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抗原的有序分子呈遞,制備及使用的方法

文檔序號(hào):1078658閱讀:1704來(lái)源:國(guó)知局
專利名稱:抗原的有序分子呈遞,制備及使用的方法
背景技術(shù)
現(xiàn)在利用重組DNA技術(shù)(也就是說(shuō),遺傳工程),通過(guò)產(chǎn)生缺失或突變變體,能夠進(jìn)行減毒病毒的特異性設(shè)計(jì)。例如,已經(jīng)證明給藥一種具有nef基因內(nèi)部缺失的工程猴免疫缺陷病毒(SIV),將保護(hù)短尾猿抗致病性SIV菌株的繼發(fā)性感染(Daniel等,科學(xué)(Science)2581938-1941(1992))。然而,在給藥減毒SIV的動(dòng)物中,獲得性免疫缺陷綜合癥(AIDS)一樣癥狀的進(jìn)展,提出了安全性憂慮(Babe等,科學(xué)(Science)2671820-1825(1995))。
作為備選的方法,減毒的病毒或細(xì)菌可以作為那些被認(rèn)為太不安全以致不能以減毒的形式給藥的病原體的抗原編碼基因的載體(例如,人免疫缺陷病毒(HIV))。一旦抗原編碼基因被投遞給宿主,此抗原就在原位合成。牛痘及相關(guān)的禽痘病毒已經(jīng)在臨床前及臨床研究中被用作各種基因的載體(例如,Shen等,科學(xué)(Science)252440(1991))。這種接種策略的一個(gè)不利之處是它不能模擬病毒粒子的表面,因?yàn)橹亟M蛋白在宿主細(xì)胞的表面表達(dá)。此外,正如威脅生命的散布性牛痘感染所證明的一樣,在無(wú)免疫應(yīng)答的個(gè)體中可能會(huì)發(fā)展并發(fā)癥(Redfield,新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志(N.Eng.J.Med.)316673((1998))。
第四種接種方法涉及病原體的分離成分的使用,這些成分或者從體外培養(yǎng)的病原體純化(例如,流感病毒凝集素或神經(jīng)氨酸酶),或者在異源表達(dá)單個(gè)病毒蛋白之后純化(例如,乙肝表面抗原)。例如,重組的、突變的毒素(已解毒)用于接種,抗白喉、破傷風(fēng)、霍亂和百日咳毒素(Levine等,New generation vaccines,2ndedn.,MarcelDekker,Inc.,New York),并作為一種誘導(dǎo)抗HIV的中和抗體的手段對(duì)HIV重組蛋白(gp120和全長(zhǎng)的gp160)做了評(píng)價(jià),結(jié)果令人失望(Connor等,病毒學(xué)雜志(J.Virol.)721552(1998))。最近,用可溶性寡聚gp160獲得了有希望的結(jié)果,這種寡聚gp160能夠誘導(dǎo)CTL應(yīng)答,并且引起具有中和活性的抗HIV-1分離物的抗體(Van Cortt等,病毒學(xué)雜志(L.Virol.)714319(1997))。此外,在其中將已知的抗原B-或T-細(xì)胞表位偶聯(lián)到設(shè)計(jì)要通過(guò)刺激T-細(xì)胞輔助作用而增強(qiáng)此表位的免疫原性的載體分子上的肽疫苗,也可使用。然而,這種方法的一個(gè)重要問(wèn)題是總體上,它提供一個(gè)針對(duì)此蛋白的有限的免疫應(yīng)答。而且,必須為不同的MHC單倍型單獨(dú)設(shè)計(jì)疫苗。這類疫苗的最嚴(yán)重的憂慮是保護(hù)性抗病毒抗體識(shí)別這些肽所不能模擬的復(fù)雜的三維結(jié)構(gòu)。
一種更新的接種策略是DNA疫苗的使用(Donnelly等,免疫學(xué)年評(píng)(Ann.Rev.Immunol.)15617(1997)),這種策略可以產(chǎn)生MHC-I限制性CTL應(yīng)答(不使用活載體)。這種策略可通過(guò)將與相同病毒的許多毒株有關(guān)的保守性內(nèi)部蛋白的表位作為靶位,提供抗一種病毒之不同毒株的更廣泛的保護(hù)作用。因?yàn)樗a(chǎn)的蛋白具有哺乳動(dòng)物的翻譯后修飾、構(gòu)象和寡聚反應(yīng),所以它更可能與病毒感染所產(chǎn)生的野生型蛋白相似或相同,而不是更可能與重組或化學(xué)修飾的蛋白相似或相同。然而,這種差別可能成為應(yīng)用細(xì)菌抗原的不利之處,因?yàn)榉翘烊坏姆g后修飾可能導(dǎo)致免疫原性的降低。此外,病毒表面蛋白在缺少基質(zhì)蛋白的條件下不是高度有組織的。
除了傳染病預(yù)防的應(yīng)用之外,疫苗技術(shù)現(xiàn)在正被用來(lái)解決與過(guò)敏反應(yīng)相關(guān)的免疫問(wèn)題。在過(guò)敏性個(gè)體中,IgE同種型的抗體在對(duì)特定抗原(過(guò)敏原)的不當(dāng)體液免疫應(yīng)答中產(chǎn)生。利用過(guò)敏反應(yīng)免疫療法對(duì)過(guò)敏反應(yīng)進(jìn)行治療,必需每周給藥持續(xù)地增大的劑量的特定過(guò)敏原長(zhǎng)達(dá)3-5年時(shí)間。可能是產(chǎn)生了在過(guò)敏原與肥大細(xì)胞上的IgE抗體反應(yīng)之前就在鼻或呼吸分泌液或在膜中截取過(guò)敏原的“封閉性”IgG抗體。然而,在IgG滴度和癥狀減輕之間不存在恒定的關(guān)系。目前,這是一種極其耗費(fèi)時(shí)間和成本的方法,僅被考慮用于患有嚴(yán)重癥狀每年超過(guò)一段被延長(zhǎng)的時(shí)期的患者。
非常確定的是單獨(dú)給藥純化的蛋白通常不足以引起一個(gè)強(qiáng)的免疫應(yīng)答;分離的抗原通常必須與被稱為佐劑的輔助物質(zhì)一起給藥。在這些佐劑中,已給藥的抗原避免了快速降解,而佐劑提供抗原的一個(gè)低水平的膨脹-釋放。
不同于分離的蛋白,病毒在缺乏任何佐劑的條件下無(wú)論有或沒(méi)有T-細(xì)胞輔助,都誘導(dǎo)迅速而有效的免疫應(yīng)答(Bachmann & Zinkernagel,免疫學(xué)年評(píng)(Ann.Rev.Immunol.)15235-270(1997))。雖然病毒通常含有少數(shù)蛋白,但是它們能夠觸發(fā)比其分離成分強(qiáng)烈得多的免疫應(yīng)答。對(duì)于B細(xì)胞應(yīng)答,已知病毒免疫原性的一個(gè)至關(guān)緊要的因子,是表面表位的重復(fù)性和有序性(Bachmann & Zinkernagel,今日免疫學(xué)(Immunol.Today)17553-558(1996))。許多病毒呈現(xiàn)準(zhǔn)晶體表面,此表面呈現(xiàn)一個(gè)有效交聯(lián)B細(xì)胞上表位-特異性免疫球蛋白的表位的規(guī)則排列。這種B細(xì)胞表面免疫球蛋白的交聯(lián),是一個(gè)直接誘導(dǎo)細(xì)胞周期進(jìn)展和IgM產(chǎn)生的強(qiáng)活化信號(hào)。進(jìn)一步地,這些被激活的B細(xì)胞能夠活化輔助T細(xì)胞,這些活化的輔助T細(xì)胞然后又誘導(dǎo)B細(xì)胞中從IgM到IgG抗體生產(chǎn)的轉(zhuǎn)變,以及長(zhǎng)壽的記憶B細(xì)胞——這是接種的目標(biāo)(Bachmann & Zinkernagel,免疫學(xué)年評(píng)(Ann.Rev.Immunol.)15235-270(1997))。病毒的結(jié)構(gòu)甚至與自身免疫疾病中抗-抗體的產(chǎn)生相聯(lián)系,并作為對(duì)病原體天然應(yīng)答的一部分(參見(jiàn)Fehr,T.,等,實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志(J.Exp.Med.)1851785-1992(1997))。因此,病毒顆粒上組織在一個(gè)有序的和重復(fù)的排列中的抗原,具有高度免疫原性,因?yàn)樗鼈兡苤苯踊罨疊細(xì)胞。
除了強(qiáng)的B細(xì)胞應(yīng)答之外,病毒顆粒還能誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T細(xì)胞應(yīng)答的產(chǎn)生,這是免疫系統(tǒng)的另一個(gè)重要途徑。這些細(xì)胞毒性T細(xì)胞對(duì)于非細(xì)胞病變性病毒,例如HIV或乙型肝炎病毒的消除,以及腫瘤的根除是特別重要的。細(xì)胞毒性T細(xì)胞不識(shí)別天然的抗原,而是識(shí)別它們的與MHCI類分子結(jié)合的降解產(chǎn)物(Townsend & Bodmer,免疫學(xué)年評(píng)(Ann.Rev.Immunol.)7601-624(1989))。巨噬細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞能夠攝取和加工外源的病毒顆粒(而不是它們的可溶性分離成分),并將所產(chǎn)生的降解產(chǎn)物呈遞給細(xì)胞毒性T細(xì)胞,導(dǎo)致其活化和增殖(Kovacsovics-Bankowski等,美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)904942-4946(1993);Bachmann等,歐洲免疫學(xué)雜志(Eur.J.Immunol.)262595-2600(1996))。
病毒顆粒作為抗原,相對(duì)于其分離成分表現(xiàn)出兩個(gè)優(yōu)勢(shì)(1)因?yàn)樗鼈兏叨戎貜?fù)的表面結(jié)構(gòu),它們能夠直接活化B細(xì)胞,產(chǎn)生高抗體滴度和持久的B細(xì)胞記憶;和(2)是病毒顆粒而不是可溶性蛋白,能夠誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T細(xì)胞應(yīng)答,即使是病毒顆粒沒(méi)有傳染性而且缺乏佐劑。
數(shù)種新的疫苗策略使用病毒的固有的免疫原性。一些這樣的方法集中于病毒顆粒的特定性質(zhì);例如,參見(jiàn)Harding,C.V.和Song,R.(免疫學(xué)雜志(J.Immunology)1534925(1994)),公開(kāi)了一種由乳膠珠子和抗原所組成的疫苗;Kovacscovics-Bankowski,M.,等,(美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊(Proc.Proc.Natl.Acad.Sci.USA)904942-4946(1993)),公開(kāi)了一種由氧化鐵珠子和抗原所組成的疫苗;Kossovsky,N.,等的美國(guó)專利5,334,394號(hào),公開(kāi)了用抗原包被的核心顆粒;美國(guó)專利5,871,747號(hào),公開(kāi)了表面攜帶一個(gè)或多個(gè)共價(jià)結(jié)合于其上的蛋白的合成聚合物顆粒;和一個(gè)至少部分覆蓋所說(shuō)顆粒的表面、具有一個(gè)非共價(jià)結(jié)合的包被的核心顆粒,以及至少一個(gè)與所說(shuō)的被包被的顆粒接觸的生物活性物質(zhì)。(例如,參見(jiàn)WO/94/15585)。
然而,這些病毒模擬系統(tǒng)的一個(gè)不利之處是它們不能再造在病毒表面所發(fā)現(xiàn)的有序的抗原呈遞。已經(jīng)發(fā)現(xiàn),以隨機(jī)取向偶聯(lián)到一個(gè)表面上的抗原誘導(dǎo)CTL應(yīng)答,而沒(méi)有或僅有微弱的B-細(xì)胞應(yīng)答。對(duì)于一種有效的疫苗,免疫系統(tǒng)的兩條途徑都必須被強(qiáng)烈活化,正如上面及Bachmann & zinkernagel,免疫學(xué)年評(píng)(Ann.Rev.Immunol.)15235(1997)所述。
在另一個(gè)實(shí)例中,重組病毒被用于抗原投遞。已經(jīng)發(fā)現(xiàn),含有一種被融合到衣殼蛋白的抗原的絲狀噬菌體病毒,是高度免疫原性的(參見(jiàn)Perham R.N.,等,歐洲微生物學(xué)會(huì)微生物學(xué)評(píng)論(FEMS Microbiol.Rev.)1725-31(1995);Willis等,基因(Gene)128835-844(1995))。然而,當(dāng)融合蛋白以高水平表達(dá)時(shí),此系統(tǒng)限制于非常小的肽(5或6個(gè)氨基酸殘基)(Iannolo等,分子生物學(xué)雜志(J.Mol.Biol.)248835-844(1995)),或者限于大蛋白的低水平表達(dá)(de laCruz等,生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.) 2634318-4322(1998))。對(duì)于小肽,到目前為止僅觀察到CTL應(yīng)答,而沒(méi)有或僅有微弱的B-細(xì)胞應(yīng)答。
在又一個(gè)系統(tǒng)中,重組甲病毒被推薦作為一種抗原投遞手段(參見(jiàn)美國(guó)專利5,766,602號(hào);5,792,462號(hào);5,739,026號(hào);5,789,245號(hào)和5,814,482號(hào))。到目前為止,所描述的重組病毒系統(tǒng)的問(wèn)題,包括異源蛋白在病毒表面低密度表達(dá)和/或成功而重復(fù)地為不同的用途創(chuàng)造新而且不同的重組病毒的困難。
在一個(gè)進(jìn)一步的發(fā)展中,病毒-樣顆粒(VLP),因?yàn)樗鼈兊慕Y(jié)構(gòu)性質(zhì)以及它們沒(méi)有傳染性的性質(zhì),正被用于疫苗生產(chǎn)領(lǐng)域。VLP是按對(duì)稱方式,用許多一種或多種類型的蛋白分子構(gòu)建的超分子結(jié)構(gòu)。它們?nèi)狈Σ《净蚪M,因此沒(méi)有傳染性。VLP??赏ㄟ^(guò)異源表達(dá)而大量生產(chǎn),并且容易純化。
VLP的實(shí)例包括乙型肝炎病毒(Ulrich,等,病毒研究(Virus Res.)50141-182(1998)),麻疹病毒(Warnes,等,基因(Gene)160173-178(1995)),辛德比斯病毒、輪狀病毒(美國(guó)專利5,071,651和5,374,426號(hào)),口蹄疫病毒(Twomey等,疫苗(Vaccine)131603-1610,(1995)),諾沃克病毒(Jiang,X.,等,科學(xué)(Science)2501580-1583(1990);Matusui,S.M.,等,臨床研究雜志(J.Clin.Invest.) 871456-1461(1991))的衣殼蛋白,逆轉(zhuǎn)錄病毒GAG蛋白(PCT專利申請(qǐng)?zhí)朩O96/30523),逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子Ty蛋白p1,乙肝病毒表面蛋白(WO92/11291)和人乳頭瘤(WO98/15631)。在一些實(shí)例中,可以利用重組DNA技術(shù)將異源蛋白融合到一種VLP蛋白上(Kratz,P.A.,等,美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)9619151920(1990))。
因此,在本領(lǐng)域中有開(kāi)發(fā)與天然的病原體同樣有效地促進(jìn)強(qiáng)烈的CTL和B細(xì)胞免疫應(yīng)答的新的改進(jìn)的疫苗的需要。
發(fā)明概括本發(fā)明提供一種允許生產(chǎn)用所期望的抗原包被的顆粒的多用途的新技術(shù)。本技術(shù)允許抗傳染病的高效疫苗的創(chuàng)造,以及過(guò)敏反應(yīng)和癌癥治療疫苗的創(chuàng)造。
在第一個(gè)實(shí)施方案中,本發(fā)明提供一種包括(A)一種非天然的分子支架和(B)一種抗原或抗原決定簇的新組合物。
非天然的分子支架包括(i)一種核心顆粒,選自(1)非天然起源的核心顆粒(2)天然起源的核心顆粒;以及(ii)一種組織者,包括至少一個(gè)第一結(jié)合位點(diǎn),其中所說(shuō)的組織者通過(guò)至少一個(gè)共價(jià)鍵連接到所說(shuō)的核心顆粒上。
此抗原或抗原決定簇具有至少一個(gè)第二結(jié)合位點(diǎn),選自(i)一種非天然地與所說(shuō)的抗原或抗原決定簇一起出現(xiàn)的結(jié)合位點(diǎn);和(ii)一種天然地與所說(shuō)的抗原或抗原決定簇一起出現(xiàn)的結(jié)合位點(diǎn)。
本發(fā)明通過(guò)將第二結(jié)合位點(diǎn)經(jīng)過(guò)至少一個(gè)非-肽鍵結(jié)合到第一結(jié)合位點(diǎn)上提供一種有序的和重復(fù)的抗原排列。因此,抗原或抗原決定簇及非天然的分子支架通過(guò)這種第一和第二結(jié)合位點(diǎn)之間的結(jié)合被集合到一起,形成一種有序的和重復(fù)的抗原排列(assay)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中,前面所提及的組合物的核心顆粒包括一種病毒、病毒-樣顆粒、噬菌體、病毒衣殼顆?;蚱湟环N重組形式。備選地,核心顆??梢允且环N合成聚合物或一種金屬。
在一個(gè)特定的實(shí)施方案中,組織者可包括至少第一結(jié)合位點(diǎn)。第一和第二結(jié)合位點(diǎn)是本發(fā)明的組合物的特別重要的元件。在本發(fā)明的各種實(shí)施方案中,第一和/或第二結(jié)合位點(diǎn)可以是抗原和其抗體或抗體片段;生物素和親合素;鏈親合素和生物素;受體及其配基;配基結(jié)合蛋白及其配基;相互作用的亮氨酸拉鏈多肽;氨基及其化學(xué)反應(yīng)基團(tuán);羧基及其化學(xué)反應(yīng)基團(tuán);巰基及其化學(xué)反應(yīng)基團(tuán);或其組合。
在一個(gè)更加優(yōu)選的實(shí)施方案中,本發(fā)明提供幾乎任何所選擇的抗原與一種病毒、噬菌體、病毒-樣顆?;虿《疽職ゎw粒之間的偶聯(lián)。通過(guò)將一種抗原組織成一種準(zhǔn)晶體的“病毒-樣”結(jié)構(gòu),本發(fā)明利用宿主強(qiáng)烈的抗病毒免疫反應(yīng)來(lái)產(chǎn)生一種抗所顯示抗原的高度有效的免疫應(yīng)答,也就是說(shuō),接種。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中,核心顆??梢赃x自輪狀病毒的重組蛋白、諾沃克病毒的重組蛋白、甲病毒的重組蛋白、口蹄疫病毒的重組蛋白、逆轉(zhuǎn)錄病毒的重組蛋白、乙型肝炎病毒的重組蛋白、煙草花葉病毒的重組蛋白、Flock House Virus的重組蛋白,以及人乳頭瘤病毒的重組蛋白。
在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中,抗原可選自(1)一種適于誘導(dǎo)抗癌癥細(xì)胞免疫應(yīng)答的蛋白;(2)一種適于誘導(dǎo)抗傳染病免疫應(yīng)答的蛋白;(3)一種適于誘導(dǎo)抗過(guò)敏原免疫應(yīng)答的蛋白;(4)一種適于在家畜中誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的蛋白。
在本發(fā)明的一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中,第一結(jié)合位點(diǎn)和/或第二結(jié)合位點(diǎn)包括一條相互作用的亮氨酸拉鏈多肽。在最優(yōu)選的實(shí)施方案中,第一結(jié)合位點(diǎn)和/或第二結(jié)合位點(diǎn)選自(1)JUN亮氨酸拉鏈蛋白結(jié)構(gòu)域;和(2)FOS亮氨酸拉鏈蛋白結(jié)構(gòu)域。
在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中,該第一結(jié)合位點(diǎn)和/或第二結(jié)合位點(diǎn)選自(1)遺傳工程賴氨酸殘基和(2)遺傳工程半胱氨酸殘基,可化學(xué)連接在一起的兩個(gè)殘基。
本發(fā)明的其它實(shí)施方案包括本發(fā)明的組合物的生產(chǎn)方法及一種使用所說(shuō)的組合物進(jìn)行醫(yī)學(xué)治療的方法。
應(yīng)該理解以上的一般描述和以下的詳細(xì)描述僅僅是示例性和解釋性的,并且意欲提供所要求保護(hù)的發(fā)明的進(jìn)一步解釋。
附圖簡(jiǎn)述

圖1.Western印跡,證明利用pCYTs∷E2JUN表達(dá)載體進(jìn)行含有E2-JUN融合蛋白的病毒顆粒的生產(chǎn)。
圖2.Western印跡,證明自pTE5’2J∷E2JUN表達(dá)載體表達(dá)的含有E2-JUN融合蛋白的病毒顆粒的生產(chǎn)。
圖3.Western點(diǎn)印跡,證明細(xì)菌及真核表達(dá)的FOS-hgh抗原。
圖4.HBcAg-JUN在大腸桿菌細(xì)胞中的表達(dá)。
圖5.Western印跡,證明HBcAg-JUN在大腸桿菌裂解物中是可溶的。
圖6.HBcAg-JUN衣殼顆粒在蔗糖密度梯度上富集的SDS-PAGE分析。
圖7.hGH-FOS與HBcAg-JUN顆粒偶聯(lián)的非還原SDS-PAGE分析。
優(yōu)選實(shí)施方案的詳述1.定義提供以下定義來(lái)闡明發(fā)明人認(rèn)為是本發(fā)明的主題。
甲病毒當(dāng)在本文使用時(shí),術(shù)語(yǔ)“甲病毒”是指包括在甲病毒屬(the genus Alphavirus)內(nèi)的任何RNA病毒。該屬成員的描述包括在Strauss和Strauss,微生物評(píng)論(Micro.Rev.),5849-562(1994)中,甲病毒的實(shí)例包括Aura virus(奧拉病毒),Bebaru virus,Cabassou Virus,Chikungunya virus(基孔貢亞病毒),Easter equineencephalomyelitis virus(東部馬腦脊髓炎病毒),F(xiàn)ort morganVirus,Getah Virus(蓋塔病毒),Kyzylagach virus,Mayoaro virus,Middleburg Virus,Mucambo virus,Ndumu virus,Pixuna virus,Tonate virus,Triniti virus,Una virus(烏納病毒),Western equineencephalomyelitis virus(西部馬腦脊髓炎病毒),Whataroa virus,Sindibis Virus(SIN)(辛德比斯病毒),Semliki virus(SFV)(塞姆利基森林病毒),Venezuelan equine encephalomyelitisVirus(VEE)(委內(nèi)瑞拉馬腦脊髓炎病毒),Ross River virus。
抗原當(dāng)在本文使用時(shí),術(shù)語(yǔ)“抗原”是一種能夠被抗體結(jié)合的分子??乖€能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生B-和/或T-細(xì)胞的體液免疫應(yīng)答和/或細(xì)胞免疫應(yīng)答??乖删哂幸粋€(gè)或多個(gè)表位(B-和T-表位)。以上所提及的特異性應(yīng)答,意在說(shuō)明,抗原將會(huì)以高度選擇性的方式與其對(duì)應(yīng)抗體反應(yīng),而不會(huì)與其它抗原所激發(fā)的其它大量抗體反應(yīng)。
抗原決定簇當(dāng)在本文使用時(shí),術(shù)語(yǔ)“抗原決定簇”是指一種抗原上能被B或T淋巴細(xì)胞特異識(shí)別的部分。B淋巴細(xì)胞通過(guò)產(chǎn)生抗體對(duì)外源的抗原決定簇應(yīng)答,而T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)細(xì)胞免疫。因此,抗原決定簇或表位是抗原上被各種抗體識(shí)別的或者是在MHC的背景下被T細(xì)胞受體識(shí)別的那些部分。
結(jié)合當(dāng)在本文使用時(shí),術(shù)語(yǔ)“結(jié)合”當(dāng)它用于第一和第二結(jié)合位點(diǎn)時(shí),是用來(lái)指至少一個(gè)非-肽鍵。結(jié)合的實(shí)質(zhì)可以是共價(jià)的、離子的、疏水的、極性的、或者其任何組合。
