID NO192)；QQNNEDPFT(SEQ.ID NO193)；YSGYPLTFG(SEQ.ID NO194)；NTLPLTFG(SEQ.ID NO195)；QQSKEVPWT(SEQ.ID NO196)；LQNNEDPYTF(SEQ.ID NO197)。這些結(jié)合于人DC-SIGNR的克隆的CDR2區(qū)域被發(fā)現(xiàn)具有下列氨基酸序列之一LASNLES(SEQ.ID NO198)；LASNLEF(SEQ.ID NO199)；NLASGVP(SEQ.ID NO200)；NLASGV(SEQ.ID NO201)；AASNQGS(SEQ.ID NO202)。
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上述描述不應該理解為限制，而是僅僅作為優(yōu)選實施方案的實例。本領域技術人員將預想本發(fā)明范圍和精神內(nèi)的其它修飾。
很清楚可以對本發(fā)明公開的實施方案進行多種修飾。例如本領域技術人員將明白，本發(fā)明描述的特異性序列可以稍微改變，只要不必然相反地影響抗體或者抗體片段的功能。例如，可以頻繁地進行抗體序列中單個或者多個氨基酸的取代，只要不破壞抗體或者片段的功能。因此，應該理解對本發(fā)明描述的特異性抗體具有大于70％同源性程度的抗體在本發(fā)明公開的范圍內(nèi)。在尤其有用的實施方案中，對特異性抗體具有大于約80％同源性的抗體也在本發(fā)明考慮的范圍內(nèi)。在其它的有用的實施方案中，對特異性抗體具有大于約90％同源性的抗體也在本發(fā)明考慮的范圍內(nèi)。因此，上述描述不應該理解為限制，而是僅僅作為優(yōu)選實施方案的例證。本領域技術人員將預想本發(fā)明公開的范圍和精神內(nèi)的其它修飾。
權利要求
1.治療自身免疫性疾病的方法，包括提供含有連接抗原遞呈細胞受體的抗體的自身抗原的抗體/自身抗原構(gòu)建體；以及給受試者施用該抗體/自身抗原構(gòu)建體。
2.治療糖尿病的方法，包括提供含有選自如下的自身抗原的抗體/自身抗原構(gòu)建體谷氨酸脫羧酶(GAD)，GAD的表位，胰島素，胰島素的表位，熱休克蛋白(HSP)，HSP的表位以及與抗原遞呈細胞受體的抗體連接的β細胞抗原；以及給受試者施用抗體/自身抗原構(gòu)建體。
3.權利要求1或者2所述的方法，其中提供抗體/自身抗原構(gòu)建體的步驟包括提供含有選自如下的抗原遞呈細胞的受體的抗體的抗體/自身抗原構(gòu)建體樹狀細胞，巨噬細胞，內(nèi)皮細胞枯否細胞以及B細胞。
4.權利要求1或者2所述的方法，其中提供抗體/自身抗原構(gòu)建體的步驟包括提供含有選自如下的受體的抗體的抗體/自身抗原構(gòu)建體DEC-205，甘露糖受體，DC-SIGN，DC-SIGNR，MHC，toll受體，langerin，脫唾液酸糖蛋白受體，β-葡聚糖受體，C-型凝集素受體以及樹狀細胞免疫受體。
5.權利要求1或者2所述的方法，其中提供抗體/自身抗原構(gòu)建體的步驟包括提供含有選自如下的抗原-內(nèi)在化受體的抗體的抗體/自身抗原構(gòu)建體DEC-205，甘露糖受體，DC-SIGN以及DC-SIGNR。
6.權利要求1所述的方法，其中提供抗體/自身抗原構(gòu)建體的步驟包括提供含有選自如下的自身抗原的抗體/自身抗原構(gòu)建體谷氨酸脫羧酶(GAD)，GAD的表位，胰島素，胰島素的表位，熱休克蛋白(HSP)，HSP的表位以及β-細胞抗原。
7.權利要求1或者2所述的方法，其中抗體識別DC-SIGNR，或者DC-SIGNR的變體。
8.抗體/肽構(gòu)建體，含有與肽連接的抗原遞呈細胞上受體的抗體。
9.權利要求8所述的抗體/肽構(gòu)建體，其中肽是自身抗原。
10.權利要求8所述的抗體/肽構(gòu)建體，其中抗體是選自如下的抗原遞呈細胞上受體的抗體樹狀細胞，巨噬細胞，內(nèi)皮細胞枯否細胞以及B細胞。
11.權利要求8所述的抗體/肽構(gòu)建體，其中抗體將選自如下的受體的抗體DEC-205，甘露糖受體，DC-SIGN，DC-SIGNR，MHC，toll受體，langerin，脫唾液酸糖蛋白受體，β-葡聚糖受體，C-型凝集素受體以及樹狀細胞免疫受體。
12.權利要求9所述的抗體/肽構(gòu)建體，其中自身抗原選自谷氨酸脫羧酶(GAD)，GAD的表位，胰島素，胰島素的表位，熱休克蛋白(HSP)，HSP的表位以及β-細胞抗原。
13.權利要求8所述的抗體/肽構(gòu)建體，進一步地含有與抗體連接的毒素。
14.權利要求13所述的抗體/肽構(gòu)建體，其中與抗體連接的毒素是腫瘤細胞毒素。
15.組合物，含有權利要求8的抗體/肽構(gòu)建體以及藥用載體。
16.重組產(chǎn)生工程抗體的方法，包括將抗原遞呈細胞受體的抗體與自身抗原連接。
17.權利要求16所述的方法，其中自身抗原與選自如下的抗原遞呈細胞的受體的抗體相連樹狀細胞，巨噬細胞，內(nèi)皮細胞枯否細胞以及B細胞。
18.權利要求16所述的方法，其中自身抗原與選自如下的受體的抗體相連DEC-205，甘露糖受體，DC-SIGN，DC-SIGNE，MHC，toll受體，langerin，脫唾液酸糖蛋白受體，β-葡聚糖受體，C-型凝集素受體以及樹狀細胞免疫受體。
19.權利要求16所述的方法，其中自身抗原選自谷氨酸脫羧酶(GAD)，GAD的表位，胰島素，胰島素的表位，熱休克蛋白(HSP)，HSP的表位以及β細胞抗原。
20. DC-SIGNR的抗體，其參與DC-SIGNR表達細胞與ICAM-表達細胞的相互作用。
21.組合物，含有權利要求20的抗體以及藥用載體。
22.疫苗，含有權利要求20的抗體。
23. DC-SIGNR的抗體，其阻止病毒進入肝細胞。
24.疫苗，含有權利要求23的抗體。
25.組合物，含有權利要求23的抗體以及藥用載體。
全文摘要
抗原遞呈細胞的抗體可用于干預抗原遞呈細胞和免疫細胞，包括T細胞的相互作用。肽可以連接所述抗體由此產(chǎn)生針對這種肽的免疫應答。優(yōu)選地，與抗體連接的肽與自身免疫有關。
文檔編號C07K16/10GK1756564SQ200480005981
公開日2006年4月5日 申請日期2004年3月4日 優(yōu)先權日2003年3月4日
發(fā)明者凱瑟琳·S·波迪什, 安克·克雷茨－羅梅爾, 納溫·達卡帕格利 申請人:亞歷森制藥有限公司