專利名稱：：Hiv－依賴型表現(xiàn)構筑體及其用途的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明之特征為包括可表現(xiàn)序列之核酸分子，其包含報導基因及治療基因，其表現(xiàn)系依賴HIVTat及Rev蛋白質之存在。其它特征為偵測HIV之方法、鑒別該可抑制HIV感染及/或基因表現(xiàn)之化合物之方法、殺死經(jīng)HIV感染之細胞之方法、以及治療經(jīng)HIV感染之對象之方法。
背景技術：
：由人類免疫缺陷病毒(HIV)感染造成之后天免疫不全癥(AIDS)為美國及世界各地之疾病及死亡之主要原因。由于內(nèi)生性或后天之抗性使得以現(xiàn)有藥物治療AIDS經(jīng)常失效。因為HIV感染之早期診斷為現(xiàn)存療法之成功關鍵，故發(fā)展出更敏感且更準確之HIV感染之診斷測試極為重要。于美國，自1981年起已報導688,000件以上之AIDS案例，且新感染案例之速度仍為無法接受高達每年40,000件。所有新感染之個體中半數(shù)為25歲以下者，且少數(shù)族群受到特別大的影響。全球，15至49歲之成人中每100人中約有1人感染HIV。1999年估計全球有5.6百萬新的HIV感染案例，每日約有15,000件感染案例。此等新感染案例中95％以上系于開發(fā)中國家。2003年，估計全球幾乎有40百萬人感染HIV(參見NIAID網(wǎng)站)。于AIDS之治療中發(fā)展有助于診斷HIV感染之方法，提供殺死經(jīng)HIV感染之細胞之手段，以及鑒別治療HIV之新的治療劑將極為重要。因此，于該領域中迫切需要此等方法。反轉錄病毒，例如HIV，系進行反轉錄作用以形成雙股DNA，然后與宿主之染色質(chromatin)整合。該經(jīng)整合之前病毒會轉錄出新的基因體及訊息RNA以產(chǎn)生病毒體。HIV于9千萬堿基(9-kilo-base)基因體中具有三種典型之反轉錄病毒基因，gag、pol、及env。該病毒基因體亦可編碼出6種輔助或調(diào)節(jié)基因。此非常多數(shù)之基因產(chǎn)物之表現(xiàn)系利用多重閱讀架(readingframe)及多重剪接位置(splicingsite)而達成。始于前病毒之轉錄作用系由于該DNA之5’端發(fā)現(xiàn)之末端長重復(LTR)，HIV激活子之活性來調(diào)節(jié)。該LTR具有多種細胞轉錄因子之結合位置，包含Spl、NFkB、AP-1、及NF-AT(Garcia，J.A.等人(1987)EMBOJ.63761-70；Kawakami，K等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA854700-4；Leonard，J.等人(1989)J.Virol.634919-24；Li，C.等人(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA887739-43；Nabel，G.及Baltimore，D.(1987)Nature326711-3[于Nature(1990)344(6262)178中出現(xiàn)公告之錯誤更正]；Ross，E.K.等人(1991)J.Virol.654350-8)。已知此等因子系負責T細胞活性，T細胞活化作用會促進病毒表現(xiàn)并不令人意外(Siekevitz，M.等人(1987)Science2381575-8[于Science(1988)239(4839)451中出現(xiàn)公告之錯誤更正]；Stevenson，M.等人(1990)EMBOJ.91551-60；Tong-Starksen，S.E.等人(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA846845-9)。缺乏未成熟終止作用時，前病毒之表現(xiàn)會造成單一「完整」RNA之產(chǎn)生。此未經(jīng)-剪接之轉錄物可作為數(shù)種HIV結構蛋白質(gag-pol基因)，以及該合并至新合成之HIV粒子之RNA基因體之訊息。然而，于正常之HIV感染中，有些事件系早于新基因體RNA之累積。通常為宿主及反轉錄病毒基因表現(xiàn)所共通，以各種蛋白質包含剪接酵素形成訊息之共轉錄結合作用，造成內(nèi)子(intron)之移除及將成熟訊息有效遞送至細胞質。該完整之HIV轉錄物亦包含各種剪接供給及接受位置。HIV之此特征允許于重迭基因(于DNA之相同片段內(nèi))中編碼出各種蛋白質，以及允許基因表現(xiàn)之暫時性分離。經(jīng)由改變使用及非-使用之剪接位置，由經(jīng)整合之DNA所產(chǎn)生之單一RNA具有近40種不同的轉錄物其總共可編碼9種不同的蛋白質(Purcell，D.F.及Martin，M.A.(1993)J.Virol.676365-78)。于經(jīng)感染之細胞中，所產(chǎn)生之最早的RNA經(jīng)由細胞剪接機制而完全地受到剪接。經(jīng)完全剪接之HIV轉錄物可編碼三種蛋白質負因子Nef、轉錄作用之反式活化子Tat、以及病毒基因表現(xiàn)之調(diào)控子Rev。此三種基因產(chǎn)物為調(diào)控性蛋白質其可影響細胞及病毒功能而造成有效之病毒復制，更具體地，此三種蛋白質可改變病毒之轉錄作用產(chǎn)量。Tat及Rev結合HIVRNA新轉錄之區(qū)域。Tat以共轉錄作用方式(與多種細胞蛋白質因子一起，包含RNA聚合II-修飾激)與5′莖環(huán)(stem-loop)結構TAR結合(Rana，T.M.及Jeang，K.T.(1999)Arch.Biochem.Biophys.365175-185)。Tat與該結合之蛋白質藉促進起始之轉錄活性之完成(持續(xù)性或抗-終止)發(fā)生作用。Rev蛋白質系負責將新感染之細胞中早期之HIV基因表現(xiàn)轉換為晚期之基因表現(xiàn)。Rev調(diào)節(jié)單一且未經(jīng)-剪接之訊息之細胞質遞送，因此其表現(xiàn)可協(xié)調(diào)占多數(shù)之Nef、Tat、及Rev(多重剪接之轉錄物的產(chǎn)物)轉換為表現(xiàn)單一且未剪接之HIV轉錄物，例如病毒體(virion)之結構蛋白質之轉錄物(Pollard，V.W.及Malim，M.H.(1998)Annu.Rev.Microbiol.52491-532)。此事件之發(fā)生系經(jīng)由Rev與未剪接或單一剪接之轉錄物及與負責將訊息自細胞核運送出來之細胞成分之物理性交互作用。供Rev結合之RNA區(qū)域，Rev-反應組件(RRE)，系位于env基因中HIVRNA之3’半段。Rev之多重復制份系組裝在RRE且Rev之不同區(qū)域與CRM1細胞核輸出蛋白質結合。此結合調(diào)節(jié)轉錄物運送至細胞質。細胞質中未與RNA結合之Rev可與輸入子-β(importin-β)結合而將Rev蛋白質運回細胞核中。Tat或Rev之存在系HIV感染之指針，以及該兩者HIV蛋白質可自經(jīng)整合之HIV前病毒影響表現(xiàn)作用。由于Tat可由LTR-驅動之基因增強表現(xiàn)作用，故經(jīng)常采用與報導基因偶合之LTR以證實HIV之存在，例如于HIV-指針細胞。此等細胞于報導子上游具有經(jīng)整合之LTR，該報導子例如β-半乳糖(Kimpton，J.及Emerman，M.(1992)J.Virol.662232-2239；Vodicka，M.A.等人(1997)Virology233193-198)、螢光素(luciferase)(Aguilar-Cordova，E.等人(1994)AIDSRes.Hum.Retroviruses10295-301)、氯霉素乙醯轉移(Ciminale，V.等人(1990)AIDSRes.Hum.Retroviruses61281-1287；Schwartz，S.等人(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA867200-7203)、或綠色螢光蛋白質(Gervaix，A.等人(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA944653-4658)。的確，于HIV及SIV(包含上述者)之NIHNIAIDResearchandReferenceReagentProgram中所列之所有指示方法系利用Tat表現(xiàn)之LTR敏感性。然而，Tat-依賴型指針細胞在許多方面不盡理想，包含HIVLTR對其他細胞因子具有反應性之事實。此會造成非所欲程度之背景值活化作用。因此，此領域中需要更專一之方法以測試HIV感染。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明系基于，至少部分系基于，發(fā)現(xiàn)新穎之DNA構筑體，本文中稱為「HIV-依賴型表現(xiàn)構筑體」、「HDEC」、或簡稱為「表現(xiàn)構筑體」核酸分子，其包括可表現(xiàn)之序列，其表現(xiàn)系依賴HIVTat與Rev蛋白質兩者之存在。HIVTat調(diào)控該可表現(xiàn)序列mRNA之轉錄作用。然而，因為該可表現(xiàn)序列系包含于，至少部分系包含于內(nèi)子中，除非Rev存在，其系藉由細胞剪接機制而剪接出來。因此，此新穎之表現(xiàn)構筑體可專一且敏感地偵測HIV感染及/或基因表現(xiàn)。其亦可用于可抑制HIV感染及/或基因表現(xiàn)之化合物之篩選試驗。其亦可經(jīng)由利用胞毒性可表現(xiàn)序列以用于殺死經(jīng)HIV感染之細胞。