專利名稱：對胰島素受體具有高活性的單鏈胰島素激動劑的制作方法
對膜島素受體具有局活性的單鏈膜島素激動劑相關(guān)申請的交叉引用
本申請要求分別于2010年6月16日和2011年I月17日提交的美國臨時專利申請?zhí)?1/355，366和61/433，500的優(yōu)先權(quán)，其每一份都通過引用以其整體結(jié)合到本文中。通過電子提交材料的引用予以結(jié)合
通過引用以其整體予以結(jié)合的是隨附的同時提交的計算機可讀核苷酸/氨基酸序列表，并如下識別一份2011年I月15日創(chuàng)建的命名為“Seqlist_singleST25”的90 KB ACII(Text)文件。背景
胰島素是一種經(jīng)過驗證的療法，用于治療幼年型糖尿病和較晚階段的成人型糖尿病。該肽經(jīng)生物合成成為低效力(約天然胰島素的2%-9%)的較大線性前體，稱為胰島素原。胰島素原通過選擇性脫去35個殘基連接肽(C肽)而被蛋白水解轉(zhuǎn)化為胰島素。通過胰島素“A鏈” (SEQ ID NO I)和“B鏈，，(SEQ ID NO 2)鏈之間的二硫鍵形成所得的有51個氨基酸的異源雙鏈，其對胰島素受體具有高效力(nM范圍)。天然胰島素對胰島素受體具有相對于相關(guān)胰島素樣生長因子I受體約100倍的選擇性親和力，但是對于兩種不同的胰島素受體同種型(名為A和B)幾乎無選擇性。

胰島素樣生長因子I和2是單鏈線性肽激素，在其A和B鏈序列中是高度同源的，與天然胰島素具有約50%同源性。IGF A和B鏈由“C肽”連接，其中兩種IGF的C肽在大小和氨基酸序列上不同，第一個長為12個氨基酸，第二個長為8個氨基酸。人IGF-1為70 aa堿性肽，具有SEQ ID NO: 3所示的蛋白質(zhì)序列，并與胰島素原具有43%同源性(Rinderknecht等(1978) J. Biol. Chem. 253:2769-2776)。人 IGF-2 為 67 個氨基酸堿性肽，具有 SEQ IDNO: 4所示的蛋白質(zhì)序列。與對A受體同種型的活性相比，IGF對胰島素B受體同種型的活性少得多。申請人:之前已經(jīng)鑒定出基于IGF-1的胰島素肽類似物(其中B鏈的天然Gln-Phe二肽被Tyr-Leu置換)對胰島素受體顯示高活性(參見PCT/US2009/068713，其公開內(nèi)容結(jié)合到本文中)。這類類似物(本文稱為IGFYL類似物肽(analog peptide))比胰島素更容易合成，并且使得能夠開發(fā)用于胰島素和IGF-1受體的共同激動劑類似物和選擇性胰島素受體特異性類似物。此外，可按照本公開內(nèi)容，將這些胰島素類似物配制成單鏈胰島素激動劑。之前已制備了包含胰島素A和B鏈的單鏈胰島素類似物(參見EP I, 193，272和US2007/0129284)。然而，之前公開的單鏈胰島素類似物的缺點是，對胰島素受體的效力低和/或?qū)GF-1受體的效力相對高。根據(jù)以下發(fā)現(xiàn)制備本發(fā)明的化合物，即可通過插入IGF-1C肽或其類似物作為連接胰島素B和A肽的連接肽，來制備單鏈高效力胰島素激動劑。C肽序列中個別氨基酸的選擇性突變產(chǎn)生相對于IGF-1受體對胰島素有高度選擇性的肽。另外，單鏈胰島素激動劑的制劑可能加強胰島素和胰島素類似物的二級結(jié)構(gòu)，以改進生物生理穩(wěn)定性、治療指數(shù)和體內(nèi)藥理學(xué)。胰島素的藥理不是葡萄糖敏感的，因此，給予胰島素可能導(dǎo)致可引起危及生命的低血糖的過度作用。不穩(wěn)定的藥理作用是胰島素療法的標志，使得極難以使血糖正常而又不發(fā)生低血糖。此外，天然胰島素具有短的作用持續(xù)時間，需要改進以使其適用于基礎(chǔ)葡萄糖的控制。單鏈胰島素類似物肽適于進一步的結(jié)構(gòu)改進，預(yù)期結(jié)構(gòu)改進通過利用前藥化學(xué)得到改進的治療指數(shù)；通過連接血漿蛋白質(zhì)例如白蛋白或其它修飾(包括聚乙二醇化和?；?延長作用持續(xù)時間；通過糖基化提高物理穩(wěn)定性；通過采用膽固醇或維生素樣取代基進行化學(xué)修飾而得到優(yōu)選的組織靶向。使用C肽接頭制備單鏈胰島素類似物還提供新的結(jié)構(gòu)位置，其中可成功地部署許多的這些化學(xué)修飾。這類優(yōu)化胰島素激動劑的主要用途可以是用于胰島素依賴型糖尿病的治療中。概述
如本文所公開的，申請人 發(fā)現(xiàn)了高效力的單鏈胰島素類似物。更具體地講，在一個實施方案中，提供相對于IGF-1受體對胰島素受體有高選擇性的高效力單鏈胰島素激動劑多肽。按照一個實施方案，單鏈胰島素類似物激動劑包含人胰島素的B鏈和A鏈或其類似物或衍生物，其中B鏈的羧基端通過連接部分與A鏈的氨基端連接。在一個實施方案中，B鏈是氨基酸B26-B30被脫去的C端截短B鏈(相對于天然胰島素B鏈的位置)。在該實施方案中，B鏈B25氨基酸的羧基端與連接部分的第一末端直接連接，連接部分的第二末端與A鏈Al氨基酸的氨基端直接連接。在一個其中線性單鏈胰島素類似物包含C端截短的B鏈，而連接部分為肽的實施方案中，連接部分的長度至少為8個氨基酸，但是長度不超過17個氨基酸。在其中線性單鏈胰島素類似物包含全長B鏈，連接部分為肽的實施方案中，連接部分的長度至少為8個氨基酸，但長度不超過12個氨基酸。按照一個實施方案，連接部分包含
