靶向交叉呈遞的樹突狀細(xì)胞的疫苗體的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及靶向樹突狀細(xì)胞的重組融合蛋白及其用途。特別地，本發(fā)明涉及包含抗體組件和靶向組件的融合蛋白，和此類融合蛋白引發(fā)免疫應(yīng)答的用途。
【專利說明】靶向交叉呈遞的樹突狀細(xì)胞的疫苗體
[0001]與相關(guān)申請的交叉引用
本申請要求享有于2012年9月23日提交的未決的美國臨時專利申請?zhí)?1/538，186的優(yōu)先權(quán)，其內(nèi)容以其整體通過引用并入。
發(fā)明領(lǐng)域
[0002]本發(fā)明涉及靶向樹突狀細(xì)胞的重組融合蛋白及其用途。特別地，本發(fā)明涉及包含革巴向組件、抗原、接頭區(qū)和抗體組件的融合蛋白(疫苗體(vaccibodies)),和此類同型二聚體融合蛋白或編碼此類融合蛋白的DNA引發(fā)免疫應(yīng)答的用途。
[0003]發(fā)明背景
DNA接種是技術(shù)上簡單的誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的方法。然而，小動物中的成功在臨床試驗中仍未再現(xiàn)。目前尋求增加DNA疫苗的效力的若干策略。
[0004]蛋白抗原對抗原呈遞細(xì)胞(APC)的靶向可以改善T細(xì)胞和B細(xì)胞應(yīng)答。重組免疫球蛋白(Ig)分子非常適合于該目的。例如，短抗原表位可以替換Ig恒定結(jié)構(gòu)域中的β鏈之間的環(huán)，而靶向抗原遞送通過用對于APC上的表面分子特異性的可變(V)區(qū)裝配重組Ig而獲得。然而，此類策略不適合含有未鑒定表位的更大抗原，此外具有短T細(xì)胞表位的重組Ig分子未能引發(fā)針對構(gòu)象表位的抗體。為了克服這些局限性，已生成基于靶向Ig的同型二聚體DNA疫苗(疫苗體)，其表達(dá)大小至少550 aa的傳染性或腫瘤抗原，并維持構(gòu)象表位。
[0005]由于效力的缺乏，迄今為止沒有DNA疫苗批準(zhǔn)用于人類使用。另外，不存在可用于幾種傳染病的有效疫苗。特別地，沒有治療性DNA癌癥疫苗已批準(zhǔn)用于人類使用。
[0006]需要的是具有改進(jìn)效力的DNA疫苗。
[0007]發(fā)明概述
本發(fā)明涉及靶向樹突狀細(xì)胞的重組融合蛋白及其用途。特別地，本發(fā)明涉及包含靶向組件、抗原、接頭區(qū)和抗體組件的融合蛋白(疫苗體)，和此類同型二聚體融合蛋白或編碼此類融合蛋白的DNA引發(fā)免疫應(yīng)答的用途。
[0008]相應(yīng)地，本發(fā)明的實施方案提供了融合多肽、編碼多肽的核酸以及編碼融合多肽的載體和包含載體的細(xì)胞，其中所述融合多肽包含靶向單元和抗原單元，所述靶向單元包含與人或小鼠XclI或Xcl2的氨基酸序列(例如如由SEQ ID NO 1、2或3描述的)具有至少80%序列同一性(例如至少85%、90%、95%、99%或100%同源性)的氨基酸序列，所述靶向單元和所述抗原單元通過二聚化基序連接。在一些實施方案中，融合多肽優(yōu)選與交叉呈遞的DC上的Xcrl結(jié)合。在一些實施方案中，人或小鼠Xcll或Xcl2的變體或同源物顯示出比天然人或小鼠Xcll或Xcl2更高的對于Xcrl的親和力。
[0009]在一些實施方案中，抗原單元是抗原scFv、細(xì)菌抗原、病毒抗原或者癌癥相關(guān)抗原或癌癥特異性抗原。在一些實施方案中，接頭例如(G4S)3接頭連接抗原scFv中的VH和VL0在一些實施方案中，抗原scFv來源于由骨髓瘤或淋巴瘤細(xì)胞產(chǎn)生的單克隆Ig。在一些實施方案中，抗原單元是端粒酶或其功能部分。在一些實施方案中，端粒酶是hTERT。在一些實施方案中，抗原單元是黑素瘤抗原。在一些實施方案中，黑素瘤抗原是酪氨酸酶、TRP-1或TRP-2。在一些實施方案中，抗原單元是前列腺癌抗原。在一些實施方案中，前列腺癌抗原是PSA。在一些實施方案中，抗原單元是宮頸癌抗原。在一些實施方案中，宮頸癌抗原選自E1、E2、E4、E6、E7、L1和L2。在一些實施方案中，抗原單元來源于細(xì)菌。在一些實施方案中，細(xì)菌來源的抗原單元是結(jié)核病抗原。在一些實施方案中，細(xì)菌來源的抗原單元是布魯氏菌病抗原。在一些實施方案中，抗原單兀來源于病毒。在一些實施方案中，病毒來源的抗原單元來源于HIV。在一些實施方案中，HIV來源的抗原單元來源于gpl20或Gag。在一些實施方案中，抗原單元選自流感病毒血凝素(HA)、核蛋白和M2抗原；和單純皰疹2抗原糖蛋白D。
[0010]在一些實施方案中，多肽作為二聚體存在。在一些實施方案中，二聚化基序包含鉸鏈區(qū)和任選的促進(jìn)二聚化的另一個結(jié)構(gòu)域，例如免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域，任選通過接頭連接。在一些實施方案中，二聚化結(jié)構(gòu)域包含人IgG3 二聚化結(jié)構(gòu)域(hCH3)。在一些實施方案中，鉸鏈區(qū)具有形成一個、兩個或幾個共價鍵的能力。在一些實施方案中，共價鍵是二硫鍵。在一些實施方案中，二聚化基序的免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域是羧基末端C結(jié)構(gòu)域，或與所述C結(jié)構(gòu)域基本上同源的序列。在一些實施方案中，羧基末端C結(jié)構(gòu)域來源于IgG。在一些實施方案中，二聚化基序的免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域具有同型二聚化的能力。在一些實施方案中，二聚化基序的免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域具有經(jīng)由非共價相互作用同型二聚化的能力。在一些實施方案中，非共價相互作用是疏水性相互作用。在一些實施方案中，二聚化結(jié)構(gòu)域不包含G2結(jié)構(gòu)域。在一些實施方案中，二聚化基序由通過接頭與人IgG3的Ch3結(jié)構(gòu)域連接的鉸鏈外顯子hi和h4組成。在一些實施方案中，連接鉸鏈區(qū)和促進(jìn)二聚化的另一個結(jié)構(gòu)域例如免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域的接頭是G3S2G3SG接頭。在一些實施方案中，抗原單元和二聚化基序通過接頭例如GLSGL接頭連接。在一些實施方案中，與天然同型二聚體蛋白質(zhì)的親和力相比較，優(yōu)選的變體同型二聚體蛋白質(zhì)具有增加的對于Xcrl趨化因子受體的親和力。