因此，一具體實施例中，本發(fā)明提供經(jīng)單離之核酸分子其包括激活子，其中該激活子之活性系依賴人類免疫缺乏病毒(HIV)Tat蛋白質(例如，HIV5’LTR)之存在；至少一個剪接供給位置(例如，HIVD1剪接供給位置)及至少一個剪接接受位置(例如，HIVA7剪接供給位置)；可表現(xiàn)序列，其非為野生型HIV序列，其中至少部分之報導子基因系位于剪接接受位置及剪接供給位置間之內(nèi)子中；以及人類免疫缺乏病毒(HIV)之Rev反應組件(RRE)。另一較佳具體實施例中，本發(fā)明之核酸分子進一步包括人類HIV3’LTR。一具體實施例中，該剪接接受位置系包含于RRE內(nèi)。另一具體實施例中，本發(fā)明之核酸分子進一步包括至少一第二剪接供給位置(例如，HIVD4剪接接受位置)以及至少一第二剪接接受位置(例如，HIVA5剪接接受位置)。又另一具體實施例中，本發(fā)明之核酸分子包括psi()位置，及/或核糖體內(nèi)入位置(IRES)。一具體實施例中，該可表現(xiàn)序列包括報導子基因，例如，編碼螢光蛋白質(綠色螢光蛋白質(GFP)、增強性綠色螢光蛋白質(EGFP)、紅色螢光蛋白質(RFP)、黃色螢光蛋白質(YFP)、增強性黃色螢光蛋白質(EYFP)、藍色螢光蛋白質(BFP)、或青綠色螢光蛋白質(CFP))之報導子基因。另一具體實施例中，該報導子基因編碼螢光素(例如，螢火蟲螢光素或水母螢光素)、β-半乳糖、胸激(TK)、或氯霉素乙醯轉移(CAT)。另一具體實施例中，該報導子基因包括治療基因(例如，胞毒性蛋白質)。于較佳之具體實施例中，本發(fā)明之經(jīng)單離之核酸分子包含SEQIDNO1、2、或3所述之核酸序列，或包含于以ATCC存取編號寄存之質體中之插入物，或其互補物(complement)。另一具體實施例中，本發(fā)明之經(jīng)單離之核酸分子包括與SEQIDNO1、2、或3之核酸序列，或與包含于以ATCC存取編號寄存之質體中之插入物具有至少約50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、98.5％、99％、99.25％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、或99.9％之相似性之核酸序列，其中該可表現(xiàn)序列之表現(xiàn)系依賴HIVTat及Rev蛋白質之存在。另一具體實施例中，本發(fā)明提供經(jīng)單離之核酸分子其包括本文所述之核酸分子之互補物(例如，完整之互補物)。另一具體實施例中，本發(fā)明提供含有本發(fā)明之核酸分子之載體(例如，質體及重組反轉錄病毒)及宿主細胞(例如，T細胞，或以ATCC存取編號＿＿寄存之宿主細胞)。又另一具體實施例中本發(fā)明提供一種測定樣本中是否存在HIV之方法，其包括將含有本發(fā)明之核酸分子之宿主細胞與樣本接觸；培養(yǎng)該細胞一段時間足以使HIV感染及基因表現(xiàn)；以及測定該可表現(xiàn)序列是否由該細胞表現(xiàn)，其中該可表現(xiàn)序列之表現(xiàn)系代表樣本中存在HIV。較佳之具體實施例中，該生物樣本系單離自對象(例如，人類對象)。又較佳之具體實施例中，該生物樣本系由生物液體樣本(例如，血液、血清、血漿、唾液、尿液、糞便、精液、陰道液、脊髓液、淋巴液、羊水、淚液、鼻腔分泌物、汗、乳汁、粘液、或組織液)、組織樣本(例如，淋巴結樣本、皮膚樣本、或絨毛膜樣本)、及細胞樣本(例如，血液細胞樣本如T細胞樣本)所組成之群組中選出者。又一具體實施例中，該樣本可經(jīng)純化。另一具體實施例中，本發(fā)明提供一種測定細胞是否感染HIV之方法，其包括將該細胞與含有本發(fā)明之核酸分子之反轉錄病毒接觸；培養(yǎng)該細胞一段時間足以使HIV基因表現(xiàn)；以及測定該可表現(xiàn)序列是否由該細胞表現(xiàn)，其中該可表現(xiàn)序列之表現(xiàn)系代表該細胞感染HIV。又另一具體實施例中，本發(fā)明提供一種測定對象(例如，人類對象)是否感染HIV之方法，其包括將該對象之細胞與含有本發(fā)明之核酸分子之反轉錄病毒接觸，以及測定該可表現(xiàn)序列是否由該細胞表現(xiàn)，其中該可表現(xiàn)序列之表現(xiàn)系代表感染HIV。又另一具體實施例中，本發(fā)明提供一種殺死經(jīng)HIV感染之細胞(例如，T細胞)之方法，其包括與含有本發(fā)明之核酸分子之反轉錄病毒接觸，其中該反轉錄病毒含有編碼出胞毒性蛋白質之可表現(xiàn)序列。較佳之具體實施例中，該細胞系包含于人類對象中。另一具體實施例中，本發(fā)明提供一種治療經(jīng)HIV感染之對象(例如，人類對象)之方法，其包括對該對象投予含有本發(fā)明之核酸分子之反轉錄病毒，其中該反轉錄病毒含有編碼出胞毒性蛋白質之可表現(xiàn)序列。另一具體實施例中，本發(fā)明提供一種鑒別可抑制HIV感染或基因表現(xiàn)之化合物之方法，其包括將含有本發(fā)明之核酸分子之宿主細胞與測試化合物接觸；將該細胞與HIV接觸；培養(yǎng)該細胞一段時間足以使HIV感染及基因表現(xiàn)；以及測定該可表現(xiàn)序列是否由該細胞表現(xiàn)，其中可抑制該可表現(xiàn)序列表現(xiàn)之化合物系鑒定為可抑制HIV感染或基因表現(xiàn)之化合物。又另一具體實施例中，本發(fā)明提供一種鑒別可抑制HIV感染或基因表現(xiàn)之化合物之方法，其包括將細胞與HIV接觸；將該細胞與含有本發(fā)明之核酸分子之反轉錄病毒接觸；將該細胞與測試化合物接觸；培養(yǎng)該細胞一段時間足以使HIV感染及基因表現(xiàn)；以及測定該可表現(xiàn)序列是否由該細胞表現(xiàn)，其中可抑制該可表現(xiàn)序列表現(xiàn)之化合物系鑒定為可抑制HIV感染或基因表現(xiàn)之化合物。又本發(fā)明之另一具體實施例中，本發(fā)明提供一種鑒別可抑制HIV感染或基因表現(xiàn)之化合物之方法，其包括將經(jīng)HIV感染之細胞與含有本發(fā)明之核酸分子之反轉錄病毒接觸；將該細胞與測試化合物接觸；培養(yǎng)該細胞一段時間足以使HIV感染及基因表現(xiàn)；以及測定該可表現(xiàn)序列是否由該細胞表現(xiàn)，其中可抑制該可表現(xiàn)序列表現(xiàn)之化合物系鑒定為可抑制HIV感染或基因表現(xiàn)之化合物。本發(fā)明之其它特征及優(yōu)點可藉由下列詳細說明及申請專利范圍而明了。第1圖說明SEQIDNO1之HIV-依賴型表現(xiàn)構筑體之核酸序列，其包含GFP報導基因及單一個剪接接受/剪接供給位置配對。第2圖說明SEQIDNO2之HIV-依賴型表現(xiàn)構筑體之核酸序列，其包含GFP報導基因及兩個剪接接受/剪接供給位置配對。第3A及3B圖說明SEQIDNO3之HIV-依賴型表現(xiàn)構筑體之核酸序列，其包含GFP報導基因、β-半乳糖報導基因、及兩個剪接接受/剪接供給位置配對。第4圖概要式說明示范性HIV-依賴型表現(xiàn)構筑體，其含有單一個剪接接受/剪接供給位置配對。其中標示出5’LTR、剪接供給位置(D1)、可表現(xiàn)序列(ORF)、Rev反應組件(RRE)、剪接接受位置(A7)、及3’LTR的相對位置。其亦顯示于Rev不存在(經(jīng)剪接)及存在(未經(jīng)剪接)時所得之mRNA轉錄物。第5圖概要式說明示范性HIV-依賴型表現(xiàn)構筑體，其含有兩個剪接接受/剪接供給位置配對。其中標示出5’LTR、剪接供給位置(D1及D4)、可表現(xiàn)序列(ORF)、Rev反應組件(RRE)、剪接接受位置(A4及A7)、及3’LTR的相對位置。其亦顯示于Rev不存在(經(jīng)剪接)及存在(未經(jīng)剪接)時所得之mRNA轉錄物。第6圖說明顯示RNA之凝膠，該RNA系萃取自經(jīng)感染HIV及感染含有SEQIDNO2之HIV-依賴型表現(xiàn)構筑體(HDEC)之反轉錄病毒之CEMT細胞。第1欄對照組(-HDEC，-HIV)；第2欄對照組(+HDEC，-HIV)；第3欄對照組(-HDEC，+HIV)；第4欄+HDEC，+HIV。第7圖說明在經(jīng)HIV感染(下圖)或未感染(上圖)時，經(jīng)含有SEQIDNO2之HIV-依賴型表現(xiàn)構筑體(HDEC)之反轉錄病毒感染之CEMT細胞的GFP螢光反應。第8圖說明于經(jīng)HIV感染亦經(jīng)SEQIDNO2之HIV-依賴型表現(xiàn)構筑體(HDEC)(與VSV糖蛋白一起包裝成慢病毒偽型)感染之細胞中，藉由流式細胞術偵測GFP-陽性之CEM細胞。上圖僅經(jīng)HDEC報導病毒感染之CEM細胞。中圖僅經(jīng)HIV感染之CEM細胞此處Nef基因系以鼠CD24取代。下圖經(jīng)HIV及HDEC報導病毒兩者感染之CEM細胞。具體實施例方式本發(fā)明系基于，至少部分系基于，發(fā)現(xiàn)新穎之DNA構筑體，本文中稱為「HIV-依賴型表現(xiàn)構筑體」、「HDEC」、或簡稱為「表現(xiàn)構筑體」核酸分子，其包括可表現(xiàn)之序列，其表現(xiàn)系依賴HIVTat與Rev蛋白質兩者之存在。HIVTat調(diào)控該可表現(xiàn)序列mRNA之轉錄作用。然而，因為該報導子系包含于，至少部分系包含于內(nèi)子中，除非Rev存在，其系藉由細胞剪接機制而剪接出來。因此，此新穎之表現(xiàn)構筑體可專一且敏感地偵測HIV感染及/或基因表現(xiàn)。其亦可用于可抑制HIV感染及/或基因表現(xiàn)之化合物之篩選試驗。其亦可經(jīng)由利用胞毒性可表現(xiàn)序列以用于殺死經(jīng)HIV感染之細胞。本發(fā)明之HIV-依賴型表現(xiàn)構筑體包括可表現(xiàn)序列，其表現(xiàn)系受控于(亦即，操作性連接至)HIV-依賴型激活子，例如，HIV5’LTR。該構筑體進一步包含至少一個剪接接受-供給位置配對以及Rev反應組件(RRE)。當該HIV-依賴型表現(xiàn)構筑體引入至細胞時，若Rev不存在，自可表現(xiàn)序列轉錄出之任何mRNA將剪接出來。