本申請(qǐng)要求2014年5月19日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)No.62/000,460的權(quán)益，通過(guò)援引將其公開內(nèi)容完整收入本文。

發(fā)明領(lǐng)域

本發(fā)明屬于經(jīng)遺傳修飾的非人動(dòng)物領(lǐng)域。

發(fā)明背景

經(jīng)遺傳修飾的小鼠，經(jīng)修飾和移入的小鼠，及其在人疾病建模中的用途是本領(lǐng)域已知的。然而，迄今為止，生成模擬靶向人類紅細(xì)胞譜系的細(xì)胞的病原體的人感染的經(jīng)遺傳修飾的小鼠很少成功。此類病原體(例如瘧原蟲，巴貝蟲，和泰勒蟲屬的原生動(dòng)物)可在人中引起危及生命的疾病。

例如，瘧原蟲屬的原生動(dòng)物引起瘧疾。在2010年，全世界總共106個(gè)國(guó)家認(rèn)為是瘧疾流行的，估計(jì)有33億人有風(fēng)險(xiǎn)發(fā)生該疾病。2010年全世界該疾病的負(fù)荷估計(jì)為2.16億例病例及65.5萬(wàn)例估計(jì)死亡，其中86％是5歲以下的兒童。當(dāng)前，用于預(yù)防和治療瘧疾的藥物和疫苗仍然非常有限。另外，針對(duì)常用瘧疾治療劑的寄生蟲抗性已經(jīng)出現(xiàn)且呈現(xiàn)持續(xù)挑戰(zhàn)。因此迫切需要開發(fā)用于控制和治療靶向人紅細(xì)胞的病原體的新藥物和疫苗。

由于這些病原體中的許多不感染實(shí)驗(yàn)室嚙齒動(dòng)物的紅血球，體內(nèi)研究傳統(tǒng)上限于由嚙齒動(dòng)物寄生蟲伯氏瘧原蟲(Plasmodium berghei)ANKA引起的瘧疾的研究或通過(guò)每天注射大量人紅細(xì)胞而急性移入并通過(guò)注射受到寄生蟲感染的紅血球而重合或隨后感染的NOD/SCID，NOD/SCID/IL2rg^無(wú)效(NSG)，或BXN小鼠的研究(Angulo-Barturen et al.(2008)A murine model of falciparum-malaria by in vivo selection of competent strains in non-myelodepleted mice engrafted with human erythrocytes.PLoS One 3：e2252；Jimenez-Diaz et al.(2009)Improved murine model of malaria using Plasmodium falciparum competent strains and non-myelodepleted NOD-scid IL2Rgnull mice engrafted with human erythrocytes.Antimicrob Agents Chemother 53：4533-4536；Badell et al.(2000)Human malaria in immunocompromised mice：an in vivo model to study defense mechanisms against Plasmodium falciparum.JEM 192(11)：1653-1660；Moreno et al.(2006)The course of infections and pathology in immunomodulated NOD/LtSz-SCID mice inoculated with Plasmodium falciparum laboratory lines and clinical isolates.Int.J.Parasitol.36：361-369)。為了研究瘧原蟲和其它病原體對(duì)人的影響，及測(cè)試疫苗和藥物預(yù)防感染和治療受到這些和其它病原體感染的人的功效，具有經(jīng)過(guò)遺傳修飾使得對(duì)此類病原體感染易感或使得會(huì)更好地支持在感染之前急性移植入動(dòng)物的人紅細(xì)胞(如傳統(tǒng)嚙齒動(dòng)物模型中進(jìn)行的)的非人動(dòng)物諸如小鼠會(huì)是有用的。

發(fā)明概述

提供了自動(dòng)物基因組表達(dá)人EPO的經(jīng)遺傳修飾的非人動(dòng)物。還提供了用于生成自非人動(dòng)物基因組表達(dá)人EPO的非人動(dòng)物的方法，及用于使用自非人動(dòng)物基因組表達(dá)人EPO的非人動(dòng)物的方法。這些動(dòng)物和方法在本領(lǐng)域中有許多用途，包括例如人紅細(xì)胞生成和紅細(xì)胞功能的建模；紅細(xì)胞的人病原體感染的建模；例如在健康或患病狀態(tài)，調(diào)控紅細(xì)胞生成和/或紅細(xì)胞功能的藥劑的體內(nèi)篩選；對(duì)紅細(xì)胞或紅細(xì)胞祖先有毒性的藥劑的體內(nèi)篩選；預(yù)防，減輕，或逆轉(zhuǎn)有毒藥劑對(duì)紅細(xì)胞或紅細(xì)胞祖先的毒性影響的藥劑的體內(nèi)篩選；來(lái)自個(gè)體的紅細(xì)胞或紅細(xì)胞祖先的體內(nèi)篩選以預(yù)測(cè)個(gè)體對(duì)疾病療法的響應(yīng)性。

在本發(fā)明的一些方面，提供了經(jīng)遺傳修飾的非人動(dòng)物，其自所述非人動(dòng)物的基因組表達(dá)人EPO。換言之，所述非人動(dòng)物包含編碼人EPO蛋白質(zhì)的核酸序列。

在一些實(shí)施方案中，所述編碼人EPO蛋白質(zhì)的核酸序列與EPO基因啟動(dòng)子可操作連接。在一些實(shí)施方案中，所述EPO基因啟動(dòng)子是人EPO啟動(dòng)子。在其它實(shí)施方案中，所述EPO啟動(dòng)子是內(nèi)源，即非人，EPO啟動(dòng)子。在某些此類實(shí)施方案中，所述內(nèi)源EPO啟動(dòng)子在非人動(dòng)物EPO基因基因座處。換言之，在某些實(shí)施方案中，所述編碼人EPO蛋白質(zhì)的核酸序列與非人動(dòng)物EPO基因座處的非人動(dòng)物EPO啟動(dòng)子可操作連接的。在一些此類實(shí)施方案中，所述可操作連接導(dǎo)致非人EPO基因基因座處的非人EPO基因中的無(wú)效突變。

在一些實(shí)施方案中，所述主題非人動(dòng)物對(duì)于包含所述編碼人EPO蛋白質(zhì)的核酸序列的等位基因是雜合的。在其它實(shí)施方案中，所述非人動(dòng)物對(duì)于包含所述編碼人EPO蛋白質(zhì)的核酸序列的等位基因是純合的。

在一些實(shí)施方案中，所述編碼人EPO蛋白質(zhì)的核酸序列包含人EPO基因組編碼和非編碼序列。在其它實(shí)施方案中，所述編碼人EPO蛋白質(zhì)的核酸序列包含人EPO cDNA序列。

在一些實(shí)施方案中，所述主題非人動(dòng)物表達(dá)一種或多種選自下組的別的人蛋白質(zhì)：由在M-csf啟動(dòng)子控制下的核酸編碼的M-CSF蛋白質(zhì)，由在Il-3啟動(dòng)子控制下的核酸編碼的IL-3蛋白質(zhì)，由在Gm-csf啟動(dòng)子控制下的核酸編碼的GM-CSF蛋白質(zhì)，由在TPO啟動(dòng)子控制下的核酸編碼的TPO蛋白質(zhì)，和由在Sirpa啟動(dòng)子控制下的核酸編碼的Sirpa蛋白質(zhì)。在一些此類實(shí)施方案中，所述啟動(dòng)子是相應(yīng)的非人動(dòng)物基因基因座處的內(nèi)源非人動(dòng)物啟動(dòng)子，且所述非人動(dòng)物對(duì)于所述非人基因是雜合無(wú)效的。在其它實(shí)施方案中，所述啟動(dòng)子是相應(yīng)的非人動(dòng)物基因基因座處的內(nèi)源非人動(dòng)物啟動(dòng)子，且所述非人動(dòng)物對(duì)于所述非人基因是純合無(wú)效的。在某些實(shí)施方案中，所述非人動(dòng)物表達(dá)選自下組的人蛋白質(zhì)，例如人源化蛋白質(zhì)：人TPO，例如人源化TPO；人IL-3，例如人源化IL-3：人GM-CSF，例如人源化GM-CSF：人EPO，例如人源化EPO；和人Sirpa，例如人源化Sirpa；和其組合。

在一些實(shí)施方案中，主題經(jīng)遺傳修飾的非人動(dòng)物是具有如下基因組的小鼠，所述基因組包含編碼人蛋白質(zhì)，例如人源化蛋白質(zhì)的核酸序列，例如編碼人EPO，例如人源化EPO；人Sirpa，例如人源化Sirpa；人IL-3，例如人源化IL-3；人GM-CSF，例如人源化GM-CSF；人M-CSF，例如人源化M-CSF；人TPO，例如人源化TPO；人IL-6，例如人源化IL-6；等的核酸，其分別與它的相應(yīng)的非人動(dòng)物啟動(dòng)子可操作連接，例如Sirpa，IL-3，GM-CSF，M-CSF，TPO，或IL-6啟動(dòng)子，其中所述動(dòng)物表達(dá)所編碼的人蛋白質(zhì)和天然小鼠蛋白質(zhì)。在其它實(shí)施方案中，主題經(jīng)遺傳修飾的非人動(dòng)物是具有如下基因組的小鼠，所述基因組包含編碼人蛋白質(zhì)，例如人源化蛋白質(zhì)的核酸序列，例如編碼人EPO，例如人源化EPO；人Sirpa，例如人源化Sirpa；人IL-3，例如人源化IL-3；人GM-CSF，例如人源化GM-CSF；人M-CSF，例如人源化M-CSF；人TPO，例如人源化TPO的核酸，其分別與它的相應(yīng)的非人動(dòng)物啟動(dòng)子可操作連接，例如Sirpa，IL-3，GM-CSF，M-CSF，或TPO啟動(dòng)子，其中所述動(dòng)物表達(dá)所編碼的人蛋白質(zhì)且不表達(dá)天然小鼠蛋白質(zhì)。如此，在一些實(shí)施方案中，所述經(jīng)遺傳修飾的非人動(dòng)物是小鼠且所述小鼠對(duì)于本文中公開的人基因，例如人源化基因中的一些或全部是雜合的。在一些實(shí)施方案中，所述經(jīng)遺傳修飾的非人動(dòng)物是小鼠且所述小鼠對(duì)于本文中公開的人基因，例如人源化基因中的一些或全部是純合的。

在一些實(shí)施方案中，主題非人動(dòng)物對(duì)于內(nèi)源免疫系統(tǒng)是免疫缺陷。在一些此類實(shí)施方案中，所述免疫缺陷是由Rag2和IL2rg之一或二者的缺陷引起的。

在一些實(shí)施方案中，主題經(jīng)遺傳修飾的免疫缺陷非人動(dòng)物進(jìn)一步包含人造血細(xì)胞的移入。在一些此類實(shí)施方案中，所述人造血細(xì)胞包含一種或多種選自下組的細(xì)胞：人CD34陽(yáng)性細(xì)胞，人造血干細(xì)胞，人髓樣細(xì)胞前體細(xì)胞，人類紅細(xì)胞前體細(xì)胞，人髓樣細(xì)胞，人樹突細(xì)胞，人單核細(xì)胞，人粒細(xì)胞，人紅細(xì)胞，人嗜中性粒細(xì)胞，人肥大細(xì)胞，人胸腺細(xì)胞，和人B淋巴細(xì)胞。

如本文中的實(shí)施例中證明的，包含與內(nèi)源基因座處的EPO啟動(dòng)子可操作連接的編碼人EPO蛋白質(zhì)的核酸序列的移入有人造血細(xì)胞的經(jīng)遺傳修飾的免疫缺陷非人動(dòng)物展現(xiàn)高水平的骨髓中的人紅細(xì)胞生成和與不表達(dá)人EPO的對(duì)照小鼠相比骨髓中類紅細(xì)胞譜系的人細(xì)胞的2至5倍升高。在一些實(shí)施方案中，包含與內(nèi)源基因座處的EPO啟動(dòng)子可操作連接的編碼人EPO蛋白質(zhì)的核酸序列的移入有人造血細(xì)胞的經(jīng)遺傳修飾的免疫缺陷非人動(dòng)物展現(xiàn)高水平的骨髓中的人紅細(xì)胞生成和與不表達(dá)人EPO的對(duì)照小鼠相比骨髓中類紅細(xì)胞譜系的人細(xì)胞的約2至約10倍升高，例如與不表達(dá)人EPO的對(duì)照小鼠相比骨髓中類紅細(xì)胞譜系的人細(xì)胞的約2倍，約3倍，約4倍，約5倍，約6倍，約7倍，約8倍，約9倍，或約10倍升高。照此，在一些實(shí)施方案中，主題經(jīng)移入的，經(jīng)遺傳修飾的免疫缺陷動(dòng)物包含如下的骨髓，其中20％或更多的類紅細(xì)胞(CD235+)是人類紅細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，主題經(jīng)移入的，經(jīng)遺傳修飾的免疫缺陷動(dòng)物包含如下的骨髓，其中約10％或更多，例如約20％或更多，約30％或更多，約40％或更多，或約50％或更多的類紅細(xì)胞(CD235+)是人類紅細(xì)胞。

在一些此類實(shí)施方案中，主題經(jīng)遺傳修飾的動(dòng)物是免疫缺陷小鼠，其包含與非人動(dòng)物EPO基因座處的非人動(dòng)物EPO啟動(dòng)子可操作連接的編碼人EPO蛋白質(zhì)的核酸，與非人動(dòng)物TPO基因座處的非人動(dòng)物TPO啟動(dòng)子可操作連接的編碼人TPO蛋白質(zhì)的核酸，與非人動(dòng)物Il-3基因座處的非人動(dòng)物Il-3啟動(dòng)子可操作連接的編碼人Il-3蛋白質(zhì)的核酸，與非人動(dòng)物GM-CSF基因座處的GM-CSF啟動(dòng)子可操作連接的編碼人GM-CSF蛋白質(zhì)的核酸，和與非人動(dòng)物M-CSF基因座處的非人動(dòng)物M-CSF啟動(dòng)子可操作連接的編碼人M-CSF蛋白質(zhì)的核酸，例如Rag2^-/-IL2rg^y/-Tpo^h/hMcsf^h/hIl3^h/hGmcsf^h/hEpo^h/h(“MITER-G”)小鼠。

在一些此類實(shí)施方案中，主題經(jīng)遺傳修飾的動(dòng)物是免疫缺陷小鼠，其包含與非人動(dòng)物EPO基因座處的非人動(dòng)物EPO啟動(dòng)子可操作連接的編碼人EPO蛋白質(zhì)的核酸，與非人動(dòng)物TPO基因座處的非人動(dòng)物TPO啟動(dòng)子可操作連接的編碼人TPO蛋白質(zhì)的核酸，與非人動(dòng)物Il-3基因座處的非人動(dòng)物Il-3啟動(dòng)子可操作連接的編碼人Il-3蛋白質(zhì)的核酸，與非人動(dòng)物GM-CSF基因座處的GM-CSF啟動(dòng)子可操作連接的編碼人GM-CSF蛋白質(zhì)的核酸，和與非人動(dòng)物M-CSF基因座處的非人動(dòng)物M-CSF啟動(dòng)子可操作連接的編碼人M-CSF蛋白質(zhì)的核酸，和與隨機(jī)整合入非人動(dòng)物基因組的非人動(dòng)物SIRPa啟動(dòng)子可操作連接的編碼人SIRPa蛋白質(zhì)的核酸，例如Rag2^-/-IL2rg^y/-Tpo^h/hMcsf^h/hIl3^h/hGmcsf^h/hEpo^h/hhSIRPα⁺(“MISTER-G”)小鼠。在其它此類實(shí)施方案中，編碼人SIRPa蛋白質(zhì)，例如，人源化SIRPa蛋白質(zhì)的核酸與非人動(dòng)物基因座處的非人動(dòng)物SIRPa啟動(dòng)子可操作連接，例如Rag2^-/-IL2rg^y/-Tpo^h/hMcsf^h/hIl3^h/hGmcsf^h/hEpo^h/hSIRPα^h/h(“SupER-G”)小鼠。

在一些此類實(shí)施方案中，主題經(jīng)遺傳修飾的動(dòng)物是免疫缺陷小鼠，其包含與非人動(dòng)物EPO基因座處的非人動(dòng)物EPO啟動(dòng)子可操作連接的編碼人EPO蛋白質(zhì)的核酸的一個(gè)等位基因(即，所述小鼠對(duì)于人EPO是雜合的)，與非人動(dòng)物SIRPa基因座處的非人動(dòng)物SIRPa啟動(dòng)子可操作連接的編碼人SIRPa蛋白質(zhì)，例如人源化SIRPa蛋白質(zhì)的核酸，與非人動(dòng)物TPO基因座處的非人動(dòng)物TPO啟動(dòng)子可操作連接的編碼人TPO蛋白質(zhì)的核酸，與非人動(dòng)物Il-3基因座處的非人動(dòng)物Il-3啟動(dòng)子可操作連接的編碼人Il-3蛋白質(zhì)的核酸，和與非人動(dòng)物GM-CSF基因座處的GM-CSF啟動(dòng)子可操作連接的編碼人GM-CSF蛋白質(zhì)的核酸，例如Rag2^-/-IL2rg^y/-Tpo^h/hIl3^h/hGm-csf^h/hEpo^h/mSIRPα^h/h(“TIES”)小鼠。

在一些實(shí)施方案中，當(dāng)它們包含編碼EPO蛋白質(zhì)的核酸序列的僅一個(gè)拷貝時(shí)，及當(dāng)它們包含內(nèi)源M-csf時(shí)，包含與內(nèi)源基因座處的EPO啟動(dòng)子可操作連接的編碼人EPO蛋白質(zhì)的核酸序列的移入有人造血細(xì)胞的經(jīng)遺傳修飾的免疫缺陷非人動(dòng)物可展現(xiàn)更好的存活和人紅細(xì)胞移入。這是因?yàn)榈玫角萌胫械娜薓-CSF支持的高水平的人髓樣細(xì)胞移入導(dǎo)致對(duì)小鼠紅血球的破壞，這繼而引起經(jīng)移入的小鼠貧血和死亡。另外，人EPO等位基因的雜合性相對(duì)于對(duì)于人EPO是純合的且對(duì)于小鼠EPO是無(wú)效的小鼠改善生育力，發(fā)育能力，和存活力。照此，在一些實(shí)施方案中，主題經(jīng)移入的，經(jīng)遺傳修飾的免疫受損的動(dòng)物相對(duì)于組成性表達(dá)EPO的小鼠，例如轉(zhuǎn)基因小鼠，或包含兩個(gè)拷貝的人EPO，例如EPO^h/h的小鼠展現(xiàn)改善的存活力。在一些此類實(shí)施方案中，所述經(jīng)遺傳修飾的免疫缺陷非人動(dòng)物是TIES小鼠(Rag2^-/-IL2rg^y/-Tpo^h/hIl3^h/hGm-csf^h/hEpo^h/mSIRPα^h/h)。

在一些實(shí)施方案中，注射了氯膦酸鹽脂質(zhì)體的移入有人造血細(xì)胞的經(jīng)遺傳修飾的免疫缺陷非人動(dòng)物顯示與未注射的動(dòng)物相比外周血中人類紅細(xì)胞(CD235+)數(shù)目的1000倍升高。在一些實(shí)施方案中，注射了氯膦酸鹽脂質(zhì)體的移入有人造血細(xì)胞的經(jīng)遺傳修飾的免疫缺陷非人動(dòng)物顯示與未注射的動(dòng)物相比外周血中人類紅細(xì)胞(CD235+)數(shù)目的約10倍或更大，約50倍或更大，約100倍或更大，約500倍或更大，或約1000倍或更大升高。在這些人類紅細(xì)胞中，10％或更多，20％或更多，30％或更多，40％或更多，或50％或更多可以是網(wǎng)織紅細(xì)胞(紅細(xì)胞前體，CD71+)。照此，在一些實(shí)施方案中，主題經(jīng)移入的，經(jīng)遺傳修飾的免疫缺陷動(dòng)物包含如下的外周血，其中1％或更多，例如5％或更多或10％或更多的類紅細(xì)胞(CD235+)是人類紅細(xì)胞，而且10％或更多，例如20％或更多，30％或更多，40％或更多，或50％或更多的那些人類紅細(xì)胞是人網(wǎng)織紅細(xì)胞(CD71+)。在一些此類實(shí)施方案中，主題經(jīng)移入的，經(jīng)遺傳修飾的免疫缺陷非人動(dòng)物是MISTER-G小鼠，SupER-G小鼠，或TIES小鼠。

在一些實(shí)施方案中，所述非人動(dòng)物進(jìn)一步包含靶向類紅細(xì)胞譜系的人細(xì)胞的病原體感染。在一些此類實(shí)施方案中，所述病原體選自瘧原蟲(Plasmodium sp.)，巴貝蟲(Babesia sp.)，和泰勒蟲(Theileri sp.)。在一些實(shí)施方案中，所述感染是通過(guò)將寄生蟲注射入非人動(dòng)物而產(chǎn)生的。在一些實(shí)施方案中，所述感染是通過(guò)將受到寄生蟲感染的人類紅細(xì)胞注射入非人動(dòng)物而產(chǎn)生的。在一些實(shí)施方案中，所述感染是通過(guò)將受到寄生蟲感染的人類紅細(xì)胞和健康人類紅細(xì)胞注射入非人動(dòng)物而產(chǎn)生的。

在本發(fā)明的一些方面，提供了用于鑒定抑制靶向類紅細(xì)胞譜系的人細(xì)胞的病原體感染的藥劑的方法。

在一些實(shí)施方案中，所述方法包括對(duì)經(jīng)遺傳修飾的非人動(dòng)物施用候選藥劑，其中所述動(dòng)物包含與EPO基因啟動(dòng)子可操作連接的編碼人EPO蛋白質(zhì)的核酸序列，一種或多種在所述非人動(dòng)物中導(dǎo)致免疫缺陷的基因突變，人造血細(xì)胞的移入，和靶向類紅細(xì)胞譜系的人細(xì)胞的病原體的感染；并測(cè)定該藥劑是否降低病原體感染的非人動(dòng)物中所述病原體的量。

在一些實(shí)施方案中，所述方法包括使包含與EPO基因啟動(dòng)子可操作連接的編碼人EPO蛋白質(zhì)的核酸序列的移入有人造血細(xì)胞的，經(jīng)遺傳修飾的免疫缺陷非人動(dòng)物與氯膦酸鹽接觸；對(duì)接觸了氯膦酸鹽的非人動(dòng)物的施用候選藥劑；對(duì)所述經(jīng)遺傳修飾的非人動(dòng)物注射受到寄生蟲感染的網(wǎng)織紅細(xì)胞或紅細(xì)胞；并測(cè)定該藥劑是否預(yù)防所述非人動(dòng)物的人網(wǎng)織紅細(xì)胞和/或紅細(xì)胞感染。