a)6-16個單體單元的聚乙二醇；
b)長度為至少8個氨基酸而不超過17個氨基酸并且包含序列X51X52X53X54X55X56X57X58(SEQ ID NO: 9)的非天然胰島素或IGF氨基酸序列或其肽模擬物；或
c)所述聚乙二醇和1-4個氨基酸的縮短氨基酸序列的組合，其中
X51選自甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸和甲硫氨酸；
X52是酪氨酸以外的任何氨基酸；
X53-X56各自獨立地為任何氨基酸；和
X57和X58獨立選自精氨酸、鳥氨酸和賴氨酸。連接部分可包含非天然存在的氨基酸以及逆倒位片段，或摻入非肽鍵例如氮雜肽鍵(azapeptide bond) (CO被NH取代)或假肽鍵(例如NH被CH2取代)或酯鍵(例如縮肽(cbpsip印tide)，其中一個或多個酰胺(-C0NHR-)鍵被酯(COOR)鍵置換)。當連接部分包含氨基酸序列時，還預(yù)期任何指定的氨基酸還包括規(guī)定氨基酸的衍生物，包括對氨基酸的化學(xué)修飾，例如酪氨酸殘基中的硝基，或酪氨酸殘基中的碘，或通過游離羧基向酯基或向酰胺基轉(zhuǎn)化，或通過氨基經(jīng)?；蝓０忿D(zhuǎn)化，或通過使羥基?；蕴峁?，或通過使伯胺烷基化以提供仲胺或親水部分與氨基酸側(cè)鏈連接。其它衍生物通過氨基酸側(cè)鏈的氧化或還原來獲得。在一個實施方案中，單鏈胰島素類似物包含與B鏈的N端或與連接部分的氨基酸側(cè)鏈連接的親水部分。更具體地講，在一個實施方案中，單鏈胰島素激動劑類似物包含通用結(jié)構(gòu)B-LM-A，其中B表示胰島素B鏈，A表示胰島素A鏈，LM表示連接B鏈羧基端與A鏈氨基端的連接部分，其中連接部分還包含與以下連接的親水部分連接部分的氨基酸側(cè)鏈和/或B鏈的N端a胺(對于基于胰島素的B鏈為BI位，對于基于IGF-1的B鏈為B2位)或選自A鏈的A9、A14和A15位或B鏈的B1、B2、B10、B22、B28或B29位的氨基酸側(cè)鏈。在
一個實施方案中，親水部分與B鏈的N端a胺(即采用基于胰島素的編碼方案為胰島素的BI位或IGF胰島素激動劑的B2位)連接。在一個實施方案中，親水部分是聚乙烯鏈，而在進一步的實施方案中，聚乙烯鏈與連接部分的氨基酸側(cè)鏈共價結(jié)合。在一個實施方案中，連接部分(LM)包含長度不超過17個氨基酸的氨基酸序列，并包含序列X51X52X53X54X55X56X57X58(SEQ ID NO: 9)，其中
X51選自甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸和甲硫氨酸；
X52是酪氨酸以外的任何氨基酸；
X53-X56各自獨立地為任何氨基酸；和
X57和X58獨立地為精氨酸、賴氨酸、半胱氨酸、高半胱氨酸、乙?；?苯丙氨酸或鳥氨酸。在一個實施方案中，連接部分(LM)包含序列X51X52GSSSX57X58 (SEQ ID NO: 29)或X51X52GsssX57X58APQT (SEQ ID NO: 46)，其中指定為X57或X58的氨基酸還包含與該位置的氨基酸側(cè)鏈連接的親水部分。在一個實施方案中，親水部分是聚乙二醇鏈。在一個實施方案中，連接部分包含包含序列GyGSSSX57X58 (SEQ ID NO: 85)或GYGSSSX57X58APQT (SEQ ID NO: 37)的8_17個氨基酸序列或其肽模擬物；
其中
X57和X58獨立地為精氨酸、賴氨酸或鳥氨酸。在一個實施方案中，親水部分與位于包含SEQ ID NO: 37或85的連接部分8位的氨基酸側(cè)鏈連接。在一個實施方案中，連接部分包含 1)6-16個單體單元的線性聚乙二醇鏈，
2)長度為至少8個氨基酸而不超過12個氨基酸并且包含序列X51X52X53X54X55X56RR(SEQID NO: 10)的氨基酸序列，或
3)所述聚乙二醇鏈和氨基酸序列的組合。在進一步的實施方案中，連接部分選自(Y1)k-X51AX53X54X55X56RR(Y2)n (SEQ ID NO: 23)、(Y2)k-GYGSSSX57R (SEQ ID NO: 51)和
權(quán)利要求
1.一種包含通用結(jié)構(gòu)B-LM-A的單鏈胰島素激動劑類似物，其中 B 表示包含序列 X25LCGX29X3QLVX33X34LYLVCGDX42GFX45 (SEQ ID NO: 58)的胰島素 B 鏈；A表示包含序列GIVX4X5CCX8X9X1QCX12LX14X15LX17X18X19CX21-R13 (SEQ ID NO: 22)的胰島素A鏈；和 LM表示連接B鏈羧基端與A鏈氨基端的連接部分； 此外其中所述連接部分包含長度不超過17個氨基酸且包含序列X51X52X53X54X55X56X57X58(SEQ ID NO: 