然而，當Rev存在時(例如，當該細胞感染HIV時)，其會經(jīng)由RRE作用以防止該可表現(xiàn)序列之剪接。然后藉由直接偵測該mRNA或經(jīng)編碼之蛋白質，或者藉由偵測該經(jīng)編碼之蛋白質之活性，而偵測該可表現(xiàn)序列。第4及5圖顯示本發(fā)明之HIV-依賴型表現(xiàn)構筑體之兩種非-限制示范性具體實施例之概要圖。該構筑體之兩端等同于線形HIV基因體之末端。中心區(qū)域系由可表現(xiàn)序列組成。該構筑體整合至宿主細胞基因體后此可表現(xiàn)序列之表現(xiàn)作用系依賴另一來源(例如，感染之HIV)之Tat及Rev的表現(xiàn)。如本文所使用，「可表現(xiàn)序列」，包含任何核酸序列，較佳為DNA序列，當經(jīng)操作性連接至激活子時，可進行轉錄而產(chǎn)生互補RNA。如本文所述，較佳之具體實施例中，可表現(xiàn)序列為報導子基因及/或治療基因。某些具體實施例中，本發(fā)明之HIV-依賴型表現(xiàn)載體可包括可表現(xiàn)序列，其本身具有多個報導子及/或治療基因，該報導子及/或治療基因間可彼此連接，或由該構筑體中之其它核酸序列分隔。如本文所使用，「操作性連接」系指該可表現(xiàn)序列系連接至該激活子，某種程度上其可使該可表現(xiàn)序列表現(xiàn)(例如，試管內(nèi)轉錄作用/轉譯系統(tǒng)或于宿主細胞內(nèi))。此外，如本文所述，「操作性連接」欲包含該HIV-依賴型表現(xiàn)構筑體之各種組件的連接順序，使該HIV-依賴型表現(xiàn)構筑體根據(jù)其預期之功能進行，如本文所述。如本文所使用，「報導子」或「報導子基因」系指當操作性連接至激活子(例如，HIV-驅動之激活子如HIV5’LTR)后可轉錄成mRNA之核酸分子，但本文所使用之「報導基因」不包含野生型HIV序列。較佳之報導子基因包含螢光素(例如，螢火蟲螢光素或水母螢光素)、β-半乳糖、氯霉素乙醯轉移(CAT)、胸激(TK)、及螢光蛋白質(綠色螢光蛋白質、紅色螢光蛋白質、黃色螢光蛋白質、藍色螢光蛋白質、青綠色螢光蛋白質、或其變異物，包含增強性變異物)。只要其可藉由報導子基因分析試驗予以偵測，任何報導核酸序列皆可作為報導子基因。報導子基因分析試驗包含任何已知之直接或間接偵測核酸序列或其編碼之蛋白質產(chǎn)物之方法。例如，報導子基因分析試驗可藉由測量報導子mRNA之程度、報導子蛋白質之程度、或報導子蛋白質之活性量而測量報導子基因之表現(xiàn)或活性的程度?？蓽y量報導子mRNA之程度，例如，利用溴化乙錠(ethidiumbromide)將標準之RNA凝膠染色、RNA雜交印跡法、引物延伸、或核酸保護試驗。可測量報導子蛋白質之程度，例如，利用考馬斯(Coomassie)將SDS-PAGE凝膠染色、蛋白印跡法、點式墨點法、狹線墨點法、ELISA、或RIA。可利用對所使用之報導子具有專一性之試驗以測量報導子蛋白質之活性。例如，螢光素、CAT、β-半乳糖、胸激(TK)試驗(包含全身掃描；參見Yu，Y.等人(2000)NatureMedicine6933-937以及Blasberg，R.(2002)J.Cereb.BloodFlowMetab.221157-1164)之標準試驗，及螢光蛋白質皆為此技藝中已知者。亦應了解「報導子基因」及「報導子」系包含治療基因，包含胞毒性蛋白質。如本文所使用，「治療基因」或「治療性蛋白質」包含任何基因或蛋白質(例如，勝肽或多肽)，當其于細胞中表現(xiàn)時，對該細胞之功能具有影響。較佳之具體實施例中，治療性蛋白質為對細胞有毒(亦即，胞毒性)之蛋白質。較佳之胞毒性蛋白質包含，但非限于蓖麻毒素(ricin)、商陸毒素(pokeweedtoxin)、白喉毒素A(diphtheriatoxinA)、肥皂草毒素(saporin)、白樹素(gelonin)、假單胞菌外毒素A(PesudomonasexotoxinA)。治療基因亦包含可編碼反義RNA(例如，其可用于使細胞中之其它mRNA失活)及酵素性RNA(如核糖)之核酸序列。治療基因進一步包含核糖體-失活性蛋白質(Peumans，W.J.等人(2001)FasebJ.151493-1506)。如本文所使用，「激活子」通常系指基因體DNA之一區(qū)，經(jīng)常發(fā)現(xiàn)于mRNA轉錄起始位置之5’端。激活子系涉及調(diào)控mRNA轉錄之時間及程度且包含，例如，細胞蛋白質(例如RNA聚合及其它轉錄因子)之結合位置。關于激活子之進一步說明可參見，例如，Goeddel(1990)MethodsEnzymol.1853-7。本發(fā)明之HIV-依賴型表現(xiàn)構筑體中所使用之激活子較佳系依據(jù)存在之HIVTat蛋白質。本發(fā)明之構筑體中所使用之較佳激活子為HIV5’LTR。一具體實施例中，該激活子包含完整之HIV5’LTR。另一具體實施例中，該激活子包含HIV5’LTR之片段。為對HIVTat蛋白質反應，此片段必須至少包含為起始mRNA轉錄作用所需之最短序列。參見，Wu.Y.及Marsh，J.W.(2003)MicrobesandInfection51023-1027；Pereira，L.A.等人(2000)NucleicAcids.Res.28663-668。此外，若欲將該HIV-依賴型表現(xiàn)載體包含于重組之反轉錄病毒中，該5’及3’LTR為反轉錄作用(形成DNA)、整合作用(與HIV整合合作)、以及經(jīng)整合之DNA的轉錄作用、與產(chǎn)生報導子基因所需。與5’-LTR相鄰之基因體區(qū)域(稱為psi()位置)為使該載體與重組之反轉錄病毒合并所需者。剪接位置(供給者及接受者)為移除(及沉默)該可表現(xiàn)序列所需。Rev可防止該剪接作用，因而促進該開放閱讀架之表現(xiàn)。該單一-剪接之構筑體為Rev-依賴型載體中最低之位置數(shù)。二-剪接之構筑體與形成Nef轉錄物之位置相似。雙剪接之Nef轉錄物為HIV感染中之主要訊息，因此HIV利用人類細胞中有利之剪接位置。Rev反應組件(RRE)為Rev結合及作用所需。為了可感染該目標細胞且整合至該細胞中，該載體需合并至重組之反轉錄病毒中。為了使此事件發(fā)生必須提供許多反式組件之病毒蛋白質以完成可單一感染循環(huán)之感染性粒子。先前已詳述為構筑似HIV粒子之系統(tǒng)。因此，較佳之具體實施例中，本發(fā)明提供經(jīng)單離之核酸分子，其包括激活子，其中該激活子之活性系依賴人類免疫缺乏病毒(HIV)Tat蛋白質(例如，HIV5’LTR)之存在；至少一個剪接供給位置(例如，HIVD1剪接供給位置)及至少一個剪接接受位置(例如，HIVA7剪接供給位置)；可表現(xiàn)序列，其非為野生型HIV序列，其中至少部分之可表現(xiàn)序列系位于剪接接受位置及剪接供給位置間之內(nèi)子中；以及人類免疫缺乏病毒(HIV)之Rev反應組件(RRE)。另一較佳具體實施例中，本發(fā)明之核酸分子進一步包括人類HIV3’LTR。一具體實施例中，該剪接接受位置系包含于RRE內(nèi)。一具體實施例中，本發(fā)明之經(jīng)單離之核酸分子包括SEQIDNO1所示(第1圖)之核酸序列。此核酸分子包括GFP報導子基因其左右兩邊為單一個剪接供給位置及單一個剪接接受位置，以及HIV5’及3’LTR。該剪接接受位置系包含于Rev反應組件中。SEQIDNO1之核酸1至634包括HIV5’LTR。SEQIDNO1之核酸686至823包括基因體RNA包裝訊號。SEQIDNO1之核酸743至744包括剪接供給位置。SEQIDNO1之核酸1143至1191包括多重選殖位置。SEQIDNO1之核酸1299至1873包括IRES。SEQIDNO1之核酸1883至2559包括可編碼綠色螢光蛋白質(GFP)之開放閱讀架。SEQIDNO1之核酸2638至3495包括HIVRRE。SEQIDNO1之核酸3394至3395包括剪接接受位置。SEQIDNO1之核酸3784至4418包括HIV3’LTR。另一具體實施例中，本發(fā)明之經(jīng)單離之核酸分子包括SEQIDNO2所示(第2圖)之核酸序列。此核酸分子包括GFP報導子基因，以及兩個剪接供給位置及兩個剪接接受位置，以及HIV5’及3’LTR。其中一個剪接接受位置系包含于Rev反應組件中。SEQIDNO2之核酸1至634包括HIV5’LTR。SEQIDNO2之核酸686至823包括基因體RNA包裝訊號。SEQIDNO2之核酸743至744包括剪接供給位置。SEQIDNO2之核酸1164至1165包括剪接接受位置。SEQIDNO2之核酸1233至1234包括剪接供給位置。SEQIDNO2之核酸1292至1327包括多重選殖位置。SEQIDNO2之核酸1435至2009包括IRES。SEQIDNO2之核酸2019至2735包括可編碼綠色螢光蛋白質(GFP)之開放閱讀架。SEQIDNO2之核酸2774至3631包括HIVRRE。SEQIDNO2之核酸3530至3531包括剪接接受位置。SEQIDNO2之核酸3921至4554包括HIV3’LTR。又另一具體實施例中，本發(fā)明之經(jīng)單離之核酸分子包括SEQIDNO3所示(第3A及3B圖)之核酸序列。此核酸分子包括GFP報導子基因與β-半乳糖報導子基因，以及兩個剪接供給位置及兩個剪接接受位置以及HIV5’及3’LTR。其中一個剪接接受位置系包含于Rev反應組件中。SEQIDNO3之核酸1至634包括HIV5’LTR。SEQIDNO3之核酸686至823包括基因體RNA包裝訊號。SEQIDNO3之核酸1至634包括HIV5’LTR。SEQIDNO3之核酸686至823包括基因體RNA包裝訊號。SEQIDNO3之核酸743至744包括剪接供給位置。SEQIDNO3之核酸1164至1165包括剪接接受位置。SEQIDNO3之核酸1233至1234包括剪接供給位置。