專(zhuān)利名稱(chēng)：大豆光受體GmPLP1及其編碼基因與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種大豆光受體GmPLPl及其編碼基因與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
光是影響植物生長(zhǎng)發(fā)育最廣泛、最明顯、最重要的環(huán)境因子。光照對(duì)植物的調(diào)控表現(xiàn)在光合作用效率、呼吸作用強(qiáng)度、頂端分生組織向花原基的分化(光周期反應(yīng))、向性運(yùn)動(dòng)等。光周期反應(yīng)直接決定作物的產(chǎn)量、品質(zhì)和適應(yīng)性。迄今為止還僅是對(duì)模式植物擬南芥的光反應(yīng)的分子機(jī)制研究得較為廣泛和詳盡。在光反應(yīng)中，植物通過(guò)光受體感受外界的光信號(hào)并將光信號(hào)傳遞到晝夜節(jié)律鐘系統(tǒng)，從而激活或抑制光周期開(kāi)花時(shí)間基因的表達(dá)來(lái)控制植物的開(kāi)花時(shí)間。到目前為止在植物中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的光受體有三種分別為紅光/遠(yuǎn)紅光受體光敏色素(phytochrome， 簡(jiǎn)稱(chēng)PHY)、藍(lán)光/紫外光-A受體包括隱花色素(cryptochrome，簡(jiǎn)稱(chēng)CRY)和向光色素 (phototropin，簡(jiǎn)稱(chēng)PHOT)以及紫外光-A受體、紫外光-B受體。光敏色素A吸收紅光和遠(yuǎn)紅光，同時(shí)隱花色素和向光素吸收藍(lán)光。光敏色素和隱花色素共同作用調(diào)控著光合形態(tài)建成過(guò)程如種子形成，開(kāi)花，莖伸長(zhǎng)和基因表達(dá)；而向光性，氣孔開(kāi)放，葉綠體的分布和其他的向光運(yùn)動(dòng)則由向光素控制。大豆是典型的量性短日照作物，對(duì)光周期反應(yīng)十分敏感，每個(gè)大豆品種的適應(yīng)范圍很窄(緯度1 1. 50)，這一特性阻礙了大豆品種的推廣，影響產(chǎn)量水平的有效發(fā)揮。大豆接受光強(qiáng)、光質(zhì)、光照方向和光周期等光信號(hào)并做出相應(yīng)的反應(yīng)，是通過(guò)光受體和光信號(hào)傳導(dǎo)途徑來(lái)接受和轉(zhuǎn)導(dǎo)的。目前植物包括擬南芥，除了 Phytochrome、Cryptochrome、Phototropin 禾口 UV-A/B 這些受體外，還有其他的光受體存在。植物光受體的名單仍然是不完整的。盡管近年已在大豆上克隆了編碼Cryptochrome、Phytochrome的基因，但是對(duì)大豆光受體類(lèi)基因的克隆和功能分析研究還很少，這方面還鮮有報(bào)道。尤其是對(duì)大豆接受光信號(hào)后調(diào)控開(kāi)花的機(jī)理， 即光受體接收光信號(hào)后在細(xì)胞內(nèi)的傳導(dǎo)；對(duì)植物內(nèi)源生長(zhǎng)激素的影響；對(duì)生理活動(dòng)的調(diào)節(jié)過(guò)程等都知之甚微，亟待更深入研究。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種大豆光受體GmPLPl及其編碼基因。本發(fā)明的提供的蛋白質(zhì)，來(lái)源于大豆(Glycine max(L. )Merri 11.)晚熟品種東農(nóng) L13，命名為GmPLPl，是如下1)或2)的蛋白質(zhì)1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；2)將序列2的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物性狀相關(guān)的由1)衍生的蛋白質(zhì)；所述植物性狀為如下1)-10)中的至少一種1)分枝數(shù)；2)開(kāi)花時(shí)間；3)株高；4)葉片面積；5)節(jié)間距；6)根長(zhǎng)；7)光合速率；8)耐逆性；9)莖直徑；10)節(jié)數(shù)。上述序列2由第1-390個(gè)氨基酸組成，其中所述一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和 /或缺失和/或添加為不超過(guò)10個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加。上述蛋白質(zhì)的編碼基因也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。所述編碼基因?yàn)槿缦?)、2)、3)、4)或5)的基因1)序列表中序列1所示的DNA分子；2)序列表中序列1自5’末端第3-1706位核苷酸所示的DNA分子；3)序列表中序列1自5，末端的第345-1575位核苷酸所示的DNA分子；4)在嚴(yán)格條件下與1)或2)或3)限定的DNA分子雜交且與植物性狀相關(guān)蛋白編碼基因的DNA分子；5)與1)或2)或3)限定的DNA序列至少具有80%同源性且與植物性狀相關(guān)蛋白編碼基因的DNA分子；所述植物性狀為如下1)-10)中的至少一種1)分枝數(shù)；2)開(kāi)花時(shí)間；3)株高；4)葉片面積；5)節(jié)間距；6)根長(zhǎng)；7)光合速率； 8)耐逆性；9)莖直徑；10)節(jié)數(shù)。上述序列1由1766個(gè)核苷酸組成，其編碼區(qū)為自5’末端的第345-1575位核苷酸。