結(jié)合位點(diǎn),第一當(dāng)在本文使用時(shí),術(shù)語(yǔ)“第一結(jié)合位點(diǎn)”是指“組織者”的一種元件,它自身按隨機(jī)的方式結(jié)合到核心顆粒上,定位在抗原或抗原決定簇的第二結(jié)合位點(diǎn)可以結(jié)合到其上。第一結(jié)合位點(diǎn)可以是蛋白、多肽、肽、糖、多聚核苷酸、天然或合成聚合物、次級(jí)代謝產(chǎn)物或化合物(生物素、熒光素、維生素A、地高辛配基、金屬離子、苯甲基磺酰氟),或其一種組合,或其一種化學(xué)反應(yīng)基團(tuán)。多個(gè)第一結(jié)合位點(diǎn)以重復(fù)的構(gòu)型存在于非天然的分子支架的表面。
結(jié)合位點(diǎn),第二當(dāng)在本文使用時(shí),術(shù)語(yǔ)“第二結(jié)合位點(diǎn)”是指一種與抗原或抗原決定簇結(jié)合的元件,定位于非天然的分子支架表面上的“組織者”的第一結(jié)合位點(diǎn)可以結(jié)合到其上??乖蚩乖瓫Q定簇的第二結(jié)合位點(diǎn)可以是蛋白、多肽、肽、糖、多聚核苷酸、天然或合成聚合物、次級(jí)代謝產(chǎn)物或化合物(生物素、熒光素、維生素A、地高辛配基、金屬離子、苯甲基磺酰氟),或其中一種組合,或其中一種化學(xué)反應(yīng)基團(tuán)。抗原或抗原決定簇上存在至少一個(gè)第二結(jié)合位點(diǎn)。
核心顆粒當(dāng)在本文使用時(shí),術(shù)語(yǔ)“核心顆?!笔侵柑峁敖M織者”結(jié)合的基礎(chǔ)、具有固有的重復(fù)性組織的剛性結(jié)構(gòu)。核心顆粒當(dāng)在本文使用時(shí),可以是合成過(guò)程的產(chǎn)物,或者是生物過(guò)程的產(chǎn)物。
順式作用當(dāng)在本文使用時(shí),“順式作用”序列是指復(fù)制酶通過(guò)與其結(jié)合從而催化RNA分子的RNA依賴性復(fù)制的核酸序列。這些復(fù)制事件導(dǎo)致全長(zhǎng)及部分RNA分子的復(fù)制,因而,甲病毒亞基因組啟動(dòng)子也是“順式作用”序列。順式作用序列,可以定位在或接近于一個(gè)核酸分子的5′端、3′端,或兩端,以及定位在其內(nèi)部。
融合當(dāng)在本文使用時(shí),術(shù)語(yǔ)“融合”是指不同來(lái)源的氨基酸序列,通過(guò)其編碼核酸序列的符合閱讀框的組合,在一條多肽鏈中的組合。術(shù)語(yǔ)“融合”明確包括內(nèi)部融合,也就是說(shuō),除了融合到它的一個(gè)末端之外,不同起源的序列在一條多肽鏈內(nèi)部的插入。
異源序列當(dāng)在本文使用時(shí),術(shù)語(yǔ)“異源序列”是指存在于本發(fā)明的載體中的另一個(gè)核苷酸序列。術(shù)語(yǔ)“異源序列”還指由本發(fā)明的一種載體中所含有的一個(gè)異源DNA序列所編碼的任何氨基酸或RNA序列。異源核酸序列可以編碼通常在其所存在的細(xì)胞類型表達(dá)的蛋白或RNA分子,或者在其中通常不表達(dá)的分子(例如,辛德比斯病毒結(jié)構(gòu)蛋白)。
分離的當(dāng)在本文使用時(shí),當(dāng)術(shù)語(yǔ)“分離的”用來(lái)指一種分子時(shí),此術(shù)語(yǔ)是指被從其天然環(huán)境中移出的分子。例如,天然存在于活動(dòng)物中的多聚核苷酸或多肽不是“分離的”,但是從天然狀態(tài)的共存的物質(zhì)中分離出的相同的多聚核苷酸或多肽是“分離的”。進(jìn)一步地,就本發(fā)明而言,一種載體中所含有的重組DNA分子被認(rèn)為是“分離的”。分離的RNA分子包括DNA和RNA分子體內(nèi)或體外的RNA復(fù)制產(chǎn)物。分離的核酸分子進(jìn)一步包括合成生產(chǎn)的分子。另外,重組宿主細(xì)胞中所含有的載體分子也是分離的。因此,不是所有“分離的”分子都需要純化。
免疫治療劑當(dāng)在本文使用時(shí),術(shù)語(yǔ)“免疫治療劑”是一種治療疾病或紊亂的組合物。更明確地,此術(shù)語(yǔ)用來(lái)指一種過(guò)敏反應(yīng)治療方法或一種癌癥治療方法。
個(gè)體當(dāng)在本文使用時(shí),術(shù)語(yǔ)“個(gè)體”是指多細(xì)胞生物體,并且包括植物和動(dòng)物,更優(yōu)選地是脊椎動(dòng)物,甚至更優(yōu)選地是哺乳動(dòng)物,最優(yōu)選地是人。
低或不可檢測(cè)的當(dāng)在本文使用時(shí),術(shù)語(yǔ)“低或不可檢測(cè)的”,當(dāng)它用來(lái)指基因表達(dá)水平時(shí),是指顯著低于該基因被最大誘導(dǎo)時(shí)所看到的表達(dá)水平的表達(dá)水平(例如,至少低5倍),或者是利用以下實(shí)施例部分所用的方法不容易檢測(cè)到的表達(dá)水平。
植物凝集素當(dāng)在本文使用時(shí),不僅特別地從豆科植物的種子獲取,也從許多其它植物和動(dòng)物來(lái)源獲取,具有特定的單糖或寡糖的結(jié)合位點(diǎn)的蛋白。實(shí)例包括在糖蛋白的研究中被廣泛用作分析和制備試劑的伴刀豆球蛋白A和麥芽凝集素。
天然起源當(dāng)在本文使用時(shí),術(shù)語(yǔ)“天然起源”是指全部或其部分不是合成的,而是在自然界中存在或產(chǎn)生的。
非天然的當(dāng)在本文使用時(shí),此術(shù)語(yǔ)一般是指并不是來(lái)自于自然界,更明確的,此術(shù)語(yǔ)是指來(lái)自于人工。
非天然起源當(dāng)在本文使用時(shí),術(shù)語(yǔ)“非天然起源”一般是指合成的而不是來(lái)自于自然界;更明確地,此術(shù)語(yǔ)是指來(lái)自于人工。
非天然的分子支架當(dāng)在本文使用時(shí),術(shù)語(yǔ)“非天然的分子支架”是指作用是用來(lái)提供第一結(jié)合位點(diǎn)的一種剛性的和重復(fù)的排列的利用人工制造的任何產(chǎn)物。理想的而不是必要地,這些結(jié)合位點(diǎn)成幾何級(jí)。非天然的分子支架,其全部或者部分,可以是有機(jī)的或者無(wú)機(jī)的,并可以是化學(xué)合成的或者是生物合成的。非天然的分子支架由以下組成(a)一種核心顆粒,是天然起源的或者非天然起源的;及(b)一種組織者,自身包括至少一個(gè)第一結(jié)合位點(diǎn),并通過(guò)至少一個(gè)共價(jià)鍵結(jié)合到一種核心顆粒上。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中,非天然的分子支架可以是病毒、病毒樣顆粒、病毒衣殼顆粒、噬菌體、其中一種重組形式或合成顆粒。
有序的和重復(fù)的抗原或抗原決定簇排列當(dāng)在本文使用時(shí),術(shù)語(yǔ)“有序的(ordered)和重復(fù)的抗原或抗原決定簇排列”一般是指一種以抗原或抗原決定簇關(guān)于支架的統(tǒng)一的空間排列為特征的、抗原或抗原決定簇的重復(fù)模式。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中,重復(fù)模式可以是幾何模式。一種理想的有序的和重復(fù)的抗原或抗原決定簇排列,將擁有一種間距為5到15納米的抗原或抗原決定簇的嚴(yán)格重復(fù)的類晶體秩序。
組織者當(dāng)在本文使用時(shí),術(shù)語(yǔ)“組織者”用來(lái)指一種以非隨機(jī)的方式結(jié)合到核心顆粒上的為創(chuàng)造一種有序的和重復(fù)的抗原排列提供成核位點(diǎn)的元件。組織者是包括至少一個(gè)通過(guò)至少一個(gè)共價(jià)鍵結(jié)合到一種核心顆粒上的第一結(jié)合位點(diǎn)的任何元件。組織者可以是蛋白、多肽、肽、氨基酸(也就是說(shuō),一種蛋白、多肽或肽的一個(gè)殘基)、糖、多聚核苷酸、天然或合成聚合物、次級(jí)代謝產(chǎn)物或化合物(生物素、熒光素、視黃醇、地高辛配基、金屬離子、苯甲基磺酰氟),或其一種組合,或其一種化學(xué)反應(yīng)基團(tuán)。
允許溫度當(dāng)在本文使用時(shí),術(shù)語(yǔ)“允許溫度”是指一種酶在此溫度下具有相對(duì)高水平的催化活性的溫度。
純化的當(dāng)在本文使用時(shí),當(dāng)術(shù)語(yǔ)“純化的”用來(lái)指一種分子時(shí),它的意思是被純化的分子的濃度相對(duì)于在其天然的環(huán)境中與其相關(guān)的分子已被提高。天然相關(guān)的分子包括蛋白、核酸、脂和糖,但是一般不包括水、緩沖液,以及被加入以維持正在純化的分子的完整性或幫助正在純化的分子的純化的試劑。例如,即使mRNA在寡脫氧胸苷酸(oligo dT)層析期間被一種水性溶劑稀釋了,如果天然相關(guān)的核酸和其它生物分子不結(jié)合到柱子上,而是與所研究的mRNA分子分離,那么mRNA分子就可以利用這種層析方法純化。
受體當(dāng)在本文使用時(shí),術(shù)語(yǔ)“受體”是指能與另一種被稱為配基的分子相互作用的蛋白或糖蛋白或其片段。配基可以屬于任何種類的生化或化學(xué)化合物。受體不必是膜結(jié)合蛋白??扇苄缘鞍祝?,麥芽糖結(jié)合蛋白或視黃醇結(jié)合蛋白也是受體。
殘基當(dāng)在本文使用時(shí),術(shù)語(yǔ)“殘基”意在指多肽主鏈或側(cè)鏈中的一個(gè)特定的氨基酸。
溫度敏感當(dāng)在本文使用時(shí),術(shù)語(yǔ)“溫度敏感”是指一種酶在一個(gè)溫度容易地催化一種反應(yīng),但在另一種溫度緩慢地催化同樣的反應(yīng)或根本不催化這種反應(yīng)。溫度敏感性酶的一個(gè)實(shí)例是由pCYTts載體所編碼的在低于34℃的溫度有容易檢測(cè)到的復(fù)制酶活性而在37℃具有低的或不可檢測(cè)的活性的復(fù)制酶蛋白。
轉(zhuǎn)錄當(dāng)在本文使用時(shí),術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)錄”是RNA聚合酶催化從DNA模板生產(chǎn)RNA分子。
重組宿主細(xì)胞當(dāng)在本文使用時(shí),術(shù)語(yǔ)“重組宿主細(xì)胞”是指向其中導(dǎo)入了本發(fā)明的一種或多種核酸分子的宿主細(xì)胞。
重組病毒當(dāng)在本文使用時(shí),術(shù)語(yǔ)“重組病毒”是指一種利用人工被遺傳修飾過(guò)的病毒。此術(shù)語(yǔ)包括本領(lǐng)域中公知的任何病毒。更特定地,術(shù)語(yǔ)是指通過(guò)人工被遺傳修飾過(guò)的甲病毒,最特定地,此術(shù)語(yǔ)是指被人工遺傳修飾過(guò)的辛德比斯病毒。
限制性溫度當(dāng)在本文使用時(shí),術(shù)語(yǔ)“限制性溫度”是指一種酶在此溫度具有低或不可檢測(cè)的水平的催化活性的溫度?!盁帷焙汀袄洹泵舾械耐蛔凅w都是公知的,因此,一種限制性溫度可以低于或高于允許溫度。
RNA依賴性RNA復(fù)制事件當(dāng)在本文使用時(shí),術(shù)語(yǔ)“RNA依賴的RNA復(fù)制事件”是指使用一種RNA分子作為模板,導(dǎo)致一種RNA分子形成的方法。
RNA依賴性RNA聚合酶當(dāng)在本文使用時(shí),術(shù)語(yǔ)“RNA依賴性RNA聚合酶”是指催化從一種RNA分子生產(chǎn)另一種RNA分子的聚合酶。此術(shù)語(yǔ)在這里與術(shù)語(yǔ)復(fù)制酶”同義使用。
非翻譯的RNA當(dāng)在本文使用時(shí),術(shù)語(yǔ)“非翻譯的RNA”是指一種不編碼開(kāi)放閱讀框,或編碼開(kāi)放閱讀框或其部分、但卻是按照一種不會(huì)產(chǎn)生氨基酸序列的方式(例如,不存在啟始密碼子)的RNA序列或分子。這些分子的實(shí)例是tRNA分子、rRNA分子,和核酶。
載體當(dāng)在本文使用時(shí),術(shù)語(yǔ)“載體”是指一種用來(lái)將遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移進(jìn)宿主細(xì)胞的物質(zhì)。載體可以包括DNA或RNA。
一(one,a或an)當(dāng)術(shù)語(yǔ)“一”被用于本公開(kāi)時(shí),它們的意思是“至少一種/個(gè)”或“一種/個(gè)或多種/個(gè)”,除非另有說(shuō)明。2.有序的和重復(fù)的抗原或抗原決定簇排列的組合物以及制備同樣的組合物的方法所公開(kāi)的發(fā)明提供包括一種有序的和重復(fù)的抗原或抗原決定簇的組合物。進(jìn)一步地,本發(fā)明方便地使實(shí)施者能夠構(gòu)建用于包括傳染病預(yù)防、過(guò)敏反應(yīng)治療及癌癥治療的各種治療目的的、有序的和重復(fù)的抗原或抗原決定簇排列。
本發(fā)明的組合物基本上包括兩個(gè)元件(1)一種非天然的分子支架;及(2)具有至少一個(gè)能夠通過(guò)至少一個(gè)非-肽鍵結(jié)合到所說(shuō)的第一結(jié)合位點(diǎn)上的所說(shuō)的第二結(jié)合位點(diǎn)的抗原或抗原決定簇。
非天然的分子支架包括(a)一種核心顆粒,選自(1)一種非天然起源的核心顆粒和(2)一種天然起源的核心顆粒;及(b)一種包括至少一個(gè)第一結(jié)合位點(diǎn)的組織者,其中所說(shuō)的組織者通過(guò)至少一個(gè)共價(jià)鍵連接到所說(shuō)的核心顆粒上。
抗原或抗原決定簇具有至少一個(gè)第二結(jié)合位點(diǎn),選自(a)一種非天然地與所說(shuō)的抗原或抗原決定簇一起出現(xiàn)的的結(jié)合位點(diǎn);(b)一種天然地與所說(shuō)的抗原或抗原決定簇一起出現(xiàn)的結(jié)合位點(diǎn)。
本發(fā)明通過(guò)第二結(jié)合位點(diǎn)與第一結(jié)合位點(diǎn)之間經(jīng)過(guò)至少一個(gè)非-肽鍵的結(jié)合而規(guī)定一種有序的和重復(fù)的抗原排列。因此,抗原或抗原決定簇和非天然的分子支架通過(guò)第一和第二結(jié)合位點(diǎn)間的結(jié)合而被集合到一起,形成一種有序的和重復(fù)的抗原決定簇排列。
實(shí)施者可以特定地設(shè)計(jì)抗原或抗原決定簇及第二結(jié)合位點(diǎn),從而使所有結(jié)合到非天然的分子支架上的抗原或抗原決定簇的排列是相同的。例如,可以將單個(gè)第二結(jié)合位點(diǎn)放置在抗原或抗原決定簇的羧基端或氨基端,從而通過(guò)設(shè)計(jì)確保所有結(jié)合到非天然的分子支架上的抗原或抗原決定簇分子按照均一的方式安排位置。因此,本發(fā)明提供一種方便的、按規(guī)定的秩序和重復(fù)性將任何抗原或抗原決定簇放置于一種非天然的分子支架的手段。
如同本領(lǐng)域的熟練人員會(huì)清楚的一樣,本發(fā)明的特定實(shí)施方案涉及重組核酸技術(shù),例如克隆、聚合鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、DNA和RNA純化,重組蛋白在原核及真核生物細(xì)胞中表達(dá)等技術(shù)的使用。這些方法對(duì)于本領(lǐng)域的熟練人員是公知的,可以方便地在已公開(kāi)的實(shí)驗(yàn)室方法手冊(cè)中找到(例如,Sambrook,J.等編,分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(MolecularCloning,A Laboratory Manual)2ndedition,Cold Spring HarborPress,Cold Spring Harbor,N.Y.(1989);Ausubel,F(xiàn).等,當(dāng)代分子生物學(xué)操作(CURRENT PROTOCALS IN MOLECULAR BIOLOGY),JohnH.Wiley & Sons,Inc.(1997)。組織培養(yǎng)細(xì)胞系的基本實(shí)驗(yàn)室技術(shù)(Celis,J.ed.,細(xì)胞生物學(xué)(CELL BIOLOGY),Academic Press,2ndedition(1998)及基于抗體的技術(shù)(Harlow,E.和Lane,D.“抗體實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(AntibodiesA Laboratory Manual)”,Cold SpringHarbor,N.Y.(1988);Deutscher,M.P.,蛋白質(zhì)純化指導(dǎo)(Guideto Protein Purification)”,酶學(xué)方法(Meth.Enzymol.),128,Academic Press San Diego(1990);Scopes,R.K.,“蛋白質(zhì)純化原理與實(shí)踐(Protein Purificaton Principles and Pratice)”,3rdediton,Springer-Verlag,New York(1994))在文獻(xiàn)中也有充分闡述,所有這些均作為參考文獻(xiàn)完整地并入本發(fā)明。A.非天然的分子支架的構(gòu)建在本發(fā)明的組合物的一種元件是一種包括一種核心顆粒和一種組織者的非天然的分子支架。當(dāng)在本文使用時(shí),術(shù)語(yǔ)“非天然的分子支架”是指任何作用是提供第一結(jié)合位點(diǎn)的一種剛性的重復(fù)的排列的、人工生產(chǎn)的產(chǎn)物。更明確地,非天然的分子支架包括(a)一種核心顆粒,選自(1)一種非天然起源的核心顆粒,及(2)一種天然起源的核心顆粒;以及(b)一種包括至少一個(gè)第一結(jié)合位點(diǎn)的組織者,其中所說(shuō)的組織者通過(guò)至少一個(gè)共價(jià)鍵連接到所說(shuō)的核心顆粒上。
正如本領(lǐng)域的熟練人員所顯而易見(jiàn)的,本發(fā)明的非天然分子支架的核心顆粒不限定于任何特定形式。核心顆粒,可以是有機(jī)的或者非有機(jī)的,并可以是化學(xué)合成的或通過(guò)生物過(guò)程合成的。
在一個(gè)實(shí)施方案中,一種非天然的核心顆??梢允且环N合成聚合物、脂微膠?;蛞环N金屬離子。這樣的核心顆粒在本領(lǐng)域是公知的,這為用它來(lái)構(gòu)建本發(fā)明的新的非天然的分子支架提供了基礎(chǔ)。舉例來(lái)說(shuō),在美國(guó)專利5,770,380號(hào)中描述了合成聚合物或金屬核心顆粒,此專利公開(kāi)了連接到一種“抗體模擬物”的發(fā)明中的許多肽環(huán)上的一種calixarene有機(jī)支架的使用,而美國(guó)專利5,334,394號(hào)描述了由許多種包括金屬、陶瓷在內(nèi)的無(wú)機(jī)材料組成的用作病毒引誘物的納米晶體(nanocrystalline)顆粒。本實(shí)施方案中優(yōu)選的金屬包括鉻、銣、鐵、鋅、硒、鎳、金、銀及鉑。本實(shí)施方案中優(yōu)選的陶瓷材料包括二氧化硅、二氧化鈦、氧化鋁、氧化銣及氧化錫。本實(shí)施方案的核心顆??梢杂冒ㄌ?鉆石)在內(nèi)的有機(jī)材料制造。優(yōu)選的聚合物包括聚苯乙烯、尼龍及硝基纖維素。對(duì)于這種納米晶體顆粒,用氧化錫、二氧化鈦或碳(鉆石)制造的顆粒是特別優(yōu)選的。一種脂微膠??梢岳帽绢I(lǐng)域之中任何公知的方法制備。例如微膠??梢愿鶕?jù)Baiselle和Millar的方法制備(Baiselle,C.J.和Millar,D.B.,生物物理化學(xué)(Biophys.Chem.)4355-361(1975))或Corti等(Corti,M.,Degriorgio,V.,Sonnino,S.,Ghidoni R.,Masserini,M.和Tettamanti,G.,脂肪化學(xué)物理學(xué)(Chem.Phys.Lipids)38197-214(1981))或Lopez等(Lopez,O de 1a Maza,A.,Coderch,L,Lopez-Iglesias,C.,Wehrli,E.和Parra,J.L.,歐洲生物化學(xué)聯(lián)合會(huì)快報(bào)(FEBS Lett.)426314-318(1998))或Topchieva和Karezin(Topchieva,I.,和Karazezin,K.,J.,膠體界面科學(xué)(Colloid Interface Sci.)21329-35(1999))或Norein等,(Morein,B.,Sundquist,B.,Hoglund,S.,Dalsgaard K.和Osterhaus,A.,天然(Nature)308457-60(1984)),這些文章在此作為參考文獻(xiàn)并入本發(fā)明。
核心顆粒還可以通過(guò)生物過(guò)程制備,可以是天然的或者非天然的。舉例來(lái)說(shuō),這種類型的實(shí)施方案可以包括一種包括一種病毒、病毒-樣顆粒、噬菌體、病毒衣殼顆?;蚱湟环N重組形式的核心顆粒。在一個(gè)更加特定的實(shí)施方案中,核心顆??梢园ㄝ啝畈《镜闹亟M蛋白、諾沃克病毒的重組蛋白、甲病毒的重組蛋白、口蹄疫病毒的重組蛋白、逆轉(zhuǎn)錄病毒的重組蛋白、乙型肝炎病毒的重組蛋白、煙草花葉病毒的重組蛋白、Flock House Virus的重組蛋白及人乳頭瘤病毒的重組蛋白。
無(wú)論是天然的還是非天然,本發(fā)明的核心顆粒以包括通過(guò)至少一個(gè)共價(jià)鍵結(jié)合到天然的或非天然的核心顆粒的組織者為特征。此組織者是一種按照非隨機(jī)方式結(jié)合到一種核心顆粒上的、為創(chuàng)造一種有序的和重復(fù)的排列提供一個(gè)成核位點(diǎn)的元件。理想地但不是必要地,組織者按幾何秩序(geometric order)與核心顆粒結(jié)合。最低限度地,組織者包括一個(gè)第一結(jié)合位點(diǎn)。
如前所述,組織者可以是任何包括至少一個(gè)通過(guò)至少一個(gè)共價(jià)鍵結(jié)合到一種核心顆粒的第一結(jié)合位點(diǎn)的元件。組織者可以是蛋白、多肽、肽、氨基酸(也就是說(shuō),一種蛋白、多肽或肽的一個(gè)殘基)、糖、多聚核苷酸、天然或合成聚合物,次級(jí)代謝產(chǎn)物或化合物(生物素、熒光素、視黃醇、地高辛配基、金屬離子、苯甲基磺酰氟),或其一種組合,或其一種化學(xué)反應(yīng)基團(tuán)。在一個(gè)更加特定的實(shí)施方案中,組織者可以包括一個(gè)包括抗原,抗體或其抗體片段、生物素、親合素、鏈親合素、受體、受體配基、配基、結(jié)合配基的蛋白、相互作用的亮氨酸拉鏈多肽、氨基、與氨基反應(yīng)的化學(xué)基團(tuán);羧基、與羧基反應(yīng)的化學(xué)基團(tuán)、巰基、與巰基反應(yīng)的化學(xué)基團(tuán),或其一種組合的第一結(jié)合位點(diǎn)。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中,非天然的分子支架的核心顆粒包括一種病毒、噬菌體、病毒-樣顆粒、病毒衣殼顆?;蚱湟环N重組形式。具有有序的和重復(fù)的包被和/或核心蛋白結(jié)構(gòu)的本領(lǐng)域中所公知的任何病毒可以被選作本發(fā)明的非天然支架;合適的病毒的實(shí)例包括辛德比斯病毒及其它甲病毒;水泡性口炎病毒;彈狀病毒-,(例如水泡性口炎病毒),細(xì)小核糖核酸病毒-,披膜病毒-,正粘病毒-,polyoma-,微細(xì)小病毒、輪狀病毒、諾沃克病毒、口蹄疫病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、乙型肝炎病毒、煙草花葉病毒、Flock House virus、人乳頭瘤病毒、(例如,參見(jiàn)Bachman,M.F.,和Zinkernagel,R.M,當(dāng)代免疫學(xué)(Immunol.Today)17553-558(1996)中的表1)。
在一個(gè)實(shí)施方案中,本發(fā)明利用一種病毒的遺傳工程,創(chuàng)造一種有序的和重復(fù)的病毒包膜蛋白與一種包括異源蛋白、肽、抗原決定簇或所選的反應(yīng)性氨基酸殘基的組織者之間的融合。其它為本領(lǐng)域中人員所公知的遺傳操作可以包括在非天然支架的構(gòu)建中;例如,可能期望通過(guò)遺傳突變來(lái)限制重組病毒的復(fù)制能力。選擇用來(lái)與組織者(也就是說(shuō),第一結(jié)合位點(diǎn))蛋白融合的病毒蛋白應(yīng)該具有一種有組織的重復(fù)的結(jié)構(gòu),更優(yōu)選地,在此病毒表面優(yōu)化地具有5-15nm間距類晶體組構(gòu)。這種融合蛋白的創(chuàng)造將在此病毒表面產(chǎn)生多個(gè)有序的和重復(fù)的組織者。因此,由此所產(chǎn)生的第一結(jié)合位點(diǎn)的、有序的和重復(fù)的組構(gòu)將反映此天然病毒蛋白的正常組構(gòu)。