9)的氨基酸序列，其中X4為谷氨酸或天冬氨酸； X5為谷氨酰胺或谷氨酸； X8為組氨酸、蘇氨酸或苯丙氨酸； X9為絲氨酸、精氨酸、賴氨酸、鳥氨酸或丙氨酸； X10為異亮氨酸或絲氨酸； X12為絲氨酸或天冬氨酸； X14為酪氨酸、精氨酸、賴氨酸、鳥氨酸或丙氨酸； X15為谷氨酰胺、谷氨酸、精氨酸、丙氨酸、賴氨酸、鳥氨酸或亮氨酸； X17為谷氨酰胺、谷氨酸、精氨酸、天冬氨酸或賴氨酸、鳥氨酸； X18為甲硫氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸或蘇氨酸； X19為酪氨酸、4-甲氧基-苯丙氨酸或4-氨基苯丙氨酸； X21選自丙氨酸、甘氨酸、絲氨酸、纈氨酸、蘇氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、組氨酸、色氨酸、酪氨酸和甲硫氨酸； X25選自組氨酸和蘇氨酸； X29選自丙氨酸、甘氨酸和絲氨酸； X3tl選自組氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、高半胱磺酸和半胱磺酸； X33選自天冬氨酸和谷氨酸； X34選自丙氨酸和蘇氨酸； X42選自丙氨酸、鳥氨酸和精氨酸； X45選自酪氨酸、組氨酸、天冬酰胺和苯丙氨酸； X51選自甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸和甲硫氨酸； X52是酪氨酸以外的任何氨基酸； X53-X56各自獨立地為任何氨基酸；和 X57和X58獨立地為精氨酸、賴氨酸、半胱氨酸、高半胱氨酸、乙?；?苯丙氨酸或鳥氨酸，此外其中親水部分與連接部分的氨基酸或位于選自A鏈的A9、A14和A15或B鏈的B1、B2、BIO, B22、B28或B29位的氨基酸共價連接。
2.權(quán)利要求1的胰島素類似物，其中B鏈包含序列X25LCGX29X3(iLVX33X34LYLVCGDX42GFX45(SEQ ID NO: 58)，連接部分包含序列(Y1)k-X51X52X53X54X55X56X57X58 (Y2)n (SEQ ID NO: 9)，A鏈包含序列 GIVX4ECCX8X9SCDLX14X15LEX18X19CX21-R13 (SEQ ID NO: 19)，其中 X4為谷氨酸或天冬氨酸； X8為組氨酸、蘇氨酸或苯丙氨酸； X9為絲氨酸、精氨酸、賴氨酸、鳥氨酸或丙氨酸；X14為酪氨酸、精氨酸、賴氨酸、鳥氨酸或丙氨酸； X15為谷氨酰胺、谷氨酸、精氨酸、丙氨酸、賴氨酸、鳥氨酸或亮氨酸； X18為甲硫氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸或蘇氨酸； X19為酪氨酸、4-甲氧基-苯丙氨酸或4-氨基苯丙氨酸； X21選自丙氨酸、甘氨酸、絲氨酸、纈氨酸、蘇氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、組氨酸、色氨酸、酪氨酸和甲硫氨酸； X25選自組氨酸和蘇氨酸； X29選自丙氨酸、甘氨酸和絲氨酸； X3tl選自組氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、高半胱磺酸和半胱磺酸； X33選自天冬氨酸和谷氨酸； X34選自丙氨酸和蘇氨酸； X42選自丙氨酸、鳥氨酸和精氨酸； X45選自酪氨酸、組氨酸、天冬酰胺和苯丙氨酸； n為O或I ; k為O或I ; Y1 選自 X46、X46X47' X46X47X48' X46X47X48X49 (SEQ ID NO: 24)和 X46X47X48X49X5tl (SEQ ID NO:13);和Y2 選自 X70、X70X71'X70X71X7J X70X71X72X73 (SEQ ID NO: 15)； X46為苯丙氨酸或酪氨酸； X47為天冬酰胺、谷氨酸、天冬氨酸或蘇氨酸； X48為天冬氨酸、精氨酸、賴氨酸或脯氨酸； X49為賴氨酸或脯氨酸； X5tl為蘇氨酸； X70-X73獨立地為任何氨基酸，此外其中B鏈B25氨基酸的羧基端與所述連接部分的氨基端直接連接。
3.權(quán)利要求1或2的胰島素類似物，其中所述親水部分是聚乙二醇鏈。
4.權(quán)利要求3的胰島素類似物，其中所述聚乙二醇鏈在連接部分的CS位上、在B鏈的N端a胺上、在A鏈的A14位的氨基酸側(cè)鏈上或在B鏈的B1、B2、B22或B29位的氨基酸側(cè)鏈上與氨基酸的側(cè)鏈共價連接。
5.權(quán)利要求3的胰島素類似物，其中 X70為丙氨酸， X71為脯氨酸， X72為谷氨酰胺；和 X73為蘇氨酸。
6.權(quán)利要求1的胰島素類似物，其中所述連接部分包含序列X51X52GSSSX57X58(SEQ IDNO: 29)或 X51X52GsssX57X58APQT (SEQ ID NO: 46)，其中 X51選自甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸和脯氨酸； X52為丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸或脯氨酸；和 X57或X58還包含與該位置的氨基酸側(cè)鏈連接的親水部分。
7.權(quán)利要求1、2、5或6中任一項的胰島素類似物，其中聚乙二醇鏈在連接部分的C8位上與氨基酸的側(cè)鏈連接。
8.權(quán)利要求3的胰島素類似物，其中所述連接部分包含序列GAGSSSRX58APQT(SEQ IDNO: 167)或GYGSSSRX58 (SEQ ID NO: 45)或因C2位以外的位置上的單個氨基酸取代而不同于SEQ ID NO: 167的氨基酸，此外其中所述聚乙二醇鏈在所述連接部分的C8位或在B鏈的N端a胺上與氨基酸的側(cè)鏈連接。