含有所述編碼基因的重組載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系、重組菌或表達(dá)盒也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。所述重組載體為在載體pBI 121的BamHI和Mc I識(shí)別位點(diǎn)間插入所述編碼基因得到的重組載體；所述重組菌為將所述的重組載體導(dǎo)入宿主菌得到的重組菌。擴(kuò)增所述編碼基因全長(zhǎng)或任一片段的引物對(duì)也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。所述引物對(duì)如下所示一條引物序列如序列表中序列4所示，另一條引物序列如序列表中序列5所示。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種轉(zhuǎn)基因植物的方法。本發(fā)明提供的方法為將所述的編碼基因?qū)肽康闹参锏玫降霓D(zhuǎn)基因植物，所述轉(zhuǎn)基因植物為如下1)-6)中的至少一種1)所述轉(zhuǎn)基因植物的分枝數(shù)多于所述目的植物；2)所述轉(zhuǎn)基因植物的開(kāi)花時(shí)間早于所述目的植物；3)所述轉(zhuǎn)基因植物的株高高于所述目的植物；4)所述轉(zhuǎn)基因植物的葉片面積大于所述目的植物；5)所述轉(zhuǎn)基因植物的節(jié)間距大于所述目的植物；6)所述轉(zhuǎn)基因植物的節(jié)數(shù)多于所述目的植物；所述目的植物為短日照植物，所述短日照植物優(yōu)選為大豆。所述大豆的品種為黑農(nóng)44。本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種轉(zhuǎn)基因植物的方法。本發(fā)明提供的方法，為將所述的編碼基因?qū)肽康闹参锏玫降霓D(zhuǎn)基因植物，所述轉(zhuǎn)基因植物為如下1)-8)中的至少一種1)所述轉(zhuǎn)基因植物的分枝數(shù)多于所述目的植物；2)所述轉(zhuǎn)基因植物的開(kāi)花時(shí)間晚于所述目的植物；
3)所述轉(zhuǎn)基因植物的株高低于所述目的植物；4)所述轉(zhuǎn)基因植物的葉片面積小于所述目的植物；5)所述轉(zhuǎn)基因植物的節(jié)間距短于所述目的植物；6)所述轉(zhuǎn)基因植物的莖直徑小于所述目的植物；7)所述轉(zhuǎn)基因植物的光合速率高于所述目的植物；8)所述轉(zhuǎn)基因植物的耐逆性低于所述目的植物。所述轉(zhuǎn)基因植物的分枝數(shù)多于所述目的植物體體現(xiàn)在所述轉(zhuǎn)基因植物中的激素含量均高于所述目的植物；所述激素為吲哚乙酸、赤霉素、脫落酸或玉米素；所述轉(zhuǎn)基因植物的光合速率高于所述目的植物體現(xiàn)在所述轉(zhuǎn)基因植物葉片的葉綠素高于所述目的植物；所述耐逆性為耐高鹽、耐干旱、耐高溫和/或耐低溫；所述轉(zhuǎn)基因植物的耐逆性低于所述目的植物為如下1)-3)中至少一種1)所述轉(zhuǎn)基因植物脯氨酸含量低于所述目的植物；2)所述轉(zhuǎn)基因植物根系活力低于所述目的植物；2)所述轉(zhuǎn)基因植物超氧化物歧化酶(SOD)酶活性低于所述目的植物；所述高溫為42 °C，所述低溫為4°C ；所述目的植物為長(zhǎng)日照植物，所述長(zhǎng)日照植物優(yōu)選為煙草。所述煙草的品種為 Petite Havana SRl0所述蛋白質(zhì)在植物品種改良中的應(yīng)用，或所述編碼基因在植物品種改良中的應(yīng)用，或所述重組載體在植物品種改良中的應(yīng)用，或所述重組菌在植物品種改良中的應(yīng)用，均為本發(fā)明保護(hù)的范圍。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，將GmPLP 1導(dǎo)入長(zhǎng)日照植物煙草(品種為Petite Havana SRl)，得到轉(zhuǎn)基因植物，這些轉(zhuǎn)基因煙草與野生型煙草相比，分枝數(shù)增加，開(kāi)花時(shí)間推遲，而且影響植物內(nèi)源生長(zhǎng)激素的影響；將GmPLPl導(dǎo)入短日照植物大豆(品種為黑農(nóng)44)中，這些轉(zhuǎn)基因大豆與野生型大豆相比，分枝數(shù)增加，開(kāi)花時(shí)間提前，而且具有株高增大等性狀， 為品種改良提供了基礎(chǔ)。


圖1為GmPLPl的RACE擴(kuò)增結(jié)果圖2為GmPLPl的cDNA全長(zhǎng)擴(kuò)增圖3為GmPLPl的全基因組擴(kuò)增結(jié)果圖4不同光照處理下GmPLPl在大豆中表達(dá)豐度變化圖5為葉盤(pán)法轉(zhuǎn)化煙草全過(guò)程圖6為煙草轉(zhuǎn)基因后代的PCR鑒定結(jié)果圖7為煙草轉(zhuǎn)基因后代的RT-PCR鑒定結(jié)果圖8為Southern分析結(jié)果圖9為轉(zhuǎn)基因煙草與空白對(duì)照的表型觀察圖10轉(zhuǎn)基因煙草和空白對(duì)照在短日照處理后表型變化圖11轉(zhuǎn)基因煙草及空白在高鹽和干旱條件下的變化
圖12掃描電鏡觀察轉(zhuǎn)基因煙草和空白的葉片細(xì)胞的大小圖13為農(nóng)桿菌浸染下胚軸法轉(zhuǎn)化大豆全過(guò)程圖14為轉(zhuǎn)基因大豆的PCR檢測(cè)結(jié)果圖15為轉(zhuǎn)基因大豆的RT-PCR檢測(cè)結(jié)果圖16轉(zhuǎn)基因以及干涉GmPLPl大豆陽(yáng)性植株的表現(xiàn)形態(tài)
