本發(fā)明涉及胰島素樣生長因子1受體特異性抗體、其片段及其用途。更具體地，本發(fā)明涉及遷移穿過血腦屏障的胰島素樣生長因子1受體特異性抗體及其片段，以及其用途。

發(fā)明背景

神經(jīng)變性疾病，諸如阿爾茨海默癥和帕金森病，是壓在我們老齡化社會上的不斷增大的負(fù)擔(dān)，因?yàn)槟壳皩τ谶@些致殘性疾病，沒有有效的治療方法。在腦中起源的這些及其它疾病的治療以及早期診斷仍然是個(gè)挑戰(zhàn)，因?yàn)榇蠖鄶?shù)合適的治療分子和診斷劑無法穿透緊密和高度限制性的血腦屏障(BBB)(Abbott，2013年)。BBB構(gòu)成由內(nèi)襯血管和通過緊密連接相互連接的腦內(nèi)皮細(xì)胞(BEC)形成的物理屏障(Abbott,2013)。BEC之間形成的緊密連接是BBB的完整性所必需的，并且阻止大于500道爾頓(Da)的分子的細(xì)胞旁轉(zhuǎn)運(yùn)。因?yàn)槟X內(nèi)皮細(xì)胞表現(xiàn)出非常低的胞飲速率(Abbott,2013)，因此較大分子的跨細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)限于高特異性受體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)胞吞(RMT)途徑以及被動的基于電荷的吸附介導(dǎo)的轉(zhuǎn)胞吞作用(Abbott,2013；Pardridge,2002)。另外，外排泵諸如P-糖蛋白或多藥抗性蛋白-1(MDR-1)的高密度有助于從腦中除去不想要的物質(zhì)(Abbott,2013)。

雖然所有這些特征保護(hù)大腦免受病原體和毒素侵害，但它們同樣阻止了大多數(shù)治療劑的進(jìn)入。事實(shí)上，少于5％的小分子治療劑和實(shí)際上沒有較大的治療劑可以以藥理學(xué)相關(guān)濃度(即，足以接合中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)靶和引起藥理學(xué)/治療性反應(yīng))穿過BBB，除非它們被專門地“擺渡”，即，偶聯(lián)于轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白分子。由于缺乏有效的“載體”來將分子運(yùn)輸穿過BBB，因此許多針對神經(jīng)變性疾病的藥物已被“擱置”或從進(jìn)一步的開發(fā)中刪除，因?yàn)樗鼈儾荒芤宰銐虻牧勘贿f送至大腦。

已開發(fā)了不同的將較大分子遞送至腦的方法。例如，可打破血腦屏障的完整性，導(dǎo)致滲漏性BBB，這進(jìn)而允許較大的分子無限制地細(xì)胞旁進(jìn)入大腦?？赏ㄟ^各種方法成功地松開或破壞緊密連接。例如，注射誘導(dǎo)滲透壓休克的物質(zhì)(例如，甘露醇，高滲溶液)至血流中引起細(xì)胞收縮并導(dǎo)致緊密連接的破壞，從而嚴(yán)重?fù)p害BBB(Guillaume,2010)。緊密連接的其它調(diào)節(jié)劑包括烷基甘油、緩激肽和其幾種類似物，以及調(diào)節(jié)參與維持緊密連接的蛋白的表達(dá)的病毒(Erdlenbruch等，2003；Preston等，2008；Gan等，2013)。BBB的更局部化破壞可能通過應(yīng)用超聲來實(shí)現(xiàn)(Nhan等，2013)。然而，破壞BBB的時(shí)間足以改變腦穩(wěn)態(tài)和允許有害的化學(xué)物質(zhì)、毒素和病原體進(jìn)入腦；這可導(dǎo)致嚴(yán)重的副作用，例如，癲癇發(fā)作和腦腫脹、感染和可能地永久神經(jīng)病理學(xué)變化。如對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說將是顯而易見的，對于影響多個(gè)腦區(qū)域的慢性和彌漫性腦疾病，利用這些技術(shù)的重復(fù)治療是不現(xiàn)實(shí)的。大多數(shù)此類治療是昂貴的，必須住院，并且一些方法需要麻醉。

繞過BBB的另一種方法是將治療分子直接注射入腦脊髓液(CSF)、實(shí)質(zhì)空間或腦的其它部分。幾個(gè)遞送方法已被開發(fā)，包括：通過輸注或?qū)α髟鰪?qiáng)擴(kuò)散(CED)泵的硬膜內(nèi)、大腦內(nèi)(實(shí)質(zhì)內(nèi))以及心室內(nèi)遞送。然而，任何類型的至腦的直接注射或腦內(nèi)植入是侵入性且昂貴的程序，因?yàn)槠湫枰≡骸⒙樽砗屯ǔＪ中g(shù)。此外，治療劑，尤其是大的生物制劑在腦實(shí)質(zhì)內(nèi)的差擴(kuò)散速率使治療劑的穿透僅限于圍繞注射/植入的部位的小區(qū)域。注射物、導(dǎo)管和植入物的正確放置仍然具有挑戰(zhàn)性，對于實(shí)現(xiàn)藥物至大腦的目標(biāo)區(qū)域的擴(kuò)散是至關(guān)重要的。另外，導(dǎo)管和植入物提供了用于感染的部位和/或針對外來物質(zhì)的免疫應(yīng)答。

在另一個(gè)增加穿過BBB的遞送的努力中，CNS藥物已被修飾來增加其腦攝取。此類修飾可包括其表面電荷的變化、分子大小的減小，以及對藥物的親脂性的改變。然而，增加腦滲透的任何修飾也可能改變藥物的總體藥理學(xué)，包括其期望的活性和/或特異性。另外，親脂性分子更容易通過P-糖蛋白外排泵從腦輸出。

最后，穿過BBB的內(nèi)源轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制已被利用。允許大分子轉(zhuǎn)運(yùn)穿過BBB的生理機(jī)制可分為高特異性受體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)胞吞(RMT)和非異性的基于電荷的吸附介導(dǎo)的胞吞途徑。當(dāng)特異性配體對其受體結(jié)合時(shí)，或當(dāng)陽離子配體或藥物與腦內(nèi)皮細(xì)胞表面(腔側(cè))上的陰離子官能團(tuán)之間發(fā)生靜電相互作用時(shí)，分別觸發(fā)了胞吞作用。隨后，新形成的核內(nèi)體被轉(zhuǎn)胞吞穿過細(xì)胞至近腔側(cè)，以釋放其貨物。

因?yàn)槲浇閷?dǎo)的轉(zhuǎn)胞吞是非特異性的電荷介導(dǎo)的相互作用，因此其在所有血管床和器官中發(fā)生，限制了藥物用于腦遞送的可用性。因此，利用RMT途徑仍然是唯一的生理性、非侵入性的且高度受體特異性的腦遞送方法。

目前已知道僅少數(shù)受體經(jīng)歷在BBB處的RMT和“擺渡”穿過其天然配體：充分研究的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(TfR)、胰島素受體(IR)、低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白1和2(LRP-1和-2)、白喉毒素受體和TMEM30A。已開發(fā)了結(jié)合這些受體的肽、天然配體和抗體或抗體片段(Pardridge等，1991；Yu等，2011；Muruganandam等，2001；Abulrob等，2005；Demeule,2008；Sumbria等，2013)，用作利用內(nèi)源RMT途徑的藥物-至-腦轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。然而，迄今為止只有一種肽(Angiopep ANG1005，靶向LRP-1)已在I期臨床研究中已經(jīng)進(jìn)行了分析，而其它候選物正處于實(shí)驗(yàn)室環(huán)境的研究中。RMT途徑似乎是藥物轉(zhuǎn)運(yùn)至大腦的最有前途的途徑，但目前的方法有局限性，包括：靶受體在BBB中的非選擇性表達(dá)、載體與受體的天然配體之間的競爭、受體的無效轉(zhuǎn)胞吞以及胞吞的載體的溶酶體降解(Xiao和Gun,2013)。

高容量和高選擇性BBB載體的缺乏延遲了用于在腦中起源的疾病(包括腦腫瘤和神經(jīng)變性疾病)的新的治療劑和診斷劑的開發(fā)。很明顯存在對將小的和大的治療性和診斷性分子以藥理學(xué)上有效劑量遞送入腦而不破壞BBB的生理學(xué)和穩(wěn)態(tài)的非侵入性方法的需要。

發(fā)明概述

本發(fā)明涉及胰島素樣生長因子1受體(IGF1R)特異性抗體及其用途。更具體地，本發(fā)明涉及遷移穿過血腦屏障的胰島素樣生長因子1受體特異性抗體及其片段，以及其用途。

本發(fā)明提供了特異性結(jié)合胰島素樣生長因子1受體(IGF1R)表位的分離的或純化的抗體或其片段，其中所述抗體或其片段遷移穿過血腦屏障，并且其中所述表位被SEQ ID NO：5的抗體特異性結(jié)合。所述IGF1R表位可在IGF1R的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域中，并可包含序列FENFLHNSIFVPR(SEQ ID NO：11)或其片段。

本發(fā)明還提供了分離的或純化的抗體或其片段，其包含

GRTIDNYA(SEQ ID NO：1)的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)1序列；

IDWGDGGX(SEQ ID NO：2)的CDR2序列，其中X為A或T；和

AMARQSRVNLDVARYDY(SEQ ID NO：3)的CDR3序列，

其中所述抗體或其片段特異性結(jié)合胰島素樣生長因子1受體(IGF1R)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述分離的或純化的抗體或其片段包含IDWGDGGA的CDR2序列。

例如，并且不希望以任何方式受到限制，所述特異于IGF1R的分離的或純化的抗體或其片段可以是：

X₁VX₂LX₃ESGGGLVQX₄GGSLRLSCAASGRTIDNYAMAWX₅RQAPGKX₆X₇EX₈VX₉TIDWGDGGX₁₀RYANSVKGRFTISRDNX₁₁KX₁₂TX₁₃YLQMNX₁₄LX₁₅X₁₆EDTAVYX₁₇CAMARQSRVNLDVARYDYWGQGTX₁₈VTVSS(SEQ ID NO：4)，其中X₁為E或Q；X₂為K或Q；X₃為V或E；X₄為A或P；X₅為V或S；X₆為D或G；X₇為L或R；X₈為F或W；X₉為A或S；X₁₀為A或T；X₁₁為A或S；X₁₂為G或N；X₁₃為M或L；X₁₄為N或R；X₁₅為E或R；X₁₆為P或A；X₁₇為S或Y；以及X₁₈為Q或L,

或與其基本上相同的序列。在更具體的非限制性實(shí)例中，所述分離的或純化的抗體可包含選自以下序列的序列：

QVKLEESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTIDNYAMAWSRQAPGKDREFVATIDWGDGGARYANSVKGRFTISRDNAKGTMYLQMNNLEPEDTAVYSCAMARQSRVNLDVARYDYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO：5)，在本文中稱為IGF1R-5；

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTIDNYAMAWVRQAPGKGLEWVSTIDWGDGGTRYANSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAMARQSRVNLDVARYDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：6)，在本文中稱為IGF1R-5_H1；

QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTIDNYAMAWVRQAPGKGLEWVATIDWGDGGTRYANSVKGRFTISRDNSKNTMYLQMNSLRAEDTAVYYCAMARQSRVNLDVARYDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：7)，在本文中稱為IGF1R-5_H2；

QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTIDNYAMAWSRQAPGKGLEFVATIDWGDGGTRYANSVKGRFTISRDNSKNTMYLQMNSLRAEDTAVYYCAMARQSRVNLDVARYDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：8)，在本文中稱為IGF1R-5_H3；

QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTIDNYAMAWSRQAPGKDREFVATIDWGDGGTRYANSVKGRFTISRDNSKGTMYLQMNSLRAEDTAVYSCAMARQSRVNLDVARYDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：9)，在本文中稱為IGF1R-5_H5；和

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTIDNYAMAWSRQAPGKDREFVSTIDWGDGGTRYANSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAMARQSRVNLDVARYDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：10)，在本文中稱為IGF1R-5_H6，

或與其基本上相同的序列。

如上所述的分離的或純化的抗體或其片段可以是單結(jié)構(gòu)域抗體(sdAb)；所述sdAb可以是駱駝來源的。所述抗體或其片段可結(jié)合于包含序列FENFLHNSIFVPR(SEQ ID NO：11)的表位。

可以以多價(jià)展示形式呈現(xiàn)本發(fā)明的分離的或純化的抗體或其片段。在多價(jià)展示形式中，所述抗體或其片段可連接于Fc片段；所述Fc片段可以是小鼠Fc2b或人Fc1。例如，并且不希望以任何方式限制，多價(jià)展示形式的分離的或純化的抗體或其片段可包含SEQ ID NO：42(在本文中稱為IGF1R-5-mFc共有序列)或43(在本文中稱為mFc-IGF1R-5共有序列)、SEQ ID NO：12(在本文中稱為IGF1R-5-mFc)或13(在本文中稱為mFc-IGF1R-5)的序列。

任何形式的如本文所述的分離的或純化的抗體或其片段可遷移穿過血腦屏障。

本發(fā)明還提供了編碼如本文中所述的分離的或純化的抗體或其片段的核酸分子。還提供了包含如前所述的核酸分子的載體。

可將如本文所述的分離的或純化的抗體或其片段固定在表面上。

本發(fā)明還提供了連接于貨物分子的如本文所述的分離的或純化的抗體或其片段；所述貨物分子可具有在約1kD至約200kDa的范圍內(nèi)的分子量。連接于抗體或其片段的貨物分子可以是可檢測試劑、治療劑、藥物、肽、生長因子、細(xì)胞因子、受體陷阱(receptor trap)、化學(xué)化合物、碳水化合物部分、酶、抗體或其片段、基于DNA的分子、病毒載體、或細(xì)胞毒性劑；一種或多種裝載有可檢測試劑、治療劑、藥物、肽、酶和抗體或其片段、基于DNA的分子、病毒載體或細(xì)胞毒性劑的脂質(zhì)體或納米載體；或一種或多種納米顆粒、納米線、納米管或量子點(diǎn)。

另外，本發(fā)明提供了包含一種或不止一種如本文所述的分離的或純化的抗體或其片段和藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑的組合物。

還提供了檢測IGF1R的體外方法，該方法包括

a)將組織樣品與一種或不止一種連接于可檢測試劑的如本文所述的分離的或純化的抗體或其片段接觸；和

b)檢測組織樣品中結(jié)合于IGF1R的抗體或其片段所連接的可檢測試劑。

在上述方法中，樣品可以是血清樣品、血管組織樣品、腫瘤組織樣本、或來自人或動物受試者的腦組織樣品。在如所述的方法中，檢測的步驟(步驟b))可使用光學(xué)成像、免疫組織化學(xué)、分子診斷成像、酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)、成像質(zhì)譜法或其它合適的方法來進(jìn)行。

還提供了檢測受試者中的IGF1R表達(dá)的體內(nèi)方法，所述方法包括：

a)向受試者施用一種或不止一種連接于可檢測試劑的如本文所述的分離的或純化的抗體或其片段；和

b)檢測結(jié)合于IGF1R的抗體或其片段所連接的可檢測試劑。

在上述方法中，檢測步驟(步驟b))可使用PET(正電子發(fā)射斷層攝影術(shù))、SPECT(單光子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層掃描)、熒光成像或任何其它合適的方法來進(jìn)行。

本文提供了將目標(biāo)分子轉(zhuǎn)運(yùn)穿過血腦屏障(BBB)的方法，所述方法包括：

a)向受試者施用一種或不止一種連接于目標(biāo)分子的如本文所述的分離的或純化的抗體或其片段，所述分離的或純化的抗體或其片段遷移穿過血腦屏障，

其中所述一種或不止一種抗體或其片段將目標(biāo)分子擺渡穿過BBB。在如前描述的方法中，所述目標(biāo)分子可具有在約1kD至約200kDa的范圍內(nèi)的分子量；所述目標(biāo)分子可以是可檢測試劑、治療劑、藥物、肽、生長因子、細(xì)胞因子、受體陷阱、化學(xué)化合物、碳水化合物部分、酶、抗體或其片段、基于DNA的分子、病毒載體或細(xì)胞毒性劑；一種或多種裝載有可檢測試劑、治療劑、藥物、肽、酶、抗體或其片段、基于DNA的分子、病毒載體或細(xì)胞毒性劑的脂質(zhì)體；或一種或更多種納米顆粒、納米線、納米管或量子點(diǎn)。在所描述的方法中，施用可以是靜脈內(nèi)(ⅳ)、皮下(sc)或肌內(nèi)(im)施用。

本發(fā)明還包括定量被遞送穿過受試者的BBB的貨物分子的量的方法，其中所述貨物分子被接連于一種或不止一種如本文所述的分離的或純化的抗體或其片段，所述方法包括：

a)從受試者收集腦脊髓液(CSF)；和

b)使用靶向蛋白質(zhì)組學(xué)方法來定量CSF中連接于一種或不止一種分離的或純化的抗體或片段的貨物分子的量。

貨物分子可以是任何期望的分子，包括先前所述的貨物分子；所述抗體或其片段遷移穿過BBB；并且該分子可“連接”于抗體或其片段，如先前所述。在上述方法中，使用本領(lǐng)域中已知的任何合適的方法從受試者收集CSF。用于步驟b)中的靶向蛋白質(zhì)組學(xué)方法所需的CSF的量可為約1至10μl。用于定量所述一種或不止一種連接于貨物分子的抗體或其片段的量的靶向蛋白質(zhì)組學(xué)方法可以是本領(lǐng)域中已知的任何合適的方法。例如且不希望是限制性的，該靶向蛋白質(zhì)組學(xué)方法可以是質(zhì)譜法，諸如多反應(yīng)監(jiān)測-同種型標(biāo)記的內(nèi)標(biāo)(MRM-ILIS)。