在一些實(shí)施方案中，所述病原體選自瘧原蟲，巴貝蟲，和泰勒蟲。在一些此類實(shí)施方案中，所述病原體選自鐮狀瘧原蟲(P.falciparum)和間日瘧原蟲(P.vivax)。在一些實(shí)施方案中，所述非人動(dòng)物是哺乳動(dòng)物。在一些此類實(shí)施方案中，所述哺乳動(dòng)物是嚙齒動(dòng)物。在某些此類實(shí)施方案中，所述嚙齒動(dòng)物是小鼠。

在本發(fā)明的一些方面，提供了用于生成表達(dá)人EPO的小鼠的方法。在一些實(shí)施方案中，所述方法包括使小鼠多能干細(xì)胞與包含與EPO啟動(dòng)子序列可操作連接的人EPO蛋白質(zhì)或其片段的編碼序列的核酸序列接觸，其中所述編碼序列和EPO啟動(dòng)子序列形成側(cè)翼為與內(nèi)源小鼠EPO基因座同源的序列的盒；在促進(jìn)該核酸序列通過(guò)同源重組在內(nèi)源小鼠EPO基因座處整合入小鼠基因組的條件下培養(yǎng)該多能干細(xì)胞；并自包含編碼人EPO蛋白質(zhì)的核酸序列的小鼠多能干細(xì)胞生成小鼠。

在一些實(shí)施方案中，所述小鼠多能干細(xì)胞是胚胎干(ES)細(xì)胞或誘導(dǎo)的多能干(iPS)細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，所述小鼠多能干細(xì)胞對(duì)于Rag2和/或IL2rg是缺陷的。在一些實(shí)施方案中，所述EPO啟動(dòng)子序列是人EPO啟動(dòng)子的序列。在其它實(shí)施方案中，所述EPO啟動(dòng)子序列是內(nèi)源非人EPO啟動(dòng)子的序列。在一些實(shí)施方案中，所述整合導(dǎo)致非人EPO基因基因座處的非人EPO基因的置換。在一些實(shí)施方案中，所述編碼人EPO蛋白質(zhì)的核酸序列包含人EPO基因組編碼和非編碼序列。在一些實(shí)施方案中，所述編碼人EPO蛋白質(zhì)的核酸序列包含人EPO cDNA序列。

在本發(fā)明的一些方面，提供了用于生成表達(dá)人EPO蛋白質(zhì)且包含人造血系統(tǒng)的小鼠的方法。在一些實(shí)施方案中，所述方法包括將包含人造血祖細(xì)胞的細(xì)胞群體移植入通過(guò)本公開內(nèi)容的方法生成的經(jīng)遺傳修飾的免疫缺陷小鼠。在一些實(shí)施方案中，所述移植包含尾靜脈注射，胎肝注射，或眶后注射。在一些實(shí)施方案中，所述經(jīng)遺傳修飾的免疫缺陷小鼠在移植之前經(jīng)過(guò)亞致死照射。在一些實(shí)施方案中，所移植的人造血祖細(xì)胞是CD34+細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，所述人造血祖細(xì)胞來(lái)自胎肝，成人骨髓，或臍帶血。

在本發(fā)明的一些方面，提供了用于生成受到靶向類紅細(xì)胞譜系的人細(xì)胞的人病原體感染的小鼠的方法。在一些實(shí)施方案中，所述方法包括依照本公開內(nèi)容的方法生成表達(dá)人EPO蛋白質(zhì)且包含人造血系統(tǒng)的小鼠，對(duì)經(jīng)移入的小鼠注射氯膦酸鹽，并對(duì)注射了氯膦酸鹽的小鼠注射受到寄生蟲感染的人紅血球(PRBC)。在一些實(shí)施方案中，所述方法進(jìn)一步包括將健康人紅血球注射入所述小鼠。在一些實(shí)施方案中，所述寄生蟲選自瘧原蟲，巴貝蟲，和泰勒蟲。在某些實(shí)施方案中，所述瘧原蟲選自鐮狀瘧原蟲和間日瘧原蟲。

附圖簡(jiǎn)述

在結(jié)合附圖閱讀時(shí)自以下詳細(xì)描述最好地理解本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)強(qiáng)調(diào)，依照慣例，附圖的各個(gè)特征不是按比例的。相反，為了清楚，各個(gè)特征的尺寸是任意擴(kuò)大或縮小的。附圖中包括下述圖。

圖1提供小鼠EPO(SEQ ID NO：2)與人EPO(SEQ ID NO：4)的蛋白質(zhì)比對(duì)。標(biāo)有下劃線的殘基是在這兩種物種之間保守的殘基。

圖2提供敲入編碼人EPO的核酸序列之前和之后的野生型小鼠EPO基因座的示意圖。

圖3提供人EPO敲入等位基因的示意圖。

圖4提供敲入編碼人源化Sirpa的核酸序列之前(上)和之后(下)的野生型小鼠Sirpa基因座的示意圖。

圖5，小圖A和B，顯示HSC移入的小鼠中人類紅細(xì)胞的頻率。(小圖A)HSC移入包含自小鼠EPO基因座表達(dá)的人EPO(“hEPO+”)和/或作為小鼠基因組中的隨機(jī)整合物表達(dá)的人SIRPa(“hSIRPa+”)所示組合的Rag2^-/-Il2rg^-/-Tpo^h/hIL3^h/hGmcsf^h/hMcsf^h/h小鼠(“MITRG小鼠”)之后6-8周骨髓中的人CD235a⁺紅細(xì)胞移入。(小圖B)在hEPO存在較之缺失下HSC移入的Rag2^-/-I12rg^無(wú)效Tpo^h/hMcsf^h/hIl3^h/hGmcsf^h/hEpo^h/hSIRPα^h/h(“SupER-G”)小鼠較之Rag2^-/-Il2rg^無(wú)效Tpo^h/hIl3^h/hGmcsf^h/hSirpa^h/h(“RGSKI-TI”)對(duì)照小鼠之后6-8周外周血中人CD235a⁺紅細(xì)胞的頻率。

圖6，小圖A和B，證明了氯膦酸鹽處理增加HSC移入的小鼠中的循環(huán)人類紅細(xì)胞和網(wǎng)織紅細(xì)胞。在HSC移入之后7周，連續(xù)3-5天用每天眶后注射50μl氯膦酸鹽脂質(zhì)體處理SupER-G小鼠。通過(guò)FACS測(cè)量外周血中人CD235⁺細(xì)胞(紅細(xì)胞和網(wǎng)織紅細(xì)胞)(小圖A)和CD235⁺/CD71⁺細(xì)胞(網(wǎng)織紅細(xì)胞)(小圖B)的頻率。小圖B：用氯膦酸鹽處理之后的3只不同小鼠。

圖7，小圖A-C，圖解自經(jīng)移入的小鼠生成的人RBC如何對(duì)鐮狀瘧原蟲感染易感。對(duì)SupER-G小鼠移入胎肝或成人HSC。移入之后7周，連續(xù)3天用每天眶后注射50μl氯膦酸鹽脂質(zhì)體處理小鼠，之后收集血液。然后將血液樣品與經(jīng)過(guò)純化的鐮狀瘧原蟲3D7血液階段寄生蟲感染RBC(99％純度)共培養(yǎng)。感染后48小時(shí)將新鮮的人RBC添加入培養(yǎng)物并將感染培養(yǎng)物再維持10天。實(shí)施吉姆薩染色和定量PCR以量化寄生蟲血癥。人RBC對(duì)照：人RBC；小鼠RBC對(duì)照：來(lái)自未移入的小鼠的RBC；小鼠RBC攙混對(duì)照：攙混0.1％hRBC的來(lái)自未移入的小鼠的RBC。在小圖A中，紅色：抗人Band3；藍(lán)色：Hoechst。在小圖C中，從上到下列出的圖例標(biāo)識(shí)符對(duì)應(yīng)于從左到右的條形圖x軸。

圖8顯示在氯膦酸鹽缺失下小鼠外周血中人RBC的破壞。用氯膦酸鹽或PBS處理未移入的小鼠。對(duì)于氯膦酸鹽處理，小鼠連續(xù)3天接受每天眶后注射50μl氯膦酸鹽。對(duì)于PBS處理，僅僅在人RBC輸注之前1小時(shí)投遞500μl PBS。將人RBC輸注入經(jīng)過(guò)預(yù)處理的小鼠并在所示時(shí)間點(diǎn)收集外周血。顯示了氯膦酸鹽和PBS曲線。

發(fā)明詳述

提供了自動(dòng)物基因組表達(dá)人EPO的經(jīng)遺傳修飾的非人動(dòng)物。還提供了用于生成自非人動(dòng)物基因組表達(dá)人EPO的非人動(dòng)物的方法，及用于使用自非人動(dòng)物基因組表達(dá)人EPO的非人動(dòng)物的方法。這些動(dòng)物和方法在本領(lǐng)域中有許多用途，包括例如人紅細(xì)胞生成和紅細(xì)胞功能的建模；紅細(xì)胞的人病原體感染的建模；例如在健康或患病狀態(tài)，調(diào)控紅細(xì)胞生成和/或紅細(xì)胞功能的藥劑的體內(nèi)篩選；對(duì)紅細(xì)胞或紅細(xì)胞祖先有毒性的藥劑的體內(nèi)篩選；預(yù)防，減輕，或逆轉(zhuǎn)有毒藥劑對(duì)紅細(xì)胞或紅細(xì)胞祖先的毒性影響的藥劑的體內(nèi)篩選；來(lái)自個(gè)體的紅細(xì)胞或紅細(xì)胞祖先的體內(nèi)篩選以預(yù)測(cè)個(gè)體對(duì)疾病療法的響應(yīng)性。在閱讀下文更加完整描述的組合物和方法的詳情后，本發(fā)明的這些和其它目的，優(yōu)點(diǎn)和特征對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言會(huì)變得顯而易見。

在描述本方法和組合物前，應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明不限于描述的具體方法和組合物，因?yàn)槠洚?dāng)然可以有所變化。還應(yīng)當(dāng)理解，本文中所使用的術(shù)語(yǔ)僅為了描述具體的實(shí)施方案，而并不意圖是限制性的，因?yàn)楸景l(fā)明的范圍僅會(huì)以所附權(quán)利要求書為限。本發(fā)明不限于所討論的特定實(shí)施方案，而是由授權(quán)權(quán)利要求來(lái)描述。

除非上下文另有明確說(shuō)明，在提供數(shù)值范圍的情況中，理解為還具體公開該范圍的上限和下限之間的每個(gè)居間數(shù)值，間隔為下限的單位的十分之一。所述范圍中的任何所述數(shù)值或居間數(shù)值和該所述范圍中的任何其它所述或居間數(shù)值之間的每個(gè)更小范圍涵蓋在本發(fā)明內(nèi)。該范圍中可獨(dú)立地包括或排除這些更小范圍的上限和下限，而且上下限任一，無(wú)一或均包括在更小范圍中的每個(gè)范圍也涵蓋在本發(fā)明內(nèi)，服從所述范圍中任何具體排除的上下限。在所述范圍包括上下限之一或二者的情況中，排除上下限之一或二者的范圍也包括在本發(fā)明中。

除非另有定義，本文中使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員的通常理解相同的含義。雖然可以在本發(fā)明的實(shí)施或測(cè)試中使用與本文中描述的方法和材料類似或等同的任何方法和材料，但是現(xiàn)在描述一些潛在和優(yōu)選的方法和材料。通過(guò)提及將本文中提及的所有出版物收入本文以公開及描述引用的出版物有關(guān)的方法和/或材料。應(yīng)當(dāng)理解，在存在矛盾的情況下，本公開內(nèi)容替代收錄的出版物的任何矛盾公開內(nèi)容。

如本領(lǐng)域技術(shù)人員在閱讀本公開內(nèi)容后會(huì)顯而易見的，本文中描述并例示的每個(gè)單獨(dú)實(shí)施方案具有離散組分和特征，其可以在不偏離本發(fā)明范圍或精神的前提下容易地與任何其它幾個(gè)實(shí)施方案的特征分開或組合?？梢砸詳⑹鍪录拇涡蚧蛞赃壿嬌峡赡艿娜魏纹渌涡?qū)嵤┤魏螖⑹龅姆椒ā?/p>

必須注意到，如本文中及所附權(quán)利要求書中使用的，單數(shù)形式“一種”，“一個(gè)”和“該/所述”包括復(fù)數(shù)個(gè)提及物，除非上下文另有明確指示。如此，例如，提及“細(xì)胞”包括多個(gè)/種此類細(xì)胞，且提及“該/所述肽”包括提及一個(gè)/種或多個(gè)/種肽及本領(lǐng)域技術(shù)人員知道的其等同物，例如多肽，等等。

本文中討論的出版物僅提供其在本申請(qǐng)?zhí)峤荒壳暗墓_內(nèi)容。本文中的內(nèi)容均不應(yīng)解釋為承認(rèn)憑借在先發(fā)明，本發(fā)明沒(méi)有資格早于此類出版物。而且，提供的公開日可能不同于實(shí)際的公開日，可能需要獨(dú)立確認(rèn)。

經(jīng)遺傳修飾的非人動(dòng)物

在本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了經(jīng)過(guò)遺傳修飾而自它們的基因組表達(dá)一種或多種人蛋白質(zhì)的非人動(dòng)物。在本發(fā)明的一些方面，所述人蛋白質(zhì)是人促紅細(xì)胞生成素(hEPO)蛋白質(zhì)(SEQ ID NO：4)。換言之，所述經(jīng)遺傳修飾的非人動(dòng)物在它的基因組中包含編碼人EPO(hEPO)蛋白質(zhì)的核酸序列。例如，所述非人動(dòng)物可以在它的基因組中包含包含人EPO基因組編碼和非編碼序列的核酸序列，例如染色體7核苷酸100318423-100321323處的序列或其部分?；蛘撸龇侨藙?dòng)物可以在它的基因組中包含包含人EPO cDNA序列(SEQ ID NO：3)或其部分的核酸序列。在一些情況中，所述非人動(dòng)物經(jīng)過(guò)進(jìn)一步遺傳修飾，從而自所述非人動(dòng)物的基因組表達(dá)一種或多種別的人蛋白質(zhì)。在一些此類實(shí)施方案中，這些一種或多種別的人蛋白質(zhì)是促進(jìn)人造血細(xì)胞發(fā)育和/或功能的人蛋白質(zhì)，例如人信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白α(hSIRPa)蛋白質(zhì)(NCBI基因ID：140885，GenBank登錄號(hào)NM_080792.2，NM_001040022.1，NM_001040023.1)，人白介素3(hIL-3)蛋白質(zhì)(NCBI基因ID：3562，GenBank登錄號(hào)NM_000588.3)，人集落刺激因子2(粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞)(hGM-CSF)蛋白質(zhì)(NCBI基因ID：1437，GenBank登錄號(hào)NM_000758.3)，人集落刺激因子1(巨噬細(xì)胞)(hM-CSF)蛋白質(zhì)(NCBI基因ID：1435，GenBank登錄號(hào)NM_000757.5，NM_172210.2，NM 172211.3，和NM_172212.2)，人血小板生成素(hTPO)蛋白質(zhì)(NCBI基因ID：7066，GenBank登錄號(hào)NM_000460.3，NM_001177597.2，NM_001177598.2，NM_001289997.1，NM_001290003.1，NM_001290022.1，NM_001290026.1，NM_001290027.1，NM_001290027.1)，人白介素6(hIL6)蛋白質(zhì)(NCBI基因ID：3569，GenBank登錄號(hào)NM_000600.3)，等等。

熟練技術(shù)人員會(huì)領(lǐng)會(huì)，在“野生型”或“天然”人核酸和蛋白質(zhì)外，術(shù)語(yǔ)“人核酸”和“人蛋白質(zhì)”還涵蓋野生型人核酸和蛋白質(zhì)的變體。如本文中使用的，術(shù)語(yǔ)“變體”定義人多肽或核酸序列的分離的天然存在遺傳突變體或人多肽或核酸序列的重組制備變異，它們與相應(yīng)的野生型人核酸或多肽序列相比各含有一處或多處突變。例如，此類突變可以是一處或多處氨基酸替代，添加，和/或刪除。術(shù)語(yǔ)“變體”還包括人同系物和直向同系物。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的變體多肽與野生型人多肽具有70％或更高同一性，例如75％，80％，或85％或更高同一性，例如與野生型人多肽具有90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％同一性。

可以使用本領(lǐng)域的任何便利技術(shù)(例如比對(duì)序列，使用例如公知可得的軟件進(jìn)行)測(cè)定兩種序列間的百分比同一性。可以使用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)(諸如定點(diǎn)誘變，PCR介導(dǎo)的誘變，定向進(jìn)化，等等)來(lái)引入突變。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到可以在不改變氨基酸序列的情況中引入一處或多處核酸替代，而且可以在不改變?nèi)说鞍踪|(zhì)的功能特性的情況中引入一處或多處氨基酸突變。

可以在人蛋白質(zhì)中做出保守氨基酸替代以生成人蛋白質(zhì)變體。保守氨基酸替代表示公認(rèn)的用一種氨基酸替代另一種具有相似特征的氨基酸。例如，每種氨基酸可以描述為具有一種或多種下述特征：電正性，電負(fù)性，脂肪族，芳香族，極性，疏水性和親水性。保守替代是用一種具有規(guī)定的結(jié)構(gòu)或功能特征的氨基酸替代另一種具有相同特征的氨基酸。酸性氨基酸包括天冬氨酸，谷氨酸；堿性氨基酸包括組氨酸，賴氨酸，精氨酸；脂肪族氨基酸包括異亮氨酸，亮氨酸和纈氨酸；芳香族氨基酸包括苯丙氨酸，甘氨酸，酪氨酸和色氨酸；極性氨基酸包括天冬氨酸，谷氨酸，組氨酸，賴氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，精氨酸，絲氨酸，蘇氨酸和酪氨酸；并且疏水性氨基酸包括丙氨酸，半胱氨酸，苯丙氨酸，甘氨酸，異亮氨酸，亮氨酸，甲硫氨酸，脯氨酸，纈氨酸和色氨酸；并且保守替代包括每組內(nèi)氨基酸間的替代。氨基酸也可以就相對(duì)大小而言描述，通常認(rèn)為丙氨酸，半胱氨酸，天冬氨酸，甘氨酸，天冬酰胺，脯氨酸，蘇氨酸，絲氨酸，纈氨酸都是較小的。

人變體可以包含合成的氨基酸類似物，氨基酸衍生物和/或非標(biāo)準(zhǔn)氨基酸，例示性包括但不限于α-氨基丁酸，瓜氨酸，刀豆氨酸，氰丙氨酸，二氨基丁酸，二氨基庚二酸，二羥基苯丙氨酸，黎豆氨酸，高精氨酸，羥脯氨酸，正亮氨酸，正纈氨酸，3-磷酸絲氨酸，高絲氨酸，5-羥基色氨酸，1-甲基組氨酸，甲基組氨酸，和鳥氨酸。

人變體通常會(huì)由與編碼野生型人蛋白質(zhì)的核酸具有高度同一性的核酸編碼。在一些實(shí)施方案中，編碼人變體的核酸的互補(bǔ)物在高嚴(yán)格性條件下與編碼野生型人的核酸特異性雜交?？梢允褂霉姆椒ǚ蛛x或重組或合成生成編碼人變體的核酸。

在“野生型”或“天然”人蛋白質(zhì)及其“變體”以外，如本文中使用的，例如在“人EPO蛋白質(zhì)(hEPO)”，“人SIRPa蛋白質(zhì)(hSIRPa)”，“人IL-3蛋白質(zhì)(hIL-3)”，“人GM-CSF蛋白質(zhì)(hGM-CSF)”，“人M-CSF蛋白質(zhì)(hM-CSF)”，“人TPO蛋白質(zhì)(hTPO)”，和“人IL-6蛋白質(zhì)(hIL-6)”的語(yǔ)境中，術(shù)語(yǔ)“人蛋白質(zhì)”涵蓋融合蛋白，即嵌合蛋白，它們包括野生型人蛋白質(zhì)(或其變體)的一個(gè)或多個(gè)片段且保留野生型人蛋白質(zhì)的一種或多種功能s，例如一種或多種信號(hào)傳導(dǎo)和/或受體功能。包括野生型人蛋白質(zhì)(或其變體)的一個(gè)或多個(gè)片段(例如與一個(gè)或多個(gè)非人肽或多肽組合的)的融合蛋白在本文中也可以稱作“人源化蛋白質(zhì)”。如此，術(shù)語(yǔ)“人SIRPα蛋白質(zhì)”涵蓋例如包括與野生型小鼠SIRPα蛋白質(zhì)的信號(hào)傳導(dǎo)域融合的野生型人SIRPα蛋白質(zhì)的胞外域的氨基酸序列的蛋白質(zhì)。

因此，編碼人蛋白質(zhì)的核酸序列是包括人蛋白質(zhì)，例如野生型人蛋白質(zhì)，野生型人蛋白質(zhì)的變體，野生型人蛋白質(zhì)(或其變體)的保留野生型人蛋白質(zhì)的一種或多種功能，例如一種或多種信號(hào)傳導(dǎo)和/或受體功能的片段，或包括野生型人蛋白質(zhì)(或其變體)的一個(gè)或多個(gè)片段且保留野生型人蛋白質(zhì)的一種或多種功能，例如一種或多種信號(hào)傳導(dǎo)和/或受體功能的融合蛋白，例如嵌合蛋白的編碼序列的多核苷酸。

典型地，在本公開內(nèi)容的經(jīng)遺傳修飾的動(dòng)物中，編碼人蛋白質(zhì)，例如hEPO蛋白質(zhì)，hSIRPa蛋白質(zhì)，hIL-3蛋白質(zhì)，hGM-CSF蛋白質(zhì)，hM-CSF蛋白質(zhì)，hTPO蛋白質(zhì)，hIL-6蛋白質(zhì)，等的核酸是與一種或多種DNA調(diào)節(jié)元件可操作連接的。DNA調(diào)節(jié)元件包括提供和/或調(diào)節(jié)編碼序列在宿主細(xì)胞中表達(dá)的轉(zhuǎn)錄和翻譯控制序列，諸如啟動(dòng)子，增強(qiáng)子，多腺苷酸化信號(hào)，終止子，等等。例如，“啟動(dòng)子”或“啟動(dòng)子序列”指能夠結(jié)合細(xì)胞中的RNA聚合酶并啟動(dòng)下游(3′方向)編碼序列轉(zhuǎn)錄的DNA調(diào)節(jié)區(qū)。啟動(dòng)子序列在它的3′末端以轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)為界且向上游(5′方向)延伸以包括以超出背景的可檢測(cè)水平啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄必需的最小數(shù)目的堿基或元件。在啟動(dòng)子序列內(nèi)會(huì)找到轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)以及負(fù)責(zé)RNA聚合酶結(jié)合的蛋白質(zhì)結(jié)合域。真核啟動(dòng)子常常但非總是會(huì)含有“TATA”框和“CAT”框。對(duì)本公開內(nèi)容特別感興趣的是DNA調(diào)節(jié)元件，例如以相同的空間和時(shí)間表達(dá)樣式(即，關(guān)于對(duì)相應(yīng)的內(nèi)源蛋白質(zhì)觀察到的，在相同的細(xì)胞和組織中及在相同的時(shí)間)推動(dòng)人蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子。