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為自常規(guī)生化試劑商店購(gòu)買(mǎi)得到的。Marker均購(gòu)自大連寶生物公司。下述實(shí)施例中的％，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為質(zhì)量百分含量。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。實(shí)施例1、GmPLPl的克隆1、GmPLPl 的克隆1)植物總RNA的提取大豆(Glycine max (L.) Merri 11.)晚熟品種東農(nóng) L13 (Lin Zhao and Wenbin Li*(2008)A RAV-Iike transcription factor control photosynthesis and senescencein soybean. Planta. 227 :1389-1399，公眾可從東北農(nóng)業(yè)大學(xué)獲得。)，具有無(wú)限結(jié)莢習(xí)性，培養(yǎng)于25°C光照培養(yǎng)箱，250 μ mo 1 n^sec—1白光，長(zhǎng)日照(LD) (16h/ !光/暗) 條件下生長(zhǎng)，待第一個(gè)三出復(fù)葉展開(kāi)后(出苗后第10天)，開(kāi)始短日照(SD)光周期處理， (8h/16h光/暗)培養(yǎng)在處理后第15天，在黑暗/光照交替處時(shí)，樣本取材，剪取第三個(gè)三出復(fù)葉，液氮速凍，_80°C保存用于總RNA提取。按照Trizol的方法提取大豆總RNA ；2)引物設(shè)計(jì)設(shè)計(jì)如下引物，用于GmPLPl基因的RACE擴(kuò)增表1用于RACE擴(kuò)增的弓丨物序列基因正反義及巢式引物(sp) 引物序列(5’ 一 3’ )5，RACE 特異性引物(5，spl) CAGGAATGCTGGACCTCTTT5，RACE 反義引物(5，sp2) CCTCACTGTAATGGGTTAGCAC5，RACE 巢式引物(5，sp3) TTCGCTTCTCATCATCACTCGC3，RACE 正義引物(3，sp5) GTGAGGCGAGTGATGATGAGAA3，RACE 巢式引物(3，nsp) GCGAAGTGCTGTTACTGCCA3)第一鏈cDNA的合成按照Roche 5/3 RACE Kit, 2nd Generation 進(jìn)行在2個(gè)離心管中分別加入以下成分5， -RACE-Ready cDNAcDNA 合成緩沖液(vial 1)4 μ LRNA 樣本1 5 μ L (0. 2 2 μ g)dNTP Mix(via3)2μ LcDNA 合成特異引物 SPl (12. 5 μ Μ) 1 μ L
反轉(zhuǎn)錄酶(via2)1 μ L3， -RACE-Ready cDNAcDNA 合成緩沖液(vial 1)4 μ LRNA 樣本1 5 μ L (0. 2 2 μ g)dNTP Mix(via3)2μ LOligo dT-接頭引物(vial8)IyL反轉(zhuǎn)錄酶(via2)IuL加入去離子水至20μ L，上下吹吸混勻，快速離心，PCR儀上55°C溫浴lh，85°C溫浴 5min，快速離心使反應(yīng)物置于管底。4)按照 QIAGEN 公司 QIAquick PCR Purification Kit 進(jìn)行 cDNA 第一鏈純化5) cDNA末端加polyA尾反應(yīng)在0. 2ml小管中依次加入如下成分試劑成分加入量(PL)已純化好的cDNA第一鏈19IOX加尾反應(yīng)緩沖液(vial5) 2.52mM dATP(vial4)2.5震蕩充分混勻，簡(jiǎn)單離心，使各成分沉于管底，94°C孵育3min，迅速冰浴冷卻，簡(jiǎn)單離心沉淀各成分，加入Iul末端加尾酶(80U/ul)，(vial 6)，混勻后37°C溫育20min,加熱到70°C IOmin使加尾酶失活，置于冰上。6)制備 PCR Master 混合物PCR 級(jí)水36. 5yLOligo dT-接頭引物(vial 8) IyLdNTP Mix(IOmM) (vial 3)1 μ L10XLA PCR 緩沖液5yLLA Taq DNA 聚合酶 5U/ul0. 5 μ L總體積44 μ L注5，RACE力口入 IyL 5，sp2 弓 |物(12. 5 μ Μ)禾口 5 μ L 力口 polyA 尾 cDNA ;3，RACE 則加入1 μ L 3，sp5引物(12. 5 μ Μ)和純化cDNA。7)進(jìn)行PCR擴(kuò)增94°C 2min10 個(gè)循環(huán)94°C 30s, 65°C 30s，72°C 40s25 個(gè)循環(huán)94°C 30s，65°C 30s，72°C 3min72 °C 7min8)將第一輪PCR產(chǎn)物按1 : 50比例稀釋?zhuān)鳛槌彩絇CR模板，反應(yīng)體系不足加水補(bǔ)足，進(jìn)行巢式PCR，每個(gè)樣品各取SyL進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析結(jié)果如圖1，_20°C保存。9) PCR產(chǎn)物的純化和膠回收按照上海華舜生物工程有限公司的小量膠回收試劑盒回收DNA片斷，PCR產(chǎn)物連接到pGEM-T Vector (promega公司)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，挑選陽(yáng)性克隆測(cè)序。