[0011]在一些實施方案中,本發(fā)明提供了編碼上文描述的疫苗體的核酸分子。在一些實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的核酸分子包括在載體中。在一些實施方案中，本發(fā)明提供了包含載體的宿主細(xì)胞。在一些實施方案中，配制根據(jù)本發(fā)明的核酸分子用于向患者施用，以誘導(dǎo)所述患者中同型二聚體蛋白質(zhì)的產(chǎn)生。
[0012]在一些實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的疫苗包含藥學(xué)上可接受的載體和/或佐劑。在一些實施方案中，本發(fā)明提供了針對癌癥或傳染病的疫苗，其包含免疫有效量的如上所述的同型二聚體蛋白質(zhì)或編碼單體蛋白質(zhì)的核酸分子，所述單體蛋白質(zhì)可以形成上文描述的同型二聚體蛋白質(zhì)，其中所述疫苗能夠引發(fā)T細(xì)胞和/或B細(xì)胞免疫應(yīng)答(優(yōu)選兩者)，并且其中同型二聚體蛋白質(zhì)含有對于所述癌癥或傳染病特異性的抗原單元。
[0013]在一些實施方案中，由根據(jù)本發(fā)明的疫苗或藥物組合物治療的癌癥是多發(fā)性骨髓瘤或淋巴瘤、惡性黑素瘤、HPV誘導(dǎo)的癌癥、前列腺癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌和/或肝癌。在一些實施方案中，由根據(jù)本發(fā)明的疫苗或藥物組合物治療的傳染病選自流感、皰疹、CMV、即￥、耶￥、布魯氏菌病、!11￥、肥￥-2和結(jié)核病。
[0014]本發(fā)明進(jìn)一步提供了包含融合多肽的試劑盒。
[0015]本發(fā)明的另外實施方案提供了誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的方法，其包括在使得個體生成對抗原單元的免疫應(yīng)答的條件下給所述個體施用本文描述的疫苗組合物。
[0016]在一些實施方案中，本發(fā)明進(jìn)一步提供了用于制備如上所述的同型二聚體蛋白質(zhì)的方法，該方法包括將編碼單體蛋白質(zhì)的核酸分子引入細(xì)胞群內(nèi)，所述單體蛋白質(zhì)可以形成上文描述的同型二聚體蛋白質(zhì)；培養(yǎng)細(xì)胞群；和收獲并純化表達(dá)自細(xì)胞群的同型二聚體蛋白質(zhì)。
[0017]另外的實施方案在本文中描述。
[0018]附圖簡述
圖1顯示Xcll靶向的疫苗體的結(jié)構(gòu)和功能。(A)具有作為靶向單元的小鼠Xcll、二聚化結(jié)構(gòu)域和病毒抗原單元的疫苗體結(jié)構(gòu)。(B)使用本發(fā)明的實施方案的融合蛋白的靶向示意圖。Xcl1-疫苗體結(jié)合表達(dá)Xcrl的DC亞群，其隨后將在MHC-1上的病毒抗原的肽呈遞給CD8+ T細(xì)胞，因此誘導(dǎo)能夠殺死病毒感染細(xì)胞的細(xì)胞毒性T細(xì)胞應(yīng)答。
[0019]圖2顯示由來自非淋巴和淋巴器官的DC亞群的XCRl表達(dá)。A，限定每個器官中的DC亞群的門控策略。B-J，顯示代表C57BL/6J和XCRl_bGal小鼠的多個器官的DC亞群中的XCRl表達(dá)的bgal酶促活性的直方圖(除了其中使用重組XCLl-mCherry的E之外)。B，表皮。C，真皮。D-F，CLN。F，通過在C57BL/6J小鼠中的bGal+細(xì)胞百分比扣除XCRl-bGal小鼠中的bGal+細(xì)胞百分比來計算bGal+細(xì)胞的百分比。G，CLN駐留⑶Ilb+和⑶8a+ DC(左圖)以及CLN-mig CDllb+、CD1032和CD103+ DC (右圖)中的CADMl表達(dá)。H，肝、肺和腸。I，來自MedLN和MLN的Mig-DC亞群。J，來自脾、MedLN和MLN的LT駐留DC亞群。
[0020]圖3顯示Xcll靶向的疫苗體的表征。A)疫苗體在體內(nèi)作為由靶向單元(Xcll)、二聚化單元(hCH3)和抗原單元(mCherry)組成的二聚化蛋白質(zhì)表達(dá)。為了生成推定不結(jié)合Xcrl的突變體，我們生成其中半胱氨酸(cystein)ll突變?yōu)楸彼?CllA)的突變Xcll。Xcll靶向和假定的非靶向CllA突變型疫苗體在293E細(xì)胞中表達(dá)，并且通過B)使用針對mCherry的抗體的蛋白質(zhì)印跡，和C)使用針對Xcll的抗體的ELISA進(jìn)行分析。D)Xcll_和Xcll (CllA)-mCherry疫苗體與從脾中分離的駐留⑶8a+ DC (左圖^POTllb+ DC的結(jié)合。與Xcll-mCherry、Xcll (CllA) -mCherry 一起孵育的DC和不與疫苗體一起孵育的DC。E)Xcll-和Xcll (CllA)-mCherry與從Xcrl 7小鼠中分離的CD8a+ DC的結(jié)合的缺乏。
