本發(fā)明尤其涉及來(lái)源于在減少干擾素(IFN)-γ分泌中有效的死亡結(jié)構(gòu)域受體3(DR3)的肽，及其使用方法，包括但不限于自身免疫疾病和/或炎性疾病的治療。

背景技術(shù)：

哺乳動(dòng)物免疫系統(tǒng)是通過(guò)信號(hào)調(diào)節(jié)的復(fù)雜細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)，所述信號(hào)通過(guò)許多分泌蛋白質(zhì)和受體蛋白質(zhì)傳遞。人腫瘤壞死因子(TNF)超家族包括至少19個(gè)成員，并且代表主要類別的刺激蛋白質(zhì)。TNF-樣1A(TL1A)是新近描述的TNF超家族的成員，其顯示涉及一系列自身免疫炎性疾病，包括炎性腸病(IBD)、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)和哮喘。TL1A是目前唯一已知的死亡結(jié)構(gòu)域受體3(DR3)的配體，其占優(yōu)勢(shì)地由活化T細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)。TL1A與DR3的結(jié)合很可能通過(guò)NF-κB相關(guān)途徑的活化來(lái)觸發(fā)增殖信號(hào)。顯示TL1A通過(guò)與白細(xì)胞介素(IL)-12和IL-18協(xié)同作用來(lái)增加干擾素(IFN)-γ生產(chǎn)，并且因此可使免疫應(yīng)答偏向1型T輔助細(xì)胞(TH1)樣應(yīng)答。首先顯示TL1A由內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)，并且它在這些細(xì)胞中的表達(dá)通過(guò)用TNF-α或IL-16處理得到顯著增強(qiáng)。后續(xù)研究已顯示TL1A也在尤其是來(lái)自患有炎性腸病(IBD)的患者的腸組織中的淋巴細(xì)胞漿細(xì)胞和單核細(xì)胞中表達(dá)。

DR3，TL1A的受體，由CD4+T細(xì)胞和天然殺傷細(xì)胞表達(dá)，并且它的表達(dá)在T細(xì)胞活化后增加。盡管DR3具有可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的細(xì)胞內(nèi)死亡結(jié)構(gòu)域，但功能數(shù)據(jù)提示DR3的活性主要是促炎。有趣的是，TL1A的另一種天然受體是誘餌受體3(DcR3)，編碼可以高親和力結(jié)合TL1A的可溶性蛋白質(zhì)。這種可溶性受體顯示出廣泛特異性，并且可結(jié)合其他TNF配體包括FasL和LIGHT。因此，由于三種TNF配體的多樣化功能，難以限定DcR3對(duì)宿主免疫的貢獻(xiàn)。

使用克羅恩氏病(CD)的兩種不同動(dòng)物模型，顯示腸道炎癥的誘導(dǎo)與發(fā)炎粘膜中TL1A和DR3的顯著上調(diào)有關(guān)。使用DR3缺陷小鼠的后續(xù)研究顯示DR3表達(dá)是關(guān)于T細(xì)胞的免疫病理學(xué)所需的，包括實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)和過(guò)敏性肺炎癥疾病模型中的局部T細(xì)胞累積和細(xì)胞因子生產(chǎn)。免疫病理學(xué)和臨床疾病在肺炎癥和EAE的小鼠模型兩者中的DR3缺陷小鼠中急劇減少。另外，顯示TL1A基因中的遺傳變異促成日本和歐洲人口中對(duì)IBD的敏感性。最后，使用RA的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷膸醉?xiàng)研究已顯示TL1A-DR3相互作用對(duì)于該疾病的發(fā)病機(jī)理是關(guān)鍵的。

TL1A途徑在介導(dǎo)炎癥和自身免疫病癥中的作用致使它成為有吸引力的干預(yù)靶。TL1A與其內(nèi)源DR3受體結(jié)合的阻斷可導(dǎo)致下游信號(hào)傳導(dǎo)效應(yīng)的取消，并且因此預(yù)防各種炎性病癥。

存在治療或改善炎性疾病或自身免疫疾病的更有效手段的長(zhǎng)期需要。能夠抑制TL1A誘導(dǎo)的IFN-γ分泌的試劑的開發(fā)因此是期望的。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明在其一些實(shí)施例中提供了死亡結(jié)構(gòu)域受體3(DR3)變體以及包含其的藥物組合物。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的變體和組合物在減少TL1A誘導(dǎo)的IFN-γ分泌中是有效的。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的DR3變體可用于治療或改善自身免疫疾病或病癥和/或炎性疾病或病癥。

本發(fā)明部分基于下述出乎意料的發(fā)現(xiàn)：如本文公開的包含位點(diǎn)特異性氨基酸修飾(例如置換)的DR3變體具有增加的對(duì)TL1A的結(jié)合親和力。像這樣，示例性肽顯示出相對(duì)于野生型(WT)DR3 5倍增加的TL1A結(jié)合親和力。令人驚訝的是，DR3變體在抑制TL1A誘導(dǎo)的IFN-γ分泌中高度有效。

根據(jù)一個(gè)方面，本發(fā)明提供了包含SEQ ID NO：13(GGTRSPRCDCAGDFHKKIGLFCCRGCPAGHYLKAPCTEPCGNSTCLVCPQDTFLAWENHHNSECARCQACDEQASQVALENCSAVADTRCGCKPGWFVECQVSQCVSSSPFYCQPCLDCGALHRHTRLLCSRRDTDCGTCLPGFYEHGDGCVSCPTSTLGSCPERCAAVCGWRQMF)的氨基酸的氨基酸分子或者其類似物或片段，其中所述氨基酸分子包含在選自下述的位置處的至少一個(gè)氨基酸置換：H15、I18、E38、V47、D51、W56、N61、A65、K93、Q101、Q104和L129。

在一個(gè)實(shí)施例中，氨基酸分子包含SEQ ID NO：1的氨基酸：GGTRSPRCDCAGDFX₁KKX₂GLFCCRGCPAGHYLKAPCTX₃PCGNSTCLX₄CPQX₅TFLAX₆ENHHX₇SECX₈RCQACDEQASQVALENCSAVADTRCGCX₉PGWFVECX₁₀VSX₁₁CVSSSPFYCQPCLDCGALHRHTRLX₁₂CSRRDTDCGTCLPGFYEHGDGCVSCPTSTLGSCPERCAAVCGWRQMF；其中：X₁是H或Q；X₂是I、T或Y；X₃是E或K；X₄是V或P；X₅是D或G；X₆是W或R；X₇是N或E；X₈是A或T；X₉是K、E或A；X₁₀是Q或S；X₁₁是Q或P；并且X₁₂是L或P。

根據(jù)一些實(shí)施例，氨基酸分子包含選自SEQ ID NO：2-9的氨基酸序列。根據(jù)另一個(gè)實(shí)施例，氨基酸分子包含SEQ ID NO：2的氨基酸。根據(jù)另一個(gè)實(shí)施例，氨基酸分子包含SEQ ID NO：3的氨基酸。根據(jù)另一個(gè)實(shí)施例，氨基酸分子包含SEQ ID NO：4的氨基酸。根據(jù)另一個(gè)實(shí)施例，氨基酸分子包含SEQ ID NO：5的氨基酸。根據(jù)另一個(gè)實(shí)施例，氨基酸分子包含SEQ ID NO：6的氨基酸。根據(jù)另一個(gè)實(shí)施例，氨基酸分子包含SEQ ID NO：7的氨基酸。根據(jù)另一個(gè)實(shí)施例，氨基酸分子包含SEQ ID NO：8的氨基酸。根據(jù)另一個(gè)實(shí)施例，氨基酸分子包含SEQ ID NO：9的氨基酸。

根據(jù)另一個(gè)實(shí)施例，氨基酸分子還包含抗體的可結(jié)晶片段(Fc)區(qū)的肽。根據(jù)另一個(gè)實(shí)施例，抗體的可結(jié)晶片段(Fc)區(qū)的所述肽包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列。

根據(jù)另一個(gè)實(shí)施例，氨基酸分子還包括包含SEQ ID NO：11(IEGRMDRS)的氨基酸序列的接頭，其中所述接頭融合至SEQ ID NO：1的所述氨基酸的羧基末端以及抗體的Fc區(qū)的所述肽的氨基末端。

根據(jù)另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明的氨基酸分子和運(yùn)載體的組合物。

根據(jù)另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了多核苷酸分子，所述多核苷酸分子包含編碼包含SEQ ID NO：1的氨基酸分子的編碼部分。根據(jù)另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了包含多核苷酸分子的表達(dá)載體，所述多核苷酸分子包括編碼包含SEQ ID NO：1的氨基酸分子的編碼部分。在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明提供了包含多核苷酸分子的表達(dá)載體，所述多核苷酸分子包含如SEQ ID NO：12中所示的核酸序列。根據(jù)另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明的表達(dá)載體的細(xì)胞。

根據(jù)另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明的表達(dá)載體和運(yùn)載體的組合物。

根據(jù)另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了用于減少或抑制有此需要的受試者中的炎癥、免疫應(yīng)答或兩者的方法，所述方法包括給所述受試者施用有效量的本發(fā)明的氨基酸分子或包含所述氨基酸分子的組合物的步驟，由此抑制所述受試者中的炎癥、免疫應(yīng)答或兩者。

根據(jù)另一個(gè)實(shí)施例，所述減少或抑制炎癥、免疫應(yīng)答或兩者是減少或抑制所述受試者中TL1A誘導(dǎo)的IFN-γ分泌。根據(jù)另一個(gè)實(shí)施例，所述受試者患有炎性腸病。根據(jù)另一個(gè)實(shí)施例，所述受試者患有牛皮癬。根據(jù)另一個(gè)實(shí)施例，所述受試者患有自身免疫疾病。根據(jù)另一個(gè)實(shí)施例，所述受試者患有哮喘。根據(jù)另一個(gè)實(shí)施例，所述受試者患有關(guān)節(jié)炎。

本發(fā)明的更多實(shí)施例和可應(yīng)用性的完全范圍由于下文給出的詳述將變得顯而易見。然而，應(yīng)當(dāng)理解詳述和具體例子雖然指出了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，但僅給出作為例子，因?yàn)樵诒景l(fā)明的精神和范圍內(nèi)的各種變化和修飾根據(jù)該詳述對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員將變得顯而易見。

附圖說(shuō)明

圖1.用于生成具有改善的TL1A親和力、穩(wěn)定性和生物活性的DR3突變體的定向進(jìn)化過(guò)程的圖解，包括：(A)文庫(kù)生成，(B)篩選，和(C)表征。

圖2A-B.(A)哺乳動(dòng)物DR3蛋白質(zhì)的比對(duì)鑒定來(lái)源于家族共有區(qū)的殘基。突出顯示的是人DR3中來(lái)源于家族共有區(qū)的V44、D48和W53。(B)用于獲得DR3基因中的回復(fù)共有突變的寡核苷酸摻料過(guò)程。

圖3A-B.使用酵母表面展示(YSD)篩選改善的DR3突變體。(A)DR3的YSD；DR3在酵母的表面上作為Aga2融合物進(jìn)行展示。表達(dá)和TL1A結(jié)合分別通過(guò)熒光抗體和鏈霉抗生物素蛋白進(jìn)行檢測(cè)。(B)在關(guān)于與TL1A結(jié)合的兩輪(R2)和三輪(R3)富集后，展示W(wǎng)T DR3、DR3突變體文庫(kù)的細(xì)胞群的流式細(xì)胞術(shù)直方圖分析。缺乏表面展示的細(xì)胞群以黑色顯示。細(xì)胞的分析在與0.2μM TL1A一起溫育后執(zhí)行。

圖4.在HEK293T細(xì)胞中的DR3表達(dá)的最佳化。在蛋白G富集之前和蛋白G富集之后，使用SDS PAGE分析含有不同引導(dǎo)肽(SP1-5)的分泌DR3的水平。大多數(shù)條件顯示DR3表達(dá)的高得率。

圖5A-B.用于檢測(cè)DR3-TL1A相互作用的ELISA實(shí)驗(yàn)。(A)關(guān)于DR3結(jié)合TL1A的ELISA的示意圖。ELISA板用抗TL1A抗體進(jìn)行涂布，并且隨后用TL1A進(jìn)行涂布。隨后將不同的DR3變體加入板中，并且使用作為一抗的特異性生物素化的抗DR3抗體和鏈霉抗生物素蛋白-HRP檢測(cè)與TL1A的結(jié)合。(B)DR3校準(zhǔn)曲線。以五個(gè)不同濃度的商購(gòu)可得的WT DR3用于TL1A結(jié)合ELISA測(cè)定中。

圖6.用于鑒定具有改善的結(jié)合親和力或穩(wěn)定性的候選突變體的代表性DR3突變體篩選。篩選在HEK293T細(xì)胞中的DR3突變體轉(zhuǎn)染和表達(dá)后執(zhí)行。含有DR3變體的培養(yǎng)基直接應(yīng)用于含有固定的TL1A的ELISA板，以檢測(cè)TL1A-DR3相互作用的水平。具有如SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：8中所示的氨基酸序列的變體以大規(guī)模進(jìn)行表達(dá)，并且純化用于后續(xù)分析(表2)，而突變體C10含有截短且從進(jìn)一步分析中棄去。