10)全長(zhǎng)cDNA序列的獲得和基因系統(tǒng)進(jìn)化分析設(shè)計(jì)引物，在引物對(duì)中分別引入BamHI和Mc I酶切位點(diǎn)；全長(zhǎng)基因序列引物設(shè)計(jì)如表2所述表2GmPLPl全長(zhǎng)擴(kuò)增引物全長(zhǎng)基因引物引物序列(5’ 一 3’ )GmPLPl 正義引物 GCCGGATCCTTGCTGCGTAGGGGAATG (序列 4)GmPLPl 反義引物 CGCGAGCTCCAACAGAGAATGTTTTCTTAC (序列 5)按次序加入以下PCR反應(yīng)成分試劑每管加入量(μ L)3，RACE cDNA 第一鏈110 X PCR 緩沖液5dNTP Mix(IOmM)1GmPLPl 正義引物1GmPLPl 反義引物1PCR 級(jí)水40.5LA Taq 酶0.5總體積50進(jìn)行PCR反應(yīng)，條件為940C 5min ；35 個(gè)循環(huán)94°C 30s，60°C 30s，72°C 2. 5min ；72°C 5min每個(gè)樣品各取8μ L進(jìn)行0.8%瓊脂糖凝膠電泳分析結(jié)果見(jiàn)圖2，得到大小1784bp 的片段。IDGmPLPl全長(zhǎng)ORF區(qū)基因DNA序列的獲得用改良的CTAB法大量抽提大豆(Glycine max (L. )Merri 11.)東農(nóng)L13葉片基因組DNA作為模板，再以GmPLPl正義引物GCCGGATCCTTGCTGCGTAGGGGAATG、GmPLPl反義引物 CGCGAGCTCCAACAGAGAATGTTTTCTTAC 進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，PCR 反應(yīng)條件為先 94°C 5min ；再；35 個(gè)循環(huán)94°C 30s，64°C 30s, 72°C 3min ；再 72°C 5min ；得到的 3996bp 的片段，將 PCR 產(chǎn)物經(jīng)過(guò)電泳檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖3所示。將上述PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，該P(yáng)CR產(chǎn)物基因的序列為序列表中的序列1自5’末端第3-1706位核苷酸，將該基因命名為GmPLPl，該基因的編碼區(qū)為序列表中序列1自5’末端第345-1575位核苷酸序列，該基因編碼的蛋白命名為GmPLPl，該蛋白的氨基酸序列如序列表中的序列2。 將該P(yáng)CR產(chǎn)物連接到載體pGEMT (promega公司)中，得到中間載體pGEMT-GmPLP 1， 經(jīng)測(cè)序該中間載體為將序列表中序列1自5’末端第3-1706位核苷酸序列插入到載體 pGEMT 中。2、GmPLPl表達(dá)的檢測(cè)將大豆(Glycine max(L. )Merri 11.)東農(nóng)L13出現(xiàn)第一片三出復(fù)葉的幼苗，進(jìn)行如表3的處理，分別提取RNA，按照TaKaRa公司的Prime ScriptTM RT-SYBR Green kit進(jìn)行定量PCR檢測(cè)，引物為GmPLPl正義引物GCCGGATCCTTGCTGCGTAGGGGAATG、GmPLPl反義弓丨物 CGCGAGCTCCAACAGAGAATGTTTTCTTAC，定量 PCR 的結(jié)果如圖 4 和表 4 所示。
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表3為日長(zhǎng)、光質(zhì)、光強(qiáng)、激素等對(duì)大豆光受體基因表達(dá)影響轉(zhuǎn)移到短日照(SD)光周期下(》1/1^1光/暗)，轉(zhuǎn)移后的 3，6，9，12，15，18，21,24h,同時(shí)日長(zhǎng)處理對(duì)LD(8h/l^i光/暗)和SD葉片取材，以及轉(zhuǎn)入完全黑暗和完全光照0，1，2，3，4，5，6d葉片取材轉(zhuǎn)移到短日照條件下3d的材料，分別對(duì)根、莖、取材部位葉取材；待長(zhǎng)日照條件下大豆開(kāi)花時(shí)，再進(jìn)行短日照處理3d分別對(duì)花，種皮和種子取材對(duì)大豆施加外源激素，包括生長(zhǎng)素、細(xì)胞分裂素、激素誘導(dǎo)乙烯和赤霉素等，葉片取材表4為大豆不同器官在暗處理時(shí)基因相對(duì)表達(dá)豐度變化取材部位相對(duì)表達(dá)倍數(shù)取材部位相對(duì)表達(dá)倍數(shù)8h 花 22.428h 根0. 000186516h 花 9.95616h 根 20.318h 種皮 189.98h 蓮4. 82IMi 種皮 111.416h 莖 339.78h 種子 31.168h 葉41.22IMi 種子 46.7216h 葉 7.8528h 芽 0.0930416h 芽 8.四4其中圖4A中SD和LD分別表示在短日照和長(zhǎng)日照處理下大豆葉片GmPLPl基因豐度的變化，圖4B中Light和Dark分別表示大豆葉片GmPLPl基因在完全光照和完全黑暗條件下基因豐度變化，綜合表4和圖4可以看出，該基因在短日照條件下在葉片、花和種皮中積累，在其他部位則呈現(xiàn)下調(diào)表達(dá)，在光照條件轉(zhuǎn)變時(shí)呈現(xiàn)周期性變化，在短日照處理9小時(shí)時(shí)達(dá)到最高，在完全黑暗條件下GmPLPl基因表達(dá)迅速上升，在第2天達(dá)到最高。