診斷劑或藥物穿過緊密且高度選擇性的BBB的不佳遞送牽累用于腦疾病(諸如，但不限于，腦腫瘤和神經(jīng)變性疾病)的治療的開發(fā)。將分子轉(zhuǎn)運(yùn)穿過BBB的載體的缺乏延遲了用于此類疾病的新的治療劑和診斷劑的開發(fā)。如本文所述的，已產(chǎn)生了為使綴合于抗體的藥物穿過BBB到達(dá)它們在腦中的靶標(biāo)的遞送提供有效轉(zhuǎn)運(yùn)平臺的IGF1R結(jié)合性V_HH。目前描述的抗體利用了從形成BBB的腦內(nèi)皮細(xì)胞的腔內(nèi)至近腔側(cè)的IGF1R的天然RMT途徑。在抗體與IGF1R結(jié)合后，RMT被啟動，抗體與綴合的分子(貨物)一起被轉(zhuǎn)胞吞通過細(xì)胞至近腔側(cè)，在近腔側(cè)中它們被釋放至腦微環(huán)境中。這是通過RMT遷移穿過BBB的抗IGF1R結(jié)合結(jié)構(gòu)域抗體的第一次鑒定和演示。IGF1R V_HH被證實(shí)結(jié)合IGF1R(圖2B)，內(nèi)化至BBB細(xì)胞內(nèi)(圖4)，并穿越至體外BBB模型的近腔側(cè)(圖5B)。體內(nèi)的藥物至腦的遞送的研究也表明，IGF1R V_HH“運(yùn)載”綴合的肽(甘丙肽；約3kDa)以及大的蛋白質(zhì)融合物(約80kDa)穿過BBB(圖7A和B；圖9)。

該結(jié)果還表明，抗IGF1R V_HH可與Fc(可結(jié)晶片段)片段融合表達(dá)，以使循環(huán)半衰期延長約75倍(相較于單獨(dú)的V_HH的約20分鐘，為約25小時(shí))。該高分子量融合構(gòu)建體(約80kDa)也被高效地轉(zhuǎn)運(yùn)穿過BBB。長的血漿半衰期顯著增加了IGF1R V_HH-mFc(mFc＝小鼠Fc)綴合物的CSF暴露(相較于單獨(dú)的V_HH)，并可用作BBB遞送載體，以用于在CNS中利用靶標(biāo)治療慢性疾病。使用免疫熒光檢測可容易地檢測腦實(shí)質(zhì)中的綴合物。結(jié)果表明，IGF1R V_HH載體可“擺渡”大分子(在大小上與抗體、酶、生長因子、肽、細(xì)胞因子、受體陷阱相似)穿過BBB。

因此，抗體遞送不僅可用于短期治療(例如癲癇發(fā)作)，而且還可用于中期(例如，癌癥)和長期(例如阿爾茨海默病或帕金森病)治療。

鑒于以下描述，本發(fā)明的另外的方面和優(yōu)勢將是明顯的。詳細(xì)的描述和實(shí)例，雖然指示本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，仍僅通過舉例說明的方式給出，因?yàn)楦鶕?jù)本發(fā)明的教導(dǎo)，本發(fā)明的范圍內(nèi)的各種變化和修改對于本領(lǐng)域技術(shù)人員將變得明顯。

附圖簡述

本發(fā)明的這些和其它特征現(xiàn)將參照所附的附圖，通過舉例的方式來描述，其中：

圖1是胰島素樣生長因子1受體(IGF1R)的示意圖。IGF1R發(fā)現(xiàn)于細(xì)胞表面上，并包含兩個(gè)亞基：α亞基和β亞基。α亞基(包含具有胰島素樣生長因子1結(jié)合位點(diǎn)的細(xì)胞外部分)通過二硫鍵連接于β亞基(包含小的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域、跨膜區(qū)和細(xì)胞內(nèi)部分)。IGF1受體可以形成二聚體。重組地產(chǎn)生包含α亞基和β亞基的細(xì)胞外部分的933個(gè)氨基酸長的片段，如灰色框內(nèi)指示的，(M1–F933，SwissProt登錄號P08069；參見圖2)，并將其用于美洲駝(llama)的免疫。

圖2顯示IGF1R(SwissProt登錄號P08069)的序列。用于免疫和淘選的933個(gè)氨基酸長的蛋白質(zhì)片段以粗體顯示；完整的胞外域是2個(gè)氨基酸更長的。分離α和β亞基的弗林蛋白酶切割位點(diǎn)以斜體小寫字母顯示。信號肽以粗斜體字顯示。IGF1R-5 V_HH可能結(jié)合的假定的表位加以下劃線。

圖3A顯示通過Superdex 75柱運(yùn)行的IGF1R-結(jié)合性V_HH IGF1R-5的大小排阻層析。特征譜表明V_HH是單體的且非聚集的。圖3B顯示如通過IGF1R-5-V_HH及其人源化變體(標(biāo)記的5H1、5H2、5H3、5H5、5H6)的圓二色性(CD)測定的解鏈溫度(Tm)。將所述蛋白質(zhì)加熱至90℃以上，并在CD儀中進(jìn)行測量以測定解鏈曲線(黑色或?qū)嵭膱A)和Tm。隨后，將蛋白質(zhì)冷卻至室溫，再次加熱并通過CD分析(灰色曲線或方塊)。這允許測定重折疊蛋白質(zhì)的分?jǐn)?shù)。圖3C顯示0.1-10nM IGF1R-5 V_HH及其人源化變體(標(biāo)記的5H1、5H2、5H3、5H5、5H6)與人IGF1R片段(h-IGF1R)的重組細(xì)胞外部分的結(jié)合的表面等離子體共振(SPR)傳感覆蓋圖。利用該特定方法和實(shí)驗(yàn)設(shè)置獲得的數(shù)據(jù)良好擬合至1：1模型，給出在低納摩爾(nM)范圍(0.6-16.4nM)內(nèi)的K_D值，如表2中詳示的。圖3D顯示IGF1R-5 V_HH與人IGF1R片段的重組細(xì)胞外部分的結(jié)合以及IGF1的隨后添加的SPR傳感圖，所述IGF1可同時(shí)結(jié)合所述受體。重復(fù)該實(shí)驗(yàn)2次，如圖中顯示的。

圖4顯示了Cy-5.5標(biāo)記的IGF1R-5 V_HH和對照V_HH的細(xì)胞攝取的成像結(jié)果。將Cy5.5-標(biāo)記的IGF1R-5 V_HH(或FC5 V_HH作為陽性對照；Muruganandam等，2002；Haqqani等，2012)與SV40永生化大鼠腦內(nèi)皮細(xì)胞(svARBEC)在4℃(頂圖)或37℃(底圖)一起溫育以評估IGF1R-5是被動地(4℃)內(nèi)化還是通過主動機(jī)制(37℃)諸如受體介導(dǎo)的胞吞內(nèi)化。利用小麥胚凝集素和DAPI進(jìn)行共染色以分別使細(xì)胞表面和細(xì)胞核可視化。頂圖：當(dāng)在4℃溫育時(shí)，發(fā)現(xiàn)IGF1R-5和FC5 V_HH在細(xì)胞外部(箭頭)，結(jié)合于細(xì)胞膜(與小麥胚凝集素共定位)。底圖：在37℃，F(xiàn)C5和IGF1R-5 V_HH均在細(xì)胞內(nèi)部累積在小囊泡樣結(jié)構(gòu)(箭頭)(可能是核內(nèi)體)中，這表明通過主動運(yùn)輸機(jī)制的內(nèi)化。

圖5A顯示IGF1R-5 V_HH與鼠Fc片段的C末端融合物(IGF1R-5-mFc)的序列，而圖5B顯示N末端融合物序列(mFc-IGF1R-5-Gal)。組裝的融合蛋白的示意圖示于圖5C中。在圖5A-C中，IGF1R-5 V_HH以黑體顯示，鼠Fc(CH2和CH3)以灰色顯示。

圖6A是概括利用體外BBB模型評估各種V_HH穿過BBB的能力的流程圖。同時(shí)測試等摩爾量(5.6μM或1.25μM)的陽性(FC5)和陰性對照(A20.1，艱難梭菌(Clostridium difficile)毒素A-結(jié)合V_HH；和EG2，一種EGFR結(jié)合V_HH)V_HH和IGF1R-5的穿過大鼠體外BBB模型的能力。在大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞條件培養(yǎng)基(在底室中)和標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基(在頂室中)存在的情況下，在插入物的膜上的單層中生長來自成年大鼠的SV40永生化腦內(nèi)皮細(xì)胞(svARBEC)。在將等摩爾量的各種V_HH共添加至BBB模型的腔內(nèi)側(cè)后，在15、30和60分鐘后從底室采集樣品。隨后通過質(zhì)譜法(多反應(yīng)監(jiān)測-同種型標(biāo)記的內(nèi)標(biāo)；MRM-ILIS)定量這些樣品中的每一種V_HH的濃度。P_app值[Qr/dt＝接收腔室中的累積量相對于時(shí)間；A＝細(xì)胞單層的面積；C0＝給藥溶液的初始濃度]通常用于測定分子穿過BBB的能力。圖6B顯示4種共施用的V_HH的P_app值。IGF1R-5具有與FC5相似的P_app值，而陰性對照均具有非常低的P_app值，表明相較于對照V_HH的非常低的非特異性轉(zhuǎn)運(yùn)或細(xì)胞旁轉(zhuǎn)運(yùn)，促進(jìn)了FC5和IGF1R5 V_HH的轉(zhuǎn)運(yùn)。結(jié)果為在5-6個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)中獲得的平均P_app值。圖6C顯示相較于A20.1 V_HH(白色條塊)的人源化IGF1R-5單結(jié)構(gòu)域抗體(H1、H2、H3、H5、H6)(黑色條塊)的P_app值，將所述A20.1 V_HH在同一小孔中作為對照進(jìn)行測試；平均FC5和A20.1值由灰色虛線標(biāo)示。圖6D顯示相較于A20.1-小鼠Fc(A20.1mFc)(深灰色)的IGF1R-5與小鼠Fc的N末端和C末端融合物(淺灰色)的P_app值，將A20.1-小鼠Fc在同一小孔中作為對照進(jìn)行測試，其具有非常低的P_app值。FC5-Fc(與Fc融合的FC5)、FC5(V_HH)、IGF1R-5(V_HH)和A20.1(V_HH)的平均P_app值由虛線標(biāo)示以進(jìn)行比較。

圖7顯示IGF1R-5 V_HH–甘丙肽綴合物的化學(xué)合成的簡圖。首先將IGF1R-5綴合于磺基-SMCC交聯(lián)劑的NHS基團(tuán)(1)；隨后將馬來酰亞胺活化的IGF1R-5-磺基-SMCC綴合于甘丙肽的還原的半胱氨酸(2)。

圖8顯示化學(xué)綴合的甘丙肽的IGF1R-5介導(dǎo)的腦遞送。圖8A是顯示IGF1R-5將藥理學(xué)有效劑量的綴合的鎮(zhèn)痛肽甘丙肽(3.2kD)遞送至腦中的能力(使用Hargraeves疼痛模型)的曲線圖。在該模型中，通過將100μl完全弗氏佐劑(CFA)注射至左足底面，從而在數(shù)小時(shí)內(nèi)引起局部炎癥，來在雄性Wistar大鼠(4-6周齡)中誘導(dǎo)局部慢性疼痛。在單獨(dú)地尾靜脈注射BBB載體V_HH-藥物綴合物或甘丙肽后，將大鼠放入設(shè)置在玻璃表面上的Plexiglas外殼內(nèi)。通過傾斜鏡將熱刺激聚焦在發(fā)炎或?qū)?cè)的爪上。刺激施加與縮爪(舔或輕彈爪)之間的等待時(shí)間被解釋為鎮(zhèn)痛作用(熱痛覺過敏的抑制)的量度。單獨(dú)的甘丙肽不能穿過BBB，如通過3mg/kg甘丙肽(灰色實(shí)心圓)的全身性(尾靜脈)注射后鎮(zhèn)痛效果的缺乏所證明的。IGF1R-5-甘丙肽綴合物(2.93mg/kg或5.85mg/kg)的全身性注射在3小時(shí)的時(shí)期中誘導(dǎo)劑量依賴性鎮(zhèn)痛作用，比利用6mg/kg的FC5-甘丙肽綴合物觀察到的作用更加明顯。圖8B將這些結(jié)果顯示為相較于最大可能作用(MPE；對照爪)的藥效學(xué)反應(yīng)的曲線下面積(AUC)。2.93mg/kg IGF1R-5-甘丙肽誘導(dǎo)28％的MPE，而5.85mg/kg IGF1R-5-甘丙肽在3小時(shí)的時(shí)期中誘導(dǎo)55％的MPE，這表明在全身性注射后所述綴合物相較于單獨(dú)的甘丙肽的顯著的腦穿透(<5％的MPE)。圖8C是顯示在靜脈內(nèi)注射不同濃度后在Hargreaves疼痛模型中mFc-IGF1R-5-Gal抑制熱痛覺過敏的能力的曲線圖。圖8D顯示在iv注射IGF1R-5-mFc-Gal或mFc-IGF1R-5-Gal綴合物后Hargreaves模型中的熱痛覺過敏的劑量依賴性反應(yīng)(峰值反應(yīng)時(shí)的逆轉(zhuǎn)百分比)。

圖9顯示在全身性(尾靜脈)施用5mg/kg后，IGF1R-5-mFc和對照V_HH(A20.1小鼠Fc融合物(A20.1-mFc))的血漿和CSF藥代動力學(xué)。將導(dǎo)管插入小腦延髓池用于連續(xù)CSF收集(1-48h)。使用“追蹤”和定量特定蛋白質(zhì)肽標(biāo)志的MRM-ILIS法測定IGF1R-5-mFc和A20.1-mFc的血漿和CSF水平。利用MRM同時(shí)測定CSF中的白蛋白水平。所有具有低于1500的血漿/CSF比率的CSF樣品作為潛在污染的血液被排除。IGF1R-5-mFc與A20.1-mFc的血漿半衰期相似(分別為23h和25h)。在所述融合蛋白全身性注射后24小時(shí)，IGF1R-5-mFc和A20.1-mFc的血漿/CSF比率分別為2％和0.04％。

圖10顯示在5mg/kg劑量的尾靜脈施用后48h，腦切片中的IGF1R-5-mFc的免疫檢測。利用PBS對大鼠進(jìn)行犧牲灌注，使用振動切片機(jī)獲得腦切片(35μm)。使用抗小鼠Fc抗體免疫檢測IGF1R-5-mFc。使用凝集素RCA1檢測皮質(zhì)切片中的血管(左上)。利用針對神經(jīng)膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)的抗體在同一切片中檢測星形細(xì)胞(右上)?？稍谘苤泻脱芡?即在腦實(shí)質(zhì)中，遷移穿過BBB)檢測到IGF1R-5-mFc(左下)，如通過箭頭標(biāo)示的。所有染色的復(fù)合顯微照片示于右下，顯示IGF1R-5-mFc從血管的腔內(nèi)側(cè)遷移穿過BBB進(jìn)入腦實(shí)質(zhì)。

圖11顯示IGF1R-5不干擾胰島素或IGF-1信號傳導(dǎo)(通過胰島素受體或IGF1R)。圖11A是顯示IGF1R-5和所測試的任何其它抗IGF1R V_HH(IGF1R-1,-3,-4或-6)在100nM的濃度下均不單獨(dú)地誘導(dǎo)下游Akt磷酸化的代表性免疫印跡。100nM的IGF1R-5或任何其它抗IGF1R V_HH的存在都不抑制如由10μg/ml胰島素誘導(dǎo)的Akt磷酸化。來自3個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的免疫印跡條帶密度的定量示于凝膠圖像下方的條形圖(平均值+/-SD)中。圖11B是顯示100nM的IGF1R-5和所測試的任何其它抗IGF1R V_HH(IGF1R,-3,-4或-6)自身均不誘導(dǎo)Akt的磷酸化，并且均不抑制在用200ng/ml的IGF-1刺激后誘導(dǎo)的IGF-1誘導(dǎo)的Akt磷酸化(即信號傳導(dǎo))的代表性免疫印跡。來自3個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的免疫印跡條帶密度的定量示于凝膠圖像下方的條形圖(平均值+/-SD)中。圖11C顯示針對磷酸化IGF1R探測的免疫印跡。將細(xì)胞與單獨(dú)的在其C末端上與鼠Fc融合(例如IGF1R-5-mFc)的100nM或500nM的IGF1R-5或任何其它抗IGF1R V_HH(IGF1R-1、-3或-4)一起溫育或在各自IGF1R-V_HH-mFc融合蛋白存在的情況下利用200ng/ml IGF-1刺激。免疫印跡表明，融合構(gòu)建體均不抑制IGF-1誘導(dǎo)的IGF1R的磷酸化，并且自身均不誘導(dǎo)受體磷酸化。

發(fā)明詳述

本發(fā)明涉及胰島素樣生長因子1受體特異性抗體，其片段，以及其用途。更具體地，本發(fā)明涉及遷移穿過血腦屏障的胰島素樣生長因子1受體特異性抗體或其片段，以及其用途。

本發(fā)明提供了特異性結(jié)合胰島素樣生長因子1受體(IGF1R)表位的分離或純化的抗體或其片段，其中所述抗體或其片段遷移穿過血腦屏障，并且其中所述表位被SEQ ID NO：5的抗體特異性結(jié)合。所述IGF1R表位可在IGF1R的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域中，并可包含序列FENFLHNSIFVPR(SEQ ID NO：11)，或其片段。