[0021]圖4顯示針對靶向Xcll的HA疫苗體的體液免疫應(yīng)答。對單獨的HA、NIP-HA (對于半抗原NIP特異性的非靶向疫苗體)和CllA突變體進(jìn)行比較。a)就抗HA抗體分析免疫后14天獲得的血清樣品。b)在免疫后第14天，進(jìn)一步就IgGl和IgG2a同種型分析血清免疫球蛋白應(yīng)答。監(jiān)控Balb/c小鼠中的IgG2a c)和IgGl d)的血清水平共18周，其中血清樣品在第1、3、5、7、10、14和18周時收集。e)當(dāng)?shù)味˙alb/c小鼠中的Xcll-HA疫苗體DNA時的IgG2a血清應(yīng)答。括號中的數(shù)目指示用于免疫小鼠的DNA總量。
[0022]圖5顯示對于在MHC-1分子Kd上呈遞的HA肽IYSTVASSL特異性的⑶8+ T細(xì)胞的五聚體染色。a)從引流淋巴結(jié)中分離的細(xì)胞對⑶8表達(dá)(Rl)進(jìn)行門控，并且分析PE綴合的IYSTVASSL五聚體的結(jié)合。右上象限中的數(shù)目指示五聚體陽性⑶8+ T細(xì)胞的百分t匕。b)包括所有對照的五聚體染色概要。我們觀察到與NIP-HA或CllA-HA接種的小鼠相比較，在Xcll-HA接種的小鼠中的五聚體陽性⑶8+ t細(xì)胞中的顯著增加(曼-懷二氏(Mann-ffhi tney))。
[0023]圖6顯示Xcll-HA疫苗體保護(hù)小鼠不受流感A/PR/8/34 (HlNl) (PR8)的致死攻擊。a)在用Xcll-HA、C11A-HA、HA或NaCl免疫后，將小鼠在免疫后14天用5x致死劑量的PR8進(jìn)行攻擊，并且監(jiān)控重量減輕。實驗在第7天時結(jié)束。b)在a)中第7天的重量數(shù)據(jù)概要，其還包括NIP-HA對照。在用Xcll-HA以及非靶向?qū)φ誑IP-HA和CllA-HA接種的小鼠之間觀察到重量中的顯著差異。c)在免疫后14天用5x致死劑量的PR8攻擊前,用于免疫小鼠的Xcll-HA DNA的滴定。括號中的數(shù)目指示用于免疫小鼠的DNA總量。d)在免疫后26周用PR8病毒進(jìn)行攻擊小鼠，并且監(jiān)控重量減輕直至攻擊后第9天。
[0024]圖7提供了表I。
[0025]圖8是比較鼠以及人Xcll和人Xcl2疫苗體的表達(dá)和分泌的圖。
[0026]圖9a和9b是比較在用Xcll和Xcl2疫苗體免疫后的免疫應(yīng)答的圖。
[0027]圖1Oa和1b是比較在用Xcll和Xcl2疫苗體免疫后14天用流感病毒攻擊后的重量減輕的圖。
[0028]定義
如本文使用的，術(shù)語“免疫應(yīng)答”指通過個體的免疫系統(tǒng)的應(yīng)答。例如，免疫應(yīng)答包括但不限于下述中的可檢測的改變(例如增加)=Toll受體活化、淋巴因子(例如細(xì)胞因子(例如Thl或Th2型細(xì)胞因子)或趨化因子)表達(dá)和/或分泌、巨噬細(xì)胞活化、樹突狀細(xì)胞活化、T細(xì)胞活化(例如CD4+或CD8+ T細(xì)胞)、NK細(xì)胞活化和/或B細(xì)胞活化(例如抗體生成和/或分泌)。另外的免疫應(yīng)答實例包括免疫原(例如抗原(例如免疫原性多肽))與MHC分子的結(jié)合和誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞("CTL")應(yīng)答，誘導(dǎo)針對免疫原性多肽來源于其的抗原的B細(xì)胞應(yīng)答(例如抗體產(chǎn)生)、和/或T輔助淋巴細(xì)胞應(yīng)答、和/或遲發(fā)型超敏反應(yīng)(DTH)應(yīng)答，免疫系統(tǒng)細(xì)胞(例如T細(xì)胞、B細(xì)胞(例如任何發(fā)育階段的(例如漿細(xì)胞)的增殖(例如細(xì)胞群的生長)，和抗原由抗原呈遞細(xì)胞的增加的加工和呈遞。免疫應(yīng)答可以是針對個體的免疫系統(tǒng)識別為外源的免疫原(例如來自微生物(例如病原體)的非自身抗原或識別為外源的自身抗原)。因此，應(yīng)當(dāng)理解，如本文使用的，“免疫應(yīng)答”指任何類型的免疫應(yīng)答，包括但不限于先天性免疫應(yīng)答(例如Toll受體信號傳遞級聯(lián)的活化)、細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答(例如由T細(xì)胞(例如抗原特異性T細(xì)胞)和免疫系統(tǒng)的非特異性細(xì)胞介導(dǎo)的應(yīng)答)和體液免疫應(yīng)答(例如由B細(xì)胞介導(dǎo)的應(yīng)答(例如經(jīng)由抗體生成和分泌到血漿、淋巴液和/或組織液內(nèi))。術(shù)語“免疫應(yīng)答”意指包含個體的免疫系統(tǒng)響應(yīng)抗原和/或免疫原的能力的所有方面(例如針對免疫原(例如病原體)的初次應(yīng)答以及獲得性(例如記憶)應(yīng)答，其為適應(yīng)性免疫應(yīng)答的結(jié)果)。
[0029]如本文使用的，術(shù)語“免疫”指在暴露于能夠引起疾病的微生物(例如病原體)時，免患疾病的保護(hù)(例如疾病體征、癥狀或病況的預(yù)防或減弱(例如抑制))。免疫可以是先天性的(例如非適應(yīng)性(例如非獲得性)免疫應(yīng)答，其在不存在先前暴露于抗原的情況下存在)和/或獲得性的(例如在先前暴露于抗原后由B和T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答(例如其顯示出對抗原增加的特異性和反應(yīng)性))。
[0030]如本文使用的，術(shù)語“免疫原”指能夠在個體中引起免疫應(yīng)答的試劑(agent)(例如微生物(例如細(xì)菌、病毒或真菌)和/或其部分或組分(例如蛋白質(zhì)抗原))。在一些實施方案中，免疫原引起針對免疫原(例如微生物(例如病原體或病原體產(chǎn)物))的免疫。
[0031]術(shù)語“測試化合物”指任何化學(xué)實體、藥劑、藥物等等，其可以用于治療或預(yù)防身體功能的疾病(disease)、病(illness)、病(sickness)或病癥,或另外改變樣品的生理或細(xì)胞狀態(tài)。測試化合物包含已知和潛在治療性化合物。測試化合物可以使用本發(fā)明的篩選方法通過篩選確定為治療性的?！耙阎委熜曰衔铩敝敢扬@示(例如通過動物試驗或施用于人的先前經(jīng)驗)在此類治療或預(yù)防中有效的治療性化合物。