實(shí)施例2、過(guò)量表達(dá)GmPLPl基因的轉(zhuǎn)基因煙草植株的獲得和表型研究一、轉(zhuǎn)GmPLPl煙草的獲得1、農(nóng)桿菌雙元表達(dá)載體的構(gòu)建將由實(shí)施例1獲得的中間載體pGEMT-GmPLP 1用BamHI和Mc I雙酶切，得到的小片段與經(jīng)過(guò)同樣雙酶切的pBI121(購(gòu)自北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司，產(chǎn)品貨號(hào) MP-091)得到的載體大片的連接，得到的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5ci，得到的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行菌液PCR鑒定，引物為GmPLPl正義引物和GmPLPl反義引物，得到1784bp大小的為陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，將陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒進(jìn)行BamHI和Mc I雙酶切鑒定，得到1768bp大小片段的質(zhì)粒，再送去測(cè)序，結(jié)果為該質(zhì)粒為將序列表中序列1自5’末端第3-1706位核苷酸插入到 PBI121的RamHI和&ic I的酶切位點(diǎn)間得到的質(zhì)粒，將該質(zhì)粒命名為pBI121_GmPLPl。將 pBI121-GmPLPl轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404(購(gòu)自英竣公司，產(chǎn)品編號(hào)18313015)，經(jīng)過(guò)抗性篩選， 得到的轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果為該質(zhì)粒為pBI121-GmPLPl，將含有該質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子命名為 LBA4404/pBI 121-GmPLPl。
2、轉(zhuǎn)GmPLPl煙草的獲得(煙草葉盤(pán)轉(zhuǎn)化)將無(wú)菌煙草(Nicotianatabacum，品種為 Petite Havana SR1，購(gòu)自 LEHLE SEEDS, 產(chǎn)品編號(hào)NT-02，以下稱(chēng)為野生型煙草。)葉片切去邊緣和主要葉脈，切成大小Icm2的外植體；外植體在上述得的LBA4404/pBI121-GmPLPl菌液中浸泡IOmin ；用無(wú)菌濾紙吸干植物材料表面的菌液，將小葉片擺放在鋪有一層濾紙的芽分化培養(yǎng)基(MS+1.0mg/L 6-芐氨基喋呤+0. 2mg/L萘乙酸+100 μ M乙酰丁香酮+3%蔗糖+0. 8%瓊脂，pH5. 8,)上進(jìn)行共培養(yǎng)， 25°C暗培養(yǎng)3天；將經(jīng)過(guò)共培養(yǎng)的煙草外植體轉(zhuǎn)移到抗性芽篩選培養(yǎng)基(MS+1. Omg/L 6-芐氨基喋呤+0. 2mg/L萘乙酸+300mg/L卡那霉素+500mg/頭孢曲松鈉+3%蔗糖+0. 8%瓊脂， PH5.8，)進(jìn)行培養(yǎng)，光照周期為Wh/8h(光照/黑暗)，期間繼代一次，一月后即可生芽，待抗性芽生長(zhǎng)至Icm高時(shí)，切下小芽轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基(l/2MS+50mg/L卡那霉素+500mg/L頭孢曲松鈉+3%蔗糖+0.8%瓊脂，pH5. 8。)中誘導(dǎo)生根，一周后就會(huì)有不定根形成，得到40株 T0代轉(zhuǎn)GmPLPl煙草幼苗，具體過(guò)程見(jiàn)圖5，A為共培養(yǎng)時(shí)期煙草葉盤(pán)、B為轉(zhuǎn)基因煙草芽的誘導(dǎo)、C為轉(zhuǎn)基因煙草叢生芽、D為轉(zhuǎn)基因煙草的再生植株。3、轉(zhuǎn)GmPLPl煙草的鑒定Ttl代轉(zhuǎn)GmPLPl煙草幼苗移栽一周后，采取葉片并提取基因組DNA，進(jìn)行 PCR 鑒定(GmPLPl 正義弓丨物GCCGGATCCTTGCTGCGTAGGGGAATG ； GmPLPl 反義引物 CGCGAGCTCCAACAGAGAATGTTTTCTTAC)。反應(yīng)條件先 94°C 5min ；再 35 個(gè)循環(huán)94°C 30s, 60°C 30s, 72°C 2. 5min ；再72°C5min。以野生型煙草為對(duì)照。結(jié)果見(jiàn)圖6，圖中，M為DL2000， 1-11為T(mén)tl代轉(zhuǎn)GmPLPl煙草，ck為野生型煙草，結(jié)果為得到大小為1784bp的目的片段為陽(yáng)性Ttl代轉(zhuǎn)GmPLPl煙草，共得到20株Ttl代轉(zhuǎn)GmPLPl煙草植株。提取Ttl代轉(zhuǎn)GmPLPl煙草植株幼嫩葉片RNA，用GmPLPl正義引物、GmPLPl反義引物進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖7所示，1和2為T(mén)tl代轉(zhuǎn)GmPLPl煙草的RT-PCR結(jié)果，ck為野生型煙草，結(jié)果為得到大小為1784bp的目的片段，可以看出GmPLPl在Ttl代轉(zhuǎn)GmPLPl煙