本發(fā)明還提供了分離的或純化的抗體或其片段，其包含

GRTIDNYA(SEQ ID NO：1)的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)1序列；

IDWGDGGX(SEQ ID NO：2)的CDR2序列，其中X為A或T；和

AMARQSRVNLDVARYDY(SEQ ID NO：3)的CDR3序列,

其中所述抗體或其片段特異性地結(jié)合于胰島素樣生長因子1受體(IGF1R)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述分離的或純化的抗體或其片段包含IDWGDGGA的CDR2序列。

如本文中所用，術(shù)語“抗體”，在本領(lǐng)域中也稱為“免疫球蛋白”(Ig)，是指從成對的重和輕多肽鏈構(gòu)建的蛋白質(zhì)；存在各種Ig同種型，包括IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。當(dāng)抗體正確折疊時(shí)，每條鏈折疊成通過更線性的肽序列連接的許多不同的球狀結(jié)構(gòu)域。例如，免疫球蛋白輕鏈折疊成可變(V_L)和恒定(C_L)結(jié)構(gòu)域，而重鏈折疊成可變(V_H)和三個(gè)恒定(C_H、C_H2、C_H3)結(jié)構(gòu)域。重鏈和輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(V_H和V_L)的相互作用導(dǎo)致抗原結(jié)合區(qū)(Fv)的形成。每一個(gè)結(jié)構(gòu)域具有本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的良好建立的結(jié)構(gòu)。

輕鏈和重鏈可變區(qū)負(fù)責(zé)結(jié)合靶抗原并因此可顯示出抗體之間的顯著序列多樣性。恒定區(qū)顯示較少的序列多樣性，并負(fù)責(zé)結(jié)合許多天然蛋白質(zhì)以引發(fā)重要的生物化學(xué)事件?？贵w的可變區(qū)含有分子的抗原結(jié)合決定簇，從而決定了抗體對其靶抗原的特異性。大多數(shù)序列可變性存在于6個(gè)高變區(qū)中，每可變重(V_H)和輕(V_L)鏈各3個(gè)；所述高變區(qū)組合以形成抗原結(jié)合部位，并促成抗原決定簇的結(jié)合和識別?？贵w對其抗原的特異性和親和力由高變區(qū)的結(jié)構(gòu)以及它們的大小、形狀以及它們呈現(xiàn)給抗原的表面的化學(xué)性來決定。存在用于鑒定高變區(qū)的各種方案，兩個(gè)最常見的方案(Kabat的以及Chothia和Lesk.Kabat等(1991)的那些方案)基于V_H和V_L結(jié)構(gòu)域的抗原結(jié)合區(qū)上的序列可變性確定“互補(bǔ)決定區(qū)”(CDR)。Chothia和Lesk(1987)基于V_H和V_L結(jié)構(gòu)域中的結(jié)構(gòu)環(huán)區(qū)域的位置確定“高變環(huán)”(H或L)。這些個(gè)體方案確定相鄰或重疊的CDR和高變環(huán)區(qū)域，抗體領(lǐng)域的技術(shù)人員通?？苫Q地使用術(shù)語“CDR”和“高變環(huán)”，并且在本文中也這樣使用它們。在本文中根據(jù)最近的IMGT編號系統(tǒng)(Lefranc,M.-P.等，2003)提及CDR/環(huán)，所述系統(tǒng)被開發(fā)來便利地比較可變結(jié)構(gòu)域。在該系統(tǒng)中，保守氨基酸(諸如Cys23、Trp41、Cys104、Phe/Trp118，和在位置89上的疏水性殘基)總是具有相同的位置。另外，提供了框架區(qū)(FR1：位置1至26；FR2：39至55；FR3：66至104；和FR4：118至129)和CDR(CDR1：27至38,CDR2：56至65；和CDR3：105至117)的標(biāo)準(zhǔn)化劃界。

如本文中提及的“抗體片段”可包括本領(lǐng)域中已知的任何合適的抗原結(jié)合抗體片段?？贵w片段可以是天然存在的抗體片段，或可通過天然存在的抗體的操作或通過使用重組方法來獲得。例如，抗體片段可包括但不限于Fv、單鏈Fv(scFv；由利用肽接頭連接的V_L和V_H組成的分子)、Fab、F(ab’)₂、單結(jié)構(gòu)域抗體(sdAb；由單個(gè)V_L或V_H組成的片段)以及任何這些的多價(jià)展示。抗體片段諸如剛剛描述的那些片段可能需要接頭序列、二硫鍵，或其它類型的共價(jià)鍵來連接片段的不同部分；本領(lǐng)域的技術(shù)人員將熟悉不同類型的片段和各種方法的要求以及用于構(gòu)建它們的各種方法。

在非限定性實(shí)例中，抗體片段可以是來源于天然存在的來源的sdAb。駱駝來源的重鏈抗體(Hamers-Casterman等，1993)缺少輕鏈，從而它們的抗原結(jié)合部位由一個(gè)稱為V_HH的結(jié)構(gòu)域組成。還已在鯊魚中觀察到sdAb，其被稱為V_NAR(Nuttall等，2003)?？苫谌薎g重鏈和輕鏈序列工程化其它sdAb(Jespers等，2004；To等，2005)。如本文中所用，術(shù)語“sdAb”包括通過噬菌體展示或其它技術(shù)直接從任何來源的V_H、V_HH、V_L或V_NAR庫分離的那些sdAb、來源于前述sdAb的sdAb、重組產(chǎn)生的sdAb以及通過此類sdAb的進(jìn)一步修飾(通過人源化、親和力成熟、穩(wěn)定化、增溶作用、駱駝化(camelization)或抗體工程的其它方法)產(chǎn)生的那些sdAb。本發(fā)明還設(shè)想了保留sdAb的抗原結(jié)合功能和特異性的同源物、衍生物或片段。

sdAb具有針對抗體分子的期望的性質(zhì)，諸如高耐熱性、高耐洗滌劑性、相對高的對蛋白酶的抗性(Dumoulin等，2002)和高生產(chǎn)產(chǎn)率(Arbabi-Ghahroudi等，1997)；還可通過從免疫文庫分離(Li等，2009)或通過體外親和力成熟(Davies&Riechmann,1996)對它們進(jìn)行工程化以具有非常高的親和力。增加穩(wěn)定性的進(jìn)一步修飾，諸如非典型二硫鍵的引入(Hussack等，2011；Kim等，2012)也可被引入至sdAb。

本領(lǐng)域技術(shù)人員非常熟悉單結(jié)構(gòu)域抗體的結(jié)構(gòu)(見，例如，蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中的3DWT、2P42)。sdAb包括保留了免疫球蛋白折疊的單個(gè)免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域；最顯著的是，只有3個(gè)CDR/高變環(huán)形成抗原結(jié)合部位。然而，并且如本領(lǐng)域中技術(shù)人員應(yīng)理解的，可能并非全部CDR是結(jié)合抗原所需的。例如，并且不希望是限制性的，1、2或3個(gè)CDR可促成本發(fā)明的sdAb對抗原的結(jié)合和識別?？勺兘Y(jié)構(gòu)域或sdAb的CDR在本文中被稱為CDR1、CDR2和CDR3，并且如由Lefranc,M.-P.等(2003)所定義的進(jìn)行編號。

本發(fā)明的抗體或其片段特異于胰島素樣生長因子1受體(IGF1R)(一種在細(xì)胞表面上發(fā)現(xiàn)的受體)。所述IGF1R包括通過二硫鍵連接于β亞基的α亞基，所述α亞基包含具有胰島素樣生長因子1結(jié)合部位的細(xì)胞外部分，所述β亞基包含小的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域、跨膜區(qū)和細(xì)胞內(nèi)部分。IGF1受體組裝成同型二聚體或可與胰島素受體形成異二聚體。IGF1R的序列可以是，但不限于，在圖2中所示的序列(SwissProt登錄號P08069；SEQ ID NO：14)，或與其基本上相同的序列。

如本文所述的抗體或其片段不應(yīng)當(dāng)干擾通過胰島素受體(IR)或IGF1R的信號傳導(dǎo)。具體地，如本文所述的抗體或片段不應(yīng)當(dāng)抑制由胰島素誘導(dǎo)的AKT磷酸化，它們自身也不應(yīng)當(dāng)誘導(dǎo)IR的磷酸化或抑制胰島素誘導(dǎo)的信號傳導(dǎo)；另外，如本文所述的抗體或其片段不應(yīng)當(dāng)抑制IGF1R的IGF-1誘導(dǎo)的磷酸化。此外，它們不應(yīng)當(dāng)結(jié)合胰島素受體。

如前所述，所述抗體或其片段可以是sdAb。所述sdAb可以是駱駝來源或來源于駱駝V_HH，因此其可基于駱駝框架區(qū)；或者，可將上述CDR可移植至V_NAR、V_HH、V_H或V_L框架區(qū)上。在另一種替代方案中，可將上述高變環(huán)移植至任何來源(例如，小鼠)的其它類型的抗體片段(Fv、scFv、Fab)的框架區(qū)或可將CDR移植至其上的具有相似大小和性質(zhì)的蛋白質(zhì)(例如，見Nicaise等，2004)。

本發(fā)明還包括使用本領(lǐng)域中已知的任何合適的方法(例如但不限于CDR移植和鑲面(veneering))“人源化”的抗體片段。抗體或抗體片段的人源化包括將序列中的氨基酸用其人對應(yīng)物(如在人共有序列中發(fā)現(xiàn)的)替代，而不喪失抗原結(jié)合能力或特異性；該方法降低了抗體或其片段當(dāng)被引入人受試者時(shí)的免疫原性。在CDR移植的過程中，可將一個(gè)或不止一個(gè)本文中定義的CDR融合至或移植至人可變區(qū)(V_H或V_L)、其它人抗體(IgA、IgD、IgE、IgG和IgM)、抗體片段的框架區(qū)(Fv、scFv、Fab)或可將CDR移植至其上的具有相似大小和性質(zhì)的蛋白(Nicaise等，2004)。在這種情況下，所述一個(gè)或不止一個(gè)高變環(huán)的構(gòu)象可能得以保持，并且sdAb對其靶(即，IGF1R)的親和力和特異性可能受到最小影響。CDR移植在本領(lǐng)域中已知的，并描述于至少以下專利中：美國專利No.6180370、美國專利No.5693761、美國專利No.6054297、美國專利No.5859205和歐洲專利No.626390。鑲面(在本領(lǐng)域也被稱為“可變區(qū)表面重修”)包括使抗體或片段的暴露于溶劑的位置人源化；因此，對于CDR構(gòu)象可能重要的包埋的非人源化殘基得以保存，同時(shí)針對暴露于溶劑的區(qū)域的免疫反應(yīng)的可能性被最小化。鑲面是在本領(lǐng)域中已知的，并且描述于至少以下專利中：美國專利No.5869619、美國專利No.5766886、美國專利No.5821123和歐洲專利No.519596。本領(lǐng)域技術(shù)人員還充分熟悉制備此類人源化抗體片段和人源化氨基酸位置的方法。

例如，并且不希望以任何方式限制，特異于IGF1R的分離的或純化的抗體或其片段可以是

X₁VX₂LX₃ESGGGLVQX₄GGSLRLSCAASGRTIDNYAMAWX₅RQAPGKX₆X₇EX₈VX₉TIDWGDGGX₁₀RYANSVKGRFTISRDNX₁₁KX₁₂TX₁₃YLQMNX₁₄LX₁₅X₁₆EDTAVYX₁₇CAMARQSRVNLDVARYDYWGQGTX₁₈VTVSS(SEQ ID NO：4)，其中X₁為E或Q；X₂為K或Q；X₃為V或E；X₄為A或P；X₅為V或S；X₆為D或G；X₇為L或R；X₈為F或W；X₉為A或S；X₁₀為A或T；X₁₁為A或S；X₁₂為G或N；X₁₃為M或L；X₁₄為N或R；X₁₅為E或R；X₁₆為P或A；X₁₇為S或Y；以及X₁₈為Q或L，

或與其基本上相同的序列?；蛘?，所述分離的或純化的抗體可包含選自以下序列的序列：

QVKLEESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTIDNYAMAWSRQAPGKDREFVATIDWGDGGARYANSVKGRFTISRDNAKGTMYLQMNNLEPEDTAVYSCAMARQSRVNLDVARYDYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO：5)，在本文中被稱為IGF1R-5；

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTIDNYAMAWVRQAPGKGLEWVSTIDWGDGGTRYANSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAMARQSRVNLDVARYDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：6)，在本文中被稱為IGF1R-5_H1；

QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTIDNYAMAWVRQAPGKGLEWVATIDWGDGGTRYANSVKGRFTISRDNSKNTMYLQMNSLRAEDTAVYYCAMARQSRVNLDVARYDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：7)，在本文中被稱為IGF1R-5_H2；

QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTIDNYAMAWSRQAPGKGLEFVATIDWGDGGTRYANSVKGRFTISRDNSKNTMYLQMNSLRAEDTAVYYCAMARQSRVNLDVARYDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：8)，在本文中被稱為IGF1R-5_H3；

QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTIDNYAMAWSRQAPGKDREFVATIDWGDGGTRYANSVKGRFTISRDNSKGTMYLQMNSLRAEDTAVYSCAMARQSRVNLDVARYDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：9)，在本文中被稱為IGF1R-5_H5；和

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTIDNYAMAWSRQAPGKDREFVSTIDWGDGGTRYANSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAMARQSRVNLDVARYDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：10)，在本文中被稱為IGF1R-5_H6,

或與其基本上相同的序列。

基本上相同的序列可以包含一個(gè)或多個(gè)保守氨基酸突變。在本領(lǐng)域中已知的是，針對參照序列的一個(gè)或多個(gè)保守氨基酸突變可產(chǎn)生相較于參照序列在生理學(xué)、化學(xué)、物理-化學(xué)或功能性質(zhì)上沒有實(shí)質(zhì)變化的突變肽；在這種情況下，參照和突變序列將被認(rèn)為是“基本相同的”多肽。保守氨基酸取代在本文中被定義為氨基酸殘基對另一個(gè)具有相似化學(xué)性質(zhì)(例如大小、電荷或極性)的氨基酸的取代?？蓪dAb的框架區(qū)進(jìn)行這些保守氨基酸突變，同時(shí)維持上文所列的CDR序列和抗體或片段的CDR的總體結(jié)構(gòu)；從而抗體的特異性和結(jié)合得以保持。

在非限制性實(shí)例中，保守突變可以是氨基酸取代。這樣的保守氨基酸取代可用堿性、中性、疏水性或酸性氨基酸取代同一組的另一種氨基酸。術(shù)語“堿性氨基酸”意指具有大于7的側(cè)鏈pK值的親水性氨基酸，其在生理pH下通常帶正電荷。堿性氨基酸包括組氨酸(His或H)、精氨酸(Arg或R)和賴氨酸(Lys或K)。術(shù)語“中性氨基酸”(也稱為“極性氨基酸”)意指具有在生理pH下不帶電荷，但具有至少一個(gè)其中由兩個(gè)原子共享的電子對被所述原子之一更緊密地持有的鍵的側(cè)鏈的親水性氨基酸。極性氨基酸包括絲氨酸(Ser或S)、蘇氨酸(Thr或T)、半胱氨酸(Cys或C)、酪氨酸(Tyr或Y)、天冬酰胺(Asn或N)和谷氨酰胺(Gln或Q)。術(shù)語“疏水性氨基酸”(也稱為“非極性氨基酸”)意指包括根據(jù)Eisenberg(1984)的標(biāo)準(zhǔn)化的一致性疏水性標(biāo)度表現(xiàn)出大于零的疏水性的氨基酸。疏水性氨基酸包括脯氨酸(Pro或P)、異亮氨酸(Ile或I)、苯丙氨酸(Phe或F)、纈氨酸(Val或V)、亮氨酸(Leu或L)、色氨酸(Trp或W)、甲硫氨酸(Met或M)、丙氨酸(Ala或A)和甘氨酸(Gly或G)?！八嵝园被帷笔侵妇哂行∮?的側(cè)鏈pK值的親水性氨基酸，其在生理pH下通常帶負(fù)電荷。酸性氨基酸包括谷氨酸(Glu或E)和天冬氨酸(Asp或D)。

序列同一性用于評估兩個(gè)序列的相似性；其通過計(jì)算當(dāng)就殘基位置之間的最大對應(yīng)性對齊兩個(gè)序列時(shí)，為相同的殘基的百分比來測定。任何已知的方法可用于計(jì)算序列同一性；例如，計(jì)算機(jī)軟件可用于計(jì)算序列同一性。不希望是限制性的，序列同一性可通過軟件諸如由Swiss Institute of Bioinformatics維護(hù)的NCBI BLAST2服務(wù)(和如在ca.expasy.org/tools/blast/找到的)、BLAST-P、Blast-N或FASTA-N，或本領(lǐng)域中已知的任何其它適當(dāng)?shù)能浖碛?jì)算。

本發(fā)明的基本上相同的序列可以是至少90％相同的；在另一個(gè)實(shí)例中，基本相同的序列可以是在氨基酸水平上與本文所述的序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％或其之間的任何百分比的同一性。重要的是，基本相同的序列保留了參照序列的活性和特異性。在非限制性實(shí)施方案中，序列同一性的差異可因保守氨基酸突變而導(dǎo)致。在非限制性實(shí)例中，本發(fā)明可涉及包含與本文所述的抗體的序列具有至少95％、98％或99％同一性的序列的抗體或其片段。