在一些實(shí)施方案中，主題非人動(dòng)物中編碼人蛋白質(zhì)的核酸序列是與該基因的人啟動(dòng)子可操作連接的，例如，如果人啟動(dòng)子推動(dòng)人蛋白質(zhì)在非人動(dòng)物中的正確空間和時(shí)間表達(dá)的話。或者，主題非人動(dòng)物中編碼人蛋白質(zhì)的核酸序列是與來(lái)自相應(yīng)的非人動(dòng)物基因的非人動(dòng)物啟動(dòng)子可操作連接的。如此，例如，就表達(dá)hEPO蛋白質(zhì)的非人動(dòng)物而言，在一些實(shí)施方案中，編碼hEPO蛋白質(zhì)的核酸是與人EPO啟動(dòng)子可操作連接的。在其它情況中，編碼人EPO蛋白質(zhì)的核酸是與非人EPO啟動(dòng)子可操作連接的。在還有其它情況中，編碼人EPO蛋白質(zhì)的核酸是與內(nèi)源非人EPO啟動(dòng)子可操作連接的。

在一些情況中，人蛋白質(zhì)是自非人動(dòng)物中相應(yīng)的基因基因座表達(dá)的。在某些情況中，編碼人蛋白質(zhì)的核酸序列替換編碼相應(yīng)的非人動(dòng)物蛋白質(zhì)的核酸序列。在其它情況中，人蛋白質(zhì)是自非人動(dòng)物中除相應(yīng)的非人基因的基因座以外的基因組位點(diǎn)表達(dá)的。如此，例如，就表達(dá)hEPO蛋白質(zhì)的非人動(dòng)物而言，在一些實(shí)施方案中，hEPO蛋白質(zhì)是自非人動(dòng)物基因組的EPO基因座表達(dá)的。在某些實(shí)施方案中，非人動(dòng)物包含編碼hEPO蛋白質(zhì)的核酸序列對(duì)編碼內(nèi)源EPO的核酸序列的替換。在其它實(shí)施方案中，hEPO是自非人動(dòng)物中除非人動(dòng)物EPO基因座以外的基因組位點(diǎn)表達(dá)的。

在一些情況中，經(jīng)遺傳修飾的非人動(dòng)物包含一個(gè)拷貝的編碼人蛋白質(zhì)的核酸序列。例如，非人動(dòng)物對(duì)于編碼人蛋白質(zhì)的核酸序列可以是雜合的，即，基因座處的一個(gè)等位基因是經(jīng)過(guò)遺傳修飾的，而另一個(gè)等位基因是內(nèi)源等位基因。在其它情況中，經(jīng)遺傳修飾的非人動(dòng)物包含兩個(gè)拷貝的編碼人蛋白質(zhì)的核酸序列。例如，非人動(dòng)物對(duì)于編碼人蛋白質(zhì)的核酸序列可以是純合的，即，雙倍體基因組中的基因座的兩個(gè)等位基因均是經(jīng)過(guò)遺傳修飾而編碼人蛋白質(zhì)的，例如兩個(gè)等位基因均包含編碼人蛋白質(zhì)的核酸序列對(duì)編碼內(nèi)源蛋白質(zhì)的核酸序列的替換。如此，例如，就表達(dá)hEPO蛋白質(zhì)的非人動(dòng)物而言，如上文討論的，編碼hEPO的核酸序列可以整合入非人動(dòng)物EPO基因座。在一些此類實(shí)施方案中，經(jīng)遺傳修飾的非人動(dòng)物對(duì)于編碼hEPO蛋白質(zhì)的核酸序列是雜合的，即經(jīng)遺傳修飾的非人動(dòng)物包含一個(gè)包含編碼hEPO的核酸的等位基因和一個(gè)編碼內(nèi)源EPO的等位基因。換言之，所述動(dòng)物是EPO^h/m動(dòng)物，其中“h”代表包含人序列的等位基因而“m”代表內(nèi)源等位基因。在其它此類實(shí)施方案中，經(jīng)遺傳修飾的非人動(dòng)物對(duì)于編碼hEPO蛋白質(zhì)的核酸序列的是純合的，即雙倍體基因組中的基因座的兩個(gè)等位基因均會(huì)包含編碼hEPO蛋白質(zhì)的核酸序列。換言之，所述動(dòng)物是EPO^h/h動(dòng)物。

在一些情況中，所述非人動(dòng)物還表達(dá)相應(yīng)的非人動(dòng)物蛋白質(zhì)。例如，編碼人蛋白質(zhì)(例如hEPO)的核酸序列可以位于動(dòng)物的基因組內(nèi)除非人動(dòng)物基因的基因座(例如mEPO基因座)以外的位點(diǎn)。作為第二個(gè)例子，編碼人蛋白質(zhì)(例如hEPO)的核酸序列可以位于相應(yīng)的動(dòng)物基因基因座(例如mEPO基因座)，其中它以容許動(dòng)物編碼序列連續(xù)表達(dá)的方式整合入動(dòng)物基因基因座，例如，人編碼序列插入動(dòng)物編碼序列的上游或下游且兩個(gè)編碼序列之間包括2A肽序列或IRES序列。作為第三個(gè)例子，編碼人蛋白質(zhì)(例如hEPO)的核酸序列可以以破壞動(dòng)物編碼序列表達(dá)的方式位于相應(yīng)的動(dòng)物基因基因座(例如mEPO基因座)，例如作為替換部分或整個(gè)動(dòng)物編碼序列，但是所述非人動(dòng)物對(duì)于插入，即“敲入”等位基因育種成雜合的，即攜帶一個(gè)敲入等位基因和一個(gè)野生型等位基因。在其它情況中，所述非人動(dòng)物不表達(dá)相應(yīng)的非人動(dòng)物蛋白質(zhì)。例如，編碼人蛋白質(zhì)(例如hEPO)的核酸序列可以以破壞動(dòng)物編碼序列表達(dá)的方式位于相應(yīng)的動(dòng)物基因基因座(例如mEPO基因座)，例如作為替換部分或整個(gè)動(dòng)物編碼序列，例如，通過(guò)替換非人動(dòng)物編碼序列，而且所述動(dòng)物對(duì)于插入，即“敲入”等位基因是純合的。

可以依照主題公開內(nèi)容遺傳修飾任何非人哺乳動(dòng)物。非限制性例子包括實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物，家畜，牲畜等，例如諸如鼠，嚙齒類，犬，貓，豬，馬，牛，綿羊，非人靈長(zhǎng)類等物種；例如小鼠，大鼠，家兔，倉(cāng)鼠，豚鼠，牛，豬，綿羊，山羊，和其它轉(zhuǎn)基因動(dòng)物物種，特別是哺乳動(dòng)物物種，如本領(lǐng)域中已知的。在其它實(shí)施方案中，所述非人動(dòng)物可以是鳥，例如雞形目(Galliformes)的，諸如雞，火雞，鵪鶉，雉，或山鶉；例如雁形目(Anseriformes)的，諸如鴨，鵝，或天鵝，例如鴿形目(Columbiformes)的，諸如家鴿(pigeon)或野鴿(dove)。在各種實(shí)施方案中，主題經(jīng)遺傳修飾的動(dòng)物是小鼠，大鼠或家兔。

在一個(gè)實(shí)施方案中，非人動(dòng)物是哺乳動(dòng)物。在一些此類實(shí)施方案中，非人動(dòng)物是小型哺乳動(dòng)物，例如跳鼠總科(Dipodoidea)或鼠總科(Muroidea)的。在一個(gè)實(shí)施方案中，經(jīng)遺傳修飾的動(dòng)物是嚙齒類。在一個(gè)實(shí)施方案中，嚙齒類選自小鼠，大鼠，和倉(cāng)鼠。在一個(gè)實(shí)施方案中，嚙齒類選自鼠總科。在一個(gè)實(shí)施方案中，經(jīng)遺傳修飾的動(dòng)物來(lái)自選自下述的科：麗倉(cāng)鼠科(Calomyscidae)(例如小鼠樣倉(cāng)鼠)，倉(cāng)鼠科(Cricetidae)(例如倉(cāng)鼠，新世界(New World)大鼠和小鼠，田鼠)，鼠科(Muridae)(真小鼠和大鼠，沙鼠，多刺小鼠(spiny mice)，鬃毛大鼠(crested rats))，馬島鼠科(Nesomyidae)(攀爬小鼠(climbing mice)，巖石小鼠(rock mice)，白尾大鼠(white-tailed rat)，馬達(dá)加斯加(Malagasy)大鼠和小鼠)，刺山鼠科(Platacanthomyidae)(例如多刺睡鼠(spiny dormice))，和鼢鼠科(Spalacidae)(例如鼴鼠(mole rates)，竹鼠(bamboo rat)，和鼢鼠(zokors))。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，經(jīng)遺傳修飾的嚙齒類選自真小鼠或大鼠(鼠科)，沙鼠，多刺小鼠，和鬃毛大鼠。

在一個(gè)實(shí)施方案中，主題經(jīng)遺傳修飾的非人動(dòng)物是大鼠。在一個(gè)此類實(shí)施方案中，大鼠選自Wistar大鼠，LEA品系，Sprague Dawley品系，F(xiàn)ischer品系，F(xiàn)344，F(xiàn)6，和Dark Agouti。在另一個(gè)實(shí)施方案中，大鼠品系是選自下組的兩種或更多種品系的混合物：Wistar，LEA，Sprague Dawley，F(xiàn)ischer，F(xiàn)344，F(xiàn)6，和Dark Agouti。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，主題經(jīng)遺傳修飾的非人動(dòng)物是小鼠，例如C57BL品系的小鼠(例如C57BL/A，C57BL/An，C57BL/GrFa，C57BL/KaLwN，C57BL/6，C57BL/6J，C57BL/6ByJ，C57BL/6NJ，C57BL/10，C57BL/10ScSn，C57BL/10Cr，C57BL/Ola等)；129品系的小鼠(例如129P1，129P2，129P3，129X1，129S1(例如129S1/SV，129S1/SvIm)，129S2，129S4，129S5，129S9/SvEvH，129S6(129/SvEvTac)，129S7，129S8，129T1，129T2)；BALB品系的小鼠(例如BALB/c)；等等。參見例如Festing等(1999)Mammalian Genome 10：836，還可參見Auerbach等(2000)Establishment and Chimera Analysis of 129/SvEv-and C57BL/6-Derived Mouse Embryonic Stem Cell Lines。在一個(gè)實(shí)施方案中，經(jīng)遺傳修飾的小鼠是前述129品系和前述C57BL/6品系的混合物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，小鼠是前述129品系的混合物，或前述BL/6品系的混合物。在又一個(gè)實(shí)施方案中，小鼠是BALB品系和另一種前述品系的混合物。

在一些實(shí)施方案中，主題經(jīng)遺傳修飾的非人動(dòng)物還是免疫缺陷的?！懊庖呷毕荨卑▌?dòng)物的天然或內(nèi)源免疫系統(tǒng)的一個(gè)或多個(gè)方面的缺陷，例如，所述動(dòng)物是一種或多種類型的發(fā)揮功能的宿主免疫細(xì)胞缺陷的，例如非人B細(xì)胞數(shù)目和/或功能，非人T細(xì)胞數(shù)目和/或功能，非人NK細(xì)胞數(shù)目和/或功能，等缺陷的。

在主題動(dòng)物中實(shí)現(xiàn)免疫缺陷的一種方法是亞致死照射?；蛘?，可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的多種基因突變?nèi)我粊?lái)實(shí)現(xiàn)免疫缺陷，它們?nèi)我豢梢詥为?dú)地或組合地育種成本公開內(nèi)容的主題經(jīng)遺傳修飾的非人動(dòng)物，或者可用作其中引入主題公開內(nèi)容的遺傳修飾的干細(xì)胞的來(lái)源。非限制性例子包括與IL2RG基因突變聯(lián)合且特征在于淋巴細(xì)胞表型T(-)B(+)NK(-)的X連鎖的SCID；與Jak3基因突變聯(lián)合且特征在于淋巴細(xì)胞表型T(-)B(+)NK(-)的常染色體隱性SCID；特征在于淋巴細(xì)胞表型T(-)B(-)NK(-)的ADA基因突變；特征在于淋巴細(xì)胞表型T(-)B(+)NK(+)的IL-7R α鏈突變；特征在于淋巴細(xì)胞表型T(-)B(+)NK(+)的CD3δ或ε突變；特征在于淋巴細(xì)胞表型T(-)B(-)NK(+)的RAG1和RAG2突變；特征在于淋巴細(xì)胞表型T(-)B(-)NK(+)的Artemis基因突變；特征在于淋巴細(xì)胞表型T(-)B(+)NK(+)的CD45基因突變；和特征在于淋巴細(xì)胞表型T(-)B(-)的Prkdc^scid突變。照此，在一些實(shí)施方案中，經(jīng)遺傳修飾的免疫缺陷非人動(dòng)物具有一種或多種選自IL2受體γ鏈(Il2rγ^y/-)缺陷，Jak3缺陷，ADA缺陷，IL7R缺陷，CD3缺陷，RAG1和/或RAG2缺陷，Artemis缺陷，CD45缺陷，和Prkdc缺陷的缺陷。普通技術(shù)人員會(huì)知道免疫缺陷的這些和其它動(dòng)物模型，它們?nèi)我豢捎糜谏杀竟_內(nèi)容的免疫缺陷動(dòng)物。

在一些實(shí)施方案中，依照本發(fā)明的經(jīng)遺傳修飾的非人動(dòng)物可用作能夠自移入的人造血細(xì)胞發(fā)生人免疫細(xì)胞的人造血細(xì)胞的接受者。照此，在本發(fā)明的一些方面，主題經(jīng)遺傳修飾的動(dòng)物是移入有人造血細(xì)胞的經(jīng)遺傳修飾的，免疫缺陷的，非人動(dòng)物。

可以將本領(lǐng)域已知的或本文中描述的人造血細(xì)胞，人造血干細(xì)胞(HSC)和/或造血干祖細(xì)胞(HSPC)的任何來(lái)源移植入本公開內(nèi)容的經(jīng)遺傳修飾的免疫缺陷非人動(dòng)物。本領(lǐng)域已知的人造血細(xì)胞的一種合適來(lái)源是人臍帶血細(xì)胞，特別是CD34陽(yáng)性(CD34⁺)細(xì)胞。人造血細(xì)胞的另一種來(lái)源是人胎肝。另一種來(lái)源是人骨髓。還涵蓋的是通過(guò)體細(xì)胞去分化(例如通過(guò)本領(lǐng)域已知方法)生成的誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞(iPSC)和誘導(dǎo)的造血干細(xì)胞(iHSC)。用于將人細(xì)胞移植入非人動(dòng)物的方法在本領(lǐng)域和在本文中別處有較好的描述，普通技術(shù)人員可以采用它們?nèi)我粊?lái)得到主題經(jīng)遺傳修飾的經(jīng)移入的非人動(dòng)物。

移植的人造血細(xì)胞在經(jīng)遺傳修飾的非人動(dòng)物產(chǎn)生一種或多種選自人CD34陽(yáng)性細(xì)胞，人造血干細(xì)胞，人造血細(xì)胞，髓樣細(xì)胞祖細(xì)胞，類紅細(xì)胞祖細(xì)胞，髓樣細(xì)胞，樹突細(xì)胞，單核細(xì)胞，嗜中性粒細(xì)胞，肥大細(xì)胞，紅細(xì)胞，及其組合的移入的人細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述人細(xì)胞在移入之后4個(gè)月，5個(gè)月，6個(gè)月，7個(gè)月，8個(gè)月，9個(gè)月，10個(gè)月，11個(gè)月，或12個(gè)月時(shí)存在。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述人細(xì)胞包含類紅細(xì)胞譜系的細(xì)胞。

在一些實(shí)施方案中，移植的人造血細(xì)胞在經(jīng)遺傳修飾的非人動(dòng)物中產(chǎn)生移入的人造血-淋巴系統(tǒng)，其包含人造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞，人髓樣細(xì)胞祖細(xì)胞，人髓樣細(xì)胞，人樹突細(xì)胞，人單核細(xì)胞，人粒細(xì)胞，人嗜中性粒細(xì)胞，人肥大細(xì)胞，人紅細(xì)胞，人胸腺細(xì)胞，人T細(xì)胞，人B細(xì)胞，和人血小板。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述人造血-淋巴系統(tǒng)在移入之后4個(gè)月，5個(gè)月，6個(gè)月，7個(gè)月，8個(gè)月，9個(gè)月，10個(gè)月，11個(gè)月，或12個(gè)月時(shí)存在。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述人造血-淋巴系統(tǒng)包含類紅細(xì)胞譜系的細(xì)胞。

類紅細(xì)胞譜系的細(xì)胞包括紅細(xì)胞和產(chǎn)生紅細(xì)胞的細(xì)胞?！凹t細(xì)胞”包括成熟紅色血細(xì)胞，也稱作紅色細(xì)胞或紅色血球。產(chǎn)生紅細(xì)胞的細(xì)胞包括紅細(xì)胞祖細(xì)胞，即增殖中的多效細(xì)胞，和紅細(xì)胞前體，即注定變成紅細(xì)胞的增殖中的或非增殖中的細(xì)胞。

紅細(xì)胞是循環(huán)血液的主要細(xì)胞成分且運(yùn)輸氧作為它們的主要功能。每立方毫米血液中紅細(xì)胞的數(shù)目通常維持在男性中450至550萬(wàn)和女性中420和480萬(wàn)。它隨年齡，活動(dòng)，和環(huán)境條件而變化。例如，升高至800萬(wàn)/mm³的水平正常情況下可發(fā)生于超出海平面10,000英尺以上時(shí)。紅細(xì)胞正常情況下存活110至120天，此時(shí)它自血流移除并由網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)破壞。新的紅細(xì)胞以略多于一天1％的速率生成；如此通常維持恒定水平。急性失血，溶血性貧血，或慢性氧剝奪可引起紅細(xì)胞生成大大升高。

紅細(xì)胞源自長(zhǎng)骨的骨髓中的造血干細(xì)胞，經(jīng)由連續(xù)細(xì)胞階段而發(fā)育成紅細(xì)胞，包括常見的髓樣細(xì)胞祖細(xì)胞(CD123+，CD34+，c-kit+，F(xiàn)lt3+)；巨核細(xì)胞-類紅細(xì)胞祖細(xì)胞(CD34+，CD38+，CD45RA-)；原成紅細(xì)胞(也稱作原正成紅細(xì)胞(如果正常的話)或原巨成紅細(xì)胞(如果異常的話)；大CD71+，EpoR+，c-kit+，Terl19+祖細(xì)胞)；嗜堿性成紅細(xì)胞(胞質(zhì)是嗜堿性的，核大有成塊染色質(zhì)，而且核仁已經(jīng)消失)；多染性成紅細(xì)胞(也稱作中間正成紅細(xì)胞，其中核染色質(zhì)顯示結(jié)塊增加且胞質(zhì)開始獲取血紅蛋白和呈現(xiàn)嗜酸性色彩)；正色性正成紅細(xì)胞(失去核之前的最后階段，其中核小且最終變成藍(lán)黑色同質(zhì)無(wú)結(jié)構(gòu)塊)；和網(wǎng)織紅細(xì)胞(循環(huán)中的CD235+，CD71+細(xì)胞；該細(xì)胞特征在于以前核的部位處線和粒的網(wǎng)樣樣式)。

成熟紅細(xì)胞在外周涂片上表現(xiàn)為兩面凹的，圓形的或卵形的盤，直徑約6-8μm。它們含有血紅蛋白且由于該細(xì)胞的兩面凹陷而具有中央蒼白區(qū)，而且可以通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)或基于免疫組織化學(xué)的方法通過(guò)相對(duì)于非類紅細(xì)胞升高的細(xì)胞表面標(biāo)志物CD235和CD59表達(dá)容易地鑒定。

如例如本公開內(nèi)容的圖5小圖A和圖5小圖B中展現(xiàn)的，在EPO啟動(dòng)子控制下來(lái)自本公開內(nèi)容的經(jīng)移入的非人動(dòng)物的基因組的hEPO表達(dá)將骨髓中類紅細(xì)胞譜系的人細(xì)胞(CD235a+)的數(shù)目提高平均約2倍(例如自約11％至約22％)。人Sirpa的表達(dá)增強(qiáng)這種效果，導(dǎo)致與不表達(dá)人EPO或人Sirpa任一的動(dòng)物相比骨髓中人CD235a+細(xì)胞的占比升高平均3倍或更多(即自約11％至約33％)(圖5小圖A)。照此，本公開內(nèi)容的表達(dá)hEPO的經(jīng)移入的，免疫缺陷的，經(jīng)遺傳修飾的非人動(dòng)物可用于研究人紅細(xì)胞生成和開發(fā)調(diào)控(例如促進(jìn)或阻抑)人紅細(xì)胞生成的藥物。

此外，如例如圖6中展示的，與未處理對(duì)照相比，氯膦酸鹽處理人HSC移入的表達(dá)hEPO的動(dòng)物將這些動(dòng)物的外周血中CD235+類紅細(xì)胞(包括CD71+網(wǎng)織紅細(xì)胞，圖6，小圖B)的數(shù)目提高1000倍，即達(dá)到外周中總紅血球的約1％。重要的是，如例如圖7中展現(xiàn)的，HSC移入的表達(dá)人EPO的動(dòng)物中在這些移入水平生成的人紅血球?qū)︾牋畀懺x感染易感。照此，本文中描述的表達(dá)hEPO的經(jīng)遺傳修飾的非人動(dòng)物特別可用于生成靶向類紅細(xì)胞譜系的人細(xì)胞的寄生蟲感染(例如導(dǎo)致瘧疾或瘧疾樣疾病的病原體)的動(dòng)物模型。