[0032]如本文使用的，術(shù)語“樣品”以其最廣泛的意義使用。在一種意義上，它可以指組織樣品。在另一種意義上，它意在包括得自任何來源的樣本或培養(yǎng)物，以及生物制品。生物樣品可以得自動物(包括人)，并且包括流體、固體、組織和氣體。生物樣品包括但不限于血液制品，例如血漿、血清等等。這些實例不應(yīng)解釋為限制可應(yīng)用于本發(fā)明的樣品類型。懷疑含有人染色體或與人染色體相關(guān)的序列的樣品可以包含細(xì)胞、從細(xì)胞中分離的染色體(例如中期染色體的擴展(spread))、基因組DNA (在溶液中或與固體支持物結(jié)合，例如用于DNA印跡分析)、RNA (在溶液中或與固體支持物結(jié)合，例如用于RNA印跡分析)、cDNA (在溶液中或與固體支持物結(jié)合)等等。懷疑含有蛋白質(zhì)的樣品可以包含細(xì)胞、組織部分、含有一種或多種蛋白質(zhì)的提取物等等。
[0033]當(dāng)“氨基酸序列”在本文中敘述，以指天然存在的蛋白質(zhì)分子的氨基酸序列時，“氨基酸序列”和相似術(shù)語例如“多肽”或“蛋白質(zhì)”不意在使氨基酸序列限制為與所述蛋白質(zhì)分子相關(guān)的完整的、天然氨基酸序列。
[0034]如本文使用的，術(shù)語“肽”指經(jīng)由肽鍵或經(jīng)修飾的肽鍵連接的兩個或更多個氨基酸的聚合物。如本文使用的，術(shù)語“二肽”指經(jīng)由肽鍵或經(jīng)修飾的肽鍵連接的兩個氨基酸的聚合物。
[0035]術(shù)語“野生型”指當(dāng)從天然存在的來源中分離時，具有該基因或基因產(chǎn)物的特征的基因或基因產(chǎn)物。野生型基因是在群體中最頻繁觀察到且因此任意指定為基因的“正常”或“野生型”形式的基因。相比之下，術(shù)語“經(jīng)修飾的”、“突變體”和“變體”指當(dāng)與野生型基因或基因產(chǎn)物相比較時，展示在序列和或功能性質(zhì)中的修飾(即，改變的特征)的基因或基因產(chǎn)物。注意到可以分離天然存在的突變體；這些通過下述事實得到鑒定:當(dāng)與野生型基因或基因產(chǎn)物相比較時，它們具有改變的特征。
[0036]如本文使用的術(shù)語“片段”指這樣的多肽，與天然蛋白質(zhì)相比較，其具有氨基末端和/或羧基末端缺失，但其中剩余氨基酸序列與由全長cDNA序列推導(dǎo)的氨基酸序列中的相應(yīng)位置相同。片段通常長至少4個氨基酸，優(yōu)選長至少20個氨基酸，通常長至少50個氨基酸或更長，并且跨過對于組合物與其多種配體和/或底物的分子間結(jié)合所需的多肽部分。
[0037]如本文使用的，術(shù)語“純化的”或“待純化”指從樣品中去除污染物。例如，抗原通過去除污染蛋白質(zhì)進(jìn)行純化。污染物的去除導(dǎo)致樣品中抗原(例如本發(fā)明的抗原)百分比中的增加。
[0038]術(shù)語“變體”可以與術(shù)語“突變體”互換使用。變體包括分別在氨基酸或核苷酸序列中的一個或多個位置處的插入、取代、顛換、截短和/或倒位。短語“變體多肽”、“多肽”、“變體”和“變體酶”意指具有這樣的氨基酸序列的多肽/蛋白質(zhì)，所述氨基酸序列已從天然Xcll的氨基酸序列進(jìn)行修飾。變體多肽包括與Xcll具有某一百分比例如80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99% 的序列同一性的多肽。
[0039]“變體核酸”可以包括與能夠和本文呈現(xiàn)的核苷酸序列雜交的序列互補的序列。例如，變體序列與在嚴(yán)格條件例如50°C和0.2X SSC( IX SSC = 0.15 M NaCU0.015 M檸檬酸鈉，pH 7.0)下能夠與本文呈現(xiàn)的核苷酸序列雜交的序列互補。更特別地，術(shù)語變體包括在高度嚴(yán)格條件例如65°C和0.1X SSC下能夠與本文呈現(xiàn)的核苷酸序列雜交的序列互補的序列。變體核酸的解鏈溫度(Tm)可以比野生型核酸的Tm低約1、2或:TC。變體核酸包括與編碼Xcll或編碼單體蛋白質(zhì)的核酸具有某一百分比例如80%、85%、90%、95%或99%的序列同一性的多核苷酸，所述單體蛋白質(zhì)可以形成根據(jù)本發(fā)明的同型二聚體蛋白質(zhì)。
[0040]如本文使用的術(shù)語“同型二聚體蛋白質(zhì)”指包含通過氫鍵鍵合、離子(帶電荷)相互作用、實際共價二硫鍵鍵合或這些相互作用的一些組合而保持為單個的、二聚體蛋白質(zhì)的兩條各自相同的氨基酸鏈或亞基的蛋白質(zhì)。
[0041]如本文使用的術(shù)語“二聚化基序”指在抗原單元和靶向單元之間的氨基酸序列，其包含鉸鏈區(qū)和可以促成二聚化的任選第二結(jié)構(gòu)域。該第二結(jié)構(gòu)域可以是免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域，并且任選地鉸鏈區(qū)和第二結(jié)構(gòu)域通過接頭連接。相應(yīng)地，二聚化基序作用于連接抗原單元和靶向單元，但還含有促進(jìn)兩個單體蛋白質(zhì)二聚化成根據(jù)本發(fā)明的同型二聚體蛋白質(zhì)的鉸鏈區(qū)。
[0042]如本文使用的術(shù)語“靶向單元”指將具有其抗原的蛋白質(zhì)遞送給靶細(xì)胞(例如交叉呈遞的樹突狀細(xì)胞)的單元。
[0043]術(shù)語“鉸鏈區(qū)”指例如通過一個或多個鏈間共價鍵例如一個或多個二硫鍵的形成，促進(jìn)二聚化的同型二聚體蛋白質(zhì)的肽序列。鉸鏈區(qū)可以是Ig來源的，例如Ig例如IgG3的鉸鏈外顯子hl+h4。
[0044]發(fā)明詳述
