超衍射極限細胞膜微結(jié)構(gòu)生物物理特性獲取方法與裝置的制造方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及光學顯微成像和原子力掃描成像不同模態(tài)成像技術的耦合，特別是一 種超衍射極限細胞膜微結(jié)構(gòu)生物物理特性獲取方法與裝置。
【背景技術】
[0002] 在微納米尺度上對細胞膜上特定及相關生物學過程進行觀察是近年來的熱點，普 通熒光光學顯微術由于對樣本具有無損特點，在活細胞顯微和檢測研究中占據(jù)重要位置。 然而，由于熒光顯微術，包括激光共焦掃描顯微術受到衍射極限制約，空間分辨率都只能接 近半個波長。為了突破衍射極限（超衍射極限），即空間分辨率在200nm以下，近年來各種超 分辨光學成像技術，如受激發(fā)射損耗顯微術STED、隨機光學重建顯微術ST0RM、光活化定位 顯微術PLAM和結(jié)構(gòu)光照明顯微術S頂?shù)葢\而生。在上述的幾種超分辨光學顯微術中，結(jié)構(gòu) 光照明顯微術S頂是基于對光的照明方式進行改變，即改變系統(tǒng)的光學傳遞函數(shù)，實現(xiàn)分辨 率的提高(線性S頂技術分辨率最高可提高1倍，約為四分之一波長）;此外，S頂技術還具有 技術方案簡單、成本較低、成像速度快、光漂白效應不明顯等優(yōu)點，使其在l〇〇nm量級的超衍 射分辨率相關研究如細胞膜上微區(qū)、細胞微絲、微管等細胞器的光學顯微成像中獲得青睞。
[0003] 原子力顯微術AFM是掃描探針顯微術的一種。它是基于探針針尖與樣本表面分子 相互作用的原理，具有很高的橫向和縱向分辨率(Ml量級），可以對樣品表面形貌實現(xiàn)精確 掃描和成像。在過去的幾十年，AFM技術已在材料領域獲得了廣泛應用。然而原子力探針無 特異性識別能力，而SIM則不具備獲取納米量級超微結(jié)構(gòu)相關功能信息的能力。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為了實現(xiàn)對特定區(qū)域微結(jié)構(gòu)和功能信息的獲取，本發(fā)明所要解決的技術問題是提 供一種將結(jié)構(gòu)光照明顯微術SM和原子力顯微術AFM有機融合的超衍射極限細胞膜微結(jié)構(gòu) 生物物理特性獲取方法與裝置。
[0005] 為了解決上述問題，本發(fā)明的技術方案是:一種超衍射極限細胞膜微結(jié)構(gòu)生物物 理特性獲取裝置，包括激光器和半導體激光器，所述激光器的激光輸出光路依次設置有偏 振器、第一會聚透鏡組、光闌、第一反射鏡、空間光調(diào)制器、第三會聚透鏡、擋光板、第二會聚 透鏡組和二向色鏡，所述二向色鏡的反射光輸出光路依次設置有光學顯微鏡的物鏡和載物 臺，所述二向色鏡的透射光輸出光路依次設置有濾波片、可切換反射鏡、第六會聚透鏡和 CCD探測器，所述半導體激光器的激光輸出光路依次設置有第二反射鏡、由三維控制器驅(qū)動 的探針和位置敏感探測器，所述CCD探測器、三維控制器和位置敏感探測器均連接至數(shù)據(jù)采 集控制系統(tǒng)。
[0006] 在本發(fā)明的進一步技術方案中，所述第一會聚透鏡組包含第一會聚透鏡和第二會 聚透鏡。
[0007] 在本發(fā)明的進一步技術方案中，所述第二會聚透鏡組包含第四會聚透鏡和第五會 聚透鏡。
[0008] 在本發(fā)明的進一步技術方案中，所述第一反射鏡輸出的激光束入射到空間光調(diào)制 器的入射角度應小于10°。
[0009] 在本發(fā)明的進一步技術方案中，所述擋光板是用于阻擋空間光調(diào)制器0級衍射光 而只允許+1級衍射光和-1級衍射光通過的0級擋光板。
[0010] 為了解決上述問題，本發(fā)明的另一技術方案是:一種超衍射極限細胞膜微結(jié)構(gòu)生 物物理特性獲取方法，采用上述的超衍射極限細胞膜微結(jié)構(gòu)生物物理特性獲取裝置，將樣 品放置于載物臺上，并按以下步驟進行： (1 )SIM成像模態(tài):激光器福射出的激光依次經(jīng)過偏振器、第一會聚透鏡組、光闌、第一 反射鏡、空間光調(diào)制器、第三會聚透鏡、擋光板和第二會聚透鏡組，第二會聚透鏡組輸出的 激光束經(jīng)二向色鏡反射后再依次經(jīng)過物鏡和載物臺，樣品反射回的激光束依次經(jīng)過載物臺 和物鏡后再經(jīng)二向色鏡透射到濾波片，濾波片過濾后的激光束依次經(jīng)過可切換反射鏡和第 六會聚透鏡后由CCD探測器接收光信號，最后由數(shù)據(jù)采集控制系統(tǒng)完成圖像采集和數(shù)據(jù)處 理； (2)AFM成像模態(tài):在實施和完成S頂成像模態(tài)后，將數(shù)據(jù)采集控制系統(tǒng)的工作方式切換 到AFM成像模態(tài);在此工作模態(tài)下，由數(shù)據(jù)采集控制系統(tǒng)控制三維控制器使探針接近樣品的 選定區(qū)域，并通過倒置的光學顯微鏡從底部的方向向上觀察探針；由半導體激光器發(fā)射出 的激光經(jīng)過第二反射鏡后從探針上表面反射到位置敏感探測器；當探針在樣品表面掃描， 探針會因為與樣品之間的相互作用力而彎曲，激光光斑會隨之偏移，位置敏感探測器接收 到信號，記錄下偏移量，通過信號轉(zhuǎn)換相應的生物物理特性參數(shù)，并被數(shù)據(jù)采集控制系統(tǒng)所 接收。