草中表達(dá)。將Ttl代轉(zhuǎn)GmPLPl煙草植株自交產(chǎn)生的種子及由它所長(zhǎng)成的植株命名為T(mén)1代轉(zhuǎn) GmPLPl煙草植株，將T1代轉(zhuǎn)GmPLPl煙草植株自交后代命名為T(mén)2代轉(zhuǎn)GmPLPl煙草植株。采用同樣的方法將空載體pBI121轉(zhuǎn)入無(wú)菌煙草(Nicotiana tabacum，品種為 Petite Havana SRl)中，得到Ttl代轉(zhuǎn)pBI 121煙草植株，將Ttl代轉(zhuǎn)pBI 121煙草植株自交產(chǎn)生的種子及由它所長(zhǎng)成的植株命名為T(mén)1代轉(zhuǎn)pBI121煙草植株，將T1代轉(zhuǎn)pBI121煙草植株自交后代命名為1代轉(zhuǎn)pBI121煙草植株。采用上述方法進(jìn)行PCR鑒定(GmPLPl正義引物、 GmPLPl反義引物)，結(jié)果為外源的GmPLPl未轉(zhuǎn)入轉(zhuǎn)pBI 121煙草植株中。4、GmPLPl基因轉(zhuǎn)基因煙草的Southern分析將上述T2代轉(zhuǎn)GmPLP 1煙草植株、野生型煙草分別提取總DNA分別用RamHI， HindIII進(jìn)行酶切，酶切產(chǎn)物進(jìn)行0.7%瓊脂糖凝膠電泳(30-50V，0/N)常規(guī)方法在搖床上處理電泳膠，用20XSSC將DNA印跡到尼龍膜上，探針標(biāo)記、雜交、預(yù)雜交、洗膜均按照 DIGHigh Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit II (Roche)進(jìn)行。在黑暗下對(duì) X光片曝光。以T2代轉(zhuǎn)pBI121煙草植株為對(duì)照。結(jié)果如圖8 (M代表HindIII酶切XDNA 的分子量標(biāo)準(zhǔn)；P為BamHI和HindIII雙酶切pBI121_GmPLPl質(zhì)粒；1和2為轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株，ck為野生型煙草)所示，得到1784bp的條帶，可以看出GmPLPl外源基因已經(jīng)以單拷貝形式插入到煙草的基因組中。T2代轉(zhuǎn)pBI121煙草植株與野生型煙草的結(jié)果無(wú)顯著差異。二、GmPLPl基因轉(zhuǎn)基因煙草的表型觀察1、GmPLPl基因轉(zhuǎn)基因煙草形態(tài)分析將收獲的陽(yáng)性T2代轉(zhuǎn)GmPLPl煙草植株和野生型煙草種子種在含有10% (質(zhì)量百分含量)草炭土的泥土中，25°C，250ymol m^sec"1白光，長(zhǎng)日照(16h/ !光/暗)光照培養(yǎng)箱條件，培養(yǎng)100天，得到煙草成熟植株，觀察煙草成熟植株的形態(tài)(見(jiàn)圖9)。統(tǒng)計(jì)陽(yáng)性 T2代轉(zhuǎn)GmPLPl煙草植株和野生型煙草植株的形態(tài)，包括株高，葉片大小(葉面積)，節(jié)數(shù)，節(jié)間距，開(kāi)花時(shí)間，莖直徑，分枝情況的差異，以T2代轉(zhuǎn)PBI121煙草為對(duì)照，其中，陽(yáng)性T2代轉(zhuǎn) GmPLPl 煙草植株共 8 株，編號(hào)分別為 GmPLP 1-A、GmPLP 1-B、GmPLPl-C、GmPLPl-D、GmPLPl-E、 GmPLPl-F, GmPLP 1-G-GmPLP 1-H，野生型煙草共 7 株，編號(hào)分別為 ck_l、ck_2、ck_3、ck_4、 ck-5、ck-6、ck-7 ；T2 代轉(zhuǎn) PBI121 煙草共 7 株。具體統(tǒng)計(jì)數(shù)值見(jiàn)表5:表5轉(zhuǎn)基因煙草的表型觀察編號(hào)株高節(jié)間距葉面積莖直徑節(jié)數(shù)開(kāi)花時(shí)間是否(cm) (cm) (cm2) (mm) (天)分枝ck-165.8 3.1 89.21 9.2 29 95否ck-262. 5 2.8 92. 54 8.6 25 90否ck-361.2 2.9 90.5 8.2 28 93否ck-459.7 2.9 87.37 8.3 28 92否ck-560. 1 2. 7 86.83 9.0 27 90否ck-666. 3 3.2 93.46 9.4 25 94否ck-758. 2 2.8 83.69 8. 2 25 91否GmpPLPl-A 45.8 1.6 63.6 6. 2 26 122否GmpPLPl-B 50. 2 2.1 58. 2 6.5 24 119否GmpPLPl-C 46. 7 1.9 55.4 5.9 25 108是GmpPLPl-D 44. 3 1.6 59. 1 6.1 25 118是GmpPLPl-E 47. 2 1.9 60.8 6. 1 27 120否GmpPLPl-F 43.4 1.5 53. 3 6 26 115是GmpPLPl-G 47. 5 1.8 56. 5 6.6 25 117否GmpPLPl-H 44.6 1.5 52. 2 6.4 27 112是野生型煙草以及T2代轉(zhuǎn)PBI121煙草植株結(jié)果無(wú)顯著差異。拍照觀察見(jiàn)圖9所示，其中，圖中，從左邊起前3株為野生型煙草植株(CK)，剩余4 株為陽(yáng)性T2代轉(zhuǎn)GmPLPl煙草植株。其中，畫(huà)圈的為分枝的部位。結(jié)合表5和圖9，可以看出與野生型煙草相比，T2代轉(zhuǎn)GmPLPl煙草植株矮小，葉片同時(shí)變小，節(jié)間距縮短，開(kāi)花時(shí)間延長(zhǎng)，并且出現(xiàn)分枝，分枝數(shù)在兩個(gè)或以上的植株占50% 比例。野生型煙草以及T2代轉(zhuǎn)ΡΒΙ121煙草植株結(jié)果無(wú)顯著差異。