正如將要更加深入地進(jìn)行討論的一樣,在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中,支架是一種重組甲病毒,更加明確地,是一種重組辛德比斯病毒。甲病毒是一種在被感染細(xì)胞的細(xì)胞漿內(nèi)完整地復(fù)制其基因組RNA而且沒(méi)有DNA中間體的正鏈RNA病毒(Strauss,J.和Strauss,E.,微生物學(xué)評(píng)論(Microbiol.Rev.)58491-562(1994))。數(shù)種甲病毒科成員、辛德比斯病毒(Xiong,C.等,科學(xué)(Science)2431188-1191(1989);Schlesinger,S.,生物技術(shù)趨勢(shì)(TrendsBiotechnol.)1118-22(1993)),塞姆利基森林病毒(SemlikiForest Virus)(Liljestrm,P.,& Garoff,H.,生物技術(shù)(Bio/Technology)91356-1361(1991))及其它病毒(Dayis,N.L.等,病毒學(xué)(Virology)171189-204(1989)),作為各種以病毒為基礎(chǔ)的、各種不同蛋白的表達(dá)載體(Lundsrom,K.,當(dāng)代生物技術(shù)評(píng)論(Curr.Opin.Biotechnol.)8578-582(1997);Liljestrom K.,當(dāng)代生物技術(shù)評(píng)論(Curr.Opin.Biotechnol.)5495-500(1994)及作為疫苗開(kāi)發(fā)的候選者已受到相當(dāng)關(guān)注。最近,許多專利已經(jīng)被頒布,針對(duì)甲病毒用于異源蛋白表達(dá)和疫苗開(kāi)發(fā)的用途(參見(jiàn)美國(guó)專利5,766,602號(hào);5,792,462號(hào);5,739,026號(hào);5,789,245號(hào)及5,814,482號(hào))。本發(fā)明的甲病毒支架的構(gòu)建,可以利用重組DNA技術(shù)領(lǐng)域中公知的方法完成,正如上述文章所描述的一樣,在此作為參考文獻(xiàn)將這些文章并入本發(fā)明。
可以使用各種不同的重組宿主細(xì)胞來(lái)生產(chǎn)以病毒為基礎(chǔ)的用于抗原或抗原決定簇結(jié)合的核心顆粒。例如,公知甲病毒有廣泛的宿主范圍;辛德比斯病毒感染培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物、爬行動(dòng)物及兩棲動(dòng)物細(xì)胞,以及一些昆蟲(chóng)細(xì)胞(Clark,H.,國(guó)立癌癥研究所雜志(J.Natl.Cancer Inst.)51645(1973);Leake,C.,普通病毒學(xué)雜志(J.Gen.Virol.)35335(1997);Stollar,V.,in囊膜病毒(THE TOGAVIRUS),R.W.SCHLESINGER,ed.,Academic Press,(1980),pp583-621)。因此,許多重組宿主細(xì)胞可以用于本發(fā)明的實(shí)施。BHK、COS、Vero、HeLa及CHO細(xì)胞特別適合異源蛋白的生產(chǎn),因?yàn)?它們)具有按照與人細(xì)胞相似的方式糖基化異源蛋白的潛力(Waston,E.等,糖生物學(xué)(Glycobiology)4227,(1994)),并且可被選擇(Zang,M.等,生物技術(shù)(Bio/Technology)13389(1995))或遺傳設(shè)計(jì)(Renner W.等,生物技術(shù)生物工程(Biotech.Bioeng)4476(1995);Lee K.等生物技術(shù)生物工程(Biotech.Bioeng.)50(1996))從而在無(wú)血清培養(yǎng)基和懸液中培養(yǎng)。
將多聚核苷酸載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞可以利用標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)中所描述的方法來(lái)實(shí)施(例如,參見(jiàn)Sambrook,J.,等,分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(MOLECULAR CLONINGA LABRORORY MANNUAL)2ndedition,ColdSpring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(1998),Chapter 9;及Ausubel,F(xiàn).,等,當(dāng)代分子生物學(xué)操作手冊(cè),eds.,CURRUNT PROTOCALS In MOLECULAR BIOLOGY,John H.Wiley & Sons,Inc(1997),Chapter 16),包括這些方法,例如電穿孔、DEAE-右旋糖苷介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)染、顯微注射、陽(yáng)離子脂-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)、刮傷加載(scrape loading)、沖擊導(dǎo)入(ballisticintroduction)及感染。Felgner,P.等,在美國(guó)專利5,580,859號(hào)中討論了將外源DNA序列導(dǎo)入宿主細(xì)胞的方法。
包裝的RNA序列也能用來(lái)感染宿主細(xì)胞??赏ㄟ^(guò)將這些包裝的RNA序列加入培養(yǎng)基而將其導(dǎo)入宿主細(xì)胞。例如,在許多來(lái)源包括“辛德比斯病毒表達(dá)系統(tǒng)”,Version C,(Invitrogen Catalog No.K750-1)在內(nèi),描述了沒(méi)有感染性的甲病毒顆粒的制備。
當(dāng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞被用作生產(chǎn)以病毒為基礎(chǔ)的核心顆粒的重組宿主細(xì)胞時(shí),這些細(xì)胞通常在組織培養(yǎng)中培養(yǎng)。培養(yǎng)細(xì)胞的方法在本領(lǐng)域中是公知的(例如,參見(jiàn)Celis,J.,ed.,CELL BIOLOGY,AcademicPress,2ndedition,(1998);Sambrook,J.,等,分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(MOLECULAR CLONINGA LABRORORY MANNUAL.2ndedition,ColdSpring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(1998),Chapter 9);及Ausubel,F(xiàn).,等,ed.s,當(dāng)代分子生物學(xué)操作手冊(cè),(CURRUNT PROTOCALS In MOLECULAR BIOLOGY,John H.Wiley & Sons,Inc(1997));Freshney,R.,動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)(CULTURE OFANIMAL CELLS),Alan R.Liss,Inc.(1983))。
正如本領(lǐng)域的人員將會(huì)理解的一樣,第一結(jié)合位點(diǎn)可以是任何合適的、能夠?qū)⑺x的抗原或抗原決定簇特異性地結(jié)合到支架上的蛋白、多肽、糖,多核苷酸肽(氨基酸)、天然或合成聚合物、次級(jí)代謝產(chǎn)物,或其一種組合或其一部分。在一個(gè)實(shí)施方案中,結(jié)合位點(diǎn)是選自本領(lǐng)域中所公知的物質(zhì)的蛋白或肽。例如,第一結(jié)合位點(diǎn)可以選自配基、受體、植物凝集素、親合素、鏈親合素、生物素、表位,例如HA或T7標(biāo)記(T7 tag)、Myc、Max、免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域以及在本領(lǐng)域中所公知的能夠用作第一結(jié)合位點(diǎn)的其它任何氨基酸序列。
本領(lǐng)域中的人員可以進(jìn)一步理解,利用本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案,第一結(jié)合位點(diǎn)可繼生于在構(gòu)建與衣殼蛋白符合閱讀框的融合中所使用的組織者(例如,蛋白或多肽)。例如,一種蛋白可被用來(lái)與具有已知按照特定方式被糖基化的氨基酸序列的包膜蛋白融合,然后,結(jié)果所加上的糖部分(moiety)可以通過(guò)結(jié)合到作為抗原的第二結(jié)合位點(diǎn)的植物凝集素上,從而在病毒支架的第一結(jié)合位點(diǎn)發(fā)揮作用?;蛘撸M織者序列可以在體內(nèi)被生物素化,生物素部分可以作為本發(fā)明的第一結(jié)合位點(diǎn),或者組織者序列可以受到不同氨基酸殘基的體外化學(xué)修飾,這種修飾作為第一結(jié)合位點(diǎn)。
本發(fā)明的一個(gè)特定的實(shí)施方案使用辛德比斯病毒。辛德比斯病毒RNA基因組被包裝進(jìn)包圍著一個(gè)含有三種被稱為E1、E2和E3的蛋白的脂雙層的衣殼蛋白中。這些所謂的包膜蛋白是糖蛋白,被糖基化的部分在脂雙層的外部,在這里,這些蛋白的復(fù)合物形成在電子顯微照片中可見(jiàn)的從病毒表面向外突出的“刺突”。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中,第一結(jié)合位點(diǎn)選擇是符合閱讀框地與E2包膜蛋白融合的JUN或FOS亮氨酸拉鏈蛋白結(jié)構(gòu)域。然而,本領(lǐng)域的所有人員都將清楚的是,其它的包膜蛋白可以被用于將第一結(jié)合位點(diǎn)定位到本發(fā)明的支架上的融合蛋白構(gòu)建體。
在本發(fā)明的一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中,第一結(jié)合位點(diǎn)選擇是符合閱讀框地與乙型肝炎病毒衣殼(核心)蛋白融合的JUN-FOS亮氨酸拉鏈蛋白結(jié)構(gòu)域。然而,對(duì)本領(lǐng)域的所有人員都將清楚的是,其它病毒衣殼蛋白可被用于將第一結(jié)合位點(diǎn)定位到本發(fā)明的支架上的融合蛋白構(gòu)建體。
在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中,第一結(jié)合位點(diǎn)選擇是符合閱讀框地與肝炎核心(衣殼)蛋白融合的賴氨酸或半胱氨酸殘基。然而,對(duì)本領(lǐng)域的所有人員都將清楚的是,其它病毒衣殼或病毒-樣顆粒可被用于將第一結(jié)合位點(diǎn)定位到本發(fā)明的支架上的融合蛋白構(gòu)建體。
提供實(shí)施例1,說(shuō)明使用Hahn等(美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊(Proc.Natl.Acad. Sci.USA)892679-2683(1992))的pTE5′2J載體構(gòu)建辛德比斯病毒E2包膜蛋白和JUN亮氨酸拉鏈蛋白結(jié)構(gòu)域之間符合閱讀框的融合蛋白。用于第一結(jié)合位點(diǎn)的JUN氨基酸序列如下CGGRIARLEEKVKTLKAQNSELASTANMLREQVAQLKQKVMNHVGC(第59號(hào)序列(SEQ ID NO59))。在這個(gè)實(shí)例中,抗原上預(yù)期的第二結(jié)合位點(diǎn)將是FOS亮氨酸拉鏈蛋白結(jié)構(gòu)域,而氨基酸序列將會(huì)是如下的序列CGGLTDTLQAETDQVEDEKSALQTEIANLLKEKEKLEFILAAHGGC(第60號(hào)序列)。
這些序列從轉(zhuǎn)錄因子JUN和FOS衍生而來(lái),每個(gè)在側(cè)翼都具有在兩端含有一個(gè)半胱氨酸殘基的短序列。已知這些序列彼此相互作用。JUN-FOS二聚體的最初假定的結(jié)構(gòu)設(shè)想了一個(gè)單體的疏水性側(cè)鏈與另一個(gè)單體相應(yīng)的側(cè)鏈以拉鏈的方式交錯(cuò)對(duì)插(Landschulz等,科學(xué)(Science) 2401759-1764(1998))。然而,這種假設(shè)證明是錯(cuò)誤的,已知這些蛋白形成α-螺旋卷曲螺旋(α-helix coiled coil)(O′Shea等,科學(xué)(Science) 243538-542(1989));Cohen & Parry,生物化學(xué)科學(xué)趨勢(shì)(Trends Biochem.Sci.)11245-248(1986)),因此,術(shù)語(yǔ)“亮氨酸拉鏈”經(jīng)常用來(lái)指這些蛋白結(jié)構(gòu)域,更多地是因?yàn)闅v史原因而不是結(jié)構(gòu)原因。貫穿本發(fā)明之中地,術(shù)語(yǔ)“亮氨酸拉鏈”用于指以上所描述的序列,以及與以上所描述的序列基本相似的序列。術(shù)語(yǔ)JUN和FOS被用于分別的亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域,而不是整個(gè)JUN和FOS蛋白。
在一個(gè)實(shí)施方案中,本發(fā)明提供使用pCYTts表達(dá)系統(tǒng)(美國(guó)專利申請(qǐng),申請(qǐng)?zhí)?0/79,562;申請(qǐng)日1998年3月27日)生產(chǎn)辛德比斯病毒E2-JUN支架。PCYTts表達(dá)系統(tǒng)提供了允許在真核細(xì)胞中進(jìn)行基因表達(dá)的嚴(yán)謹(jǐn)控制的新表達(dá)載體。本系統(tǒng)的DNA載體被轉(zhuǎn)錄,從而形成RNA分子,然后此RNA分子又被一種溫度敏感型復(fù)制酶復(fù)制從而形成額外的RNA分子。復(fù)制所產(chǎn)生的RNA分子含有一個(gè)可以被翻譯從而產(chǎn)生感興趣的蛋白或者編碼一個(gè)或多個(gè)不被翻譯的RNA分子的核苷酸序列。因此,此表達(dá)系統(tǒng)可以進(jìn)行重組辛德比斯病毒顆粒的生產(chǎn)。
實(shí)施例2提供了本發(fā)明的E2-JUN辛德比斯病毒(sinbis)非天然的分子支架生產(chǎn)的細(xì)節(jié)。另外在實(shí)施例3中還提供了另一種使用實(shí)施例1中所產(chǎn)生的pTE5′2JE2JUN載體生產(chǎn)重組E2-JUN辛德比斯病毒支架的方法。因此本發(fā)明提供了兩種方法—pCYTts表達(dá)系統(tǒng)(實(shí)施例2)和pTE5′2J載體系統(tǒng)(實(shí)施例3)—利用這些方法可以生產(chǎn)重組辛德比斯病毒E2-JUN非天然的分子支架。在圖1和圖2中證明了在各系統(tǒng)中所產(chǎn)生的病毒顆粒的分析。
如前所述,本發(fā)明包括一種以病毒為基礎(chǔ)的、包括一種病毒、病毒-樣顆粒、噬菌體、病毒衣殼顆粒或其一種重組形式的核心顆粒。熟練的技術(shù)人員具有生產(chǎn)這樣的核心顆粒以及將其與組織者結(jié)合的知識(shí)。通過(guò)提供其它實(shí)施例,本發(fā)明在此提供了作為核心顆粒的乙型肝炎病毒-樣顆粒及麻疹病毒衣殼顆粒的生產(chǎn)(實(shí)施例17到22)。在這樣的一個(gè)實(shí)施方案中,JUN亮氨酸拉鏈蛋白結(jié)構(gòu)域或FOS亮氨酸拉鏈蛋白結(jié)構(gòu)域可被用作組織者,從而作為本發(fā)明的非天然的分子支架的第一結(jié)合位點(diǎn)。
實(shí)施例23-29提供分別作為第一和第二結(jié)合位點(diǎn)的、攜帶與一個(gè)反應(yīng)性賴氨酸殘基符合閱讀框地融合的肽的乙型肝炎核心顆粒,和攜帶遺傳上融合的半胱氨酸殘基的抗原的生產(chǎn)的細(xì)節(jié)。B.具有第二結(jié)合位點(diǎn)的抗原或抗原決定簇的構(gòu)建本發(fā)明的組合物的第二個(gè)元件是一種擁有至少一個(gè)能夠通過(guò)至少一個(gè)非-肽鍵結(jié)合到非天然的分子支架的第一結(jié)合位點(diǎn)的第二結(jié)合位點(diǎn)的抗原或抗原決定簇。本發(fā)明提供了根據(jù)考慮所期望的治療效果所選擇的抗原或抗原決定簇而變化的組合物。其它組合物通過(guò)變化為第二結(jié)合位點(diǎn)所選擇的分子來(lái)提供。
本發(fā)明的抗原可選自(a)適于誘導(dǎo)抗癌細(xì)胞免疫應(yīng)答的蛋白;(b)適于誘導(dǎo)抗傳染病免疫應(yīng)答的蛋白;(c)適于誘導(dǎo)抗過(guò)敏原免疫應(yīng)答的蛋白,及(d)適于在家畜動(dòng)物中誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的蛋白。
在本發(fā)明的一個(gè)特定的實(shí)施方案中,抗原或抗原決定簇是對(duì)傳染病預(yù)防有用的抗原或抗原決定簇。這樣的治療方法對(duì)于治療大量影響范圍廣泛的宿主,例如人、奶牛、羊、豬、狗、貓、其它物種哺乳動(dòng)物以及非-哺乳動(dòng)物的傳染病將會(huì)是有用的??梢灾委煹募膊?duì)本領(lǐng)域中熟練人員是公知的,這些實(shí)例包括病毒性感染,例如HIV、流感、皰疹、病毒性肝炎、Epstein Bar,脊髓灰質(zhì)炎、病毒性腦炎、麻疹、水痘,等;或細(xì)菌性感染,例如肺炎、肺結(jié)核、梅毒,等;或寄生蟲(chóng)性感染,例如瘧疾、錐蟲(chóng)病、利什曼病、trichomoniasis、阿米巴病,等。因此,為本發(fā)明的組合物所選擇的抗原或抗原決定簇對(duì)于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的人員將會(huì)是公知的;抗原或抗原決定簇的實(shí)例包括HIV抗原gp140和gp160;流感病毒抗原紅細(xì)胞凝集素和神經(jīng)胺酸酶;乙型肝炎表面抗原、瘧疾的環(huán)子孢子蛋白。
在另一個(gè)特定的實(shí)施方案中,本發(fā)明的組合物是可以用于過(guò)敏反應(yīng)或癌癥治療的免疫治療劑。
用于治療過(guò)敏反應(yīng)的組合物及方法的抗原或抗原決定簇的選擇對(duì)于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中治療這樣的疾病的熟練人員是公知的;這種類型的抗原或抗原決定簇的代表性實(shí)例包括蜂毒磷脂酶A2、BetvI(樺木花粉過(guò)敏原(birch pollen allergen))、5Dol m V(white-faced hornetvenom a1lergen)、Der p I(House dust mite allergen)。
用于癌癥治療的組合物及方法的抗原及抗原決定簇的選擇對(duì)于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中治療這樣的疾病的熟練人員是公知的;這種類型的抗原或抗原決定簇的代表性實(shí)例包括Her2(乳腺癌)、GD2(成神經(jīng)細(xì)胞瘤)、EGF-R(惡性成膠質(zhì)細(xì)胞瘤)、CEA(甲狀腺髓樣癌)、CD52(白血病)。
在本發(fā)明的一個(gè)特別的實(shí)施方案中,抗原或抗原決定簇選自(a)HIV的一種重組蛋白,(b)流感病毒的一種重組蛋白,(c)丙型肝炎病毒的一種重組蛋白,(d)弓形蟲(chóng)的一種重組蛋白,(e)惡性瘧原蟲(chóng)的一種重組蛋白,(f)間日瘧原蟲(chóng)的一種重組蛋白,(g)卵形瘧原蟲(chóng)的一種重組蛋白,(h)三日瘧原蟲(chóng)的一種重組蛋白,(i)乳腺癌細(xì)胞的一種重組蛋白,(j)一種腎癌細(xì)胞的重組蛋白,(k)一種前列腺癌細(xì)胞的重組蛋白,(l)皮膚癌細(xì)胞的一種重組蛋白,(m)腦癌細(xì)胞的一種重組蛋白,(n)白血病細(xì)胞的一種重組蛋白,(o)一種重組的profiling,(p)蜂螫(bee sting)過(guò)敏反應(yīng)一種的重組蛋白,(q)堅(jiān)果過(guò)敏反應(yīng)的一種重組蛋白,(r)食物過(guò)敏反應(yīng)的一種重組蛋白、哮喘的重組蛋白及衣原體的一種重組蛋白。
一旦選定本組合物的抗原或抗原決定簇,在準(zhǔn)備要構(gòu)建與本發(fā)明非天然的分子支架結(jié)合的、有組織的重復(fù)的排列時(shí),可以給此分子加上至少一個(gè)第二結(jié)合位點(diǎn)。什么將會(huì)構(gòu)成一個(gè)適合的第二結(jié)合位點(diǎn)的知識(shí)對(duì)于本領(lǐng)域的熟練人員將會(huì)是公知的。第二結(jié)合位點(diǎn)的代表性實(shí)例包括,但是不限制于抗原、抗體或其抗體片段、生物素、親合素、鏈親合素、受體、受體的配基、配基、配基結(jié)合蛋白、相互作用的亮氨酸拉鏈多肽、氨基、與氨基反應(yīng)的化學(xué)基團(tuán)、羧基、與羧基反應(yīng)的化學(xué)基團(tuán)、巰基、與巰基反應(yīng)的化學(xué)基團(tuán),或其一種組合。
第一和第二結(jié)合位點(diǎn)之間的結(jié)合將利用所選擇的各個(gè)分子的特征來(lái)確定,但是,將會(huì)包括至少一個(gè)非肽-鍵。決定于第一和第二結(jié)合位點(diǎn)之間的組合,結(jié)合的實(shí)質(zhì)可以是共價(jià)的、離子的、疏水的、極性的,或其組合。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中,第二結(jié)合位點(diǎn)可以是FOS亮氨酸拉鏈蛋白結(jié)構(gòu)域或JUN亮氨酸拉鏈蛋白結(jié)構(gòu)域。
在最具體的實(shí)施方案中,所選的該第二結(jié)合位點(diǎn)是FOS亮氨酸拉鏈蛋白結(jié)構(gòu)域,F(xiàn)OS亮氨酸拉鏈蛋白結(jié)構(gòu)域與本發(fā)明的非天然的分子支架的JUN亮氨酸拉鏈蛋白結(jié)構(gòu)域特異性地結(jié)合。JUN和FOS亮氨酸拉鏈蛋白結(jié)構(gòu)域之間的結(jié)合提供了一個(gè)在此支架表面形成有組織的重復(fù)的抗原或抗原決定簇排列的基礎(chǔ)。FOS亮氨酸拉鏈蛋白結(jié)構(gòu)域可以符合閱讀框地與所選的抗原或抗原決定簇在氨基端、羧基端融合,或者如果希望的話定位于蛋白質(zhì)內(nèi)部。
出于示范意圖,提供數(shù)個(gè)FOS融合構(gòu)建體。人生長(zhǎng)激素(實(shí)施例4)、蜂毒磷脂酶A2(PLA)(實(shí)施例9)、卵清蛋白(實(shí)施例10)和HIVgp140(實(shí)施例12)。
為了簡(jiǎn)化FOS融合蛋白構(gòu)建體的生成,公開(kāi)了數(shù)種載體為抗原或抗原決定簇的設(shè)計(jì)和構(gòu)建提供選擇的載體(參見(jiàn)實(shí)施例6)。載體pAV1-4是為FOS融合蛋白在E.coli中表達(dá)而設(shè)計(jì)的;載體pAV5和pAV6是為FOS融合蛋白在真核細(xì)胞中表達(dá)而設(shè)計(jì)的。這些載體的性質(zhì)簡(jiǎn)述如下1.pAV1此載體是為將FOS位于C-末端的融合蛋白分泌到E.coli周質(zhì)間隙而設(shè)計(jì)的。感興趣的基因(g.o.i)可以連接到此載體的Stu I/Not I位點(diǎn)。
2.pVA2此載體是為將FOS位于N-末端的融合蛋白分泌到E.coli周質(zhì)間隙而設(shè)計(jì)的。感興趣(g.o.i)的基因可以連接到此載體的Not I/EcoRV位點(diǎn)(或Not I/HindIII)。
3.pAV3此載體是在E.coli中細(xì)胞質(zhì)生產(chǎn)FOS位于C-末端的融合蛋白而設(shè)計(jì)的。感興趣(g.o.i)的基因可以連接到此載體的EcoRV/Not I位點(diǎn)。
4.pAV4此載體是在E.coli中細(xì)胞質(zhì)產(chǎn)生FOS位于N-末端的融合蛋白而設(shè)計(jì)的。感興趣(g.o.i)的基因可以連接到此載體的Not I/EcoRV位點(diǎn)(或Not I/HindIII)?;诘鞍踪|(zhì)被合成即通過(guò)蛋白質(zhì)水解除去N-末端的甲硫氨酸殘基(Hirel等,美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊(ProcNatl.Acad Sci.USA)868247-8251(1989)).