因而，在本發(fā)明的一些方面，主題經(jīng)遺傳修飾的動(dòng)物是移入有人造血細(xì)胞且包含人病原體感染的非人動(dòng)物。這些實(shí)施方案中特別感興趣的是靶向類紅細(xì)胞譜系的人細(xì)胞的人病原體。此類病原體的非限制性例子包括瘧原蟲，巴貝蟲，泰勒蟲等屬的原生動(dòng)物。如下文更為詳細(xì)描述的，可以使用本領(lǐng)域已知的或本文中描述的用于用感興趣病原體感染動(dòng)物的任何適宜方法用人病原體感染移入有人造血細(xì)胞的主題經(jīng)遺傳修飾的非人動(dòng)物。如此感染的動(dòng)物通常會(huì)顯示寄生蟲血癥的跡象，包括吉姆薩染色的血涂片所示改變的形態(tài)學(xué)，及總紅細(xì)胞濃度的劇烈降低(例如50％)和貧血。

生成主題經(jīng)遺傳修飾的小鼠的方法

在本發(fā)明的一些方面，提供了用于生成本公開內(nèi)容的主題非人動(dòng)物的方法。在實(shí)施所述主題方法時(shí)，生成包含與EPO啟動(dòng)子(例如非人動(dòng)物EPO啟動(dòng)子，例如非人動(dòng)物基因組的EPO基因座處的)可操作連接的編碼hEPO蛋白質(zhì)的核酸序列的非人動(dòng)物。

可以使用用于生成經(jīng)遺傳修飾的動(dòng)物的任何方便方法來(lái)實(shí)現(xiàn)包含與EPO啟動(dòng)子可操作連接的編碼hEPO蛋白質(zhì)的核酸序列的非人動(dòng)物的生成，例如如本領(lǐng)域中已知的或如本文中描述的。

例如，可以將編碼hEPO蛋白質(zhì)的核酸以如下的形式摻入重組載體中，所述形式適合于插入宿主細(xì)胞基因組中并在非人宿主細(xì)胞中表達(dá)該人蛋白質(zhì)。在各個(gè)實(shí)施方案中，重組載體包含以如下的方式與編碼人蛋白質(zhì)的核酸可操作連接的一種或多種調(diào)節(jié)序列，所述方式容許將核酸轉(zhuǎn)錄成mRNA并將mRNA翻譯成人蛋白質(zhì)，如上文描述的。應(yīng)當(dāng)理解，載體的設(shè)計(jì)可以取決于諸如要轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞的選擇和/或要表達(dá)的人蛋白質(zhì)的量等因素。

然后，可以使用多種方法之任一種來(lái)將人核酸序列導(dǎo)入動(dòng)物細(xì)胞中以生成表達(dá)人基因的經(jīng)遺傳修飾的動(dòng)物。此類技術(shù)是本領(lǐng)域中公知的，并且包括但不限于原核顯微注射，胚胎干細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，同源重組和敲入技術(shù)?？梢允褂玫挠糜谏山?jīng)遺傳修飾的動(dòng)物的方法包括但不限于那些記載于Sundberg和Ichiki(2006，Genetically Engineered Mice Handbook，CRC Press)，Hofker和van Deursen(2002，Genetically Modified Mouse Methods and Protocols，Humana Press)，Joyner(2000，Gene Targeting：A Practical Approach，Oxford University Press)，Turksen(2002，Embryonic stem cells：Methods and Protocols in Methods Mol Biol.，Humana Press)，Meyer等(2010，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 107：15022-15026)，及Gibson(2004，A Primer Of Genome Science第2版Sunderland，Massachusetts：Sinauer)，美國(guó)專利No.6,586,251，Rathinam等(2011，Blood 118：3119-28)，Willinger等(2011，Proc Natl Acad Sci USA，108：2390-2395)，Rongvaux等(2011，Proc Natl Acad Sci USA，108：2378-83)及Valenzuela等(2003，Nat Biot 21：652-659)的。

例如，可以通過(guò)將編碼人蛋白質(zhì)的核酸導(dǎo)入卵母細(xì)胞中(例如通過(guò)顯微注射)，并容許卵母細(xì)胞在雌性孕育動(dòng)物中發(fā)育來(lái)創(chuàng)建主題經(jīng)遺傳修飾的動(dòng)物。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，將表達(dá)構(gòu)建體注射入受精的卵母細(xì)胞中?？梢栽诮慌浜竽翘熳耘怕堰^(guò)度的雌性收集受精的卵母細(xì)胞，并注射表達(dá)構(gòu)建體。將注射后的卵母細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)夜或直接轉(zhuǎn)移入0.5天p.c.假孕雌性的輸卵管中。用于排卵過(guò)度，收獲卵母細(xì)胞，表達(dá)構(gòu)建體注射和胚胎轉(zhuǎn)移的方法是本領(lǐng)域中已知的，并且記載于Manipulating the Mouse Embryo(2002，A Laboratory Manual，第3版，Cold Spring Harbor Laboratory Press)?？梢酝ㄟ^(guò)DNA分析(例如PCR，Southern印跡，DNA測(cè)序，等)或者通過(guò)蛋白質(zhì)分析(例如ELISA，Western印跡，等)對(duì)后代評(píng)估導(dǎo)入的核酸的存在。

作為另一個(gè)例子，可以使用公知的方法(諸如電穿孔，磷酸鈣沉淀，脂轉(zhuǎn)染，等)將包含編碼人蛋白質(zhì)的核酸序列的構(gòu)建體轉(zhuǎn)染入干細(xì)胞(例如ES細(xì)胞或iPS細(xì)胞)中?？梢酝ㄟ^(guò)DNA分析(例如PCR，Southern印跡，DNA測(cè)序，等)或者通過(guò)蛋白質(zhì)分析(例如ELISA，Western印跡，等)對(duì)細(xì)胞評(píng)估導(dǎo)入的核酸的存在。然后，可以將測(cè)定為已經(jīng)摻入有表達(dá)構(gòu)建體的細(xì)胞導(dǎo)入植入前胚胎中。關(guān)于可用于本發(fā)明組合物和方法的本領(lǐng)域中已知方法的詳細(xì)描述參見Nagy等(2002，Manipulating the Mouse Embryo：A Laboratory Manual，第3版，Cold Spring Harbor Laboratory Press)，Nagy等(1990，Development 110：815-821)，美國(guó)專利No.7,576,259，美國(guó)專利No.7,659,442，美國(guó)專利No.7,294,754，及Kraus等(2010，Genesis 48：394-399)。

另外，如下文實(shí)施例中的一些中描述的，可以使用遺傳工程技術(shù)構(gòu)建核酸構(gòu)建物(參見例如Valenzuela et al.(2003)High throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis，Nature Biotech.21(6)：652-59和美國(guó)專利No.6,586,251)，導(dǎo)入干細(xì)胞(例如ES細(xì)胞)，并使用等位基因丟失和等位基因獲取測(cè)定法測(cè)定正確打靶的克隆(Valenzuela et al.，見上文)；可以使用正確打靶的ES細(xì)胞作為供體ES細(xì)胞，使用方法導(dǎo)入8細(xì)胞階段的小鼠胚胎(參見例如美國(guó)專利No.7,294,754和Poueymirou et al.2007，F(xiàn)0generation mice that are essentially fully derived from the donor gene-targeted ES cells allowing immediate phenotypic analyses Nature Biotech.25(1)：91-99)。

可以使用經(jīng)遺傳修飾的建立者動(dòng)物來(lái)培育別的攜帶遺傳修飾的動(dòng)物。可以將本公開內(nèi)容的攜帶編碼人蛋白質(zhì)的核酸的經(jīng)遺傳修飾的動(dòng)物與攜帶其它遺傳修飾的其它經(jīng)遺傳修飾的動(dòng)物，例如hSIRPa敲入小鼠，hIL-3敲入小鼠，hGM-CSF敲入小鼠，hM-CSF敲入小鼠，hTPO敲入小鼠，hIL-6敲入小鼠，等等進(jìn)一步育種，或與敲除動(dòng)物(例如一種或多種蛋白質(zhì)缺陷的，例如不表達(dá)一種或多種其基因的非人動(dòng)物，例如Rag2缺陷動(dòng)物，I12rg缺陷動(dòng)物)育種。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，可以生成干細(xì)胞，例如ES細(xì)胞，使得它們包含數(shù)處遺傳修飾，例如本文中描述的人源化或基因刪除，而且可以將此類干細(xì)胞導(dǎo)入胚胎以生成具有數(shù)處遺傳修飾的經(jīng)遺傳修飾的動(dòng)物。

如上文討論的，在一些實(shí)施方案中，主題經(jīng)遺傳修飾的非人動(dòng)物是免疫缺陷動(dòng)物?？梢允褂糜糜谏山?jīng)遺傳修飾的動(dòng)物的任何方便方法生成免疫缺陷且包含一種或多種人蛋白質(zhì)(例如hEPO，hSIRPa，hIL-3，hGM-CSF，hM-CSF，和/或hTPO)的經(jīng)遺傳修飾的非人動(dòng)物，所述方法例如如本領(lǐng)域中已知的或如本文中描述的。例如，經(jīng)遺傳修飾的免疫缺陷動(dòng)物的生成可以通過(guò)將編碼人蛋白質(zhì)的核酸導(dǎo)入包含突變體SCID基因等位基因的卵母細(xì)胞或干細(xì)胞來(lái)實(shí)現(xiàn)，所述等位基因在純合子時(shí)會(huì)導(dǎo)致免疫缺陷，如上文和本文的實(shí)施例中極為詳細(xì)描述的。然后，使用例如本文中描述和本領(lǐng)域中已知的方法用經(jīng)修飾的卵母細(xì)胞或ES細(xì)胞生成小鼠，并交配以生成包含期望遺傳修飾的免疫缺陷小鼠。作為另一個(gè)例子，可以在免疫勝任背景中生成經(jīng)遺傳修飾的非人動(dòng)物，并與包含突變體基因等位基因的動(dòng)物雜交，并使后代交配以創(chuàng)建表達(dá)至少一種感興趣人蛋白質(zhì)的免疫缺陷動(dòng)物，所述等位基因在半合子或純合子時(shí)會(huì)導(dǎo)致免疫缺陷。

在一些實(shí)施方案中，處理經(jīng)遺傳修飾的小鼠從而消除該小鼠中可能存在的內(nèi)源造血細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述處理包含照射該經(jīng)遺傳修飾的小鼠。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，亞致死照射新生的經(jīng)遺傳修飾的小鼠幼畜。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，以4小時(shí)間隔2x 200cGy照射新生的幼畜。

本發(fā)明的各個(gè)實(shí)施方案提供在基本上所有它們的細(xì)胞中包括人核酸的經(jīng)遺傳修飾的動(dòng)物，以及在一些但非所有它們的細(xì)胞中包括人核酸的經(jīng)遺傳修飾的動(dòng)物。在一些情況中，例如靶向重組，一個(gè)拷貝的人核酸會(huì)整合入經(jīng)遺傳修飾的動(dòng)物的基因組。在其它情況中，例如隨機(jī)整合，彼此鄰近或遠(yuǎn)離的多個(gè)拷貝的人核酸可整合入經(jīng)遺傳修飾的動(dòng)物的基因組。

如此，在一些實(shí)施方案中，主題經(jīng)遺傳修飾的非人動(dòng)物可以是包含如下基因組的免疫缺陷動(dòng)物，所述基因組包括與相應(yīng)的非人動(dòng)物啟動(dòng)子可操作連接的編碼人多肽的核酸，其中所述動(dòng)物表達(dá)所編碼的人多肽。換言之，主題經(jīng)遺傳修飾的免疫缺陷非人動(dòng)物包含如下基因組，所述基因組包含編碼至少一種人多肽的核酸，其中所述核酸與相應(yīng)的非人啟動(dòng)子和聚腺苷酸化信號(hào)可操作連接的，且其中所述動(dòng)物表達(dá)所編碼的人多肽。

如上文討論的，在一些實(shí)施方案中，主題經(jīng)遺傳修飾的非人動(dòng)物移入有人造血細(xì)胞。可以將本領(lǐng)域已知的或本文中討論的人造血細(xì)胞，人造血干細(xì)胞(HSC)和/或造血干祖細(xì)胞(HSPC)的任何來(lái)源移植入本公開內(nèi)容的經(jīng)遺傳修飾的非人動(dòng)物，例如臍帶血，胎肝，骨髓，iPSC，等。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述造血細(xì)胞選自人臍帶血細(xì)胞和人胎肝細(xì)胞。要移植的細(xì)胞的量會(huì)是普通技術(shù)人員較好地了解，或者可以憑經(jīng)驗(yàn)確定。在一個(gè)實(shí)施方案中，移入約1-2x 10⁵個(gè)人CD34+細(xì)胞?？梢允褂帽绢I(lǐng)域已知的任何便利技術(shù)將細(xì)胞移植入宿主主題非人動(dòng)物，例如尾靜脈注射，眶后注射，注射入新生肝，等等。可以在任何便利的緩沖溶液中將細(xì)胞移植入宿主，例如PBS，Dulbecco氏改良培養(yǎng)基，Iscove氏改良培養(yǎng)基，等等。在一些情況中，可以在例如如上文描述的移入之前照射動(dòng)物以提高免疫缺陷。

如此移入的人造血細(xì)胞產(chǎn)生一種或多種選自CD34+細(xì)胞，造血干細(xì)胞，造血細(xì)胞，髓樣細(xì)胞前體細(xì)胞，髓樣細(xì)胞，樹突細(xì)胞，單核細(xì)胞，粒細(xì)胞，嗜中性粒細(xì)胞，肥大細(xì)胞，胸腺細(xì)胞，T細(xì)胞，B細(xì)胞，血小板，紅細(xì)胞，及其組合的人細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述人細(xì)胞在移之后入4個(gè)月，5個(gè)月，6個(gè)月，7個(gè)月，8個(gè)月，9個(gè)月，10個(gè)月，11個(gè)月，或12個(gè)月時(shí)存在?？梢詫?shí)施多種測(cè)定法任一來(lái)確認(rèn)移入是成功的，包括例如針對(duì)各種感興趣人造血細(xì)胞的流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定法，血涂片，和免疫組織化學(xué)。

如上文討論的，在一些實(shí)施方案中，用人病原體感染移入有人造血細(xì)胞的主題經(jīng)遺傳修飾的非人動(dòng)物。這些實(shí)施方案中特別感興趣的是靶向類紅細(xì)胞譜系的人細(xì)胞的人病原體。此類病原體的非限制性例子包括瘧原蟲，巴貝蟲，泰勒蟲，等等屬的原生動(dòng)物。在一些實(shí)施方案中，所使用的病原體的株系是天然發(fā)生的株系。在某些實(shí)施方案中，所使用的株系已經(jīng)針對(duì)它在人紅細(xì)胞移入的免疫缺陷小鼠中能繁殖地生長(zhǎng)的能力進(jìn)行了體內(nèi)選擇，例如鐮狀瘧原蟲Pf3D7^0087/N9或Pf3D7^0087/N5株。

可以使用本領(lǐng)域已知的用于用靶向類紅細(xì)胞譜系的細(xì)胞的病原體感染動(dòng)物的任何方法感染主題經(jīng)移入的免疫缺陷動(dòng)物。例如，可以對(duì)主題經(jīng)移入的免疫缺陷動(dòng)物腹膜內(nèi)接種受到寄生感染的紅血球(PRBC)。參見例如Badell et al.(2000)Human malaria in immunocompromised mice：an in vivo model to study defense mechanisms against Plasmodium falciparum.JEM 192(11)：1653-1660；和Moreno et al.(2006)The course of infections and pathology in immunomodulated NOD/LtSz-SCID mice inoculated with Plasmodium falciparum laboratory lines and clinical isolates.Int.J.Parasitol.36：361-369。又例如，可以對(duì)主題經(jīng)移入的免疫缺陷動(dòng)物血管內(nèi)接種受到寄生感染的紅血球。參見例如Angulo-Barturen et al.(2008)A murine model of falciparum-malaria by in vivo selection of competent strains in non-myelodepleted mice engrafted with human erythrocytes.PLoS One 3：e2252；和Jimenez-Diaz et al.(2009)Improved murine model of malaria using Plasmodium falciparum competent strains and non-myelodepleted NOD-scid IL2Rg^nullmice engrafted with human erythrocytes.Antimicrob Agents Chemother 53：4533-4536。在一些實(shí)施方案中，所述感染是通過(guò)將寄生蟲注射入非人動(dòng)物而產(chǎn)生的，即不是在類紅細(xì)胞的背景中。在一些實(shí)施方案中，在感染之前和/或期間對(duì)主題經(jīng)移入的免疫缺陷動(dòng)物體內(nèi)化學(xué)消減吞噬細(xì)胞。在此類實(shí)施方案中，可以將選擇性消減宿主吞噬細(xì)胞的任何化療劑施用于主題動(dòng)物，包括例如氯膦酸鹽，例如如本文中的實(shí)施例中描述的；二氯亞甲基二膦酸酯，例如如Badell et al.，見上文和Moreno et al.，見上文中描述的；對(duì)多形核嗜中性粒細(xì)胞特異性的單克隆抗體，例如NIMP-R14，如Badell et al.，見上文和Moreno et al.，見上文中描述的；等等。

本公開內(nèi)容的受到感染的經(jīng)遺傳修飾的非人動(dòng)物中的百分比寄生蟲血癥可以通過(guò)本領(lǐng)域的任何便利方法來(lái)評(píng)估，例如吉姆薩染色的血涂片的顯微鏡檢查，例如注射之后3天；或通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)，例如通過(guò)測(cè)量核酸染料YOYO-1或細(xì)胞滲透性染料SYTO-16的發(fā)射，例如在TER-119單抗存在或缺失下。參見例如Jimenez-Diaz et al.Quantitative measurement of Plasmodium-infected erythrocytes in murine models of malaria by flow cytometry using bidimensional assessment of SYTO-16fluorescence.Cytometry A 2009，75：225-235。

主題經(jīng)遺傳修飾的小鼠的用途

在小鼠中在體內(nèi)設(shè)置中研究人組織的能力打開了一系列可能的研究大道。主要限制阻礙了所述辦法的應(yīng)用，其中最重要的缺陷之一是小鼠因子沒(méi)有能力支持人細(xì)胞。確實(shí)，在免疫系統(tǒng)中，人免疫細(xì)胞發(fā)育和功能所需要的許多必要因子是物種特異性的且不能由小鼠有效提供。因此決定遵循將小鼠基因用它們的人對(duì)應(yīng)物替換的策略，使得能夠?qū)崿F(xiàn)更好的人細(xì)胞發(fā)育和功能且潛在使得相應(yīng)的小鼠細(xì)胞發(fā)育和功能不能實(shí)現(xiàn)。通過(guò)將這種概念應(yīng)用于人細(xì)胞因子EPO，本文中顯示了用編碼人EPO蛋白質(zhì)的核酸序列替換編碼小鼠EPO蛋白質(zhì)的核酸序列改善小鼠中移入的人免疫系統(tǒng)中類紅細(xì)胞譜系的細(xì)胞的發(fā)育和功能。

例如，例如圖5處的實(shí)施例展現(xiàn)了來(lái)自在非人動(dòng)物的基因組處的EPO啟動(dòng)子控制下的核酸序列的hEPO表達(dá)將人HSC移入的動(dòng)物的骨髓中發(fā)育的類紅細(xì)胞譜系的人細(xì)胞(CD235a+)的數(shù)目提高約2倍(即自約11％至約22％)。人Sirpa的表達(dá)增強(qiáng)這種效果，導(dǎo)致與不表達(dá)人EPO或人Sirpa任一的動(dòng)物相比骨髓中人CD235a+細(xì)胞的占比升高總共3倍(即自約11％至約33％)(圖4a)。此外，如例如圖6中展現(xiàn)的，與未處理對(duì)照相比，氯膦酸鹽處理人HSC移入的表達(dá)人EPO的動(dòng)物將這些動(dòng)物的外周血中CD235+類紅細(xì)胞(包括CD71+網(wǎng)織紅細(xì)胞，圖6，小圖B)的數(shù)目提高1000倍，即達(dá)到總紅血球的約1％。重要的是，如例如圖7中展現(xiàn)的，HSC移入的表達(dá)人EPO的動(dòng)物中在這些移入水平生成的人紅血球?qū)Ο懺x諸如鐮狀瘧原蟲感染易感。因而，本文中描述的表達(dá)人EPO的經(jīng)遺傳修飾的非人動(dòng)物特別可用于生成對(duì)瘧原蟲感染易感的動(dòng)物，或者會(huì)更好地支持在當(dāng)前嚙齒動(dòng)物模型中在感染之前急性移植入動(dòng)物的人紅細(xì)胞的動(dòng)物。

照此，本公開內(nèi)容的經(jīng)遺傳修飾的非人動(dòng)物在本領(lǐng)域中找到許多用途。例如，本公開內(nèi)容的經(jīng)移入的經(jīng)遺傳修飾的動(dòng)物對(duì)于研究人紅細(xì)胞生成和人紅細(xì)胞的功能是有用的。作為另一個(gè)例子，本公開內(nèi)容的經(jīng)移入的經(jīng)遺傳修飾的小鼠提供了一種系統(tǒng)，可用于對(duì)候選藥劑篩選期望的體內(nèi)活性，例如用以鑒定能夠例如在健康或患病狀態(tài)(例如作為癌性細(xì)胞)，在病原體感染期間等調(diào)控(即促進(jìn)或抑制)人紅細(xì)胞生成和/或人紅細(xì)胞功能的藥劑，例如用以鑒定新穎的治療劑；或作為另一個(gè)例子，用以鑒定對(duì)類紅細(xì)胞譜系的人細(xì)胞有毒性的藥劑；及用以鑒定預(yù)防，減輕，或逆轉(zhuǎn)有毒藥劑對(duì)類紅細(xì)胞譜系的人細(xì)胞的毒性影響的藥劑；等等。作為又一個(gè)例子，本公開內(nèi)容的經(jīng)移入的經(jīng)遺傳修飾的動(dòng)物提供了一種對(duì)于預(yù)測(cè)個(gè)體對(duì)疾病療法的響應(yīng)性有用的系統(tǒng)，例如通過(guò)提供用于篩選個(gè)體的免疫系統(tǒng)對(duì)藥劑(例如治療劑)的響應(yīng)性的體內(nèi)平臺(tái)，用以預(yù)測(cè)個(gè)體對(duì)所述藥劑的響應(yīng)性。