9.權(quán)利要求1-8中任一項的胰島素類似物，其中A鏈包含序列 GIVDECCX8RSCDLYQLENX19CN-R13 (SEQ ID NO: 195)，B 鏈包含序列GPEX25LCGSHLVDALYLVCGDX42GFX45 (SEQ ID NO: 196) 其中 X8為蘇氨酸、組氨酸或苯丙氨酸； X19為酪氨酸、4-甲氧基-苯丙氨酸或4-氨基苯丙氨酸； X25為組氨酸或蘇氨酸； X42為丙氨酸、鳥氨酸或精氨酸； X45為酪氨酸組氨酸、天冬酰胺或苯丙氨酸；和 R13 為 COOH 或 CONH2。
10.權(quán)利要求1-9中任一項的胰島素類似物，其中第一親水部分與連接部分的C8位的氨基酸連接，第二親水部分在選自以下的位置與氨基酸連接B鏈的N端a胺、A鏈的A9、A14和A15位的氨基酸側(cè)鏈或B鏈的B1、B2、BIO、B22、B28或B29位的氨基酸側(cè)鏈。
11.權(quán)利要求10的胰島素類似物，其中所述第一和第二親水部分兩者均為聚乙二醇鏈。
12.權(quán)利要求9的胰島素類似物，其中所述連接部分包含序列(Y1),-X51X52X53X54X55X56X57X58 (Y2)n (SEQ ID NO: 9)，其中 X51選自甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸和脯氨酸； X52為丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸或脯氨酸；和 X53-X56各自獨立地為任何氨基酸；和 X57和X58獨立地為精氨酸、賴氨酸、半胱氨酸、高半胱氨酸、乙?；?苯丙氨酸或鳥氨酸； n為I或0 ; k為I ;Y1 選自 X46、X46X47、X46X47X48、X46X47X48X49 (SEQ ID NO: 24)和 X46X47X48X49X5tl (SEQ ID NO:13)；Y2 選自 X70、X70X71、X70X71XJX70X71X72X73 (SEQ ID NO: 15)； X46為苯丙氨酸或酪氨酸； X47為天冬酰胺、谷氨酸、天冬氨酸或蘇氨酸； X48為天冬氨酸、精氨酸，脯氨酸或賴氨酸； X49 is賴氨酸或脯氨酸； X5tl為蘇氨酸； X70為丙氨酸；X71為脯氨酸； X72為谷氨酰胺；和 X73為蘇氨酸。
13.權(quán)利要求12中任一項的胰島素類似物，其中X57或X58之一為聚乙二醇化賴氨酸，另一個為精氨酸、賴氨酸或鳥氨酸。
14.一種單鏈胰島素類似物，其包含A鏈和氨基酸B26-B30已脫去的C端截短的B鏈，其中所述A鏈和B鏈是人胰島素序列或其類似物或衍生物，此外其中B鏈的B25氨基酸的羧基端與連接部分的第一末端直接連接，連接部分的第二末端與A鏈的Al氨基酸的氨基端直接連接， 所述連接部分包含 a)6-16個單體單元的聚乙二醇； b)長度為至少8個氨基酸而不超過17個氨基酸，并包含序列(Y1),-X51X52GSSSX57X58-(Y2)n (SEQ ID NO: 29)的非天然氨基酸序列；或 c)所述聚乙二醇和1-4個氨基酸的非天然氨基酸序列的組合； 其中 n為O或I ; k為O或I ;Y1 選自 X46 和 X46X47 ；Y2 選自 X70、X70X71、X70X71XJX70X71X72X73 (SEQ ID NO: 15)； X51選自甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸和甲硫氨酸； X52為丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸或脯氨酸； X57和X58獨立地為精氨酸、賴氨酸、半胱氨酸、高半胱氨酸、乙?；?苯丙氨酸或鳥氨酸；和 X46為苯丙氨酸或酪氨酸； X47為天冬酰胺、谷氨酸、天冬氨酸或蘇氨酸； X70-X73獨立地為任何氨基酸。
15.權(quán)利要求14的單鏈類似物，其中所述連接部分包含以下通用結(jié)構(gòu)=W2-Z2-Y2 其中 W2和Y2獨立地為以下通用結(jié)構(gòu)的聚乙二醇
16.權(quán)利要求15的單鏈胰島素類似物，其中Z2 為 X46 或 X46X47, X46 和 X47 獨立地為 Lys 或 Cys。
17.權(quán)利要求15的單鏈胰島素類似物，其中 Z2為鍵。
18.權(quán)利要求17的單鏈胰島素激動劑，其中所述聚乙二醇包含至少10個但少于14個單體單元。
19.權(quán)利要求14的單鏈胰島素類似物，其中所述連接部分包含序列(Y1),-X51X52GSSSX57X58 (Y2)n (SEQ ID NO: 29)，其中 n為I ; k為O或I ;Y2 選自 X7tl、X7tlX71、X7tlX71X7JP X7tlX71X72X73 (SEQ ID NO: 15) ;X7(1-X73 各自獨立地為任何氨基酸，前提條件是X57、X58, X70, X71、X72和X73的至少一個為選自以下的氨基酸
20.權(quán)利要求19的單鏈胰島素類似物，其中 X70為丙氨酸； X71為脯氨酸； X72為谷氨酰胺； X73為蘇氨酸;x57或X58之一為聚乙二醇化賴氨酸，另一個為精氨酸、賴氨酸或鳥氨酸。
21.權(quán)利要求14、19或20的單鏈胰島素激動劑，其中X52為丙氨酸或脯氨酸。