SEQIDNO3之核酸1314至4463包括可編碼β-半乳糖(lacZ)之開放閱讀架。SEQIDNO3之核酸4600至5174包括IRES。SEQIDNO3之核酸5184至5900包括可編碼綠色螢光蛋白質(GFP)之開放閱讀架。SEQIDNO3之核酸5939至6796包括HIVRRE。SEQIDNO3之核酸6695至6696包括剪接接受位置。SEQIDNO3之核酸7086至7719包括HIV3’LTR。具有SEQIDNO1(核酸1至4418)之核酸序列之質體系寄存于NIHAIDSResearchandReferenceReagentProgram，McKessonBioServicesCorporation，621LofstrandLane，Rockville，MD20850，于＿＿，及其指定之編號為＿＿。具有SEQIDNO1(核酸1至4418)之核酸序列之宿主細胞系寄存于NIHAIDSResearchandReferenceReagentProgram，McKessonBioServicesCorporation，621LofstrandLane，Rockville，MD20850，于＿＿，及其指定之編號為＿＿。具有SEQIDNO1(核酸1至4418)之核酸序列之質體系寄存于美國菌種中心(AmericanTypeCultureCollection，ATCC)，10801UniversityBoulevard，Manassas，Va.20110-2209，于＿＿，及其指定之編號為＿＿。具有SEQIDNO1(核酸1至4418)之核酸序列之宿主細胞系寄存于美國菌種中心(ATCC)，10801UniversityBoulevard，Manassas，Va.20110-2209，于＿＿，及其指定之編號為＿＿。具有SEQIDNO2(核酸1至4554)之核酸序列之質體系寄存于NIHAIDSResearchandReferenceReagentProgram，McKessonBioServicesCorporation，621LofstrandLane，Rockville，MD20850，于＿＿，及其指定之編號為＿＿。具有SEQIDNO2(核酸1至4554)之核酸序列之宿主細胞系寄存于NIHAIDSResearchandReferenceReagentProgram，McKessonBioServicesCorporation，621LofstrandLane，Rockville，MD20850，于＿＿，及其指定之編號為＿＿。具有SEQIDNO2(核酸1至4554)之核酸序列之質體系寄存于美國菌種中心(ATCC)，10801UniversityBoulevard，Manassas，Va.20110-2209，于＿＿，及其指定之編號為＿＿。具有SEQIDNO2(核酸1至4554)之核酸序列之宿主細胞系寄存于美國菌種中心(ATCC)，10801UniversityBoulevard，Manassas，Va.20110-2209，于＿＿，及其指定之編號為＿＿。具有SEQIDNO3(核酸1至7719)之核酸序列之質體系寄存于NIHAIDSResearchandReferenceReagentProgram，McKessonBioServicesCorporation，621LofstrandLane，Rockville，MD20850，于＿＿，及其指定之編號為＿＿。具有SEQIDNO3(核酸1至7719)之核酸序列之宿主細胞系寄存于NIHAIDSResearchandReferenceReagentProgram，McKessonBioServicesCorporation，621LofstrandLane，Rockville，MD20850，于＿＿，及其指定之編號為＿＿。具有SEQIDNO3(核酸1至7719)之核酸序列之質體系寄存于美國菌種中心(ATCC)，10801UniversityBoulevard，Manassas，Va.20110-2209，于＿＿，及其指定之編號為＿＿。具有SEQIDNO3(核酸1至7719)之核酸序列之宿主細胞系寄存于美國菌種中心(ATCC)，10801UniversityBoulevard，Manassas，Va.20110-2209，于＿＿，及其指定之編號為＿＿。依據(jù)布達佩斯條約上述提及之寄存物將保存于國際認可之微生物寄存機構以符合專利程序。此等寄存物僅為熟于此技藝者之方便而制作而基于35U.S.C.§112并不認為需要寄存。I.經(jīng)單離之核酸分子本發(fā)明之一方面系關于經(jīng)單離之核酸分子，其包括HIV-依賴型表現(xiàn)構筑體。如本文所使用，「核酸分子」一般系包含DNA分子(例如，cDNA或基因體DNA)以及RNA分子(例如，mRNA)及利用核酸類似物產(chǎn)生之DNA或RNA類似物。該核酸分子可為單股或雙股，但較佳為雙股DNA。通常，本發(fā)明之最佳實施方式可藉由利用經(jīng)認可之操作方式達成。例如，單離mRNA之技術、制造及篩選cDNA數(shù)據(jù)庫之方法、純化及分析核酸、制造重組載體DNA之方法、以限制酵素切割DNA、接合DNA、藉由穩(wěn)定及瞬間方式將DNA引入至宿主細胞、培養(yǎng)該宿主細胞、單離及純化多肽與制造抗體之方法皆為此領域中已知者。一般可參見Sambrook等人，MolecularCloning(2ded.1989)，及Ausubel等人，CurrentProtocolsinMolecularBiology，(1989)JohnWiley&Sons，NewYork.「經(jīng)單離之核酸分子」包含自其它存在于核酸自然來源之核酸分子分離出之核酸分子。例如，關于基因體DNA，「經(jīng)單離」包含自病毒DNA或染色體(其通常與天然之基因體DNA有關)分離之核酸分子。較佳地，「經(jīng)單離」之核酸并無于自然情況下取得該核酸之有機體的基因體DNA中位于該核酸(亦即，序列位于該核酸之5’及3’端)兩側之序列。例如，各種具體實施例中，經(jīng)單離之HIV-依賴型表現(xiàn)構筑體核酸分子可包含小于約5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb或0.1kb之核酸序列，該核酸序列系于自然情況下取得該核酸之HIV病毒基因體DNA中位于該核酸分子兩側之序列。再者，「經(jīng)單離」之核酸分子當由重組技術產(chǎn)生時，其實質上無其它細胞物質或培養(yǎng)基，或者當由化學合成時，其實質上無化學前驅物或其它化學物。本發(fā)明之核酸分子，例如，具有SEQIDNO1、2、或3，或其部分之核酸分子，可利用標準分子生物技術及本文提供之序列信息加以構筑而得。再者，具有完整或部分SEQIDNO1、2、或3之核酸分子可藉由使用針對SEQIDNO1、2、或3序列所設計之合成的寡核酸引子以聚合鏈反應(PCR)單離出來。本發(fā)明之核酸可利用cDNA、mRNA或者，基因體DNA作為模板以及適當之寡核酸引子根據(jù)標準PCR增幅技術予以增幅。所增幅之核酸可選殖至適當載體且以DNA定序分析找出其特征。再者，相應于HIV-依賴型表現(xiàn)構筑體核酸序列之寡核酸可由標準合成技術，例如，利用自動化DNA合成儀而制備。又另一具體實施例中，本發(fā)明之經(jīng)單離之核酸分子包括核酸分子，其為SEQIDNO1、2、或3所示之核酸序列的互補物。與SEQIDNO1、2、或3所示之核酸序列互補之核酸分子為可充分地與SEQIDNO1、2、或3所示之核酸序列互補者，因此其可與SEQIDNO1、2、或3所示之核酸序列雜交，而形成穩(wěn)定之雙鏈?！富パa」等系指核酸或核酸間，例如，雙股DNA分子的兩股間或寡核酸引子與欲定序或增幅之單股核酸中之引子結合位置間之雜交作用或堿基配對。一般互補核酸為A與T(或A與U)，或C與G。當一股核酸與另一股核酸進行比對及比較，可具有適當之核酸插入或刪除，而產(chǎn)生最理想之配對時，至少約95％之核酸與另一股配對，通常至少約98％，以及更佳為自約99至約100％，可稱該兩單股RNA或DNA分子實質上互補?；パa之聚核酸序列可由各種方法，包含利用已知之計算機演算及軟件，予以鑒別。又另一具體實施例中，本發(fā)明之經(jīng)單離之核酸分子包括核酸序列，其與SEQIDNO1、2、或3所示之核酸序列(例如，完整長度之核酸序列)，或此等核酸序列之部分或互補物具有至少約50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或以上之相似性。一具體實施例中，本發(fā)明之核酸分子包括核酸序列，該序列包括部分或完整之SEQIDNO1或2，或其互補物，且其長度至少為(或不大于)25、30、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200、1250、1300、1350、1400、1250、1300、1350、1400、1450、1500、1550、1600、1650、1700、1750、1800、1850、1900、1950、1994、2000、2050、2073、2100、2150、2200、2250、2300、2350、2400、2450、2500、2550、2600、2650、2700、2750、2800、2850、2900、2950、3000、3050、3100、3150、3200、3250、3300、3350、3400、3441、3450、3500、3550、3600、3650、3700、3750、3800、3841、3850、3900、3950、4000、4050、4100、4150、4200、4250、4300、4350、4400、4450、4500、4550、4600、4650、4700、4750、4800、4850、4900、5000、5050、5100、5150、5200、5250、5300、5350、5400、5450、5500、5550、5600、5650、5700、5750、5800、5850、5900、6000、6050、6100、6150、6200、6250、6300、6350、6400、6450、6500、6550、6600、6650、6700、6750、6800、6850、6900、6950、7000、7050、7100、7150、7200、7250、7300、7350、7400、7450、7500、7550、7600、7650、7700或以上之核酸(例如連續(xù)核酸)。