本發(fā)明涉及靶向樹突狀細(xì)胞的重組融合蛋白及其用途。特別地，本發(fā)明涉及包含靶向組件、抗原、接頭區(qū)和抗體組件的融合蛋白(疫苗體)，和此類同型二聚體融合蛋白或編碼此類融合蛋白的DNA引發(fā)免疫應(yīng)答的用途。
[0045]樹突狀細(xì)胞(DC)在不同解剖學(xué)位置中行使其免疫崗哨(immune sentinels)的功能。位于非淋巴組織(NLT)的實質(zhì)中的DC被稱為間質(zhì)DC (int-DC)。這些DC輸送組織抗原至引流淋巴結(jié)(LN)，其中它們被稱為遷移DC (mig-DC)。在小鼠皮膚中，DC構(gòu)成表皮朗格漢斯細(xì)胞(LC)和真皮DC的三個主要亞群:CDllbhiCD24 DC、CDllb_CD24+CD1032 DC和CDllbCD24+CD103+ DC (1)，下文被稱為 CDllb+ DC、CD103 DC 和 CD103+ DC (表 I)。盡管LC和所有真皮DC亞群從皮膚組成性遷移至皮膚LN (CLN)，但⑶103+ DC突出作為用于將角化細(xì)胞來源的Ag呈遞給CLN中的⑶8 T細(xì)胞的最有效力亞群(I)。該能力暗示淋巴組織(LT)-駐留⑶8a+ DC用于交叉呈遞的高效率(I)。⑶103+ int_DC也在其他解剖學(xué)位置例如肺和腸中發(fā)現(xiàn)。⑶103+ int-DC和LT-駐留⑶8a+ DC的發(fā)育選擇性依賴于共同的一組轉(zhuǎn)錄因子(2，3)。因此，這些小鼠DC群可以屬于獨特的一類⑶8a+型DC (I)。
[0046]⑶8a+型DC存在于人和綿羊中，其中它們的鑒定基于其與小鼠脾⑶8a+ DC共享的獨特轉(zhuǎn)錄指紋的表達(dá)(4，5)和其對于Ag交叉呈遞的效率(5 - 9)。已發(fā)表了將DC分入與組織和物種無關(guān)的五個主要亞群的通用分類法:單核細(xì)胞來源的炎性DC、LC、類漿細(xì)胞DC、⑶IIb+型DC和⑶8a+型DC (I)。趨化因子受體XCRl由在小鼠脾、人血和綿羊淋巴中的CD8a+型DC特異性表達(dá)(4-7，10)。Xcrl的功能首先由R.Kroczek的團(tuán)隊揭開(10)，其顯示了 CD8+ T細(xì)胞交叉引發(fā)取決于它們在實驗?zāi)Ｐ?其中在體內(nèi)施用與抗CD205 Ab偶聯(lián)的OVA或表達(dá)OVA的同種異體前B細(xì)胞)中分泌Xcrl配體XCLl的能力。在單核細(xì)胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes)感染時，也發(fā)現(xiàn)在⑶8a+ DC上的Xcrl表達(dá)對于⑶8+T細(xì)胞應(yīng)答的優(yōu)化誘導(dǎo)是關(guān)鍵的(6)。
[0047]融合蛋白疫苗的實例包括例如WO 2004/076489、US20070298051、EP920522、Fredriksen AB 等人(Mol Ther 2006 ;13:776_85)以及 Fredriksen AB 和 Bogen B (Blood2007 ；110:1797-805);其每一個以其整體通過引用合并入本文。本發(fā)明的實施方案提供了重組融合蛋白，其包括靶向Xcrl的Xcll或Xcl2趨化因子(例如疫苗體)。本發(fā)明的實施方案的疫苗體提供了針對抗原的增強免疫應(yīng)答特別是CD8+ T細(xì)胞應(yīng)答的優(yōu)點。
[0048]眾多研究已顯示將抗原靶向抗原呈遞細(xì)胞(APC)增強免疫應(yīng)答。然而，并非全部APC均具有誘導(dǎo)CD8+ T細(xì)胞的能力。近期出版物指示Xcrl在具有該能力的交叉呈遞的DC上專一地表達(dá)。雖然尋求其他靶向方法以便將抗原靶向交叉呈遞的DC(例如靶向DEC205)，但這些受體通常也在其他APC群上表達(dá)。經(jīng)由Xcll或Xcl2的靶向因此確保高度特異性靶向方法。
[0049]因此，本發(fā)明的實施方案提供了包含與免疫球蛋白和/或免疫原融合的人或小鼠Xcll或Xcl2的融合蛋白。Xcll和Xcl2將融合多肽靶向受體Xcrl。Xcll由Genbank登記號NM_002995 (人核酸)和NM_008510 (小鼠核酸)描述。本發(fā)明的實施方案進(jìn)一步利用Xe 11的變體、同源物和模擬物(下文更詳細(xì)地描述的)。
[0050]人和小鼠Xcl I多肽的序列由
ν?Π?'?ν?.Ι?Ι^Χ?'νΝΙ-ΟΙ^ΚΙ.Ρν^ΚΙΚΙ?Ι?ν?'Χ?ΛΜΚΛν?Ι-'νΤΚΚ?ΙΙ.ΚΚ'ΛΙ?ΡΙ?ΛΚ?ννΚAAIKl'VIMiKAXl'KKNMAfflVPI'iiAQR^rSl'Al'riJiX； (SEQ ID NO:1 ;小鼠)和ViKliVSIiKRlX'VSIJl'QRl-FVSRIKl'Til'niCLSLRAVini'KRCil.KVt'ADPQA'nVVRI)
VVRSMI>RK.SXTRN^MIQI'KFIXITQQSTMVWri；I'Ct (SEQ ID NO: 2 ;人)描述。人 Xcl2 的氨基酸序歹I」由 VCKltVSHRRIX'VSI/ll'QK1.PVSRlKl'TITil-X1.SI^AVIIi'rKKiH.KVC'ADPQAI'WVRDVVHSMIWKSNTRNNMjyTKFIXTrQQSTNTAVT1.TC? (SEQ ID NO:3 ;人)和核酸序列ΛΤ(1Λ15Λ( --Χ ?Χ WR:( ?Χ;(!α+Γ?Γ( ?Τ(;?:Λ‘Γ( T1: ;<:Τ( ?+Γ—ΓΓ,Μ.Τ( K --ΑΓΛΤ?！?ΤCM ?ΛΛ< ?<'ιΤ(Π'Λ(ΜΚ；Λ(ΓΓ--ΛΛ< ;?ΧΤΓΛΓΛΤΛ< ?( ?Λ(?(;ΛΓΓΤ? ;—『(7TCJAi ?( *( ?ΓΛΓΤΛΓC X ?( K 'C LM.?( ；C X 'AC ?ΠΜ K 'Λ? ΙΑΛ?Ι 'AAdAVi ?'Λ? 'AC *( VViX 'AC XJC ?ΛΛΙ K H:'TC X Tl*