本發(fā)明的抗體或其片段還可以包含輔助重組抗體或其片段的表達(dá)、檢測或純化的額外序列?？墒褂帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何這樣的序列或標(biāo)簽。例如，并且不希望是限制性的，所述抗體或其片段可包含靶向或信號序列(例如但不限于ompA)、檢測/純化標(biāo)簽(例如但不限于c-Myc、His₅或His₆)或其組合。在另一個(gè)實(shí)例中，所述額外序列可以是生物素識別位點(diǎn)，例如由Cronan等在WO 95/04069或Voges等在WO/2004/076670中描述的生物素識別位點(diǎn)。如本領(lǐng)域技術(shù)人員還已知的，可將接頭序列與額外序列或標(biāo)簽結(jié)合使用，或者可用作檢測/純化標(biāo)簽。

本發(fā)明的抗體或其片段還可呈多價(jià)展示形式，在本文中也稱為多價(jià)呈現(xiàn)。多聚化可通過本領(lǐng)域已知的任何合適的方法來實(shí)現(xiàn)。例如，并且不希望以任何方式進(jìn)行限制，可以使用自組裝分子諸如在Zhang等人(2004a；2004b)和WO2003/046560中描述的那些自組裝分子來實(shí)現(xiàn)多聚化，其中通過表達(dá)包含本發(fā)明抗體或其片段與AB₅毒素家族的B亞基的五聚化結(jié)構(gòu)域的融合蛋白來產(chǎn)生pentabody(Merritt&Hol,1995)。多聚體也可以使用Zhu等人描述的多聚化結(jié)構(gòu)域形成(2010)；還可使用由Zhu等(2010)描述的多聚化結(jié)構(gòu)域來形成多聚體；該形式，在本文中被稱為“combody”形式，是本發(fā)明的抗體或片段與產(chǎn)生多聚體分子的卷曲螺旋肽的融合物。本發(fā)明還包括其它形式的多價(jià)展示。例如，并且不希望是限制性的，所述抗體或其片段可以作為二聚體、三聚體或任何其它合適的寡聚體存在。這可以通過本領(lǐng)域已知的方法，例如直接連接聯(lián)結(jié)(Nielson等，2000)、c-jun/Fos相互作用(de Kruif&Logtenberg，1996)、“旋鈕入孔(Knob into holes)”相互作用(Ridgway等，1996)來實(shí)現(xiàn)。

本領(lǐng)域已知的用于多聚化的另一種方法是使用Fc結(jié)構(gòu)域(例如但不限于人Fc結(jié)構(gòu)域)二聚化抗體或其片段。Fc結(jié)構(gòu)域可選自多個(gè)種類，包括但不限于IgG、IgM或各種亞類，包括但不限于IgG1、IgG2等。在該方法中，將Fc基因連同sdAb基因插入載體以產(chǎn)生sdAb-Fc融合蛋白(Bell等，2010；Iqbal等，2010)；重組表達(dá)所述融合蛋白，隨后進(jìn)行純化。例如，并且不希望以任何方式進(jìn)行限制，多價(jià)展示形式可包括與Fc結(jié)構(gòu)域連接的抗IGF1R-5 V_HH的嵌合形式，或具有兩個(gè)或三個(gè)識別獨(dú)特表位的抗IGF1R-5 V_HH的雙或三特異性抗體融合物。此類抗體易于工程化和生產(chǎn)，可以大大延長sdAb的血清半衰期，并且可以是優(yōu)良的腫瘤成像試劑(Bell等，2010)。

剛剛描述的多聚復(fù)合物中的Fc結(jié)構(gòu)域可以是本領(lǐng)域已知的任何合適的Fc片段。所述Fc片段可來自任何合適的來源；例如，F(xiàn)c可具有小鼠或人來源。在具體的非限制性實(shí)例中，F(xiàn)c可以是小鼠Fc2b片段或人Fc1片段(Bell等，2010；Iqbal等，2010)。在具體的非限制性實(shí)例中，剛剛描述的多聚化分離的或純化的抗體或片段可包含SEQ ID NO：42、43、12或13的序列。

上述多聚體的每個(gè)亞基可以包含相同或不同的本發(fā)明的抗體或其片段，其可以具有相同或不同的特異性。另外，根據(jù)需要，可使用接頭將多聚化結(jié)構(gòu)域連接于抗體或抗體片段；此類接頭應(yīng)當(dāng)具有足夠的長度和合適的組成以提供兩個(gè)分子的柔性連接，但不應(yīng)阻礙抗體的抗原結(jié)合性質(zhì)。

如本文所述的抗體或其片段可以遷移穿過血腦屏障。腦通過被稱為血腦屏障(BBB)的特化內(nèi)皮組織與身體的其余部分分離。BBB的內(nèi)皮細(xì)胞通過緊密連接來連接，并高效地防止許多治療性化合物進(jìn)入腦。除了低水平的囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)以外，BBB的一個(gè)特定特征是在BBB的近腔(腦)側(cè)上存在酶促屏障和ATP-依賴性轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的高水平表達(dá)，所述轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白包括P-糖蛋白(Gottesman等，1993；Watanabe,1995)，其將各種分子從腦主動運(yùn)輸至血流中(Samuels,1993)。只有小的(<500道爾頓)和疏水性(Pardridge，1995)分子可以更容易地穿過BBB。因此，如上所述的抗體或其片段特異性結(jié)合表面受體、內(nèi)化進(jìn)入腦內(nèi)皮細(xì)胞并通過逃避溶酶體降解而經(jīng)歷穿過BBB的轉(zhuǎn)胞吞的能力在神經(jīng)學(xué)領(lǐng)域中是有用的。

本發(fā)明也包括編碼如本文所述的分子的核酸序列。鑒于遺傳密碼的簡并性，許多核苷酸序列將具有編碼所述多肽的效果，這是本領(lǐng)域技術(shù)人員容易理解的。核酸序列可以經(jīng)密碼子優(yōu)化以用于在各種微生物中表達(dá)。本發(fā)明還包括包含剛剛描述的核酸的載體。此外，本發(fā)明包括包含所述核酸和/或載體的細(xì)胞。

本發(fā)明還包括使用各種方法學(xué)固定在表面上的分離的或純化的抗體或其片段；例如，并且不希望是限制性的，可將抗體或片段通過His-標(biāo)簽偶聯(lián)、生物素結(jié)合、共價(jià)結(jié)合、吸附等連接或偶聯(lián)至表面。本發(fā)明的抗體或其片段的固定可用于捕獲、純化或分離蛋白質(zhì)的各種應(yīng)用。固體表面可以是任何合適的表面，例如但不限于微量滴定板的孔表面、表面等離子體共振(SPR)傳感器芯片的通道、膜、珠粒(諸如基于磁性或基于瓊脂糖的珠?；蚱渌鼘游鰳渲?、玻璃、塑料、不銹鋼、薄膜或任何其它有用的表面，諸如納米顆粒、納米線和懸臂表面。

本發(fā)明還包括連接于貨物分子的如上所述的抗體或其片段。貨物分子可以是任何合適的分子，其通過抗體或其片段被遞送穿過BBB。貨物分子可以具有在約1kD至約200kDa的范圍內(nèi)的分子量；例如，貨物分子可以具有約1kDa、5kDa、10kDa、15kDa、20kDa、25kDa、30kDa、35kDa、40kDa、45kDa、50kDa、55kDa、60kDa、65kDa、70kDa、75kDa、80kDa、85kDa、90kDa、95kDa、100kDa、105kDa、110kDa、115kDa、120kDa、125kDa、130kDa、135kDa、140kDa、145kDa、150kDa、155kDa、160kDa、165kDa、170kDa、175kDa、180kDa、185kDa、190kDa、195kDa或200kDa的分子量，或其之間的任何分子量，或由任何兩個(gè)前述分子量限定的任何分子量范圍。在具體的非限制性實(shí)例中，貨物分子可具有1kDa(例如，但不限于小分子，例如Cy5.5)、1-10kDa(例如，但不限于肽諸如甘丙肽，3kDa)、約80kDa(例如，但不限于Fc片段、酶、蛋白質(zhì)、抗體等)或約200kDa(例如，但不限于單克隆抗體)的分子量。

例如，并且不希望以任何方式進(jìn)行限制，貨物分子可以是可檢測試劑、治療劑、藥物、肽、酶、生長因子、細(xì)胞因子、受體陷阱、抗體或其片段(例如，IgG、scFv、Fab、V_HH、V_H、V_L等)、化學(xué)化合物、碳水化合物部分、基于DNA的分子(反義寡核苷酸、microRNA、siRNA、質(zhì)粒)、細(xì)胞毒性劑、病毒載體(腺病毒、慢病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體)、一種或多種裝載有任何前述類型的貨物分子的脂質(zhì)體或納米載體，或一種或多種納米顆粒、納米線、納米管或量子點(diǎn)。如上所述的貨物分子可以是可檢測試劑。例如，可將IGF1R特異性抗體或其片段連接于放射性同位素、順磁性標(biāo)記、熒光團(tuán)、熒光劑、近紅外(NIR；例如Cy5.5)熒光色素或染料、回聲微泡、親和標(biāo)記、基于蛋白質(zhì)的可檢測分子、核苷酸、量子點(diǎn)、納米顆粒、納米線或納米管或可通過成像方法檢測的任何其它合適的試劑?？墒褂帽绢I(lǐng)域已知的任何方法(重組技術(shù)、化學(xué)綴合等)將抗體或其片段連接于貨物分子。

還可通過本領(lǐng)域已知的任何合適的方法將如本文所述的貨物分子連接(在本文中也稱為“綴合”)于抗體或其片段。例如，并且不希望是限制性的，可通過共價(jià)鍵或離子相互作用將貨物分子連接于肽?？赏ㄟ^化學(xué)交聯(lián)反應(yīng)或使用與任何肽表達(dá)系統(tǒng)(諸如基于細(xì)菌、酵母或哺乳動物細(xì)胞的系統(tǒng))組合的重組DNA方法學(xué)通過融合來實(shí)現(xiàn)所述連接。當(dāng)將貨物分子綴合于抗體或其片段時(shí)，可以使用合適的接頭。用于將抗體或其片段連接于貨物分子諸如治療劑或可檢測試劑的方法對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是公知的。

在一個(gè)非限制性實(shí)例中，貨物分子可以是可檢測標(biāo)記、放射性同位素、順磁性標(biāo)記諸如釓或氧化鐵、熒光團(tuán)、近紅外(NIR)熒光色素或染料、回聲微泡、親和標(biāo)記(例如生物素、抗生物素蛋白等)、酶或可通過診斷成像方法檢測的任何其它合適的試劑。在具體的非限制性實(shí)例中，可將抗IGF1R-5或其片段連接于近紅外熒光(NIRF)成像染料，例如并且不希望限于Cy5.5、Alexa680、Dylight680或Dylight800。

因此，本發(fā)明還提供了檢測IGF1R的體外方法，包括將組織樣品與一種或不止一種連接于可檢測試劑的本發(fā)明的分離或純化的抗體或其片段接觸。隨后可使用本領(lǐng)域已知的檢測和/或成像技術(shù)檢測IGF1R-抗體復(fù)合物。剛剛描述的方法中的組織樣品可以是任何合適的組織樣品，例如但不限于血清樣品、血管組織樣品、腫瘤組織樣品或腦組織樣品；組織樣品可來自人或動物受試者。在本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的合適條件下進(jìn)行接觸步驟，以用于形成抗體或其片段與IGF1R之間的復(fù)合物。檢測步驟可以通過本領(lǐng)域已知的任何合適的方法來完成，所述方法是例如，但不限于光學(xué)成像、免疫組織化學(xué)、分子診斷成像、ELISA、成像質(zhì)譜法或其它合適的方法。例如，并且不希望以任何方式進(jìn)行限制，連接于可檢測試劑的分離的或純化的抗體或其片段可用于免疫測定(IA)，包括，但不限于酶IA(EIA)、ELISA、“快速抗原捕獲”、“快速層析IA和“快速EIA”。(例如，見Planche等，2008；Sloan等，2008；Rüssmann等，2007；Musher等，2007；Turgeon等，2003；Fenner等，2008)。

本發(fā)明還提供了檢測受試者中的IGF1R表達(dá)的體內(nèi)方法。該方法包括向受試者施用一種或不止一種與可檢測試劑連接的如本文所述的分離的或純化的抗體或其片段，隨后檢測結(jié)合于IGF1R的標(biāo)記抗體或其片段。檢測步驟可包括本領(lǐng)域已知的任何合適的方法，例如，但不限于PET、SPECT或熒光成像或任何其它合適的方法。剛剛描述的方法可用于檢測血管或組織(例如，但不限于腫瘤組織)中的IGF1R的表達(dá)。

上述方法中的體內(nèi)檢測步驟可以是定量方式的用于診斷目的的全身成像或在特定部位例如但不限于腦血管或腦腫瘤血管的局部成像，以評估疾病的進(jìn)展或宿主對治療方案的反應(yīng)。如上所述的方法中的檢測步驟可以是免疫組織化學(xué)或非侵入性(分子)診斷成像技術(shù)，包括但不限于：

·光學(xué)成像；

·正電子發(fā)射斷層攝影術(shù)(PET)，其中可檢測試劑為同位素諸如¹¹C、¹³N、¹⁵O、¹⁸F、⁶⁴Cu、⁶²Cu、1²⁴I、⁷⁶Br、⁸²Rb和⁶8Ga，¹⁸F是臨床上使用最多的；

·單光子發(fā)射計(jì)算機(jī)體層攝影(SPECT)，其中可檢測試劑為放射性示蹤元素諸如^99mTc、¹¹¹In、¹²³I、²⁰¹Tl、¹³³Xe，取決于具體應(yīng)用；

·磁共振成像(MRI)，其中可檢測試劑可以是例如，但不限于釓、氧化鐵納米顆粒和碳涂覆的鐵-鈷納米顆粒，從而增加MRI對斑塊檢測的靈敏度。

·超聲造影(Contrast-Enhanced Ultrasonography)(CEUS)或超聲，其中可檢測試劑是至少一種聲學(xué)活性和充氣微泡。超聲是用于人疾病的篩選和早期檢測的廣泛的技術(shù)。其比MRI或閃爍掃描術(shù)便宜，且比分子成像模式諸如放射性核素成像安全，因?yàn)槠洳簧婕拜椪铡?/p>

本發(fā)明還提供了將目標(biāo)分子轉(zhuǎn)運(yùn)穿過血腦屏障的方法。該方法包括向受試者施用連接于本文所述的抗體或其片段的分子；所述抗體或其片段遷移穿過血腦屏障。所述分子可以是任何期望的分子，包括如前所述的貨物分子；可以使用任何合適的方法將該分子“連接”于抗體或其片段，所述方法包括，但不限于綴合或以融合蛋白形式表達(dá)。施用可以通過任何合適的方法進(jìn)行，例如腸胃外施用，包括但不限于靜脈內(nèi)(iv)、皮下(sc)和肌內(nèi)(im)施用。在該方法中，本發(fā)明的抗體或其片段將目標(biāo)分子“擺渡”穿過BBB至其腦靶標(biāo)。

本發(fā)明還包括包含一種或不止一種如本文所述的分離的或純化的抗體或其片段的組合物。所述組合物可包含如上所述的單一抗體或片段，或可以是抗體或片段的混合物。此外，在包含本發(fā)明的抗體或片段的混合物的組合物中，抗體可具有相同的特異性，或可在它們的特異性方面不同；例如，并且不希望以任何方式進(jìn)行限制，所述組合物可包含特異于IGF1R(相同或不同的表位)的抗體或其片段。

組合物還可包含藥學(xué)上可接受的稀釋劑、賦形劑或載體。所述稀釋劑、賦形劑或載體可以是本領(lǐng)域已知的任何合適的稀釋劑、賦形劑或載體，并且必須與組合物中的其它成分相容，與組合物的遞送方法相容，并且對于組合物的接受者是無害的。所述組合物可以是任何合適的形式；例如，所述組合物可以以懸浮液形式、粉劑形式(例如，但不限于凍干的或膠囊化的)、膠囊或片劑形式提供。例如并且不希望是限制性的，當(dāng)將組合物以懸浮液形式提供時(shí)，載體可包括水、鹽水、合適的緩沖液或用于改善溶解性和/或穩(wěn)定性的添加劑；在具有適當(dāng)pH的緩沖液中進(jìn)行產(chǎn)生懸浮液的重建以確?？贵w或其片段的活力。干粉還可包含改善穩(wěn)定性的添加劑和/或增加體積/容積的載體；例如，并且不希望是限制性的，干粉組合物可包含蔗糖或海藻糖。在具體的非限制性實(shí)例中，可配制組合物以將抗體或其片段遞送至受試者的胃腸道。因此，所述組合物可包括包封、延時(shí)釋放或用于遞送抗體或其片段的其它合適技術(shù)。制備包含本發(fā)明化合物的合適組合物在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍內(nèi)。