為決定兩核酸或胺基酸序列之相似性百分比，將序列以最理想之比較目的進行比對(例如，于第一及第二胺基酸或核酸序列之一或兩者中引入缺口(gap)以達最理想之比對以及為了比較之目的可忽略非-同源序列)。較佳之具體實施例中，為比較之目的而比對之參考序列的長度為該參考序列之長度的至少30％，較佳為至少40％，更佳為至少50％，甚至更佳為至少60％，以及甚至更佳為至少70％、80％、或90％(例如，將第二序列與具有100個核酸之核酸序列比對時，至少有30個，較佳為至少40個，更佳為至少50個，甚至更佳為至少60個，以及甚至更佳為至少70、80、或90個核酸比對)。然后于相對應之胺基酸位置或核酸位置比較該胺基酸殘基或核酸。當?shù)谝恍蛄兄兄骋晃恢玫陌坊釟埢蚝怂崤c第二序列中相對應位置者相同，則該分子于該位置完全相同(如本文所使用，胺基酸或核酸之「相似性」等同于胺基酸或核酸之「同源性」)。兩序列間之相似性百分比為該序列共有之相同位置之函數(shù)，其涉及計算為達兩序列最理想之比對所需引入之缺口數(shù)，及各缺口之長度。利用數(shù)學算法可完成兩序列間之比對且決定相似性百分比。較佳之具體實施例中，兩胺基酸序列間之相似性百分比系利用Needleman及Wunsch(J.Mol.Biol.(48)444-453(1970))算法其已合并于GCG軟件套件(于網(wǎng)絡上可經(jīng)由GeneticsComputerGroup而得)中之GAP程序，利用Blossum62矩陣或PAM250矩陣，以及缺口比重(gapweight)16、14、12、10、8、6、或4以及長度比重(lengthwright)1、2、3、4、5、或6決定。又另一較佳具體實施例中，兩核酸序列間之相似性百分比系利用GCG軟件套件(于網(wǎng)絡上可經(jīng)由GeneticsComputerGroup而得)中之GAP程序，利用NWSgapdna.CMP矩陣以及缺口比重40、50、60、70或80以及長度比重1、2、3、4、5、或6決定。欲與GAP程序一起使用之參數(shù)的較佳非-限制實例包含Blossum62記分矩陣，其缺口罰分(gappenalty)為12、缺口延長罰分為4、及閱讀架移動缺口罰分為5。另一具體實施例中，兩胺基酸或核酸序列間之相似性百分比系利用Meyers及Miller算法(Comput.Appl.Biosci.411-17(1988))其已合并于ALIGN程序(2.0版或2.0U版)，利用PAM120比重殘基表(PAM120weightresiduetable)，缺口長度罰分為12以及缺口罰分為4決定。本發(fā)明之核酸分子可僅包括SEQIDNO1、2、或3之部分核酸序列，例如，可作為探針或引子之片段或可編碼部分HIV-依賴型表現(xiàn)構筑體之片段。該探針/引子(例如寡核酸)典型地包括實質上純之寡核酸。該寡核酸典型地包括一段核酸序列其于嚴格條件下可與SEQIDNO1、2、或3，或其互補物之至少約12或15個，較佳約20或25個，更佳約30、35、40、45、50、55、60、65、或75個連續(xù)的核酸雜交。示范性之探針或引子之核酸長度至少為(或不大于)12或15，20或25，30、35、40、45、50、55、60、65、70、75或以上以及/或包括本文所述之經(jīng)單離之核酸分子之連續(xù)的核酸。具有本文所述之經(jīng)單離之核酸分子之相連或連續(xù)核酸之探針或引子亦包含于本發(fā)明之范疇中，但該探針或引子序列中可具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個堿基之差異。根據(jù)該HIV-依賴型表現(xiàn)構筑體核酸序列之探針可用于偵測(例如，專一性偵測)基因體序列。較佳之具體實施例中，該探針進一步包括附接于其上之標記基團，例如，該標記基團可為放射性同位素、螢光化合物、酵素、或酵素輔-因子。另一具體實施例中系提供一組引子，例如，適用于PCR之引子，其可用于增幅HIV-依賴型表現(xiàn)構筑體序列中之選定的區(qū)域，例如，域(domain)、區(qū)域、位置或其它本文所述之序列。該引子之長度至少為5、10、或50個堿基對且少于100、或少于200個堿基對。當與本文所揭示之序列或與自然產(chǎn)生之變異物相比時，該引子應與其相同，或小于1、2、3、4、5、6、7、8、9或10的堿基之差異。此等探針可作為用于鑒別細胞或組織是否含有表現(xiàn)構筑體，或是否表現(xiàn)該可表現(xiàn)序列之測試套組的一部分。另一具體實施例中，本發(fā)明之核酸分子可包括本文所揭示之序列組件的變異物。核酸變異物(例如，5’或3’LTR、RRE、及/或剪接接受位置變異物)可自然產(chǎn)生，例如等位基因(allelic)變異物(相同位置(locus))、同源物(不同位置)、及異種物(orthologue)(不同有機體，例如小鼠)，或為非-自然產(chǎn)生。非-自然產(chǎn)生之變異物可經(jīng)由突變技術，包含應用于聚核酸、細胞、或有機體者，予以制造。該變異物可包含核酸之取代、刪除、倒置及插入。等位基因變異物系由，例如，族群(例如，HIV族群)中之DNA序列多態(tài)性所產(chǎn)生。對應于本發(fā)明之HIV-依賴型表現(xiàn)構筑體之獨立組件之自然等位基因變異物及同源物之核酸分子，可根據(jù)其與本文所揭示之HIV-依賴型表現(xiàn)構筑體核酸的同源性，利用本文所揭示之核酸序列或其部分，作為雜交探針且依照標準雜交技術于嚴格之雜交條件下予以單離。如本文所使用，「于嚴格之條件下雜交」，系說明雜交作用及于該彼此顯著相同或同源之核酸序列仍彼此雜交時進行洗滌之條件。較佳地，該條件為彼此間至少為約70％，更佳為至少約80％，甚至更佳為至少約85％或90％相似性之序列仍彼此雜交之條件。此嚴格之條件為熟于此技藝者所知悉且可參見CurrentProtocolsinMolecularBiology，Ausubel等人，eds.，JohnWiley&Sons，Inc.(1995)，第2、4、及6節(jié)。其它嚴格之條件可參見MolecularCloningALaboratoryManual，Sambrook等人，ColdSpringHarborPress，ColdSpringHarbor，N.Y.(1989)，第7、9、及11章。嚴格的雜交條件之較佳、非-限制實例包含于4X氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)，約65至70℃下(或于4XSSC加50％甲醯胺于約42至50℃下)接著于約65至70℃下以1XSSC洗滌一次或多次之雜交作用。極嚴格的雜交條件之較佳、非-限制實例包含于1XSSC，約65至70℃下(或于1XSSC加50％甲醯胺于約42至50℃下)接著于約65至70℃下以0.3XSSC洗滌一次或多次之雜交作用。較不嚴格的雜交條件之較佳、非-限制實例包含于4XSSC，約50至60℃下(或于6XSSC加50％甲醯胺于約40至45℃下)接著于約50至60℃下以2XSSC洗滌一次或多次之雜交作用。上述數(shù)值之中間范圍，例如，于65至70℃或于42至50℃亦欲包含于本發(fā)明。于雜交作用及洗滌緩沖液中SSPE(1XSSPE為0.15MNaCl，10mMNaH2PO4，及1.25mMEDTA，pH7.4)可取代SSC(1XSSC為0.15MNaCl及15mM檸檬酸鈉)；各雜交作用完成后進行15分鐘之洗滌。預期長度小于50個堿基對之雜交物的雜交作用溫度應比該雜交物之熔解溫度(Tm)低5至10℃，此處Tm系根據(jù)下列方程式?jīng)Q定。雜交物之長度小于18個堿基對時，Tm(℃)＝2(A+T堿基數(shù))+4(G+C堿基數(shù))。雜交物之長度為18至49個堿基對時，Tm(℃)＝81.5+16.6(log10[Na+])+0.41(％G+C)-(600/N)，此處N為該雜交中之堿基數(shù)，以及為[Na+]雜交作用緩沖液中之鈉離子濃度(1XSSC之[Na+]＝0.165M)。熟于此技藝者亦了解可于雜交作用及/或洗滌緩沖液中添加其它試劑以降低核酸分子對膜(例如，硝化纖維或尼龍膜)之非-專一性雜交作用，其包含但非限于阻斷劑(例如，BSA或鮭魚或鯡魚精子載體DNA)、界面活性劑(例如，SDS)、螯合劑(例如，EDTA)、聚蔗糖(Ficoll)、PVP等。尤其，使用尼龍膜時，該嚴格的雜交作用條件之另一較佳、非-限制實例為于0.25至0.5MNaH2PO4，7％SDS于約65℃下，接著于約65℃下以0.02MNaH2PO4，1％SDS洗滌一次或多次之雜交作用(參見，例如，Church及Gilbert(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA811991-1995)，或可使用0.2XSSC，1％SDS。除了族群中可能存在之自然產(chǎn)生之HIV-依賴型表現(xiàn)構筑體序列組件之等位基因變異物外，熟于此技藝者更喜歡藉由將突變引入至SEQIDNO1、2、或3之核酸序列中之改變，而不會變更該HIV-依賴型表現(xiàn)構筑體序列之功能。一具體實施例中，該經(jīng)單離之核酸分子包括一核酸序列，其與SEQIDNO1、2、或3(例如，與完整長度之SEQIDNO1、2、或3)具有至少約50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或以上之相似性。II.重組表現(xiàn)載體及宿主細胞本發(fā)明之另一方面系關于，例如重組表現(xiàn)載體，其含有HIV-依賴型表現(xiàn)構筑體核酸分子。