作為一個(gè)非限制性例子，本公開內(nèi)容的移入的經(jīng)遺傳修飾的小鼠可用于生成靶向人類紅細(xì)胞的寄生蟲(例如瘧原蟲，巴貝蟲，泰勒蟲，等等)的病原體感染的小鼠模型。感染的此類小鼠模型在研究(例如為了更好地了解人中感染的進(jìn)展)和藥物發(fā)現(xiàn)(例如為了鑒定針對(duì)此類寄生蟲的感染提供保護(hù)或治療此類寄生蟲的感染的候選藥劑)二者中會(huì)是有用的。

瘧原蟲屬的原生動(dòng)物是人中瘧疾的原因。瘧疾始于受到感染的按蚊屬(Anopheles)蚊子的叮咬，經(jīng)由它的唾液將原生動(dòng)物引入循環(huán)系統(tǒng)，并最終到達(dá)肝，它們?cè)谀抢锍墒旌头敝?。然后原生?dòng)物進(jìn)入血流并感染處于各種成熟階段的類紅細(xì)胞譜系的細(xì)胞。

瘧原蟲的五個(gè)種能感染人和通過(guò)人傳播。絕大多數(shù)死亡是由鐮狀瘧原蟲引起的，而間日瘧原蟲，卵形瘧原蟲(P.ovale)，和三日瘧原蟲(P.malariae)引起一般更溫和形式的瘧疾，很少致命。認(rèn)為這是至少部分由于每個(gè)種所靶定的細(xì)胞的類型：鐮狀瘧原蟲在所有成熟期的紅血球(RBC)中生長(zhǎng)，而，例如，間日瘧原蟲限于網(wǎng)織紅細(xì)胞中的生長(zhǎng)，它們只占外周中總RBC的大約1％-2％。另外，鐮狀瘧原蟲經(jīng)不與任何其它人瘧疾分享的即扣留(sequestration)的獨(dú)特特性引起嚴(yán)重瘧疾。在48小時(shí)無(wú)性血液階段周期內(nèi)，成熟形式改變受到感染紅血球的表面特性，使它們粘附至血管(稱作細(xì)胞粘附的過(guò)程)。這引起微循環(huán)阻塞并導(dǎo)致多種器官功能障礙。

瘧疾的癥狀包括發(fā)熱，發(fā)冷，頭痛，出汗，疲勞，貧血，惡心，干性(非排痰性)咳嗽，肌肉和/或背痛，和脾腫大。與瘧疾有關(guān)的其它癥狀和并發(fā)癥包括腦部感染(腦炎)，溶血性貧血，腎衰竭，肝衰竭，腦膜炎，肺水腫，和脾出血。一般而言，有風(fēng)險(xiǎn)發(fā)生瘧疾的個(gè)體會(huì)在感染之后7天或更久，例如鐮狀瘧原蟲初始感染之后9至14天，間日瘧原蟲或卵形瘧原蟲初始感染之后12至18天，三日瘧原蟲初始感染之后18至40天，或諾氏瘧原蟲(P.knowlesi)初始感染之后11至12天開始顯示癥狀。本領(lǐng)域用于治療或預(yù)防瘧疾的抗瘧藥包括氯喹(chloroquine)，奎尼丁(quinidine)，多西環(huán)素(doxycycline)，四環(huán)素(tetracycline)，克林霉素(clindamycin)，阿托伐醌(atovaquone)加氯胍(proguanil)(Malarone)，甲氟喹(Mefloquine)，青蒿琥酯(artesunate)，乙胺嘧啶(pyrimethamine)加磺胺多辛(sulfadoxine)(Fansidar)。

用于確定受試者是否已經(jīng)受到瘧原蟲感染的方法是本領(lǐng)域公知的，而且包括例如使用血膜的血液顯微鏡檢查，基于抗原的快速診斷性測(cè)試(RDT)，例如基于免疫層析的RDT，通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)檢測(cè)寄生蟲DNA，等?？墒褂萌魏伪憷椒▉?lái)確定受試者的人紅血球是否已經(jīng)受到病原體感染。

感興趣的病原體的另一個(gè)例子是巴貝蟲屬的原生動(dòng)物。巴貝蟲感染導(dǎo)致一種瘧疾樣疾病，稱作巴貝蟲病。巴貝蟲病是一種媒介傳播病，通常通過(guò)肩突硬蜱種(Ixodes scapularis)的蜱來(lái)傳播。該疾病通常由人中的果氏巴貝蟲(B.microti)，犬中的羅氏巴貝蟲(B.canis rossi)和犬巴貝蟲(B.canis canis)，牛(cow)中的牛巴貝蟲(B.bovis)，和小牛(cattle)中的雙芽巴貝蟲(B.bigemina)引起。感染人的果氏巴貝蟲使用與萊姆病和埃里希體病相同的蜱媒介，而且可以與這些其它疾病聯(lián)合發(fā)生。該原生動(dòng)物還能通過(guò)輸血來(lái)傳播。

在人中，巴貝蟲病可以是無(wú)癥狀的，或者特征在于范圍從輕度發(fā)熱和腹瀉到高度發(fā)熱，惡寒戰(zhàn)栗，和嚴(yán)重貧血的癥狀。在嚴(yán)重病例中可發(fā)生器官衰竭，包括活性窘迫綜合征。嚴(yán)重病例大多在具有脾切除術(shù)的人，或具有免疫缺陷的人，諸如HIV/AIDS患者中發(fā)生。治療通常包含奎寧和克林霉素或阿托伐醌和阿奇霉素的雙藥方案。在巴貝蟲病看來(lái)危及生命的情況中，實(shí)施換血輸注，其中去除受到感染的紅血球并用未受感染的紅血球替換。

巴貝蟲感染通過(guò)在吉姆薩染色的薄血涂片上鑒定寄生蟲來(lái)進(jìn)行確定性診斷。寄生蟲在紅細(xì)胞中作為成對(duì)裂殖子出現(xiàn)，其形成人中的“馬耳他十字形成”或動(dòng)物中的“兩個(gè)梨掛在一起”。其它診斷方法包括外周血PCR，和針對(duì)巴貝蟲的抗體(IgG，IgM)的血清學(xué)測(cè)試。

還有另一種瘧疾樣疾病，泰勒蟲病，是由泰勒蟲屬的原生動(dòng)物引起的。在人中，泰勒蟲病是由微小泰勒蟲(T.microti)引起的；在馬中，是由馬泰勒蟲(T.equi)引起的(“馬梨漿蟲病”)；在綿羊和山羊中，是由萊氏泰勒蟲(T.lestoquardi)引起的；而在牛(cattle)，非洲野牛(African buffalo)，水牛(waterbuffalo)，和公水牛(water buck)中，是由環(huán)形泰勒蟲(T.annulata)引起的(“熱帶泰勒蟲病”，也稱作“地中海泰勒蟲病”)或小泰勒蟲(T.parva)(“東海岸熱”，也稱作“科立多病”)。泰勒蟲病通過(guò)多種蜱物種傳播至宿主，包括肩突硬蜱種(Ixodes scapularis)，扇頭蜱屬(Rhipicephalus)，矩頭蟬屬(Dermacentor)，血蜱屬(Haemaphysalis)，和璃眼蜱屬(Hyalomma)。該生物體在蜱中繁殖，即它前行通過(guò)它的生命階段，并在蜱附著至宿主之后成熟及進(jìn)入唾液。通常，在它變成感染性的之前，蜱必須附著幾天。然而，如果環(huán)境溫度較高的話，感染性子孢子能在地面上的蜱中發(fā)育，而且可以附著數(shù)小時(shí)內(nèi)進(jìn)入宿主。

人中的泰勒蟲病通常呈現(xiàn)發(fā)熱和溶血。泰勒蟲感染通過(guò)在吉姆薩染色的薄血涂片上鑒定寄生蟲來(lái)進(jìn)行確定性診斷。

本公開內(nèi)容的經(jīng)移入的經(jīng)遺傳修飾的動(dòng)物可用于篩選候選藥劑以鑒定那些會(huì)預(yù)防(例如疫苗)或治療瘧原蟲，巴貝蟲，泰勒蟲，和其它靶向人紅細(xì)胞的寄生蟲感染的。術(shù)語(yǔ)“治療”，“處理”等等在本文中用于一般包括獲得期望的藥理學(xué)和/或生理學(xué)效果。效果可以是就完全或部分阻止疾病或其癥狀而言預(yù)防性的和/或可以是就部分或完全治愈疾病和/或可歸于疾病的不利影響而言治療性的。如本文中使用的，“治療”包括哺乳動(dòng)物中的疾病的任何治療，而且包括：(a)阻止疾病在可能傾向于疾病但尚未診斷為具有疾病的受試者中發(fā)生；(b)抑制疾病，即阻滯它的發(fā)生；或(c)減輕疾病，即引起疾病消退。作為抗寄生蟲治療劑感興趣的候選藥劑包括那些可以在寄生蟲感染之前，期間或之后施用的，和那些以有效量施用時(shí)抑制寄生蟲對(duì)個(gè)體(即宿主)的影響的，例如通過(guò)殺死寄生蟲或受到寄生蟲感染的細(xì)胞，通過(guò)阻止寄生蟲的繁殖，通過(guò)阻止由寄生蟲生成的對(duì)個(gè)體有毒的因子(即毒素)的生成或作用，等。術(shù)語(yǔ)“個(gè)體”，“受試者”，“宿主”，和“患者”在本文中可互換使用且包括想要進(jìn)行診斷，處理，或治療的任何哺乳動(dòng)物受試者，特別是人。

在生物學(xué)活性劑的篩選測(cè)定法中，使本公開內(nèi)容的移入有人造血細(xì)胞的經(jīng)遺傳修飾的非人動(dòng)物(例如經(jīng)移入的Rag2^-/-Il2rg^無(wú)Epo^h/m小鼠，經(jīng)移入的Rag2^-/-Il2rg^無(wú)Tpo^h/hIl3/Gmcsfh^h/hEpo^h/mSIRPα^h/h(“TIES”)小鼠，經(jīng)移入的Rag2^-/-IL2rg^y/-Tpo^h/hMcsf^h/hIl3^h/hGmcsf^h/hEpo^h/hhSIRPα+(“MISTER-G”)小鼠，經(jīng)移入的Rag2^-/-Il2rg^無(wú)Tpo^h/hMcsf^h/hIl3/Gmcsf^h//hEpo^h/hSIRPa-tg+(“SupER-G”)小鼠等)與感興趣的候選藥劑接觸，并通過(guò)監(jiān)測(cè)一種或多種輸出參數(shù)來(lái)評(píng)估候選藥劑的效果。根據(jù)本領(lǐng)域中公知的方法，這些輸出參數(shù)可以反映細(xì)胞的存活力，例如造血細(xì)胞的總數(shù)或特定造血細(xì)胞類型的細(xì)胞的數(shù)目，或細(xì)胞的凋亡狀態(tài)，例如DNA片段化的量，細(xì)胞空泡化的量，細(xì)胞表面上磷脂酰絲氨酸的量等。或者/另外，輸出參數(shù)可以反映細(xì)胞的分化能力，例如分化細(xì)胞的比例和分化細(xì)胞類型。或者/另外，輸出參數(shù)可以反映細(xì)胞的功能，例如由細(xì)胞生成的細(xì)胞因子和趨化因子，由細(xì)胞生成的抗體(例如量或類型)，細(xì)胞歸巢和溢出至攻擊部位的能力，細(xì)胞在體外或在體內(nèi)調(diào)控(即促進(jìn)或抑制)其它細(xì)胞的活性的能力，吸收血紅蛋白的能力，等。根據(jù)與實(shí)施的研究的相關(guān)性，又一些參數(shù)可以反映藥劑對(duì)感染的影響，例如動(dòng)物中的病原體感染，例如小鼠中病原體的滴度，等。

參數(shù)是細(xì)胞的可量化組分，特別是可以精確測(cè)量的組分(是高通量系統(tǒng)中所期望的)。參數(shù)可以是任何細(xì)胞組分或細(xì)胞產(chǎn)物，包括細(xì)胞表面決定簇，受體，蛋白質(zhì)或其構(gòu)象或翻譯后修飾，脂質(zhì)，碳水化合物，有機(jī)或無(wú)機(jī)分子，核酸(例如mRNA，DNA，等)或自此類細(xì)胞組分衍生的部分或其組合。雖然大多數(shù)參數(shù)會(huì)提供定量讀出，在一些情況中，半定量或定量結(jié)果會(huì)是可接受的。讀出可以包括單一測(cè)定數(shù)值，或者可以包括均值，中值或方差，等。特征性地，由于相同測(cè)定法的多重性會(huì)對(duì)每個(gè)參數(shù)獲得一個(gè)范圍的參數(shù)讀出數(shù)值。預(yù)期變率，并且會(huì)使用標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)計(jì)學(xué)方法及用于提供單一數(shù)值的常用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法獲得測(cè)試參數(shù)集中每個(gè)的數(shù)值范圍。

用于篩選的感興趣候選藥劑包括已知的和未知的化合物，其涵蓋許多化學(xué)種類，主要是有機(jī)分子(其可以包括有機(jī)金屬分子)，無(wú)機(jī)分子，遺傳序列，疫苗，抗生素或懷疑具有抗生素特性的其它藥劑，肽，多肽，抗體，已經(jīng)批準(zhǔn)用于人的藥物的藥劑，等。本發(fā)明的一個(gè)重要方面是評(píng)估候選藥物，包括毒性測(cè)試；等等。

候選藥劑包括包含對(duì)于結(jié)構(gòu)相互作用(特別是形成氫鍵)必需的官能團(tuán)的有機(jī)分子，并且通常至少包含胺，羰基，羥基或羧基基團(tuán)，通常至少兩種官能性化學(xué)基團(tuán)。候選藥劑經(jīng)常包含用一種或多種上述官能團(tuán)取代的環(huán)狀碳或雜環(huán)結(jié)構(gòu)和/或芳香族或多芳香族結(jié)構(gòu)。還在生物分子(包括肽，多核苷酸，糖，脂肪酸，類固醇，嘌呤，嘧啶，衍生物，結(jié)構(gòu)類似物或其組合)中找到候選藥劑。包括的有藥理學(xué)活性藥物，遺傳活性分子，等。感興趣化合物包括化學(xué)治療劑，激素或激素拮抗劑，等。適合于本發(fā)明的例示性藥劑是那些記載于“The Pharmacological Basis of Therapeutics，”Goodman和Gilman，McGraw-Hill，New York，N.Y.，1996，第九版的。還包括毒素，和生物學(xué)和化學(xué)戰(zhàn)劑，例如見Somani，S.M.(編)，“Chemical Warfare Agents，”Academic Press，New York，1992。

用于篩選的感興趣候選藥劑還包括核酸，例如編碼siRNA，shRNA，反義分子，或miRNA的核酸，或編碼多肽的核酸?？捎糜趯⒑怂徂D(zhuǎn)移入靶細(xì)胞中的許多載體是可得的?？梢詫⑤d體以附加體維持，例如作為質(zhì)粒，微環(huán)DNA，病毒衍生載體諸如巨細(xì)胞病毒，腺病毒，等，或者可以經(jīng)由同源重組或隨機(jī)整合將它們整合入靶細(xì)胞基因組中，例如逆轉(zhuǎn)錄病毒衍生載體諸如MMLV，HIV-1，ALV，等?？梢灾苯訉?duì)主題細(xì)胞提供載體。換言之，使多能細(xì)胞與包含感興趣核酸的載體接觸，使得載體被細(xì)胞攝取。

用于使細(xì)胞(例如培養(yǎng)中的細(xì)胞或小鼠中的細(xì)胞)與核酸載體接觸的方法(諸如電穿孔，氯化鈣轉(zhuǎn)染，和脂轉(zhuǎn)染)是本領(lǐng)域中公知的?；蛘?，可以經(jīng)由病毒對(duì)細(xì)胞提供感興趣核酸。換言之，使細(xì)胞與包含感興趣核酸的病毒顆粒接觸。逆轉(zhuǎn)錄病毒(例如慢病毒)特別適合于本發(fā)明的方法。常用的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體是“有缺陷的”，即不能生成生產(chǎn)性感染需要的病毒蛋白質(zhì)。相反，載體的復(fù)制需要在包裝細(xì)胞系中生長(zhǎng)。為了生成包含感興趣核酸的病毒顆粒，通過(guò)包裝細(xì)胞系將包含核酸的逆轉(zhuǎn)錄病毒核酸包裝入病毒殼體中。不同包裝細(xì)胞系提供要摻入殼體中的不同包膜蛋白，此包膜蛋白決定病毒顆粒對(duì)細(xì)胞的特異性。包膜蛋白屬于至少三種類型，即同向性(ecotropic)，兼向性(amphotropic)和異向性(xenotropic)。包裝有同向性包膜蛋白的逆轉(zhuǎn)錄病毒(例如MMLV)能夠感染大多數(shù)鼠和大鼠細(xì)胞類型，并且通過(guò)使用同向性包裝細(xì)胞系(諸如BOSC23)生成(Pear等(1993)P.N.A.S.90：8392-8396)。攜帶兼向性包膜蛋白的逆轉(zhuǎn)錄病毒(例如4070A(Danos等，見上文))能夠感染大多數(shù)哺乳動(dòng)物細(xì)胞類型，包括人，犬和小鼠，并且通過(guò)使用兼向性包裝細(xì)胞系諸如PA12(Miller等(1985)Mol.Cell.Bio1.5：431-437)；PA317(Miller等(1986)Mol.Cell.Biol.6：2895-2902)；GRIP(Danos等(1988)PNAS 85：6460-6464)生成。用異向性包膜蛋白(例如AKR env)包裝的逆轉(zhuǎn)錄病毒能夠感染大多數(shù)哺乳動(dòng)物細(xì)胞類型，鼠細(xì)胞除外?？梢允褂煤线m的包裝細(xì)胞系來(lái)確保感興趣細(xì)胞(在一些例子中為移入細(xì)胞，在一些例子中為宿主(即經(jīng)遺傳修飾的動(dòng)物)的細(xì)胞)被包裝病毒顆粒靶向。

用于對(duì)主題細(xì)胞提供感興趣核酸的載體通常會(huì)包含適合于驅(qū)動(dòng)感興趣核酸表達(dá)(也就是轉(zhuǎn)錄活化)的啟動(dòng)子。這可以包括遍在起作用的啟動(dòng)子，例如CMV-β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子，或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，諸如在特定細(xì)胞群體中有活性或者響應(yīng)藥物諸如四環(huán)素存在的啟動(dòng)子。轉(zhuǎn)錄活化意指轉(zhuǎn)錄會(huì)在靶細(xì)胞中在基礎(chǔ)水平上升高至少約10倍，至少約100倍，更通常至少約1000倍。另外，用于對(duì)主題細(xì)胞提供再編程因子的載體可以包含后來(lái)必須去除的基因(例如使用重組酶系統(tǒng)諸如Cre/Lox)，或破壞表達(dá)它們的細(xì)胞的基因(例如通過(guò)納入容許選擇性毒性的基因，諸如皰疹病毒TK，bcl-xs，等)。

用于篩選的感興趣候選藥劑還包括多肽。任選地，可以將此類多肽與提高產(chǎn)物溶解度的多肽域融合?？梢越?jīng)由限定的蛋白酶切割位點(diǎn)(例如TEV序列，其受到TEV蛋白酶切割)將該域與多肽連接。接頭還可以包含一個(gè)或多個(gè)柔性序列，例如1至10個(gè)甘氨酸殘基。在一些實(shí)施方案中，在維持產(chǎn)物溶解度的緩沖液中，例如在0.5至2M尿素存在下，在提高溶解度的多肽和/或多核苷酸存在下，等等情況下實(shí)施對(duì)融合蛋白的切割。感興趣的域包括內(nèi)體裂解域(endosomolytic domain)，例如流感HA域；和幫助生成的其它多肽，例如IF2域，GST域，GRPE域，等。另外/或者，可以配制此類多肽以實(shí)現(xiàn)改善的穩(wěn)定性。例如，可以將肽PEG化，其中聚乙烯氧基基團(tuán)提供血流中延長(zhǎng)的壽命?？梢詫⒍嚯呐c另一種多肽融合以提供添加的功能性，例如提高體內(nèi)穩(wěn)定性。一般地，此類融合配偶體是一種穩(wěn)定的血漿蛋白質(zhì)，其在作為融合物存在時(shí)可以例如延長(zhǎng)多肽的體內(nèi)血漿半衰期，特別是此類穩(wěn)定的血漿蛋白質(zhì)是免疫球蛋白恒定域的情況。在大多數(shù)情況中(其中穩(wěn)定的血漿蛋白質(zhì)通常以多聚體形式找到，例如免疫球蛋白或脂蛋白，其中相同或不同多肽鏈通常是二硫化物和/或非共價(jià)連接的，以形成裝配的多鏈多肽)，也會(huì)以與穩(wěn)定的血漿蛋白質(zhì)前體具有基本上相同結(jié)構(gòu)的多聚體生成和采用含有多肽的本文融合物。這些多聚體就它們包含的多肽藥劑而言會(huì)是同質(zhì)的，或者它們可以含有超過(guò)一種多肽藥劑。

候選多肽藥劑可以自真核細(xì)胞生成，或者可以由原核細(xì)胞生成。可以通過(guò)解折疊(例如熱變性，DTT還原，等)將其進(jìn)一步加工，并且可以使用本領(lǐng)域中已知的方法進(jìn)一步重折疊。不改變一級(jí)序列的感興趣修飾包括多肽的化學(xué)衍生化，例如酰化，乙酰化，羧化，酰胺化，等。還包括糖基化修飾，例如那些通過(guò)在其合成和加工期間或在進(jìn)一步的加工步驟中修飾多肽的糖基化樣式進(jìn)行的；例如通過(guò)將多肽暴露于影響糖基化的酶，諸如哺乳動(dòng)物糖基化或者去糖基化酶。還包括具有磷酸化氨基酸殘基(例如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，或磷酸蘇氨酸)的序列?？梢允褂闷胀ǖ姆肿由飳W(xué)技術(shù)和合成化學(xué)修飾多肽，從而改善其對(duì)蛋白水解降解的抗性或優(yōu)化溶解度特性或使它們更適合作為治療劑。此類多肽的類似物包括那些含有與天然存在L-氨基酸不同的殘基(例如D-氨基酸或非天然存在合成氨基酸)的。可以用D-氨基酸替代一些或所有氨基酸殘基。