[0011] 在本發(fā)明的進一步技術方案中，步驟（1)中的數(shù)據(jù)采集控制系統(tǒng)按以下步驟進行 圖像米集： (1.1) 放置好樣品后，在三維控制器上裝上探針，使針尖略浸入樣品的細胞液面，調(diào)節(jié) 激光光斑在位置敏感探測器上的位置； (1.2) 校準探針； (1.3) 選定樣品的區(qū)域，做光學校準，CCD探測器采集熒光圖像 (1.4) 進行亞衍射極限細胞結(jié)構(gòu)的熒光高分辨成像； (1.5) 設置空間光調(diào)制器的相位控制圖像，在相位Φ、Φ + Δφ、φ+2Δφ、φ +90°、Φ + 90° + Δ φ和φ+90°+2Δ φ控制的結(jié)構(gòu)光照明下，C⑶探測器依次采集熒光圖像Π 、熒光圖像 ΙΠ 、熒光圖像IV、熒光圖像V、熒光圖像VI和熒光圖像W; (1.6) 重構(gòu)獲得超分辨圖像VI; (1.7) 打開半導體激光器，依據(jù)超分辨圖像珊，調(diào)整探針至樣品所選定區(qū)域位置或目 標； (1.8) 關閉空間光調(diào)制器，選用相應AFM工作模式，進行AFM數(shù)據(jù)采集。
[0012] 在本發(fā)明的進一步技術方案中，步驟（1.5)中的空間光調(diào)制器按以下步驟進行設 置相位控制圖像： (1.5.1) 空間光調(diào)制器的相位控制圖像設置為0°相位的結(jié)構(gòu)光照明圖像，調(diào)節(jié)偏振器， 使得擋光板后的+1級衍射光和-1級衍射光達到最強，CCD探測器采集熒光圖像Π ; (1.5.2) 空間光調(diào)制器的相位控制圖像設置為Δ φ相位的結(jié)構(gòu)光照明圖像，(XD探測器 采集熒光圖像m; (1.5.3) 空間光調(diào)制器的相位控制圖像設置為2 Δ φ相位的結(jié)構(gòu)光照明圖像，CXD探測 器采集熒光圖像IV; (1.5.4) 空間光調(diào)制器的相位控制圖像設置為90°相位的結(jié)構(gòu)光照明圖像，(XD探測器 采集熒光圖像V; (1.5.5) 空間光調(diào)制器的相位控制圖像設置為90° + Δ φ相位的結(jié)構(gòu)光照明圖像，C⑶探 測器采集熒光圖像VI; (1.5.6) 空間光調(diào)制器的相位控制圖像設置為90°+2Δ φ相位的結(jié)構(gòu)光照明圖像，（XD 探測器采集熒光圖像W。
[0013] 在本發(fā)明的進一步技術方案中，步驟(1.5.4)調(diào)節(jié)偏振器，使得擋光板后的+1級衍 射光和-1級衍射光達到最強。
[0014] 在本發(fā)明的進一步技術方案中，步驟(1.6)按以下步驟重構(gòu)獲得超分辨圖像VIII: (1.6.1) 對圖像采集步驟中CCD探測器采集到的6張原始圖像Π -W進行圖像亮度均一 化處理，以消除由于光源強度波動引起的成像亮度的影響； (1.6.2) 對上述處理后的圖像進行傅里葉變換操作，獲得相應的頻譜信息； (1.6.3) 由各方向的三個相位圖像對應頻譜信息，求解3X3的線性方程組，分離出0級、 +1級和-1級頻譜成像信息； (1.6.4) 由分離出0級與+1級或-1級頻譜的重疊區(qū)域的信息確定結(jié)構(gòu)光照明的空間頻 率ko與初始相位Φ ; (1.6.5) 將分尚出的+1級頻譜平移+k〇，將分尚出的-1級頻譜平移_k〇; (1.6.6) 將平移后的+1級和-1級頻譜與0級頻譜疊加合成，并做維納濾波，使得其頻譜 擴寬； (1.6.7) 對步驟（1.6.6)得到的擴寬的頻譜做傅里葉反變換，獲得(XD探測器采集的超 分辨圖像。
[0015] 與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點：本發(fā)明有機融合了結(jié)構(gòu)光照明方式顯微 術SIM和原子力掃描成像AFM二種不同模態(tài)的成像技術，可以實現(xiàn)超衍射極限細胞膜微結(jié)構(gòu) 生物物理特性的信息獲取，對納米生物醫(yī)學及其相關研究具有重要意義。
【附圖說明】
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