如本文所使用，「載體」系指一種核酸分子其可運送另一經(jīng)連接之核酸。其中一種載體為「質體」，其為環(huán)狀雙股DNA環(huán)狀物其可與其它DNA片段接合。另一種載體為病毒載體，其中其它DNA片段可與病毒基因體接合。某些載體于其所引入之宿主細胞中可自行復制(例如，具有細菌之復制原點之細菌載體及游離型(episomal)哺乳動物載體)。其它載體(例如，非-游離型哺乳動物載體)系經(jīng)由引入至宿主細胞而與宿主細胞之基因體整合，因而隨著宿主基因體復制。此外，某些載體可直接表現(xiàn)經(jīng)操作性連接之基因。此等載體系指本文中「表現(xiàn)載體」。通常，重組DNA技術中所利用之表現(xiàn)載體經(jīng)常為質粒之形式。本說明書中，「質?！辜啊篙d體」可交互使用而質粒為最常使用之載體形式。然而，本發(fā)明欲包含此等其它形式之表現(xiàn)載體，例如病毒載體(例如，復制缺陷之反轉錄病毒、腺病毒、腺相關病毒(adeno-associatedvirus)、及慢病毒)，其可提供同等之功能。較佳之具體實施例中，該HIV-依賴型表現(xiàn)構筑體系包含于反轉錄病毒載體中，其可用于感染哺乳動物細胞(例如，人類細胞)。更佳之具體實施例中，該反轉錄病毒載體無復制能力。此點尤其重要因為極不希望產(chǎn)生具有復制能力之含有HIV序列之反轉錄病毒，其可能會感染人類而造成疾病。用于表現(xiàn)該HIV-依賴型表現(xiàn)構筑體之特佳反轉錄病毒載體為Naldini，L等人之慢病毒載體((1996)Science272263-267，以參考資料合并于本文)。慢病毒載體特別適用于偵測未-分裂(以及分裂中)細胞。其它較佳之載體系詳述于美國專利第6,428,953、6,165,782、6,013,516、及5,994,136號中，皆以參考資料合并于本文。本發(fā)明之另一方面系關于宿主細胞，其系用于引入本發(fā)明之HIV-依賴型表現(xiàn)構筑體核酸分子，例如，位于載體(例如，重組反轉錄病毒載體)中之HIV-依賴型表現(xiàn)構筑體核酸分子或含有可因同源性而與宿主細胞之基因體中特定位置再結合之序列之HIV-依賴型表現(xiàn)構筑體核酸分子。本文中「宿主細胞」與「重組宿主細胞」可交互使用。應了解此等名詞不僅系指特定對象之細胞亦指此等細胞之繼代或可能之繼代。由于突變或環(huán)境影響，后代中可能發(fā)生一些變化，故此繼代可能(事實上)與母細胞不完全相同，但仍包含于本文所使用之名詞之范圍中。宿主細胞可為任何原核或真核細胞。例如，含有HIV-依賴型表現(xiàn)構筑體之載體可于細菌細胞(如大腸桿菌)、昆蟲細胞、酵母菌或哺乳動物細胞(如中國倉鼠卵細胞(CHO)、COS細胞(例如COS7細胞)、C6神經(jīng)膠質瘤細胞、HEK293T細胞、或神經(jīng)元)中增殖及/或表現(xiàn)。其它適合之宿主細胞為熟于此技藝者所知悉。較佳之具體實施例中，宿主細胞為人類T細胞(例如，CEMT細胞)。載體DNA可藉由習知之轉形或轉染技術引入至原核或真核細胞。如本文所使用，「轉形」及「轉染」系指各種用于將外來核酸(例如，DNA)引入至宿主細胞之經(jīng)此技藝認可之技術，包含磷酸鈣或氯化鈣共-沉淀、DEAE-葡聚糖-中介之轉染、脂質體轉染(lipofection)、或電穿孔。將宿主細胞轉形或轉染之適合的方法可見于Sambrook等人(MolecularCloningALaboratoryManual.2nded.，ColdSpringHarborLaboratory，ColdSpringHarborLaboratiryPress，ColdSpringHarbor，N.Y.，1989)，及其它實驗室手冊。至于哺乳動物細胞之穩(wěn)定轉染，已知根據(jù)所使用之表現(xiàn)載體及轉染技術，僅少部分之細胞可將外來DNA與其基因體整合。為了鑒別及挑選此整合物，通常會將編碼可選擇性標志(例如，抗生素抗性)之基因隨著所欲之基因引入至宿主細胞中。較佳之可選擇性標志包含對藥物，例如G418、潮霉素(hygromycin)及甲氨喋呤(methotrexate)，具有抗性者。將編碼可選擇性標志之核酸引入至與編碼HIV-依賴型表現(xiàn)構筑體相同之載體或者可引入至另一載體。藉由藥物選擇作用可鑒別該經(jīng)穩(wěn)定地以經(jīng)引入之核酸轉染之細胞(例如，已合并該可選擇性標志基因之細胞可存活，而其它細胞則死亡)。最佳之具體實施例中，含有本發(fā)明之HIV-依賴型表現(xiàn)構筑體之宿主細胞系由將細胞以含有該構筑體之重組反轉錄病毒轉染而產(chǎn)生。產(chǎn)生宿主細胞之較佳方法可見于，例如，Naldini等人((1996)如前述)以及美國專利第6,428,953、6,165,782、6,013,516、及5,994,136號，皆以參考資料合并于本文。本發(fā)明之宿主細胞亦可用于產(chǎn)生非-人類基因轉殖動物。例如，于一具體實施例中，本發(fā)明之宿主細胞為受精卵或胚胎干細胞其中已引入HIV-依賴型表現(xiàn)構筑體序列。此等宿主細胞可用于創(chuàng)造非-人類基因轉殖動物，其中外來性HIV-依賴型表現(xiàn)構筑體序列已引入其基因體。此等動物可用于研究HIV感染及/或基因表現(xiàn)以及用于鑒別及/或評估HIV感染及/或基因表現(xiàn)之調(diào)控劑。如本文所使用，「基因轉殖動物」為非-人類動物，較佳為哺乳動物，更佳為嚙齒類如大鼠或小鼠，其中該動物之一種或多種細胞包含轉基因(trausgene)?；蜣D殖動物之其它實例包含非-人類靈長類、綿羊、狗、牛、山羊、雞、兩棲類等。轉基因為外來性DNA其系與細胞之基因體整合而發(fā)展出基因轉殖動物且該外來性DNA仍存留于成熟動物之基因體中，因此可于該基因轉殖動物之一種或多種細胞類型或組織中直接表現(xiàn)出經(jīng)編碼之基因產(chǎn)物。本發(fā)明之基因轉殖動物可藉由將HIV-依賴型表現(xiàn)構筑體-編碼核酸引入至受精卵之雄性原核(malepronuclei)，例如，藉由微量注射或反轉錄病毒感染，以及使該卵于假孕之雌性養(yǎng)育動物中成長而創(chuàng)造出來。SEQIDNO1、2、或3之HIV-依賴型表現(xiàn)構筑體序列可作為轉基因而引入至非-人類動物之基因體中。藉由胚胎操作及微量注射以產(chǎn)生基因轉殖動物之方法，尤其例如小鼠之動物，已為此技藝所知悉，且詳述于，例如，Leder等人之美國專利第4,736,866及4,870,009號、Wagner等人之美國專利第4,873，191號以及Hogan，B.，ManipulatingtheMouseEmbryo(ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，N.Y.，1986)?？墒褂妙愃浦椒ㄒ灾圃炱渌蜣D殖動物?；蜣D殖創(chuàng)始動物之鑒別可基于其基因體中HIV-依賴型表現(xiàn)構筑體轉基因之存在及/或于該動物之細胞或組織中表現(xiàn)該HIV-依賴型表現(xiàn)構筑體轉基因中之可表現(xiàn)序列?？蓪⒒蜣D殖創(chuàng)始動物用于繁殖出其它帶有該轉基因之動物。再者，帶有HIV-依賴型表現(xiàn)構筑體之轉基因之基因轉殖動物可進一步與帶有其它轉基因之基因轉殖動物育種。本發(fā)明之基因轉殖動物亦可用于產(chǎn)生含有HIV-依賴型表現(xiàn)構筑體之穩(wěn)定的細胞株。此細胞株系有用的因為其可經(jīng)制造而使其不會過度表現(xiàn)該轉基因(于瞬間轉染時可能發(fā)生)，因此更確實地反應出該轉基因之自然的細胞環(huán)境。此細胞株可自基因轉殖動物(例如，小鼠)中單離出細胞且利用標準方法予以培養(yǎng)而產(chǎn)生。某些具體實施例中以初代(亦即，未-永生化)細胞較佳，或為了于培養(yǎng)基中使其無限增殖該細胞可經(jīng)永生化(例如，經(jīng)由加入諸如SV40大T抗原之基因)。III.偵測HIV之方法又另一具體實施例中，本發(fā)明提供一種測定樣本中是否存在HIV之方法，其包括將含有本發(fā)明之核酸分子之宿主細胞與樣本接觸；培養(yǎng)該細胞一段時間足以使HIV感染及基因表現(xiàn)；以及測定該可表現(xiàn)序列是否由該細胞表現(xiàn)，其中該可表現(xiàn)序列之表現(xiàn)系代表樣本中存在HIV。較佳之具體實施例中，該生物樣本系單離自對象(例如，人類對象)。又較佳之具體實施例中，該生物樣本系由生物液體樣本(例如，血液、血清、血漿、唾液、尿液、糞便、精液、陰道液、脊髓液、淋巴液、羊水、淚液、鼻腔分泌物、汗、乳汁、粘液、或組織液)、組織樣本(例如，淋巴結樣本、皮膚樣本、或絨毛膜樣本)、及細胞樣本(例如，血液細胞樣本如T細胞樣本)所組成之群組選出者。又一具體實施例中，該樣本可經(jīng)純化。另一具體實施例中，本發(fā)明提供一種測定細胞(例如，T細胞)是否感染HIV之方法，其包括將該細胞與含有本發(fā)明之核酸分子之反轉錄病毒接觸；培養(yǎng)該細胞一段時間足以使HIV基因表現(xiàn)；以及測定該可表現(xiàn)序列是否由該細胞表現(xiàn)，其中該可表現(xiàn)序列之表現(xiàn)系代表該細胞感染HIV。又另一具體實施例中，本發(fā)明提供一種測定對象(例如，人類對象)是否感染HIV之方法，其包括將該對象之細胞與含有本發(fā)明之核酸分子之反轉錄病毒接觸，以及測定該可表現(xiàn)序列是否由該細胞表現(xiàn)，其中該可表現(xiàn)序列之表現(xiàn)系代表感染HIV。IV.篩選試驗本發(fā)明提供一種鑒別調(diào)控劑(亦即，可抑制HIV感染及/或基因表現(xiàn)之候選或測試化合物或試劑)之方法(本文中亦稱為「篩選試驗」)。本發(fā)明之篩選試驗系依據(jù)本文所述之HIV-依賴型表現(xiàn)構筑體偵測HIV感染之能力。