圖7A-D.溫度對(duì)變體活性的作用。(A)在37℃下的結(jié)合活性溫育。將3ug/ml具有SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4的氨基酸序列的DR3突變體溶解于PBS，2mM DTT中，在37℃下溫育所示時(shí)間，并且以最大速度離心5分鐘。隨后如材料與方法中所述，100ul上清液用于ELISA測(cè)定。在37℃下溫育所示時(shí)間的變體的結(jié)合作為在T＝0時(shí)溫育的每種變體的結(jié)合的部分(fraction)進(jìn)行標(biāo)繪。(B)3ug/ml DR3 W.T以及具有SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：5的氨基酸序列的突變體在所示溫度下溫育15分鐘，并且以最大速度離心5分鐘。隨后，如上所述，100ul上清液用于ELISA測(cè)定。在所示溫度下溫育的變體的結(jié)合作為在T＝0時(shí)溫育的每種變體的結(jié)合的部分進(jìn)行標(biāo)繪。(C)在25℃下的結(jié)合活性溫育。3ug/ml具有SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：5的氨基酸序列的DR3突變體溶解于PBS中，1mM DTT在25℃下溫育所示時(shí)間，并且隨后以最大速度離心5分鐘。隨后，如上所述，100ul上清液用于ELISA測(cè)定。在25℃下溫育所示時(shí)間的變體的結(jié)合作為在T＝0時(shí)溫育的每種變體的結(jié)合的部分進(jìn)行標(biāo)繪。(D)在4℃、37℃、47℃下溫育35分鐘后的結(jié)合活性。3ug/ml DR3和具有SEQ ID NO：4的氨基酸序列的突變體溶解于PBS中，1mM DTT在所示溫度下溫育～35分鐘，并且以最大速度離心5分鐘。隨后，如上所述，100ul上清液用于ELISA測(cè)定。在37℃和47℃下溫育的變體的結(jié)合作為在4℃下溫育的每種變體的結(jié)合的部分進(jìn)行計(jì)算。

圖8.TL1a增強(qiáng)來(lái)自CD4細(xì)胞的IL-12/IL-18依賴性IFN-γ分泌。人CD4+細(xì)胞與100ng/ml TL1A、2ng/ml IL-12和50ng/ml IL-18一起溫育24小時(shí)。通過(guò)ELISA就IFN-γ檢測(cè)分析1∶10稀釋的細(xì)胞上清液。

圖9A-B.本發(fā)明的變體對(duì)TL1A誘導(dǎo)的人CD4+中的IFN-γ分泌的作用。CD4⁺細(xì)胞與100ng/ml TL1A、2ng/ml IL-12和50ng/ml IL-18以及不同濃度的(A)可溶性DR3WT(矩形)、具有SEQ ID NO：4的氨基酸序列的變體(三角形)和具有SEQ ID NO：3的氨基酸序列的變體(圓形)；或(B)具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的變體一起溫育24小時(shí)。通過(guò)ELISA就IFN檢測(cè)分析1∶10稀釋的細(xì)胞上清液。數(shù)據(jù)代表每次實(shí)驗(yàn)的兩個(gè)獨(dú)立重復(fù)的平均值。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明在一些實(shí)施例中提供了包含死亡結(jié)構(gòu)域受體3(DR3)的變體的多肽，特別是包含至少一個(gè)位點(diǎn)特異性氨基酸修飾(例如置換)的多肽，以及包含多肽的藥物組合物。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的肽在預(yù)防、治療或改善自身免疫疾病和/或炎性疾病中有效。

如本文下文例示的，可溶性DR3變體以高親和力結(jié)合TL1A，由此阻止配體與內(nèi)源受體結(jié)合。不希望受任何作用機(jī)制束縛，由于DR3細(xì)胞外配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的小分子量及其TL1A結(jié)合表面的完美識(shí)別，可溶性DR3受體的使用是有利的。在另外的實(shí)施例中，具有增加的穩(wěn)定性和與TL1A的親和力的DR3變體增加DR3變體與內(nèi)源DR3受體競(jìng)爭(zhēng)的能力，導(dǎo)致在施用后增加的生物活性和血清半衰期。

根據(jù)一些實(shí)施例，本發(fā)明提供了用于減少或抑制有此需要的受試者中的炎癥、免疫應(yīng)答或兩者的方法，所述方法包括給所述受試者施用包含有效量的本發(fā)明的氨基酸分子的組合物的步驟，由此減少或抑制所述受試者中的炎癥、免疫應(yīng)答或兩者。在其他實(shí)施例中，本發(fā)明的方法可用于治療T細(xì)胞介導(dǎo)的疾病，特別是Th1細(xì)胞介導(dǎo)的的疾病。

根據(jù)另一個(gè)實(shí)施例，所述炎性疾病包括但不限于炎性疾病或過(guò)敏性疾病如哮喘，超敏性肺疾病，超敏性肺炎，遲發(fā)型超敏反應(yīng)，間質(zhì)性肺病(ILD)(例如特發(fā)性肺纖維化或者與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎或其他炎性疾病相關(guān)的ILD)；硬皮病；牛皮癬(包括T-細(xì)胞介導(dǎo)的牛皮癬)；皮炎(包括特應(yīng)性皮炎和濕疹性皮炎)，虹膜炎，結(jié)膜炎，角膜結(jié)膜炎，皮膚紅斑狼瘡，硬皮病，陰道炎，直腸炎，藥疹，過(guò)敏性腦脊髓炎，急性壞死性出血性腦病，特發(fā)性雙側(cè)進(jìn)行性感覺(jué)神經(jīng)性聽力損失，再生障礙性貧血，純紅細(xì)胞貧血，特發(fā)性血小板減少癥，多軟骨炎，格雷夫斯眼病和原發(fā)性膽汁性肝硬化。每種可能性代表本發(fā)明的一個(gè)分開實(shí)施例。

在其他實(shí)施例中，組合物可用于治療自身免疫疾病，包括但不限于：多發(fā)性硬化(MS)、自身免疫性神經(jīng)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、牛皮癬、I型糖尿病(IDDM)、斯耶格倫氏病、甲狀腺疾病、重癥肌無(wú)力、結(jié)節(jié)病、自身免疫性葡萄膜炎、炎性腸病(克羅恩病和潰瘍性結(jié)腸炎)、動(dòng)脈粥樣硬化、原發(fā)性膽汁性肝硬化(PBC)或自身免疫性肝炎、類類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。每種可能性代表本發(fā)明的一個(gè)分開實(shí)施例。

在其他實(shí)施例中，組合物可用于治療移植排斥，包括同種異體移植排斥或移植物抗宿主病。

根據(jù)另一個(gè)實(shí)施例，所述減少或抑制炎癥、免疫應(yīng)答或兩者是抑制TL1A介導(dǎo)的疾病。

根據(jù)另一個(gè)實(shí)施例，所述減少或抑制炎癥、免疫應(yīng)答或兩者是抑制所述受試者中TL1A誘導(dǎo)的IFN-γ分泌。如本文使用的，術(shù)語(yǔ)“減少炎癥”指統(tǒng)計(jì)上顯著的炎癥減少。

根據(jù)另一個(gè)實(shí)施例，所述受試者患有炎性腸病。根據(jù)另一個(gè)實(shí)施例，所述受試者患有牛皮癬。根據(jù)另一個(gè)實(shí)施例，所述受試者患有自身免疫疾病。根據(jù)另一個(gè)實(shí)施例，所述受試者患有哮喘。根據(jù)另一個(gè)實(shí)施例，所述受試者患有關(guān)節(jié)炎。根據(jù)另一個(gè)實(shí)施例，所述受試者患有結(jié)腸炎。

根據(jù)一些實(shí)施例，本發(fā)明的DR3變體包含SEQ ID NO：13(GGTRSPRCDCAGDFHKKIGLFCCRGCPAGHYLKAPCTEPCGNSTCLVCPQDTFLAWENHHNSECARCQACDEQASQVALENCSAVADTRCGCKPGWFVECQVSQCVSSSPFYCQPCLDCGALHRHTRLLCSRRDTDCGTCLPGFYEHGDGCVSCPTSTLGSCPERCAAVCGWRQMF)的氨基酸或者其類似物或片段，其中所述氨基酸分子包含在選自下述的位置處的至少一個(gè)氨基酸置換：H15、I18、E38、V47、D51、W56、N61、A65、K93、Q101、Q104和L129。在一個(gè)實(shí)施例中，SEQ ID NO：13的氨基酸分子或者其類似物或片段包含在選自下述的位置處的至少2、或可替代地至少3、或可替代地至少4、或可替代地至少5、或可替代地至少6、或可替代地至少7、或可替代地至少8、或可替代地至少9、或可替代地至少10、或可替代地至少11、或可替代地至少12個(gè)氨基酸置換：H15、I18、E34、E38、V47、D51、W56、N61、A65、K93、Q101、Q104和L129。

根據(jù)一些實(shí)施例，本發(fā)明的DR3變體包含SEQ ID NO：1的氨基酸：

GGTRSPRCDCAGDFX₁KKX₂GLFCCRGCPAGHYLKAPCTX₃PCGNSTCLX₄CPQX₅TFLAX₆ENHHX₇SECX₈RCQACDEQASQVALENCSAVADTRCGCX₉PGWFVECX₁₀VSX₁₁CVSSSPFYCQPCLDCGALHRHTRLX₁₂CSRRDTDCGTCLPGFYEHGDGCVSCPTSTLGSCPERCAAVCGWRQMF；其中：X₁是H或Q；X₂是I、T或Y；X₃是E或K；X₄是V或P；X₅是D或G；X₆是W或R；X₇是N或E；X₈是A或T；X₉是K、E或A；X₁₀是Q或S；X₁₁是Q或P；并且X₁₂是L或P。

根據(jù)一些實(shí)施例，氨基酸分子包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列，以及任選地，選自下述的至少一個(gè)氨基酸置換：在DR3的第47位處Val(V)至Pro(P)的置換；在第61位處Asn(N)至Glu(E)的置換；以及在第104位處Gln(Q)至Pro(P)的置換，其中每種可能性代表本發(fā)明的一個(gè)分開的實(shí)施例。

術(shù)語(yǔ)“DR3變體”和“DR3突變體”可互換使用，以指包含一個(gè)或多個(gè)置換的DR3的核酸序列和/或核苷酸序列。應(yīng)當(dāng)了解DR3ECD的野生型序列(例如SEQ ID NO：13)或其片段不包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。

根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例，本發(fā)明的DR3變體具有對(duì)TL1A增加的選擇性。如本文使用的，術(shù)語(yǔ)“選擇性”指具有的與TL1A的結(jié)合親和力基本上大于對(duì)于野生型(WT)TL1A的所述結(jié)合親和力。如與選擇性結(jié)合親和力結(jié)合使用的，“基本上更大的”意指在與TL1A的選擇性中的至少1.5倍、至少兩倍、至少三倍、至少四倍或至少五倍增加。

在一些實(shí)施例中，與DR3WT相比較，本發(fā)明的DR3變體顯示出在不同溫度(例如至少25℃、至少40℃、至少41℃、至少42℃、至少43℃、至少44℃、至少45℃、至少46℃、至少47℃、至少48℃、至少49℃、至少50℃、至少51℃或至少52℃)下的結(jié)合活性的穩(wěn)定性增加。如本文使用的，術(shù)語(yǔ)“增加的穩(wěn)定性”指具有的穩(wěn)定性基本上大于DR3WT的穩(wěn)定性。在一些實(shí)施例中，與DR3WT相比較，所述增加的穩(wěn)定性為至少兩倍、至少三倍、至少四倍、至少五倍或至少六倍增加。

在一些實(shí)施例中，DR3變體在抑制TL1A誘導(dǎo)的IFN-γ分泌中具有比DR3WT增加的效力。如本文使用的，術(shù)語(yǔ)“增加的效力”指具有的效力基本上大于DR3WT的效力。在一些實(shí)施例中，所述增加的效力為與DR3WT相比較在效力中的至少兩倍、至少三倍、至少四倍、至少五倍或至少六倍增加。

在一些實(shí)施例中，DR3變體減少TL1A介導(dǎo)的抗炎細(xì)胞因子(例如IL-13和IL-5)的分泌。在一些實(shí)施例中，所述減少為TL1A介導(dǎo)的抗炎細(xì)胞因子分泌中的至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、或至少70％減少。

如本文使用的，術(shù)語(yǔ)“肽”涵蓋天然肽(降解產(chǎn)物、合成肽或重組肽)、擬肽(通常包括非肽鍵或其他合成修飾)以及肽類似物類肽和半類肽，并且可具有例如致使肽在體內(nèi)時(shí)更穩(wěn)定或更能夠穿透到細(xì)胞內(nèi)的修飾。

術(shù)語(yǔ)“多肽”、“氨基酸分子”和“蛋白質(zhì)”在本文中可互換使用，以指氨基酸殘基的聚合物。該術(shù)語(yǔ)應(yīng)用于其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基為相應(yīng)的天然存在的氨基酸的人工化學(xué)類似物的氨基酸聚合物，以及天然存在的氨基酸聚合物。

術(shù)語(yǔ)“經(jīng)分離的”肽指基本上不含污染細(xì)胞組分的肽，所述污染細(xì)胞組分例如碳水化合物、脂質(zhì)或在自然界中與肽結(jié)合的其他蛋白質(zhì)性雜質(zhì)。通常，經(jīng)分離的肽的制備物含有以高度純化形式，即至少約80％純、至少約90％純、至少約95％純、大于95％純、或大于99％純的肽。每種可能性代表本發(fā)明的一個(gè)分開的實(shí)施例。

本發(fā)明還提供了本發(fā)明的DR3變體的片段、類似物和化學(xué)修飾，只要它們能夠結(jié)合TL1A和/或調(diào)節(jié)(例如減少或抑制)TL1A誘導(dǎo)的IFN-γ分泌。

肽可包含在肽的N末端、肽的C末端或兩者處的另外的氨基酸。根據(jù)另一個(gè)實(shí)施例，氨基酸分子還包含抗體的可結(jié)晶片段(Fc)區(qū)的肽。根據(jù)另一個(gè)實(shí)施例，抗體的Fc區(qū)的所述肽包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列。根據(jù)另一個(gè)實(shí)施例，氨基酸分子還包含在氨基酸分子和Fc區(qū)之間的接頭。在一些實(shí)施例中，所述接頭具有不超過(guò)20個(gè)氨基酸、不超過(guò)19個(gè)氨基酸、不超過(guò)18個(gè)氨基酸、不超過(guò)17個(gè)氨基酸、不超過(guò)16個(gè)氨基酸、不超過(guò)15個(gè)氨基酸、不超過(guò)14個(gè)氨基酸、不超過(guò)13個(gè)氨基酸或不超過(guò)12個(gè)氨基酸、不超過(guò)11個(gè)氨基酸、不超過(guò)10個(gè)氨基酸、不超過(guò)9個(gè)氨基酸、不超過(guò)8個(gè)氨基酸、不超過(guò)7個(gè)氨基酸、不超過(guò)6個(gè)氨基酸、不超過(guò)5個(gè)氨基酸、不超過(guò)4個(gè)氨基酸、不超過(guò)3個(gè)氨基酸、不超過(guò)2個(gè)氨基酸或具有一個(gè)氨基酸的長(zhǎng)度。在一些實(shí)施例中，接頭包含SEQ ID NO：11的氨基酸序列(IEGRMDRS)。在示例性實(shí)施例中，所述接頭融合至SEQ ID NO：1的所述氨基酸的羧基末端以及Fc區(qū)的所述肽的氨基末端。

如本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，保守氨基酸置換在本發(fā)明的范圍內(nèi)。保守氨基酸置換包括一個(gè)氨基酸由具有相同類型的官能團(tuán)或側(cè)鏈(例如脂肪族、芳香族、帶正電、帶負(fù)電)的另一個(gè)氨基酸的替換。技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到改變、添加或缺失編碼序列中的單個(gè)氨基酸或小百分比的氨基酸的對(duì)肽、多肽或蛋白質(zhì)序列的個(gè)別置換、缺失或添加是“保守修飾的變體”，其中改變導(dǎo)致氨基酸由化學(xué)上相似的氨基酸的置換。提供功能上相似的氨基酸的保守置換表是本領(lǐng)域眾所周知的。

下述六組各自含有其為彼此的保守置換的氨基酸：1)丙氨酸(A)、絲氨酸(S)、蘇氨酸(T)；2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)、賴氨酸(K)；5)異亮氨酸、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、纈氨酸(V)；和6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)(參見例如Creighton，Proteins，1984)。

術(shù)語(yǔ)“類似物”包括具有基本上等同于本文具體顯示的序列之一的氨基酸序列的任何肽，其中一個(gè)或多個(gè)殘基已由功能上相似的殘基保守置換且其展示如本文描述的能力。保守置換的例子包括一個(gè)非極性(疏水性)殘基例如異亮氨酸、纈氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸置換另一個(gè)非極性(疏水性)殘基，一個(gè)極性(親水)殘基置換另一個(gè)極性(親水)殘基，例如精氨酸和賴氨酸之間、谷氨酰胺和天冬酰胺之間、甘氨酸和絲氨酸之間，一個(gè)堿性殘基例如賴氨酸、精氨酸或組氨酸置換另一個(gè)堿性殘基，或一個(gè)酸性殘基例如天冬氨酸或谷氨酸置換另一個(gè)酸性殘基。每種可能性代表本發(fā)明的一個(gè)分開的實(shí)施例。

短語(yǔ)“保守置換”還包括化學(xué)上衍生的殘基代替非衍生殘基的使用，條件是此類肽如本文指定的展示調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)的先天性應(yīng)答的必要功能。

術(shù)語(yǔ)“來(lái)源于”或“對(duì)應(yīng)于”指使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的合適手段中的任何一種，例如根據(jù)本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)方案的化學(xué)合成，基于序列的了解構(gòu)建氨基酸序列。

根據(jù)另一個(gè)實(shí)施例，本發(fā)明的DR3變體與SEQ ID NO：1-9中的任何一個(gè)具有至少75％序列同一性。根據(jù)另一個(gè)實(shí)施例，所述DR3變體與SEQ ID NO：1-9中的任何一個(gè)具有至少80％序列同一性。根據(jù)另一個(gè)實(shí)施例，所述DR3變體與SEQ ID NO：1-9中的任何一個(gè)具有至少85％序列同一性。根據(jù)另一個(gè)實(shí)施例，所述DR3變體與SEQ ID NO：1-9中的任何一個(gè)具有至少90％序列同一性。根據(jù)另一個(gè)實(shí)施例，所述DR3變體與SEQ ID NO：1-9中的任何一個(gè)具有至少95％序列同一性。

在比對(duì)序列以提供最大同源性后，序列同一性百分比可例如通過(guò)由Needleman等人描述的算法(Needleman等人，J.Mol.Biol.48：443-453(1970))的Fitch等人版本(Fitch等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.80：1382-1386(1983))進(jìn)行測(cè)定?？商娲兀瑑蓚€(gè)序列之間的同一性百分比的測(cè)定可使用Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-5877的數(shù)學(xué)算法來(lái)完成。此類算法摻入Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215，403-410的BLASTP程序內(nèi)。BLAST蛋白質(zhì)搜索用BLASTP程序執(zhí)行，以獲得與SEQ ID NO：4同源的氨基酸序列。為了獲得用于比較目的的缺口比對(duì)，如Altschul等人(1997)Nucleic Acids Res.25：3389-3402中所述利用Gapped BLAST。當(dāng)利用BLAST和Gapped BLAST程序時(shí)，使用分別程序(例如XBLAST)的缺省參數(shù)。

通常，本發(fā)明涵蓋DR3肽的衍生物。術(shù)語(yǔ)“衍生物”或“化學(xué)衍生物”包括具有通過(guò)側(cè)鏈或官能團(tuán)的反應(yīng)而化學(xué)衍生的一個(gè)或多個(gè)殘基的肽的任何化學(xué)衍生物。此類衍生分子包括例如其中游離氨基已衍生以形成胺鹽酸鹽、對(duì)甲苯磺?；?、芐氧羰基、叔丁氧羰基、氯乙酰基或甲?；哪切┓肿?。游離羧基可衍生以形成鹽、甲基酯和乙基酯或其他類型的酯或酰肼。游離羥基可衍生以形成O-?；騉-烷基衍生物。組氨酸的咪唑氮可衍生以形成N-im-芐基組氨酸。還包括作為化學(xué)衍生物的是含有二十種標(biāo)準(zhǔn)氨基酸殘基的一種或多種天然存在的氨基酸衍生物的那些肽。例如：4-羥基脯氨酸可置換脯氨酸；5-羥基賴氨酸可置換賴氨酸；3-甲基組氨酸可置換組氨酸；高絲氨酸可置換絲氨酸；并且鳥氨酸可置換賴氨酸。

另外，肽衍生物可通過(guò)化學(xué)修飾(包括但不限于末端-NH2?；?、乙?；驇€基乙醇酸酰胺化)，以及通過(guò)例如用氨、甲胺等等的末端羧基酰胺化，而不同于本發(fā)明的肽的天然序列。肽可為線性、環(huán)狀或分支的等等，所述構(gòu)象可使用本領(lǐng)域眾所周知的方法來(lái)實(shí)現(xiàn)。

根據(jù)本發(fā)明的原理的肽衍生物和類似物還可包括側(cè)鏈鍵修飾，包括但不限于-CH2-NH-、-CH2-S-、-CH2-S＝0、OC-NH-、-CH2-O-、-CH2-CH2-、S＝C-NH-和-CH＝CH-，以及主鏈修飾例如經(jīng)修飾的肽鍵。肽內(nèi)的肽鍵(-CO-NH-)可例如通過(guò)N-甲基化鍵(-N(CH3)-CO-)；酯鍵(-C(R)H-C-0-0-C(R)H-N)；酮亞甲基鍵(-CO-CH2-)；a-氮雜鍵(-NH-N(R)-CO-)置換，其中R是任何烷基例如甲基；卡巴鍵(-CH2-NH-)；羥基亞乙基鍵(-CH(OH)-CH2-)；硫代酰胺鍵(-CS-NH)；烯烴雙鍵(-CH＝CH-)；以及肽衍生物(-N(R)-CH2-CO-)，其中R是碳原子上天然存在的“正?！眰?cè)鏈。這些修飾可在沿肽鏈的一個(gè)或多個(gè)鍵上發(fā)生，并且甚至同時(shí)在幾個(gè)(例如2-3個(gè))鍵上發(fā)生。

本發(fā)明還涵蓋肽衍生物和類似物，其中游離氨基已衍生以形成胺鹽酸鹽、對(duì)甲苯磺酰氨基、芐氧羰基氨基、叔丁氧羰基氨基、氯乙酰氨基或甲酰氨基。游離羧基可衍生以形成例如鹽、甲基酯和乙基酯或者其他類型的酯或酰肼。組氨酸的咪唑氮可衍生以形成N-im-芐基組氨酸。

肽類似物還可含有非天然氨基酸。非天然氨基酸的例子包括但不限于肌氨酸(Sar)、正亮氨酸、鳥氨酸、瓜氨酸、二氨基丁酸、高絲氨酸、異丙基Lys、3-(2′-萘基)-Ala、煙?；鵏ys、氨基異丁酸和3-(3′-吡啶基-Ala)。

此外，肽類似物可含有其他衍生的氨基酸殘基，包括但不限于甲基化氨基酸、N-芐基化氨基酸、O-芐基化氨基酸、N-乙?；被帷-乙?；被?、芐氧羰基取代氨基酸等等。具體實(shí)例包括但不限于甲基-Ala(Me Ala)、MeTyr、MeArg、MeGlu、MeVal、MeHis、N-乙?；?Lys、O-乙酰基-Lys、芐氧羰基-Lys、Tyr-O-芐基、Glu-O-芐基、芐基-His、Arg-甲苯磺?；⑹宥』拾彼?、叔丁基丙氨酸、苯基甘氨酸、環(huán)己基丙氨酸等等。

本發(fā)明還包括肽類似物，其可含有氨基酸的一種或多種D-異構(gòu)體形式。其中至少一個(gè)氨基酸且可能所有氨基酸為D-氨基酸的逆-反式D-氨基酸肽的生產(chǎn)是本領(lǐng)域眾所周知的。當(dāng)肽中的所有氨基酸均為D-氨基酸，并且分子的N末端和C末端為反轉(zhuǎn)的時(shí)，結(jié)果是在相同位置處具有與分子的L-氨基酸形式相同的結(jié)構(gòu)基團(tuán)的分子。然而，分子對(duì)蛋白水解降解更穩(wěn)定，并且因此可用于本文敘述的許多應(yīng)用中。由于其更高的水溶性、更低的免疫原性以及對(duì)蛋白水解降解的更低易感性，非對(duì)映體肽可超過(guò)具有相同氨基酸序列的所有L-氨基酸肽或所有D-氨基酸肽高度有利。如本文使用的，術(shù)語(yǔ)“非對(duì)映體肽”指包含L-氨基酸殘基和D-氨基酸殘基兩者的肽。本發(fā)明的非對(duì)映體肽中的D-氨基酸殘基的數(shù)目和位置可改變，只要肽能夠展示必要的結(jié)合TL1A和/或調(diào)節(jié)(例如減少或抑制)TL1A誘導(dǎo)的IFN-γ分泌的功能，如本文指定的。

本發(fā)明的肽可通過(guò)本領(lǐng)域眾所周知的技術(shù)進(jìn)行合成或制備。肽可通過(guò)Merrifield的固相肽合成方法(參見J.Am.Chem.Soc，85：2149，1964)進(jìn)行合成。可替代地，本發(fā)明的肽可使用本領(lǐng)域眾所周知的標(biāo)準(zhǔn)溶液方法(參見例如Bodanszky，M.，Principles of Peptide Synthesis，Springer-Verlag，1984)或通過(guò)本領(lǐng)域已知的用于肽合成的任何其他方法進(jìn)行合成。

一般而言，這些方法包括一個(gè)或多個(gè)氨基酸或適當(dāng)保護(hù)的氨基酸序貫添加至與合適樹脂結(jié)合的增長(zhǎng)中的肽鏈。

通常，第一個(gè)氨基酸的氨基或羧基受合適的保護(hù)基團(tuán)保護(hù)。在有助于形成酰胺鍵的條件下，通過(guò)在序列中添加具有適當(dāng)保護(hù)的互補(bǔ)(氨基或羧基)基團(tuán)的下一個(gè)氨基酸，保護(hù)或衍生的氨基酸隨后可附著至惰性固體支撐物(樹脂)或在溶液中利用。保護(hù)基團(tuán)隨后從這個(gè)新近添加的氨基酸殘基中去除，并且加入下一個(gè)氨基酸(適當(dāng)保護(hù)的)，等等。在所有所需氨基酸已以適當(dāng)序列連接后，序貫或同時(shí)去除任何剩余保護(hù)基團(tuán)，并且如果通過(guò)固相方法合成，則從固體支撐物中切割肽鏈，以提供最終肽。