CIM ΙΑ( K 'AC ΓΙ'ΛΛ----?'ΛΤΙ'Λ? ΓΛΛΛΓ? ;Τ? it'I ΤΛΛΛΛ? ;-- 'TC Ι?( Μ 'TC IMXX:Λ( 'ΛΛC ?( *Λ? 'C ;Τ( SC Hjlt ?Λ(?Λ(；Λ?；(；.1t M ii'C ?( '? ；AC K 'All MjAC 'ACiC !ΛΛΛ'ΙΧ ?'ΛΛ? 'AC ? 'AC iΛΛΛΙ'ΛΛΙ \Μ\ IAlX'('Al IM X'ΛΛ? SC.ΓΛ/\ΓΛ( ；(ΙΛΛ?'(’C 'AC K?Α?Χ.? ?Λ('t 'AATACM W
TCiIt !AC VCn ?Λ< ?ΧΜ Κ?'Λ? t (SEQ ID NO:4 ;人)描述。天然 Xcl2 表達(dá)具有 21 個氨基酸的信號序歹 |J: M K1.1.11.Al J X ?IC *ΗΙ:ΓΛ YIVI ;:t H SI ?) NO: 51。
[0051]本發(fā)明的實施方案的示例性融合蛋白顯示于圖1中。在一些實施方案中，融合蛋白包含作為靶向單元的Xcll (Xcl2可以代替Xcll)、人IgG3 二聚化結(jié)構(gòu)域(hCH3)和由抗原組成但不限于抗原的抗原單元。二聚化導(dǎo)致疫苗分子就靶向單元(Xcll或Xcl2)和抗原而言是二價的。本發(fā)明并不限于特定機制。實際上，機制的理解不是實踐本發(fā)明所需的。但是，考慮將疫苗體靶向交叉呈遞的DC上的Xcrl誘導(dǎo)MHC-1上的病毒肽呈遞給⑶8+ T細(xì)胞。一旦活化，后者隨后可以殺死呈遞相同肽/ MHC復(fù)合物的病毒感染的細(xì)胞或其他靶向的細(xì)胞。
[0052]在本發(fā)明的實施方案開發(fā)過程期間進(jìn)行的實驗證實:當(dāng)與使用流感病毒血凝素(HA)作為抗原單元的非靶向疫苗體疫苗體相比較測試時，Xcll/2靶向的疫苗體作為DNA疫苗表現(xiàn)更佳。Xcll/2靶向的疫苗體誘導(dǎo)更強的IgG2a抗體應(yīng)答，和在小鼠中針對致死流感感染的更佳保護(hù)(參見例如實施例1和圖4-6)。
[0053]本文描述的實驗生成疫苗體構(gòu)建體，其含有作為靶向單元的Xcll，并組合有熒光蛋白質(zhì)mCherry以及來自流感病毒的病毒抗原血凝素(HA)。最初,評估Xcll-mCherry疫苗體的表達(dá)和分泌。對從淋巴結(jié)或皮膚富集的DC分析結(jié)合。Xcll-mCherry僅觀察到與⑶8+駐留DC和⑶103+遷移DC結(jié)合，其兩者均已知在MHC-1上交叉呈遞抗原(圖2_3)。為了評估在疫苗設(shè)定中的Xcll靶向的效應(yīng)，我們使用Xcll-HA疫苗體給小鼠接種，并且隨后收獲血清樣品以評估IgG水平。Xcll-HA誘導(dǎo)強且持久的IgG2a應(yīng)答。接下來，評估Xcll-HA保護(hù)小鼠不受流感病毒的致死攻擊的能力。在用25 Pg DNA的單次接種后，用Xcll-HA接種的小鼠完全獲得保護(hù)免受病毒，并且我們能夠滴定用于免疫小鼠的DNA量下至4.16 μδ,并且仍獲得完全保護(hù)。這指示Xcll/2靶向提供了用于誘導(dǎo)保護(hù)性免疫應(yīng)答的有效力的方法。
[0054]根據(jù)本發(fā)明的融合蛋白疫苗(例如疫苗體)可以是基于重組Ig的同型二聚體疫苗，每條鏈由直接連接至Ig鉸鏈和CH3的靶向單元構(gòu)成，其組合誘導(dǎo)共價同型二聚化。
[0055]優(yōu)選構(gòu)建包含Xcll/2多肽(包括其變體)和不同抗原單元的融合蛋白且作為功能蛋白表達(dá)。特別地，本發(fā)明涉及Xcll/2及其天然同種型在融合疫苗中的利用，以將抗原遞送靶向至抗原呈遞細(xì)胞。在特別優(yōu)選的實施方案中，抗原呈遞細(xì)胞是交叉呈遞的樹突狀細(xì)胞或呈遞Xcrl的其他APC。在本發(fā)明內(nèi)包括的是編碼融合蛋白的DNA疫苗，所述融合蛋白將抗原遞送靶向在專門的抗原呈遞細(xì)胞(APC)上的Xcll/2受體(Xcrl)。在優(yōu)選實施方案中，考慮將疫苗體靶向交叉呈遞DC上的Xcrl誘導(dǎo)在MHC-1上的病毒肽對⑶8+ T細(xì)胞的呈遞。一旦活化，后者隨后就可以殺死呈遞相同肽/MHC復(fù)合物的病毒感染的細(xì)胞。
[0056]根據(jù)本發(fā)明的重組蛋白質(zhì)可以是用于疫苗(包括癌癥疫苗)的人抗體樣分子。這些分子也稱為疫苗體，結(jié)合APC且引發(fā)T細(xì)胞和B細(xì)胞免疫應(yīng)答。此外，考慮疫苗體與APC 二價結(jié)合，以促進(jìn)強免疫應(yīng)答的更有效誘導(dǎo)。疫苗體優(yōu)選包含單體單元的二聚體，其由對APC上的表面分子具有特異性的靶向單元組成，所述靶向單元通過二聚化基序例如鉸鏈區(qū)和C Y 3結(jié)構(gòu)域與抗原單元連接，后者在COOH末端或NH2末端中。本發(fā)明還涉及編碼該重組蛋白質(zhì)的DNA序列，涉及包含這些DNA序列的表達(dá)載體，包含所述表達(dá)載體的細(xì)胞系，涉及優(yōu)選通過借助于疫苗體DNA、疫苗體RNA或疫苗體蛋白質(zhì)的免疫治療哺乳動物，和最后涉及包含此類分子的藥劑和試劑盒。
[0057]可以構(gòu)建根據(jù)本發(fā)明的蛋白質(zhì)中的二聚化基序，以包括鉸鏈區(qū)和免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域(例如C Y 3結(jié)構(gòu)域)，例如羧基末端C結(jié)構(gòu)域(Ch3結(jié)構(gòu)域)、或與所述C結(jié)構(gòu)域基本上同源的序列。鉸鏈區(qū)可以是Ig來源的，并且通過形成一個或多個鏈間共價鍵例如一個或多個二硫鍵促成二聚化。另外，它充當(dāng)結(jié)構(gòu)域間的柔性間隔區(qū)，其允許兩個靶向單元與以可變距離表達(dá)的APC上的兩個靶分子同時結(jié)合。免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域通過非共價相互作用例如疏水性相互作用促成同型二聚化。在優(yōu)選實施方案中，CH3結(jié)構(gòu)域來源于IgG。這些二聚化基序可以與其他多聚化基序(例如來自其他Ig同種型/亞類)交換。優(yōu)選地，二聚化基序來源于天然人蛋白質(zhì)例如人IgG。