22.權(quán)利要求14的單鏈胰島素激動劑，其中所述連接部分包含1-4個氨基酸序列和與所述1-4個氨基酸序列共價結(jié)合的長度為至少8個但少于14個單體單元的線性聚乙二醇，前提條件是1-4個氨基酸序列不是YTPK (SEQ ID NO: 78)或FNKP (SEQ ID NO: 77)。
23.權(quán)利要求14-22中任一項的單鏈胰島素激動劑，其中B鏈包含序列R22-X25LCGX29X30LVX33X34LYLVCGX41X42GFX45 (SEQ ID NO: 21)，A 鏈包含序列 Gm4X5CCX8X9X10CX12LX14X15LX17X18X19CX21-R13 (SEQ ID NO: 22)，其中 X4為谷氨酸或天冬氨酸； X5為谷氨酰胺或谷氨酸； X8為組氨酸、蘇氨酸或苯丙氨酸； X9為絲氨酸、精氨酸、賴氨酸、鳥氨酸或丙氨酸； X10為異亮氨酸或絲氨酸； X12為絲氨酸或天冬氨酸； X14為酪氨酸、精氨酸、賴氨酸、鳥氨酸或丙氨酸； X15為谷氨酰胺、谷氨酸、精氨酸、丙氨酸、賴氨酸、鳥氨酸或亮氨酸； X17為谷氨酰胺、谷氨酸、精氨酸、天冬氨酸或賴氨酸、鳥氨酸； X18為甲硫氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸或蘇氨酸； X19為酪氨酸、4-甲氧基-苯丙氨酸或4-氨基苯丙氨酸； X21選自丙氨酸、甘氨酸、絲氨酸、纈氨酸、蘇氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、組氨酸、色氨酸、酪氨酸和甲硫氨酸； X25為組氨酸或蘇氨酸；X29選自丙氨酸、甘氨酸和絲氨酸； X3tl選自組氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、高半胱磺酸和半胱磺酸； X33選自天冬氨酸、谷氨酰胺和谷氨酸； X34選自丙氨酸和蘇氨酸； X41選自谷氨酸、天冬氨酸或天冬酰胺； X42選自丙氨酸、賴氨酸、鳥氨酸和精氨酸； X45為酪氨酸、組氨酸、天冬酰胺或苯丙氨酸；R22 選自 AYRPSE (SEQ ID NO: 14)、FVNQ (SEQ ID NO: 12)、PGPE (SEQ ID NO: 11)、三肽甘氨酸-脯氨酸-谷氨酸、三肽纈氨酸-天冬酰胺-谷氨酰胺、二肽脯氨酸-谷氨酸、二肽天冬酰胺-谷氨酰胺、谷氨酰胺、谷氨酸和鍵；和R13 為 COOH 或 CONH2。
24.權(quán)利要求23的單鏈胰島素類似物，其中B鏈還包含含有1-6個帶電荷的氨基酸的氨基端突出端。
25.權(quán)利要求24的單鏈胰島素類似物，其中所述氨基端突出端包含序列X6tl(X61X62) dX63K(SEQ ID NO: 192) 其中 X6tl選自甘氨酸、谷氨酸和天冬氨酸； X61和X62獨立選自谷氨酸和天冬氨酸； X63選自精氨酸、天冬氨酸和谷氨酸； d為1-3范圍的整數(shù)。
26.權(quán)利要求14的單鏈胰島素類似物，其中n為1，Y2選自A、AP、APQ和APQT。
27.權(quán)利要求26的單鏈胰島素類似物，其中Y1選自F、Y、FN、YT、FD、FE、YD和YE0
28.權(quán)利要求14-27中任一項的胰島素類似物，其中A鏈包含序列 GIVDECCX8RSCDLYQLENX19CN-R13 (SEQ ID NO: 195)，B 鏈包含序列GPEX25LCGSHLVDALYLVCGDX42GFX45 (SEQ ID NO: 196) 其中 X8為蘇氨酸、組氨酸或苯丙氨酸； X19為酪氨酸、4-甲氧基-苯丙氨酸或4-氨基苯丙氨酸； X25為組氨酸或蘇氨酸； X42為丙氨酸、鳥氨酸或精氨酸； X45為酪氨酸、組氨酸、天冬酰胺或苯丙氨酸；和 R13 為 COOH 或 CONH2。
29.權(quán)利要求15-27的單鏈胰島素類似物，其中B鏈包含序列R22-HLCGSX30LVEALYLVCGERGFF (SEQ ID NO: 154)或 R24-X25LCGX29X3(iLVX33X34LYLVCGX41X42GFX45 (SEQ ID NO: 21)，A 包含序列 GIVEQCCX8SICSLYQLENX19CX21-R13 (SEQ ID NO: 55)或 GIVX4ECCX8X9SCDLX14X15LX17X18X19CX21-R13 (SEQ ID NO: 19) 其中 X4為谷氨酸或天冬氨酸； X8為組氨酸、蘇氨酸或苯丙氨酸；X9為精氨酸、賴氨酸、鳥氨酸或丙氨酸； X14為精氨酸、賴氨酸、鳥氨酸或丙氨酸； X15為谷氨酰胺、谷氨酸、精氨酸、丙氨酸、賴氨酸、鳥氨酸或亮氨酸； X17為谷氨酰胺或谷氨酸； X18為甲硫氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸或蘇氨酸； X19為酪氨酸、4-甲氧基-苯丙氨酸或4-氨基苯丙氨酸； X21選自丙氨酸、甘氨酸、絲氨酸、纈氨酸、蘇氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、組氨酸、色氨酸、酪氨酸和甲硫氨酸； X22選自苯丙氨酸和脫氨基-苯丙氨酸； X23為天冬酰胺或甘氨酸； X25為組氨酸或蘇氨酸； X29選自丙氨酸和甘氨酸； X3tl選自組氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、高半胱磺酸和半胱磺酸； X33選自天冬氨酸、谷氨酰胺和谷氨酸； X34選自丙氨酸和蘇氨酸； X41選自谷氨酸、天冬氨酸或天冬酰胺； X42選自丙氨酸、賴氨酸、鳥氨酸和精氨酸； X45為酪氨酸組氨酸，天冬酰胺或苯丙氨酸； R22選自X22VNQ (SEQ ID NO: 84)、三肽纈氨酸-天冬酰胺-谷氨酰胺、二肽天冬酰胺-谷氨酰胺、谷氨酰胺和鍵； R24 選自 AYRPSE (SEQ ID NO: 14)、PGPE (SEQ ID NO: 11)、三肽甘氨酸-脯氨酸-谷氨酸、二肽脯氨酸-谷氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸和鍵；和R13 為 COOH 或 CONH2。
30.權(quán)利要求23的單鏈胰島素類似物，其中B鏈包含序列R23-R24-X25LCGX29X3qLVX33X34LYLVCGX41X42GfX45 (SEQ ID NO: 21)或 R23-R22_HLCGSX3(ILVEALYLVCGERGFF (SEQ ID NO: 154)，A 鏈包含序列 GIVX4ECCX8X9SCDLX14X15LX17X18X19CX21-R13 (SEQ ID NO: 19) 其中 X4為谷氨酸或天冬氨酸； X8為組氨酸、蘇氨酸或苯丙氨酸； X9為精氨酸、賴氨酸、鳥氨酸或丙氨酸； X14為精氨酸、賴氨酸、鳥氨酸或丙氨酸； X15為谷氨酰胺、谷氨酸、精氨酸、丙氨酸、賴氨酸、鳥氨酸或亮氨酸； X17為谷氨酰胺或谷氨酸； X18為甲硫氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸或蘇氨酸； X19為酪氨酸、4-甲氧基-苯丙氨酸或4-氨基苯丙氨酸； X21選自丙氨酸、甘氨酸、絲氨酸、纈氨酸、蘇氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、組氨酸、色氨酸、酪氨酸和甲硫氨酸； X22選自苯丙氨酸和脫氨基-苯丙氨酸； X25為組氨酸或蘇氨酸；X29選自丙氨酸和甘氨酸； X3tl選自組氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、高半胱磺酸和半胱磺酸； X33選自天冬氨酸、谷氨酰胺和谷氨酸； X34選自丙氨酸和蘇氨酸； X41選自谷氨酸、天冬氨酸或天冬酰胺； X42選自丙氨酸、賴氨酸、鳥氨酸和精氨酸； X45為酪氨酸組氨酸、天冬酰胺或苯丙氨酸； R22選自X22VNQ (SEQ ID NO: 84)、三肽纈氨酸-天冬酰胺-谷氨酰胺、二肽天冬酰胺-谷氨酰胺、谷氨酰胺和鍵；R23 為 N 端胺或 X6tl (X61X62)dX63K (SEQ ID NO: 192) 其中 X6tl選自甘氨酸、谷氨酸和天冬氨酸； X61和X62獨立選自谷氨酸和天冬氨酸； X63選自精氨酸天冬氨酸和谷氨酸； d為1-3范圍的整數(shù)； R24 選自 AYRPSE (SEQ ID NO: 14)、PGPE (SEQ ID NO: 11)、三肽甘氨酸-脯氨酸-谷氨酸、二肽脯氨酸-谷氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸和鍵；和R13 為 COOH 或 CONH2。
31.權(quán)利要求30的單鏈胰島素激動劑，其中X8、X25和X3tl各自為組氨酸。
32.權(quán)利要求31的單鏈胰島素激動劑，其中 X4為天冬氨酸； X9為精氨酸、賴氨酸、鳥氨酸或丙氨酸； X21為丙氨酸、甘氨酸或天冬酰胺； X29為丙氨酸； X33為天冬氨酸； X34為丙氨酸； X41為天冬氨酸；和 R22為甘氨酸-脯氨酸-谷氨酸三肽。
33.權(quán)利要求14-32中任一項的單鏈胰島素類似物，其還包含與所述類似物連接的親水部分。
34.權(quán)利要求33的單鏈胰島素類似物，其中所述親水部分為與B鏈的N端氨基酸或與連接部分CS位氨基酸的氨基酸側(cè)鏈連接的聚乙二醇。
35.前述權(quán)利要求中任一項的單鏈胰島素類似物的前藥衍生物，其包含結(jié)構(gòu)U-B，其中 U為氨基酸或羥酸； B為通過B的羧基部分和單鏈胰島素類似物的胺之間的酰胺鍵與所述單鏈胰島素類似物連接的N-烷基化氨基酸，其中U、B或U-B與之連接的單鏈胰島素類似物的氨基酸是非編碼氨基酸，此外其中U-B在生理條件下在PBS中自單鏈胰島素類似物的化學(xué)切割半壽期(t1/2)為至少約I小時-約I周。
36.權(quán)利要求35的前藥，其中所述單鏈類似物包含GivX4X5CCX8X9XiciCX12LX14X15LX17X18X19CX21-R13 (SEQ ID NO: 22)的 A 鏈序列，其中 X4為谷氨酸或天冬氨酸； X5為谷氨酰胺或谷氨酸； X8為組氨酸、蘇氨酸或苯丙氨酸； X9為絲氨酸、精氨酸、賴氨酸、鳥氨酸或丙氨酸； X10為異亮氨酸或絲氨酸； X12為絲氨酸或天冬氨酸； X14為酪氨酸、精氨酸、賴氨酸、鳥氨酸或丙氨酸； X15為谷氨酰胺、谷氨酸、精氨酸、丙氨酸、賴氨酸、鳥氨酸或亮氨酸； X17為谷氨酰胺、谷氨酸、精氨酸、天冬氨酸或賴氨酸、鳥氨酸； X18為甲硫氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸或蘇氨酸； X19為4-氨基苯丙氨酸； X21選自丙氨酸、甘氨酸、絲氨酸、纈氨酸、蘇氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、組氨酸、色氨酸、酪氨酸和甲硫氨酸；此外其中U-B通過B的羧基部分和A19位的4-氨基苯丙氨酸的對位胺之間的酰胺鍵與單鏈胰島素激動劑連接。