在固相肽合成方法中，氨基酸的α-氨基受酸或堿敏感基團(tuán)保護(hù)。此類保護(hù)基團(tuán)應(yīng)具有對(duì)肽鍵形成的條件穩(wěn)定的特性，同時(shí)可容易去除，而不破壞增長(zhǎng)中的肽鏈。合適的保護(hù)基團(tuán)是叔丁氧羰基(BOC)、芐氧羰基(Cbz)、聯(lián)苯基異丙氧羰基、叔戊氧羰基、異冰片氧羰基、(α，α)-二甲基-3，5-二甲氧基芐氧羰基、鄰硝基苯氧硫基(o-nitrophenylsulfenyl)、2-氰基叔丁氧羰基、9-芴甲氧羰基(FMOC)等等。

在固相肽合成方法中，C末端氨基酸附著至合適的固體支撐物?？捎糜谏衔暮铣傻暮线m的固體支撐物是這樣的材料，所述材料對(duì)逐步縮合-脫保護(hù)反應(yīng)的試劑和反應(yīng)條件惰性，以及在使用的溶劑介質(zhì)中是不溶性的。合適的固體支撐物是氯甲基聚苯乙烯-二乙烯基苯聚合物、羥甲基-聚苯乙烯-二乙烯基苯聚合物等等。偶聯(lián)反應(yīng)在溶劑例如乙醇、乙腈、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)等等中完成。如本領(lǐng)域眾所周知的，相繼受保護(hù)氨基酸的偶聯(lián)可在自動(dòng)多肽合成儀中進(jìn)行。

本發(fā)明的肽可替代地可這樣合成，使得連接肽的氨基酸殘基的鍵中的一個(gè)或多個(gè)是非肽鍵。這些可替代非肽鍵包括但不限于亞氨基鍵、酯鍵、酰肼鍵、氨基脲鍵和偶氮鍵，所述非肽鍵可通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的反應(yīng)形成。

在一些實(shí)施例中，重組蛋白質(zhì)技術(shù)用于生成本發(fā)明的蛋白質(zhì)。在一些實(shí)施例中，重組蛋白質(zhì)技術(shù)用于生成相對(duì)長(zhǎng)的肽(例如長(zhǎng)于18-25個(gè)氨基酸)。在一些實(shí)施例中，重組蛋白質(zhì)技術(shù)用于生成大量本發(fā)明的蛋白質(zhì)。在一些實(shí)施例中，重組技術(shù)通過(guò)Bitter等人，(1987)Methods in Enzymol.153：516-544，Studier等人(1990)Methods in Enzymol.185：60-89，Brisson等人(1984)Nature310：511-514，Takamatsu等人(1987)EMBO J.6：307-311，Coruzzi等人(1984)EMBO J.3：1671-1680和Brogli等人，(1984)Science 224：838-843，Gurley等人(1986)Mol.Cell.Biol.6：559-565和Weissbach&Weissbach，1988，Methods for Plant Molecular Biology，Academic Press，NY，Section VIII，第421-463頁(yè)描述。

通過(guò)重組技術(shù)產(chǎn)生的本發(fā)明的肽、其類似物或衍生物可這樣純化，使得肽當(dāng)施用于受試者時(shí)是基本上純的。術(shù)語(yǔ)“基本上純的”指已與天然伴隨其的組分分開的化合物例如肽。

通常，當(dāng)樣品中的至少50％、優(yōu)選至少75％、更優(yōu)選至少90％且最優(yōu)選至少99％的總材料(按體積計(jì)、按濕重或干重計(jì)、或按摩爾百分比或摩爾分?jǐn)?shù)計(jì))是目的肽時(shí)，肽是基本上純的。純度可通過(guò)任何適當(dāng)方法進(jìn)行測(cè)量，例如在肽的情況下通過(guò)HPLC分析進(jìn)行測(cè)量。

根據(jù)另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了編碼本發(fā)明的多肽、或者其類似物或綴合物的經(jīng)分離的多核苷酸序列。編碼融合至Fc區(qū)的DR3ECD的多核苷酸序列的非限制性例子包含SEQ ID NO：12的核酸序列?；赟EQ ID NO：12生成本發(fā)明的DRS突變體在技術(shù)人員的能力內(nèi)。

術(shù)語(yǔ)“多核苷酸”意指脫氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)或其組合的聚合物，所述聚合物可來(lái)源于任何源，可為單鏈或雙鏈的，并且可任選含有合成、非天然或改變的核苷酸，其能夠摻入DNA或RNA聚合物內(nèi)。

“經(jīng)分離的多核苷酸”指多核苷酸區(qū)段或片段，其已與在天然存在的狀態(tài)中側(cè)接其的序列分開，例如已從序列中取出的DNA片段，所述序列通常與片段鄰接，例如它天然存在于其中的基因組中與片段鄰接的序列。該術(shù)語(yǔ)還應(yīng)用于多核苷酸，所述多核苷酸基本上純化掉在細(xì)胞中天然伴隨多核苷酸的其他組分，例如RNA或DNA或蛋白質(zhì)。術(shù)語(yǔ)因此包括例如重組DNA，其摻入載體、自主復(fù)制的質(zhì)?；虿《?、或者原核生物或真核生物的基因組DNA內(nèi)，或作為分開的分子(例如作為cDNA或者通過(guò)PCR或限制性酶消化產(chǎn)生的基因組片段或cDNA片段)存在，不依賴于其他序列。它還包括其為編碼另外多肽序列的雜合基因的部分的重組DNA，以及RNA例如mRNA。

術(shù)語(yǔ)“編碼”指經(jīng)分離的多核苷酸例如基因、cDNA或mRNA中的特異性核苷酸序列的固有特性，以在生物過(guò)程中充當(dāng)用于合成具有限定核苷酸序列(即rRNA、tRNA和mRNA)或限定氨基酸序列以及起因于其的生物特性的其他聚合物和大分子的模板。因此，如果對(duì)應(yīng)于基因的mRNA的轉(zhuǎn)錄和翻譯在細(xì)胞或其他生物系統(tǒng)中產(chǎn)生肽或蛋白質(zhì)，則該基因編碼肽或蛋白質(zhì)。用作基因或cDNA轉(zhuǎn)錄的模板，其核苷酸序列等同于mRNA序列且通常在序列表中提供的編碼鏈和非編碼鏈兩者，均可被稱為編碼肽或蛋白質(zhì)或者該基因或cDNA的其他產(chǎn)物。

考慮到遺傳密碼的簡(jiǎn)并性，以及如由所謂的“擺動(dòng)規(guī)則”給出的允許密碼子的第三個(gè)位置中的經(jīng)典堿基配對(duì)的例外，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)了解超過(guò)一種多核苷酸可編碼任何給定肽或蛋白質(zhì)。預(yù)期本發(fā)明涵蓋編碼本發(fā)明的肽以及其類似物的多核苷酸。

本發(fā)明的多核苷酸可作為分泌肽進(jìn)行表達(dá)，其中本發(fā)明的多肽或其類似物從含有多核苷酸的宿主細(xì)胞在其中生長(zhǎng)的培養(yǎng)基中分離，或多核苷酸可通過(guò)缺失引導(dǎo)肽或其他肽作為細(xì)胞內(nèi)多肽進(jìn)行表達(dá)，在所述情況下，本發(fā)明的多肽或其類似物從宿主細(xì)胞中分離。本發(fā)明的多肽或其類似物隨后通過(guò)本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)純化方法進(jìn)行純化。

通過(guò)將包含編碼本發(fā)明多肽或其類似物的經(jīng)分離的多核苷酸的表達(dá)載體轉(zhuǎn)移至與目的組織相關(guān)的細(xì)胞，還可將本發(fā)明的多肽、其類似物或衍生物提供給目的組織。細(xì)胞這樣產(chǎn)生肽，使得它適當(dāng)?shù)靥峁┙o組織內(nèi)的細(xì)胞，以發(fā)揮生物活性，例如以減少或抑制目的組織內(nèi)的炎性過(guò)程。

根據(jù)本發(fā)明的原理的表達(dá)載體還包含啟動(dòng)子。在本發(fā)明的上下文中，啟動(dòng)子必須能夠驅(qū)動(dòng)肽在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)。許多病毒啟動(dòng)子適用于此類表達(dá)載體(例如逆轉(zhuǎn)錄病毒ITR、LTR、立即早期病毒啟動(dòng)子(IEp)(例如皰疹病毒IEp(例如ICP4-IEp和ICPO-IEp)和巨細(xì)胞病毒(CMV)IEp)、以及其他病毒啟動(dòng)子(例如晚期病毒啟動(dòng)子、潛伏活性啟動(dòng)子(LAP)、勞斯肉瘤病毒(RSV)啟動(dòng)子和鼠白血病病毒(MLV)啟動(dòng)子)。其他合適的啟動(dòng)子是真核生物啟動(dòng)子，其含有增強(qiáng)子序列(例如兔β-珠蛋白調(diào)節(jié)元件)、組成型活性啟動(dòng)子(例如β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子等)、信號(hào)和/或組織特異性啟動(dòng)子(例如誘導(dǎo)型和/或阻遏型啟動(dòng)子，例如響應(yīng)TNF或RU486的啟動(dòng)子、金屬硫蛋白啟動(dòng)子等)、以及腫瘤特異性啟動(dòng)子。

在表達(dá)載體內(nèi)，編碼本發(fā)明的多肽或其類似物的多核苷酸和啟動(dòng)子可操作地連接，使得啟動(dòng)子能夠驅(qū)動(dòng)多核苷酸的表達(dá)。只要這種可操作地連接得到維持，表達(dá)載體就可包括超過(guò)一種基因，例如通過(guò)內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)分開的多重基因。此外，表達(dá)載體可任選包括其他元件，例如剪接位點(diǎn)、多聚腺苷酸化序列、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件(例如增強(qiáng)子、沉默子等)或其他序列。

表達(dá)載體以這樣的方式引入細(xì)胞內(nèi)，使得它們能夠表達(dá)其中包含的編碼本發(fā)明的多肽或其類似物的經(jīng)分離的多核苷酸。任何合適的載體均可如此采用，其中許多是本領(lǐng)域已知的。此類載體的例子包括裸露DNA載體(例如寡核苷酸或質(zhì)粒)、病毒載體例如腺伴隨病毒載體(Berns等人，1995，Ann.N.Y.Acad.Sci.772：95-104，所述參考文獻(xiàn)的內(nèi)容以引用的方式在此全文并入)、腺病毒載體、皰疹病毒載體(Fink等人，1996，Ann.Rev.Neurosci.19：265-287)、包裝擴(kuò)增子(Federoff等人，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：1636-1640，所述參考文獻(xiàn)的內(nèi)容以引用的方式在此全文并入)、乳頭狀瘤病毒載體、微小核糖核酸病毒載體、多瘤病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、SV40病毒載體、牛痘病毒載體和其他載體。另外，載體還可包括其他遺傳元件，例如編碼可選擇標(biāo)記物(例如β-gal或賦予對(duì)毒素的抗性的標(biāo)記物)的基因、藥理學(xué)活性蛋白、轉(zhuǎn)錄因子或其他生物活性物質(zhì)。

用于操作包含經(jīng)分離的多核苷酸的載體的方法是本領(lǐng)域眾所周知的(例如Sambrook等人，1989，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor Press，所述參考文獻(xiàn)的內(nèi)容以引用的方式在此全文并入)，并且包括直接克隆、使用重組酶的位點(diǎn)特異性重組、同源重組和構(gòu)建重組載體的其他合適方法。以這種方式，表達(dá)載體可這樣構(gòu)建，使得它可在任何所需細(xì)胞中復(fù)制，在任何所需細(xì)胞中表達(dá)，并且甚至可變得整合到任何所需細(xì)胞的基因組內(nèi)。

包含目的多核苷酸的表達(dá)載體通過(guò)對(duì)于將DNA轉(zhuǎn)移到細(xì)胞內(nèi)適當(dāng)?shù)娜魏问侄我爰?xì)胞內(nèi)。許多此類方法是本領(lǐng)域眾所周知的(例如Sambrook等人，同上；還參見Watson等人，1992，Recombinant DNA，第12章，第2版，Scientific American Books，所述參考文獻(xiàn)的內(nèi)容以引用的方式在此全文并入)。因此，在原核細(xì)胞的情況下，載體引入可例如通過(guò)電穿孔、轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)、綴合或移動(dòng)來(lái)完成。對(duì)于真核細(xì)胞，載體可通過(guò)使用例如電穿孔、轉(zhuǎn)染、感染、DNA包被的微彈或原生質(zhì)體融合引入。表達(dá)載體可引入其內(nèi)的真核細(xì)胞的例子包括但不限于卵子、干細(xì)胞、胚細(xì)胞等等。

需要時(shí)，多核苷酸在誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的控制下轉(zhuǎn)移到其內(nèi)的細(xì)胞可用作瞬時(shí)轉(zhuǎn)化體。此類細(xì)胞自身隨后可轉(zhuǎn)移到受試者內(nèi)用于其中的治療利益。因此，細(xì)胞可轉(zhuǎn)移至受試者中的部位，使得本發(fā)明的肽在其中表達(dá)且由其分泌，并且因此例如減少或抑制T細(xì)胞介導(dǎo)的過(guò)程，使得受試者的臨床狀況得到改善。可替代地，特別是在載體已在體外加入其中的細(xì)胞的情況下，細(xì)胞可首先經(jīng)歷幾輪克隆選擇(通常通過(guò)在載體中使用可選擇標(biāo)記物序列得到促進(jìn))，以選擇穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化體。此類穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化體隨后轉(zhuǎn)移至受試者優(yōu)選人，用于其中的治療利益。