5.pAV5此載體是為FOS位于C-末端的融合蛋白的真核生產(chǎn)而設(shè)計(jì)的。感興趣的基因(g.o.i)可以通過(guò)將其連接到此載體的EcoR47III/Not I位點(diǎn)而插入編碼hGH信號(hào)序列及FOS結(jié)構(gòu)域的序列之間?;蛘?,一種含有其自身信號(hào)序列的基因,可以通過(guò)連接到Stu I/Not I位點(diǎn)而融合到FOS編碼序列。
6.pAY6此載體是為N一末端具有FOS的融合蛋白的真核生產(chǎn)而設(shè)計(jì)的。感興趣的基因(g.o.i)可以連接到此載體的Not I/Stu I(或NotI/HindIII)位點(diǎn)。
正如本領(lǐng)域的熟練人員將會(huì)理解的,一種FOS-抗原或抗原決定簇融合蛋白的構(gòu)建可以包括便于重組蛋白生產(chǎn)的特定遺傳元件的加入。實(shí)施例4為特定的E.coli轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件的加入提供指導(dǎo),實(shí)施例7為真核信號(hào)序列的加入提供指導(dǎo)。其它遺傳元件可根據(jù)實(shí)施者的特定需要而加以選擇。
還可見(jiàn)本發(fā)明包括FOS-抗原或FOS-抗原決定簇融合蛋白在細(xì)菌(實(shí)施例5)或真核細(xì)胞(實(shí)施例8)中的生產(chǎn)。選擇在何種細(xì)胞類型中表達(dá)此融合蛋白是熟練技術(shù)人員知識(shí)之內(nèi)的事情,取決于這些因子,例如翻譯后修飾在此組合物的設(shè)計(jì)中是否是一項(xiàng)重要的考慮。
正如先前提到的,本發(fā)明公開(kāi)各種通過(guò)使用pAY載體構(gòu)建FOS-抗原或FOS-抗原決定簇融合蛋白的各種方法。除了能進(jìn)行原核和真核表達(dá)之外,這些載體允許實(shí)施者選擇-和C-末端加入到FOS亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域的抗原。提供了特定實(shí)施例,其中將-和C-末端FOS融合進(jìn)行到PLA(實(shí)施例9)及卵清蛋白(實(shí)施例10)上。實(shí)施例11說(shuō)明PLA和卵清蛋白融合蛋白的純化。
在一個(gè)最特定的實(shí)施方案中,本發(fā)明描述一種由HIV基因組所編碼的抗原或抗原決定簇。更特別的,此HIV抗原是gp140。正如實(shí)施例11-15中所提供的一樣,可以創(chuàng)造HIV gp140,具有FOS亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域和為結(jié)合本發(fā)明的非天然的分子支架所合成和純化的融合蛋白。正如本領(lǐng)域的熟練人員將會(huì)知道的,其它HIV抗原或抗原決定簇可被用于本發(fā)明的組合物的創(chuàng)造。
在本發(fā)明的一個(gè)最特定的實(shí)施方案中,所選擇的第二結(jié)合位點(diǎn)是一個(gè)半胱氨酸殘基,此半胱氨酸殘基特異性地結(jié)合本發(fā)明的非天然的分子支架的賴氨酸殘基。賴氨酸殘基(Lys)與半胱氨酸(Cys)的化學(xué)結(jié)合提供了一個(gè)在支架的表面形成有組織的重復(fù)的抗原或抗原決定簇排列的基礎(chǔ)。半胱氨酸殘基可以符合讀框地改造到所選抗原或抗原決定簇,在氨基端、羧基端的或者如果期望的話位于此蛋白的內(nèi)部。例如,提供PLA和HIVgp140用于連接到賴氨酸殘基第一結(jié)合位點(diǎn)的半胱氨酸殘基。
C.甲疫苗(AlphaVaccine)顆粒的制備本發(fā)明提供有序的和重復(fù)的抗原排列的新組合物和構(gòu)建方法。正如本領(lǐng)域的熟練人員將會(huì)知道的一樣,有序的和重復(fù)的抗原排列的組裝條件在很大程度上取決于非天然支架的第一結(jié)合位點(diǎn)的特定選擇及抗原或抗原決定簇的第二結(jié)合位點(diǎn)的特定選擇。因此,在此組合物設(shè)計(jì)中實(shí)施者的選擇(也就是說(shuō),第一及第二結(jié)合位點(diǎn)、抗原及非天然支架的選擇)將會(huì)決定甲疫苗(AlphaVaccine)顆粒(有序的和重復(fù)的抗原排列及所結(jié)合非天然的分子支架)組裝的特定條件。與甲疫苗(AlphaVaccine)顆粒組裝有關(guān)的信息正好屬于實(shí)施者的工作知識(shí)之內(nèi),而且存在許多參考資料幫助實(shí)施者(例如,參見(jiàn)Sambrook,J.,等,編著的分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)第2版(MOLECULAR CLONINGALABRORORY MANNUAL.2ndedition),Cold Spring Harbor LaboratoryPress,Cold Spring Harbor,N.Y.(1998);及Ausubel,F(xiàn).,等,當(dāng)代分子生物學(xué)操作手冊(cè)(CURRUNT PROTOCALS In MOLECULAR BIOLOGY),John H.Wiley & Sons,Inc.(1997);Celis,J.編著,細(xì)胞生物學(xué)(CELL BIOLOGY),Academic Press,2ndedition(1998);及Harlow,E.和Lane,D.“抗體實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(AntibodiesA LaboratoryManual)”,Cold Spring Harbor,N.Y.)(1988)),所有這些文獻(xiàn)在此作為參考文獻(xiàn)并入本發(fā)明。
在一個(gè)特定實(shí)施方案中,分別將JUN和FOS亮氨酸拉鏈蛋白結(jié)構(gòu)域用于本發(fā)明的第一和第二結(jié)合位點(diǎn)。在AlphaVaccine(甲疫苗)的制備中,抗原必須在促進(jìn)有序的和重復(fù)的抗原排列到非天然支架之上的條件下生產(chǎn)和純化。在這個(gè)特別的JUN/FOS亮氨酸拉鏈蛋白結(jié)構(gòu)域?qū)嵤┓桨钢?,F(xiàn)OS-抗原或FOS-抗原決定簇應(yīng)該用還原劑(例如二硫蘇糖醇(DTT))進(jìn)行處理從而減少或消除二硫鍵形成的發(fā)生率(實(shí)施例15)。
對(duì)于JUN/FOS亮氨酸拉鏈蛋白結(jié)構(gòu)域?qū)嵤┓桨傅姆翘烊恢Ъ?也就是說(shuō),重組辛德比斯病毒)的制備,重組E2-JUN病毒顆粒應(yīng)該濃縮、中和并用還原劑處理(實(shí)施例16)。
在這個(gè)JUN/FOS實(shí)施方案中有序的和重復(fù)的抗原排列的組裝,是在存在redox shuffle的存在下完成的。E2-JUN病毒顆粒與240倍摩爾過(guò)量的FOS-抗原或FOS-抗原決定簇在4℃結(jié)合10小時(shí)。隨后,AlphaVaccine(甲疫苗)顆粒通過(guò)層析方法濃縮及純化(實(shí)施例16)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中,非天然的分子支架偶聯(lián)到抗原或抗原決定簇上可以通過(guò)化學(xué)交聯(lián)來(lái)完成。在一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中,化學(xué)試劑是異雙功能交聯(lián)試劑,例如ε-馬來(lái)酰亞胺己酸N-羥基琥珀酰亞胺酯(Tanimori等,藥物藥效學(xué)雜志(J.Phar.Dyn.)4812(1981);Fujiwara等,免疫學(xué)方法雜志(J.Immunol.Meth.)45195(1981)),此酯含有(1)與氨基反應(yīng)的琥珀酰亞胺基團(tuán)和(2)與SH基團(tuán)反應(yīng)的馬來(lái)酰亞胺基團(tuán)。第一結(jié)合位點(diǎn)的一種異源蛋白或多肽可以加工成含有一個(gè)或多個(gè)作為此異雙功能交聯(lián)試劑的琥珀酰亞胺部分的反應(yīng)部分的賴氨酸殘基。一旦被化學(xué)偶聯(lián)到非天然的分子支架的第一結(jié)合位點(diǎn)上,此異雙功能交聯(lián)試劑的馬來(lái)酰亞胺基團(tuán)將可與抗原或抗原決定簇上半胱氨酸殘基的SH基團(tuán)反應(yīng)。在這個(gè)實(shí)例中,抗原或抗原決定簇制備可能需要將半胱氨酸加工到被選為第二結(jié)合位點(diǎn)的蛋白或多肽中,從而使其可以與結(jié)合到非天然的分子支架第一結(jié)合位點(diǎn)的交聯(lián)試劑上自由的馬來(lái)酰亞胺功能反應(yīng)。
C.組合物、疫苗及其給藥,與治療的方法在一個(gè)實(shí)施方案中,本發(fā)明提供在廣泛的物種,特別是哺乳動(dòng)物例如人、猴、奶牛、狗、馬、豬等當(dāng)中預(yù)防傳染病的疫苗??梢栽O(shè)計(jì)疫苗來(lái)治療病毒性感染,例如HIV、流感、皰疹、病毒性肝炎、EpsteinBar、脊髓灰質(zhì)炎、病毒性腦炎、麻疹、水痘等;或細(xì)菌性傳染病,例如肺炎、肺結(jié)核、梅毒等;或寄生蟲(chóng)性感染,例如瘧疾、錐蟲(chóng)病、利什曼病、滴蟲(chóng)病、阿米巴病等。
在另一個(gè)實(shí)施方案中,本發(fā)明提供在廣泛的物種,特別是哺乳動(dòng)物例如人、猴、奶牛、狗、馬、豬等當(dāng)中預(yù)防癌癥的疫苗??梢栽O(shè)計(jì)疫苗來(lái)治療所有類型癌癥淋巴溜、細(xì)胞癌、肉瘤、黑色素瘤等。
在本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方案中,本發(fā)明的組合物可用于治療過(guò)敏反應(yīng)的疫苗的設(shè)計(jì)。IgE同種型的抗體是過(guò)敏反應(yīng)中的重要成分。肥大細(xì)胞在其表面結(jié)合IgE抗體,而且一旦特異性抗原結(jié)合到結(jié)合在肥大細(xì)胞表面的IgE抗體,就釋放組織胺和其它的過(guò)敏反應(yīng)介質(zhì)。因此,抑制IgE抗體的生產(chǎn),是一個(gè)有希望的抗過(guò)敏反應(yīng)的靶。通過(guò)獲得一種期望的T輔助細(xì)胞應(yīng)答,這應(yīng)該是可能的。T輔助細(xì)胞應(yīng)答可以分成1型(TH1)和2型(TH2)輔助細(xì)胞應(yīng)答(Ramagnani,當(dāng)代免疫學(xué)(Immunol.Today)18263-266(1997))。TH1細(xì)胞分泌干擾素-γ及其它觸發(fā)B細(xì)胞產(chǎn)生IgG1-3抗體的細(xì)胞因子。相反地,TH2細(xì)胞所分泌的一種至關(guān)重要的細(xì)胞因子是IL-4,此細(xì)胞因子驅(qū)使B細(xì)胞產(chǎn)生IgG4及IgE抗體。在許多實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)中,TH1和TH2應(yīng)答的發(fā)展是相互排斥的,因?yàn)門(mén)H1細(xì)胞抑制TH2細(xì)胞的誘導(dǎo),反之亦然。因此,觸發(fā)強(qiáng)烈TH1應(yīng)答的抗原同時(shí)抑制TH2細(xì)胞應(yīng)答的發(fā)展,以及IgE抗體的產(chǎn)生。有趣地,事實(shí)上所有的病毒在宿主中誘導(dǎo)TH1應(yīng)答而不能觸發(fā)IgE抗體的產(chǎn)生(Coutelie等,實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志(J.Exp.Med.)16564-69(1987))。此同種型模式并不僅僅限定于活病毒,在滅活的或重組病毒顆粒上也被觀察到(Lo-Man等,歐洲免疫學(xué)雜志(Eur.J.Immunol.)281401-1407(1998))。因此,通過(guò)使用本發(fā)明的方法(例如,AlphaVaccine Technology(甲疫苗技術(shù))),可用各種過(guò)敏原點(diǎn)綴病毒顆粒并用于免疫。因?yàn)樗a(chǎn)生的過(guò)敏原的“病毒結(jié)構(gòu)將會(huì)引起一個(gè)TH1應(yīng)答,將會(huì)產(chǎn)生“保護(hù)性”IgG1-3抗體,而引起過(guò)敏反應(yīng)的IgE抗體的產(chǎn)生將會(huì)被避免。因?yàn)檫^(guò)敏原是以被不同組的輔助T細(xì)胞識(shí)別的病毒顆粒而不是以過(guò)敏原自身被呈遞的,所以在即使定居有已經(jīng)存在的對(duì)此過(guò)敏原特異的TH2細(xì)胞的過(guò)敏性個(gè)體中也可能誘導(dǎo)過(guò)敏原特異性IgG1-3抗體。高濃度IgG抗體的存在,可以避免過(guò)敏原結(jié)合到結(jié)合著肥大細(xì)胞的IgE上,從而抑制組織胺的釋放。因此,IgG抗體的存在可以保護(hù)(肌體)抗IgE介導(dǎo)的過(guò)敏反應(yīng)。引起過(guò)敏反應(yīng)的典型物質(zhì)包括草、豚草、樺(birch)或高山雪松花粉(mountain cedarpollen)、屋塵(house dust)、螨(mites)、動(dòng)物毛發(fā)皮屑(animaldanders)、霉菌(mold)、昆蟲(chóng)毒素(insect venom)或藥物(例如青霉素)。因此,給個(gè)體用過(guò)敏原修飾的病毒顆粒免疫不僅在過(guò)敏反應(yīng)發(fā)病之前,而且在發(fā)病之后,都應(yīng)該是有益的。
正如本領(lǐng)域的具有普通技能的人員將會(huì)理解的一樣,當(dāng)給個(gè)體給藥本發(fā)明的組合物時(shí),它們可以是一種含有鹽、緩沖液、佐劑或其它改善組合物之效能的物質(zhì)的組合物。在包括REMIGTON′SPHARMACEUTICAL SCIENCE(Osol,A,ed.,Mack Publishing Co.,(1980))在內(nèi)的許多來(lái)源中,提供了適用于制備藥用組合物的材料的實(shí)例。
本發(fā)明的組合物,如果其給藥能夠被接受藥物的個(gè)體耐受,那么就說(shuō)其是“藥理上接受的”。進(jìn)一步地,本發(fā)明的組合物將按一個(gè)“治療有效的量”給藥(也就是說(shuō),一個(gè)產(chǎn)生所期望的生理效應(yīng)的量)。
本發(fā)明的組合物可用本領(lǐng)域公知的各種方法給藥,但是通常將會(huì)通過(guò)注射、灌輸、吸入、口服或其它適合的物理方法給藥。此外,此組合物還可以通過(guò)肌肉內(nèi)、靜脈內(nèi)或皮下注射給藥。給藥的組合物的成分包括無(wú)菌的水溶液(例如生理鹽水)、非水溶液以及懸浮液。非水性溶劑的實(shí)例包括丙二醇、聚乙二醇、植物油例如橄欖油、以及可以注射的有機(jī)酯例如油酸乙酯。載體或密閉包裝可用來(lái)提高皮膚通透性及增強(qiáng)抗原吸收。
除疫苗技術(shù)之外,本發(fā)明的其它實(shí)施方案描述癌癥和過(guò)敏反應(yīng)的醫(yī)學(xué)治療。
在此所引用的全部專利及公開(kāi)明確地作為參考文獻(xiàn)并入本發(fā)明。
實(shí)施例用于以下實(shí)驗(yàn)的酶或試劑包括從New England Biolabs獲得的T4DNA連接酶;從QIAGEN獲得的Taq DNA聚合酶、QIAprep Spin PlamidKit試劑盒,QIAGEN Plasmid Midi Kit試劑盒、QiaExIIGel ExtractionKit試劑盒、QIAquick PCR Purification Kit試劑盒;從Pharmacia獲得的QuickPrep Micro mRNA Purification Kit試劑盒;從Gibco BRL獲得的Superscript One-step RT-PCR Kit試劑盒、胎牛血清(FCS)、胰化蛋白胨及酵母提取物;從Microsynth(Switzerland)獲得的寡聚核苷酸;從Boehringer Mannheim、New England Biolabs或MBIFermentas獲得的限制性內(nèi)切酶;從Boehringer Mannheim獲得的Pwo聚合酶及dNTPs。從Cell culture technologies(Glattbrugg,Switzerland)獲得HP-1培養(yǎng)基。所有的標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)品從Fluka-Sigma-Aldrich獲得,而所有的細(xì)胞培養(yǎng)材料從TPP獲得。
DNA操作使用標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)實(shí)施。根據(jù)生產(chǎn)商的使用說(shuō)明使用QIAprep Spin Plamid Kit試劑盒用2ml細(xì)菌培養(yǎng)或使用QIAGENPlasmid Midi Kit試劑盒用50ml培養(yǎng)物制備了DNA。為了進(jìn)行限制性內(nèi)切酶消化,在生產(chǎn)商推薦的條件(緩沖液和溫度)下,將DNA與適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶以每毫克DNA 5-10單位(U)酶的濃度溫育了至少2小時(shí)。如果反應(yīng)條件對(duì)所有的酶都合適,則同時(shí)進(jìn)行多于一個(gè)酶的消化,否則進(jìn)行順序消化。為進(jìn)一步操作而分離的DNA片段在0.7-1.5%瓊脂糖凝膠上利用電泳分離,從凝膠上切除并根據(jù)生產(chǎn)商所提供的使用說(shuō)明利用QiaExII Gel Extration Kit試劑盒純化。為了DNA片段的連接,將100到200pg已純化的載體DNA與三倍摩爾過(guò)量的插入片段在生產(chǎn)商所提供的緩沖液(總體積10-20μl)中存在1U T4 DNA連接酶的條件下,在16℃溫育過(guò)夜。等份(0.1-0.5μl)連接反應(yīng)液被用于E.coli XL 1-Blue(Stratagene)的轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化使用一個(gè)Gene Pulser(BioRAD)和0.1cm Gene Pulser Cuvettes(BioRAD)在200Ω,25μF,1.7kV條件下通過(guò)電穿孔完成。電穿孔之后,將此細(xì)胞在1ml S.O.B.培養(yǎng)基(Miller,1972)中搖動(dòng)溫育1小時(shí)。
實(shí)施例1JUN兩親性螺旋結(jié)構(gòu)域在E2中的插入在載體pTE5′2J(Hanh等,美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)892679-2683(1992))中,在結(jié)構(gòu)蛋白E2編碼序列的密碼子71(Gln)和密碼子74(Thr)之間引進(jìn)了MluI及BstEII限制性內(nèi)切酶切位點(diǎn),產(chǎn)生載體pET5′2IBM。這些限制性內(nèi)切酶切位點(diǎn)的引進(jìn)是使用以下寡聚核苷酸通過(guò)PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))完成的
Oligo 1E2insBstEII/BssHII5′-ggggACGCGTGCAGCAggtaaccaccgTTAAAGAAGGCACC-3′(SEQ IDNO1)Oligo 2E2insMluIStuI5′-cggtggttaccTGCTGCACGCGTTGCTTAAGCGACATGTAGCGG-3′(SEQID NO2)Oligo 3E2insStuI5′-CCATGAGGCCTACGATACCC-3′(SEQ ID NO3)Oligo 4E2insBssHII5′-GGCACTCACGGCGCGCTTIACAGGC-3′(SEQID NO4)為了PCR反應(yīng),使用每一種寡聚核苷酸各100pmol與5ng模板DNA在100μl含有4單位Taq或Pwo聚合酶、0.1mM dNTPs和1.5mMMgSO4的反應(yīng)混合物中進(jìn)行反應(yīng)。所有的DNA濃度都使用GeneQuant裝置(Pharmacia)利用光度測(cè)定法測(cè)定。聚合酶在開(kāi)始PCR反應(yīng)之前直接加入(起點(diǎn)是95℃)。溫度循環(huán)以如下方式和次序完成95℃2分鐘;5個(gè)95℃(45秒)、53℃(60秒)、72℃(80秒)循環(huán);及25個(gè)95℃(45秒)、57℃(60秒)、72℃(80秒)循環(huán)。
分析了這兩個(gè)PCR片段,并利用瓊脂糖電泳純化。使用寡聚核苷酸3和4(oligo3和4)進(jìn)行這兩個(gè)PCR片段的裝配PCR(Assembly PCR)擴(kuò)增從而獲得最終的構(gòu)建體。
為了裝配PCR反應(yīng),使用每一種寡聚核苷酸各100pmol與2ng已純化的PCR片段在100μl含有4單位Taq或Pwo聚合酶、0.1mMdNTPs和1.5mM MgSO4的反應(yīng)混合物中進(jìn)行反應(yīng)。所有的DNA濃度都使用GeneQuant裝置(Pharmacia)利用光度測(cè)定法測(cè)定。聚合酶在開(kāi)始PCR反應(yīng)之前直接加入(起點(diǎn)是95℃)。溫度循環(huán)以如下方式和次序完成95℃2分鐘;5個(gè)95℃(45秒)、57℃(60秒)、72℃(90秒)循環(huán);及25個(gè)95℃(45秒)、59℃(60秒)、72℃(90秒)循環(huán)。
最終的PCR產(chǎn)物使用Qia Spin PCR柱(Qiagen)純化,并用BssHII及StuI限制性核酸內(nèi)切酶各10單位在一種合適的緩沖液中在37℃消化12小時(shí)。DNA片段進(jìn)行凝膠純化,并連接到已用BssHII及StuI消化和凝膠純化的pTE5′2J載體上(Hanh等,美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)892679-2683)。首先利用BstEII及MluI限制性分析,此后又通過(guò)PCR產(chǎn)物的DNA序列測(cè)定,分析了PCR產(chǎn)物的正確插入。
使用如下寡聚核苷酸從載體pJuFo(Crameri和Suter,基因(Gene)13769(1993))PCR-擴(kuò)增編碼JUN兩親性螺旋結(jié)構(gòu)域的DNA序列Oligo 5JUNBstEII5′-CCTTCTTTAAcggtggttaccTGCTGGCAACCAACGTGGTTCATGAC-3′(SEQ ID NO5)Oligo 6MluIJUN5′-AAGCATGCTGCacgcgtgTGCGGTGGTCGGATCGCCCGGC-3′(SEQ ID NO6)為了這個(gè)PCR反應(yīng),使用每一種寡聚核苷酸各100pmol與5ng已經(jīng)純化的DNA模板在100μl含有4單位Taq或Pwo聚合酶、0.1mMdNTPs和1.5mM MgSO4的反應(yīng)混合物中進(jìn)行反應(yīng)。所有的DNA濃度都使用GeneQuant裝置(Pharmacia)利用光度測(cè)定法測(cè)定。聚合酶在開(kāi)始PCR反應(yīng)之前直接加入(起點(diǎn)是95℃)。溫度循環(huán)以如下方式和次序完成95℃2分鐘;5個(gè)95℃(45秒)、60℃(30秒)、72℃(25秒)循環(huán);及25個(gè)95℃(45秒)、68℃(30秒)、72℃(20秒)循環(huán)。
最終的PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠純化,并連接到已用EcoRV消化和凝膠純化的pBluecsript(KS-)上。通過(guò)使用MluI和BstEII切割從所產(chǎn)生的載體中分離了JUN序列,用QiaExII純化,并將其連接到載體pTE5′2JBM上(先前用相同的限制性內(nèi)切酶切割),從而獲得載體pTE5′2JE2JUN。
實(shí)施例2使用pCYTts系統(tǒng)生產(chǎn)含有E2-JUN的病毒顆粒使用pTE5′2JE2JUN作為模板和寡聚核苷酸XgalStruct(ctatcaTCTAGAATGAATAGAGGATTCTTTAAC)和StructBsp1201(tcgaatGGGCCCTCATCTTCGTGTGCTAGTCAG)PCR-擴(kuò)增此結(jié)構(gòu)蛋白。為了這個(gè)PCR,使用每一種寡聚核苷酸各100pmol和5ng已純化的DNA模板在100μl含有4單位Taq或Pwo聚合酶、0.1mM dNTPs和1.5mM MgSO4的反應(yīng)混合物中進(jìn)行反應(yīng)。所有的DNA濃度都使用GeneQuant裝置(Pharmacia)利用光度測(cè)定法測(cè)定。聚合酶在開(kāi)始PCR反應(yīng)之前直接加入(起點(diǎn)是95℃)。溫度循環(huán)如下95℃3分鐘,隨后是5個(gè)95℃(30秒)、54℃(35秒)、72℃(270秒)循環(huán);隨后又是25個(gè)95℃(30秒)、63℃(35秒)、72℃(270秒)循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠純化,并使用限制性內(nèi)切酶Xbal I/Bsp1201消化,連接到以前已用相同的酶切割過(guò)的載體pCYTts上(美國(guó)專利申請(qǐng),申請(qǐng)?zhí)?0/079,562;1998年3月27日提交)。
20μg pCYTtsE2JUN與30單位ScaI在一種合適的緩沖液中在37℃溫育至少4小時(shí)。利用酚/氯仿抽提終止反應(yīng),隨后利用異丙醇沉淀線性DNA。利用瓊脂糖電泳檢查了限制性酶切反應(yīng)。為了轉(zhuǎn)染,將5.4μg線性化pCYTtsE2JUN與0.6μg線性pSV2Neo在30μl H2O中混合,并加入30μl 1M CaCl2溶液。加入60μl磷酸緩沖液(50mM HEPES,280mM NaCl,1.5mM Na2PO4,pH7.05)之后,渦旋溶液5秒鐘,隨后在室溫溫育25秒鐘。立即將此溶液加入2ml含有2%FCS的HP-1培養(yǎng)基(2%FCS培養(yǎng)基)中。使用含有DNA的培養(yǎng)基替換6-孔板中80%鋪滿的BHK21細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基。在CO2培養(yǎng)箱中在37℃溫育5小時(shí)之后,除去含有DNA的培養(yǎng)基并用2ml內(nèi)含15%甘油的2%FCS培養(yǎng)基替換。在30秒的溫育期之后除去含有甘油的培養(yǎng)基,使用5ml含有10%FCS的HP-1培養(yǎng)基漂洗而洗滌細(xì)胞。最后,加入含有2ml含有10%FCS的新鮮的HP-1培養(yǎng)基。