本發(fā)明還包括定量被遞送穿過受試者的BBB的貨物分子的量的方法，其中將所述貨物分子與一種或不止一種本文所述的分離的或純化的抗體或其片段連接，所述方法包括：

a)從受試者收集腦脊髓液(CSF)；和

b)使用靶向蛋白質(zhì)組學(xué)方法定量CSF中連接于一種或不止一種抗體或其片段的貨物分子的量。

貨物分子可以是任何期望的分子，包括如前所述的貨物分子；所述分離的或純化的抗體或其片段遷移穿過血腦屏障；并且可使用任何合適的方法將該分子“連接”于抗體或其片段，所述方法包括，但不限于如前所述的綴合或以融合蛋白形式表達(dá)。在上述方法中，使用本領(lǐng)域已知的任何合適的方法從受試者收集CSF。用于步驟b)中的靶向蛋白質(zhì)組學(xué)方法所需的CSF的量可在約1至10μl之間；例如，所需CSF的量可以是約1.0μl、1.5μl、2.0μl、2.5μl、3.0μl、3.5μl、4.0μl、4.5μl、5.0μl、5.5μl、6.0μl、6.5μl、7.0μl、7.5μl、8.0μl、8.5μl、9.0μl、9.5μl或10μl，或其間的任何量，或由剛剛所述的量限定的任何范圍?？稍谑占疌SF之前向受試者施用連接于貨物分子的抗體或片段?？赡苄枰B接于貨物分子的抗體或片段的施用與遞送穿過BBB之間的合適延遲。延遲可以是施用連接于貨物分子的抗體或片段后至少30分鐘；例如并且不希望以任何方式進(jìn)行限制，延遲可以是至少30分鐘、1小時(shí)、1.5小時(shí)、2小時(shí)、2.5小時(shí)、3小時(shí)、3.5小時(shí)、4小時(shí)、4.5小時(shí)或5小時(shí)。用于定量連接于貨物分子的一種或不止一種抗體或其片段的量的靶向蛋白質(zhì)組學(xué)方法可以是本領(lǐng)域已知的任何合適的方法。例如并且不希望是限制性的，靶向蛋白質(zhì)組學(xué)方法可以是質(zhì)譜法，例如但不限于使用同位素標(biāo)記的內(nèi)標(biāo)的多反應(yīng)監(jiān)測(MRM-ILIS；見例如Haqqani等，2013)。MRM是有利的，因?yàn)槠湓试S對生物樣品中的未標(biāo)記的靶向分析物(例如，如本文所述的抗體或其片段)進(jìn)行快速、靈敏和特異性定量。測定的多重性能可允許定量抗體或其片段和貨物分子兩者。

本發(fā)明將在以下實(shí)施例中進(jìn)一步說明。然而，應(yīng)當(dāng)理解的是，這些實(shí)施例僅用于說明目的，不應(yīng)以任何方式用于限制本發(fā)明的范圍。

實(shí)施例1：IGF1R重組片段的純化

制備IGF1R的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的933個(gè)氨基酸長的重組片段(圖1中的灰色框所示；也見SEQ ID NO：14的氨基酸1-933)。該片段包含N-末端30個(gè)氨基酸的信號肽、完整的α亞基、弗林蛋白酶切割位點(diǎn)(RKRR，SEQ ID NO：15；分離α和β亞基)以及β亞基的大部分胞外部分(圖1和圖2)。

克隆。使用以下引物通過PCR擴(kuò)增目標(biāo)IGF1R胞外域的序列：

5’-CGGGATCCGCCACCATGAAGTCTGGCTCCGGAG-3’(正向；SEQ ID NO：16)

5’-GCTCTAGATCAGAAGTTTTCATATCCTGTTTTGG-3’(反向；SEQ ID NO：17)

并亞克隆入Puc19的SmaI位點(diǎn)。隨后將IGF1R⁹³³序列亞克隆入pCDN4/myc-His(Invitrogen)以產(chǎn)生pIGF1R⁹³³-His，其允許表達(dá)如先前所述的His-標(biāo)記的胞外域(Samani等2004).

瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。如先前所述，在包裝細(xì)胞系293SF-PacLV中產(chǎn)生表達(dá)IGF1R⁹³³-His的慢病毒顆粒(Broussau等，2008)。簡言之，使用聚乙烯亞胺，利用載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞。在轉(zhuǎn)染后5小時(shí)，向細(xì)胞中添加含有1μg/ml多西環(huán)素和10μg/ml cumate的新鮮培養(yǎng)基(LC-SFM)，在48-72小時(shí)后收集含有LV顆粒的上清液，通過在20％蔗糖墊上以100,000xg在4℃下超速離心2小時(shí)進(jìn)行濃縮(Gaillet B等人，2007)，將其重懸于補(bǔ)充有1％FBS的LC-SFM培養(yǎng)基中，并于-70℃貯存直至使用。

穩(wěn)定表達(dá)。通過使用先前描述的方案(Gaillet B.等2010)利用各自的慢病毒顆粒轉(zhuǎn)導(dǎo)293SF-Cum2細(xì)胞系來產(chǎn)生穩(wěn)定的細(xì)胞系293SF-cum2-CR5-IGF1R-His。簡言之，將0.5-1.0×10⁵ 293SF-Cum2細(xì)胞于24孔板中接種在200μl不含硫酸葡聚糖的LC-SFM培養(yǎng)基中。通過將200-500μL LV與8μg/mL的聚凝胺混合并在37℃下溫育30分鐘來制備LV懸浮液。接種后4小時(shí)，將新鮮制備的LV懸浮液添加至細(xì)胞中。24小時(shí)后，向細(xì)胞中加入500μL補(bǔ)充有硫酸葡聚糖的培養(yǎng)基。為了升高表達(dá)水平，在3-4天的細(xì)胞回收后，使用相同的方案將細(xì)胞再轉(zhuǎn)導(dǎo)多達(dá)6次。最后，將細(xì)胞在6孔板和搖瓶中進(jìn)行擴(kuò)增。

大規(guī)模蛋白生產(chǎn)和純化。將鑒定為最高生產(chǎn)者的克隆在振蕩器或旋轉(zhuǎn)瓶中進(jìn)行擴(kuò)增。通過在新鮮培養(yǎng)基中添加1μg/ml的cumate來開始蛋白質(zhì)生產(chǎn)，隨后在37℃下溫育24小時(shí)，和在30℃下溫育4-8天。通過離心除去細(xì)胞，并使用切向流過濾系統(tǒng)(Pellicon ultrafiltration cassette，EMD Millipore)過濾和濃縮(10x)上清液。

按照制造商的說明書，使用HisPrep柱(GE Healthcare)純化IGF1R⁹³³-His。簡言之，將濃縮的樣品施加于用50mM磷酸鈉、300mM NaCl、5mM咪唑pH7.5平衡和洗滌的His-prep FF(16/10)柱(GE Healtcare)，并用50mM磷酸鈉、300mM NaCl、500mM咪唑pH7.5進(jìn)行洗脫。將利用0.1M檸檬酸鈉pH4.5至pH2.5的梯度洗脫用于洗脫蛋白質(zhì)并合并峰級分。使用50kDa截留膜或脫鹽柱利用含有50mM磷酸鈉、150mM NaCl和0.01％Tween-80，pH7.2的緩沖液，通過超濾進(jìn)行緩沖液交換。通過SDS-PAGE驗(yàn)證兩種蛋白質(zhì)的純度，并將它們-80℃下貯存直至使用(參見隨后的實(shí)施例)。

實(shí)施例2：美洲駝免疫和血清反應(yīng)

為了分離靶向IGF1R的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的V_HH，用實(shí)施例1中獲得的重組IGF1R⁹³³–His片段免疫美洲駝。

通過皮下、下背部注射IGF1R⁹³³-His重組抗原(實(shí)施例1)免疫一只雄性美洲駝(Lama glama)。在第1天，將在PBS中稀釋至1ml的200μg抗原與1ml弗氏完全佐劑(Sigma，St.Louis，MO)一起注射。在第22、36和50天進(jìn)行100μg IGF1R⁹³³-His抗原加上弗氏不完全佐劑(Sigma)的另外3次注射。在第77天進(jìn)行不含佐劑的100μg抗原的最終注射。在第1天首次注射之前抽取免疫前血，并用作陰性對照。在第29、43、57和84天收集血液(10-15ml)。立即處理來自第84天的血液以分離外周血單核細(xì)胞(PBMC)。用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)以1：1稀釋血液，并使用Lymphoprep管(Axis Shield)從血液純化PBMC。計(jì)數(shù)細(xì)胞，并將其以約1x 10⁷個(gè)細(xì)胞的等份在-80℃下貯存，以備將來使用。

在第57天通過ELISA分析免疫前和免疫后總血清對IGF1R⁹³³-His抗原的特異性反應(yīng)。如前所述對來自第84天的美洲駝血清進(jìn)行分級分離(Doyle等，2008)。通過ELISA分析所得級分A1(HCAb)、A2(HCAb)、G1(HCAb)和G2(cIgG)對IGF1R⁹³³-His抗原的特異性結(jié)合。簡言之，將在PBS中稀釋的5μg IGF1R⁹³³-His重組抗原在96孔Maxisorp板(Nalgene,Nunc)中溫育過夜(100μl/孔,18h,4℃)以包被板。用牛血清白蛋白(BSA)封閉平板，用PBS-T(PBS+0.05％(v/v)Tween-20)進(jìn)行洗滌，隨后施用免疫前總血清、免疫后總血清(第57天)和分級分離的血清(第84天)的系列稀釋物。在室溫下溫育1.5小時(shí)后，用PBS-T洗滌板，隨后添加山羊抗美洲駝IgG(PBS中1：1000)并將板在37℃下溫育1小時(shí)。在用PBS-T洗滌后，添加豬抗山羊IgG-HRP綴合物(PBS中1：3,000)，將平板在37℃下溫育1小時(shí)。在加入100μl/孔的TMB底物(KPL,Gaithersburg,MD)之前進(jìn)行最后的PBS-T洗滌；將底物溫育10分鐘。用100μl/孔的1M H₃PO₄終止反應(yīng)。在450nm讀取吸光度。

實(shí)施例3：IGF1R-結(jié)合性V_HH的文庫構(gòu)建和選擇

基于從實(shí)施例2中的PBMC分離的RNA構(gòu)建超免疫的美洲駝V_HH文庫。

基本上如先前所述(Arbabi-Ghahroudi等，2009a,2009b；Tanha等，2003)進(jìn)行文庫構(gòu)建和淘選。使用QIAamp RNA Blood Mini試劑盒(Qiagen)從免疫(實(shí)施例2)后84天收集的約10⁷個(gè)PBMC分離總RNA。將約5μg的總RNA用作使用First-Strand cDNA Synthesis試劑盒(GE Healthcare)，利用寡聚dT引物的第一鏈cDNA合成的模板。利用以下3個(gè)可變區(qū)特異性正義引物：

MJ1：5’-GCCCAGCCGGCCATGGCCSMKGTGCAGCTGGTGGAKTCTGGGGGA-3’(SEQ ID NO：18)

MJ2：5’-GCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGTAAAGCTGGAGGAGTCTGGGGGA-3’(SEQ ID NO：19)

MJ3：5’-GCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGCTCAGGTACAGCTGGTGGAGTCT-3’(SEQ ID NO：20),

和2個(gè)反義CH₂-特異性引物：

CH₂：5’-CGCCATCAAGGTACCAGTTGA-3’(SEQ ID NO：21)

CH₂b₃：5’-GGGGTACCTGTCATCCACGGACCAGCTGA-3’(SEQ ID NO：22)

的等摩爾混合物擴(kuò)增cDNA和兩個(gè)反義CH₂-特異性引物。

簡言之，將PCR反應(yīng)混合物設(shè)置在具有以下組分的50μl的總體積中：1-3μl cDNA、5pmol MJ1-3引物混合物、5pmol CH₂或CH₂b₃引物、5μl 10x反應(yīng)緩沖液、1μl 10mM dNTP、2.5個(gè)單位的Taq DNA聚合酶(Hoffmann-La Roche)。PCR方案由以下步驟組成：(i)94℃的初始步驟，持續(xù)3分鐘，(ii)隨后30個(gè)循環(huán)：94℃持續(xù)1分鐘，55℃持續(xù)30秒，72℃持續(xù)30秒，和(iii)最后的延伸步驟，在72℃持續(xù)7分鐘。將擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物在2％瓊脂糖凝膠上電泳，觀察到兩條主要條帶：約850bp的條帶(對應(yīng)于常規(guī)IgG)和約600bp的第二條帶(對應(yīng)于駱駝重鏈抗體的V_HH-CH2區(qū))。使用QIAquick凝膠提取試劑盒(Qiagen)切割和純化較小的條帶，并在第二PCR中使用1μl(30ng)DNA模板，各5pmol的MJ7引物(5’-CATGTGTAGACTCGCGGCCCAGCCGGCCATGGCC-3’SEQ ID NO：23)和MJ8引物(5’-CATGTGTAGATTCCTGGCCGGCCTGGCCTGAGGAGACGGTGACCTGG-3’SEQ ID NO：24)，5μl的10x反應(yīng)緩沖液，1μl的10mM dNTP，2.5個(gè)單位的Taq DNA聚合酶在50μl的總體積中對其進(jìn)行再擴(kuò)增。PCR方案由以下步驟組成：(i)初始步驟，94℃持續(xù)3分鐘，(ii)隨后30個(gè)循環(huán)：94℃持續(xù)30秒，57℃持續(xù)30秒和72℃持續(xù)1分鐘，和(iii)最后的延伸步驟，72℃持續(xù)7分鐘。使用QIAquick PCR純化試劑盒(Qiagen)純化擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物，其范圍在340bp與420bp之間并對應(yīng)于重鏈抗體的V_HH片段，用SfiI限制性內(nèi)切酶(New England BioLabs)進(jìn)行消化，并使用相同試劑盒進(jìn)行再純化。

在50℃下用SfiI消化80μg的pMED1噬菌粒載體(Arbabi-Ghahroudi等，2009b)過夜。為了使自身連接最小化，加入20個(gè)單位的XhoI和PstI限制性內(nèi)切酶以切割切下的片段，并將消化反應(yīng)在37℃下再溫育2小時(shí)。按照制造商的說明書，使用LigaFast快速DNA連接系統(tǒng)(Promega)將60μg消化的噬菌粒DNA與6μg消化的(SfiI在50℃持續(xù)5小時(shí))V_HH片段(摩爾比為1：1)在室溫下連接3小時(shí)。使用QIAquick PCR純化試劑盒(Qiagen)純化連接的質(zhì)粒，在100μl的終體積中洗脫，并如所述的(Arbabi-Ghahroudi等，2009b)，使用每個(gè)轉(zhuǎn)化反應(yīng)5μl的經(jīng)連接的DNA等分試樣轉(zhuǎn)化入電感受態(tài)TG1大腸桿菌(E.coli)(Stratagene)。如Arbabi-Ghahroudi等，2009b中所述，測定文庫大小為5×10⁷。對20個(gè)克隆進(jìn)行測序，其含有所有獨(dú)特的V_HH序列。在2％(w/v)葡萄糖存在的情況下，將包含文庫的大腸桿菌在37℃、250rpm生長2-3小時(shí)。隨后將細(xì)菌沉淀，重懸于含有35％(v/v)甘油的2xYT/Amp/Glu(具有100μg/ml氨芐青霉素和2％(w/v)葡萄糖的2xYT培養(yǎng)基)中，并以小的等分試樣于-80℃貯存。

淘選實(shí)驗(yàn)基本上如(Arbabi等，1997)中所述進(jìn)行。將2毫升的文庫(2.0×10¹⁰個(gè)細(xì)菌)在冰上解凍，隨后37℃下于2xYT/Amp/Glu中生長約2小時(shí)(A₆₀₀＝0.4-0.5)。隨后在37℃下用20×過量的M13KO7輔助噬菌體(New England Biolabs)感染大腸桿菌，持續(xù)1小時(shí)。隨后將培養(yǎng)物在4℃下離心，將感染的細(xì)菌沉淀重新懸浮于200ml含有50μg/ml卡那霉素的2xYT/Amp中，并在37℃和250rpm下溫育。將培養(yǎng)上清液中的噬菌體顆粒與1/5體積的20％PEG 8000/2.5M NaCl一起在冰上溫育1h，并以10,000rpm離心15分鐘。將噬菌體沉淀重懸于1.5ml無菌PBS中，滴定并用作用于淘選的輸入噬菌體。對于第1輪淘選，將96孔Maxisorp^TM平板在4℃下用每孔100μl PBS中的10μg重組IGF1R⁹³³-His包被過夜。用PBS漂洗孔，并用PBS加1％(w/v)酪蛋白在37℃封閉2小時(shí)。將約10¹²個(gè)噬菌體添加至封閉的孔并在37℃溫育2小時(shí)。在用PBS/0.1％(v/v)Tween 20進(jìn)行10×洗滌后，用0.1M三乙胺洗脫結(jié)合的噬菌體，中和(50μl 1M Tris-HCl，pH7.4)，將其與指數(shù)生長的TG1大腸桿菌混合。對洗脫的噬菌體進(jìn)行滴定，將感染的細(xì)菌用M13K07進(jìn)行超感染并在37℃下生長過夜。將來自過夜培養(yǎng)物的純化的噬菌體用作下一輪淘選的輸入。繼續(xù)進(jìn)行另外三輪淘選。使用與上述相同的方案，除了用于包被平板的重組抗原的量分別在第二輪、第三輪和第四輪淘選中減少至7μg、5μg和5μg。

對第4輪淘選后獲得的個(gè)體TG1集落進(jìn)行噬菌體ELISA篩選，基本上如其它地方所述(Doyle等，2008)地進(jìn)行，除了使用5μg/ml IGF1R⁹³³-His重組抗原包被微量滴定板。將所有陽性克隆送去用于DNA測序。選擇產(chǎn)生高噬菌體ELISA信號的獨(dú)特克隆用于使用已知方法進(jìn)行大規(guī)模表達(dá)和純化(見實(shí)施例4)。鑒定出稱為IGF1R-5的克隆用于進(jìn)一步研究；其序列如下所示。

QVKLEESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTIDNYAMAWSRQAPGKDREFVATIDWGDGGARYANSVKGRFTISRDNAKGTMYLQMNNLEPEDTAVYSCAMARQSRVNLDVARYDYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO：5)

實(shí)施例4：IGF1R-5的人源化

為了避免美洲駝來源的IGF1R-5在用作治療劑的BBB載體時(shí)的潛在免疫原性，通過V_HH中的“駱駝”殘基的突變對駱駝來源的sdAb進(jìn)行“人源化”。應(yīng)當(dāng)指出的是，為了人源化的目的，使用Kabat編號(Kabat等，1991)來鑒定CDR殘基。