在細(xì)胞內(nèi)，編碼本發(fā)明的肽或其類似物的多核苷酸得到表達(dá)且任選被分泌。多核苷酸的成功表達(dá)可使用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)(例如RNA雜交、蛋白質(zhì)印跡、免疫沉淀、酶免疫測(cè)定等)進(jìn)行評(píng)價(jià)。

本發(fā)明涵蓋包含編碼本發(fā)明肽的經(jīng)分離的多核苷酸的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。

本發(fā)明的藥物組合物

在一些實(shí)施例中，本發(fā)明提供了包含治療有效量的本發(fā)明的氨基酸分子(即多肽)(例如SEQ ID NO：1)作為活性成分和藥學(xué)可接受的運(yùn)載體的組合物(即藥物組合物)。

本發(fā)明的藥物組合物可以本發(fā)明的多肽或者其類似物或其衍生物的藥學(xué)可接受的鹽形式進(jìn)行配制。藥學(xué)可接受的鹽包括由游離氨基形成的那些鹽，例如來(lái)源于無(wú)毒無(wú)機(jī)酸或有機(jī)酸(例如鹽酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等等)的鹽，以及由游離羧基形成的那些鹽，例如來(lái)源于無(wú)毒無(wú)機(jī)堿或有機(jī)堿(例如鈉、鉀、銨、鈣、氫氧化鐵、異丙胺、三乙胺、2-乙基氨基乙醇、組氨酸、普魯卡因等等)的鹽。在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明的藥物組合物通過(guò)本領(lǐng)域眾所周知的過(guò)程進(jìn)行制造，所述過(guò)程例如借助于常規(guī)混合、溶解、制粒、糖衣丸制造、水飛、乳化、封裝、包埋或凍干過(guò)程。

術(shù)語(yǔ)“藥學(xué)可接受的”意指適合于施用于受試者例如人。例如，術(shù)語(yǔ)“藥學(xué)可接受的”可意指由聯(lián)邦政府或州政府的管理機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)或者美國(guó)藥典或其他一般公認(rèn)藥典中列出用于在動(dòng)物中且更具體而言在人中使用。術(shù)語(yǔ)“運(yùn)載體”指治療化合物與其一起施用的稀釋劑、佐劑、賦形劑或媒介物。此類藥學(xué)運(yùn)載體可為無(wú)菌液體，例如水和油，包括石油、動(dòng)物、植物或合成起源的那些，例如花生油、大豆油、礦物油、芝麻油等等，聚乙二醇、丙三醇、丙二醇或其他合成溶劑。當(dāng)藥物組合物靜脈內(nèi)施用時(shí)，水是優(yōu)選運(yùn)載體。鹽水溶液以及水性右旋糖和甘油溶液也可用作液體運(yùn)載體，特別是用于可注射溶液。合適的藥學(xué)賦形劑包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽、大米、面粉、白堊、硅膠、硬脂酸鈉、單硬脂酸甘油酯、滑石、氯化鈉、脫脂乳、甘油、丙二醇、水、乙醇等等。需要時(shí)，組合物還可含有少量濕潤(rùn)劑或乳化劑，或者pH緩沖劑例如乙酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽。還設(shè)想了抗菌劑例如芐醇或?qū)αu基苯甲酸甲酯；抗氧化劑例如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉；以及用于調(diào)整張力的試劑例如氯化鈉或右旋糖。

組合物可采取溶液、懸浮液、乳狀液、片劑、丸劑、膠囊、粉末、凝膠、乳膏、軟膏、泡沫、糊劑、持續(xù)釋放制劑等等的形式。組合物可用常規(guī)粘合劑和運(yùn)載體例如甘油三酯、微晶纖維素、黃蓍膠或明膠配制為栓劑。經(jīng)口制劑可包括標(biāo)準(zhǔn)運(yùn)載體，例如藥物級(jí)別的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、纖維素、碳酸鎂等。合適藥學(xué)運(yùn)載體的例子在下述中描述：通過(guò)E.W.Martin的Remington′s Pharmaceutical Sciences″，所述參考文獻(xiàn)的內(nèi)容以引用的方式在此并入本文。此類組合物含有治療有效量的本發(fā)明的肽，優(yōu)選以基本上純化的形式，連同合適量的運(yùn)載體，以便提供用于適當(dāng)施用于受試者的形式。

本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例涉及以單位劑型呈現(xiàn)的多肽，并且通過(guò)藥學(xué)領(lǐng)域眾所周知的方法中的任一種進(jìn)行制備。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，單位劑型采取片劑、膠囊、錠劑、薄片、貼片、安瓿、小瓶或預(yù)填充注射器的形式。另外，體外測(cè)定可任選用于幫助鑒定最佳劑量范圍。在制劑中要采用的精確劑量還取決于施用途徑以及疾病或病癥的性質(zhì)，并且應(yīng)當(dāng)根據(jù)從業(yè)者的判斷和每個(gè)患者的情況來(lái)決定。有效劑量可由來(lái)源于體外或體內(nèi)動(dòng)物模型測(cè)試生物測(cè)定或系統(tǒng)的劑量應(yīng)答曲線外推。

取決于目的組織的位置，本發(fā)明的多肽可以適合于將肽提供給目的組織內(nèi)的細(xì)胞的任何方式供應(yīng)。因此，例如，含有多肽的組合物可例如引入體循環(huán)內(nèi)，所述體循環(huán)將所述肽分配至目的組織?？商娲兀M合物可局部應(yīng)用于目的組織(例如注射，或作為連續(xù)輸注泵送，或作為組織內(nèi)的推注，應(yīng)用于皮膚表面的全部或一部分等)。

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，多肽經(jīng)由經(jīng)口、直腸、陰道、局部、鼻、眼、透皮、皮下、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)或靜脈內(nèi)施用途徑進(jìn)行施用。藥物組合物的施用途徑將取決于要治療的疾病或狀況。合適的施用途徑包括但不限于腸胃外注射，例如皮內(nèi)、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、損傷內(nèi)、皮下、鞘內(nèi)、以及如本領(lǐng)域已知的任何其他注射模式。盡管通過(guò)其他途徑施用的肽的生物利用度可低于經(jīng)由腸胃外注射施用時(shí)，通過(guò)使用適當(dāng)制劑，設(shè)想能夠經(jīng)由經(jīng)皮、經(jīng)口、直腸、陰道、局部、鼻、吸入和眼部治療模式施用本發(fā)明的組合物。另外，可能期望通過(guò)任何合適途徑引入本發(fā)明的藥物組合物，包括心室內(nèi)和鞘內(nèi)注射；心室內(nèi)注射可通過(guò)例如附著至儲(chǔ)庫(kù)的心室內(nèi)導(dǎo)管得到促進(jìn)。肺施用還可例如通過(guò)使用吸入器或噴霧器采用。

對(duì)于局部應(yīng)用，本發(fā)明的肽、其衍生物、類似物或片段可與藥學(xué)可接受的運(yùn)載體組合，使得基于所需活性遞送有效劑量。運(yùn)載體可采用例如但不限于下述形式：軟膏、乳膏、凝膠、糊劑、泡沫、氣霧劑、栓劑、墊或凝膠棒。

對(duì)于經(jīng)口應(yīng)用，藥物組合物可采取片劑或膠囊的形式，所述片劑或膠囊可含有下述成分中的任一種或相似性質(zhì)的化合物：粘合劑如微晶纖維素，黃蓍膠或明膠；賦形劑如淀粉或乳糖；崩解劑如海藻酸、Primogel或玉米淀粉；潤(rùn)滑劑如硬脂酸鎂；或助流劑如膠體二氧化硅。當(dāng)劑量單位形式是膠囊時(shí)，除上文類型的材料之外，它還可含有液體運(yùn)載體例如脂肪油。另外，劑量單位形式可含有修飾劑量單位的物理形式的各種其他材料，例如糖包衣、蟲膠或其他腸試劑。本發(fā)明的片劑還可以是薄膜包衣的。

對(duì)于腸胃外施用的目的，可采用芝麻油或花生油或者水性丙二醇中的溶液，以及相應(yīng)的水溶性鹽的無(wú)菌水性溶液。需要時(shí)，此類水性溶液可為適當(dāng)緩沖的，并且液體稀釋劑首先用足夠的鹽水或葡萄糖致使等滲。這些水溶液尤其適合于靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下和腹膜內(nèi)注射目的。

本發(fā)明的組合物一般以藥物組合物的形式施用，所述藥物組合物包含本發(fā)明的活性組分中的至少一種連同藥學(xué)可接受的運(yùn)載體或稀釋劑。因此，本發(fā)明的組合物可個(gè)別或一起在任何常規(guī)經(jīng)口、腸胃外或經(jīng)皮劑型中施用。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例的藥物組合物可含有0.1％-95％本發(fā)明的活性組分，優(yōu)選1％-70％。在任何情況下，要施用的組合物或制劑可含有一定數(shù)量的根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例的活性組分，以有效治療被治療的受試者的狀況或疾病的量。

組合物還包含防腐劑，例如苯扎氯銨和硫柳汞等等；螯合劑，例如EDTA鈉及其他；緩沖劑，例如磷酸鹽、檸檬酸鹽和乙酸鹽；張力劑，例如氯化鈉、氯化鉀、丙三醇、甘露醇及其他；抗氧化劑，例如抗壞血酸、乙酰半胱氨酸、偏亞硫酸氫鈉及其他；芳香劑；粘度調(diào)節(jié)劑，例如聚合物，包括纖維素及其衍生物；以及聚乙烯醇以及酸和堿，以根據(jù)需要調(diào)整這些水性化合物的pH。組合物還可包含局部麻醉劑或其他活性劑。

另外，組合物還可包含粘合劑(例如阿拉伯膠、玉米淀粉、明膠、卡波姆、乙基纖維素、瓜爾膠、羥丙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、聚維酮)、崩解劑(例如玉米淀粉、馬鈴薯淀粉、海藻酸、二氧化硅、交聯(lián)羧甲基纖維素鈉、交聚維酮、瓜爾膠、淀粉羥乙酸鈉)、各種pH和離子強(qiáng)度的緩沖液(例如Tris-HCl、乙酸鹽、磷酸鹽)、添加劑例如白蛋白或明膠以防止吸收至表面、去污劑(例如Tween 20、Tween 80、Pluronic F68、膽汁酸鹽)、蛋白酶抑制劑、表面活性劑(例如十二烷基硫酸鈉)、滲透促進(jìn)劑、增溶劑(例如甘油、聚乙烯甘油)、抗氧化劑(例如抗壞血酸、偏亞硫酸氫鈉、丁基羥基茴香醚)、穩(wěn)定劑(例如羥丙基纖維素、羥丙基甲基纖維素)、粘度增加劑(例如卡波姆、膠體二氧化硅、乙基纖維素、瓜爾膠)、甜味劑(例如阿斯巴甜、檸檬酸)、防腐劑(例如硫柳汞、苯甲醇、對(duì)羥基苯甲酸酯)、潤(rùn)滑劑(例如硬脂酸、硬脂酸鎂、聚乙二醇、十二烷基硫酸鈉)、流動(dòng)助劑(例如膠體二氧化硅)、增塑劑(例如鄰苯二甲酸二乙酯、檸檬酸三乙酯)、乳化劑(例如卡波姆、羥丙基纖維素、十二烷基硫酸鈉)、聚合物包衣(例如泊洛沙姆或泊洛沙胺)、包衣和成膜劑(例如乙基纖維素、丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯)和/或佐劑。

本發(fā)明的多肽、其衍生物或類似物可在控制釋放系統(tǒng)中遞送。因此，輸液泵可用于施用肽例如用于例如將胰島素或化學(xué)療法遞送至特定器官或腫瘤的那種。在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明的肽與生物可降解、生物相容性聚合物埋植劑組合施用，所述埋植劑在所選位點(diǎn)處經(jīng)過(guò)控制時(shí)間段釋放肽。優(yōu)選聚合物材料的例子包括但不限于聚酸酐、聚原酸酯、聚乙醇酸、聚乳酸、聚乙烯乙酸乙烯酯、其共聚物和共混物(參見Medical applications of controlled release，Langer和Wise(編輯)，1974，CRC Pres.，Boca Raton，F(xiàn)la.，所述參考文獻(xiàn)的內(nèi)容以引用的方式在此全文并入)。在另外一個(gè)實(shí)施例中，控制釋放系統(tǒng)可置于治療靶附近，因此僅需要全身劑量的部分。

在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明的組合物在包或分配器裝置例如FDA批準(zhǔn)的試劑盒中呈現(xiàn)，所述包或分配器裝置包含含有活性成分的一種或多種單位劑型。在一個(gè)實(shí)施例中，包或分配器裝置伴隨施用說(shuō)明書。

在一個(gè)實(shí)施例中，應(yīng)了解本發(fā)明的多肽可與另外的活性劑一起提供給個(gè)體，以實(shí)現(xiàn)與每種試劑單獨(dú)治療相比較改善的療效。在另一個(gè)實(shí)施例中，采取針對(duì)與組合療法相關(guān)的不良副作用的措施(例如補(bǔ)充試劑的給藥和選擇)。

肽的“治療有效量”是足以對(duì)肽施用于其的受試者提供有利效應(yīng)的肽量。更具體而言，治療有效量意指有效預(yù)防、減輕或改善被治療的受試者的組織損害或疾病癥狀的肽量。