選擇被穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞,并在37℃在CO2培養(yǎng)箱中在選擇培養(yǎng)基(補(bǔ)充了G418的HP-1培養(yǎng)基)中培養(yǎng)。當(dāng)此混合細(xì)胞群生長(zhǎng)到鋪滿時(shí),將此培養(yǎng)物分入2個(gè)平皿,隨后在37℃培養(yǎng)12小時(shí)。將一平皿細(xì)胞轉(zhuǎn)移到30℃從而誘導(dǎo)病毒顆粒的表達(dá);另一平皿細(xì)胞在37℃保存。
病毒顆粒的表達(dá)利用Western印跡測(cè)定(圖1)。用培養(yǎng)基(0.5ml)進(jìn)行甲醇/氯仿沉淀,沉淀物在SDS-PAGE(聚丙烯酰胺凝膠電泳)上樣緩沖液中重新懸浮。樣品在95℃加熱5分鐘,然后上樣到15%丙烯酰胺凝膠上。在SDS-PAGE之后,如Bass和Yang,在Creighton,T.E.編著的蛋白質(zhì)功能一種實(shí)用方法(Protein FunctionA PracticalApproch,2ndedn.,),IRL Press,Oxford(1997),29-55頁(yè)所述,將蛋白轉(zhuǎn)移到Protan硝酸纖維膜(Schleicher & Schuell,Germany)上。用1%牛血清白蛋白的TBS溶液(10x TBS/升87.7g NaCl,66.1gTrima hydrochloride(Sigma)和9.7g Tris base(Sigma)pH7.4)在室溫封閉1小時(shí),此后與抗-El/E2抗體(多克隆抗體)溫育1小時(shí)。印跡斑點(diǎn)用TBS-T(含有0.05%Tween20的TBS)洗滌3次10分鐘,并與堿性磷酸酶-抗-兔IgG偶聯(lián)物(0.1μg/ml,Amersham LifeScience,England)溫育1小時(shí)。用TBS-T洗滌2次10分鐘和TBS洗滌2次10分鐘之后,使用堿性磷酸酶檢測(cè)試劑和50μl NBT(內(nèi)含7.7%氮藍(lán)四唑(Sigma)的70%二甲基甲酰胺)及37μl X-Phosphate溶液(內(nèi)含5%5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸的二甲基甲酰胺)進(jìn)行顯色反應(yīng)。
病毒顆粒的產(chǎn)生在圖1說(shuō)明。Western印跡模式說(shuō)明,與野生型E2(欄2)比較,E2-JUN(欄1)在SDS-PAGE上遷移到更高的分子量處,而B(niǎo)HK21宿主細(xì)胞系沒(méi)有顯示出任何背景。
實(shí)施例3使用pTE5′2JE2JUN載體生產(chǎn)含有E2-JUN的病毒顆粒無(wú)RNase載體(1.0μg)利用PvuI消化使其線性化。此后,使用一種SP6體外轉(zhuǎn)錄試劑盒(InvitroscriptCAP,Invitrogen,Invitrogen BV,NV Leek,Netherlands)進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄。所產(chǎn)生的5′-加帽的mRNA在還原性瓊脂糖凝膠上進(jìn)行分析。
根據(jù)Invitrogen的使用手冊(cè)(辛德比斯病毒表達(dá)系統(tǒng),Invitrogen BV,Netherlands),將體外轉(zhuǎn)錄的mRNA(5μg)電穿孔導(dǎo)入BHK21細(xì)胞(ATCCCCL10)。在37℃溫育10小時(shí)之后,使用不合有FCS的HP-1培養(yǎng)基替換含有FCS的培養(yǎng)基,此后又在37℃溫育10小時(shí)。收獲懸液,并完全按照實(shí)施例2中所述,利用Western印跡分析法分析病毒顆粒的產(chǎn)生。
所獲結(jié)果與圖2所示的用pCYTtsE2JUN獲得的結(jié)果相同。
實(shí)施例4人生長(zhǎng)激素(hGH)與FOS亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域(OmpA信號(hào)序列)的融合利用PCR從原始質(zhì)粒(ATCC31389)擴(kuò)增沒(méi)有人源前導(dǎo)序列的hGH基因。具有內(nèi)部XbaI位點(diǎn)的寡聚核苷酸7(Oligo7)是為在hGH基因的5′末端退火而設(shè)計(jì)的,而具有內(nèi)部EcoRI位點(diǎn)的寡聚核苷酸9(Oligo9)在hGH基因的3′末端引發(fā)。為了這個(gè)PCR反應(yīng),使用每一種寡聚核苷酸各100pmol和5ng已純化的模板DNA在75μl含有4單位Taq或Pwo聚合酶、0.1mM dNTPs和1.5mM MgSO4的反應(yīng)混合物中進(jìn)行反應(yīng)。
PCR循環(huán)按如下方式進(jìn)行30循環(huán),退火溫度是60℃而延伸時(shí)間是37℃1分鐘。
經(jīng)凝膠純化和分離的PCR產(chǎn)物被用作第二次PCR反應(yīng)的模板,從而引進(jìn)ompA信號(hào)序列及Shine-Dalgarno序列。為了這個(gè)PCR反應(yīng),使用寡聚核苷酸8和9(oligo8和9)各100pmol和1ng模板PCR產(chǎn)物在75μl反應(yīng)混合液中進(jìn)行反應(yīng)(4單位Taq或Pwo聚合酶,o.1mMdNTPs和1.5mM MgSO4)。最初5個(gè)循環(huán)的退火溫度55℃,延伸時(shí)間是72℃60秒;使用65℃的退火溫度和72℃60秒的延伸時(shí)間進(jìn)行另25個(gè)循環(huán)。
Oligo7gggtctagattcccaaccattcccttatccaggctttttgacaacgctatgctccgcgcccatcgtctgcaccagctggcctttgacacc(SEQ ID NO7)Oligo8gggtctagaaggaggtaaaaaacgatgaaaaagacagctatcgcgattgcagtggcactggctggtttcgctaccgtagcgcaggccttcccaaccattcccttatcc(SEQ ID NO8)Oligo9cccgaattcctagaagccacagctgccctcc(SEQID NO9)所產(chǎn)生的重組hGH基因經(jīng)過(guò)Xba I/EcoR I被亞克隆到pBluescript上。利用DNA測(cè)序證明了兩條鏈的正確序列。
使用下列寡聚核苷酸從載體pJuFo(Crameri & Suter基因(Gene)13769(1993))PCR-擴(kuò)增了編碼FOS兩親性螺旋結(jié)構(gòu)域的DNA序列omp-FOS5′-ccTGCGGTGGTCTGACCGACACCC-3′(SEQ ID NO10)FOS-hgh5-ccgcggaagagccaccGCAACCACCGTGTGCCGCCAGGATG-3′(SEQ IDNO11)為了這個(gè)PCR反應(yīng),使用每一種寡聚核苷酸各100pmol和5ng模板DNA在75μl反應(yīng)混合液(4單位Taq或Pwo聚合酶,0.1mM dNTPs和1.5mM MgSO4)中進(jìn)行反應(yīng)。溫度循環(huán)如下95℃2分鐘;此后是5個(gè)95℃(45秒)、60℃(30秒)、72℃(25秒)循環(huán);此后是25個(gè)95℃(45秒)、68℃(30秒)、72℃(20秒)循環(huán)。
PCR產(chǎn)物被純化和分離,并被克隆到用Stu I消化的pBluecript-ompA-hGH中。然后將雜合基因克隆到pKK223-3質(zhì)粒上(Pharmacia)。
實(shí)施例5FOS-hGH的細(xì)菌表達(dá)pkk223-3中的omp-FOS-hGH使用JM101作為E.coli宿主菌,在可誘導(dǎo)的IPTG-依賴性啟動(dòng)子的控制之下表達(dá)。表達(dá)在搖瓶中進(jìn)行。細(xì)胞在OD600為0.5時(shí)用1mM IPTG誘導(dǎo)。表達(dá)在37℃持續(xù)10小時(shí)。通過(guò)在10℃3600rpm離心10分鐘而收獲細(xì)胞。冰凍(-20℃或液氮)細(xì)胞沉淀物并貯存16小時(shí)。然后在4℃使此沉淀物解凍,并在10ml含有600mM蔗糖的10mM Tris-HCl,pH7.4中重新懸浮。在4℃攪拌15分鐘之后,細(xì)胞周質(zhì)蛋白通過(guò)滲透壓休克程序?qū)⒌鞍揍尫?。加入冷卻(4℃)的去離子H2O,然后在4℃攪拌30分鐘。將污泥稀釋,重新懸浮,并加入溶菌酶從而降解細(xì)菌的細(xì)胞壁。通過(guò)在4℃ 11000g離心20分鐘將細(xì)胞和細(xì)胞周質(zhì)球芽分離。利用含有還原性和非還原性SDS-PAGE及斑點(diǎn)印跡(Dot Bolt)分離了含有FOS-hGH上清。使用一種抗-hGH抗體(Sigma)作為第一抗體及堿性磷酸酶(AP)-抗-小鼠抗體偶聯(lián)物作為第二抗體,如實(shí)施例8中所述進(jìn)行斑點(diǎn)雜交。
全長(zhǎng)的、被正確加工的FOS-hGH在還原性及非還原性條件下可以檢測(cè)到。由于FOS兩親性螺旋中所存在的自由的半胱氨酸,F(xiàn)OS-hGH的一部分結(jié)合到其它沒(méi)有被鑒定的蛋白上。然而,超過(guò)50%的表達(dá)的FOS-hGH以其天然的單體構(gòu)象存在(圖3)。
將使用已純化的FOS-hGH,進(jìn)行使用含有JUN的病毒顆粒的最初的添加實(shí)驗(yàn)(doping experiment)。
實(shí)施例6表達(dá)FOS融合蛋白的pAV載體系列的構(gòu)建構(gòu)建一種多用途的載體系統(tǒng)從而允許在E.coli中進(jìn)行-或C-末端FOS融合蛋白的細(xì)胞質(zhì)生產(chǎn)或分泌,或者在真核細(xì)胞中進(jìn)行-或C-末端FOS融合蛋白的生產(chǎn)。為在E.coli中生產(chǎn)FOS融合蛋白而設(shè)計(jì)的載體pAV1-pAV4,包括以下所列的DNA盒,其含有按不同次序排列的下列遺傳元件(a)一個(gè)從E.coliompA基因衍生而來(lái)的強(qiáng)的核糖體結(jié)合位點(diǎn)和5′不翻譯區(qū)(aggaggtaaaaaacg)(第13號(hào)序列);(b)一個(gè)編碼E.coli外膜蛋白OmpA的信號(hào)肽的序列(MKKTAIAIAVALAGFATVAQA)(第14號(hào)序列)的序列;(c)一個(gè)編碼兩側(cè)具有兩個(gè)甘氨酸殘基和一個(gè)半胱氨酸殘基的FOS二聚化結(jié)構(gòu)域的序列(CGGLTDTLQAETDQVEDEKSALQTEIANLLKEKEKLEFILAAHGGC)(第15號(hào)序列);及(d)一個(gè)編碼一種連接感興趣蛋白與FOS二聚化結(jié)構(gòu)域的短肽接頭(AAASGG(第16號(hào)序列)或GGSAAA(第17號(hào)序列))的區(qū)域。有關(guān)的編碼區(qū)域以大寫(xiě)字母列出。限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)的排列使得具有或不具有信號(hào)信號(hào)序列的FOS融合蛋白的構(gòu)建容易。將此盒式組件克隆到在強(qiáng)tac啟動(dòng)子控制下表達(dá)此融合蛋白的表達(dá)載體pKK223-3(Pharmacia)中的EcoR I/HindIII限制性位點(diǎn)處。pAV1此載體是為將FOS位于C-末端的融合蛋白分泌到E.coli細(xì)胞周質(zhì)間隙而設(shè)計(jì)的。感興趣的基因(g.o.i)可以連接到此載體的StuI/NotI位點(diǎn)處。EcoRI 31/11gaa ttc agg agg taa aaa acg ATG AAA AAG ACA GCT ATC GCG ATT GCA GTG GCA CTG GCTM K K T A I A I A V A L A6/21StuINotIGGT TTC GCT ACC GTA GCG CAG GCC tgg gtg ggg GCG GCC GCT TCT GGT GGT TGC GGT GGTG F A T V A Q A(goi) A A A S G G C G G121/41 151/51CTG ACC GAC ACC CTG CAG GCG GAA ACC GAC CAG GTG GAA GAC GAA AAA TCC GCG CTG CAAL T D T L Q A E T D Q V E D E K S A L Q181/61 211/71ACC GAA ATC GCG AAC CTG CTG AAA GAA AAA GAA AAG CTG GAG TTC ATC CTG GCG GCA CACT E I A N L L K E K E K L E F I L A A H241/51 HindIIIGGT GGT TGC taa gct t(SEQ ID NO18)G G C * A(SEQ ID NO19)pAV2此載體是為將FOS位于N-末端的融合蛋白分泌到E.coli細(xì)胞周質(zhì)間隙而設(shè)計(jì)的。感興趣的基因(g.o.i)可以連接到此載體的NotI/EcoRV(或NotI/HindIII)位點(diǎn)處。EcoRI 31/11gaa ttc agg agg taa aaa acg ATG AAA AAG ACA GCT ATC GCG ATT GCA GTG GCA CTG GCTM K K T A I A I A V A L A61/21StuI 91/31GGT TTC GCT ACC GTA GCG CAG GCC TGC GGT GGT CTG ACC GAC ACC CTG CAG GCG GAA ACCG F A T V A Q A C G G L T D T L Q A E T121/41 151/51GAC CAG GTG GAA GAC GAA AAA TCC GCG CTG CAA ACC GAA ATC GCG AAC CTG CTG AAA GAAD Q V E D E K S A L Q T E I A N L L K E181/61 211/71 NotIAAA GAA AAG CTG GAG TTC ATC CTG GCG GCA CAC GGT GGT TGC GGT GGT TCT GCG GCC GCTK E K L E F I L A A H G G C G G S A A A241/81 EcoRV HindIIIggg tgt ggg gat atc aag ctt (SEQ ID NO20)(goi) (SEQ ID NO21)pAV3此載體是為在E.coli細(xì)胞質(zhì)生產(chǎn)FOS位于C-末端的融合蛋白而設(shè)計(jì)的。感興趣的基因(g.o.i)可以連接到此載體的EcoRV/NotI位點(diǎn)處。EcoRI EcoRV NotIgaa ttc agg agg taa aaa gat atc ggg tgt ggg GCG GCC GCT TCT GGT GGT TGC GGT GGT(goi) A A A S G G C G G61/21 91/31CTG ACC GAC ACC CTG CAG GCG GAA ACC GAC CAG GTG GAA GAC GAA AAA TCC GCG CTG CAAL T D T L Q A E T D Q V E D E K S A L Q121/41 151/51ACC GAA ATC GCG AAC CTG CTG AAA GAA AAA GAA AAG CTG GAG TTC ATC CTG GCG GCA CACT E I A N L L K E K E K L E F I L A A H181/61 HindIIIGGT GGT TGC taa gct t (SEQ ID NO22)G G C * (SEQ ID NO23)pAV4此載體是為在E.coli細(xì)胞質(zhì)生產(chǎn)FOS位于N-末端的融合蛋白而設(shè)計(jì)的。感興趣的基因(g.o.i)可以連接到此載體的NotI/EcoRV(或NotI/HindIII)位點(diǎn)處。一旦蛋白質(zhì)被合成即通過(guò)蛋白質(zhì)水解去除甲硫氨酸殘基(Hirel等,美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)868247-8251(1989))。EcoRI 31/11caa ttc agg agg taa aaa acg ATG GCT TGC GGT GGT CTG ACC GAC ACC CTG CAG GCG GAAE F R R * K T M A C G G L T D T L Q A E61/21 91/31ACC GAC CAG GTG GAA GAC GAA AAA TCC GCG CTG CAA ACC GAA ATC GCG AAC CTG CTG AAAT D Q V E D E K S A L Q T E I A N L L K121/41 151/51 NotIGAA AAA GAA AAG CTG GAG TTC ATC CTG GCG GCA CAC GGT GGT TGC GGT GGT TCT GCG GCCE K E K L E F I L A A H G G C G G S A A181/61 EcoRVHindIIIGCT ggg tgt ggg gat atc aag ctt (SEQ ID NO24)A (goi) (SEQ ID NO25)
載體pAV5和pAV6,是為FOS融合蛋白的真核生產(chǎn)而設(shè)計(jì)的,包括按不同次序排列的下列遺傳元件(a)一個(gè)編碼人生長(zhǎng)激素的前導(dǎo)肽的區(qū)域(MATGSRTSLLLAFGLLCLPWLQEGSA)(第26號(hào)序列);(b)一個(gè)編碼兩側(cè)具有兩個(gè)甘氨酸殘基和一個(gè)絲氨酸殘基的FOS二聚化結(jié)構(gòu)域的序列(CGGLTDTLQAETDQVEDEKSALQTEIANLLKEKEKLEFILAAHGGC)(第15號(hào)序列);及(c)一個(gè)編碼一個(gè)連接感興趣蛋白與FOS二聚化結(jié)構(gòu)域的短肽接頭(AAASGG(第16號(hào)序列)或GGSAAA(第17號(hào)序列))的區(qū)域。有關(guān)的編碼區(qū)域以大寫(xiě)字母列出。限制性切割位點(diǎn)的排列使得FOS融合基因的構(gòu)建容易。此盒式組件被克隆到表達(dá)載體pMPSVEH的EcoRI/HindIII限制性位點(diǎn)中(Artelt,等,基因(Gene)681998))。pAV5此載體是為FOS位于C-末端的融合蛋白的真核生產(chǎn)而設(shè)計(jì)的。感興趣的基因(g.o.i)可以通過(guò)將其連接到此載體的Eco47III/NotI位點(diǎn)而被插入編碼hGH信號(hào)序列和FOS結(jié)構(gòu)域的序列之間?;蛘?,一個(gè)含有其自身信號(hào)序列的基因可以通過(guò)將其連接到StuI/NotI位點(diǎn)而與FOS編碼序列融合。EcoRI StuI31/11gaa ttc agg cct ATG GCT ACA GGC TCC CGG ACG TCC CTG CTC CTG GCT TTT GGC CTG CTCM A T G S R T S L L L A F G L L61/21 Eco47IIINotITGC CTG CCC TGG CTT CAA GAG GGC AGC GCT ggg tgt ggg GCG GCC GCT TCT GGT GGT TGCC L P W L Q E G S A (goi) A A A S G G C121/41 151/51GGT GGT CTG ACC GAC ACC CTG CAG GCG GAA ACC GAC CAG GTG GAA GAC GAA AAA TCC GCGG G L T D T L Q A E T D Q V E D E K S A181/61 211/71CTG CAA ACC GAA ATC GCG AAC CTG CTG AAA GAA AAA GAA AAG CTG GAG TTC ATC CTG GCGL Q T E I A N L L K E K E K L E F I L A241/81HindIIIGCA CAC GGT GGT TGC taa gct t(SEQ ID NO27)A H G G C * (SEQ ID NO28)pAV6此載體是為FOS位于N-末端的融合蛋白的真核生產(chǎn)而設(shè)計(jì)的。感興趣的基因(g.o.i)可以連接到此載體的NotI/StuI(NotI/HindIII)位點(diǎn)。EcoRI 31/11gaa ttc ATG GCT ACA GGC TCC CGG ACG TCC CTG CTC CTG GCT TTT GGC CTG CTC TGC CTGM A T G S R T S L L L A F G L L C L61/21 Eco47III91/31CCC TGG CTT CAA GAG GGC AGC GCT TGC GGT GGT CTG ACC GAC ACC CTG CAG GCG GAA ACCF W L Q E G S A C G G L T D T L Q A E T221/41 151/51GAC CAG GTG GAA GAC GAA AAA TCC GCG CTG CAA ACC GAA ATC GCG AAC CTG CTG AAA GAAD Q V E D E K S A L Q T E I A N L L K E181/61 211/71 NotIAAA GAA AAG CTG GAG TTC ATC CTG GCG GCA CAC GGT GGT TGC GGT GGT TCT GCG GCC GCTK E K L E F I L A A H G G C G G S A A A241/81 StuIHindIIIggg tgt ggg agg cct aag ctt (SEQ ID NO29)(goi) (SEQ ID NO30)表達(dá)載體pAV1-pAV6的構(gòu)建合成了以下寡聚核苷酸用于表達(dá)載體pAV1-pAV6的構(gòu)建FOS-FOR1CCTGGGTGGGGGCGGCCGCTTCTGGTGGTTGCGGTGGTCTGACC(SEQID NO31);FOS-FOR2GGTGGGAATTCAGGAGGTAAAAAGATATCGGGTGTGGGGCGGCC(SEQ ID NO32);FOS-FOR3GGTGGGAATTCAGGAGGTAAAAAACGATGGCTTGCGGTGGTCTGACC(SEQ ID NO33);FOS-FOR4GCTTGCGGTGGTCTGACC(SEQ ID NO34);FOS-REV1CCACCAAGCTTAGCAACCACCGTGTGC(SEQ ID NO35);FOS-REV2CCACCAAGCTTGATATCCCCACACCCAGCGGCCGCAGAACCACCGCAACCACCG(SEQID NO36);FOS-REV3CCACCAAGCTTAGGCCTCCCACACCCAGCGGC(SEQ ID NO37);OmpA-FOR1GGTGGGAATTCAGGAGGTAAAAAACGATG(SEQ ID NO38);hGH-FOR1GGTGGGAATTCAGGCCTATGGCTACAGGCTCC(SEQ ID NO39);和hGH-FOR2GGTGGGAATTCATGGCTACAGGCTCCC(SEQ ID NO40)為了載體pAV2的構(gòu)建,使用引物對(duì)OmpA-FOR1/FOS-REV2從載體pKK223-3的ompA-FOS-hGH融合基因(參見(jiàn)實(shí)施例5)擴(kuò)增了編碼OmpA信號(hào)序列和FOS結(jié)構(gòu)域的區(qū)域。PCR產(chǎn)物用EcoRI/HindIII消化并連接到載體pKK223-3的相同位點(diǎn)上(Pharmacia)。
為了載體pAV1的構(gòu)建,使用引物對(duì)FOS-FOR1/FOS-REV1從載體pKK223-3中的ompA-FOS-hGH融合基因(參見(jiàn)實(shí)施例5)擴(kuò)增了編碼FOS的區(qū)域。PCR產(chǎn)物用HindIII消化并連接到用StuI/HindIII消化過(guò)的載體pAV2。
為了載體pAV3的構(gòu)建,使用引物對(duì)FOS-FOR2/FOS-REV1從載體pAV1擴(kuò)增了編碼FOS結(jié)構(gòu)域的區(qū)域。PCR產(chǎn)物用EcoRI/HindIII消化并連接到載體pKK223-3的相同位點(diǎn)上(Pharmacia)。
為了載體pAV4的構(gòu)建,使用引物對(duì)FOS-FOR3/FOS-REV2從載體pKK223-3中的ompA-FOS-hGH融合基因(參見(jiàn)實(shí)施例5)擴(kuò)增了編碼FOS結(jié)構(gòu)域的區(qū)域。PCR產(chǎn)物用EcoRI/HindIII消化并連接到載體pKK223-3的相同位點(diǎn)上(Pharmacia)。
為了載體pAV5的構(gòu)建,使用引物對(duì)hGH-FOR1/hGHREV1從載體pSINrep5中的hGH-FOS-hGH融合基因(參見(jiàn)實(shí)施例7)擴(kuò)增了編碼hGH信號(hào)序列的區(qū)域。PCR產(chǎn)物用EcoRI/NotI消化并連接到載體pAV1的相同位點(diǎn)上。此后,通過(guò)EcoRI/HindIII消化,分離所產(chǎn)生的編碼hGH信號(hào)序列和FOS結(jié)構(gòu)域的盒式組件,并將其克隆到用相同的酶消化過(guò)的載體pMPSVEH上(Artelt等,基因(Gene)68213-219(1998))。
為了載體pAV6的構(gòu)建,使用引物對(duì)FOS-FOR4/FOSREV3從載體pAV2擴(kuò)增了編碼FOS的區(qū)域。PCR產(chǎn)物用HindIII消化,并被克隆到用Eco47III/HindIII切割過(guò)的載體pAV5上。此后,使用引物對(duì)hGH-FOR2/FOSREV3從所產(chǎn)生的載體上再次擴(kuò)增編碼hGH信號(hào)序列和FOS結(jié)構(gòu)域的完整盒式組件,用EcoRI/HindIII消化并將其連接到用相同的酶消化過(guò)的載體pMPSVEH上(Artelt等,基因(Gene)68213-219(1998))。
實(shí)施例7具有人(hGH)信號(hào)序列的FOS-hGH的構(gòu)建為了FOS-hGH融合蛋白的真核表達(dá),利用Xba I/Bsp120 I消化從pBluescript∷OmpA-FOS-hGH(參見(jiàn)實(shí)施例4)分離了OmpA-FOS-hGH融合基因,并將其克隆到用相同的酶消化過(guò)的載體pSINrep5(Invitrogen)上。使用重疊的寡聚核苷酸Sig-hGH-FOR(GGGTCTAGAATGGCTACAGGCTCCCGGACGTCCCTGCTCCTGGCTTTTGGCCTGCTCTG)(第41號(hào)序列)和Sig-hGH-REV(CGCAGGCCTCGGCACTGCCCTCTTGAAGCCAGGGCAGGCAGAGCAGGCCAAAAGCCAG)(第42號(hào)序列),通過(guò)PCR合成了hGH信號(hào)序列(反應(yīng)混合物每種引物各50pmol,dATP、dGTP、dTTP、dCTP各200μM,2.5單位Taq DNA聚合酶(Qiagen),50μl總反應(yīng)體積,在生產(chǎn)商所提供的的緩沖液中;擴(kuò)增92℃30秒、55℃30秒、72℃30秒,30個(gè)循環(huán))。PCR產(chǎn)物使用QiaEx II Kit試劑盒進(jìn)行純化,用Stu I/Xba I進(jìn)行消化,并連接到用同樣的酶切割過(guò)的載體pSINrep∷OmpA-FOS-hGH上。