可以使用本領(lǐng)域中已知的常規(guī)方法通過(guò)體外合成制備候選多肽藥劑。多種商業(yè)合成裝置是可得的，例如Applied Biosystems，Inc.，Beckman，等的自動(dòng)化合成儀。通過(guò)使用合成儀，可以用非天然的氨基酸替代天然存在的氨基酸。特定的序列和制備方式會(huì)由便利，經(jīng)濟(jì)效果，需要的純度，等決定?；蛘?，可以依照重組合成的常規(guī)方法分離和純化候選多肽藥劑?？梢灾苽浔磉_(dá)宿主的裂解物，并使用HPLC，排阻層析，凝膠電泳，親和層析，或其它純化技術(shù)純化裂解物。在很大程度上，關(guān)于與產(chǎn)品制備及其純化的方法相關(guān)的污染物，使用的組合物會(huì)包含按重量計(jì)至少20％的期望產(chǎn)物，更通常按重量計(jì)至少約75％，優(yōu)選地按重量計(jì)至少約95％，且對(duì)于治療目的，通常按重量計(jì)至少約99.5％。通常，百分比會(huì)基于總蛋白質(zhì)。

在一些情況中，要篩選的候選多肽藥劑是抗體。術(shù)語(yǔ)“抗體”或“抗體模塊”意圖包括具有適合并識(shí)別表位的特定形狀的任何含有多肽鏈的分子結(jié)構(gòu)，其中一種或多種非共價(jià)結(jié)合相互作用穩(wěn)定分子結(jié)構(gòu)和表位之間的復(fù)合物。給定結(jié)構(gòu)與其特定表位的特異性或選擇性適合有時(shí)稱為“鎖匙”適合。原型抗體分子是免疫球蛋白，并且認(rèn)為來(lái)自所有來(lái)源(例如人，嚙齒類，家兔，牛，綿羊，豬，犬，其它哺乳動(dòng)物，雞，其它鳥類，等)的所有類型的免疫球蛋白(IgG，IgM，IgA，IgE，IgD等)是“抗體”。本發(fā)明中利用的抗體可以是多克隆抗體或單克隆抗體。通常在培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)基中提供抗體。在下文極為詳細(xì)討論抗體生成和篩選。

可以從極其多種來(lái)源(包括合成或天然化合物的文庫(kù))獲得候選藥劑。例如，許多手段可用于隨機(jī)和定向合成極其多種有機(jī)化合物，包括生物分子，包括表達(dá)隨機(jī)化的寡核苷酸和寡肽?；蛘撸?xì)菌，真菌，植物和動(dòng)物提取物形式的天然化合物的文庫(kù)是可得的或容易生成的。另外，經(jīng)由常規(guī)化學(xué)，物理和生物化學(xué)手段容易修飾天然或合成生成的文庫(kù)和化合物，并且可以用于生成重組文庫(kù)?？梢詫⒁阎乃幚韺W(xué)藥劑進(jìn)行定向或隨機(jī)化學(xué)修飾，諸如酰化，烷基化，酯化，酰胺化(amidification)，等以生成結(jié)構(gòu)類似物。

如下對(duì)候選藥劑篩選生物學(xué)活性，即對(duì)至少一份和通常多份樣品施用藥劑，有時(shí)與缺乏藥劑的樣品一起。測(cè)量響應(yīng)藥劑的參數(shù)變化，并且通過(guò)與用其它藥劑等獲得的參照樣品(例如在藥劑存在和缺乏下)比較來(lái)評(píng)估結(jié)果。在實(shí)施篩選以鑒定會(huì)預(yù)防，減輕或逆轉(zhuǎn)病原體的作用的候選藥劑的情況中，通常在致病因子存在下實(shí)施篩選，其中在最適合于要測(cè)定的結(jié)果的時(shí)間時(shí)添加致病因子。例如，在測(cè)試候選藥劑的保護(hù)/預(yù)防能力的情況中，可以在病原體之前，與病原體同時(shí)，或者在受到病原體感染后添加候選藥劑。作為另一個(gè)例子，在測(cè)試候選藥劑逆轉(zhuǎn)病原體作用的能力的情況中，可以在受到病原體感染后添加候選藥劑。如上文提及的，在一些情況中，“樣品”是已經(jīng)移入有細(xì)胞的經(jīng)遺傳修飾的非人動(dòng)物，例如對(duì)已經(jīng)移入有人造血細(xì)胞的免疫缺陷動(dòng)物(例如小鼠)提供候選藥劑，所述免疫缺陷動(dòng)物包含與EPO啟動(dòng)子可操作連接的編碼人EPO的核酸。在一些例子中，樣品是要移入的人造血細(xì)胞，即在移入免疫缺陷的經(jīng)遺傳修飾的動(dòng)物前對(duì)細(xì)胞(例如網(wǎng)織紅細(xì)胞，紅細(xì)胞，等)提供候選藥劑。

若要直接對(duì)經(jīng)移入的經(jīng)遺傳修飾的動(dòng)物施用候選藥劑，則可以通過(guò)用于對(duì)小鼠施用肽，小分子和核酸的本領(lǐng)域中的許多公知方法之任一種施用藥劑。例如，可以口服，粘膜，表面，皮內(nèi)，或者通過(guò)注射，例如腹膜內(nèi)，皮下，肌肉內(nèi)，靜脈內(nèi)，或顱內(nèi)注射等施用藥劑?？梢栽诰彌_液中施用藥劑，或者可以將它摻入多種配制劑之任一種中，例如通過(guò)與合適的藥學(xué)可接受媒介物組合進(jìn)行?！八帉W(xué)可接受媒介物”可以是得到聯(lián)邦或州政府的管理機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)或美國(guó)藥典或其它公認(rèn)的用于哺乳動(dòng)物(諸如人)的藥典中列出的媒介物。術(shù)語(yǔ)“媒介物”指為了對(duì)哺乳動(dòng)物施用而配制本發(fā)明化合物的稀釋劑，佐劑，賦形劑，或載體。此類藥用媒介物可以是脂質(zhì)，例如脂質(zhì)體，例如脂質(zhì)體樹狀聚合物，液體，諸如水和油，包括石油，動(dòng)物，植物或合成起源的，諸如花生油，大豆油，礦物油，芝麻油等，鹽水；阿拉伯樹膠，明膠，淀粉糊，滑石，角蛋白，膠體硅土，尿素，等。另外，可以使用輔助，穩(wěn)定，增稠，潤(rùn)滑和著色劑。可以將藥物組合物配制成固體，半固體，液體或氣體形式的制劑，諸如片劑，膠囊劑，粉劑，顆粒劑，軟膏劑，溶液劑，栓劑，注射液，吸入劑，凝膠劑，微球劑，和氣霧劑。藥劑在施用后可以是系統(tǒng)性的或者可以通過(guò)使用區(qū)域性施用，壁內(nèi)施用，或使用作用為在植入部位處保留活性劑量的植入物局部化?？梢耘渲苹钚詣┮詫?shí)現(xiàn)立即活性或者可以將其配制以實(shí)現(xiàn)持續(xù)釋放。對(duì)于一些狀況，特別是中樞神經(jīng)系統(tǒng)狀況，可能有必要配制藥劑以穿越血腦屏障(BBB)。一種用于穿過(guò)血腦屏障(BBB)的藥物投遞的策略需要破壞BBB，通過(guò)滲透手段諸如甘露醇或白三烯，或以生物化學(xué)方式通過(guò)使用血管活性物質(zhì)諸如緩激肽進(jìn)行。在通過(guò)血管內(nèi)注射施用組合物時(shí)，可以與藥劑共施用BBB破壞劑。穿過(guò)BBB的其它策略可需要使用內(nèi)源轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，包括窖蛋白-1介導(dǎo)的轉(zhuǎn)胞吞，載體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白諸如葡萄糖和氨基酸載體，受體介導(dǎo)的胰島素或轉(zhuǎn)鐵蛋白轉(zhuǎn)胞吞，和主動(dòng)流出轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白諸如p-糖蛋白。還可以將主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)模塊與本發(fā)明中使用的治療性化合物綴合以促進(jìn)轉(zhuǎn)運(yùn)穿過(guò)血管的內(nèi)皮壁?；蛘?，在BBB后藥劑的藥物投遞可以通過(guò)局部投遞，例如通過(guò)鞘內(nèi)投遞，例如經(jīng)由Ommaya儲(chǔ)器(參見例如美國(guó)專利No.5,222,982和5,385,582，通過(guò)提及將它們收入本文)；通過(guò)推注，例如通過(guò)注射器，例如玻璃體內(nèi)或顱內(nèi)；通過(guò)連續(xù)輸注，例如通過(guò)套管插入術(shù)，例如用對(duì)流(參見例如美國(guó)申請(qǐng)No.20070254842，通過(guò)提及將其收入本文)；或者通過(guò)植入其上已經(jīng)可逆性附加藥劑的裝置(參見例如美國(guó)申請(qǐng)No.20080081064和20090196903，通過(guò)提及將其收入本文)。

若在移入前對(duì)細(xì)胞提供藥劑，則將藥劑在溶液，或容易可溶形式中方便地添加至培養(yǎng)中的細(xì)胞的培養(yǎng)基?？梢栽诹鬟^(guò)系統(tǒng)中作為流(間斷或連續(xù))，或者添加化合物推注(單次或遞增)將藥劑添加至其它情況下靜態(tài)的溶液。在流過(guò)系統(tǒng)中，使用兩種流體，其中一種是生理學(xué)中性溶液，而另一種是與添加的測(cè)試化合物相同的溶液。將第一種流體通過(guò)細(xì)胞，接著是第二種。在一種單一溶液方法中，將測(cè)試化合物的推注添加至細(xì)胞周圍的培養(yǎng)基體積。培養(yǎng)基的組分的總體濃度不應(yīng)隨推注的添加或者在流過(guò)方法中的兩種溶液間顯著變化。

可以用不同藥劑濃度平行運(yùn)行多個(gè)測(cè)定法以獲得對(duì)各種濃度的差異響應(yīng)。如本領(lǐng)域中已知的，測(cè)定藥劑的有效濃度通常使用源自1：10，或其它對(duì)數(shù)比例稀釋的濃度范圍。在必要時(shí)，可以用第二個(gè)稀釋系列進(jìn)一步細(xì)化濃度。通常，這些濃度中的一種充當(dāng)陰性對(duì)照，即處于0濃度或低于藥劑的檢測(cè)水平或者處于或低于沒(méi)有給出表型的可檢測(cè)變化的藥劑濃度。

可以在用藥劑處理后的任何時(shí)間時(shí)實(shí)施經(jīng)移入的經(jīng)遺傳修飾的動(dòng)物中的細(xì)胞對(duì)候選藥劑的響應(yīng)的分析。例如，可以在與候選藥劑接觸后1，2，或3天，有時(shí)4，5，或6天，有時(shí)8，9，或10天，有時(shí)14天，有時(shí)21天，有時(shí)28天，有時(shí)1個(gè)月或更多，例如2個(gè)月，4個(gè)月，6個(gè)月或更多分析細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，分析包括在多個(gè)時(shí)間點(diǎn)時(shí)的分析。為分析選擇時(shí)間點(diǎn)會(huì)基于要實(shí)施的分析類型，如普通技術(shù)人員會(huì)容易理解的。

分析可以包括測(cè)量本文中描述的或本領(lǐng)域中已知的任何參數(shù)以測(cè)量細(xì)胞存活力，細(xì)胞增殖，細(xì)胞身份，細(xì)胞形態(tài)學(xué)，和細(xì)胞功能，特別是在它們可以屬于免疫細(xì)胞的細(xì)胞時(shí)。例如，可以使用流式細(xì)胞術(shù)來(lái)測(cè)定造血細(xì)胞的總數(shù)目或特定造血細(xì)胞類型的細(xì)胞數(shù)目。可以實(shí)施組織化學(xué)或免疫組織化學(xué)以測(cè)定細(xì)胞的凋亡狀態(tài)，例如末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶dUTP切口末端標(biāo)記(TUNEL)以測(cè)量DNA片段化，或免疫組織化學(xué)以檢測(cè)膜聯(lián)蛋白V對(duì)細(xì)胞表面上磷脂酰絲氨酸的結(jié)合。也可以采用流式細(xì)胞術(shù)來(lái)評(píng)估分化細(xì)胞類型和分化細(xì)胞的比例，例如用以測(cè)定造血細(xì)胞在藥劑存在下存活和/或分化的能力?？梢詫?shí)施ELISA，Western，和Northern印跡以測(cè)定經(jīng)移入的經(jīng)遺傳修飾的小鼠中表達(dá)的細(xì)胞因子，趨化因子，免疫球蛋白等的水平，例如用以評(píng)估移入細(xì)胞的功能，評(píng)估紅細(xì)胞的存活，等。也可以實(shí)施測(cè)試免疫細(xì)胞功能的體內(nèi)測(cè)定法，以及與感興趣的特定疾病或病癥(諸如貧血，例如鐮狀細(xì)胞貧血，等)相關(guān)的測(cè)定法。參見例如Current Protocols in Immunology(Richard Coico編，John Wiley&Sons，Inc.2012)及Immunology Methods Manual(I.Lefkovits編，Academic Press 1997)，其公開內(nèi)容通過(guò)提及收入本文。

因此，例如提供了用于測(cè)定藥劑對(duì)病原體可感染或感染的類紅細(xì)胞的影響的方法，其包括對(duì)已經(jīng)移入有人網(wǎng)織紅細(xì)胞和/或紅細(xì)胞的人EPO小鼠(例如Rag2^-/-IL2rg^-/-EPO^m/h小鼠)施用藥劑；在藥劑存在下隨時(shí)間測(cè)量移入細(xì)胞的存活力的參數(shù)；并比較所述測(cè)量與自沒(méi)有暴露于所述藥劑的經(jīng)移入的人EPO小鼠的測(cè)量。若在單次施用或在選定時(shí)間里兩次或更多次施用藥劑后藥劑將小鼠的外周血中的人紅細(xì)胞的感染和/或死亡降低至少20％，30％，40％或更多，在一些情況中50％，60％，70％或更多，例如80％，90％或100％，即至檢測(cè)不到的量，則它測(cè)定為抗致病的。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，在移入人造血細(xì)胞后至少3天，至少1周，至少10天，例如在移入人造血細(xì)胞后2周，3周，或4周，例如在移入人造血細(xì)胞后6周，8周，10周或更久施用藥物或藥物組合。

在本文中別處提供了主題小鼠用途的其它例子。本公開內(nèi)容中描述的經(jīng)遺傳修飾且經(jīng)移入的小鼠的別的應(yīng)用在閱讀本公開內(nèi)容后對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)是顯而易見的。

本公開內(nèi)容的非限制性方面的例子

上文描述的本主題的各方面(包括各實(shí)施方案)可以是單獨(dú)或與一個(gè)或多個(gè)其它方面或?qū)嵤┓桨附M合時(shí)有益的。并非限制前面的描述，下文提供了編號(hào)1-58的本公開內(nèi)容的某些非限制性方面。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員在閱讀本公開內(nèi)容后會(huì)明白的，可以使用每一個(gè)單獨(dú)編號(hào)的方面或與任何在前或在后的單獨(dú)編號(hào)的方面組合。這意圖為各方面的所有此類組合提供支持且不限于下文明確提供的各方面的組合：

1.一種經(jīng)遺傳修飾的非人動(dòng)物，其包含：

與EPO基因啟動(dòng)子可操作連接的編碼人EPO蛋白質(zhì)(hEPO)的核酸序列。

2.依照1的非人動(dòng)物，其中所述EPO基因啟動(dòng)子是內(nèi)源非人EPO啟動(dòng)子。

3.依照1的非人動(dòng)物，其中所述可操作連接是與非人動(dòng)物EPO基因座處的內(nèi)源非人EPO啟動(dòng)子的。

4.依照3的非人動(dòng)物，其中所述可操作連接導(dǎo)致所述非人EPO基因基因座處的非人EPO基因中的無(wú)效突變。

5.依照4的非人動(dòng)物，其中所述非人動(dòng)物對(duì)于包含所述編碼hEPO的核酸序列的等位基因是雜合的。

6.依照4的非人動(dòng)物，其中所述非人動(dòng)物對(duì)于包含所述編碼hEPO的核酸序列的等位基因是純合的。

7.依照1-6任一項(xiàng)的非人動(dòng)物，其中所述編碼hEPO的核酸序列包含人EPO基因組編碼和非編碼序列。

8.依照1-6任一項(xiàng)的非人動(dòng)物，其中所述編碼hEPO的核酸序列包含人EPO cDNA序列。

9.依照1-8任一項(xiàng)的非人動(dòng)物，其中所述非人動(dòng)物表達(dá)一種或多種選自下組的別的人蛋白質(zhì)：

由在M-csf啟動(dòng)子控制下的核酸編碼的hM-CSF蛋白質(zhì)，

由在Il-3啟動(dòng)子控制下的核酸編碼的hIL3蛋白質(zhì)，

由在Gm-csf啟動(dòng)子控制下的核酸編碼的hGM-CSF蛋白質(zhì)，

由在TPO啟動(dòng)子控制下的核酸編碼的hTPO蛋白質(zhì)，和

由在Sirpa啟動(dòng)子控制下的核酸編碼的hSirpa蛋白質(zhì)。

10.依照9的非人動(dòng)物，其中所述啟動(dòng)子是相應(yīng)的非人動(dòng)物基因基因座處的內(nèi)源非人動(dòng)物啟動(dòng)子，且其中所述非人動(dòng)物對(duì)于所述非人基因是雜合無(wú)效的。

11.依照9的非人動(dòng)物，其中所述啟動(dòng)子是相應(yīng)的非人動(dòng)物基因基因座處的內(nèi)源非人動(dòng)物啟動(dòng)子，且其中所述非人動(dòng)物對(duì)于所述非人基因是純合無(wú)效的。

12.依照9的非人動(dòng)物，其中所述人蛋白質(zhì)至少包括hTPO，hIL3，hGM-CSF，和hSirpa。

13.依照1-12任一項(xiàng)的非人動(dòng)物，其中所述非人動(dòng)物是免疫缺陷的。

14.依照13的非人動(dòng)物，其中所述免疫缺陷是由Rag2和I12rg之一或二者的缺陷引起的。

15.依照1-14任一項(xiàng)的非人動(dòng)物，其中所述非人動(dòng)物是哺乳動(dòng)物。

16.依照15的非人動(dòng)物，其中所述哺乳動(dòng)物是嚙齒動(dòng)物。

17.依照16的非人動(dòng)物，其中所述嚙齒動(dòng)物是小鼠。

18.依照1-17任一項(xiàng)的非人動(dòng)物，其中所述非人動(dòng)物進(jìn)一步包含人造血細(xì)胞的移入。

19.依照18的非人動(dòng)物，其中所述人造血細(xì)胞包含一種或多種選自下組的細(xì)胞：人CD34陽(yáng)性細(xì)胞，人造血干細(xì)胞，人髓樣細(xì)胞前體細(xì)胞，人類紅細(xì)胞前體細(xì)胞，人髓樣細(xì)胞，人樹突細(xì)胞，人單核細(xì)胞，人粒細(xì)胞，人紅細(xì)胞，人嗜中性粒細(xì)胞，人肥大細(xì)胞，人胸腺細(xì)胞，和人B淋巴細(xì)胞。

20.依照19的非人動(dòng)物，其中所述非人動(dòng)物包含氯膦酸鹽。

21.依照20的非人動(dòng)物，其中所述非人動(dòng)物進(jìn)一步包含靶向類紅細(xì)胞譜系的人細(xì)胞的病原體的感染。

22.依照21的非人動(dòng)物，其中所述病原體選自瘧原蟲(Plasmodium sp.)，巴貝蟲(Babesia sp.)，和泰勒蟲(Theileri sp.)。

23.一種用于鑒定抑制靶向類紅細(xì)胞譜系的人細(xì)胞的病原體感染的藥劑的方法，該方法包括：

a.對(duì)經(jīng)遺傳修飾的非人動(dòng)物施用候選藥劑，其中所述動(dòng)物包含：

i.與EPO基因啟動(dòng)子可操作連接的編碼人EPO蛋白質(zhì)(hEPO)的核酸序列，

ii.一種或多種在所述非人動(dòng)物中導(dǎo)致免疫缺陷的基因突變，

iii.人造血細(xì)胞的移入，和

iv.靶向類紅細(xì)胞譜系的人細(xì)胞的病原體的感染，并

b.測(cè)定該藥劑是否降低病原體感染的非人動(dòng)物中所述病原體的量。

24.一種用于鑒定預(yù)防靶向類紅細(xì)胞譜系的人細(xì)胞的病原體感染的藥劑的方法，該方法包括：

a.使經(jīng)遺傳修飾的非人動(dòng)物與氯膦酸鹽接觸，其中所述非人動(dòng)物包含：

i.與EPO基因啟動(dòng)子可操作連接的編碼人EPO蛋白質(zhì)(hEPO)的核酸序列，

ii.一種或多種在所述非人動(dòng)物中導(dǎo)致免疫缺陷的基因突變，和

iii.人造血細(xì)胞的移入，

b.對(duì)經(jīng)遺傳修飾的非人動(dòng)物施用候選藥劑，

c.對(duì)該經(jīng)遺傳修飾的非人動(dòng)物施用受到寄生蟲感染的網(wǎng)織紅細(xì)胞或紅細(xì)胞，并

d.測(cè)定該藥劑是否預(yù)防所述非人動(dòng)物的人網(wǎng)織紅細(xì)胞和/或紅細(xì)胞的感染。

25.依照23或24的方法，其中所述EPO基因啟動(dòng)子是內(nèi)源非人啟動(dòng)子。

26.依照23或24的方法，其中所述可操作連接是與非人動(dòng)物EPO基因座處的內(nèi)源非人EPO啟動(dòng)子的。

27.依照26的方法，其中所述可操作連接導(dǎo)致所述非人EPO基因基因座處的非人EPO基因中的無(wú)效突變。

28.依照27的方法，其中所述非人動(dòng)物對(duì)于包含所述編碼hEPO的核酸序列的等位基因是雜合的。

29.依照27的方法，其中所述非人動(dòng)物對(duì)于包含所述編碼hEPO的核酸序列的等位基因是純合的。

30.依照23-29任一項(xiàng)的方法，其中所述編碼hEPO的核酸序列包含人EPO基因組編碼和非編碼序列。

31.依照23-29任一項(xiàng)的方法，其中所述編碼hEPO的核酸序列包含人EPO cDNA序列。

32.依照23-31任一項(xiàng)的方法，其中所述非人動(dòng)物表達(dá)一種或多種選自下組的別的人蛋白質(zhì)：

由在M-csf啟動(dòng)子控制下的核酸編碼的hM-CSF蛋白質(zhì)，

由在Il-3啟動(dòng)子控制下的核酸編碼的hIL3蛋白質(zhì)，

由在Gm-csf啟動(dòng)子控制下的核酸編碼的hGM-CSF蛋白質(zhì)，

由在TPO啟動(dòng)子控制下的核酸編碼的hTPO蛋白質(zhì)，和

由在Sirpa啟動(dòng)子控制下的核酸編碼的hSirpa蛋白質(zhì)。

33.依照32的方法，其中所述啟動(dòng)子是相應(yīng)的非人動(dòng)物基因基因座處的內(nèi)源非人動(dòng)物啟動(dòng)子，且其中所述非人動(dòng)物對(duì)于所述非人基因是雜合無(wú)效的。