[0058]應(yīng)當(dāng)理解二聚化基序可以具有就抗原單元和靶向單元而言的任何定向。在一個實施方案中，抗原單元在二聚化基序的COOH末端中，而靶向單元在二聚化基序的N末端中。在另一個實施方案中，抗原單元在二聚化基序的N末端中，而靶向單元在二聚化基序的COOH末端中。
[0059]通過引用在此并入的國際申請WO 2004/076489公開了可以根據(jù)本發(fā)明使用的核酸序列和載體。
[0060]根據(jù)本發(fā)明的蛋白質(zhì)可以適合于針對任何起源的任何多肽的免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)。包括特異性表位的具有足夠長度的任何抗原序列可以用作根據(jù)本發(fā)明的蛋白質(zhì)中的抗原單元。因此，在一些實施方案中，抗原單元包含具有至少9個氨基酸的氨基酸序列，所述至少9個氨基酸對應(yīng)于編碼此類抗原單元的核酸序列中的至少約27個核苷酸。此類抗原序列可以來源于癌癥蛋白質(zhì)或傳染原。此類癌癥序列的實例是端粒酶，更具體而言hTERT、酪氨酸酶、TRP-1/ TRP-2黑素瘤抗原、前列腺特異性抗原和獨特型。傳染原可以具有細(xì)菌起源例如結(jié)核病抗原和來自布魯氏菌病的0MP31，或具有病毒起源，更具體而言HIV來源的序列如例如gpl20來源的序列，來自HSV-2的糖蛋白D，和流感病毒抗原如血凝素、核蛋白(nuceloprotein)和M2。此類序列在疫苗體形式中的插入還可以導(dǎo)致免疫應(yīng)答的兩臂的活化。或者，抗原單元可以是抗體或其片段，例如來源于由骨髓瘤或淋巴瘤細(xì)胞產(chǎn)生的單克隆Ig的C末端scFv，其在患有B細(xì)胞淋巴瘤或多發(fā)性骨髓瘤的患者中也稱為骨髓瘤/淋巴瘤M組分。
[0061]例如通過肌內(nèi)或皮內(nèi)注射連同或不連同隨后的電穿孔，本發(fā)明的疫苗體蛋白質(zhì)、疫苗體DNA或疫苗體RNA可以用于個體的免疫。
[0062]根據(jù)本發(fā)明的蛋白質(zhì)的靶向單元通過與趨化因子受體結(jié)合將蛋白質(zhì)靶向APC。在特別優(yōu)選的實施方案中，趨化因子受體是Xcrl。
[0063]根據(jù)本發(fā)明的融合蛋白的多個單元可以經(jīng)由標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)方法可操作地連接，并且DNA轉(zhuǎn)染到合適宿主細(xì)胞例如NSO細(xì)胞、293E細(xì)胞、CHO細(xì)胞或C0S-7細(xì)胞內(nèi)。轉(zhuǎn)染子產(chǎn)生且分泌重組蛋白質(zhì)。
[0064]本發(fā)明進(jìn)一步涉及包含根據(jù)本發(fā)明的基于上述重組體的蛋白質(zhì)、DNA/RNA序列或表達(dá)載體的藥劑。適當(dāng)時，該藥劑另外包含藥學(xué)上可接受的載體。合適的載體和此類藥劑的制劑是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。合適的載體是例如磷酸鹽緩沖的普通鹽溶液、水、乳狀液例如油/水乳狀液、濕潤劑、無菌溶液等。藥劑可以口服或腸胃外施用。腸胃外施用的方法包括局部、動脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、髓內(nèi)、鞘內(nèi)(intrathekal)、心室內(nèi)、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)或鼻內(nèi)施用。合適劑量由主治醫(yī)師確定并且取決于不同因素，例如患者的年齡、性別和重量，施用種類等。此外，本發(fā)明涉及針對癌癥或傳染病的疫苗組合物，其包含免疫有效量的編碼本發(fā)明分子的核酸或其簡并變體，其中所述組合物能夠引發(fā)T細(xì)胞和B細(xì)胞免疫應(yīng)答。
[0065]本發(fā)明還涉及用于診斷、醫(yī)療或科學(xué)目的的包含疫苗體DNA、RNA或蛋白質(zhì)的試劑盒。
[0066]本發(fā)明進(jìn)一步涉及制備本發(fā)明的重組分子的方法，其包括將包含本發(fā)明的分子的載體轉(zhuǎn)染到細(xì)胞群內(nèi)；培養(yǎng)細(xì)胞群；收集從細(xì)胞群表達(dá)的重組蛋白質(zhì)；和純化所表達(dá)的蛋白質(zhì)。
[0067]上述核苷酸序列可以優(yōu)選例如在特異性啟動子的控制下，插入適合于基因療法的載體內(nèi)，并且引入細(xì)胞內(nèi)。在優(yōu)選實施方案中，包含所述DNA序列的載體是病毒，例如腺病毒、牛痘病毒或腺伴隨病毒。逆轉(zhuǎn)錄病毒是特別優(yōu)選的。合適逆轉(zhuǎn)錄病毒的實例是例如MoMuLV或HaMuSV。為了基因療法的目的，根據(jù)本發(fā)明的DNA/RNA序列還可以以膠狀分散體的形式轉(zhuǎn)運到靶細(xì)胞。它們包含例如脂質(zhì)體或脂質(zhì)復(fù)合物(lipoplexes)。
[0068]本發(fā)明還包括多肽或多肽內(nèi)的結(jié)構(gòu)域或基序的用途，所述多肽與本文限定的一種或多種氨基酸序列，或與具有本文限定的特定性質(zhì)的多肽具有一定程度的序列同一性或序列同源性。本發(fā)明特別包括與Xcll/2具有一定程度的序列同一性的肽，或其同源物。此處，術(shù)語“同源物”意指與本發(fā)明的氨基酸序列或本發(fā)明的核苷酸序列具有序列同一性的實體，其中本發(fā)明的氨基酸序列優(yōu)選是Xcl 1/2的氨基酸序列。