實(shí)施例8
FOS-hGH的真核表達(dá)通過(guò)利用ScaI限制性消化,使無(wú)RNase的載體(1.0μg)(pSINrep∷OmpA-FOS-hGH)及1.0μg DHEB(Bredenbeek等,病毒學(xué)雜志(J.Virol.)676439-6446(1993))線性化。此后,使用SP6體外轉(zhuǎn)錄試劑盒(InvitroscriptCAP,InvitroGen,Invitrogen BV,NVLeek,Netherlands)進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄。所產(chǎn)生的5′-加帽的mRNA在還原性瓊脂糖凝膠上進(jìn)行分析。
根據(jù)Invitrogen的使用手冊(cè)(辛德比斯病毒表達(dá)系統(tǒng),Invitrogen BV,Netherlands)將體外轉(zhuǎn)錄的mRNA 5μg電穿孔導(dǎo)入BHK21細(xì)胞(ATCCCCL10)中。在37℃溫育10小時(shí)之后,用不含有FCS的HP-1培養(yǎng)基替換含有FCS的培養(yǎng)基,隨后又在37℃溫育10小時(shí)。收獲上清,并利用斑點(diǎn)印跡(dot-Blot)分析了FOS-hGH的生產(chǎn)。
在硝酸纖維素膜上點(diǎn)培養(yǎng)基(2.5μl)并在室溫干燥10分鐘。用1%牛血清白蛋白(Sigma)的TBS(10×TBS每毫升87.7g NaCl,66.1g Trizma hydrochloride(Sigma)和9.7g Trizma base(Sigma),pH7.4)溶液在室溫封閉此膜1小時(shí),此后在10ml TBS-T(含有0.05%Tween20的TBS)中與2μg兔抗-人hGH抗體溫育1小時(shí)。用TBS-T洗滌此印跡斑點(diǎn)3次10分鐘,并與用TBS-T 1∶5000稀釋的偶聯(lián)了抗-兔IgG的堿性磷酸酶(Jackson Laboratories,Inc.)溫育1小時(shí)。在用TBS-T洗滌2次10分鐘和TBS洗滌2次10分鐘之后,如實(shí)施例2中所述,利用AP染色使印跡顯色。結(jié)果表示在圖3中。
實(shí)施例9FOS-PLA(N-和C-末端)的構(gòu)建通過(guò)編碼一種蜂毒磷脂酶A2(PLA)的、催化活性被滅活的突變體的化學(xué)基因合成,構(gòu)建下列基因(Frster等,過(guò)敏反應(yīng)臨床免疫學(xué)雜志(J.Allergy Clin.Immunol.)951229-1235(1995))。1/1 31/11ATC ATC TAC CCA GGT ACT CTG TGG TGT GGT CAC GGC AAC AAA TCT TCT GGT CCG AAC GAAI I Y P G T L W C G H G N K S S G P N E61/21 91/31CTC GGC CGC TTT AAA CAC ACC GAC GCA TGC TGT CGC ACC CAG GAC ATG TGT CCG GAC GTCL G R F K H T D A C C R T Q D M C P D V121/41 151/51ATG TCT GCT GGT GAA TCT AAA CAC GGG TTA ACT AAC ACC GCT TCT CAC ACG CGT CTC AGCM S A G E S K H G L T N T A S H T R L S181/61 211/71TGC GAC TGC GAC GAC AAA TTC TAC GAC TGC CTT AAG AAC TCC GCC GAT ACC ATC TCT TCTC D C D D K F Y D C L K N S A D T I S S241/81 271/91TAC TTC GTT GGT AAA ATG TAT TTC AAC CTG ATC GAT ACC AAA TGT TAC AAA CTG GAA CACY F V G K M Y F N L I D T K C Y K L E H301/101 331/111CCG GTA ACC GGC TGC GGC GAA CGT ACC GAA GGT CGC TGC CTG CAC TAC ACC GTT GAC AAAP V T G C G E R T E G R CL H Y T V D K361/121 391/131TCT AAA CCG AAA GTT TAC CAG TGG TTC GAC CTG CGC AAA TAC(SEQ ID NO43)S K P K V Y Q W F D L R K Y (SEQ ID NO44)為了PLA與FOS二聚化結(jié)構(gòu)域的N-末端的融合,使用寡聚核苷酸PLA-FOR1(CCATCATCTACCCAGGTAC)(第45號(hào)序列)和PLA-REV1(CCCACACCCAGCGGCCGCGTATTTGCGCAGGTCG)(第46號(hào)序列)擴(kuò)增了該區(qū)域。這個(gè)PCR產(chǎn)物用Not I進(jìn)行切割,并被連接到先前已經(jīng)用限制性內(nèi)切酶Stu I/Not I切割過(guò)的載體pAV1上。為了PLA與FOS二聚化結(jié)構(gòu)域的C-末端的融合,使用寡聚核苷酸PLA-FOR2(CGGTGGTTCTGCGGCCGCTATCATCTACCCAGGTAC)(第47號(hào)序列)和PLA-REV2(TTAGTATTTGCGCAGGTCG)(第47號(hào)序列)擴(kuò)增了該區(qū)域。這個(gè)PCR產(chǎn)物用Not I切割并連接到先前已經(jīng)用限制性內(nèi)切酶Not I/EcoRV切割過(guò)的載體pAV2上。
實(shí)施例10
FOS-卵清蛋白融合基因(N-末端和C-末端)的構(gòu)建為了卵清蛋白編碼序列的克隆,根據(jù)生產(chǎn)商的使用說(shuō)明,使用QuickPrepTMMicro mRNA Purifieation Kit試劑盒(Pharmacia)用雞輸卵管組織制備mRNA。使用SuperScriptTMOne-step RT-PCR Kit試劑盒(Gibco BRL),使用引物Ova-FOR1(CCGGCTCCATCGGTGCAG)(第49號(hào)序列)和Ova-REV1(ACCACCAGAAGCGGCCGCAGGGGAAACACATCTGCC)(第50號(hào)序列)合成一個(gè)編碼卵清蛋白的成熟部分的cDNA(對(duì)應(yīng)于該mRNA的68-1222位核苷酸(McReynold等,科學(xué)(Nature)273723-728(1978))。這個(gè)PCR產(chǎn)物用Not I消化,并被克隆到用StuI/Not I消化過(guò)的載體pAV1上,以表達(dá)FOS二聚化結(jié)構(gòu)域在C-末端的融合蛋白。為了FOS二聚化結(jié)構(gòu)域在N-末端的融合蛋白的生產(chǎn),使用引物Ova-FOR2(CGGTGGTTCTGCGGCCGCTGGCTCCATCGGTGCAG)(第51號(hào)序列)和Ova-REV2(TTAAGGGGAAACACATCTGCC)(第52號(hào)序列),從已構(gòu)建的載體(pAV1∷Ova)擴(kuò)增了卵清蛋白編碼區(qū)。PCR產(chǎn)物用Not I消化,并被克隆到用Not I/EcoR V消化過(guò)的載體pAV2上。所克隆的片段利用DNA序列分析驗(yàn)證。
實(shí)施例11FOS-PLA和FOS-卵清蛋白融合蛋白的生產(chǎn)和純化為了在細(xì)胞周質(zhì)產(chǎn)生FOS融合蛋白,用載體pAV3∷PLA、pAV4∷PLA、pAV3∷Ova或pAV4∷Ova轉(zhuǎn)化了一種合適的E.coli菌株。培養(yǎng)物在37℃,在存在氨芐青霉素的豐富培養(yǎng)基中溫育和搖動(dòng)。在光密度(550nm)為1時(shí),加入1mM IPTG并繼續(xù)溫育5小時(shí)。通過(guò)離心收獲細(xì)胞,重新懸浮在一種含有DNase、RNase和溶菌酶的合適的緩沖液(例如,Tris-HCl,pH7.2,150mM NaCl)中,并使細(xì)胞通過(guò)弗氏壓碎器(Fench pressure cell)從而將細(xì)胞破碎。離心(Sovall RC-5C,SS34轉(zhuǎn)頭,15000rpm,10分鐘,4℃)之后,在4℃將沉淀物重新懸浮于25ml包函體洗滌緩沖液(20mM Tris-HCl,23%蔗糖,0.5%TritonX-100,1mM EDTA,pH8.0)中,并如上所述再次離心。重復(fù)進(jìn)行此過(guò)程直到離心以后的上清基本澄明。在室溫將包函體溶解于20ml溶解緩沖液(5.5M鹽酸胍,25mM Tris-HCl,pH7.5)中,并離心、此后使上清通過(guò)無(wú)菌濾膜(0.45μm)從而去除不溶物質(zhì)。蛋白溶液在存在10mM和100mM DTT的條件下在4℃保存至少10小時(shí),對(duì)10體積的5.5M鹽酸胍,25mM Tris-HCl,10mM EDTA,pH6(溶液)透析3次。在存在redox shuffle(氧化型谷胱甘肽/還原型谷胱甘肽;胱氨酸/半胱氨酸)的條件下,將此溶液對(duì)5升2M尿素,4mM EDTA,O.1MNH4Cl,20mM硼酸鈉(pH8.3)(溶液)透析2次。然后對(duì)重折疊的蛋白進(jìn)行離子交換層析。將此蛋白貯存于一種合適的緩沖液中,pH大于7并存在2-10mM DTT,從而使位于FOS側(cè)翼的半胱氨酸殘基處于還原形式。在此蛋白和甲病毒顆粒偶聯(lián)之前,將此蛋白溶液通過(guò)SephadexG-25凝膠過(guò)濾柱,從而除去DTT。
實(shí)施例12gp140-FOS的構(gòu)建使用下列寡核苷酸,通過(guò)PCR從含有全長(zhǎng)gp160基因的原始質(zhì)粒pAbT4671(ATCC 40829)擴(kuò)增了不含有內(nèi)部蛋白酶切割位點(diǎn)的gp140基因(Swiss-ProtP03375)HIV-15′-ACTAGTCTAGAatgagagtgaaggagaaatatc-3′(SEQ ID NO53);HIV-end5′-TAGCATGCTAGCACCGAAtttatctaattccaataattcttg-3′(SEQ ID NO54);HIV-Cleav5′-gtagcacccaccaaggcaaagCTGAAAGCTACCCAGCTCGAGAAACTGgca-3′(SEQ ID NO55);和HIV-Cleav25′-caaagctcctattcccactgcCAGTTICTCGAGCTGGGTAGCTTICAG-3′(SEQ IDNO56).
為了PCR I,使用寡聚核苷酸HIV-I和HIV-Cleav2各100pmol和5ng模板DNA在75μl反應(yīng)混合液(4單位Taq或Pwo聚合酶,0.1mM dNTPs和1.5mM MgSO4)中進(jìn)行反應(yīng)。PCR循環(huán)以如下方式進(jìn)行30個(gè)循環(huán),退火溫度是60℃,延伸時(shí)間72℃2分鐘。
為了PCRII,使用寡聚核苷酸HIV-end和HIV-Cleav各100pmol和5ng模板DNA在75μl反應(yīng)混合液(4單位Taq或Pwo聚合酶,0.1mM dNTPs和1.5mM MgSO4)中進(jìn)行反應(yīng)。PCR循環(huán)以如下方式進(jìn)行30個(gè)循環(huán),退火溫度是60℃,延伸時(shí)間72℃50秒。
兩個(gè)PCR產(chǎn)物都進(jìn)行純化、分離,并用于裝配PCR反應(yīng)。為了這個(gè)裝配PCR反應(yīng),使用寡聚核苷酸HIV-I和HIV-end各100pmol和每一個(gè)PCR片段各2ng在75μl反應(yīng)混合液(4單位Taq或Pwo聚合酶,0.1mM dNTPs和1.5mM MgSO4)中進(jìn)行反應(yīng)。PCR循環(huán)以如下方式進(jìn)行30個(gè)循環(huán),退火溫度是60℃,延伸時(shí)間72℃2.5分鐘。裝配PCR產(chǎn)物用Xba I和Nhe I消化。此FOS兩親性螺旋符合閱讀框地融合到gp-140的C-末端。
使用下列寡聚核苷酸,從載體pJuFo(Crameri & Suter基因(Gene)13769(1993))PCR-擴(kuò)增了編碼FOS兩親性螺旋結(jié)構(gòu)域的DNA序列FOS-HIV5′-ttcggtgctagcggtggcTGCGGTGGTCTGACCGAC-3′(SEQID NO57);和FOS-Apa5′-gatgctgggcccttaaccGCAACCACCGTGTGCCGCC-3′(SEQID NO58).
為了這個(gè)PCR反應(yīng),使用每一種寡聚核苷酸各100pmol與5ng模板DNA在75μl反應(yīng)混合物(4單位Taq或Pwo聚合酶、0.1mM dNTPs和1.5mM MgSO4)中進(jìn)行反應(yīng)。溫度循環(huán)以如下方式完成95℃2分鐘;隨后是5個(gè)95℃(45秒)、60℃(30秒)、72℃(25秒)的循環(huán);隨后又是25個(gè)95℃(45秒)、68℃(30秒)、72℃(20秒)循環(huán)。所獲得的PCR片段用NheI和Bsp120L消化。
GP140-FOS的最終表達(dá)載體在將2個(gè)PCR片段連接到pSinRep5的3片段連接反應(yīng)中獲得。所產(chǎn)生的載體pSinRep5-GP140-FOS通過(guò)限制性分析和DNA測(cè)序進(jìn)行評(píng)價(jià)。
GP140-FOS還經(jīng)過(guò)XbaI和Bsp120L而被克隆到pCYTts中,從而獲得一個(gè)穩(wěn)定的可以誘導(dǎo)的GP140-FOS表達(dá)細(xì)胞系。
實(shí)施例13使用pSinRep5-GP140FOS表達(dá)GP140FOS通過(guò)限制性內(nèi)切酶消化,使無(wú)RNA酶(RNase-free)的載體(1.0μg)(pSinRep5-GP140-FOS)和1.0μg DHEB(Bredenbreek等,病毒學(xué)雜志(J.Virol.)676439-6446(1993))線性化。此后,使用一種SP6體外轉(zhuǎn)錄試劑盒(InvitroscriptCAP,InvitroGen,Invitrogen BV,NV Leek,Netherlands)進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄。所產(chǎn)生的5′-加帽的mRNA在還原性瓊脂糖凝膠上分析。
根據(jù)Invitrogen的使用手冊(cè)(辛德比斯病毒表達(dá)系統(tǒng),Invitrogen BV,Netherlands),將所轉(zhuǎn)錄的mRNA(5μg)電穿孔導(dǎo)入BHK21細(xì)胞系(ATCCCCL10)。37℃溫育10小時(shí)之后,用不含有FCS的HP-1培養(yǎng)基交換含有FCS的培養(yǎng)基,此后又在37℃溫育10小時(shí)。收獲上清,并完全按照實(shí)施例2中所述,利用Western印跡分析可溶性GP140-FOS的生產(chǎn)。
實(shí)施例14使用pCYTts-GP140FOS表達(dá)GP140FOS利用限制性內(nèi)切酶消化使pCYT-GP140-FOS線性化。利用酚/氯仿抽提終止此反應(yīng),此后用異丙醇沉淀線性DNA。利用瓊脂糖凝膠電泳評(píng)價(jià)限制性內(nèi)切酶消化。為了轉(zhuǎn)染,將5.4μg的線性pCYTtsGP140-FOS與0.6μg線性pSV2Neo混合于30μlH2O中,并加入30μlCaCl2溶液。在加入60μ1磷酸緩沖液(50mM HEPES,280mM NaCl,1.5mMNa2HPO4,pH7.05)之后,振搖此溶液30秒,然后在室溫溫育25秒。立即將此溶液加入2ml含有2%FCS(2%FCS)的HP-1培養(yǎng)基中。然后用含有DNA的培養(yǎng)基替換80%鋪滿的BHK21細(xì)胞培養(yǎng)(6-孔板)的培養(yǎng)基。在CO2培養(yǎng)箱中在37℃溫育5小時(shí)后,去除含有DNA的培養(yǎng)基,并用2ml內(nèi)含15%甘油的2%FCS培養(yǎng)基替換。在30秒的溫育期4之后,去除含有甘油的培養(yǎng)基,通過(guò)用5ml含有10%FCS的HP-1培養(yǎng)基漂洗而洗滌細(xì)胞。最后,加入2ml含有10%FCS的新鮮HP-1培養(yǎng)基。
選擇穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞,并在CO2培養(yǎng)箱中,在選擇培養(yǎng)基(補(bǔ)充G418的HP-1培養(yǎng)基)中在37℃培養(yǎng)。當(dāng)混合的細(xì)胞群培養(yǎng)到鋪滿時(shí),將細(xì)胞分到兩個(gè)平皿中,然后在37℃培養(yǎng)12小時(shí)。將一平皿細(xì)胞轉(zhuǎn)移到30℃,從而誘導(dǎo)可溶性GP140-FOS的表達(dá)。另一平皿細(xì)胞在37℃保存。
利用Western印跡測(cè)定了可溶性GP140-FOS的表達(dá)。培養(yǎng)基(0.5ml)用甲醇/氯仿沉淀,并將此沉淀物重新懸浮于SDS-PAGE上樣緩沖液中。將樣品95℃加熱5分鐘,然后上樣到15%丙烯酰胺凝膠上。SDS-PAGE之后,如Bass和Yang在Creighton,T.E.,eds.蛋白質(zhì)功能一種實(shí)用方法(Protein FunctionA Practical Approch,2ndedn.,),IRLPress,Oxford(1997),29-55頁(yè)所述,將蛋白轉(zhuǎn)移到Protan硝酸纖維膜(Schleicher & Schuell,Germany)上。用含有1%牛血清白蛋白(Sigma)的TBS溶液(10×TBS/升87.7g NaCl,66.1g Trizmahydrochloride(Sigma)和9.7g Trizma base(Sigma),pH7.4)室溫封閉1小時(shí),隨后與抗-GP140或GP160抗體溫育1小時(shí)。印跡斑點(diǎn)用TBS-T(含有0.05%Tween20的TBS)洗滌3次10分鐘,并與堿性磷酸酶抗-小鼠/兔/猴/人IgG偶聯(lián)物溫育1小時(shí)。用TBS-T洗滌2次10分鐘和TBS洗滌2次10分鐘之后,使用堿性磷酸酶檢測(cè)試劑和50μlNBT(內(nèi)含7.7%氮藍(lán)四唑(Sigma)的70%二甲基甲酰胺)及37μlX-Phosphate溶液(內(nèi)含5%5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸的二甲基甲酰胺)進(jìn)行顯色反應(yīng)。
實(shí)施例15GPl40FOS的生產(chǎn)及純化將一種抗-gp120抗體共價(jià)偶聯(lián)到一種用NHS/EDC活化的右旋糖苷上,并裝到層析柱中。將含有GP140FOS的上清裝載到層析柱上,充分洗滌之后,用0.1M HCl洗脫GP140FOS。在收集期間,使用1M TrispH7.2直接在收集試管中中和洗脫物。
純化期間可能存在二硫鍵形成,因此所收集的樣品用內(nèi)含10mMDTT的10mM Tris pH7.5在25℃處理2小時(shí)。
隨后對(duì)10mM Mes;80mM NaCl pH6.0透析從而去除DTT。最后,如實(shí)施例16中所述,將GP140-FOS與在E2中含有JUN亮氨酸拉鏈的甲病毒顆?;旌?。
實(shí)施例16甲疫苗(AlphaVaccine)顆粒的制備根據(jù)生產(chǎn)商所提供的操作程序,使用分子量截留值為100kD的Millipore Ultra Centrifugal Filter Devices濃縮病毒顆粒(參見(jiàn)實(shí)施例2和3)。或者,病毒顆??扇缧恋卤人共《颈磉_(dá)系統(tǒng)(Invitrogen,Sam Diego,California)的使用手冊(cè)所述,利用蔗糖梯度離心來(lái)濃縮。將病毒懸浮液的pH調(diào)整到pH7.5,在存在2-10mM DTT的條件下將病毒顆粒溫育數(shù)小時(shí)。用一種合適的緩沖液在SephacrylS-300柱(Pharmacia)(病毒顆粒用空體積洗脫)上從污染蛋白純化出病毒顆粒。
在存在一種redox shuffle(氧化型谷胱甘肽/還原型谷胱甘肽;胱氨酸/半胱氨酸)的條件下,在一種適當(dāng)?shù)木彌_液(pH7.5-8.5)中將所純化的病毒顆粒與至少240倍摩爾過(guò)量的FOS-抗原融合蛋白在4℃溫育至少10小時(shí)。在使用分子量截留值為100kD的Millipore UltraCentrifugal Filter Devices濃縮此顆粒之后,將此混合物通過(guò)Sephacryl S-300過(guò)濾柱(Pharmacia)。病毒顆粒用空水體積(voidvolume)洗脫。
實(shí)施例17JUN兩親性螺旋與HBcAg(1-144)的氨基端的融合JUN螺旋被融合到HBcAg第1到144位氨基酸序列的氨基末端(JUN-HBcAg構(gòu)建體)。為了JUN-HBcAg DNA序列的構(gòu)建,通過(guò)PCR擴(kuò)增了編碼JUN螺旋和HBcAg(1-144)的序列。使用引物EcoR I-JUN(s)和JUN-SacII(as)從pJuFo質(zhì)粒擴(kuò)增了JUN序列。EcoR I-JUN(s)引物引進(jìn)了一個(gè)EcoR I位點(diǎn)和此后一個(gè)啟始ATG密碼子。JUN-SacII(as)引物引進(jìn)了一個(gè)編碼氨基酸序列GAAGS的接頭。使用引物JUN-HBcAg(s和HBcAg(1-144)Hind(as),從pEco63質(zhì)粒(從ATCC No.31518獲得)擴(kuò)增了HBcAg(1-144)序列。JUN-HBcAg(s)含有一個(gè)對(duì)應(yīng)于編碼JUN螺旋和此后一個(gè)編碼GAAGS接頭的序列和HBcAg序列5′末端的序列的3′末端。HBcAg(1-144)Hind(as)在HBcAg基因的114位密碼子之后引進(jìn)一個(gè)終止密碼子和一個(gè)HindIII位點(diǎn)。為了這個(gè)PCR反應(yīng),使用每一種寡聚核苷酸各100pmol和50ng模板DNA在50μl含有2個(gè)單位Pwo聚合酶,0.1mM dNTPs和2mM MgSO4的反應(yīng)混合液中進(jìn)行反應(yīng)。對(duì)于這兩個(gè)反應(yīng),溫度循環(huán)都以如下方式進(jìn)行94℃2分鐘;及30個(gè)94℃(1分鐘)、50℃(1分鐘)、72℃(2分鐘)。引物序列EcoRI-JUN(s)(5′-CCGGAATTCATGTGCGGTGGTCGGATCGCCCGG-3′)(SEQ IDNO61);JUN-SacII(as)(5′-GTCGCTACCCGCGGCTCCGCAACCAACGTGGTTCATGAC-3′)(SEQID NO62);JUN-HBcAg(s)(5′-GTTGGTTGCGGAGCCGCGGGTAGCGACATTGACCCTTATAAAGAATTTGG-3′)(SEQ ID NO63);HBcAg(1-144)Hind(as)(5′-CGCGTCCCAAGCTTCTACGGAAGCGTTGATAGGATAGG-3′)(SEQID NO64).
使用引物EcoR I-JUN(s)和HbcAg(1-144)Hind(as)通過(guò)PCR進(jìn)行這兩個(gè)PCR片段的融合。使用每一種寡聚核苷酸各100pmol與100ng純化的PCR片段在50μl含有2個(gè)單位Pwo聚合酶,0.1mM dNTPs和2mM MgSO4的反應(yīng)混合物中進(jìn)行反應(yīng)。PCR循環(huán)條件是94℃2分鐘;及35個(gè)94℃(1分鐘)、50℃(1分鐘)、72℃(2分鐘)循環(huán)。最終的PCR產(chǎn)物利用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析,純化,并在一種合適的緩沖液中用EcoR I和HindIII限制性內(nèi)切酶消化16小時(shí)。將已消化的DNA片段連接到用EcoR I/HindIII-消化過(guò)的pKK載體上,從而產(chǎn)生pKK-JUN-HBcAg表達(dá)載體。利用EeoR I/HindIII限制性分析及利用插入物的DNA序列測(cè)定,分析了這個(gè)PCR產(chǎn)物的插入。
實(shí)施例18JUN兩親性螺旋與HBcAg(1-144)的羧基末端的融合JUN螺旋被融合到HBcAg氨基酸序列第1到144位的羧基末端(HBcAg-JUN構(gòu)建體)。為了HBcAg-JUN DNA序列的構(gòu)建,通過(guò)PCR分別擴(kuò)增了編碼JUN螺旋和HBcAg(1-144)的序列。使用引物SacII-JUN(s)和JUN-HindIII(as)從pJuFo質(zhì)粒擴(kuò)增了JUN序列。SacII-JUN(s)引物引進(jìn)了一個(gè)編碼氨基酸LAAG的接頭。此序列還含有一個(gè)SacII位點(diǎn)。JUN-HindIII(as)引進(jìn)了一個(gè)終止密碼子(TAA)及隨后一個(gè)HindIII位點(diǎn)。使用引物EcoR I-HBcAg(s)和HBcAg(1-144)-JUN(as),從pEco63質(zhì)粒擴(kuò)增了HBcAg(1-144)DNA序列。EcoR I-HBcAg(s)在HBcAg編碼序列的啟始ATG之前引進(jìn)一EcoR I位點(diǎn)。HBcAg(1-144)-JUN(as)引進(jìn)一個(gè)編碼肽接頭(LAAG)的序列,這個(gè)序列還含有一個(gè)SacII位點(diǎn)。為了這個(gè)PCR反應(yīng),使用每一種寡聚核苷酸各100pmol和50ng模板DNA在50μl含有2個(gè)單位Pwo聚合酶,0.1mM dNTPs和2mM MgSO4的反應(yīng)混合液中進(jìn)行反應(yīng)。溫度循環(huán)都以如下方式進(jìn)行94℃2分鐘;及30個(gè)94℃(1分鐘)、50℃(1分鐘)、72℃(2分鐘)。引物序列SacII-JUN(s)(5′-CTAGCCGCGGGTTGCGGTGGTCGGATCGCCCGG-3′)(SEQ IDNO65);JUN-HindIII(as)(5′-CGCGTCCCAAGCTTTTAGCAACCAACGTGGTTCATGAC-3′)(SEQID NO66);EcoRI-HBcAg(s)(5′-CCGGAATTCATGGACATTGACCCTTATAAAG-3′)(SEQ ID NO67);和HBcAg-JUN(as)(5′-CCGACCACCGCAACCCGCGGCTAGCGGAAGCGTTGATAGGATAGG-3′)(SEQ ID NO68).