34.依照33的方法，其中所述啟動(dòng)子是相應(yīng)的非人動(dòng)物基因基因座處的內(nèi)源非人動(dòng)物啟動(dòng)子，且其中所述非人動(dòng)物對(duì)于所述非人基因是純合無(wú)效的。

35.依照23-34任一項(xiàng)的方法，其中所述非人動(dòng)物對(duì)于Rag2和Il2rg之一或二者是缺陷的。

36.依照23-35任一項(xiàng)的方法，其中所述人造血細(xì)胞包含一種或多種選自下組的細(xì)胞：人CD34陽(yáng)性細(xì)胞，人造血干細(xì)胞，人髓樣細(xì)胞前體細(xì)胞，人類紅細(xì)胞前體細(xì)胞，人髓樣細(xì)胞，人樹突細(xì)胞，人單核細(xì)胞，人粒細(xì)胞，人紅細(xì)胞，人嗜中性粒細(xì)胞，人肥大細(xì)胞，人胸腺細(xì)胞，和人B淋巴細(xì)胞。

37.依照23-36任一項(xiàng)的方法，其中所述病原體選自瘧原蟲，巴貝蟲，和泰勒蟲。

38.依照37的方法，其中所述病原體是瘧原蟲且所述瘧原蟲選自鐮狀瘧原蟲(P.falciparum)和間日瘧原蟲(P.vivax)。

39.依照23-38任一項(xiàng)的方法，其中所述非人動(dòng)物是哺乳動(dòng)物。

40.依照39的方法，其中所述哺乳動(dòng)物是嚙齒動(dòng)物。

41.依照40的方法，其中所述嚙齒動(dòng)物是小鼠。

42.一種用于生成表達(dá)人EPO蛋白質(zhì)(hEPO)的小鼠的方法，其包括：

使小鼠多能干細(xì)胞與包含與EPO啟動(dòng)子序列可操作連接的hEPO或其片段的編碼序列的核酸序列接觸，其中所述編碼序列和EPO啟動(dòng)子序列形成側(cè)翼為與內(nèi)源小鼠EPO基因座同源的序列的盒，

在促進(jìn)該核酸序列通過(guò)同源重組在內(nèi)源小鼠EPO基因座處整合入小鼠基因組的條件下培養(yǎng)該多能干細(xì)胞；并

自包含編碼hEPO的核酸序列的小鼠多能干細(xì)胞生成小鼠。

43.依照42的方法，其中所述小鼠多能干細(xì)胞是ES細(xì)胞或iPS細(xì)胞。

44.依照42或43的方法，其中所述小鼠多能干細(xì)胞對(duì)于Rag2和/或IL2rg是缺陷的。

45.依照42-44任一項(xiàng)的方法，其中所述EPO啟動(dòng)子序列是人EPO啟動(dòng)子的序列。

46.依照42-44任一項(xiàng)的方法，其中所述EPO啟動(dòng)子序列是內(nèi)源非人EPO啟動(dòng)子的序列。

47.依照42-46任一項(xiàng)的方法，其中所述整合導(dǎo)致非人EPO基因基因座處的非人EPO基因的置換。

48.依照42-47任一項(xiàng)的方法，其中所述編碼hEPO的核酸序列包含人EPO基因組編碼和非編碼序列。

49.依照42-48任一項(xiàng)的方法，其中所述編碼hEPO的核酸序列包含人EPO cDNA序列。

50.一種用于生成表達(dá)人EPO蛋白質(zhì)(hEPO)且包含人造血系統(tǒng)的小鼠的方法，其包括：

將包含人造血祖細(xì)胞的細(xì)胞群體移植入通過(guò)依照42-49任一項(xiàng)的方法生成的經(jīng)遺傳修飾的小鼠。

51.依照50的方法，其中所述移植包含尾靜脈注射，胎肝注射，或眶后注射。

52.依照50或51的方法，其中所述經(jīng)遺傳修飾的小鼠在移植之前經(jīng)過(guò)亞致死照射。

53.依照50-52任一項(xiàng)的方法，其中所述人造血祖細(xì)胞是CD34+細(xì)胞。

54.依照50-53任一項(xiàng)的方法，其中所述人造血祖細(xì)胞來(lái)自胎肝，成人骨髓，或臍帶血。

55.一種用于生成受到靶向類紅細(xì)胞譜系的人細(xì)胞的人病原體感染的小鼠的方法，其包括：

依照50-54的方法生成表達(dá)人EPO蛋白質(zhì)(hEPO)且包含人造血系統(tǒng)的小鼠，

對(duì)該小鼠注射氯膦酸鹽，并

對(duì)該小鼠注射受到寄生蟲感染的人紅血球(PRBC)。

56.依照55的方法，其中所述方法進(jìn)一步包括將健康人紅血球注射入該小鼠。

57.依照55的方法，其中所述寄生蟲選自瘧原蟲，巴貝蟲，和泰勒蟲。

58.依照57的方法，其中所述寄生蟲是瘧原蟲且所述瘧原蟲選自鐮狀瘧原蟲和間日瘧原蟲。

實(shí)施例

提出以下實(shí)施例以給本領(lǐng)域普通技術(shù)人員提供如何實(shí)施和使用本發(fā)明的完整公開內(nèi)容和描述，而并不意圖限制發(fā)明人視為其發(fā)明的范圍，它們也不意圖代表下述實(shí)驗(yàn)是實(shí)施的所有或唯一實(shí)驗(yàn)。已經(jīng)努力確保使用數(shù)字(例如量，溫度等)的準(zhǔn)確性，但是應(yīng)當(dāng)考慮一些實(shí)驗(yàn)誤差和偏差。除非另有說(shuō)明，份是重量份，分子量是重量平均分子量，溫度以攝氏度計(jì)，而壓力為或接近大氣壓。

分子和細(xì)胞生物化學(xué)的通用方法可見于諸如下述標(biāo)準(zhǔn)教科書：Molecular Cloning：A Laboratory Manual，3rd Ed.(Sambrook et al.，HaRBor Laboratory Press 2001)；Short Protocols in Molecular Biology；4th Ed.(Ausubel et al.eds.，John Wiley&Sons 1999)；Protein Methods(Bollag et al.，John Wiley&Sons 1996)；Nonviral Vectors for Gene Therapy(Wagner et al.eds.，Academic Press 1999)；Viral Vectors(Kaplift&Loewy eds.，Academic Press 1995)；Immunology Methods Manual(I.Lefkovits ed.，Academic Press 1997)；和Cell and Tissue Culture：Laboratory Procedures in Biotechnology(Doyle&Griffiths，John Wiley&Sons 1998)，通過(guò)援引將其公開內(nèi)容收入本文。本公開內(nèi)容中提到的用于遺傳操作的試劑，克隆載體，和試劑盒可得自供應(yīng)商，諸如BioRad，Stratagene，Invitrogen，Sigma-Aldrich，和ClonTech。

實(shí)施例1

人EPO敲入小鼠的生成。

用來(lái)自人促紅細(xì)胞生成素基因基因座的編碼序列(人NCBI基因ID：2056；HGNC：3415；NM_000799.2(SEQ ID NO：3)的RefSeq cDNA轉(zhuǎn)錄物和NP_000790(SEQ ID NO：4)的所編碼的蛋白質(zhì))替換小鼠促紅細(xì)胞生成素基因基因座處的編碼序列(小鼠NCBI基因ID：13856；MGI：95407；NM_007942.2(SEQ ID NO：1)的RefSeq轉(zhuǎn)錄物cDNA和NP_031968(SEQ ID NO：2)的所編碼的蛋白質(zhì))。

表1

具體而言，刪除GRCm38：ch5：137482017：137485745(負(fù)鏈)處的小鼠基因組區(qū)域并在它的位置插入來(lái)自GRCh37：ch7：100318604：100321567(正鏈)的人基因組序列。這導(dǎo)致小鼠Epo基因的編碼外顯子1至5(整個(gè)編碼區(qū))被人EPO基因的外顯子1至5加3’人非翻譯區(qū)替換?？偣?729nt小鼠序列被2964nt人序列替換。

簡(jiǎn)言之，使用遺傳工程技術(shù)構(gòu)建用于在單一靶向步驟中用人EPO基因替換小鼠EPO基因的靶向構(gòu)建體(參見Valenzuela等(2003)見上文，和美國(guó)專利No.6,586,251)。分別自細(xì)菌人工染色體bMQ-386K4和RP11-797M3獲得小鼠和人EPO DNA。將通過(guò)缺口修復(fù)克隆生成的APspXI線性化靶向構(gòu)建體電穿孔入Rag2^-/-IL2rg^Y/-ES細(xì)胞中，所述靶向構(gòu)建體含有側(cè)翼為小鼠EPO上游和下游同源臂的2964nt人EPO序列(從外顯子1中的ATG延伸至外顯子5中的終止密碼子，即包括3’下游序列)和側(cè)翼為lox的(floxed)neo選擇盒(圖2和圖3)。小鼠EPO 5’非翻譯區(qū)(UTR)和人EPO外顯子1之間的接合處以SEQ ID NO：5提供，其中人基因的第一個(gè)核苷酸前面的最后一個(gè)小鼠核苷酸是下文表2中SEQ ID NO：5的非粗體部分中的“G”(在方括號(hào)中顯示)，而人序列的第一個(gè)核苷酸是下文表2中SEQ ID NO：5的粗體部分中的“A”(在方括號(hào)中顯示)。

表2

人3’UTR和選擇盒的5’末端之間的接合處以SEQ ID NO：6提供，其中人序列的最后一個(gè)核苷酸是下文表3中SEQ ID NO：6的粗體部分中的“C”(在單方括號(hào)中顯示)，而選擇盒序列的第一個(gè)核苷酸是下文表3中SEQ ID NO：6的非粗體部分中的“C”(在雙方括號(hào)中顯示)；下游接合區(qū)還含有3’端的loxP位點(diǎn)，其用于去除側(cè)翼為lox的泛素啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的neo盒。

表3

選擇盒的3’末端和小鼠基因組之間的接合處以SEQ ID NO：7提供，其中單方括號(hào)中顯示的“C”是neo盒的最后一個(gè)核苷酸，而該盒后面的小鼠基因組的第一個(gè)核苷酸是雙方括號(hào)中顯示的“G”，如下文表4中顯示的。

表4

通過(guò)天然等位基因喪失(LONA)測(cè)定法(Valenzuela等(2003)見上文)鑒定正確靶向的hEPOES細(xì)胞克隆，其中通過(guò)對(duì)小鼠EPO基因中靶向刪除的序列特異性的兩個(gè)TaqMan^TM定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qPCR)測(cè)定天然的，未修飾的EPO基因的拷貝數(shù)。qPCR測(cè)定法包含以下引物-探針組(以5’至3’書寫)：上游正向引物，CATCTGCGACAGTCGAGTTC(SEQ ID NO：8)；上游反向引物，CCAGGGAGCTTACCGTGAC(SEQ ID NO：9)；上游探針，F(xiàn)AM-AGGTACATCTTAGAGGCCAAGGAGGCA-BHQ(SEQ ID NO：10)；下游正向引物，ACAGCCGAGTCCTGGAGAG(SEQ ID NO：11)；下游反向引物，AAGCCCTGAGCGTGAGTTC(SEQ ID NO：12)；下游探針，F(xiàn)AM-AGGCCAAGGAGGCCGAGAATATCACG-BHQ(SEQ ID NO：13)；其中FAM指5-羧基熒光素?zé)晒馓结?，而BHQ指黑洞淬滅劑型的熒光淬滅劑(Biosearch Technologies)。依照制造商的建議在384孔PCR板(MicroAmp^TM光學(xué)384孔反應(yīng)板，Life Technologies)中將自已經(jīng)攝取靶向載體并且在其基因組中摻入的ES細(xì)胞克隆純化的DNA與TaqMan^TM基因表達(dá)主混合物(Life Technologies)組合，并且在Applied Biosystems Prism 7900HT中循環(huán)，其收集PCR過(guò)程期間的熒光數(shù)據(jù)，并且測(cè)定閾循環(huán)(Ct)，即積累的熒光達(dá)到預(yù)先設(shè)置的閾值的分?jǐn)?shù)PCR循環(huán)。對(duì)每份DNA樣品運(yùn)行上游和下游EPO特異性qPCR和兩個(gè)針對(duì)非靶向性參照基因的qPCR。計(jì)算每個(gè)EPO特異性qPCR和每個(gè)參照基因qPCR之間的Ct值差異(ΔCt)，然后計(jì)算所有測(cè)定樣品的每個(gè)ΔCt和中值ΔCt之間的差異以對(duì)每份樣品獲得ΔΔCt值。自下述公式計(jì)算每份樣品中EPO基因的拷貝數(shù)：拷貝數(shù)＝2·2^-ΔΔCt。已經(jīng)喪失其天然拷貝之一的正確靶向的克隆會(huì)具有等于1的EPO基因拷貝數(shù)。通過(guò)包含以下引物-探針組(以5’至3’書寫)的TaqMan^TMqPCR測(cè)定法實(shí)施人源化等位基因中人EPO基因序列替換刪除的小鼠EPO基因序列的確認(rèn)：人正向引物，GAGCCCTGCACTGGACAAC(SEQ ID NO：14)；人反向引物，TCCCATGAACGCTGAGAGTC(SEQ ID NO：15)；和人探針，AGGGTCAAGGAGCCATAGACAGAATGGC(SEQ ID NO：16)。

用瞬時(shí)Cre表達(dá)載體電穿孔正確靶向的ES細(xì)胞以去除藥物選擇盒。為了生成包含人EPO且Rag2和Il2rg缺陷的小鼠，如上所述鑒定正確靶向的ES細(xì)胞，并且使用本領(lǐng)域中已知的技術(shù)將其導(dǎo)入植入前胚胎中。然后，將人EPO敲入(KI)小鼠回交以生成Rag2和Il2rg缺陷且表達(dá)人EPO的小鼠。

實(shí)施例2

人SIRPα小鼠的生成。

結(jié)合本文中描述的例子中的一些，如美國(guó)專利申請(qǐng)公開文本No.2013-0340105(通過(guò)援引將其公開內(nèi)容收入本文)中描述的那樣制備包括隨機(jī)整合入經(jīng)遺傳修飾的小鼠的基因組的編碼人SIRPα的核酸序列的經(jīng)遺傳修飾的小鼠。

結(jié)合本文中描述的例子中的一些，如下文描述的那樣制備人SIRPα敲入小鼠。人SIRPα已知存在至少10種等位基因形式。在這個(gè)特定實(shí)施例中，采用人SIRPα變體1來(lái)人源化小鼠的內(nèi)源SIRPα基因。

使用技術(shù)(參見例如美國(guó)專利No.6,586,251和Valenzuela et al.(2003)，見上文)構(gòu)建用于人源化SIRP(例如SIRPα)基因胞外區(qū)的打靶載體。

簡(jiǎn)言之，修飾小鼠細(xì)菌人工染色體(BAC)克隆bMQ-261H14以刪除內(nèi)源SIRPα基因的含有外顯子2至4的序列并使用人BAC克隆CTD-3035H21插入人SIRPα基因的外顯子2至4。將BAC克隆bMQ-261H14中與內(nèi)源SIRPα基因外顯子2至4對(duì)應(yīng)的基因組DNA(～8555bp)用來(lái)自BAC克隆CTD-3035H21的含有人SIRPα基因外顯子2至4的～8581bp DNA片段替換。BAC克隆CTD-3035H21中所含人SIRPα等位基因的序列分析揭示與人變體1對(duì)應(yīng)的等位基因。將側(cè)翼為loxP位點(diǎn)的新霉素盒添加至含有人SIRPα基因外顯子2至4的～8581bp人DNA片段的末端(圖4)。

上游和下游同源臂自小鼠BAC DNA分別在外顯子2和4的5′和3′位置獲得，并添加至～8581bp人片段-新霉素盒以創(chuàng)建最終的用于人源化內(nèi)源SIRPα基因的打靶載體，其自5′至3′含有5′同源臂(含有內(nèi)源SIRPα基因外顯子2的5′的19kb小鼠DNA)，～8581bp DNA片段(含有人SIRPα基因的外顯子2至4)，側(cè)翼為loxP位點(diǎn)的新霉素盒，和3′同源臂(含有內(nèi)源SIRPα基因外顯子4的3′的21kb小鼠DNA)。打靶載體的靶向插入將新霉素盒定位在小鼠SIRPα基因外顯子4和5之間的第五內(nèi)含子中。打靶載體通過(guò)SwaI消化而線性化，然后用于細(xì)菌細(xì)胞中的同源重組以實(shí)現(xiàn)人SIRPα基因外顯子2至4對(duì)小鼠SIRPα基因中外顯子2至4的靶向替換(圖4)。

使用靶向BAC DNA(上文描述的)電穿孔小鼠ES細(xì)胞以創(chuàng)建包含下述替換的經(jīng)修飾ES細(xì)胞，所述替換為包含人SIRPα基因外顯子2至4的基因組片段對(duì)內(nèi)源小鼠SIRPα基因中外顯子2至4的替換。使用TAQMAN^TM探針(Lie and Petropoulos，1998.Curr.Opin.Biotechnology 9：43-48)通過(guò)定量PCR來(lái)鑒定含有包含人SIRPα基因外顯子2至4的基因組片段的陽(yáng)性ES細(xì)胞?？缭缴嫌尾迦朦c(diǎn)的核苷酸序列包括下述，其指示與插入點(diǎn)處存在的人SIRPα基因組序列連續(xù)連接的插入點(diǎn)上游的內(nèi)源小鼠序列(下文圓括號(hào)內(nèi)所含的)：(AGCTCTCCTACCACTAGACTGCTGAGACCCGCTGCTCTGCTCAGGACTCGATTTCCAGTACACAATCTCCCTCTTTGAAAAGTACCACACATCCTGGGGT)GCTCTTGCATTTGTGTGACACTTTGCTAGCCAGGCTCAGTCCTGGGTTCCAGGTGGGGACTCAAACACACTGGCACGAGTCTACATTGGATATTCTTGGT(SEQ ID NO：17)?？缭叫旅顾睾?′末端處的下游插入點(diǎn)的核苷酸序列包括下述，其指示與插入點(diǎn)下游的盒序列連續(xù)的人SIRPα基因組序列(下文圓括號(hào)內(nèi)所含的，loxP序列為斜體)：GCTCCCCATTCCTCACTGGCCCAGCCCCTCTTCCCTACTCTTTCTAGCCCCTGCCTCATCTCCCTGGCTGCCATTGGGAGCCTGCCCCACTGGAAGCCAG(TCGAGATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATATGCATGGCCTCCGCGCCGGGTTTTGGCGCCTCCCGCGGGCGCCCCCCTCCTCACGGCGA)(SEQ ID NO：18)?？缭叫旅顾睾?′末端處的下游插入點(diǎn)的核苷酸序列包括下述，其指示與內(nèi)源SIRPα基因外顯子4的3′的小鼠基因組序列連續(xù)的盒序列(下文圓括號(hào)內(nèi)所含的)：CATTCTCAGTATTGTTTTGCCAAGTTCTAATTCCATCAGACCTCGACCTGCAGCCCCTAGATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATGCTAGC(TGTCTCATAGAGGCTGGCGATCTGGCTCAGGGACAGCCAGTACTGCAAAGAGTATCCTTGTTCATACCTTCTCCTAGTGGCCATCTCCCTGGGACAGTCA)(SEQ ID NO：19)。然后使用方法(參見例如美國(guó)專利No.7,294,754和Poueymirou et al.2007，F(xiàn)0generation mice that are essentially fully derived from the donor gene-targeted ES cells allowing immediate phenotypic analyses Nature Biotech.25(1)：91-99，見上文)使用陽(yáng)性ES細(xì)胞克隆植入雌性小鼠以生成一窩含有人SIRPα基因外顯子2至4插入小鼠內(nèi)源SIRPα基因的幼畜。

使用上文所述靶定ES細(xì)胞作為供體ES細(xì)胞并通過(guò)方法(見上文)導(dǎo)入8細(xì)胞階段的小鼠胚胎。使用檢測(cè)人SIRPα基因序列的存在的改良的等位基因測(cè)定法(Valenzuela et al.(2003)，見上文)通過(guò)基因分型來(lái)鑒定攜帶內(nèi)源SIRPα基因外顯子2至4人源化的小鼠。

可以將攜帶人源化SIRPα基因構(gòu)建物(即在小鼠SIRPα基因中含有人SIRPα外顯子2至4)的小鼠與Cre刪除小鼠株(參見例如國(guó)際專利申請(qǐng)公開文本No.WO 2009/114400)育種以去除例如在ES細(xì)胞階段或在胚胎中未去除的由打靶載體引入的任何側(cè)翼為lox的新霉素盒。任選地，在小鼠中保留新霉素盒。

實(shí)施例3

復(fù)合敲入小鼠的生成。

將人EPO敲入小鼠與表達(dá)其它感興趣人基因(或是作為進(jìn)入小鼠基因組的隨機(jī)整合物或是作為敲入，即自相應(yīng)的小鼠基因座)的小鼠雜交。例如，將Rag2^-/-，IL-2rg^Y/-，hEPO KI小鼠與如上所述自小鼠TPO基因座表達(dá)人TPO(Rongvaux et al.，2011，Proc Natl Acad Sci USA，108(6)：2378-2383)，自小鼠IL-3/GM-CSF基因座表達(dá)人IL-3和人GM-CSF(Willinger et al，2011，Proc Natl Acad Sci USA，108(6)：2390-2395)，自小鼠M-CSF基因座表達(dá)人M-CSF(Rathinam et al，2011，Blood，118(11)：3119-3128)，和/或作為隨機(jī)整合物(Strowig et al.，2011，Proc Natl Acad Sci USA，108(32)：13218-13223)或自小鼠基因座表達(dá)人SIRPa的小鼠雜交以生成表達(dá)這些人蛋白質(zhì)的組合(Rag2^-/-Il2rg^無(wú)效hSIRPa^h/hTpo^h/hMcsf^h/hIl3/Gmcsf^h/hEpO^h/h)的小鼠。表達(dá)人TPO，人IL-3，人GM-CSF，人M-CSF，和人SIRPa中一種或多種的經(jīng)遺傳修飾的小鼠極為詳細(xì)地描述于美國(guó)專利No.8,541,646和8,847,004；美國(guó)專利申請(qǐng)公開文本No.2014/0134662；和PCT國(guó)際公開文本No.WO/2014/039782；通過(guò)援引將其公開內(nèi)容收入本文。