2、GmPLPl基因轉(zhuǎn)基因煙草暗處理后的形態(tài)分析上述在10%草炭土的泥土中，25 OdSOym0Im2sec-1白光，長(zhǎng)日照(16h/8h光/ 暗)光照培養(yǎng)箱條件生長(zhǎng)30天的陽(yáng)性T2代轉(zhuǎn)GmPLPl煙草和野生型煙草各取5株，轉(zhuǎn)移到25°C,250ymol n^sec—1白光，短日照光/暗)光照培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)15天后，分別統(tǒng)計(jì)長(zhǎng)日照和短日照下此時(shí)葉片面積和節(jié)間距如下，結(jié)果取平均值，以T2代轉(zhuǎn)PBI121煙草為對(duì)照。短日照處理下陽(yáng)性T2代轉(zhuǎn)GmPLPl煙草植株葉片面積為32. 9cm2，節(jié)間距為0. 6cm, 野生型煙草葉片面積為13. Scm2，節(jié)間距為0. 4cm,而長(zhǎng)日照條件下45天生長(zhǎng)的陽(yáng)性T2代轉(zhuǎn) GmPLPl煙草植株葉片面積為18. Scm2，節(jié)間距為1. 1cm，野生型煙草葉片面積為24. 2cm2，節(jié)間距為1. 6cm，可以看出，陽(yáng)性T2代轉(zhuǎn)GmPLPl煙草植株經(jīng)過(guò)短日照處理葉片增大而野生型煙草植株葉片減小，節(jié)間距縮小的程度卻小于野生型煙草植株。拍照如圖10所示，從左邊起依次為短日照處理野生型煙草植株、短日照處理陽(yáng)性 T2代轉(zhuǎn)GmPLPl煙草，長(zhǎng)日照下野生型煙草、長(zhǎng)日照下陽(yáng)性T2代轉(zhuǎn)GmPLPl煙草。從圖10中看出，與長(zhǎng)日照處理的植株相比，短日照處理的植株的根系均小而短。野生型煙草和T2代轉(zhuǎn)PBI121煙草植株結(jié)果無(wú)顯著差異。三、轉(zhuǎn)GmPLPl煙草的生理檢測(cè)1、轉(zhuǎn)GmPLPl煙草光合速率的測(cè)定(光合速率和煙草的生長(zhǎng)狀態(tài)有關(guān))將10%草炭土的泥土中，25°C，長(zhǎng)日照(16h/ !光/暗)光照培養(yǎng)箱條件生長(zhǎng)80 天陽(yáng)性T2代轉(zhuǎn)GmPLPl煙草植株和野生型植株在人工氣候培養(yǎng)倉(cāng)(光強(qiáng)250 μ moln^sec—1) 進(jìn)行光合速率的測(cè)定，選用Lico-6400光合速率儀進(jìn)行測(cè)量，重復(fù)三次，以T2代轉(zhuǎn)PBI121煙草為對(duì)照，測(cè)量植株各八株。方法為使用該光合速率儀直接進(jìn)行葉片活體測(cè)量即可。檢測(cè)結(jié)果如下陽(yáng)性T2 代轉(zhuǎn)GmPLPl煙草植株的光合速率為3. 452 士0. 026 μ mol dm^h"1,野生型植株光合速率為 3. 246士0. 071 μ mol (ΙιΛ—1，陽(yáng)性T2代轉(zhuǎn)GmPLPl煙草植株光合速率比T2代轉(zhuǎn)ΡΒΙ121煙草植株高。野生型煙草和T2代轉(zhuǎn)ΡΒΙ121煙草植株結(jié)果無(wú)顯著差異。2、轉(zhuǎn)基因煙草葉綠素含量的測(cè)定為了驗(yàn)證是否光合速率能否增強(qiáng)，進(jìn)行了葉綠素含量測(cè)定。將上述1中得到的生長(zhǎng)80天的陽(yáng)性T2代轉(zhuǎn)GmPLPl煙草植株和野生型煙草植株避開(kāi)葉脈分別剪取0. 2g新鮮葉片，碾磨后用80%丙酮(體積百分含量)抽提葉綠素，加80%丙酮定容到25ml，用分光光度計(jì)分別測(cè)定在波長(zhǎng)665歷、649歷、470歷下吸光值。根據(jù)公式Ca = 12. 21A663_2. 8IA646 ；Cb =20. 13Α646-5 · 03Α663 ；葉綠體色素質(zhì)量分?jǐn)?shù)(mg/g) = 25ml XCX 10_3XW，計(jì)算，以 T2 代轉(zhuǎn) PBI121煙草為對(duì)照。結(jié)果為陽(yáng)性T2代轉(zhuǎn)GmPLPl煙草植株的總?cè)~綠素總含量為1. 4 士0. Ol^iig/g，野生型植株的總?cè)~綠素含量1.357士0.0i;3mg/g，看出，陽(yáng)性T2代轉(zhuǎn)GmPLPl煙草植株比野生型煙草植株的葉綠素含量略高。野生型煙草和T2代轉(zhuǎn)PBI121煙草植株結(jié)果無(wú)顯著差異。3、轉(zhuǎn)基因煙草各類(lèi)激素含量的測(cè)定為了揭示轉(zhuǎn)該基因植物分枝增加的原因，測(cè)量了陽(yáng)性T2代轉(zhuǎn)GmPLPl煙草植株和野生型煙草植株各類(lèi)激素含量的變化。采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)進(jìn)行激素含量測(cè)定。以1~2代轉(zhuǎn)PBI121煙草為對(duì)照。取10%草炭土的泥土中，25°C，長(zhǎng)日照(16h/ !光/暗)光照培養(yǎng)箱條件生長(zhǎng)50 天T2代GmPLPl轉(zhuǎn)基因和對(duì)照煙草新鮮葉片各0. 5g加入2ml樣品提取液(80%甲醇內(nèi)含 lmmol/L 二叔丁基對(duì)甲苯酚)，冰浴研磨成勻漿，轉(zhuǎn)入IOmL試管中，放置4°C中提取過(guò)夜，3500rpm離心Smin取上清，過(guò)C-18固相萃取柱，過(guò)柱純化樣品轉(zhuǎn)入5mL管中，用氮?dú)獯蹈桑?用樣品稀釋液(500mL磷酸緩沖液加入0. 5mL Tween-20,0. 5g明膠)定容至5mL，含有各個(gè)激素抗體的酶標(biāo)板(購(gòu)自北京北農(nóng)為天生物技術(shù)有限公司)上每孔上樣50uL，37°C競(jìng)爭(zhēng) 0. 5h，洗板，加入底物顯色，在酶聯(lián)免疫分光光度計(jì)上測(cè)定吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得出各個(gè)激素的含量。