使用引物EcoR I-HBcAg(s)和JUN-HindIII(as)通過(guò)PCR進(jìn)行這兩個(gè)PCR片段的融合。使用每一種寡聚核苷酸各100pmol與100ng純化的PCR片段在50μl含有2個(gè)單位Pwo聚合酶,0.1mM dNTPs和2mM MgSO4的反應(yīng)混合物中進(jìn)行。PCR循環(huán)條件是94℃1分鐘;及35個(gè)94℃(1分鐘)、50℃(1分鐘)、72℃(2分鐘)循環(huán)。最終的PCR產(chǎn)物利用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析,并在一種合適的緩沖液中用EcoRI和HindIII限制性內(nèi)切酶消化16小時(shí)。凝膠純化此DNA,并連接到經(jīng)EcoR I/HindIII-消化過(guò)的pKK載體上,從而產(chǎn)生pKK-HBcAg-JUN表達(dá)載體。利用EcoR I/HindIII限制性分析及利用插入物的DNA測(cè)序分析這個(gè)PCR產(chǎn)物的插入。
實(shí)施例19JUN兩親性螺旋插入HBcAg(1-144)的c/el表位已知HBcAg的c/el表位(第72-78位殘基)是定位于乙型肝炎病毒衣殼表面的尖端區(qū)域。此蛋白這一區(qū)域的一部分(第76-82殘基)在遺傳上被JUN螺旋替換,從而提供一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)(HBcAg-JUNIns構(gòu)建體)。HBcAg-JUNIns DNA序列通過(guò)PCR產(chǎn)生通過(guò)PCR分別擴(kuò)增JUN螺旋和兩個(gè)編碼HBcAg片段(第1到75位氨基酸殘基和第83到144位氨基酸殘基)的序列。使用引物BamH I-JUN(s)和JUN-SacII(as)從pJuFo質(zhì)粒擴(kuò)增了JUN序列。BamH I-JUN(s)引進(jìn)一個(gè)編碼又含有一個(gè)BamH I位點(diǎn)的肽序列的接頭序列。JUN-SacII(as)引進(jìn)一個(gè)編碼肽接頭GAAGS及其后一個(gè)與JUN編碼序列的3′末端互補(bǔ)的序列。使用引物EcoR I HBcAg(s)和HBcAg75-JVN(as),從pEco63質(zhì)粒擴(kuò)增了HBcAg(1-75)DNA序列。EcoR I HBcAg(s)引進(jìn)了一個(gè)EcoR I位點(diǎn),和此后一個(gè)對(duì)應(yīng)于HBcAg序列的5′末端的序列。HBcAg75-JUN(as)引進(jìn)了一個(gè)編碼HBcAg第75位氨基酸之后的肽GSGGG的接頭,及此后一個(gè)與JUN螺旋編碼序列的5′末端互補(bǔ)的序列。使用引物JUN-HBcAg83(s)和引物HBcAg(1-144)Hind(as)擴(kuò)增了HBcAg(83-144)片段。JUN-HBcAg83(s)含有一個(gè)對(duì)應(yīng)于JUN-編碼序列的3′末端和此后一個(gè)編碼多肽GAAGS的接頭的序列和一個(gè)對(duì)應(yīng)于HBcAg(83-144)編碼序列的5′端的序列。HBcAg(1-144)Hind(as)引進(jìn)了一個(gè)終止密碼子和一個(gè)位于HBcAg基因的第144位密碼子之后的HindIII位點(diǎn)。為了這個(gè)PCR反應(yīng),使用每一種寡聚核苷酸各100pmol和50ng模板DNA在50μl反應(yīng)混合液(2單位Pwo聚合酶,0.1mM dNTPs和2mM MgSO4)中進(jìn)行反應(yīng)。溫度循環(huán)都以如下方式進(jìn)行94℃2分鐘;及35個(gè)94℃(1分鐘)、50℃(1分鐘)、72℃(2分鐘)。引物序列BamHI-JUN(s)(5′-CTAATGGATCCGGTGGGGGCTGCGGTGGTCGGATCGCCCGGCTCGAG-3′)(SEQ ID NO69);JUN-SacII(as)(5′-GTCGCTACCCGCGGCTCCGCAACCAACGTGGTTCATGAC-3)(SEQID NO70);EcoRIHBcAg(s)(5′-CCGGAATTCATGGACATTGACCCTTATAAAG-3′)(SEQ ID NO71);HBcAg75-JUN(as)(5′-CCGACCACCGCAGCCCCCACCGGATCCATTAGTACCCACCCAGGTAGC-3′)(SEQ ID NO72);JUN-HBcAg83(s)(5′-GTTGGTTGCGGAGCCGCGGGTAGCGACCTAGTAGTCAGTTATGTC-3′)(SEQ ID NO73);和HBcAg(1-144)Hind(as)(5′-CGCGTCCCAAGCTTCTACGGAAGCGTTGATAGGATAGG-3′)(SEQID NO74).
這三個(gè)PCR片段的融合如下進(jìn)行。首先,使用引物EcoR I HBcAg(s)和JUN-SacII(as)通過(guò)PCR將編碼HBcAg1-75的片段與編碼JUN的序列融合。第二,使用引物EcoR I HBcAg(s)和HBcAgHindIII(as)通過(guò)PCR將所獲得的產(chǎn)物與HBcAg(83-144)片段融合。為了PCR融合,使用每一種寡聚核苷酸各100pmol和100ng純化的PCR片段在50μl含有2個(gè)單位Pwo聚合酶,0.1mM dNTPs和2mM MgSO4的反應(yīng)混合物中進(jìn)行反應(yīng)。同樣的PCR條件被用于產(chǎn)生個(gè)別片段。最終的PCR產(chǎn)物在一種適合的緩沖液中用EcoR I/HindIII限制性內(nèi)切酶消化16小時(shí)。將此DNA片段連接到已用EcoR I/HindIII消化的pKK載體上,產(chǎn)生pKK-HBcAg-JUNIns載體。利用EcoR I/HindIII限制性分析以及利用插入物的DNA序列測(cè)定,分析了這個(gè)PCR產(chǎn)物的插入。
實(shí)施例20JUN兩親性螺旋與麻疹病毒核衣殼(N)蛋白的羧基端的融合JUN螺旋被融合到截短的、包括第1到473位氨基酸殘基的麻疹病毒N蛋白片段的羧基端(N473-JUN構(gòu)建體)。為了編碼N473-JUN的DNA序列的構(gòu)建,通過(guò)PCR分別擴(kuò)增了編碼JUN螺旋的序列和編碼N473-JUN的序列。使用引物SacII-JUN(s)和JUN-HindIII(as)從pJuFo質(zhì)粒擴(kuò)增了JUN序列。SacII-JUN(s)引物引進(jìn)了一個(gè)編碼肽接頭LAAG的序列。此序列還含有一個(gè)SacII位點(diǎn)。JUN-HindIII(as)反義引物引進(jìn)了一個(gè)終止密碼子(TAA)及此后一個(gè)HindIII位點(diǎn)。使用引物EcoR I-Nmea(s)和Nmea-JUN(as),從含有完整的麻疹病毒N蛋白編碼序列(從M.Billeter,Zurich處獲取)的pSC-N質(zhì)粒擴(kuò)增了N(1-473)序列。EcoR I-N(mea)(s)在N編碼序列的啟始ATG之前引進(jìn)一個(gè)EcoR I位點(diǎn)。N(mea)-JUN(as)與N(1-473)編碼序列的3′末端互補(bǔ),此后是一個(gè)與肽接頭(LAAG)的編碼序列互補(bǔ)的序列。為了這個(gè)PCR反應(yīng),使用每一種寡聚核苷酸各100pmol和50ng模板DNA在50μl含有2個(gè)單位Pwo聚合酶,0.1mM dNTPs和2mM MgSO4的反應(yīng)混合液中進(jìn)行反應(yīng)。溫度循環(huán)以如下方式進(jìn)行94℃2分鐘;及35個(gè)94℃(1分鐘)、55℃(1分鐘)、72℃(2分鐘)循環(huán)。引物序列SacII-JUN(s)(5′-CTAGCCGCGGGTTGCGGTGGTCGGATCGCCCGG-3′)(SEQ IDNO75);JUN-HindIII(as)(5′-CGCGTCCCAAGCTTTTAGCAACCAACGTGGTTCATGAC-3′)(SEQID NO76);EcoRI-Nmea(s)(5′-CCGGAATTCATGGCCACACTTTTAAGGAGC-3′)(SEQ ID NO77);和Nmea-JUN(as)(5′-CGCGTCCCAAGCTTTTAGCAACCAACGTGGTTCATGAC-3′)(SEQ IDNO78)使用引物EcoR I-Nmea(s)和Nmea-JUN(as)通過(guò)進(jìn)一步PCR使這兩個(gè)PCR片段的融合。為了這個(gè)PCR融合,使用每一種寡聚核苷酸各100pmol與100ng所純化的PCR片段在50μl含有2個(gè)單位Pwo聚合酶,0.1mM dNTPs和2mM MgSO4的反應(yīng)混合物中進(jìn)行。進(jìn)行如下的溫度循環(huán)95℃2分鐘;及35個(gè)94℃(1分鐘)、50℃(1分鐘)、72℃(2分鐘)的循環(huán)。PCR產(chǎn)物在一種合適的緩沖液中用EcoR I和HindIII限制性內(nèi)切酶消化16小時(shí)。凝膠純化此DNA片段,并連接到用EcoRI/HindIII-消化過(guò)的pKK載體上,產(chǎn)生pKK-N473-JUN質(zhì)粒。利用EcoRI/HindIII限制性分析及利用插入物的DNA序列測(cè)定,分析了PCR產(chǎn)物的插入。
實(shí)施例21HBcAg-JUN的表達(dá)及部分純化用pKK-HBcAg-JUN轉(zhuǎn)化了E.coli菌株XL-1 blue。用1ml細(xì)菌過(guò)夜培養(yǎng)物接種100ml含有100μg/ml培養(yǎng)基氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基。此培養(yǎng)物在37℃培養(yǎng)4小時(shí),直至600nm光密度達(dá)到約0.8。通過(guò)加入最終濃度1mM的IPTG,誘導(dǎo)HBcAg-JUN的合成。誘導(dǎo)之后,細(xì)菌進(jìn)一步在37℃搖16小時(shí)。通過(guò)5000xg離心10分鐘,收獲細(xì)菌。將沉淀物在-20℃冰凍。解凍此沉淀物,并用補(bǔ)充了200μg/ml溶菌酶和10μl Benzonase(Merck)的細(xì)菌裂解緩沖液(10mM Na2PO4,pH 7.0,30mM NaCl,0.25% Tween-20,10mM EDTA,10mM DTT)重新懸浮。細(xì)胞在室溫溫育30分鐘,并用弗氏壓碎器(Fench pressurecell)破碎細(xì)胞。向裂解物中加入最終濃度為0.2%的Triton X-100,并將裂解物在冰上溫育30分鐘,偶爾搖動(dòng)。圖4表示一旦用IPTG誘導(dǎo)時(shí),HBcAg-JUN蛋白在E.coli中的表達(dá)。帶有pKK-HBcAg-JUN表達(dá)質(zhì)?;蛞环N對(duì)照質(zhì)粒的E.coli,被用于HBcAg-JUN表達(dá)的IPTG誘導(dǎo)。在加入IPTG之前,從攜帶pKK-HBcAg-JUN質(zhì)粒(第3欄)的細(xì)菌培養(yǎng)物及從攜帶對(duì)照質(zhì)粒(第1欄)的細(xì)菌培養(yǎng)物中取出一份樣品。加入IPTG后16小時(shí),從攜帶pKK-HBcAg-JUN質(zhì)粒(第4欄)的培養(yǎng)物及對(duì)照培養(yǎng)物(第2欄)取樣。利用SDS-PAGE及隨后的考馬斯亮藍(lán)染色(Coomassie staining)來(lái)監(jiān)測(cè)蛋白的表達(dá)。
然后,為了除去不溶性的細(xì)胞碎片,將裂解物在12,000xg離心30分鐘。使用一種抗HBcAg單克隆抗體(YVS1841,購(gòu)買(mǎi)自AccurateChemical and Scientific Corp,Westbury,NY,USA)進(jìn)行Wesatern印跡來(lái)分析上清和沉淀物,表明顯著量的HBcAg-JUN是可溶性的(圖5)。簡(jiǎn)單地說(shuō),表達(dá)HBcAg-JUN的E.coli細(xì)胞及對(duì)照細(xì)胞的裂解物在14,000xg離心30分鐘。上清(=可溶性部分)和沉淀物(不溶性部分)被分離,并用SDS上樣緩沖液稀釋到相同體積。利用SDS-PAGE,隨后使用抗-HBcAg單克隆抗體YVS1841進(jìn)行Western印跡來(lái)分析這些樣品。第1欄可溶性部分;第1和2欄不溶性部分,對(duì)照細(xì)胞;第3欄可溶性部分,表達(dá)HBcAg-JUN的細(xì)胞;第4欄不溶性部分,表達(dá)HBcAg-JUN的細(xì)胞。
使用包括用3ml 15%蔗糖溶液、隨后又用4ml細(xì)菌裂解物覆蓋的4ml 65%蔗糖溶液的蔗糖分級(jí)梯度對(duì)澄明的細(xì)菌裂解物進(jìn)行分級(jí)梯度離心。樣品在4℃用100,000xg離心3小時(shí)。離心之后,從頂部收集了1ml的部分,并用SDS-PAGE及其后的考馬斯亮藍(lán)染色分析(圖6)。第1欄離心前的總細(xì)菌裂解物;第1和2欄梯度頂部的第1部分和第2部分;第4到7欄第5到8部分(15%蔗糖)。HBcAg-JUN蛋白利用考馬斯亮藍(lán)染色檢測(cè)。
HBcAg-JUN蛋白在15%和65%蔗糖之間的界面處富集,說(shuō)明已經(jīng)形成了衣殼顆粒。大多數(shù)的細(xì)菌蛋白保留在梯度的無(wú)蔗糖的上層中,因此HBcAg-JUN蛋白的分級(jí)梯度離心導(dǎo)致這些顆粒的富集和部分純化。
實(shí)施例22hGH對(duì)HBcAg-JUN的共價(jià)偶聯(lián)為了證明蛋白對(duì)HBcAg-JUN顆粒的結(jié)合,我們選擇在其羧基端融合劑FOS螺旋的人生長(zhǎng)激素(hGH-FOS)作為模型蛋白(hGH-FOS)將HBcAg-JUN顆粒與部分純化的hGH-FOS混合并在4℃下溫育4小時(shí)讓蛋白結(jié)合。然后,該混合物對(duì)300倍體積的透析緩沖液(150mMNaCl,10mMTris-HCl溶液,pH8.0)透析過(guò)夜以除去在HBcAg-JUN溶液和hGH-FOS溶液中存在的DTT并從而讓蛋白通過(guò)二硫鍵的建立而共價(jià)偶聯(lián)。作為對(duì)照,HBcAg-JUN和hGH-FOS溶液也對(duì)透析緩沖液透析。通過(guò)還原條件下的SDS-PAGE分析來(lái)自所有三個(gè)透析的蛋白溶液的樣品。在抗-hGH免疫印跡(圖))中檢測(cè)hGH-FOS對(duì)HBcAg-JUN的偶聯(lián)。結(jié)合到HBcAg-JUN的hGH-FOS應(yīng)該遷移的表觀分子量約53KDa,而未結(jié)合的hGH-FOS遷移的表觀分子量為31KDa。在無(wú)(欄3)和有還原劑(欄2)的存在下通過(guò)SDS-PAGE分析透析液并通過(guò)考馬斯染色檢測(cè)。作為對(duì)照,也將未與衣殼顆?;旌系膆GH-FOS負(fù)載到存在還原劑的凝膠(欄1)上。
在存在HBcAg-JUN衣殼蛋白下觀察到hGH-FOS遷移到約53KDa的分子量,提示發(fā)生了hGH-FOS與HBcAg-JUN的有效結(jié)合。
實(shí)施例23將一個(gè)含有一個(gè)賴氨酸殘基的肽插入HBcAg(1-149)的c/el表位HBcAg的c/el表位(第72到88位殘基)位于乙型肝炎病毒衣殼(HBcAg)表面的尖端區(qū)域。這個(gè)區(qū)域的一部分(脯氨酸79和丙氨酸80)在遺傳上被肽Gly-Gly-Lys-Gly-Gly(HBcAg-Lys構(gòu)建體)替換。所引進(jìn)的賴氨酸殘基在其側(cè)鏈中含有一個(gè)可用于HBcAg顆粒與任何含有自由半胱氨酸基團(tuán)之間化學(xué)交聯(lián)的反應(yīng)性氨基。
HBcAg-Lys DNA序列通過(guò)PCR產(chǎn)生通過(guò)PCR分別擴(kuò)增編碼HBcAg片段的兩個(gè)片段(第1到78位和第81到149位氨基酸殘基)。這些PCR所使用的引物也引進(jìn)了一個(gè)編碼Gly-Gly-Lys-Gly-Gly肽的DNA序列。使用引物EcoR I HBcAg(s)和Lys-HBcAg(as)從pEco63質(zhì)粒中擴(kuò)增了HBcAg(1到78)片段。使用引物L(fēng)ys-HBcAg(s)和HBcAg(1-149)Hind(as)從pEco63擴(kuò)增了HBcAg(81到149)片段。引物L(fēng)ys-HBcAg(as)和Lys-HBcAg(s)在這兩個(gè)PCR產(chǎn)物的末端引進(jìn)了互補(bǔ)的DNA序列,(這就)允許這兩個(gè)PCR產(chǎn)物在隨后的一個(gè)裝配PCR中的融合。使用引物EcoR I HBcAg(s)和HBCAg(1-149)Hind(as)擴(kuò)增這些已裝配的片段。
為了這些PCR反應(yīng),使用每一種寡聚核苷酸各100pmol和50ng模板DNA在50μl含有2單位Pwo聚合酶,0.1mM dNTPs和2mM MgSO4的反應(yīng)混合液中進(jìn)行反應(yīng)。對(duì)于這兩個(gè)反應(yīng),溫度循環(huán)以如下方式進(jìn)行94℃2分鐘;及30個(gè)94℃(1分鐘)、50℃(1分鐘)、72℃(2分鐘)的循環(huán)。引物序列EcoRIHBcAg(s)(5’-CCGGAATTCATGGACATTGACCCTTATAAAG-3)(SEQ ID NO79);Lys-HBcAg(as)(5’-CCTAGAGCCACCTITGCCACCATCTTCTAAATTAGTACCCACCCAGGTAGC-3’)(SEQ ID NO80);Lys-HBcAg(s)(5’-GAAGATGGTGGCAAAGGTGGCTCTAGGGACCTAGTAGTCAGTTATGTC-3’)(SEQ ID NO81);HBcAg(1-149)Hind(as)(5’-CGCGTCCCAAGCTTCTAAACAACAGTAGTCTCCGGAAG-3’)(SEQID NO82).
為了通過(guò)PCR融合這兩個(gè)PCR片段,使用引物EcoR I HBcAg(s)和HBcAg(1-149)Hind(as)和100ng兩個(gè)純化的PCR片段在50μl含有2個(gè)單位Pwo聚合酶,0.1mM dNTPs和2mM MgSO4的反應(yīng)混合物中進(jìn)行反應(yīng)。PCR循環(huán)的條件是94℃2分鐘;及30個(gè)94℃(1分鐘)、50℃(1分鐘)、72℃(2分鐘)的循環(huán)。裝配PCR產(chǎn)物,利用瓊脂糖凝膠電泳分析,并純化,在一種合適的緩沖液中用EcoR I和HindIII限制性內(nèi)切酶消化19小時(shí)。將已消化的DNA片段連接到已用EcoR I/HindIII消化過(guò)的pKK載體上,從而產(chǎn)生pKK-HBcAg-Lys表達(dá)載體。利用EcoR I/HindIII限制性分析及插入物的DNA序列測(cè)定分析這個(gè)PCR產(chǎn)物在此載體中的插入。
實(shí)施例24HBcAg-Lys的表達(dá)及部分純化用pKK-HBcAg-Lys轉(zhuǎn)化了E.coli菌株XL-1 blue。用1ml細(xì)菌過(guò)夜培養(yǎng)物接種100ml含有100μg/ml培養(yǎng)基氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基。此培養(yǎng)物在37℃培養(yǎng)4小時(shí),直至600nm的光密度達(dá)到約0.8。通過(guò)加入最終濃度1mM的IPTG,誘導(dǎo)HBcAG-JUN的合成。誘導(dǎo)之后,細(xì)菌進(jìn)一步在37℃搖16小時(shí)。5000xg離心15分鐘,收獲細(xì)菌。將沉淀物在-20℃冰凍。解凍此沉淀物,并用補(bǔ)充了200μg/ml溶菌酶和10μl Benzonase(Merck)的細(xì)菌裂解緩沖液(10mM Na2PO4,pH7.0,30mM NaCl,0.25%Tween-20,10mM EDTA,10mM DTT)重新懸浮。細(xì)胞在室溫下溫育30分鐘,并用弗氏壓碎器(Fench pressurecell)破碎細(xì)胞。向裂解物中加入最終濃度為0.2%的Triton X-100,并將裂解物在冰上溫育30分鐘,偶爾搖動(dòng)。帶有pKK-HBcAg-Lys表達(dá)質(zhì)?;蛞环N對(duì)照質(zhì)粒的E.coli,被用于HBcAg-Lys表達(dá)的IPTG誘導(dǎo)。在加入IPTG之前,從攜帶pKK-HBcAg-Lys質(zhì)粒的細(xì)菌培養(yǎng)物及從攜帶對(duì)照質(zhì)粒的細(xì)菌培養(yǎng)物中取出一份樣品。加入IPTG后16小時(shí),再次從攜帶pKK-HBcAg-Lys質(zhì)粒的培養(yǎng)物及攜帶對(duì)照質(zhì)粒的培養(yǎng)物取樣。利用SDS-PAGE及其后的考馬斯亮藍(lán)染色來(lái)監(jiān)測(cè)蛋白的表達(dá)。
然后,為了除去不溶性的細(xì)胞碎片,將裂解物在12,000xg離心30分鐘。使用一種抗HBcAg單克隆抗體(YVS1841,購(gòu)買(mǎi)自AccurateChemical and Scientific Corp.,Westbury,NY,USA)進(jìn)行Wesatern印跡,來(lái)分析上清和沉淀物,表明有顯著量的HBcAg-Lys是可溶性的。簡(jiǎn)單地說(shuō),表達(dá)HBcAg-Lys的E.coli細(xì)胞及對(duì)照細(xì)胞的裂解物在14,000xg離心30分鐘。上清(=可溶性部分)和沉淀物(不溶性部分)被分離,并用SDS上樣緩沖液稀釋到相等體積。利用SDS-PAGE,隨后使用抗-HBcAg單克隆抗體YVS1841進(jìn)行Western印跡來(lái)分析這些樣品。
使用一種由4ml 65%蔗糖溶液,覆蓋有3ml 15%蔗糖溶液、隨后又覆蓋有4ml細(xì)菌裂解物組成的蔗糖分級(jí)梯度,對(duì)澄明的細(xì)菌裂解物進(jìn)行分級(jí)梯度離心。樣品在4℃100,000xg離心3小時(shí)。離心之后,從頂部收集了各1ml的部分,并用SDS-PAGE及其后的考馬斯亮藍(lán)染色分析。HBcAg-Lys蛋白利用考馬斯亮藍(lán)染色檢測(cè)。
HBcAg-Lys蛋白在15%和65%蔗糖之間的界面處富集,說(shuō)明已經(jīng)形成了衣殼顆粒。大多數(shù)的細(xì)菌蛋白保留在梯度無(wú)蔗糖的上層中,因此,HBcAg-Lys蛋白分級(jí)梯度離心導(dǎo)致這些顆粒的富集和部分純化。
實(shí)施例25使用異雙功能交聯(lián)劑SPDP將FLAG肽化學(xué)偶聯(lián)到HBcAg-Lys上為了引起一個(gè)抗FLAG肽的免疫應(yīng)答,將合成的、在其氨基端具有一個(gè)半胱氨酸殘基的FLAG肽(氨基酸序列為CGGDYKDDDDK)化學(xué)偶聯(lián)到已純化的HBcAg-Lys顆粒上。在室溫下將600μl HBcAg-Lys顆粒的95%純?nèi)芤号c異雙功能交聯(lián)劑N-琥珀酰亞胺基3-(2-吡啶基二硫)丙酸酯(N-Succinimidyl 3-(2-pyridyldithio) propionate)(SPDP)(0.5mM)溫育30分鐘。反應(yīng)完成之后,將此混合物對(duì)1升50mM磷酸緩沖液(pH7.2)和150mM NaCl(溶液)透析過(guò)夜,從而去除游離的SPDP。在存在10mM EDTA的條件下,將500μl已經(jīng)衍生化的HBcAg-Lys衣殼顆粒(2mg/ml)與0.1mM FLAG肽(含有一個(gè)氨基端半胱氨酸)混合,從而避免金屬催化巰基的氧化。通過(guò)由于一旦與此肽的自由半胱氨酸反應(yīng),吡啶-2-硫酮從SPDP釋放所引起的溶液的光密度在343nm處的增加來(lái)監(jiān)測(cè)此反應(yīng)。衍生化的賴氨酸殘基與此肽的反應(yīng)在約30分鐘后完成。
將FLAG修飾的顆粒注射給小鼠。
實(shí)施例26pMPSV-gp140cys的構(gòu)建使用引物寡聚核苷酸gp140CysEcoR I和SalIgp140通過(guò)PCR,從pCytTSgp140FOS擴(kuò)增gp140基因。為了這些PCR反應(yīng),使用每一種寡聚核苷酸各100pmol和50ng模板DNA在50μl含有2單位Pwo聚合酶,0.1mM dNTPs和2mM MgSO4的反應(yīng)混合液中進(jìn)行反應(yīng)。對(duì)于這兩個(gè)反應(yīng),溫度循環(huán)以如下方式進(jìn)行94℃2分鐘;及30個(gè)94℃(0.5分鐘)、55℃(1分鐘)、72℃(2分鐘)的循環(huán)。
使用QiaExII試劑盒純化PCR產(chǎn)物,用Sal I和EcoR I消化,并將其連接到已用同樣的酶消化過(guò)的載體pMPSVHE上。寡聚核苷酸序列Gp140CysEcoRI5’-GCCGAATTCCTAGCAGCTAGCACCGAATTTATCTAA-3’(SEQ IDNO83);SalIgp1405’-GGTTAAGTCGACATGAGAGTGAAGGAGAAATAT-3’(SEQ ID NO84).