37.權(quán)利要求35或36的前藥，其中 X4為天冬氨酸； X5為谷氨酸； X8為組氨酸或苯丙氨酸； X9為精氨酸、賴氨酸或鳥氨酸； X10為絲氨酸； X12為天冬氨酸； X14和X15獨立地為精氨酸、賴氨酸或鳥氨酸； X17為谷氨酰胺、谷氨酸、精氨酸、天冬氨酸或賴氨酸、鳥氨酸； X18為甲硫氨酸；和 X21為丙氨酸或天冬酰胺。
38.權(quán)利要求35或36的前藥，其中結(jié)構(gòu)U-B的第一氨基酸和/或第二氨基酸為呈D立體異構(gòu)體構(gòu)型的氨基酸。
39.權(quán)利要求35或36的前藥，其中U-B包含下式X的結(jié)構(gòu)
40.權(quán)利要求39的前藥，其中 R1和R2獨立地為C1-C18烷基或芳基； R3為C1-C18烷基，或R3和R4與它們所連接的原子一起形成4-12雜環(huán)； R4和R8獨立選自氫、C1-C18烷基和芳基；和 R5為胺或輕基。
41.權(quán)利要求39的前藥，其中 R1選自氫、C1-C18烷基和芳基，或R1和R2通過-(CH2)p-連接，其中p為2-9 ; R3為C1-C18烷基，或R3和R4與它們所連接的原子一起形成4-6雜環(huán)； R4和R8獨立選自氫、C1-C18烷基和芳基；和 R5為胺或N-取代胺。
42.權(quán)利要求39的前藥，其中 R1和R2獨立選自氫、C1-C8烷基和芳基； R3為C1-C18烷基，或R3和R4與它們所連接的原子一起形成4-6雜環(huán)； R4和R8各自為氫;和 R5選自胺、N-取代胺和羥基。
43.權(quán)利要求35-42中任一項的前藥，其還包含與結(jié)構(gòu)U-B或連接部分的氨基酸連接的聚乙二醇鏈。
44.權(quán)利要求35-42中任一項的前藥，其中貯庫聚合物與結(jié)構(gòu)U-B或連接部分的氨基酸連接。
45.權(quán)利要求1-44中任一項的單鏈胰島素激動劑或其前藥衍生物，其中所述單鏈胰島素激動劑或其前藥衍生物的氨基酸側(cè)鏈通過烷基胺、酰胺、醚、酯、硫醚或巰基酯鍵與?；蛲榛矁r連接，其中所述?；蛲榛鶎τ谔烊淮嬖诘陌被崾欠翘烊坏摹?br> 46.一種包含結(jié)構(gòu)IB-LM-1A的單鏈胰島素類似物，其中IB包含序列 J-R23R22-X25LCGX29X30LVX33X34LX36LVCGX41X42GFX45 (SEQ ID NO: 20)； LM 為選自以下的連接部分:(Y1)k-X51X52X53X54X55X56X57X58 (Y2)n (SEQ ID NO: 9)和
47.權(quán)利要求46的單鏈胰島素類似物，其中R23為鍵或氨基序列X6tl (X61X62) dX63K (SEQID NO: 192) 其中 X6tl選自甘氨酸、谷氨酸和天冬氨酸； X61和X62獨立選自谷氨酸和天冬氨酸； X63選自精氨酸天冬氨酸和谷氨酸；d為1-3范圍的整數(shù)。
48.權(quán)利要求46的單鏈胰島素類似物，其中 X36為酪氨酸；和 U-B包含下式X的結(jié)構(gòu)
49.權(quán)利要求48的單鏈類似物，其中 LM選自(Y1)k-X51AX53X54X55X56X57R(Y2)n (SEQ ID NO:28)、(Y1)k-X51AX53X54X55X56RR(Y2)n (SEQ ID NO: 23)、(Y1)k-GYGSSSX57X58 (Y2)n (SEQ ID NO:85)，其中IB的B25氨基酸與LM直接連接，其中
50.權(quán)利要求46的單鏈類似物，其中IB包含序列R22-HLCGSX3(iLVEALYLVCGERGFF(SEQID NO: 154)或 R24-X25LCGX29X30LVX33X34LYLVCGX41X42GFX45 (SEQ ID NO: 21)，IA 包含序列GIVEQCCX8SICSLYQLENX19CX21-R13 (SEQ ID NO: 55)或 GIVX4ECCX8X9SCDLX14X15LENX19CN_R13(SEQ ID NO: 151)，其中 X4為谷氨酸或天冬氨酸； X8為組氨酸、蘇氨酸或苯丙氨酸； X9為精氨酸、賴氨酸、鳥氨酸或丙氨酸；X14為精氨酸、賴氨酸、鳥氨酸或丙氨酸； X15為谷氨酰胺、谷氨酸、精氨酸、丙氨酸、賴氨酸、鳥氨酸或亮氨酸； X19為以下通用結(jié)構(gòu)的氨基酸
51.權(quán)利要求50的單鏈胰島素類似物，其中LM包含結(jié)構(gòu)