駱駝V_HH的3D結(jié)構(gòu)建模。使用針對蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(PDB)的BLAST搜索鑒定類似于IGF1R-5 V_HH的模板結(jié)構(gòu)。使用基于4KRP|B(PDB代碼|鏈ID)(作為主模板)的同源性建模，利用來自4FHB|D的附加信息來近似IGF1R-5的3D結(jié)構(gòu)。隨后通過將主模板結(jié)構(gòu)突變?yōu)镮GF1R-5序列來構(gòu)建IGF1R-5 V_HH結(jié)構(gòu)；這包括在各個(gè)位置的35個(gè)突變。隨后通過利用AMBER力場的能量最小化和約束的逐步釋放(范圍從首先被松開的CDR環(huán)至僅在最后階段才被完全松開的框架區(qū)的主鏈重原子)來精制IGF1R-5 V_HH模型。隨后通過蒙特卡羅最小化(MCM)構(gòu)象取樣來精制V_HH模型的CDR-H3環(huán)，其中對CDR-H3區(qū)域中的二面角進(jìn)行取樣，隨后進(jìn)行能量最小化。

用于駱駝CDR的人重鏈框架的選擇。通過針對人種系數(shù)據(jù)庫(VBASE)，針對其它序列數(shù)據(jù)庫(Genbank和SwissProt)和針對人框架共有序列的標(biāo)準(zhǔn)序列同源性比較來選擇人重鏈框架。進(jìn)行BLAST搜索以在匹配CDR的長度的同時(shí)僅檢索框架區(qū)(即，排除CDR)中具有最高同源性的序列匹配。針對對應(yīng)于人VH-3亞組的IGF1R-5 V_HH鑒定最接近的人框架。除了人VH-3共有序列以外，還保留了幾個(gè)與IGF1R-5 V_HH最相似的人種系VH-3框架序列。IGF1R-5 V_HH框架序列需要18個(gè)突變，以達(dá)到用于100％框架人源化的共有人VH-3序列。

用于回復(fù)突變的框架殘基的鑒定。表征IGF1R-5 V_HH模型及其完全人源化的對應(yīng)物以估計(jì)人類性指數(shù)、抗原接觸傾向指數(shù)，以描繪CDR、典型殘基、罕見框架殘基、潛在的糖基化位點(diǎn)、包埋的殘基、Vernier區(qū)殘基和與CDR的接近度。這些數(shù)據(jù)的分析提示了針對抗IGF1R V_HH的幾種人源化變體的設(shè)計(jì)，每個(gè)變體在不同位置上的親代駱駝殘基具有不同數(shù)目的回復(fù)突變。針對IGF1R-5 V_HH(IGF1R-5H1、H2、H3、H5、H6)設(shè)計(jì)了5個(gè)人源化變體，其中變體含有多達(dá)10個(gè)回復(fù)突變。這些駱駝回復(fù)突變殘基中的一些被埋在V_HH結(jié)構(gòu)域核心內(nèi)部，因此預(yù)期不會誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。

實(shí)施例5：選定的V_HH構(gòu)建體的表達(dá)和純化

將實(shí)施例3中鑒定的IGF1R-5和實(shí)施例4中構(gòu)建的人源化形式(在本文中統(tǒng)稱為“V_HH構(gòu)建體”)亞克隆入表達(dá)質(zhì)粒中用于蛋白表達(dá)和純化。

使用MiniPrep試劑盒(Qiagen)純化含有IGF1R-5克隆的DNA的噬菌粒載體。從pMED1噬菌粒載體PCR擴(kuò)增IGF1R結(jié)合性V_HH IGF1R-5，使用以下引物添加N末端BbsI切割位點(diǎn)和C末端BamHI切割位點(diǎn)：

5’-TATGAAGACACCAGGCCCAGGTAAAGCTGGAGGAGTCT-3’(正向；SEQ ID NO：25)

5’-TTGTTCGGATCCTGAGGAGACGGTGACCTG-3’(反向；SEQ ID NO：26)

按照制造商的說明書，用BbsI和BamHI限制性內(nèi)切酶(NEB)消化PCR片段和pSJF2H表達(dá)載體。使用與在Arbabi-Ghahroudi等(2009b)中所述的那些方法相似的方法將消化的IGF1R-5 V_HH片段連接至消化的pSJF2H表達(dá)載體中；隨后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至電感受態(tài)TG1大腸桿菌中。在LB瓊脂板+100μg/ml氨芐青霉素上選擇克隆，并通過DNA測序驗(yàn)證。

使用與上述方法類似的方法合成人源化克隆并將其直接克隆入pSJF2H，隨后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌TG1中；如上所述選擇克隆。

蛋白表達(dá)。將所有IGF1R-5 V_HH構(gòu)建體在TG1大腸桿菌中表達(dá)。將LB/amp/glu培養(yǎng)基(補(bǔ)充有100μg/ml氨芐青霉素和1％葡萄糖的LB培養(yǎng)基)中的過夜培養(yǎng)物在1L LB/amp/glu中以1：100稀釋進(jìn)行傳代培養(yǎng)。通過添加IPTG至終濃度為0.2mM來在0.8-0.9的OD₆₀₀下誘導(dǎo)蛋白表達(dá)。將培養(yǎng)物在37℃以220rpm生長過夜。通過以6000rpm離心12分鐘來使細(xì)菌沉淀；將沉淀重懸于35ml冷TES緩沖液(0.2M Tris-Cl pH8.0，20％蔗糖，0.5mM EDTA)中。將懸浮液在冰上溫育，并每10分鐘渦旋一次，持續(xù)1小時(shí)。隨后添加45ml冷TES(總體積的1/8體積)并立即渦旋1分鐘，此后每10分鐘渦旋15秒，持續(xù)1小時(shí)，以從周質(zhì)提取蛋白質(zhì)。將所得的含有V_HH的上清液通過0.22μm膜過濾，并在固定化金屬親和層析(IMAC)緩沖液A(10mM HEPES pH 7.0，500mM NaCl)中透析過夜。如先前所述(Arbabi-Ghahroudi2009b)使用HiTrap Chelating HP柱(GE Healthcare)純化蛋白質(zhì)。通過SDS-PAGE和免疫印跡分析洗脫的蛋白質(zhì)級分，隨后如先前所述(Arbabi-Ghahroudi 2009b)針對PBS進(jìn)行透析。合并純化的蛋白質(zhì)級分，并針對PBS+3mM EDTA進(jìn)行透析，測定蛋白質(zhì)濃度。

實(shí)施例6：抗IGF1R V_HH IGF1R-5的生物物理學(xué)表征

使用大小排阻層析、表面等離子體共振分析和解鏈溫度分析來表征在實(shí)施例5中表達(dá)和純化的抗IGF1R V_HH IGF1R-5構(gòu)建體。還進(jìn)行了IFG1R-5 V_HH的表位作圖。

大小排阻色譜：將應(yīng)用Superdex^TM 75(GE Healthcare)的大小排阻層析用于消除任何可能的聚集體，隨后進(jìn)行表面等離子體共振(SPR)分析。所用的運(yùn)行緩沖液是含有150mM NaCl、3mM EDTA和0.005％P20的10mM HEPES，pH7.4。通過測量280nm波長處的吸光度來測定用于SPR分析的級分的濃度。SEC分析表明，基于相較于標(biāo)準(zhǔn)品的洗脫體積，抗體是單體的(圖3A)。

解鏈溫度：通過CD光譜法，使用解鏈溫度(T_m)測量來評價(jià)IGF1R-5 V_HH構(gòu)建體的熱穩(wěn)定性。使用配備有Peltier熱電型溫度控制系統(tǒng)的Jasco J-815分光偏振計(jì)(Jasco,Easton,MD,USA)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。使用路徑長度為1mm的CD比色皿。在掃描速度為50nm/分鐘，數(shù)字積分時(shí)間(DIT)為4秒，帶寬為1nm，數(shù)據(jù)間距為1nm以及積分時(shí)間為1秒的條件下，在180-260nm的波長范圍內(nèi)記錄光譜。為了測量解鏈溫度或T_m(Greenfield，2006a；2006b)，在30℃至96℃的溫度范圍內(nèi)記錄CD光譜。從對應(yīng)于緩沖液光譜的空白中減去所有CD光譜。用在100mM磷酸鈉緩沖液，pH 7.4中的50μg/mL V_HH進(jìn)行測量。對于所有變體，在210nm監(jiān)測熱誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)變性。通過所描述的公式(Greenfield,2006a；2006b)獲得折疊分?jǐn)?shù)(ff)：

ff＝([θ]_T–[θ]_U)/([θ]_F–[θ]_U) 公式I

其中[θ]_T是在任何溫度下的摩爾橢圓率，[θ]_F是30℃下完全折疊的蛋白質(zhì)的摩爾橢圓率，[θ]_U是90℃下未折疊蛋白質(zhì)的摩爾橢圓率。使用繪圖軟件GraphPad Prism(4.02版，Windows版)，通過非線性回歸曲線擬合(Boltzman S形方程)獲得為解折疊曲線(折疊分?jǐn)?shù)(ff)相對于溫度)的中點(diǎn)的解鏈溫度(T_m)。V_HH的解鏈溫度(T_m)是基于橢圓率數(shù)據(jù)假設(shè)兩態(tài)系統(tǒng)來測定的，其與對應(yīng)于急劇轉(zhuǎn)變至變性的所觀察到的變性曲線一致(圖2D)。T_m值取自折疊分?jǐn)?shù)(ff)相對溫度的S形變性曲線的中點(diǎn)。結(jié)果示于圖3B中。相較于IGF1R-5 V_HH，所有人源化V_HH的解鏈溫度得到改善(更高)，表明改善的生物物理性質(zhì)。

表面等離子體共振(SPR)：使用BIACORE 3000(GE Healthcare)通過SPR測定單體IGF1R-5 V_HH構(gòu)建體與固定化重組人IGF1R(實(shí)施例1)的結(jié)合。將約3000個(gè)共振單位(RU)的重組人IGF1R(R&D Systems)固定在傳感器芯片CM5上。使用由制造商提供的胺偶聯(lián)試劑盒，在pH4.0的10mM乙酸鹽中以10μg/ml的濃度進(jìn)行固定化。用pH 8.5的1M乙醇胺封閉剩余的結(jié)合位點(diǎn)。將乙醇胺封閉的表面用作參照表面。對于結(jié)合研究，在25℃于含有150mM NaCl、3mM EDTA和0.005％表面活性劑P20的10mM HEPES，pH7.4(聚氧乙烯脫水山梨醇；GEHealthcare)中進(jìn)行分析。以20μl/分鐘的流速將各種濃度的IGF1R-5 V_HH注射至固定化人IGF1R和參照表面上方。利用pH 2.0的10mM甘氨酸和24秒的接觸時(shí)間再生表面。用BIAevaluation 4.1軟件(GE Healthcare)分析數(shù)據(jù)。結(jié)果(見圖3C)顯示數(shù)據(jù)良好擬合至1：1模型，得到表1中所示的K_D。這表明IGF1R-5和人源化變體是針對人IGF1R的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的高親和性單結(jié)構(gòu)域抗體結(jié)合劑。

表1.如通過表面等離子體共振測定的IGF1R-5 V_HH構(gòu)建體對于人(h)IGF1R的親和力

進(jìn)一步使用SPR分析來證明IGF1R-5 V_HH不與受體上與天然配體IGF-1的表位相同的表位結(jié)合(圖3D)。如上所述設(shè)置、進(jìn)行和分析實(shí)驗(yàn)。通過以20μl/分鐘的流速，5分鐘的注射時(shí)間，注射濃度為25xK_D的IGF1R-5 V_HH，隨后共注射濃度均為25xK_D的IGF1R-5和人IGF-1配體來研究對新鮮固定的人IGF1R表面的結(jié)合。通過用運(yùn)行緩沖液洗滌來再生表面。IGF1R-5 V_HH結(jié)合受體，在非再生表面上達(dá)到約38RU的飽和度。在IGF1R-5 V_HH的存在下，IGF-1配體能夠以預(yù)期～70RU(相對單位)結(jié)合IGF1R受體。IGF1R-5 V_HH和IGF-1兩者同時(shí)結(jié)合受體表明兩者結(jié)合不同的表位。IGF1R-5 V_HH和胰島素受體的SPR分析表明IGF1R-5 V_HH不能結(jié)合胰島素受體(數(shù)據(jù)未顯示)。盡管IGF1R-5結(jié)合再生表面相對新鮮的非再生表面的相對單位(RU)不同，但在兩個(gè)表面上測定的結(jié)合親和力是高度相似的，并且可在不同的實(shí)驗(yàn)中再現(xiàn)(數(shù)據(jù)未顯示)。

表位作圖：表位作圖服務(wù)由Pepscan(Lelystad,The Netherlands；pepscan.com)提供。IGF1R的全長序列如圖2所示。基于表位作圖結(jié)果和相關(guān)胰島素受體結(jié)構(gòu)的三維呈現(xiàn)(如在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫登錄號2DTG中公開的，未顯示)，IGF1R-5 V_HH所結(jié)合的表位被建議為FENFLHNSIFVPR(SEQ ID NO：11)。

實(shí)施例7：IGF1R-5被腦內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)化

為了確定IGF1R-5是否被內(nèi)化至細(xì)胞中，將svARBEC細(xì)胞與Cy5-5標(biāo)記的IGF1R-5一起溫育。

用NHS-Cy5.5標(biāo)記IGF1R-5 V_HH。標(biāo)記通過伯胺(在蛋白質(zhì)的N-末端和/或賴氨酸側(cè)鏈上)與NHS酯之間的穩(wěn)定的胺鍵進(jìn)行。通常，將pH9.3的10％v/v的1M碳酸鹽/碳酸氫鹽緩沖液(759mM碳酸氫鹽，258mM碳酸鹽)添加至在PBS(1.06mM KH₂PO₄，154mM NaCl，5.6mM Na₂HPO₄)pH7.4中制備的4mg V_HH，調(diào)節(jié)終濃度為4mg/mL。以2X摩爾比的染料對蛋白質(zhì)添加以10mg/mL溶解于DMSO中的NHS-Cy5.5。將混合物在室溫下于1.5mL微量離心管中倒置數(shù)次，溫育2小時(shí)。溫育后，使用Zeba Spin脫鹽柱，7K MWCO(Pierce)過濾未結(jié)合的染料和反應(yīng)雙產(chǎn)物，并使用Beckman DU530分光光度計(jì)(Beckman Coulter)測量。將Cy5.5-標(biāo)記的IGF1R-5或FC5作為陽性對照(1mg/ml)與SV40永生化大鼠腦內(nèi)皮細(xì)胞(svARBEC)在4℃溫育(圖4，頂圖)，從而只允許被動的非特異性轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制發(fā)生，或在37℃溫育(圖4，底圖)，以允許主動轉(zhuǎn)運(yùn)諸如受體介導(dǎo)的胞吞發(fā)生。用小麥胚凝集素和DAPI進(jìn)行共染色以分別顯現(xiàn)細(xì)胞表面和細(xì)胞核。在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞并捕獲圖像。

如果4℃下溫育，發(fā)現(xiàn)IGF1R-5在細(xì)胞外與小麥胚凝集素染色的細(xì)胞膜共定位。相反地，當(dāng)在37℃溫育時(shí)，IGF1R-5累積在細(xì)胞內(nèi)的囊泡(可能是核內(nèi)體)中，這表明抗體通過主動轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制內(nèi)化至細(xì)胞中。對于FC5觀察到類似的行為，其先前被顯示經(jīng)由籠形蛋白包被的小泡通過能量依賴的胞吞作用進(jìn)入細(xì)胞(Abulrob等2005)。

實(shí)施例8：IGF1R-5-Fc構(gòu)建體的產(chǎn)生

制備包含與可結(jié)晶的鼠抗體片段(Fc；mFc2b)融合的IGF1R-5V_HH的構(gòu)建體，表達(dá)并分離所述構(gòu)建體。制備C末端構(gòu)建體(IGF1R-5-mFc)和N末端IGF1R-5小鼠Fc融合構(gòu)建體(mFc-IGF1R-5)，其序列示于圖5A-B中，分子的示意圖示于圖5C中。融合蛋白(～80kDa)還包含在圖5A-B的序列中未顯示的N-末端信號肽(MEFGLSWVFLVAILKGVQC；SEQ ID NO：40)，因?yàn)槠湓诜置诤蟊磺懈睢?/p>

將IGF1R-5 cDNA克隆入含有小鼠Fc2b片段的哺乳動物表達(dá)載體pTT5(Durocher 2002)。通過混合25ml質(zhì)粒DNA溶液與25ml含有1.125mg的PEIproTM(PolyPlus Transfection)的PEI溶液(兩者均在F17培養(yǎng)基中制備)，預(yù)形成所得載體的多聚復(fù)合物(polyplex)，所述質(zhì)粒DNA溶液含有187.5μg pTT5-IR5mFc2b，56.25μg pTT-AKTdd(蛋白激酶B的活化突變體)，18.75μg pTTo-GFP(以監(jiān)測轉(zhuǎn)染效率)和112.5μg鮭魚睪丸DNA(Sigma-Aldrich)。將混合物溫育10分鐘，隨后添加至細(xì)胞培養(yǎng)物中。用50ml多聚復(fù)合物轉(zhuǎn)染穩(wěn)定表達(dá)截短的EBNA1蛋白(CHO-3E7)并在F17培養(yǎng)基(Invitrogen)中生長的CHO細(xì)胞的450ml培養(yǎng)物。轉(zhuǎn)染后24小時(shí)，向培養(yǎng)物中加入12.5ml 40％(w/v)胰蛋白胨N1(Organotechnie)溶液和1.25ml 200mM丙戊酸溶液。轉(zhuǎn)染后8天收獲培養(yǎng)物并通過離心澄清。將澄清的培養(yǎng)基通過0.22μm膜過濾，隨后施加至填充有5ml蛋白質(zhì)-A MabSelect SuRe樹脂(GE Healthcare)的柱上。上樣后，將柱子用5倍體積的磷酸緩沖鹽水pH 7.1(PBS)洗滌，用100mM檸檬酸鈉緩沖液pH 3.0洗脫抗體。合并含有洗脫的抗體的級分，并通過加載至在PBS中平衡的脫鹽Econo-Pac柱(BioRad)上進(jìn)行緩沖液交換。隨后通過Millex GP(Millipore)過濾器單元(0.22μm)將脫鹽抗體無菌過濾并進(jìn)行等分。