由于該可表現(xiàn)序列僅于Tat及Rev兩者皆存在時才表現(xiàn)，故可將含有本發(fā)明之表現(xiàn)構筑體之宿主細胞以HIV感染且進行測試以鑒別可抑制HIV感染及/或基因表現(xiàn)之化合物。本發(fā)明之測試化合物可利用此技藝中已知之組合數(shù)據(jù)庫中多種方法之任一種而得，包含生物學數(shù)據(jù)庫；空間可定位平行固相或液相數(shù)據(jù)庫；需要反折積(deconvolution)之合成數(shù)據(jù)庫法；「一球珠-一化合物(one-beadone-compound)」數(shù)據(jù)庫法；及利用親合性層析選擇之合成數(shù)據(jù)庫法。該生物學數(shù)據(jù)庫法限于勝肽數(shù)據(jù)庫，而其它四種方法可應用于勝肽、非-勝肽寡聚物或化合物之小分子數(shù)據(jù)庫(Lam，K.S.(1997)AnticancerDrugDes.1245)。用于合成分子數(shù)據(jù)庫之方法的實例可見于此技藝中，例如，DeWitt等人(1993)Proc.Natl.Acad.USA906909；Erb等人(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA9111422；Zuckermann等人(1994)J.Med.Chem.372678；Cho等人(1993)Science2611303；Carell等人(1994)Angew.Chem.Int.Ed.Engl.332059；Carrell等人(1994)Angew.Chem.Int.Ed.Engl.332061；以及Gallop等人(1994)J.Med.Chem.371233?；衔镏當?shù)據(jù)庫可存在于溶液中(例如，Houghten(992)Biotechniques13412-421)、或存在于球珠(Lam(1991)Nature35482-84)、芯片(Fodor(1993)Nature364555-556)、細菌(Ladner美國專利第5,223,409號)、孢子(Ladner美國專利第’409號)、質體(Cull等人(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA891865-1869)或噬菌體(Scott及Smith(1990)Science249386-390)；(Devlin(1990)Science249404-406)；(Cwirla等人(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA876378-6382)；(Felici(1991)J.Mol.Biol.222301-310)；(前述之Ladner)。一具體實施例中，該篩選試驗系以細胞為主之試驗，包括將含有本發(fā)明之HIV-依賴型表現(xiàn)構筑體之宿主細胞與測試化合物接觸；將細胞與HIV接觸；培養(yǎng)該細胞一段時間足以使HIV感染及基因表現(xiàn)；以及測定該可表現(xiàn)序列是否由該細胞表現(xiàn)。該HIV-依賴型表現(xiàn)構筑體較佳系穩(wěn)定地與該細胞之基因體整合。該測試化合物可于HIV感染該細胞之前，同時間，或之后添加。另一具體實施例中，本發(fā)明之篩選試驗為以細胞為主之試驗，包括將細胞與HIV接觸；將該細胞與含有本發(fā)明之HIV-依賴型表現(xiàn)構筑體之反轉錄病毒接觸；將細胞與測試化合物接觸；培養(yǎng)該細胞一段時間足以使HIV感染及基因表現(xiàn)；以及測定該可表現(xiàn)序列是否由該細胞表現(xiàn)。HIV感染、HIV-依賴型表現(xiàn)構筑體(反轉錄病毒)感染、及測試化合物之添加可同時進行或以任何順序進行。又本發(fā)明之另一篩選試驗系以細胞為主之試驗，包括將經(jīng)HIV感染之細胞與含有本發(fā)明之HIV-依賴型表現(xiàn)構筑體之反轉錄病毒接觸；將該細胞與測試化合物接觸；培養(yǎng)該細胞一段時間足以使HIV感染及基因表現(xiàn)；以及測定該可表現(xiàn)序列是否由該細胞表現(xiàn)。HIV-依賴型表現(xiàn)構筑體(反轉錄病毒)感染以及測試化合物之添加可同時進行或以任何順序進行。應注意若該篩選試驗中所使用之宿主細胞已經(jīng)HIV感染時此具體實施例尤其適用。決定該測試化合物調(diào)控HIV感染及/或基因表現(xiàn)之能力可藉由，例如，監(jiān)測可表現(xiàn)序列之表現(xiàn)作用(例如，報導子mRNA或多肽表現(xiàn)程度)或活性而達成。如本文中所述，缺乏HIVRev蛋白質時，由可表現(xiàn)序列表現(xiàn)之任何mRNA系作為內(nèi)子之一部分而剪接掉，故無法偵測。該可表現(xiàn)序列可為核酸序列，其表現(xiàn)可藉由，例如，RNA雜交印跡法、RT-PCR、引物延伸、或核酸保護試驗予以測量。該可表現(xiàn)序列亦可為編碼多肽之核酸序列，其表現(xiàn)可藉由，例如，蛋白印跡法、ELISA、或RIA試驗予以測量。可表現(xiàn)序列之表現(xiàn)亦可藉由使用，例如，螢光素試驗、β-半乳糖試驗、氯霉素乙醯轉移(CAT)試驗、胸激(TK)試驗、或螢光蛋白質試驗測量該可表現(xiàn)序列所編碼之蛋白質之活性而予以監(jiān)測。實行此等試驗之方法為此技藝中已知者。將受HIV-依賴型表現(xiàn)構筑體控制且候選化合物存在時，該可表現(xiàn)序列之表現(xiàn)程度或活性與候選化合物不存在時該可表現(xiàn)序列之表現(xiàn)程度或活性進行比較?；诖吮容^，則可鑒別該候選化合物是否為HIV感染及/或基因表現(xiàn)之調(diào)控劑。例如，當該候選化合物存在時，可表現(xiàn)序列之mRNA或蛋白質之表現(xiàn)，或者蛋白質之活性大于(統(tǒng)計上顯著較大者)候選化合物不存在時，則該候選化合物系鑒別為HIV感染及/或基因表現(xiàn)之刺激物(非所欲者)。較佳地，當候選化合物存在時，可表現(xiàn)序列之mRNA或蛋白質之表現(xiàn)或活性小于(統(tǒng)計上顯著較小者)候選化合物不存在時，則該候選化合物系鑒別為HIV感染及/或基因表現(xiàn)之抑制劑。本發(fā)明進一步系關于由上述篩選試驗所鑒別之新穎藥劑。因此，于適當之動物模型(例如，感染HIV之動物模型，如以HIV或SIV(猴免疫缺陷病毒)感染非-人類靈長類)中進一步使用如本文所述而鑒別之藥劑系落于本發(fā)明之范疇。例如，如本文所述而鑒別之藥劑可用于動物模型中以決定此藥劑之功效、毒性、或治療之副作用?；蛘?，如本文所述而鑒別之藥劑可用于動物模型中以決定此藥劑之作用機制。再者，本發(fā)明系關于由上述篩選試驗所鑒別出之新穎藥劑之如本文所述之治療用途。V.治療方法該HIV-依賴型表現(xiàn)構筑體可藉由利用編碼治療性蛋白質之可表現(xiàn)序列，用以治療經(jīng)HIV感染之對象(例如，人類對象)。如本文所使用，「治療性蛋白質」為任何蛋白質(例如，勝肽或多肽)，當其于細胞中表現(xiàn)時，會對細胞之功能產(chǎn)生作用。較佳之具體實施例中，治療性蛋白質為對細胞有毒之蛋白質(亦即，胞毒性)。較佳之胞毒性蛋白質包含，但非限于，蓖麻毒素、商陸毒素、白喉毒素A、肥皂草毒素、白樹素、及假單胞菌外毒素A。由于本發(fā)明之HIV-依賴型表現(xiàn)構筑體中之可表現(xiàn)序列僅于HIV蛋白質存在時才表現(xiàn)，故胞毒性蛋白質可用于選擇性地殺死遭HIV感染之細胞。因此，本發(fā)明提供殺死遭HIV感染之細胞之方法，以及治療經(jīng)HIV感染之對象之方法。如本文所使用，「治療」對象包含向對象施用或投予治療劑(例如，HIV-依賴型表現(xiàn)構筑體)，向對象之細胞或組織施用或投予治療劑，而該對象患有疾病或病癥(例如，HIV感染或AIDS)，具有疾病或病癥之癥狀，或具有罹患疾病或病癥之風險(可能罹患疾病或病癥)，其目的為治愈、治療、減輕、緩和、改變、醫(yī)治、改善、改進、或影響該疾病或病癥、該疾病或病癥之癥狀、或罹患該疾病或病癥之風險(罹患該疾病或病癥之可能性)。藉由以含有本發(fā)明之HIV-依賴型表現(xiàn)構筑體(其中該可表現(xiàn)序列為胞毒性蛋白質)之反轉錄病毒感染遭HIV感染之細胞，該胞毒性蛋白質可于該細胞中表現(xiàn)。該細胞可為任何遭HIV感染之細胞，例如T細胞。該細胞可為，例如，培養(yǎng)之細胞株，或藉由習知方法自對象(，例如，人類對象)取得之細胞。具有胞毒性可表現(xiàn)序列之HIV-依賴型表現(xiàn)構筑體亦可用于治療遭HIV感染或具有感染HIV風險之對象(例如，人類對象)。含有HIV-依賴型表現(xiàn)構筑體之反轉錄病毒可直接投予至該對象俾使其感染該對象之細胞(例如，T細胞)。當藉由反轉錄病毒遞送至該細胞后，該HIV-依賴型表現(xiàn)載體僅于該細胞經(jīng)HIV感染時才表現(xiàn)該胞毒性蛋白質，因而殺死該細胞而防止病毒復制及散布。應了解，任何方法中涉及對人類對象投予反轉錄病毒時，尤其系含有HIV-衍生序列之反轉錄病毒，該反轉錄病毒應無復制能力，因此于感染細胞后其無法復制。某些具體實施例中，以本發(fā)明之HIV-依賴型表現(xiàn)構筑體治療對象時可結合其它治療HIV感染及/或AIDS之方法(例如，已認可或實驗性之療法)。例如，本發(fā)明之HIV-依賴型表現(xiàn)載體可與已知之AIDS藥物一起投予，該AIDS藥物包含，但非限于，蛋白抑制劑、反轉錄抑制劑、及核類似物。