52.權(quán)利要求50的單鏈胰島素類似物，其中LM 包含序列(Y1)k-X51AX53X54X55X56RR(Y2)n (SEQ ID NO: 23)或(Y1)k-GYGSSSX57R (SEQID NO: 51)，其中k為0或I ;n為0或I ; X51選自甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸和甲硫氨酸； X53-X56各自獨立地為任何氨基酸； X57為賴氨酸、鳥氨酸或精氨酸； Y1 選自 X46、X46X47 和 X46X47X48 ； 其中 X46為苯丙氨酸或酪氨酸； X47為天冬酰胺、谷氨酸、天冬氨酸或蘇氨酸； X48為天冬氨酸、精氨酸、賴氨酸或脯氨酸；和 Y2選自A、AP、APQ和APQT (SEQ ID NO: 82)，前提條件是如果k為0，則LM不含序列YTPKT (SEQ ID NO: 16)或 FNKPT (SEQ ID NO: 76)。
53.權(quán)利要求50的單鏈胰島素類似物，其中IB包含序列X25LCGX29X3QLVX33X34LYLVCGDX42GFX45 (SEQ ID NO: 58) 其中 X25選自組氨酸和蘇氨酸； X29選自丙氨酸、甘氨酸和絲氨酸； X3tl選自組氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、高半胱磺酸和半胱磺酸； X33選自天冬氨酸和谷氨酸； X34選自丙氨酸和蘇氨酸； X42選自丙氨酸、賴氨酸、鳥氨酸和精氨酸；和 X45選自酪氨酸、組氨酸、天冬酰胺和苯丙氨酸。
54.權(quán)利要求50的單鏈胰島素類似物，其中 k為0 ; IA 包含序列 GIVEQCCX8SICSLYQLENX19CX21-R13 (SEQ ID NO: 164)或GIVDECCX8X9SCDLRRLEMX19CX21-R13 (SEQ ID NO: 166) ;IB 包含序列 R22_X25LCGAX3(ILVDALYLVC⑶X42GFYFN-R48-R49 (SEQ ID NO: 165)，其中 R22為AYRPSE (SEQ ID NO: 14)或甘氨酸-脯氨酸-谷氨酸三肽；R48為天冬氨酸-賴氨酸二肽、精氨酸-脯氨酸二肽、賴氨酸-脯氨酸二肽或脯氨酸-賴氨酸二肽； R49為蘇氨酸；和 R13 為 COOH 或 CONH2。
55.權(quán)利要求50的單鏈胰島素類似物，其中 k為0 ; IA 包含序列 GIVEQCCHSICSLYQLENX19CX21-R13 (SEQ ID NO: 68)或GIVDECCHRSCDLRRLEMX19CX21-R13 (SEQ ID NO: 88);和IB包含序列FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKT (SEQ ID NO: 2)、GPETLCGX26ELVDX27LYLVCGDX42GFYFNKPT-R14(SEQ ID NO: 197)或GPETLCGAELVDALYLVCGDRGFYFNPKT (SEQ ID NO:89) 其中 X19為酪氨酸、4-甲氧基苯丙氨酸或4-氨基-苯丙氨酸； X21為丙氨酸、甘氨酸或天冬酰胺； X26和X27各自為丙氨酸；和 X42為精氨酸。
56.權(quán)利要求46-55中任一項的單鏈胰島素激動劑,其中所述類似物在選自以下的一個或多個位置上被?；疊鏈的N端a胺、A14、A15、B1、B2、B10、B22、B28、B29位上的氨基酸的側(cè)鏈、連接部分的氨基酸側(cè)鏈的側(cè)鏈或二肽U-B的氨基酸的側(cè)鏈。
57.權(quán)利要求14、46或50中任一項的單鏈胰島素激動劑，其中所述類似物在選自以下的一個或多個位置上被聚乙二醇化=B鏈的N端a胺、在414、八15、81、82、810、822、828、B29位的氨基酸的側(cè)鏈上、在連接部分的氨基酸側(cè)鏈上或二肽U-B的氨基酸側(cè)鏈。
58.權(quán)利要求57的胰島素類似物，其中所述連接部分包含序列GAGSSSRX58APQT(SEQID NO: 167)或 GYGSSSRX58 (SEQ ID NO: 45)，其中 X58 表示聚乙二醇化氨基酸。
59.—種二聚體或多聚體，其包含權(quán)利要求1-58中任一項的單鏈胰島素激動劑。
60.一種藥物組合物，其包含權(quán)利要求1-59中任一項的單鏈胰島素激動劑或其前藥衍生物和藥學(xué)上可接受的載體。
61.一種治療糖尿病的方法，所述方法包括給予有效量的權(quán)利要求60的藥物組合物。
62.權(quán)利要求1-59中任一項的化合物在制備用于治療高血糖癥的藥物中的用途。
63.權(quán)利要求1-59中任一項的化合物用于治療糖尿病的用途。
全文摘要
本發(fā)明提供對胰島素受體具有高效力和特異性的單鏈胰島素類似物?？墒褂帽景l(fā)明公開的最適大小的連接部分連接人胰島素A鏈和B鏈或其類似物或衍生物，其中B鏈B25氨基酸的羧基端通過間插連接部分與A鏈A1氨基酸的氨基端連接。在一個實施方案中，連接部分包含6-16個單體單元的聚乙二醇，而在備選實施方案中，連接部分包含來源于IGF-1C肽并包含長度為至少8個氨基酸而不超過12個氨基酸的非天然氨基酸序列。本發(fā)明還公開了單鏈胰島素類似物的前藥和綴合物衍生物。
文檔編號C07K14/62GK103068842SQ201180039321
公開日2013年4月24日 申請日期2011年6月16日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月16日
發(fā)明者R.D.迪瑪基, J.阿斯里爾, Z.考爾, J.邁爾斯, T.帕羅迪, Y.趙 申請人:印第安納大學(xué)研究及科技有限公司