[0069]在一個方面，同源氨基酸序列和/或核苷酸序列應(yīng)提供和/或編碼多肽，其保留功能活性和/或增強Xcll/2多肽的活性。
[0070]在本文背景下，認(rèn)為同源序列包括這樣的氨基酸序列，其可以與本發(fā)明的序列至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%相同。通常，同源物將包含與本發(fā)明的氨基酸序列相同的活性位點及其他功能序列。盡管同源性還可以以相似性(例如具有相似化學(xué)性質(zhì)/功能的氨基酸殘基)的方式加以考慮，但在本發(fā)明的背景下，優(yōu)選以序列同一性的方式表達(dá)同源性。
[0071]序列同一性比較可以通過肉眼或更通常地借助于可容易獲得的序列比較程序進(jìn)行。這些商購可得的計算機程序使用復(fù)雜的比較算法，以比對最佳反映進(jìn)化事件的兩條或多條序列，所述進(jìn)化事件可以導(dǎo)致兩條或多條序列之間的一種或多種差異。因此，這些算法用評分系統(tǒng)運行，所述評分系統(tǒng)對相同或相似氨基酸的比對獎分，并且對缺口的插入、缺口延伸和非相似氨基酸的比對罰分。比較算法的評分系統(tǒng)包括:
i )每次插入缺口的罰分指定(缺口罰分)， i i )每次現(xiàn)有缺口延伸額外位置的罰分指定(延伸罰分)，
iii)在相同氨基酸比對時的高分指定，和
iv)在不相同氨基酸比對時的可變分指定。
[0072]大多數(shù)比對程序允許修改缺口罰分。然而，當(dāng)使用此類軟件用于序列比較時，優(yōu)選使用缺省值。
[0073]對于不相同氨基酸比對給出的得分根據(jù)評分矩陣(也稱為取代矩陣)進(jìn)行指定。在此類取代矩陣中提供的得分反映下述事實:在進(jìn)化過程中一個氨基酸由另一個取代的可能性改變，并且依賴待取代的氨基酸的物理/化學(xué)性質(zhì)。例如，與由疏水性氨基酸取代相比較，極性氨基酸由另一個極性氨基酸取代的可能性更高。因此，評分矩陣將指定相同氨基酸的最高得分，不相同但相似氨基酸的更低得分，和不相同不相似氨基酸的甚至更低得分。最頻繁使用的評分矩陣是PAM矩陣(Dayhoff等人(1978)，Jones等人(1992))、BLOSUM矩陣(Henikoff 和 Henikoff (1992))和 Gonnet 矩陣(Gonnet 等人(1992))。
[0074]用于執(zhí)行此類比對的合適計算機程序包括但不限于Vector NTI (InvitrogenCorp.)以及 ClustalV、ClustalW 和 ClustalW2 程序(Higgins DG 和 Sharp PM (1988)、Higgins等人(1992)、Thompson等人(1994)、Larkin等人(2007)。不同比對工具的選擇可得自ExPASy Proteomics服務(wù)器。可以進(jìn)行序列比對的另一個軟件實例是BLAST(基本局部比對搜索工具(Basic Local Alignment Search Tool)),其可得自美國國家生物技術(shù)信息中心(Nat1nal Center for B1technology Informat1n)的網(wǎng)頁(Altschul 等人(1990)J.Mol.B1l.215 ;403_410)。
[0075]一旦軟件已產(chǎn)生比對，就能夠計算％相似性和％序列同一性。軟件通常將這作為序列比較的部分且生成數(shù)字結(jié)果。
[0076]在一個實施方案中，優(yōu)選使用ClustalW軟件用于進(jìn)行序列比對。優(yōu)選地，用Clustalff的比對用下述配對比對參數(shù)進(jìn)行:
【權(quán)利要求】
1.融合多肽，其包含靶向單元和抗原單元，所述靶向單元包含與SEQID NO 1、2或3具有至少80%序列同一性的氨基酸序列。
2.權(quán)利要求1的融合多肽，其中所述靶向單元和所述抗原單元通過二聚化基序連接。
3.權(quán)利要求1或2中任一項的融合多肽，其中所述抗原單元選自抗原scFv、細(xì)菌抗原、病毒抗原和癌癥相關(guān)抗原或癌癥特異性抗原。
4.權(quán)利要求1-3中任一項的融合多肽，其中所述靶向單元包含與SEQID NO 1、2或3具有至少90%序列同一性的氨基酸序列。
5.權(quán)利要求1-3中任一項的融合多肽，其中所述靶向單元包含與SEQID NO 1、2或3具有至少95%序列同一性的氨基酸序列。
6.權(quán)利要求1-3中任一項的融合多肽，其中所述靶向單元包含SEQID NO 1、2或3的氨基酸序列。
7.權(quán)利要求1-6中任一項的融合多肽，其中所述多肽作為二聚體存在。
8.權(quán)利要求1-7中任一項的融合多肽，其中所述二聚化結(jié)構(gòu)域包含人IgG3二聚化結(jié)構(gòu)域(hCH3)。
9.權(quán)利要求1-8中任一項的融合多肽，其中所述融合多肽與交叉呈遞的DC上的Xcrl彡口 口 ?
10.核酸分子，其編碼權(quán)利要求1-9中任一項的融合多肽。
11.疫苗，其包含融合多肽或編碼權(quán)利要求1-9中任一項的融合多肽的核酸。
12.權(quán)利要求11的疫苗，其中所述疫苗進(jìn)一步包含藥學(xué)上可接受的載體。
13.誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的方法，其包括在這樣的條件下向個體施用權(quán)利要求11-12中任一項的疫苗組合物，所述條件使得所述個體產(chǎn)生針對所述抗原的免疫應(yīng)答。
14.權(quán)利要求1-9的融合蛋白或權(quán)利要求11-12的疫苗在個體中產(chǎn)生免疫應(yīng)答的用途。
【文檔編號】A61K39/00GK104136039SQ201280057434
【公開日】2014年11月5日 申請日期:2012年9月24日 優(yōu)先權(quán)日:2011年9月23日
【發(fā)明者】B.博根, E.富瑟姆, G.格羅德蘭 申請人:奧斯陸大學(xué)