實(shí)施例9：IGF1R-5-mFc在CSF和血漿中的藥代動力學(xué)

進(jìn)行體內(nèi)測定以確定IGF1R-5-mFc(實(shí)施例8)是否能夠進(jìn)入腦，特別是進(jìn)入腦脊髓液(CSF)，以及定量其在CSF和血清中的存在。

通過改進(jìn)先前描述的方法(Huang等,1995；Kornhuber等，1986；Yaksh和Rudy,1976)，在NRC開發(fā)了用于小腦延髓池CSF的多重取樣的技術(shù)。動物被單獨(dú)飼養(yǎng)在聚丙烯籠中，并允許自由獲取食物和水。在24℃的溫度和50±5％的相對濕度下在12小時(shí)光/暗周期中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。所有動物方法由NRC的動物護(hù)理委員會批準(zhǔn)并符合加拿大動物保護(hù)委員會指導(dǎo)原則。

用氯胺酮/甲苯噻嗪混合物(45/12mg/kg,i.p.)麻醉8-10周齡的雄性Wistar大鼠(體重范圍，230-250g)，并將其安置在立體定位儀(可使用牢固地保持動物的頭部的任何其它裝置)中。在中線處進(jìn)行從連接耳朵的線開始并在尾部方向上延伸約3cm的切割：將筋膜從顱骨縮回，暴露頸部肌肉的表層，隨后通過在枕骨嵴開始并向尾部延伸約2cm的中線切口分離其。表面肌肉組織的分離暴露了下面的肌肉層，其通過鈍器解剖被容易地沿中線分開。使用刮擦工具從它們在枕骨上的原點(diǎn)將肌肉從中線兩側(cè)釋放約0.5cm；頸部肌肉組織的輕微收縮暴露寰枕膜；隨后將大鼠的頭向下旋轉(zhuǎn)至約45°角。使用27G一次性針頭的尖端制造小孔；當(dāng)切口正確地進(jìn)行時(shí)，澄清的CSF應(yīng)立即通過狹縫涌出；隨后將聚乙烯管(PE-20)插入狹縫0.5cm。隨后借助于氰丙烯酸丁酯膠或Vetbond膠將套管固定至寰枕膜上，從而允許樣品長時(shí)間(超過1周)收集并且還防止感染或其它污染物進(jìn)入CSF；隨后套管用人工CSF徹底沖洗。使用牙科用水泥將套管的收集部分牢固地附接至枕骨。套管被固定后，自由部分(4-5cm)用20G針穿過皮膚，隨后關(guān)閉肌肉和皮膚，將暴露部分切成所需的長度，并將尖端輕微加熱以防止CSF的回流。最后，將動物放置在恢復(fù)室中至少一周，以允許關(guān)閉小腦延髓池。該技術(shù)不涉及通過顱骨的鉆孔(如其它方法所描述的)，避免損傷腦膜和相鄰的神經(jīng)組織。

在腦池套管插入術(shù)后1周，將5mg/kg的IGF1R-5mFc或?qū)φ誂20.1mFc融合物注射至尾靜脈中。用3％異氟烷麻醉大鼠；丟棄在套管中累積的前10μl CSF。在注射后0.5小時(shí)、1小時(shí)、2小時(shí)、24小時(shí)和48小時(shí)收集10μl CSF。在相同的時(shí)間點(diǎn)使用聚合物凝膠管(Becton,Dickinson and Company Franklin Lakes,NJ USA)從尾靜脈(Fluttert等，2000)中取血樣(50μl)；將樣品離心(以1600rcf進(jìn)行15分鐘；室溫)。將樣品于-80℃貯存直至分析。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，在麻醉下通過斷頭處死大鼠。

通過質(zhì)譜和基于nanoLC-SRM的定量分析血清和CSF樣品，如實(shí)施例7中所述。

CSF收集是一種精細(xì)的過程，在此期間CSF可容易被血液污染。由于預(yù)期V_HH的量在CSF中比在血液中少得多(<0.1％)，即使輕微的血液污染也會嚴(yán)重?fù)p害個(gè)體CSF樣品的值。因此有必要為血液污染的CSF樣品開發(fā)嚴(yán)格的排除標(biāo)準(zhǔn)。為了評估血液-CSF白蛋白比率，開發(fā)了用于定量血漿和CSF中的白蛋白水平的nanoLC-SRM方法?；谄洫?dú)特的保留時(shí)間和m/z值(Mol Pharm)選擇白蛋白肽APQVSTPTLVEAAR(SEQ ID NO：38)，以在多重測定中具有對其它肽峰的最小干擾。使用如上所述的SRM定量CSF和血漿樣品中的肽的強(qiáng)度。對于每只大鼠，如下計(jì)算白蛋白比率：

白蛋白比率＝每nL的分析的血漿的強(qiáng)度/每nL的分析的CSF的強(qiáng)度

1500及以下的比率被認(rèn)為是污染的血液。

結(jié)果示于圖9和表2中。該圖顯示了含F(xiàn)c分子的“典型”血清藥代動力學(xué)特征。IGF1R-5Fc的CSF水平隨時(shí)間增加，在注射后24小時(shí)達(dá)到峰值，此時(shí)它們達(dá)到血清水平的2％。雖然對照A20.1Fc融合分子的血清水平/衰退是相似的，但其CSF水平是最低的，在24小時(shí)達(dá)到血清水平的0.04％。表2顯示了在全身性靜脈內(nèi)施用等摩爾劑量(5mg/kg V_HH—Fc融合物)后，CSF和血清中IGF1R5-Fc和對照A20.1-Fc的藥代動力學(xué)參數(shù)。IGF1R5-Fc和對照A20.1-Fc的血清半衰期分別為23小時(shí)和25小時(shí)。

陰性對照A20.1Fc(75kD)顯示與文獻(xiàn)中針對具有相似大小的分子所描述的相似的24小時(shí)時(shí)的血清/CSF比率。穩(wěn)定狀態(tài)下的白蛋白(60kD)的典型血清/CSF(腰部)比率為0.1％，而IgG的血清/CSF比率為0.07(Shen等，2004；Lin,2008)。24小時(shí)時(shí)的IGF1R5-Fc血清/CSF比率為A20.1mFc的50倍。

每個(gè)分子的CSF/血清AUC比率指示在48小時(shí)期間構(gòu)建體的CNS“暴露”。與A20.1Fc相比，IGF1R-5-Fc顯示33倍更高的CNS暴露。結(jié)果表明，與對照V_HH-Fc融合分子相比，IGF1R-5Fc獲得增加的至CSF的進(jìn)入；這可通過脈絡(luò)叢的特異性“分泌”或通過在穿過BBB后從腦實(shí)質(zhì)的“洗出”(通過內(nèi)襯腦室系統(tǒng)的室管膜層的擴(kuò)散或經(jīng)由間質(zhì)液的大量流動)或通過這兩者發(fā)生(Abbott 2004；DeLange，2002；Groothius，2007)。

還已顯示～110kDa和180kDa的另外的構(gòu)建體通過IGF1R-5和人源化形式被擺渡穿過BBB(數(shù)據(jù)未顯示)。

表2.全身注射的IGF1R-5Fc和A20.1Fc在大鼠血清和小腦延髓池CSF中的藥代動力學(xué)參數(shù)

實(shí)施例10：穿過體外血腦屏障模型的IGF1R-5的轉(zhuǎn)運(yùn)

為了評估IGF1R-5 V_HH和實(shí)施例8的構(gòu)建體是否遷移穿過血腦屏障，如下所述使用體外測定法。概括實(shí)驗(yàn)的流程圖示于圖6A。

如所述的(Garberg等，2005；Haqqani等，2012)使用SV40永生化成年大鼠腦內(nèi)皮細(xì)胞(Sv-ARBEC)產(chǎn)生體外血腦屏障(BBB)模型。將Sv-ARBEC(80,000個(gè)細(xì)胞/膜)于1ml生長培養(yǎng)基中接種在0.1mg/mL大鼠尾膠原蛋白I型包被的組織培養(yǎng)插入物(孔徑-1μm；表面積0.9cm²，F(xiàn)alcon)上。插入組件的底室含有以1：1(v/v)比率補(bǔ)充有永生化新生大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞條件培養(yǎng)基的2ml生長培養(yǎng)基。

測試等摩爾量(5.6μM)的陽性(FC5)或陰性對照(A20.1，艱難梭菌毒素A結(jié)合性V_HH；和EG2，EGFR結(jié)合性V_HH)、IGF1R-5 V_HH以及實(shí)施例8的C-和N-末端mFc-IFG1R-5構(gòu)建體的穿過該大鼠體外BBB模型的能力。

在等摩爾量的sdAb暴露于BBB的腔內(nèi)側(cè)后，在15、30和60分鐘后從近腔側(cè)采集樣品。隨后通過如由Haqqani等(2012)所述的質(zhì)譜法(多重反應(yīng)監(jiān)測–同種型標(biāo)記的內(nèi)標(biāo)；MRM–ILIS)(見下文中的方法描述)定量每一個(gè)樣品的sdAb含量。

表觀滲透系數(shù)的測定：可以直接繪出定量的值，或者可用給定的公式(圖5A)測定P_app(表觀滲透系數(shù))值并繪圖。P_app值通常用于測定分子穿過BBB的能力。[Qr/dt＝接受器區(qū)室中的累積量相對于時(shí)間；A＝細(xì)胞單層的面積；C0＝給藥溶液的初始濃度]。P_app值是化合物穿過腦內(nèi)皮單層的比滲透性的量度。

結(jié)果示于圖6B-D中。給出的結(jié)果是從多個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)獲得的平均P_app值。兩個(gè)陰性對照均具有非常低的P_app值，表明這些V_HH穿過BBB模型的非特異性轉(zhuǎn)運(yùn)或細(xì)胞旁轉(zhuǎn)運(yùn)是最少的。IGF1R-5具有高P_app值，表明穿過體外BBB模型的高轉(zhuǎn)運(yùn)速率。IGF1R-5 V_HH的P_app(圖6B)與陽性對照BBB可滲透的V_HH FC5(WO 02/057445)的P_app相似。人源化IGF1R-5變體顯示出與野生型IGF1R-5相似或更高的P_app值(圖6C)。值得注意的是，相較于野生型IGF1R5，IGF1R-5 H2顯示P_app值顯著增加35％(圖6C)。顯示改善的體外BBB穿過(P_app值)的兩種人源化變體IGF1R-5 H1和IGF1R H2還在此處進(jìn)行的利用SPR的受體結(jié)合研究中顯示更快的“解離速率”(圖3C)，表明更快的“解離速率”是改善結(jié)合BBB受體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)胞吞受體IGF1R的抗體的轉(zhuǎn)胞吞所期望的。融合于鼠Fc(80kD)的N或C末端的IGF1R-5具有與單結(jié)構(gòu)域抗體IGF1R-5(15kD)相似的P_app值，表明當(dāng)與IGF1R融合時(shí)，80kD的分子可在體外有效地穿過BBB。值得注意的是，與Fc的N-末端融合提供了一些優(yōu)勢(15％的P_app的提高)。這些數(shù)據(jù)顯示IGF1R-5可用作平臺來工程化雙特異性抗體，特別地以融合于需要被轉(zhuǎn)運(yùn)至腦中的具有治療功能的完整IgG的C-末端。這些結(jié)果提供了強(qiáng)烈的指示：IGF1R-5在體外經(jīng)歷促進(jìn)的穿過腦內(nèi)皮細(xì)胞的跨細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)，并且可在體內(nèi)具有相似的性質(zhì)。值得注意的是，還已顯示包含連接于貨物分子(MW～110kDa或180kDa)的IGF1R-5或人源化形式的構(gòu)建體也被擺渡穿過BBB(數(shù)據(jù)未顯示)。

使用MRM-ILIS方法對V_HH的絕對定量。方法全部如Haqqani等(2012)所述。簡言之，為了開發(fā)用于V_HH的SRM(選擇的反應(yīng)監(jiān)測，也稱為多反應(yīng)監(jiān)測(MRM))測定，首先通過nanoLC-MS/MS，使用數(shù)據(jù)依賴性采集分析每一V_HH，以鑒定所有可離子化的肽。對于每一個(gè)肽，選擇3至5個(gè)最強(qiáng)的碎片離子。初始SRM測定被開發(fā)來監(jiān)測attomole量(約100-300amol)的消化物的這些片段。在低量下顯示可重現(xiàn)的強(qiáng)度比率(即，相較于較高的量具有Pearson r2≥0.95)的片段被認(rèn)為是穩(wěn)定的，并且被選擇用于最終的SRM測定。為了進(jìn)一步優(yōu)化測定，還包括每個(gè)肽的洗脫時(shí)間，小心不要選擇具有接近的m/z(質(zhì)荷比)和洗脫時(shí)間的肽。

細(xì)胞培養(yǎng)基或體液(血清或腦脊液(CSF))中的V_HH的典型多重SRM分析包括加標(biāo)已知量的ILIS(0.1-10nM)，隨后將100-400ng CSF或培養(yǎng)的培養(yǎng)基蛋白(0.3-1μL)或約50-100ng血清蛋白(1-3納升)注射入nanoLC-MS系統(tǒng)。在靶的指定洗脫時(shí)間，在離子陷阱中選擇前體m/z的每種靶肽離子(和丟棄剩余的不相關(guān)離子)，隨后進(jìn)行碰撞誘導(dǎo)解離(CID)斷裂，并在離子陷阱中僅選擇所需的碎片離子，以用于通過檢測器監(jiān)測。對于定量分析，將由LTQ(ThermoFisher)產(chǎn)生的原始文件轉(zhuǎn)換為標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜數(shù)據(jù)格式mzXML，并且使用稱為Q-MRM(Quantitative-MRM；見Haqqani等2012)的內(nèi)部軟件提取強(qiáng)度，所述軟件為MatchRx軟件的改進(jìn)版本。對于每一個(gè)V_HH，對于其片段離子中的每一個(gè)產(chǎn)生提取離子色譜圖，其由在整個(gè)洗脫時(shí)間內(nèi)在0.25Da的片段m/z內(nèi)的組合強(qiáng)度組成。為了獲得每個(gè)片段的最終強(qiáng)度值，將在0.5分鐘的預(yù)期保留時(shí)間內(nèi)的所有強(qiáng)度相加。如果其肽的至少一種的片段顯示預(yù)期的強(qiáng)度比率，即最終強(qiáng)度值顯示出與其對應(yīng)的純V_HH的最終強(qiáng)度值相比較強(qiáng)的Pearson相關(guān)性r≥0.95和p<0.05，則V_HH被定義為在樣品中是可檢測的。

將含有V_HH的混合物(培養(yǎng)基、血清、CSF)的樣品如前所述進(jìn)行還原、烷基化和胰蛋白酶消化(Haqqani等，2012；Gergov等，2003)。利用乙酸(5％的終濃度)酸化消化物(胰蛋白酶肽)并在與LTQ XL ETD或LTQ Orbitrap ETD質(zhì)譜儀(ThermoFisher,Waltham,MA)偶聯(lián)的反相nanoAcquity UPLC(Waters,Milford,MA)上進(jìn)行分析。將樣品的所需等分試樣注射并裝載至300μm I.D.×0.5mm 3μm PepMaps C18捕集器(ThermoFisher)，隨后使用在1分鐘內(nèi)0％至20％的乙腈(在0.1％甲酸中)，16分鐘內(nèi)20％-46％和1分鐘內(nèi)46％-95％的梯度，400nL/min的流速將其洗脫至100μm的I.D.×10cm 1.7μm BEH130C18nanoLC柱(Waters)。使用用于片段化肽離子的CID通過電噴霧電離(ESI)將洗脫的肽電離至質(zhì)譜儀中用于MS/MS和SRM分析。使用氦作為碰撞氣體，以35％的標(biāo)準(zhǔn)化碰撞能量和30ms的活化時(shí)間進(jìn)行CID。使用6x 10³的自動增益控制(AGC)目標(biāo)值和200ms的最大累積時(shí)間，通過儀器來調(diào)整進(jìn)入線性離子陷阱的離子注入時(shí)間。

在多重測定中用于檢測和定量每種V_HH的V_HH特異性肽示于表3中。

表3.FC5、FC5-ILIS、EG2、A20.1、IGF-1R-5和白蛋白的nanoLC-SRM檢測中使用的肽。(a)在所述的各種研究中，以不同組合多重化測定以用于同一樣品中的同時(shí)監(jiān)測；(b)重標(biāo)記的肽；(c)每種肽的SRM測定的檢測和定量的限度范圍為1.5-2.5ng/ml。1ng/mL對應(yīng)于約60-70pM的V_HH。A20-1如Hussack等人，2011b中所述；EG2如Iqbal等人，2010中所述。