實(shí)施例27pMPSVgpl40Cys的表達(dá)利用限制性消化使pMPSVgp140Cys(20μg)線性化。反應(yīng)用酚/氯仿抽提終止,隨后用異丙醇沉淀已線性化的DNA。利用瓊脂糖凝膠電泳評(píng)價(jià)了限制性內(nèi)切酶消化。為了轉(zhuǎn)染,將5.4μg的線性化pMPSVgp140-Cys與0.6μg線性pSV2Neo在30μl H2O中混合,并加入30μlCaCl2溶液。在加入60μl磷酸緩沖液(50mM HEPES,280mMNaCl,1.5mM Na2HPO4,pH7.05)之后,振動(dòng)此溶液5秒,然后在室溫溫育25秒。立即將此溶液加入2ml含有2%FCS(2%FCS)的HP-1培養(yǎng)基中。然后用含有DNA的培養(yǎng)基替換一種80%鋪滿的BHK21細(xì)胞培養(yǎng)(6-孔板)的培養(yǎng)基。在CO2培養(yǎng)箱中37℃溫育5小時(shí)后,去除含有DNA的培養(yǎng)基,并用2ml內(nèi)含15%甘油的2%FCS培養(yǎng)基替換。在30秒溫育期之后,去除含有甘油的培養(yǎng)基,用5ml含有10%FCS的HP-1培養(yǎng)基漂洗來(lái)洗滌細(xì)胞。最后,加入2ml含有10%FCS的新鮮HP-1培養(yǎng)基。
選擇穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞,并在CO2培養(yǎng)箱中、在選擇性培養(yǎng)基(補(bǔ)充G418的HP-1培養(yǎng)基)上37℃培養(yǎng)。當(dāng)混合的細(xì)胞群培養(yǎng)到鋪滿時(shí),將細(xì)胞分到兩個(gè)平皿中,然后在37℃培養(yǎng)12小時(shí)。將一個(gè)細(xì)胞平皿轉(zhuǎn)移到30℃,誘導(dǎo)可溶性GP140-FOS的表達(dá)。另一個(gè)細(xì)胞平皿在37℃保存。
利用Western印跡分析測(cè)定了可溶性GP140-Cys的表達(dá)。培養(yǎng)基(0.5ml)用甲醇/氯仿沉淀,并將此沉淀物重新懸浮于SDS-PAGE樣品緩沖液中。樣品在95℃加熱5分鐘,然后上樣到15%丙烯酰胺凝膠上。SDS-PAGE之后,如Bass和Yang在Creighton,T.E.,編著的蛋白質(zhì)功能一種實(shí)用方法,第2版(Protein FunctionA Practical Approch,2ndedn.,),IRL Press,Oxford(1997),29-55頁(yè)所述,將蛋白轉(zhuǎn)移到Protan硝酸纖維膜(Schleicher & Schuell,Germany)上。用含有1%牛血清白蛋白(Sigma)的TBS溶液(10×TBS/升87.7g NaCl,66.1gTrizma hydrochloride(Sigma)和9.7g Trizma base(Sigma),pH7.4)室溫封閉1小時(shí),隨后與抗-GP140或GP160抗體溫育1小時(shí)。印跡斑點(diǎn)用TBS-T(含有0.05%Tween20的TBS)洗滌3次10分鐘,并與堿性磷酸酶-抗小鼠/兔/猴/人IgG偶聯(lián)物溫育1小時(shí)。用TBS-T洗滌2次10分鐘和TBS洗滌2次10分鐘之后,使用堿性磷酸酶檢測(cè)試劑和50μl NBT(內(nèi)含7.7%氮藍(lán)四唑(Sigma)的70%二甲基甲酰胺)及37μlX-Phosphate溶液(內(nèi)含5%5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸的二甲基甲酰胺)進(jìn)行顯色反應(yīng)。
實(shí)施例28gp140Cys的純化將一種抗-gp120抗體共價(jià)偶聯(lián)到一種NHS/EDC活化的右旋糖苷上,并裝到層析柱中。含有GP140Cys的上清被加載到層析柱上,在充分洗滌之后,用0.1M HCl洗脫GP140Cys。在收集期間,用在收集管中的1MTris pH7.2直接中和該洗脫液。
在純化期間可能形成二硫鍵,因此,在25℃用內(nèi)含10mM DTT的10mM Tris pH7.5(溶液)處理所收集的樣品2小時(shí)。
隨后對(duì)10mM Mes;80mM NaCl pH6.0透析,從而除去DTT。最后如實(shí)施例16所述,將GP140Cys和在E2中含有JUN殘基的甲病毒顆?;旌?。
實(shí)施例29PLA2-Cys的構(gòu)建使用寡聚核苷酸EcoR I PLA和PLA-Cys-hind通過(guò)PCR,從pAV3PLAfOS擴(kuò)增PLA2基因。為了這些PCR反應(yīng),使用每一種寡聚核苷酸各100pmol和50ng模板DNA在50μl含有2單位Pwo聚合酶,0.1mM dNTPs和2mM MgSO4的反應(yīng)混合液中進(jìn)行反應(yīng)。對(duì)于這兩個(gè)反應(yīng),溫度循環(huán)以如下方式進(jìn)行94℃2分鐘;及30個(gè)94℃(0.5分鐘)、55℃(0.5分鐘)、72℃(2分鐘)的循環(huán)。
使用QiaExII試劑盒純化PCR產(chǎn)物,用EcoRI/HindIII消化,并將其連接到已用同樣的酶消化過(guò)的載體pAV3上。寡聚核苷酸序列OligosEcoRIPLA5’-TAACCGAATTCAGGAGGTAAAAAGATATGG-3’(SEQ ID NO85)PLACys-hind5’-GAAGTAAAGCTTTTAACCACCGCAACCACCAGAAG-3’(SEQ IDNO86).
實(shí)施例30PLA-cys的表達(dá)及純化為了在細(xì)胞周質(zhì)生產(chǎn)Cys標(biāo)記的蛋白,用載體pAY3∷PLA和pPLA-Cys轉(zhuǎn)化E.coli XL-1 Blue菌株。培養(yǎng)物在37℃,在存在氨芐青霉素的豐富培養(yǎng)基中搖動(dòng)溫育。在光密度(550nm),加入1mMIPTG,再溫育5小時(shí)。通過(guò)離心收獲細(xì)胞,重新懸浮在一種含有DNase、RNase和溶菌酶的合適的緩沖液(例如,Tris-HCl,pH7.2,150mM NaCl)中,并使細(xì)胞通過(guò)弗氏壓碎器(Fench pressure cell)從而將細(xì)胞破碎。離心(Sovall RC-5C,SS34轉(zhuǎn)頭,15000rpm,10分鐘,4℃)之后,在4℃將沉淀物重新懸浮于25ml包函體洗滌緩沖液(20mM Tris-HCl,23%蔗糖,0.5%Triton X-100,1mM EDTA,pH8.0)中,并如上所述再次離心。重復(fù)進(jìn)行此過(guò)程直到離心后的上清基本澄明。在室溫下將包函體溶解于20ml溶解緩沖液(5.5M鹽酸胍,25mM Tris-HCl,pH7.5)中,并離心,隨后使上清通過(guò)無(wú)菌濾膜(0.45μm)從而去除不溶物質(zhì)。蛋白溶液在存在10mMEDTA和100mM DTT的條件下4℃保持至少10小時(shí),對(duì)10倍體積5.5M鹽酸胍,25mM Tris-HCl,10mM EDTA,pH6(溶液)透析3次。在存在redox shuffle(氧化型谷胱甘肽/還原型谷胱甘肽;胱氨酸/半胱氨酸)的條件下,將此溶液對(duì)5升2M尿素,4mMEDTA,0.1M NH4Cl,20mM硼酸鈉(pH8.3)(溶液)透析2次。然后對(duì)重折疊的蛋白進(jìn)行離子交換層析。將此蛋白貯存于一種適當(dāng)?shù)?、pH大于7、并存在2-10mM DTT的緩沖液中,從而使半胱氨酸殘基處于還原型。在將此蛋白與甲病毒顆粒偶聯(lián)之前,將此蛋白溶液通過(guò)Sephadex G-25凝膠過(guò)濾柱,從而除去DTT。
權(quán)利要求
1.一種組合物,包括a)一種非天然存在的分子支架,包括(i)一種核心顆粒,選自(1)一種非天然起源的核心顆粒;及(2)一種天然起源的核心顆粒;及(ii)一種組織者,包括至少一個(gè)第一結(jié)合位點(diǎn),其中所說(shuō)的組織者通過(guò)至少一個(gè)共價(jià)鍵連接到所說(shuō)的核心顆粒上;及b)一種具有至少一個(gè)第二結(jié)合位點(diǎn)的抗原或抗原決定簇,所說(shuō)的第二結(jié)合位點(diǎn)選自(i)一種非天然地與所說(shuō)的抗原或抗原決定簇一起存在的結(jié)合位點(diǎn);及(ii)一種天然地與所說(shuō)的抗原或抗原決定簇一起存在的結(jié)合位點(diǎn),其中,所說(shuō)的第二結(jié)合位點(diǎn)能夠通過(guò)至少一個(gè)非-肽鍵結(jié)合到所說(shuō)的第一結(jié)合位點(diǎn);而且,其中所說(shuō)的抗原或抗原決定簇與所說(shuō)的支架通過(guò)所說(shuō)的結(jié)合相互作用,從而形成一種有序的和重復(fù)的抗原排列。
2.權(quán)利要求1的組合物,其中a)所說(shuō)的核心顆粒,選自(i)一種病毒(ii)一種病毒-樣顆粒;(iii)一種噬菌體;(iv)一種病毒衣殼顆粒;及(v)(i),(ii),(iii)或(iv)的一種重組形式;且b)所說(shuō)的組織者是多肽或其殘基;且c)所說(shuō)的第二結(jié)合位點(diǎn)是多肽或其殘基。
3.權(quán)利要求2的組合物,其中所說(shuō)的第一和/或第二結(jié)合位點(diǎn)包括a)抗原和其抗體或抗體片段;b)生物素和親合素;c)鏈親合素和生物素;d)一種受體及其配基;e)一種配基-結(jié)合蛋白及其配基;f)相互作用的亮氨酸拉鏈多肽;g)氨基及與其反應(yīng)的化學(xué)基團(tuán);h)羧基及與其反應(yīng)的化學(xué)基團(tuán);i)巰基及與其反應(yīng)的化學(xué)基團(tuán);或j)其組合。
4.權(quán)利要求3的組合物,其中所說(shuō)的第二結(jié)合位點(diǎn)非天然地與所說(shuō)的抗原或抗原決定簇一起存在。
5.權(quán)利要求2的組合物,其中所說(shuō)的核心顆粒是重組甲病毒。
6.權(quán)利要求5的組合物,其中所說(shuō)的重組甲病毒是辛德比斯病毒而所說(shuō)的第一結(jié)合位點(diǎn)和所說(shuō)的第二結(jié)合位點(diǎn)各包括一種相互作用的亮氨酸拉鏈多肽。
7.權(quán)利要求6的組合物,其中所說(shuō)的第一結(jié)合位點(diǎn)和所說(shuō)的第二結(jié)合位點(diǎn)是JUN和/或FOS亮氨酸拉鏈多肽。
8.權(quán)利要求2的組合物,其中所說(shuō)的核心顆粒是一種病毒-樣顆粒。
9.權(quán)利要求8的組合物,其中所說(shuō)的第一結(jié)合位點(diǎn)是氨基而所說(shuō)的第二結(jié)合位點(diǎn)是巰基。
10.權(quán)利要求8的組合物,其中所說(shuō)的病毒-樣顆粒是一種乙型肝炎病毒衣殼蛋白。
11.權(quán)利要求10的組合物,其中所說(shuō)的第一結(jié)合位點(diǎn)和第二結(jié)合位點(diǎn)各包括一種相互作用的亮氨酸拉鏈多肽。
12.權(quán)利要求11的組合物,其中所說(shuō)的第一結(jié)合位點(diǎn)是JUN多肽而所說(shuō)的第二結(jié)合位點(diǎn)是FOS多肽。
13.權(quán)利要求10的組合物,其中所說(shuō)的第一結(jié)合位點(diǎn)是一個(gè)賴氨酸殘基而所說(shuō)的第二結(jié)合位點(diǎn)是一個(gè)半胱氨酸殘基。
14.權(quán)利要求8的組合物,其中所說(shuō)的病毒-樣顆粒是一種麻疹病毒衣殼蛋白。
15.權(quán)利要求14的組合物,其中所說(shuō)的第一結(jié)合位點(diǎn)和所說(shuō)的第二結(jié)合位點(diǎn)各自包括一種相互作用的亮氨酸拉鏈多肽。
16.權(quán)利要求15的組合物,其中所說(shuō)的第一結(jié)合位點(diǎn)和所說(shuō)的第二結(jié)合位點(diǎn)是JUN和/或FOS亮氨酸拉鏈多肽。
17.權(quán)利要求2的組合物,其中所說(shuō)的核心顆粒,選自a)輪狀病毒屬的重組蛋白,b)諾沃克病毒的重組蛋白,c)甲病毒屬的重組蛋白,d)口蹄疫病毒的重組蛋白,e)逆轉(zhuǎn)錄病毒的重組蛋白,f)乙型肝炎病毒的重組蛋白,g)煙草花葉病毒的重組蛋白,h)Flock House Virus的重組蛋白,和i)人乳頭瘤病毒屬的重組病毒。
18.權(quán)利要求17的組合物,其中第一結(jié)合位點(diǎn)和第二結(jié)合位點(diǎn)各包括一種相互作用的亮氨酸拉鏈多肽。
19.權(quán)利要求17的組合物,其中所說(shuō)的第一結(jié)合位點(diǎn)是氨基而所說(shuō)的第二結(jié)合位點(diǎn)是巰基。
20.權(quán)利要求1的組合物,其中所說(shuō)的核心顆粒是非天然起源的。
21.權(quán)利要求20的組合物,其中所說(shuō)的核心顆粒選自a)合成聚合物,b)一種脂微膠粒,及c)一種金屬。
22.權(quán)利要求21的組合物,其中所說(shuō)的第一結(jié)合位點(diǎn)和所說(shuō)的第二結(jié)合位點(diǎn)各包括一種相互作用的亮氨酸拉鏈多肽。
23.權(quán)利要求22的組合物,其中所說(shuō)的第一結(jié)合位點(diǎn)和第二結(jié)合位點(diǎn)是JN和/或FOS亮氨酸拉鏈多肽。
24.權(quán)利要求1的組合物,其中所說(shuō)的抗原選自a)適合誘導(dǎo)抗癌細(xì)胞免疫應(yīng)答的蛋白,b)適合誘導(dǎo)抗傳染病免疫應(yīng)答的蛋白,c)適合誘導(dǎo)抗過(guò)敏原免疫應(yīng)答的蛋白,d)適合在家畜動(dòng)物中誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的蛋白。
25.權(quán)利要求24的組合物,其中所說(shuō)的抗原是a)HIV的一種重組蛋白,b)流感病毒的一種重組蛋白,c)丙型肝炎病毒的一種重組蛋白,d)弓形蟲(chóng)的一種重組蛋白,e)惡性狀瘧原蟲(chóng)的一種重組蛋白,f)間日瘧原蟲(chóng)的一種重組蛋白,g)卵形瘧原蟲(chóng)的一種重組蛋白,h)三日瘧原蟲(chóng)的一種重組蛋白,i)乳腺癌細(xì)胞的一種重組蛋白,j)腎癌細(xì)胞的一種重組蛋白,k)前列腺癌細(xì)胞的一種重組蛋白,l)皮膚癌細(xì)胞的一種重組蛋白,m)腦癌細(xì)胞的一種重組蛋白,n)白血病細(xì)胞的一種重組蛋白,o)一種重組profiling,p)蜂螫過(guò)敏反應(yīng)的一種重組蛋白,q)堅(jiān)果過(guò)敏反應(yīng)的一種重組蛋白,r)食物過(guò)敏反應(yīng)的一種重組蛋白,或s)哮喘的一種重組蛋白,或t)衣原體的一種重組蛋白。
26.權(quán)利要求24的組合物,其中所說(shuō)的第一結(jié)合位點(diǎn)和第二結(jié)合位點(diǎn)各包括一種相互作用的亮氨酸拉鏈多肽。
27.一種生產(chǎn)非天然存在的、有序的和重復(fù)的抗原排列的方法,包括a)提供一種非天然存在的分子支架,包括(i)一種核心顆粒,選自(1)一種非天然起源的核心顆粒;及(2)一種天然起源的核心顆粒;及(ii)一種組織者,包括至少一個(gè)第一結(jié)合位點(diǎn),其中,所說(shuō)的組織者通過(guò)至少一個(gè)共價(jià)鍵連接到所說(shuō)的核心顆粒上;且b)提供一種具有至少一個(gè)第二結(jié)合位點(diǎn)的抗原或抗原決定簇,所說(shuō)的第二結(jié)合位點(diǎn)選自(i)一種非天然地與所說(shuō)的抗原或抗原決定簇一起存在的結(jié)合位點(diǎn);及(ii)一種天然地與所說(shuō)的抗原或抗原決定簇一起存在的結(jié)合位點(diǎn),其中所說(shuō)的第二結(jié)合位點(diǎn)能夠通過(guò)至少一個(gè)非-肽鍵結(jié)合到所說(shuō)的第一結(jié)合位點(diǎn)上;及c)所說(shuō)的非天然地存在的分子支架與與所說(shuō)的抗原或抗原決定簇的結(jié)合,其中所說(shuō)的抗原或抗原決定簇與所說(shuō)的支架通過(guò)所說(shuō)的結(jié)合相互作用,從而形成一種有序的和重復(fù)的抗原排列。
28.權(quán)利要求27的方法,其中a)所說(shuō)的核心顆粒,選自(i)一種病毒(ii)一種病毒-樣顆粒;(iii)一種噬菌體;(iv)一種病毒衣殼顆粒;及(v)(i),(ii),(ii)或(iv)的一種重組形式;且b)所說(shuō)的組織者是多肽或其殘基;且c)所說(shuō)的第二結(jié)合位點(diǎn)是多肽或其殘基。
29.權(quán)利要求28的方法,其中所說(shuō)的第一和/或第二結(jié)合位點(diǎn)包括a)抗原和其抗體或抗體片段;b)生物素和親合素;c)鏈親合素和生物素;d)一種受體及其配基;e)一種配基-結(jié)合蛋白及其配基;f)相互作用的亮氨酸拉鏈多肽;g)氨基及與其反應(yīng)的化學(xué)基團(tuán);h)羧基及與其反應(yīng)的化學(xué)基團(tuán);i)巰基及與其反應(yīng)的化學(xué)基團(tuán);或j)其組合。
30.權(quán)利要求29的方法,其中所說(shuō)的第二結(jié)合位點(diǎn)非天然地與所說(shuō)的抗原或抗原決定簇一起存在。
31.一種分離的重組甲病毒,在其基因組內(nèi)包括a)RNA包裝信號(hào)序列的缺失;及b)JUN亮氨酸拉鏈蛋白結(jié)構(gòu)域核酸序列的符合所說(shuō)的甲病毒E2包膜蛋白核酸序列讀框的非天然存在的插入。
32.一種宿主細(xì)胞,包括權(quán)利要求31的重組甲病毒。
33.一種醫(yī)學(xué)治療的方法,包括給受試者給藥權(quán)利要求1的組合物。
34.一種藥物組合物,包括a)權(quán)利要求1的組合物;及b)一種可以接受的藥物載體。
35.一種免疫方法,包括給受試者給藥一種組合物,此組合物包括a)一種非天然存在的分子支架,包括(i)一種核心顆粒,選自(1)一種非天然起源的核心顆粒;及(2)一種天然起源的核心顆粒;及(ii)一種組織者,包括至少一個(gè)第一結(jié)合位點(diǎn),其中至少一個(gè)所說(shuō)的組織者通過(guò)至少一個(gè)共價(jià)鍵連接到所說(shuō)的核心顆粒上;及b)一種具有至少一個(gè)第二結(jié)合位點(diǎn)的抗原或抗原決定簇,所說(shuō)的第二結(jié)合位點(diǎn)選自(i)一種非天然地與所說(shuō)的抗原或抗原決定簇一起存在的結(jié)合位點(diǎn);及(ii)一種天然地與所說(shuō)的抗原或抗原決定簇一起存在的結(jié)合位點(diǎn),其中,所說(shuō)的第二結(jié)合位點(diǎn)能夠通過(guò)至少一個(gè)非一肽鍵結(jié)合到所說(shuō)的第一結(jié)合位點(diǎn)上;而且,其中所說(shuō)的抗原或抗原決定簇與所說(shuō)的支架通過(guò)所說(shuō)的結(jié)合相互作用,從而形成一種有序的和重復(fù)的抗原排列。
36.權(quán)利要求35的方法,其中所說(shuō)的免疫產(chǎn)生一種免疫應(yīng)答。
37.權(quán)利要求35的方法,其中所說(shuō)的免疫產(chǎn)生一種體液免疫應(yīng)答。
38.權(quán)利要求35的方法,其中所說(shuō)的免疫產(chǎn)生一種細(xì)胞免疫應(yīng)答。
39.權(quán)利要求35的方法,其中所說(shuō)的免疫產(chǎn)生一種體液免疫應(yīng)答和細(xì)胞免疫應(yīng)答。
40.權(quán)利要求35的方法,其中所說(shuō)的免疫產(chǎn)生一種保護(hù)性應(yīng)答。
41.一種疫苗組合物,包括a)一種非天然存在的分子支架,包括(i)一種核心顆粒,選自(1)一種非天然起源的核心顆粒;及(2)一種天然起源的核心顆粒;及(ii)一種組織者,包括至少一個(gè)第一結(jié)合位點(diǎn),其中至少一個(gè)所說(shuō)的組織者通過(guò)至少一個(gè)共價(jià)鍵連接到所說(shuō)的核心顆粒上;及b)一種具有至少一個(gè)第二結(jié)合位點(diǎn)的抗原或抗原決定簇,所說(shuō)的第二結(jié)合位點(diǎn)選自(i)一種非天然地與所說(shuō)的抗原或抗原決定簇一起存在的結(jié)合位點(diǎn);及(ii)一種天然地與所說(shuō)的抗原或抗原決定簇一起存在的結(jié)合位點(diǎn),其中所說(shuō)的第二結(jié)合位點(diǎn)能夠通過(guò)至少一個(gè)非-肽鍵結(jié)合到所說(shuō)的第一結(jié)合位點(diǎn)上;而且,其中所說(shuō)的抗原或抗原決定簇與所說(shuō)的支架通過(guò)所說(shuō)的結(jié)合相互作用,從而形成一種有序的和重復(fù)的抗原排列。
42.權(quán)利要求41的疫苗組合物,進(jìn)一步包括一種佐劑。
43.權(quán)利要求41的疫苗組合物,其中,a)所說(shuō)的核心顆粒選自(i)一種病毒(ii)一種病毒-樣顆粒;(iii)一種噬菌體;(iv)一種病毒衣殼顆粒;及(v)(i),(ii),(iii)或(iv)的一種重組形式;且b)所說(shuō)的組織者是多肽或其殘基;且c)所說(shuō)的第二結(jié)合位點(diǎn)是多肽或其殘基。
44.權(quán)利要求43的疫苗組合物,其中所說(shuō)的第一結(jié)合位點(diǎn)和/或第二結(jié)合位點(diǎn)包括a)抗原和其抗體或抗體片段;b)生物素和親合素;c)鏈親合素和生物素;d)一種受體及其配基;e)一種配基-結(jié)合蛋白及其配基;f)相互作用的亮氨酸拉鏈多肽;g)氨基及與其反應(yīng)的化學(xué)基團(tuán);h)羧基及與其反應(yīng)的化學(xué)基團(tuán);i)巰基及與其反應(yīng)的化學(xué)基團(tuán);j)其組合。
45.權(quán)利要求43的疫苗組合物,其中所說(shuō)的核心顆粒包括一種病毒-樣顆粒。
46.權(quán)利要求45的疫苗組合物,其中所說(shuō)的核心顆粒包括乙型肝炎病毒-樣顆粒。
47.權(quán)利要求45的疫苗組合物,其中所說(shuō)的核心顆粒包括一種麻疹病毒-樣顆粒。
48.權(quán)利要求43的疫苗組合物,其中所說(shuō)的核心顆粒包括一種病毒。
49.權(quán)利要求48的疫苗組合物,其中所說(shuō)的核心顆粒包括一種辛德比斯病毒。
全文摘要
本發(fā)明提供有序的和重復(fù)的抗原或抗原決定簇排列的組合物及生產(chǎn)方法。本發(fā)明的組合物對(duì)于傳染病預(yù)防、過(guò)敏反應(yīng)治療和癌癥治療疫苗的生產(chǎn)有用。本發(fā)明的各種實(shí)施方案提供了一種由于特異性相互作用而以高度有序和重復(fù)的方式用任何期望的抗原包被的病毒、病毒-樣顆粒、病毒衣殼顆粒、噬菌體或其重組形式。在一個(gè)特定的實(shí)施方案中,一種多用途的基于盒-類型系統(tǒng)(Alpha疫苗技術(shù),甲疫苗技術(shù))的新技術(shù)允許被抗原包被的病毒顆粒的生產(chǎn)。其它特定的實(shí)施方案允許被抗原包被的乙型肝炎病毒-樣顆?;虮豢乖坏穆檎畈《荆瓨宇w粒的生產(chǎn)。
文檔編號(hào)A61P31/00GK1333693SQ99815506
公開(kāi)日2002年1月30日 申請(qǐng)日期1999年11月30日 優(yōu)先權(quán)日1998年11月30日
發(fā)明者W·A·倫納, F·亨內(nèi)克, L·尼巴, M·貝克曼 申請(qǐng)人:希托斯生物技術(shù)股份公司
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