在一些實(shí)施例中，有效量或劑量的制備可最初由體外測(cè)定進(jìn)行估計(jì)。在一個(gè)實(shí)施例中，劑量可在動(dòng)物模型中配制，并且此類信息可用于更精確地測(cè)定在人中的有用劑量。

在一個(gè)實(shí)施例中，本文描述的活性成分的毒性和治療功效可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)藥學(xué)程序在體外、在細(xì)胞培養(yǎng)物或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物中進(jìn)行測(cè)定。在一個(gè)實(shí)施例中，得自這些體外和細(xì)胞培養(yǎng)測(cè)定和動(dòng)物研究的數(shù)據(jù)可用于配制用于在人中使用的一系列劑量。在一個(gè)實(shí)施例中，劑量取決于采用的劑型和利用的施用途徑而改變。在一個(gè)實(shí)施例中，確切制劑、施用途徑和劑量可通過(guò)個(gè)別醫(yī)生考慮到患者的條件加以選擇。[參見例如Fingl等人，(1975)″The Pharmacological Basis of Therapeutics″，第1章，第1頁(yè)]。

在一個(gè)實(shí)施例中，取決于要治療的狀況的嚴(yán)重性和應(yīng)答性，給藥可為單次施用或多次施用，其中療程從幾天持續(xù)到幾周，或直至實(shí)現(xiàn)治愈或?qū)崿F(xiàn)疾病狀態(tài)的縮小。在一個(gè)實(shí)施例中，要施用的組合物的量當(dāng)然取決于被治療的受試者、痛苦的嚴(yán)重性、施用方式、開處方醫(yī)生的判斷等。在一個(gè)實(shí)施例中，還可制備包括在相容的藥學(xué)運(yùn)載體中配制的本發(fā)明制備物的組合物，置于適當(dāng)容器中，并且標(biāo)記用于所示狀況的治療。

在說(shuō)明書中，除非另有說(shuō)明，否則修飾本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例的一個(gè)或多個(gè)特征特有的條件或關(guān)系的形容詞例如“基本上”和“約”理解為意指條件或特征定義為在容許量?jī)?nèi)，所述容許量對(duì)于它預(yù)期用于其的應(yīng)用的實(shí)施例操作是可接受的。除非另有說(shuō)明，否則在說(shuō)明書和權(quán)利要求中的單詞“或”視為包括性“或”，而不是排他性或，并且指示它結(jié)合的項(xiàng)目中的至少一個(gè)或任何組合。

在本專利申請(qǐng)的說(shuō)明書和權(quán)利要求中，動(dòng)詞“包含”、“包括”和“具有”及其綴合物各自用于指示動(dòng)詞的一個(gè)或多個(gè)賓語(yǔ)不一定是動(dòng)詞的一個(gè)或多個(gè)對(duì)象的組分、元素或部分的完全列表。

在檢查并非預(yù)期是限制性的下述實(shí)例后，本發(fā)明的另外目的、優(yōu)點(diǎn)和新型特征對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將變得顯而易見。另外，如上文描述和如下文權(quán)利要求部分中請(qǐng)求保護(hù)的本發(fā)明的各個(gè)實(shí)施例和方面各自在下述實(shí)例中找到實(shí)驗(yàn)支持。

實(shí)例

一般地，本文使用的命名法和本發(fā)明中利用的實(shí)驗(yàn)室程序包括分子、生物化學(xué)、微生物和重組DNA技術(shù)。此類技術(shù)在文獻(xiàn)中得到充分說(shuō)明。參見例如″Molecular Cloning：A laboratory Manual″Sambrook等人，(1989)；″Current Protocols in Molecular Biology″第I-III卷，Ausubel，R.M.，編輯(1994)；Ausubel等人，″Current Protocols in Molecular Biology″，John Wiley and Sons，Baltimore，Maryland(1989)；Perbal，″A Practical Guide to Molecular Cloning″，John Wiley&Sons，New York(1988)；Watson等人，″Recombinant DNA″，Scientific American Books，New York；Birren等人(編輯)″Genome Analysis：A Laboratory Manual Series″，第1-4卷，Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York(1998)；如美國(guó)專利號(hào)4,666,828；4,683,202；4,801,531；5,192,659和5,272,057中所示的方法；″Cell Biology：A Laboratory Handbook″，第I-III卷Cellis，J.E.，編輯(1994)；Freshney的″Culture of Animal Cells-A Manual of Basic Technique″，Wiley-Liss，N.Y.(1994)，第三版；″Current Protocols in Immunology″第I-III卷Coligan J.E.，編輯(1994)；Stites等人(編輯)，″Basic and Clinical Immunology″(第8版)，Appleton&Lange，Norwalk，CT(1994)；Mishell和Shiigi(編輯)，″Strategies for Protein Purification and Characterization-A Laboratory Course Manual″CSHL Press(1996)；所有這些參考文獻(xiàn)以引用的方式并入。其他一般參考文獻(xiàn)在本文件自始至終提供。

材料與方法

質(zhì)粒和細(xì)胞培養(yǎng)

人DR3細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域由購(gòu)自O(shè)pen Biosystems的人DR3的EST cDNA克隆進(jìn)行擴(kuò)增。大腸桿菌(E.coli)E.Cloni菌株(Lucigen)用于克隆和質(zhì)粒提取。對(duì)于酵母表面展示，使用NheI和BamHI位點(diǎn)將變體克隆到pCTCON質(zhì)粒內(nèi)。對(duì)于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)，使用pFUSE(Invivogen)載體，以獲得與人IgG1Fc融合的DR3-ECD變體。

HEK293T在補(bǔ)充有10％FBS(Biological Industries，Beit-Haemek，Israel)、2mM谷氨酰胺、1x青霉素/鏈霉素溶液(Biological Industries，Beit-Haemek，Israel)的DMEM中生長(zhǎng)，在轉(zhuǎn)染前3小時(shí)，培養(yǎng)基更換為Freestyle無(wú)血清培養(yǎng)基(Invitrogen)。H293F在不含任何補(bǔ)充物的Freestyle培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。PBL和CD4+T細(xì)胞亞群以1*10⁶/ml的濃度在RPMI 1640中生長(zhǎng)，所述RPMI 1640具有10％FBS 2mM谷氨酰胺、1x青霉素/鏈霉素溶液(Biological Industries，Beit-Haemek，Israel)，補(bǔ)充有10％熱滅活的FBS(Biological Industries，Beit-Haemek，Israel)。

酵母表面展示

DR3變體在EBY100菌株細(xì)胞的酵母細(xì)胞表面上展示(Chao，G.等人Nat Protoc 1，755-68，2006)，并且基本上如所述的通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析。簡(jiǎn)言之，用含有所需克隆的質(zhì)粒pCTCON轉(zhuǎn)化的EBY100細(xì)胞在SDCAA培養(yǎng)基(20g蔗糖、6.7g酵母氮源、5g酪蛋白氨基酸、5.4g Na2HPO4和8.56g NaH2PO4*H2O)中在30℃下生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期。隨后，將2*10⁶細(xì)胞洗滌，重懸浮于SGCAA誘導(dǎo)培養(yǎng)基(類似于SDCAA，但含有半乳糖代替蔗糖)中，并且在30℃下伴隨振蕩生長(zhǎng)另外18小時(shí)。經(jīng)誘導(dǎo)的細(xì)胞(1*10⁶)通過(guò)離心收集，用PBSF(PBS+1g/L BSA)洗滌，并且在25℃下與0.2μM TL1A(R&D Systems)一起溫育1小時(shí)，所述TL1A根據(jù)制造商的程序，使用生物素標(biāo)記試劑盒(Pierce)進(jìn)行生物素化。細(xì)胞隨后洗滌且在25℃下與小鼠α-myc抗體(Santa Cruz Biotechnology，1μl/50μl PBSF)一起溫育1小時(shí)。隨后，細(xì)胞再次洗滌且與FITC綴合的α-小鼠IgG(Sigma，1μl/50μl PBSF)和別藻藍(lán)蛋白綴合的鏈霉抗生物素蛋白(Jackson Immunoresearch，1μl/50μl PBSF)一起在冰上溫育另外一小時(shí)，伴隨頻繁混合。將標(biāo)記的細(xì)胞洗滌，用PBSF重懸浮，并且通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)(FACS Calibur，BD)分析。

文庫(kù)生成

對(duì)于DR3回復(fù)共有區(qū)文庫(kù)的生成，人DR3基因通過(guò)PCR進(jìn)行擴(kuò)增，并且5μg用DNA酶I進(jìn)行消化，以獲得50-125bp片段，如先前描述的28。如在DNA改組31中，在16種短寡核苷酸(各4-6nM)的混合物的存在下，將片段重裝配，導(dǎo)致在每種基因中含有3-8個(gè)突變的文庫(kù)，具有～4的平均突變數(shù)目(Stemmer，W.P.，1994，Proc Natl Acad Sci USA 91，10747-51；Aharoni等人，2004，Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 101，482-487)?；谙率龅仁剑烙?jì)的文庫(kù)復(fù)雜性為～170,000種突變體：N！/(N-K)！*K，其中N是位置總數(shù)目，并且K是插入基因內(nèi)的平均突變數(shù)目(Bamias，G.等人2006，Proc Natl Acad Sci USA103，8441-6)。如所述的(Chao，G.等人2006，Nat Protoc，1，755-68)，反應(yīng)混合物還通過(guò)嵌套PCR進(jìn)行擴(kuò)增。將文庫(kù)連接到pCTCON載體內(nèi)用于酵母表面展示，或通過(guò)重組克隆到酵母內(nèi)。

使用酵母表面展示的文庫(kù)選擇

如上所述，將文庫(kù)誘導(dǎo)且用c-myc和生物素化的TL1A進(jìn)行標(biāo)記。將展示DR3文庫(kù)的EBY100細(xì)胞(1*10⁷)標(biāo)記，分析且使用FACS(Synergy iCyt)分選。執(zhí)行三個(gè)迭代富集循環(huán)。在每個(gè)循環(huán)中，將對(duì)應(yīng)于在頂部1-2％的綠色和紅色熒光強(qiáng)度區(qū)域內(nèi)發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞的多重‘陽(yáng)性’事件(3-5*10⁴)收集到生長(zhǎng)培養(yǎng)基內(nèi)，并且在瓊脂上鋪平板用于新的富集循環(huán)。對(duì)于首次用于實(shí)驗(yàn)的文庫(kù)的初始分選，使用頂部5％的熒光細(xì)胞的分選門。選擇循環(huán)繼續(xù)直至未獲得進(jìn)一步富集。

在哺乳動(dòng)物表達(dá)后使用ELISA篩選富集的DR3文庫(kù)

將來(lái)自最后一輪FACS富集的質(zhì)粒庫(kù)PCR擴(kuò)增，克隆到如上所述的pFUSE質(zhì)粒內(nèi)，并且轉(zhuǎn)化到HEK293T細(xì)胞內(nèi)。轉(zhuǎn)染后兩至三天，含有分泌的DR3變體的培養(yǎng)基使用ELISA就DR3-TL1A相互作用進(jìn)行測(cè)試。為了進(jìn)行測(cè)定，ELISA板(Griener Microlon 96W)與100μl 0.66μg/ml單克隆小鼠α-TL1A抗體(Santa Cruz)一起溫育1小時(shí)，用補(bǔ)充有0.05％Tween-80的PBS(PBST)洗滌，并且將100μl 0.6μg/ml TL1A(Cam Bio)加入板中，共另外一小時(shí)。板隨后用PBST進(jìn)行洗滌，并且通過(guò)與150μl補(bǔ)充有3％脫脂乳的PBS一起溫育1小時(shí)進(jìn)行封閉。在封閉后，將板洗滌且與用WT或DR3突變體轉(zhuǎn)染的100μl HEK293T培養(yǎng)基一起溫育，所述WT或DR3突變體在轉(zhuǎn)染后48或72小時(shí)收獲，使ELISA板振蕩另外一小時(shí)。DR3-Fc(R&D Systems)以2μg/ml的濃度加入作為陽(yáng)性對(duì)照，并且補(bǔ)充有1％BSA的PBS充當(dāng)陰性對(duì)照。板隨后用PBST洗滌，與100μl 0.05μg/ml生物素化的山羊多克隆α-DR3抗體(R&D Systems)一起溫育，隨后與次級(jí)過(guò)氧化物酶綴合的鏈霉抗生物素蛋白(Jackson，1∶10000稀釋度)一起溫育。最后，加入100μl辣根過(guò)氧化物酶(HRP)生色3，3′，5，5′-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)底物溶液(Dako)。反應(yīng)通過(guò)加入1M硫酸得到停止，并且使用Tecan Infinite M200板閱讀器在450nm下進(jìn)行記錄。