實(shí)施例11：IGF1R-5至甘丙肽的綴合

為了確定IGF1R-5是否可以在體內(nèi)穿過血腦屏障(BBB)并且將不能自身穿過BBB的分子“擺渡”穿過BBB，將神經(jīng)肽甘丙肽化學(xué)綴合于與鼠Fc的C-或N-末端融合的IGF1R-5 V_HH或IGF1R-5，并全身性施用。甘丙肽是通過結(jié)合腦組織中表達(dá)的GalR1和GalR2來產(chǎn)生鎮(zhèn)痛作用的神經(jīng)活性肽。當(dāng)在外周給予時(shí)，甘丙肽沒有鎮(zhèn)痛作用，因?yàn)槠洳荒茏约捍┻^BBB(Robertson等，2011)。

將IGF1R-5 V_HH和Fc-融合構(gòu)建體綴合于具有半胱氨酰胺(cysteamide)修飾的C末端(Biomatic)(GWTLNSAGYLLGPHAIDNHRSFSDKHGLT-半胱氨酰胺，SEQ ID NO：39)的大鼠甘丙肽(Gal)片段。綴合方案示于圖7中。

簡言之，將5mg在0.5X PBS、2.5mM EDTA中的[2mg/ml]的IGF1R-5 V_HH(實(shí)施例5)與436.4μl的2.5mg/ml磺基琥珀酰亞胺基-4-(N-馬來酰亞胺基甲基)環(huán)己烷-1-羧酸酯(磺基-SMCC)(7.5x過量摩爾比)混合。隨后用氮?dú)鉀_洗混合物，并在室溫(RT)下溫育30分鐘，以使得磺基-SMCC的NHS酯臂與V_HH上的胺反應(yīng)。隨后，使用10ml7K Zeba柱(Pierce)從馬來酰亞胺活化的IGF1R-5 V_HH中除去未反應(yīng)的磺基-SMCC。在樣品上樣之前，將柱用5ml PBS洗滌3次，并以1000xg離心2分鐘。在樣品上樣后，用200μl PBS加滿柱子，并以1000×g離心2分鐘。對于IGF1R-Fc構(gòu)建體，如上所述，將5mg與～68μl磺基-SMCC(6.5x過量摩爾比)反應(yīng)。

單獨(dú)地和同時(shí)地，通過將10mg凍干粉末溶解在10ml無內(nèi)毒素的水中以制備1mg/ml原液來制備半胱氨酰胺修飾的C-TERM甘丙肽(Gal-cya)(甘丙肽-cya粉末具有少量DTT以防止在純化期間形成二硫鍵)。最后，加入100μl的0.5M EDTA(5mM終濃度)。

將純化的馬來酰亞胺活化的IGF1R-5 V_HH和IGF1R-Fc構(gòu)建體(2.6ml)用0.5X PBS，2.5mM EDTA稀釋至5ml，隨后在渦旋下分別加入5ml或1ml Gal-cya。將樣品用氮?dú)鉀_洗，密封并在4℃溫育過夜。第二天，分別使用Amicon-15 10K和30K柱(Millipore)除去未反應(yīng)的Gal-cya。將樣品加入柱中并以4000×g離心7分鐘，直到體積減少至5ml。將5ml 0.5X PBS，2.5mM EDTA添加至柱的插入物中剩余的5ml樣品中，并再次旋轉(zhuǎn)，直至樣品減少至4ml。隨后將綴合的樣品添加至如上所述制備的10ml 7K Zeba柱(Pierce)中，隨后以1000×g離心2分鐘。

隨后將綴合的IGF1R-5-Gal和IGF1R-Fc-Gal樣品在16％或10％SDS-PAGE非還原凝膠上電泳并銀染，以確認(rèn)綴合后分子量大小的偏移。滴定反應(yīng)物以獲得每個(gè)V_HH或IGF1R-Fc構(gòu)建體約1至2個(gè)甘丙肽分子。

內(nèi)毒素去除和內(nèi)毒素水平的測定：使用Amicon Ultra分子量截留(MWCO)纖維素膜旋轉(zhuǎn)柱(Millipore)除去內(nèi)毒素。首先，通過以4000xg離心10分鐘使15ml V_HH制備物通過Amicon-15-50K MWCO柱；收集洗脫液。隨后將該洗脫液添加至Amicon-15-10K MWCO柱中，并以4000×g離心7-10分鐘，導(dǎo)致上清液體積從15ml減少至7.5ml。通過添加PBS將柱中的上清液體積調(diào)節(jié)回15ml。如上所述再次旋轉(zhuǎn)柱。收集上清液并使用EndoSafe-PTS系統(tǒng)，使用靈敏度范圍為10-0.1EU/ml的套筒(Charles River Laboratories International)測量內(nèi)毒素水平。將25μl的樣品加載至套筒上的4個(gè)孔中的每一個(gè)中，必要時(shí)進(jìn)行稀釋。只有EU<1/1mg的樣品才用于動物研究。

在無菌條件下在哺乳動物細(xì)胞中產(chǎn)生Fc-融合構(gòu)建體。如上所述在從細(xì)胞純化的樣品中測量內(nèi)毒素水平，并且只將<0.5EU/1mg的樣品用于動物研究。

實(shí)施例12：使用Hargreaves模型的IGF1R-5-Gal的轉(zhuǎn)運(yùn)

為了評價(jià)IGF1R-5-Gal、mFc-IGF1R-5-Gal和IGF1R-5-mFc-Gal(實(shí)施例11)是否遷移穿過血腦屏障，使用先前在國際專利公開No.WO2011/127580中描述的體內(nèi)測定。

使用與由Hargreaves等(1988)所描述的類似的炎性痛覺過敏的大鼠模型。將動物以每個(gè)聚丙烯籠子三只的組(Hargreaves模型)進(jìn)行飼養(yǎng)，并允許自由獲得食物和水。在24℃的溫度和50±5％的相對濕度下在12小時(shí)光/暗周期中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。所有動物程序由NRC的動物護(hù)理委員會批準(zhǔn)并符合加拿大動物保護(hù)委員會指導(dǎo)原則。

在該模型中，在短暫異氟烷麻醉(3％)下，用低體積(100μl，用30號針頭)的完全弗氏佐劑(CFA；熱滅活的結(jié)核分枝桿菌(M.tuberculosis)(Sigma)懸浮在油:生理鹽水1:1的乳劑中)注入至6-8周齡(體重范圍230-250g)的雄性Wistar大鼠的右后爪中。CFA誘導(dǎo)促炎物質(zhì)的釋放，其激活傷害感受器并產(chǎn)生慢性疼痛狀態(tài)和痛覺過敏(增強(qiáng)的對有害的熱的敏感性)。使用用于爪刺激的足底測痛計(jì)設(shè)備(IITC Model#336TG Life Science，Inc.)通過在兩個(gè)后爪(發(fā)炎的和非發(fā)炎對照爪)的足底表面中施加輻射刺激來測量縮爪潛伏期。動物通過舔或輕彈其爪來響應(yīng)所用的時(shí)間被解釋為陽性反應(yīng)(縮爪潛伏期)。調(diào)節(jié)光強(qiáng)燈以在兩個(gè)后爪中引發(fā)在17秒至20秒之間的基線縮爪潛伏期，然后施用CFA。如果在20秒內(nèi)沒有發(fā)生縮回反應(yīng)，則光束被自動關(guān)閉以避免組織損傷，并且該爪被賦予最大得分。

CFA注射后2天并且在施用化合物之前2天，操作動物并在測痛儀設(shè)備中適應(yīng)至少60分鐘，目的是減輕壓力并防止假陽性反應(yīng)。在兩只爪中測量基線以驗(yàn)證發(fā)展的疼痛(熱痛覺過敏)；非發(fā)炎的爪用作針對注射的爪的對照。從實(shí)驗(yàn)中排除對于“發(fā)炎的爪”具有超過6秒的縮爪潛伏期和對于“正常的爪”短于17秒的動物。

為了確定IGF1R-5-Gal、mFc-IGF1R-5-Gal和IGF1R-5-mFc-Gal是否被遞送穿過血腦屏障，并且可接合腦實(shí)質(zhì)中的靶受體(GalR1和2)，大鼠在CFA注射后3天接受IGF1R-5-甘丙肽(2.93mg/kg或5.85mg/kg；內(nèi)毒素EU＝<1/mg)，或mFc-IGF1R-5-Gal Gal(1.98mg/kg或4.96mg/kg；<0.5EU/mg)，或IGF1R-5-mFc-Gal(2.0mg/kg或5.0mg/kg；<0.5EU/mg)或?qū)φ栈衔锏囊淮挝察o脈注射。對每個(gè)后爪(發(fā)炎的和未發(fā)炎的)每15分鐘測試縮爪潛伏期(PWL)，持續(xù)3小時(shí)。增加的縮爪潛伏期指示成功的鎮(zhèn)痛誘導(dǎo)，其僅可通過IGF1R-5將甘丙肽成功遞送至腦實(shí)質(zhì)中而獲得。甘丙肽只有當(dāng)存在于腦實(shí)質(zhì)中時(shí)才能引起鎮(zhèn)痛，并且其自身不能穿過完整的BBB(Robertson等，2011)。

結(jié)果被分析為縮爪潛伏期(PWL，秒)相對于時(shí)間(分鐘或小時(shí))的時(shí)間進(jìn)程(圖8A-D)。

結(jié)果顯示，與PBS相比，靜脈內(nèi)施用的甘丙肽不減輕疼痛。相反地，F(xiàn)C5-Gal、IGF1R5-Gal、mFc-IGF1R-5-Gal或IGF1R-5-mFc-Gal的單次注射均產(chǎn)生熱痛覺過敏的劑量依賴性抑制，表明IGF1R-5 V_HH是負(fù)責(zé)“擺渡”甘丙肽穿過BBB以通過結(jié)合腦實(shí)質(zhì)中的GalR1和/或2產(chǎn)生藥理作用的實(shí)體。IGF1R-5-Gal效應(yīng)是劑量依賴性的并且比由FC5-Gal誘導(dǎo)的效應(yīng)明顯更加顯著，這表明IGF1R受體具有比假定的FC5受體更高的BBB轉(zhuǎn)運(yùn)速率。這些結(jié)果表明，IGF1R-5 V_HH可以使用受體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)胞吞途徑將大分子(3kDa-80kDa)“擺渡”穿過BBB。主動的受體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)運(yùn)是需要的，因?yàn)橐阎狟BB阻止大于0.5kDa的所有親水分子通過。

實(shí)施例13：IGF1R-5-mFc的免疫檢測

為了確定在外周施用后在CSF中檢測到的高水平的IGF1R-5mFc至少部分源自實(shí)質(zhì)細(xì)胞外空間，換句話說，完整構(gòu)建體已經(jīng)穿過BBB，在大鼠腦中進(jìn)行IGF1R-5-mFc的免疫檢測。

簡言之，在用PBS進(jìn)行動物灌注后立即(即在5mg/kg尾靜脈注射IGF1R-5-mFc之后48小時(shí))收獲來自實(shí)施例11的實(shí)驗(yàn)的動物的腦；冷凍腦并在冷凍切片機(jī)上切成12μm切片。將切片在RT下于100％甲醇中固定10分鐘，在PBS中洗滌3次，并在含有0.3％的TritonX-100的1X PBS中的10％正常山羊血清(NGS)中溫育1小時(shí)。在4℃下施加在1X PBS中的含有0.3％TritonX-100的5％NGS中的1：200的山羊抗-m-IgG Fcγ-cy3(Cat#115-165-071,Jackson Immuno Reasearch,lot#106360)，進(jìn)行過夜。將切片在1x PBS中洗滌3次，隨后在室溫下在5％NGS/1XPBS中的1：500的兔抗GFAP(Cat#Z0334，Dako)中溫育1小時(shí)。將切片在1xPBS中再洗滌三次，隨后在1xPBS中的1：300的山羊抗小鼠Alexa 647(A21235，Invitrogen)或1：500的山羊抗兔Alexa 647(A21244，Invitrogen)中溫育。隨后加入1×PBS中的1：500的脈管系統(tǒng)染色凝集素RCAI(Cat#FL-1081,Vector)，進(jìn)行10分鐘。在用1xPBS洗滌三次后，將切片在Dako熒光封固劑(Cat#S3023,Dako)中用蓋玻片覆蓋，并用2μg/mL Hoechst(Cat#H3570,Invitrogen)加標(biāo)以對細(xì)胞核進(jìn)行染色。使用10X和60X物鏡和如表4所示的信道利用Olympus 1X81熒光顯微鏡捕獲圖像。

表4.用于熒光顯微鏡的物鏡和信道

結(jié)果示于圖10中。小鼠Fc的免疫檢測顯示在整個(gè)不同腦區(qū)域中的腦血管的強(qiáng)染色，以及血管周腦實(shí)質(zhì)的染色，表明IGF1R-5Fc在腦血管中積累，并且還遷移穿過BBB進(jìn)入周圍的腦實(shí)質(zhì)中。該結(jié)果支持如下結(jié)論：IGF1R-Fc的升高的CSF水平指示構(gòu)建體遷移穿過BBB。這得到以下觀察的進(jìn)一步強(qiáng)烈支持：連接于IGF1R-5的甘丙肽誘導(dǎo)對實(shí)質(zhì)GalR1和GalR2受體的藥理學(xué)反應(yīng)(鎮(zhèn)痛)?？傊w外BBB遷移穿過結(jié)果、體內(nèi)藥物動力學(xué)(血清/CSF水平)和藥效學(xué)(Hargreaves模型)結(jié)果表明IGF1R-5 V_HH通過由其與IGF1R表位的結(jié)合觸發(fā)的主動的受體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)胞吞以比其它V_HH顯著更高的速率遷移穿過完整的BBB，并且其可“擺渡”一系列(1-80kD)本來非滲透性的分子穿過血腦屏障。

實(shí)施例14：IGF1R-5對IGF1R的“生理”功能的影響

從安全角度來看，重要的是顯示本發(fā)明的抗體當(dāng)接合其受體用于通過受體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)胞吞遞送藥物時(shí)，不干擾受體的生理功能(即通過其天然配體IGF-1誘導(dǎo)信號傳導(dǎo))。鑒于此，重要的是證明IGF1R-5 V_HH或IGF1R-5-mFc不干擾IGF1R或相關(guān)胰島素受體(IR)由其天然配體誘導(dǎo)的生理信號傳導(dǎo)。

為了確定IGF1R-5是否單獨(dú)誘導(dǎo)通過IGF1R或IR的信號傳導(dǎo)，或干擾如通過受體的天然配體IGF-1或胰島素刺激的信號傳導(dǎo)，在SV-ARBEC細(xì)胞中測定它們對受體本身的磷酸化或受體刺激的下游激酶Akt的影響。

根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法，將SV-ARBEC在補(bǔ)充有蛋白胨、D-葡萄糖、BME氨基酸、BME維生素、抗生素/抗霉菌溶液和胎牛血清的M199基礎(chǔ)培養(yǎng)基中生長至匯合。在處理前18小時(shí)將細(xì)胞轉(zhuǎn)換到無血清培養(yǎng)基中。在添加200ng/ml IGF-1、10μg/ml胰島素或媒介物之前1小時(shí)向細(xì)胞中加入IGF1R-5 V_HH或IGF1R-5-Fc融合物(100nM或500nM)。將細(xì)胞與配體或媒介物一起溫育20分鐘，隨后在Hank平衡鹽溶液中洗滌兩次。隨后使用補(bǔ)充有1％Triton-x 100和蛋白酶抑制劑混合物(Sigma)的1x RIPA緩沖液(Cell Signaling Technology)裂解細(xì)胞。在水浴超聲器中給予細(xì)胞以2×20秒的爆發(fā)，通過以14,000rpm離心10分鐘澄清裂解物。使用DC蛋白測定系統(tǒng)(BIO-RAD laboratories)測定蛋白質(zhì)濃度。將等μg的蛋白質(zhì)樣品在125V下在4-20％梯度的SDS聚丙烯酰胺凝膠上分離并轉(zhuǎn)移到PVDF膜。通過在針對該靶標(biāo)的一抗(Cell Signaling Technology)的1：1000稀釋液中過夜溫育，隨后與山羊抗兔IgG-HRP二抗溫育1小時(shí)來檢測磷酸-Akt(Ser 473)，隨后與ECL Plus試劑反應(yīng)，并將其顯現(xiàn)在放射自顯影膠片上。使用Un-Scan-It軟件(Silk Scientific Inc.)測定密度測定值。

結(jié)果示于圖11中。Akt磷酸化的免疫印跡分析顯示當(dāng)與100nM的IGF1R-5或IGF1R-5-mFc或500nM IGF1R-5-mFc共同施用時(shí)，IGF1R-5不抑制通過10μg/ml的胰島素或通過200ng/ml的IGF-1誘導(dǎo)的Akt磷酸化。V_HH或Fc融合物本身均不誘導(dǎo)Akt信號傳導(dǎo)(圖11A、11B和11C，標(biāo)記為“-5”)。結(jié)果證明，即使在呈Fc融合形式的二價(jià)展示中，IGF1R-5也不觸發(fā)受體二聚化和下游信號傳導(dǎo)，因此在天然配體存在的情況下不干擾受體功能。IGF1R-5的這個(gè)特征(“安靜的結(jié)合劑”)對于其作為用于治療劑的BBB載體的應(yīng)用是重要的，因?yàn)槠滟x予有利的安全性特征。

本文所述的實(shí)施方案和實(shí)施例是舉例說明性的，并不意味著限制所要求保護(hù)的本發(fā)明的范圍。前述實(shí)施方案的變化，包括替代、修改和等同物，由發(fā)明人意圖包括在權(quán)利要求中。此外，所討論的特征的組合對于本發(fā)明的解決方案可能不是必需的。

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本文和整個(gè)申請中提及的所有專利、專利申請和出版物通過引用并入本文。

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