此等藥物之實例包含，但非限于，安瑞那偉(agenerase)(安普那偉(amprenavir))、雙汰芝(Combivir)(結合瑞托偉(Retrovir)(300毫克)及依皮偉(Epivir)(150毫克)-于同一錠劑中)、佳息患(Crixivan)印地那偉(indinavir)、依皮偉(Epivir)(3tc/拉米夫定(lamivudine))、恩曲伐(Emtriva)(恩曲他濱(emtricitabine)(FTC))、服妥美(Fortovase)(沙奎那偉(saquinavir))、福澤昂(Fuzeon)(恩夫偉地(enfuvirtide))、西維得(Hivid)(ddc/扎西他濱(zalcitabine))、愛治(Hydrea)(羥基)、印維瑞(Invirase)(沙奎那偉)、卡雷翠(Kaletra)(洛皮那偉(lopinavir))、諾維(Norvir)(利托那偉(ritonavir))、蕊潰特(Rescfiptor)(地拉偉啶(delavirdine))、瑞托偉(Retrovir)、AZT(齊多夫啶(zidovudine))、瑞塔茲(Reyataz)(阿扎那偉(atazanavir)；BMS-232632)、蘇提發(fā)(Sustiva)(依發(fā)偉侖(efavirenz))、三思偉(Trizivir)(一錠劑中含有3種非核；阿巴卡偉(abacavir)+齊多夫啶+拉米夫定)、惠妥茲(Videx)(ddl/去羥肌(didanosine))、惠妥茲EC(VidexEC)(ddl/去羥肌)、維拉賽特錠(Viracept)(奈非那偉(nelfinavir))、維拉繆(Viramune)(奈偉拉平(nevirapine))、維瑞(Viread)(替諾福偉酯(tenofovirdisoproxilfumarate))、司瑞(Zerit)(d4t/斯塔夫啶(stavudine))、及司準(Ziagen)(阿巴卡偉)。本發(fā)明將藉由下列實施例予以進一步說明，而不應以該實施例限制本發(fā)明。此申請案中所注明之所有參考資料、專利案及公開之專利申請案的內(nèi)容，以及序列表與圖標系以參考資料合并于本文。實施例實施例1利用HIV-依賴型表現(xiàn)載體偵測經(jīng)HIV感染之細胞利用Naldini等人((1996)Science272263-267，以參考資料合并于本文)所述之系統(tǒng)將人類T細胞株CEM以SEQIDNO2之HIV-依賴型表現(xiàn)構筑體感染，其中該反轉錄病毒載體系以吾等之SEQIDNO2之雙-剪接載體置換。檢驗經(jīng)選殖之細胞，其具有穩(wěn)定整合形式之HIV-依賴型表現(xiàn)構筑體。于Tat不存在時，該細胞自經(jīng)整合之構筑體表現(xiàn)出RNA(參見第6圖；剪接之RNA；參見第2欄)但不表現(xiàn)編碼GFP之未剪接訊息。該CEM細胞(不含載體者)亦未表現(xiàn)RNA(第1欄)。于HIV感染后，該載體-陽性株即表現(xiàn)高程度之GFP-編碼RNA(未剪接之RNA)，參見第4欄。經(jīng)HIV感染后，藉由螢光顯微術，HDEC-感染之細胞中顯示強GFP螢光(第7圖)。于未經(jīng)感染之細胞(無Tat蛋白質)中低表現(xiàn)程度之經(jīng)剪接之RNA證實缺乏Tat-依賴型報導子。于HIV不存在時(無Rev蛋白質)未經(jīng)剪接之RNA的缺乏證實此系統(tǒng)之選擇性。實施例2利用經(jīng)合并至慢病毒中之HIV-依賴型表現(xiàn)載體偵測經(jīng)活化感染之細胞將SEQIDNO2之HIV-依賴型表現(xiàn)構筑體(本文中亦稱為pNL-ORF-RRE-雙/剪接構筑體)系包裝至VSV糖蛋白偽型之慢病毒中，且其中之可表現(xiàn)序列為綠色螢光蛋白質(GFP)。將CEM細胞以報導子病毒轉導但未受HIV感染故未產(chǎn)生報導子(第8圖，上圖，F(xiàn)L1-H)。將人類CEMT細胞以HIV感染，此處Nef基因系以鼠CD24取代。將細胞染色以顯現(xiàn)鼠CD24(FL2-H)界定HIV感染之細胞(第8圖，中間)。經(jīng)HIV感染后，將細胞以報導子病毒感染，且藉由流式細胞術檢驗。僅于經(jīng)HIV感染(FL2-H陽性)之細胞中專一性地發(fā)現(xiàn)GFP-陽性之細胞(由構筑體而來之報導子；FL1-H)(第8圖，下圖)。本發(fā)明已參照其較佳之具體實施例予以詳細說明。然而，應了解熟于此技藝者可根據(jù)此揭示在下述申請專利范圍所提出之本發(fā)明之精神與范疇下進行修飾及改進。序列表<110>美國衛(wèi)生與公共服務部<120>HIV-依賴型表現(xiàn)構筑體及其用途<130>59582-PCT<150>60/507,034<151>2003-09-28<160>3<170>PatentIn3.3版<210>1<211>4418<212>DNA<213>人工合成<220><223>HIV-依賴型表現(xiàn)構筑體<400>1tggaagggctaatttggtcccaaaaaagacaagagatccttgatctgtggatctaccaca60cacaaggctacttccctgattggcagaactacacaccagggccagggatcagatatccac120tgacctttggatggtgcttcaagttagtaccagttgaaccagagcaagtagaagaggcca180aataaggagagaagaacagcttgttacaccctatgagccagcatgggatggaggacccgg240agggagaagtattagtgtggaagtttgacagcctcctagcatttcgtcacatggcccgag300agctgcatccggagtactacaaagactgctgacatcgagctttctacaagggactttccg360ctggggactttccagggaggtgtggcctgggcgggactggggagtggcgagccctcagat420gctacatataagcagctgctttttgcctgtactgggtctctctggttagaccagatctga480gcctgggagctctctggctaactagggaacccactgcttaagcctcaataaagcttgcct540tgagtgctcaaagtagtgtgtgcccgtctgttgtgtgactctggtaactagagatccctc600agacccttttagtcagtgtggaaaatctctagcagtggcgcccgaacagggacttgaaag660cgaaagtaaagccagaggagatctctcgacgcaggactcggcttgctgaagcgcgcacgg720caagaggcgaggggcggcgactggtgagtacgccaaaaattttgactagcggaggctaga780aggagagagatgggtgcgagagcgtcagtattaagcgggggagaattagatcgcgatggg840aaaaaattcggttaaggccagggggaaagaaaaaatataaattaaaacatatagtatggg900caagcagggagctagaacgattcgcagttaatcctggcctgttagaaacatcagaaggct960gtagacaaatactgggacagctacaaccatcccttcagacaggatcagaagaacttagat1020cattatataatacagtagcaaccctctattgtgtgcatcaaaggatagagataaaagaca1080ccaaggaagctttagacaagatagaggaagagcaaaacaaaagtaagaccaccgcacagc1140aagcggccgctctagcccgggcggatccgaattcgcatgcgtcgactcgaggactacaag1200gatgacgatgacaaggattacaaagacgacgatgataaggactataaggatgatgacgac1260aaataatagcaattcctcgacgactgcatagggttacccccctctccctcccccccccct1320aacgttactggccgaagccgcttggaataaggccggtgtgcgtttgtctatatgttattt1380tccaccatattgccgtcttttggcaatgtgagggcccggaaacctggccctgtcttcttg1440acgagcattcctaggggtctttcccctctcgccaaaggaatgcaaggtctgttgaatgtc1500gtgaaggaagcagttcctctggaagcttcttgaagacaaacaacgtctgtagcgaccctt1560tgcaggcagcggaaccccccacctggcgacaggtgcctctgcggccaaaagccacgtgta1620taagatacacctgcaaaggcggcacaaccccagtgccacgttgtgagttggatagttgtg1680gaaagagtcaaatggctc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該報告基因所編碼的多肽。69.如權利要求68所述的方法，其中檢測該多肽的方法選自蛋白印跡法、ELISA、或RIA。70.如權利要求68所述的方法，其中該多肽采用檢測該多肽活性的方法進行檢測。71.如權利要求70所述的方法，其中檢測該多肽活性的方法選自螢光試驗、β-半乳糖苷酶試驗、CAT試驗、螢光素酶試驗、及胸腺嘧啶脫氧核苷激酶試驗。全文摘要本發(fā)明提供具有可表現(xiàn)序列之核酸分子，該可表現(xiàn)序列包含報導基因及治療基因，其表現(xiàn)系依賴HIVTat及Rev兩種蛋白質之存在。本發(fā)明進一步提供偵測HIV之方法、鑒別該可抑制HIV感染及/或基因表現(xiàn)之化合物之方法、殺死經(jīng)HIV感染之細胞之方法、以及治療經(jīng)HIV感染之對象之方法。文檔編號C12NGK1886417SQ200480035300公開日2006年12月27日申請日期2004年9月28日優(yōu)先權日2003年9月28日發(fā)明者Y·吳,J·W·馬什申請人:美國衛(wèi)生與公共服務部