在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的大規(guī)模蛋白質(zhì)表達(dá)和純化

根據(jù)制造商的程序，將含有DR3變體的pFUSE轉(zhuǎn)移至Freestyle培養(yǎng)基中的500ml 293F細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后六天，收集培養(yǎng)基，并且使用10K Amicon超濾裝置濃縮五倍，隨后濃縮的上清液用30mM Tris pH 8.3(緩沖液A)稀釋六倍。最終pH測(cè)量為8.25，并且將上清液裝載到MonoQ柱(GE)上。接下來(lái)，柱用20柱體積的緩沖液A進(jìn)行洗滌，并且通過(guò)應(yīng)用20柱體積從緩沖液A到緩沖液B(30mM Tris pH 8.3和0.5M NaCl)的梯度來(lái)洗脫蛋白質(zhì)，在整個(gè)洗脫過(guò)程期間收集級(jí)分。級(jí)分活性通過(guò)ELISA進(jìn)行測(cè)量，將活性級(jí)分合并在一起，針對(duì)含有1.5mM DTT的PBS進(jìn)行透析，并且隨后十倍稀釋到50mM NaCitrate 25mM NaCl pH 5.8(緩沖液C)內(nèi)。稀釋的活性級(jí)分直接裝載到SP柱(GE)上，并且柱用緩沖液C洗滌直至OD 280是穩(wěn)定的。SP柱通過(guò)應(yīng)用從緩沖液C到含有50mM NaCitrate 450mM NaCl pH 5.8的緩沖液(緩沖液D)的梯度進(jìn)行洗脫，具有23柱體積的梯度長(zhǎng)度，在整個(gè)洗脫過(guò)程期間收集級(jí)分。樣品在SDS PAGE凝膠上運(yùn)行，并且合并含有對(duì)應(yīng)于DR3-Fc融合蛋白的大約47kDa的主要條帶的級(jí)分。

合并的級(jí)分兩倍稀釋到2M NH₃SO₄50mM Tris pH 7.3內(nèi)，并且隨后裝載到丁基HIC柱(GE)上。丁基柱用1M NH₃SO₄ 200mM NaCl 25mM NaCitrate pH 5.8洗滌超過(guò)20柱體積，并且通過(guò)應(yīng)用21柱體積梯度至含有50mM檸檬酸鹽25mM NaCl pH 5.8的緩沖液進(jìn)行洗脫，收集洗脫級(jí)分且通過(guò)SDS PAGE凝膠進(jìn)行分析。將含有以90％或更高純度的DR3-FC的級(jí)分合并在一起，針對(duì)含有1.5mM DTT的PBS透析，并且在液氮中以小等分試樣沖洗凍干用于未來(lái)使用。

用于抑制TL1A誘導(dǎo)的IFN--γ分泌的基于CD4+細(xì)胞的測(cè)定

根據(jù)制造商說(shuō)明書，使用Lymphoprep^TM(Axis shield，Oslo，Norway)，從正常健康志愿者的血液中分離PBMC，在燒瓶中在37℃下溫育PBMC三小時(shí)后分離PBL級(jí)分，并且非貼壁級(jí)分指定為PBL。如通過(guò)制造商描述的，非接觸CD4+T細(xì)胞亞群的分離使用CD4+或T細(xì)胞分離試劑盒(Miltenyi Biotec，Auburn，CA)執(zhí)行。PBL與IL-12(2ng/ml)和IL-18(50ng/ml)一起溫育72小時(shí)，連同或不連同TL1A(100ng/ml)或以不同濃度的DR3變體。收集培養(yǎng)基，并且根據(jù)制造商說(shuō)明書，通過(guò)使用ELISA試劑盒(PeproTech)定量IFN-γ的水平。

使用表面等離子體共振的親和力測(cè)量

TL1A與DR3變體結(jié)合的親和力通過(guò)在ProteOn XPR36(Bio-Rad)儀器上的表面等離子體共振(SPR)測(cè)量進(jìn)行測(cè)定。所有樣品均在含有2mM DTT的PBS中。GLC Chip進(jìn)行空氣初始化，并且用EDC/S-NHS進(jìn)行活化。來(lái)自DR3變體各自的5μg在乙酸鹽緩沖液，pH 5.5中稀釋，并且固定到芯片上作為參考，并且BSA也裝載到芯片上。在用乙醇胺封閉芯片上的可用的未結(jié)合位點(diǎn)后，芯片用HBST緩沖液進(jìn)行洗滌且旋轉(zhuǎn)。TL1A以30μl/分鐘以各種濃度(100、50、25、12.5和6.25nM)運(yùn)行300秒，隨后為10分鐘解離步驟。使用Bio-Rad的proteOn Manager軟件V2.1.2.05，用Langmuir單結(jié)合位點(diǎn)模型測(cè)定結(jié)合參數(shù)。

定向進(jìn)化方法

在過(guò)去幾年中，定向進(jìn)化方法已證明對(duì)于生成具有改善功能的蛋白質(zhì)是高度有價(jià)值的。定向進(jìn)化方法基于天然達(dá)爾文進(jìn)化的原理，并且由兩個(gè)主要步驟組成：(i)以基因文庫(kù)形式在靶基因中產(chǎn)生遺傳多樣性，和(ii)就所需活性有效選擇或篩選那些文庫(kù)。定向進(jìn)化已用于改善酶的催化活性，用于改變底物特異性，用于增強(qiáng)熱穩(wěn)定性和用于加強(qiáng)重組系統(tǒng)中的表達(dá)。另外，這種方法用于生成對(duì)于各種配體具有顯著增強(qiáng)的親和力的蛋白質(zhì)。

實(shí)例1

DR3-ECD基因文庫(kù)的生成

DR3受體是跨膜蛋白質(zhì)，含有N末端信號(hào)肽，隨后為長(zhǎng)171個(gè)氨基酸(aa)的ECD(其中aa 35-141與腫瘤壞死因子受體1同源)、跨膜結(jié)構(gòu)域和含有死亡結(jié)構(gòu)域的細(xì)胞質(zhì)尾部(aa 343-419)。由171個(gè)殘基組成的受體的全長(zhǎng)ECD在DR3突變體文庫(kù)的生成中作為第一步進(jìn)行克隆。接下來(lái)，DR3ECD的多重序列比對(duì)用于生成聚焦回復(fù)共有區(qū)DR3文庫(kù)(圖2)。近年來(lái)，已開發(fā)幾種方法，以基于靶蛋白的結(jié)構(gòu)、功能和進(jìn)化生成小型和功能上富集的基因文庫(kù)。這些方法之一是通過(guò)殘基的靶向誘變，所述殘基來(lái)源于基因家族的共有序列，以生成回復(fù)共有區(qū)文庫(kù)。這種文庫(kù)方法顯示為增強(qiáng)靶蛋白的穩(wěn)定性和活性。

為了鑒定來(lái)源于DR3ECD中的家族共有區(qū)的靶殘基，比對(duì)12種哺乳動(dòng)物DR3序列。我們鑒定了來(lái)源于DR3家族共有區(qū)的13個(gè)不同位置(表1)。為了生成含有回復(fù)共有區(qū)突變的DR3基因文庫(kù)，我們采用新近開發(fā)的稱為ISOR(經(jīng)由基因重裝配摻入合成核苷酸)的方法，用于靶位置的部分誘變(Herman，A.&Tawfik，D.S.(2007).Protein Eng Des Sel 20，219-26)。這種方法是基因改組的修改，并且通過(guò)在基因裝配期間用含有所需突變的合成寡核苷酸摻料，允許特異性殘基的同時(shí)多樣化(圖2B)。在文庫(kù)生成后，6種隨機(jī)DR3文庫(kù)變體的測(cè)序指示3-8個(gè)回復(fù)共有區(qū)突變/基因的插入，具有～4個(gè)突變/基因的平均值。每種文庫(kù)變體攜帶突變殘基的隨機(jī)和不同子集(數(shù)據(jù)未示出)。

表1：DR3蛋白質(zhì)中的氨基酸殘基頻率。

^a氨基酸殘基位置根據(jù)人DR3蛋白質(zhì)序列顯示。

^b基于來(lái)自不同物種的12種同源DR3(ECD)蛋白質(zhì)的比對(duì)，同源DR3蛋白質(zhì)中的給定殘基頻率。

^c摻料到DR3(ECD)內(nèi)的氨基酸突變，以生成‘回復(fù)共有區(qū)’文庫(kù)(關(guān)于細(xì)節(jié)參見正文和材料與方法)

實(shí)例2

使用酵母表面展示的DR3文庫(kù)富集

酵母表面展示(YSD)是用于改造具有增加的親和力、特異性和穩(wěn)定性的蛋白質(zhì)的強(qiáng)大方法。YSD方法提供了對(duì)于大型突變體文庫(kù)的高流通量篩選超過(guò)其他方法的幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)。這種方法允許通過(guò)使用熒光激活細(xì)胞分選定量篩選大型文庫(kù)，從而允許“實(shí)時(shí)”分析文庫(kù)特征和選擇閾值的細(xì)調(diào)。YSD方法用于在酵母細(xì)胞表面上展示DR3，并且檢查其與TL1A的結(jié)合(圖3)。DR3的展示水平使用異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的抗體進(jìn)行監(jiān)測(cè)，所述抗體針對(duì)在蛋白質(zhì)的C末端處引入的myc標(biāo)簽。與TL1A的結(jié)合使用生物素化的α-DR3抗體進(jìn)行監(jiān)測(cè)，隨后與綴合至別藻藍(lán)蛋白(APC)的鏈霉抗生物素蛋白一起溫育。為了就具有對(duì)TL1A增強(qiáng)的展示水平和親和力的突變體富集文庫(kù)，展示DR3文庫(kù)的酵母細(xì)胞與TL1A一起溫育，并且分析超過(guò)5*10⁶個(gè)細(xì)胞，并且基于熒光表達(dá)和結(jié)合信號(hào)，通過(guò)熒光激活細(xì)胞分選(FACS)進(jìn)行分選。執(zhí)行三個(gè)迭代富集循環(huán)，導(dǎo)致群的平均熒光中的連續(xù)增加(圖3B)。

實(shí)例3

使用ELISA篩選富集的DR3文庫(kù)

為了鑒定對(duì)于TL1A具有增強(qiáng)的結(jié)合親和力的單一DR3突變體候選物，將FACS富集的文庫(kù)亞克隆到含有引導(dǎo)肽的哺乳動(dòng)物載體內(nèi)，并且與人IgG1Fc融合。先前顯示許多受體的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域是高度糖基化的，并且此類糖基化可顯著促成受體構(gòu)象和結(jié)合靶配體。因此，可溶性DR3受體的基于哺乳動(dòng)物的表達(dá)提供維持天然蛋白質(zhì)翻譯后修飾包括糖基化的優(yōu)點(diǎn)。為了獲得在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中高水平的DR3表達(dá)，將引導(dǎo)肽序列最佳化(圖4)，轉(zhuǎn)染和在HEK293F細(xì)胞中的表達(dá)條件(關(guān)于細(xì)節(jié)參見實(shí)驗(yàn)程序)。為了促進(jìn)相對(duì)大數(shù)目的DR3突變體的篩選，細(xì)胞在24板形式中進(jìn)行轉(zhuǎn)染，并且使用ELISA就TL1A相互作用檢查分泌的DR3。開發(fā)快速靈敏的ELISA，其基于在多孔板上固定TL1A且使用特異性抗體檢測(cè)DR3結(jié)合(圖5)。為了檢查用于檢測(cè)DR3-TL1A相互作用的動(dòng)態(tài)范圍，改變應(yīng)用于板的DR3濃度，并且發(fā)現(xiàn)測(cè)定是高度靈敏的，允許檢測(cè)大范圍的DR3濃度(圖5B)。使用這種測(cè)定，來(lái)自FACS富集文庫(kù)的～250種DR3突變體在HEK293F細(xì)胞中表達(dá)，并且篩選與TL1A的結(jié)合?？傊?，這種篩選努力允許分離7種候選突變體，其顯示出在篩選實(shí)驗(yàn)期間相對(duì)于WT DR3增加的結(jié)合(圖6)。

實(shí)例4

八種所選DR3突變體的表征

為了表征，將七種所選DR3突變體測(cè)序，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)且純化蛋白質(zhì)(關(guān)于突變列表，參見表2)。對(duì)于哺乳動(dòng)物表達(dá)和純化，將HEK293F細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，并且在七天后收集培養(yǎng)基。當(dāng)嘗試使用蛋白A親和層析純化DR3變體時(shí)，發(fā)現(xiàn)在來(lái)自蛋白A樹脂的洗脫步驟后DR3活性的顯著喪失。這種喪失是由于洗脫緩沖液的低pH。因此，開發(fā)用于獲得高度純的DR3蛋白質(zhì)的DR3變體的可替代純化方案。這種純化方案基于離子交換層析，隨后為疏水柱純化(關(guān)于細(xì)節(jié)參見實(shí)驗(yàn)程序)。

表2：所選DR3變體中的突變列表

接下來(lái)，使用表面等離振子共振表征不同DR3變體的TL1A結(jié)合親和力(表3)。WT DR3與TL1A的親和力為45nM，是與先前報(bào)告的TL1A結(jié)合親和力良好一致的值。有趣的是，具有SEQ ID NO：2的DR3變體顯示出相對(duì)于WT DR3增加5倍的TL1A結(jié)合親和力。具有SEQ ID NO：3的DR3變體顯示出相對(duì)于WT DR3增加6.6倍的TL1A結(jié)合親和力，具有SEQ ID NO：5的DR3變體顯示出相對(duì)于WT DR3增加1.7倍的TL1A結(jié)合親和力，并且具有SEQ ID NO：2的DR3變體顯示出相對(duì)于WT DR3增加4.6倍的TL1A結(jié)合親和力(表3)。

表3：如通過(guò)SPR測(cè)定的，TL1A細(xì)胞因子與DR3-Fc變體結(jié)合的動(dòng)力學(xué)速率常數(shù)