實(shí)施例4

用于血液階段的鐮狀瘧原蟲和間日瘧原蟲的人源化小鼠模型的開發(fā)

本文中證明了通過(guò)提供具有有限的自小鼠至人的交叉反應(yīng)性的生長(zhǎng)因子來(lái)遺傳人源化鼠宿主能成功強(qiáng)化一般而言的人細(xì)胞移入和具體而言的人造血干細(xì)胞(HSC)移入的小鼠中的紅細(xì)胞生成。

自它們的基因組表達(dá)人EPO(以增強(qiáng)終末紅細(xì)胞生成)以及人TPO，MCSF，和IL-3(以增強(qiáng)HSC維持和早期紅細(xì)胞生成)的MITERG小鼠特征在于人HSC移入的小鼠的骨髓中比不表達(dá)hEPO的小鼠更高水平的人紅細(xì)胞生成(圖5A，比較“hSIRPa-，hEPO+”(即“MITERG小鼠”)與“hSIRPa-，hEPO-”(即“MITRG小鼠”))，事實(shí)上等同于相同動(dòng)物中的小鼠紅細(xì)胞生成。然而，這些小鼠缺乏顯著水平的循環(huán)人類紅細(xì)胞(未顯示的數(shù)據(jù))。

假設(shè)了外周中低水平的循環(huán)人類紅細(xì)胞源自小鼠巨噬細(xì)胞對(duì)外周人RBC的破壞(噬紅細(xì)胞作用)。通過(guò)生成自小鼠基因組中除mSIRPa基因座以外的基因座即作為隨機(jī)整合的轉(zhuǎn)基因表達(dá)hSIRPa的小鼠，即作為hSIRPa-tg(Rag2^-/-Il2rg^無(wú)效Tpo^h/hMcsf^h/hIl3^h/hGmcsf^h/hEpo^h/hSIRPα-tg+，即“MISTER-G小鼠”)和作為敲入(KI)自mSIRPa基因座表達(dá)hSIRPa的小鼠，即作為hSIRPa KI(Rag2^-/-Il2rg^無(wú)效Tpo^h/hMcsf^h/hIl3^h/hGmcsf^h/hEpo^h/hSIRPα^h/h，即“SupER-G小鼠”)，評(píng)估了SIRPa在這個(gè)過(guò)程中的作用。

例如作為MISTER-G小鼠中隨機(jī)整合的轉(zhuǎn)基因，人SIRPa的表達(dá)促進(jìn)表達(dá)人EPO的人HSC移入的小鼠的骨髓中人類紅細(xì)胞數(shù)目的進(jìn)一步增多(圖5，小圖A，比較“hSIRPa+，hEPO+”與“hSIRPa-，hEPO+”)。人SIRPa的引入顯著改善外周中大多數(shù)造血細(xì)胞的存活，其中外周血中人CD45⁺細(xì)胞(包括淋巴樣和髓樣細(xì)胞)的頻率比在不表達(dá)hSIRPa的小鼠中觀察到的提高至少10倍。然而，hSIRPa KI對(duì)于外周血中人RBC的移入水平具有很小的影響(圖5，小圖B)。

由于人SIRPα敲入不足以提高外周血中的人類紅細(xì)胞，因而使用氯膦酸鹽脂質(zhì)體來(lái)消減巨噬細(xì)胞，具體是脾中的紅髓巨噬細(xì)胞和肝中的Kupffer細(xì)胞。通過(guò)氯膦酸鹽脂質(zhì)體消減駐留組織的巨噬細(xì)胞之后，在SuPER-G小鼠中觀察到類紅細(xì)胞譜系的循環(huán)人細(xì)胞顯著增多至總循環(huán)類紅細(xì)胞的1％(圖6，小圖A)。另外，氯膦酸鹽處理之后外周中的大多數(shù)人類紅細(xì)胞是網(wǎng)織紅細(xì)胞(CD71⁺)(圖6，小圖B)。這是一項(xiàng)令人興奮的觀察結(jié)果，因?yàn)樗甘具@些小鼠會(huì)是較好的候選者來(lái)支持優(yōu)先感染網(wǎng)織紅細(xì)胞的間日瘧原蟲感染。

類紅細(xì)胞感染是瘧原蟲的生命周期的一個(gè)必要部分。然而，不同瘧原蟲種的成功體內(nèi)感染所必需的人RBC的所需頻率尚未確立。當(dāng)前可得的鐮狀瘧原蟲的唯一體內(nèi)模型基于將人RBC轉(zhuǎn)移入免疫缺陷株諸如NOD/scid或NSG。在這些小鼠中，只有在每天注射大量人紅細(xì)胞之后才能通過(guò)i.v.注射受到感染的紅細(xì)胞實(shí)現(xiàn)裂殖子感染。在感染時(shí)，人RBC占這些動(dòng)物中總紅細(xì)胞數(shù)目的大約一半。

如上文證明的，移入有人造血干細(xì)胞(HSC)的SupER-G小鼠在骨髓中發(fā)育人類紅細(xì)胞(圖5B)，和ii)氯膦酸鹽處理提高經(jīng)移入的SupER-G小鼠的外周中人類紅細(xì)胞的頻率(圖6)。為了確定經(jīng)移入的，氯膦酸鹽處理的SupER-G小鼠是否在外周中包含足夠數(shù)目的人類紅細(xì)胞以維持成功的體內(nèi)瘧原蟲感染，自移入有胎肝或成人HSC的SupER-G小鼠收集外周血，并在體外與鐮狀瘧原蟲株3D7感染的血液一起培養(yǎng)該血液。為了推動(dòng)多輪寄生蟲復(fù)制，48小時(shí)后將新鮮人紅血球添加入感染培養(yǎng)物，預(yù)期通過(guò)再感染后續(xù)添加的人RBC而實(shí)現(xiàn)的擴(kuò)增只會(huì)在自HSC移入的SupER-G小鼠收獲的人RBC產(chǎn)生了鐮狀瘧原蟲的整個(gè)感染周期的情況中發(fā)生。感染之后12天，在所有來(lái)自經(jīng)移入的SuPER-G小鼠的血液樣品(“經(jīng)移入的小鼠RBC，成人1”，“經(jīng)移入的小鼠RBC，成人2”，和“經(jīng)移入的小鼠RBC，胎肝”)中觀察到寄生蟲感染的晚期階段和來(lái)自裂殖體的裂殖子的擴(kuò)增，但是來(lái)自未移入的或通過(guò)注射急性移入0.1％hRBC的對(duì)照小鼠(“攙混對(duì)照”)的血液樣品不然(圖7A和未顯示的數(shù)據(jù))。通過(guò)吉姆薩染色和定量PCR觀察到寄生蟲血癥的指數(shù)式增長(zhǎng)(圖7B)。這指示經(jīng)移入的，用氯膦酸鹽處理的SupER-G生成足夠數(shù)目的人紅血球以維持鐮狀瘧原蟲感染。自此，預(yù)期用鐮狀瘧原蟲和間日瘧原蟲裂殖子體內(nèi)感染進(jìn)行了氯膦酸鹽給藥的經(jīng)移入的小鼠會(huì)是成功的。

實(shí)施例5

TIES小鼠(Rag2-/-Il2rg無(wú)效Tpoh/hIl3/Gmcsfh/hEpoh/mSIRPαh/h)

由于低生育力，發(fā)育無(wú)能和高死亡率，具有Epo^h/h的小鼠對(duì)于感染研究是不理想的。反而，對(duì)于hEPO基因是雜合的小鼠(即Epo^h/m，例如TIES小鼠)完全能夠生成促紅細(xì)胞生成素(EPO)及支持紅細(xì)胞生成的所有階段。通過(guò)在小鼠基因座處保留小鼠M-CSF基因而非用人M-CSF替換它，實(shí)現(xiàn)了存活力自8-10周進(jìn)一步改進(jìn)至4個(gè)月，因?yàn)榈玫饺司奘杉?xì)胞集落刺激因子(M-CSF)敲入支持的高水平的人髓樣細(xì)胞移入引起對(duì)小鼠紅血球的破壞，這導(dǎo)致經(jīng)移入的小鼠貧血和死亡。

與SupER-G小鼠一樣，如果進(jìn)行氯膦酸鹽給藥的話，TIES小鼠支持人紅細(xì)胞生成且維持外周血中1％人類紅細(xì)胞的頻率。另外，氯膦酸鹽處理之后外周中的大多數(shù)人類紅細(xì)胞是網(wǎng)織紅細(xì)胞(CD71+)。這提示這些小鼠會(huì)是較好的候選者來(lái)支持間日瘧原蟲感染。

證明了如果進(jìn)行氯膦酸鹽給藥的話，經(jīng)移入的TIES小鼠能維持外周血中1％人類紅細(xì)胞的頻率。另外，測(cè)定了TIES小鼠支持人RBC輸注的能力。如圖8中顯示的，氯膦酸鹽處理將輸注的群體穩(wěn)定化于外周中細(xì)胞總?cè)后w的超過(guò)20％。在輸注之后約4小時(shí)實(shí)現(xiàn)的這些水平在輸注之后維持至少12小時(shí)。預(yù)期這些RBC頻率會(huì)足以支持不同種的瘧原蟲的體內(nèi)感染。

上文僅例示本發(fā)明的原則。應(yīng)當(dāng)領(lǐng)會(huì)，本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)能夠想出各種排列，雖然本文中沒(méi)有明確描述或顯示，但是其體現(xiàn)本發(fā)明的原則，并且包含在其精神和范圍內(nèi)。此外，本文中敘述的所有例子和條件語(yǔ)言在原則上意圖幫助讀者了解本發(fā)明的原則和發(fā)明人促成技術(shù)進(jìn)步的概念，而且應(yīng)解釋為不限于此類具體敘述的例子和條件。此外，本文中敘述本發(fā)明原則，方面和實(shí)施方案及其具體例子的所有陳述意圖涵蓋其結(jié)構(gòu)和功能等同方案兩者。因而，此類等同方案包括目前已知的等同方案和未來(lái)開發(fā)的等同方案兩者，即，包括為實(shí)施相同功能而開發(fā)的，與結(jié)構(gòu)無(wú)關(guān)的任何要素。因此，本發(fā)明的范圍并不意圖限于本文中顯示及描述的例示性實(shí)施方案。而所附權(quán)利要求書體現(xiàn)本發(fā)明的范圍和精神。

序列表

<110> 再生元制藥公司（Regeneron Pharmaceuticals, Inc.）

耶魯大學(xué)（Yale University）

生物醫(yī)學(xué)研究院（Institute for Research in Biomedicine (IRB)）

A·J·墨菲（Murphy, Andrew J.）

S·史蒂文斯（Stevens, Sean）

R·弗拉維爾（Flavell, Richard）

M·曼茨（Manz, Markus）

單亮（Shan, Liang）

<120> 表達(dá)人EPO的經(jīng)遺傳修飾的非人動(dòng)物

<130> REGN-013WO

<150> US62/000,460

<151> 2014-05-19

<160> 19

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 715

<212> DNA

<213> 小鼠（Mus musculus）

<400> 1

gatgaagact tgcagcgtgg acactggccc agccccgggt cgctaaggag ctccggcagc 60

taggcgcgga gatgggggtg cccgaacgtc ccaccctgct gcttttactc tccttgctac 120

tgattcctct gggcctccca gtcctctgtg ctcccccacg cctcatctgc gacagtcgag 180

ttctggagag gtacatctta gaggccaagg aggcagaaaa tgtcacgatg ggttgtgcag 240

aaggtcccag actgagtgaa aatattacag tcccagatac caaagtcaac ttctatgctt 300

ggaaaagaat ggaggtggaa gaacaggcca tagaagtttg gcaaggcctg tccctgctct 360

cagaagccat cctgcaggcc caggccctgc tagccaattc ctcccagcca ccagagaccc 420

ttcagcttca tatagacaaa gccatcagtg gtctacgtag cctcacttca ctgcttcggg 480

tactgggagc tcagaaggaa ttgatgtcgc ctccagatac caccccacct gctccactcc 540

gaacactcac agtggatact ttctgcaagc tcttccgggt ctacgccaac ttcctccggg 600

ggaaactgaa gctgtacacg ggagaggtct gcaggagagg ggacaggtga catgctgctg 660

ccaccgtggt ggaccgacga acttgctccc cgtcactgtg tcatgccaac cctcc 715

<210> 2

<211> 192

<212> PRT

<213> 小鼠（Mus musculus）

<400> 2

Met Gly Val Pro Glu Arg Pro Thr Leu Leu Leu Leu Leu Ser Leu Leu

1 5 10 15

Leu Ile Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Cys Ala Pro Pro Arg Leu Ile

20 25 30

Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Ile Leu Glu Ala Lys Glu Ala

35 40 45

Glu Asn Val Thr Met Gly Cys Ala Glu Gly Pro Arg Leu Ser Glu Asn

50 55 60

Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met

65 70 75 80

Glu Val Glu Glu Gln Ala Ile Glu Val Trp Gln Gly Leu Ser Leu Leu

85 90 95

Ser Glu Ala Ile Leu Gln Ala Gln Ala Leu Leu Ala Asn Ser Ser Gln

100 105 110

Pro Pro Glu Thr Leu Gln Leu His Ile Asp Lys Ala Ile Ser Gly Leu

115 120 125

Arg Ser Leu Thr Ser Leu Leu Arg Val Leu Gly Ala Gln Lys Glu Leu

130 135 140

Met Ser Pro Pro Asp Thr Thr Pro Pro Ala Pro Leu Arg Thr Leu Thr

145 150 155 160

Val Asp Thr Phe Cys Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ala Asn Phe Leu Arg

165 170 175

Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Val Cys Arg Arg Gly Asp Arg

180 185 190

<210> 3

<211> 1340

<212> DNA

<213> 人（homo sapiens）

<400> 3

cccggagccg gaccggggcc accgcgcccg ctctgctccg acaccgcgcc ccctggacag 60

ccgccctctc ctccaggccc gtggggctgg ccctgcaccg ccgagcttcc cgggatgagg 120

gcccccggtg tggtcacccg gcgcgcccca ggtcgctgag ggaccccggc caggcgcgga 180

gatgggggtg cacgaatgtc ctgcctggct gtggcttctc ctgtccctgc tgtcgctccc 240

tctgggcctc ccagtcctgg gcgccccacc acgcctcatc tgtgacagcc gagtcctgga 300

gaggtacctc ttggaggcca aggaggccga gaatatcacg acgggctgtg ctgaacactg 360

cagcttgaat gagaatatca ctgtcccaga caccaaagtt aatttctatg cctggaagag 420

gatggaggtc gggcagcagg ccgtagaagt ctggcagggc ctggccctgc tgtcggaagc 480

tgtcctgcgg ggccaggccc tgttggtcaa ctcttcccag ccgtgggagc ccctgcagct 540

gcatgtggat aaagccgtca gtggccttcg cagcctcacc actctgcttc gggctctggg 600

agcccagaag gaagccatct cccctccaga tgcggcctca gctgctccac tccgaacaat 660

cactgctgac actttccgca aactcttccg agtctactcc aatttcctcc ggggaaagct 720

gaagctgtac acaggggagg cctgcaggac aggggacaga tgaccaggtg tgtccacctg 780

ggcatatcca ccacctccct caccaacatt gcttgtgcca caccctcccc cgccactcct 840

gaaccccgtc gaggggctct cagctcagcg ccagcctgtc ccatggacac tccagtgcca 900

gcaatgacat ctcaggggcc agaggaactg tccagagagc aactctgaga tctaaggatg 960

tcacagggcc aacttgaggg cccagagcag gaagcattca gagagcagct ttaaactcag 1020

ggacagagcc atgctgggaa gacgcctgag ctcactcggc accctgcaaa atttgatgcc 1080

aggacacgct ttggaggcga tttacctgtt ttcgcaccta ccatcaggga caggatgacc 1140

tggagaactt aggtggcaag ctgtgacttc tccaggtctc acgggcatgg gcactccctt 1200

ggtggcaaga gcccccttga caccggggtg gtgggaacca tgaagacagg atgggggctg 1260

gcctctggct ctcatggggt ccaagttttg tgtattcttc aacctcattg acaagaactg 1320

aaaccaccaa aaaaaaaaaa 1340

<210> 4

<211> 193

<212> PRT

<213> 人（homo sapiens）

<400> 4

Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu

1 5 10 15

Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu

20 25 30

Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu

35 40 45

Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu

50 55 60

Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg

65 70 75 80

Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu

85 90 95

Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser

100 105 110

Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly

115 120 125

Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu

130 135 140

Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile

145 150 155 160

Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu

165 170 175

Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp

180 185 190

Arg

<210> 5

<211> 226

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的多核苷酸序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(115)

<223> 小鼠序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (116)..(128)

<223> 人外顯子1

<220>

<221> misc_feature

<222> (116)..(226)

<223> 人序列

<400> 5

tcttccaggc tagtggggtg atctggccct acagaacttc caaggatgaa gacttgcagc 60

gtggacactg gcccagcccc gggtcgctaa ggagctccgg cagctaggcg cggagatggg 120

ggtgcacggt gagtactcgc gggctgggcg ctcccgcccg cccgggtccc tgtttgagcg 180

gggatttagc gccccggcta ttggccagga ggtggctggg ttcaag 226

<210> 6

<211> 1054

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的多核苷酸序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(115)

<223> 人外顯子5

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(926)

<223> 人序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (927)..(1054)

<223> 選擇盒的5'端

<400> 6

actccgaaca atcactgctg acactttccg caaactcttc cgagtctact ccaatttcct 60

ccggggaaag ctgaagctgt acacagggga ggcctgcagg acaggggaca gatgaccagg 120

tgtgtccacc tgggcatatc caccacctcc ctcaccaaca ttgcttgtgc cacaccctcc 180

cccgccactc ctgaaccccg tcgaggggct ctcagctcag cgccagcctg tcccatggac 240

actccagtgc cagcaatgac atctcagggg ccagaggaac tgtccagaga gcaactctga 300

gatctaagga tgtcacaggg ccaacttgag ggcccagagc aggaagcatt cagagagcag 360

ctttaaactc agggacagag ccatgctggg aagacgcctg agctcactcg gcaccctgca 420

aaatttgatg ccaggacacg ctttggaggc gatttacctg ttttcgcacc taccatcagg 480

gacaggatga cctggagaac ttaggtggca agctgtgact tctccaggtc tcacgggcat 540

gggcactccc ttggtggcaa gagccccctt gacaccgggg tggtgggaac catgaagaca 600

ggatgggggc tggcctctgg ctctcatggg gtccaagttt tgtgtattct tcaacctcat 660

tgacaagaac tgaaaccacc aatatgactc ttggcttttc tgttttctgg gaacctccaa 720

atcccctggc tctgtcccac tcctggcagc agtgcagcag gtccaggtcc gggaaacgag 780

gggtggaggg ggctgggccc tacgtgctgt ctcacacagc ctgtctgacc tctcgaccct 840

accgggcctg aggccacaag ctctgcctac gctggtcaat aaggtgtctc cattcaaggc 900

ctcaccgcag taaggcagct gccaacctcg agataacttc gtataatgta tgctatacga 960

agttatatgc atggcctccg cgccgggttt tggcgcctcc cgcgggcgcc cccctcctca 1020

cggcgagcgc tgccacgtca gacgaagggc gcag 1054

<210> 7

<211> 243

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的多核苷酸序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(121)

<223> 選擇盒的3'端

<220>

<221> misc_feature

<222> (122)..(243)

<223> 小鼠序列

<400> 7

gcctctgttc cacatacact tcattctcag tattgttttg ccaagttcta attccatcag 60

acctcgacct gcagccccta gataacttcg tataatgtat gctatacgaa gttatgctag 120

cgccaacccg ctaggacaag tgctgagtga gctggggcca ccgtttgagg aaacaggagc 180

cagtacagag gggttcccct ttaggggttg gtggcaatgg gcgaccctgg ttaatggatc 240

att 243

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的多核苷酸序列

<400> 8

catctgcgac agtcgagttc 20

<210> 9

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的多核苷酸序列

<400> 9

ccagggagct taccgtgac 19

<210> 10

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的多核苷酸序列

<400> 10

aggtacatct tagaggccaa ggaggca 27

<210> 11

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的多核苷酸序列

<400> 11

acagccgagt cctggagag 19

<210> 12

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的多核苷酸序列

<400> 12

aagccctgag cgtgagttc 19

<210> 13

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的多核苷酸序列

<400> 13

aggccaagga ggccgagaat atcacg 26

<210> 14

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的多核苷酸序列

<400> 14

gagccctgca ctggacaac 19

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的多核苷酸序列

<400> 15

tcccatgaac gctgagagtc 20

<210> 16

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的多核苷酸序列

<400> 16

agggtcaagg agccatagac agaatggc 28

<210> 17

<211> 200

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的多核苷酸序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(100)

<223> 小鼠序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (101)..(200)

<223> 人序列

<400> 17

agctctccta ccactagact gctgagaccc gctgctctgc tcaggactcg atttccagta 60

cacaatctcc ctctttgaaa agtaccacac atcctggggt gctcttgcat ttgtgtgaca 120

ctttgctagc caggctcagt cctgggttcc aggtggggac tcaaacacac tggcacgagt 180

ctacattgga tattcttggt 200

<210> 18

<211> 199

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的多核苷酸序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(100)

<223> 新霉素盒的5'端

<220>

<221> misc_feature

<222> (101)..(199)

<223> 人序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (106)..(139)

<223> LoxP

<400> 18

gctccccatt cctcactggc ccagcccctc ttccctactc tttctagccc ctgcctcatc 60

tccctggctg ccattgggag cctgccccac tggaagccag tcgagataac ttcgtataat 120

gtatgctata cgaagttata tgcatggcct ccgcgccggg ttttggcgcc tcccgcgggc 180

gcccccctcc tcacggcga 199

<210> 19

<211> 200

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的多核苷酸序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(100)

<223> 新霉素盒的3'端

<220>

<221> misc_feature

<222> (101)..(200)

<223> 小鼠外顯子4

<400> 19

cattctcagt attgttttgc caagttctaa ttccatcaga cctcgacctg cagcccctag 60

ataacttcgt ataatgtatg ctatacgaag ttatgctagc tgtctcatag aggctggcga 120

tctggctcag ggacagccag tactgcaaag agtatccttg ttcatacctt ctcctagtgg 180

ccatctccct gggacagtca 200