接下來(lái)，測(cè)試相對(duì)于DR3WT蛋白質(zhì)，所選DR3變體在不同溫度下與TL1A結(jié)合的能力。首先，與DR3WT相比較，發(fā)現(xiàn)包含SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4的DR3變體在37℃下的延長(zhǎng)溫育后顯示出更高的結(jié)合活性(圖7A)。接下來(lái)，發(fā)現(xiàn)包含SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：5的DR3變體與TL1A結(jié)合的能力在不同溫度下是穩(wěn)定的，而DR3WT與TL1A結(jié)合的能力下降(圖7B)。另外，在25℃下溫育后，與包含SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：5的DR3變體相比較，DR3WT與TL1A結(jié)合的能力更快速下降(圖7C)。DR3WT的結(jié)合活性在47℃下的35分鐘溫育后基本上下降，而包含SEQ ID NO：4的DR3變體顯示穩(wěn)定的結(jié)合活性(圖7D)。為了檢查經(jīng)改造的DR3突變體抑制TL1A與細(xì)胞中的內(nèi)源DR3受體結(jié)合的能力，我們建立基于細(xì)胞的測(cè)定。測(cè)定基于在與IL-12和IL-18結(jié)合的TL1A加入人CD4+細(xì)胞后測(cè)量IFN-γ分泌。先前，顯示TL1A與IL-12和IL-18合作，以在T細(xì)胞中誘導(dǎo)IFN-γ，并且IFN-γ分泌的程度在CD4+細(xì)胞中更高。此外，TL1A證實(shí)增強(qiáng)CD4+細(xì)胞中IL-12/IL-18依賴性的IFN-γ分泌(圖8)。

由于競(jìng)爭(zhēng)，可溶性DR3連同TL1A的添加阻止配體與內(nèi)源DR3受體結(jié)合，因此導(dǎo)致減少的IFN-γ分泌。我們發(fā)現(xiàn)高濃度DR3連同100ng/ml TL1A一起加入CD4+T細(xì)胞足以抑制TL1A誘導(dǎo)的IFN-γ分泌。檢查本發(fā)明的變體對(duì)人CD4+中TL1A誘導(dǎo)的IFN-γ分泌的作用。在包含SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4的DR3變體的存在下，TL1A誘導(dǎo)的IFN-γ分泌顯著下降。此外，高濃度DR3變體證實(shí)抑制IFN-γ的分泌(圖9A、B)。

雖然本發(fā)明已得到具體描述，但本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)了解可作出許多變化和修飾。因此，本發(fā)明不應(yīng)解釋為限制于具體描述的實(shí)施例，并且本發(fā)明的范圍和概念通過(guò)參考下文權(quán)利要求更容易得到理解。

實(shí)例5

體內(nèi)試驗(yàn)

腹腔TL1a和DR3注射

以范圍為0.5至20mg/kg的不同濃度的DR3WT以及包含SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4的變體或PBS注射到腹腔，在注射30分鐘后，將0.2mg/kg人TL1A或PBS注射到模型動(dòng)物(例如C57BL/6或Balb/c小鼠)的腹腔內(nèi)，在人TL1A注射后六小時(shí)，腹腔用1ml PBS進(jìn)行洗滌，并且通過(guò)ELISA分析IL-13和IL-5的水平。這種測(cè)定可如Yu X等人，2014，Mucosal Immunol；7(3)：730-40中所述執(zhí)行，所述參考文獻(xiàn)的內(nèi)容以引用的方式在此全文并入。

在另一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，0.2mg/kg人TL1A以及一系列20mg/kg-0.5mg/kg DR3WT或包含SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4的DR3變體或PBS混合在一起，并且將混合物注射到模型動(dòng)物的腹腔內(nèi)，在初始注射后六小時(shí)，腹腔用PBS進(jìn)行洗滌，并且通過(guò)ELISA分析IL-13和IL-5的水平。

過(guò)繼轉(zhuǎn)移模型

產(chǎn)生通過(guò)慢病毒轉(zhuǎn)染在誘導(dǎo)條件下過(guò)表達(dá)TL1A的人基因的干細(xì)胞。在一個(gè)例子中，這種測(cè)定可通過(guò)使用如Pan H等人，2008，J Immunol Methods.329(1-2)：31-44中所述的誘導(dǎo)系統(tǒng)來(lái)執(zhí)行，所述參考文獻(xiàn)的內(nèi)容以引用的方式在此全文并入。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)了解可使用本領(lǐng)域已知的其他誘導(dǎo)系統(tǒng)。例如，將500,000個(gè)CD45RDhi/人TL1A或CD45RDhi細(xì)胞注射到Rag1-/-小鼠的腹腔內(nèi)，并且在使處死的小鼠經(jīng)歷組織學(xué)分析之前，監(jiān)測(cè)疾病嚴(yán)重性共八周。

實(shí)驗(yàn)分析利用關(guān)于改變細(xì)胞效應(yīng)的評(píng)分系統(tǒng)。評(píng)分系統(tǒng)包括0至4的得分，代表關(guān)于下述中的變化的異常：體重(0，無(wú)重量減輕；1，1％至5％重量減輕；2，5％至10％重量減輕；3，10％至15％重量減輕；4，超過(guò)15％重量減輕)、大便稠度(0，堅(jiān)硬干燥大便；1，濕糞；2，柔軟粘連大便；3，稀便；4，液體大便)、使用Hemoccult II SENSA的糞便隱血試驗(yàn)(Beckman Coulter，Brea，CA；0，無(wú)色；1，藍(lán)色斑點(diǎn)；2，最多50％藍(lán)色；3，超過(guò)50％藍(lán)色；4，肉眼可見的紅色血液)，這三個(gè)標(biāo)準(zhǔn)總計(jì)為最終得分。另外，執(zhí)行結(jié)腸和小腸的肉眼可見炎癥以及十二指腸、空腸和回腸的定量組織學(xué)評(píng)分：A)炎癥：0，正常；1，輕度；2，中度；3，重度；B)隱藏?fù)p害：0，無(wú)一；1，基底三分之一損害；2，基底三分之二損害；3，超過(guò)三分之二損害；C)絨毛變化：0，正常；1，變形；2，分支；3，萎縮和變鈍。

在第二階段中，用500,000個(gè)CD45RDhi/hTL1a細(xì)胞注射的小鼠用在0.5mg/kg-20mg/kg范圍內(nèi)的PBS、DR3WT或本文公開的變體(例如SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4)進(jìn)一步注射到腹腔內(nèi)，一周兩次。小鼠就疾病嚴(yán)重性進(jìn)行評(píng)分，并且組織學(xué)得分如上文公開的進(jìn)行指定。

在轉(zhuǎn)基因小鼠中硫酸葡聚糖鈉(DSS)誘導(dǎo)的結(jié)腸炎

產(chǎn)生在CD11c的啟動(dòng)子或任何其他合適的啟動(dòng)子下過(guò)表達(dá)TL1A的人基因(hTL1a)的轉(zhuǎn)基因小鼠品系。在實(shí)驗(yàn)第1至5、8至12、15至19、以及22至26天時(shí)，轉(zhuǎn)基因小鼠用3％DSS(w/v)水進(jìn)行施用，以與Takedatsu等人2008，Gstroentrology，135(2)：552-567類似的方式?？商娲?，在轉(zhuǎn)基因小鼠不耐受3％DSS的情況下，將2％或1.5％DSS的劑量加入飲用水中。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析利用關(guān)于下述中的變化的異常的0至4評(píng)分系統(tǒng)：體重：重量(0，無(wú)重量減輕；1，1％至5％重量減輕；2，5％至10％重量減輕；3，10％至15％重量減輕；4，超過(guò)15％重量減輕)、大便稠度(0，堅(jiān)硬干燥大便；1，濕糞；2，柔軟粘連大便；3，稀便；4，液體大便)、使用Hemoccult II SENSA的糞便隱血試驗(yàn)(Beckman Coulter，Brea，CA；0，無(wú)色；1，藍(lán)色斑點(diǎn)；2，最多50％藍(lán)色；3，超過(guò)50％藍(lán)色；4，肉眼可見的紅色血液)，這三個(gè)標(biāo)準(zhǔn)總計(jì)為最終得分。另外，結(jié)腸和小腸的肉眼可見炎癥。正常腸形態(tài)的宏觀證據(jù)將指定得分0；無(wú)充血的輕度腸壁增厚指定得分1；具有充血的中度腸壁增厚指定得分2；具有僵化和充血的重度腸壁增厚指定得分3；并且具有僵化、充血和粘連的重度腸壁增厚指定得分4。執(zhí)行十二指腸、空腸和回腸的定量組織學(xué)評(píng)分：A)炎癥：0，正常；1，輕度；2，中度；3，重度；B)隱藏?fù)p害：0，無(wú)一；1，基底三分之一損害；2，基底三分之二損害；3，超過(guò)三分之二損害；C)絨毛變化：0，正常；1，變形；2，分支；3，萎縮和變鈍。

這些轉(zhuǎn)基因人TL1A小鼠通過(guò)以范圍為0.5至20mg/kg的各種濃度的PBS、DR3WT或DR3變體(例如SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4)的一周兩次腹膜內(nèi)注射進(jìn)行施用，一周兩次。在小鼠被處死且指定肉眼可見炎癥和組織學(xué)評(píng)分之前，它們就疾病嚴(yán)重性評(píng)分26天。

慢性硫酸葡聚糖鈉(DSS)模型

在實(shí)驗(yàn)第1至5、8至12、15至19、以及22至26天時(shí)，模型動(dòng)物(例如C57BL/6小鼠)用3％DSS(w/v)水進(jìn)行施用，以與Takedatsu等人2008，Gstroentrology，135(2)：552-567類似的方式。

關(guān)于下述中的變化的異常的0至4評(píng)分系統(tǒng)：體重：重量(0，無(wú)重量減輕；1，1％至5％重量減輕；2，5％至10％重量減輕；3，10％至15％重量減輕；4，超過(guò)15％重量減輕)、大便稠度(0，堅(jiān)硬干燥大便；1，濕糞；2，柔軟粘連大便；3，稀便；4，液體大便)、使用Hemoccult II SENSA的糞便隱血試驗(yàn)(Beckman Coulter，Brea，CA；0，無(wú)色；1，藍(lán)色斑點(diǎn)；2，最多50％藍(lán)色；3，超過(guò)50％藍(lán)色；4，肉眼可見的紅色血液)，這三個(gè)標(biāo)準(zhǔn)總計(jì)為最終得分。另外，結(jié)腸和小腸的肉眼可見炎癥。正常腸形態(tài)的宏觀證據(jù)將指定得分0；無(wú)充血的輕度腸壁增厚指定得分1；具有充血的中度腸壁增厚指定得分2；具有僵化和充血的重度腸壁增厚指定得分3；并且具有僵化、充血和粘連的重度腸壁增厚指定得分4。執(zhí)行十二指腸、空腸和回腸的定量組織學(xué)評(píng)分：A)炎癥：0，正常；1，輕度；2，中度；3，重度；B)隱藏?fù)p害：0，無(wú)一；1，基底三分之一損害；2，基底三分之二損害；3，超過(guò)三分之二損害；C)絨毛變化：0，正常；1，變形；2，分支；3，萎縮和變鈍。

DSS誘導(dǎo)的小鼠用以范圍為0.5至20mg/kg的各種濃度的PBS、DR3 WT或者具有SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4的DR3變體的一周兩次腹膜內(nèi)注射進(jìn)行施用，一周兩次。小鼠就疾病嚴(yán)重性評(píng)分26天。其后，將小鼠處死且指定肉眼可見炎癥和組織學(xué)評(píng)分。

急性結(jié)腸炎模型：2，4，6三硝基苯磺酸(TNBS)

實(shí)驗(yàn)室小鼠(例如C57BL/10)通過(guò)在50％乙醇的TNBS或僅50％乙醇的直腸內(nèi)施用進(jìn)行誘導(dǎo)，如Scheiffele F等人，2002，Curr Protoc Immunol.2002，第15章：Unit 15.19中所述。在第-1和0天時(shí)，小鼠用與DR3-Fc變體的腹膜內(nèi)(IP)注射組合的急性TNBS-結(jié)腸炎進(jìn)行誘導(dǎo)，如Meylan，F(xiàn)等人，2011，Mucosal Immunol；4(2)：172-85中先前描述的。

為了評(píng)價(jià)在抑制TNBS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎中的受體功效，將DR3WT、DR3變體和小鼠IgG(對(duì)照)以不同濃度(例如2.5、5、10和20mg/kg)注射到實(shí)驗(yàn)室小鼠(例如C57BL/10小鼠)的腹腔內(nèi)。為了測(cè)量針對(duì)重量減輕的保護(hù)水平和經(jīng)處理的小鼠相對(duì)于未經(jīng)處理的小鼠的死亡率，小鼠每天進(jìn)行稱重共五天，并且0至4的評(píng)分系統(tǒng)指定至關(guān)于下述中的變化的異常：體重：重量(0，無(wú)重量減輕；1，1％至5％重量減輕；2，5％至10％重量減輕；3，10％至15％重量減輕；4，超過(guò)15％重量減輕)、大便稠度(0，堅(jiān)硬干燥大便；1，濕糞；2，柔軟粘連大便；3，稀便；4，液體大便)。在五天后，小鼠被安樂(lè)死，并且收獲其結(jié)腸用于組織學(xué)分析。將從這些小鼠中分離的結(jié)腸樣品切片且用蘇木精和伊紅(H&E)染色，以鑒定嚴(yán)重炎癥的區(qū)域。每個(gè)切片根據(jù)炎癥的嚴(yán)重性以不知情方式進(jìn)行評(píng)分。