各取3個(gè)樣品，三次重復(fù)，取平均值士標(biāo)準(zhǔn)差。測(cè)定結(jié)果如表6所示表6轉(zhuǎn)基因煙草激素含量激素含量(ng/g · fw)類(lèi)型吲哚乙酸赤霉素脫落酸玉米素轉(zhuǎn)基因煙草5185. 13 士 14. 02 6127. 73 士 34. 86 8166. 50 士 14. 96 722. 96 士 20. 99空白煙草3783. 43士7. 40 5735. 63士24. 53 6826. 02士21. 00 818. 52士 12. 44從上表可以看出，與野生型煙草植株相比，T2代轉(zhuǎn)GmPLPl煙草植株的各種激素水平除了玉米素其他均有上升趨勢(shì)數(shù)脫落酸上升最多。野生型煙草和T2代轉(zhuǎn)PBI121煙草植株結(jié)果無(wú)顯著差異。四、轉(zhuǎn)基因煙草的逆境脅迫為了確定該基因是否可以啟動(dòng)逆境應(yīng)答反應(yīng)，進(jìn)行了以下的逆境實(shí)驗(yàn)將陽(yáng)性T2代轉(zhuǎn)GmPLPl煙草植株和野生型煙草植株在10%草炭土的泥土中，25°C， 長(zhǎng)日照(16h/ !光/暗)光照培養(yǎng)箱條件生長(zhǎng)50天后再做以下處理；未處理組上述苗不經(jīng)任何處理繼續(xù)在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)Mh0. 5M NaCl處理組將上述苗洗干凈泥土，盡量避免損壞根，轉(zhuǎn)移到含有0. 5M NaCl 的完全培養(yǎng)液(含有MS培養(yǎng)基大量鹽和鐵鹽成分)中充氧水培，其他條件不變繼續(xù)培養(yǎng) 24h ；20% PEG處理組將上述苗洗干凈泥土，盡量避免損壞根，轉(zhuǎn)移到含有20% PEG的完全培養(yǎng)液(含有MS培養(yǎng)基大量鹽和鐵鹽成分)中充氧水培，其他條件不變繼續(xù)培養(yǎng)Mh ； (PEG是種滲透劑，可以改變植物體內(nèi)外的滲透壓，阻止植物吸水，相當(dāng)于是干旱處理)高溫(42°C)處理組將上述苗移到溫度為42°C的高溫培養(yǎng)箱中，其他培養(yǎng)條件不變繼續(xù)培養(yǎng)Mh ；低溫)處理組將上述苗移到溫度為4°C的低溫培養(yǎng)箱中，其他培養(yǎng)條件不變繼續(xù)培養(yǎng)Mh ；以上各組均以T2代轉(zhuǎn)PBI121煙草植株為對(duì)照。A 觀察植株萎蔫程度結(jié)果見(jiàn)圖11所示，圖中為兩組，左邊兩個(gè)為高鹽處理組，右邊兩個(gè)為干旱處理組，T2代轉(zhuǎn)GmPLPl煙草植株為GmPLPl，野生型煙草植株為CK，可以看出0. 5M NaCl處理24h后T2代轉(zhuǎn)GmPLPl煙草嚴(yán)重萎蔫，野生型煙草剛開(kāi)始出現(xiàn)萎蔫現(xiàn)象，20% PEG處理24h后的T2代轉(zhuǎn)GmPLPl煙草葉片出現(xiàn)萎蔫，而野生型煙草生長(zhǎng)正常，都表明過(guò)量表達(dá)GmPLPl基因的T2代轉(zhuǎn)GmPLPl煙草對(duì)高鹽和干旱的抵抗能力降低。野生型煙草和T2代轉(zhuǎn)PBI121煙草植株結(jié)果無(wú)顯著差異。B 轉(zhuǎn)基因煙草葉片細(xì)胞大小和氣孔密度的觀察將陽(yáng)性T2代轉(zhuǎn)GmPLPl煙草植株和野生型煙草植株在10%草炭土的泥土中，25°C， 長(zhǎng)日照(16h/ !光/暗)光照培養(yǎng)箱條件生長(zhǎng)50天，分別取第四節(jié)處的葉片避開(kāi)葉脈切成大小約Icm2大小的葉片，放入戊二醛固定液中，真空固定Mh，分別經(jīng)20% JO^jO^i、 80%,90%U00%乙醇置換后，再經(jīng)叔丁醇置換，冷凍干燥后用掃描電鏡觀察。以T2代轉(zhuǎn) PBI121煙草植株為對(duì)照。觀察結(jié)果見(jiàn)圖12 (圖12中張開(kāi)的一個(gè)個(gè)小洞就是氣孔，張開(kāi)的氣孔數(shù)目直接與抗旱作用相關(guān)，如果是抗旱的話氣孔數(shù)目會(huì)減少。)，圖中，空白煙草為野生型煙草，GmPLPl轉(zhuǎn)基因煙草為陽(yáng)性T2代轉(zhuǎn)GmPLPl煙草，可以看出，與野生型煙草植株相比，陽(yáng)性T2代轉(zhuǎn)GmPLPl煙草植株細(xì)胞明顯變小，因此，推測(cè)，轉(zhuǎn)基因煙草及后代矮小是由于細(xì)胞變小所制。轉(zhuǎn)基因煙草葉片單位面積上氣孔數(shù)目并無(wú)變化再次證實(shí)該基因并不參加抗旱反應(yīng)。野生型煙草和T2代轉(zhuǎn)PBI121煙草植株結(jié)果無(wú)顯著差異。C、轉(zhuǎn)基因煙草脯氨酸含量、根系活力、SOD舌性的測(cè)定分別測(cè)定了在高溫(42°C )、低溫) >20% PEG、5M NaCl處理下陽(yáng)性T2代轉(zhuǎn) GmPLPl煙草植株及野生型煙草植株的脯氨酸含量、根系活力、SOD活性的變化。測(cè)定方法參照《植物生理實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)》(郝再彬，倉(cāng)晶，徐仲.哈爾濱工業(yè)大學(xué)出版社，2006年2月第2 版。)該書(shū)中全部記載了脯氨酸含量、根系活力、SOD活性的詳細(xì)檢測(cè)方法)，各株系各有5 株，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，結(jié)果取平均值士標(biāo)準(zhǔn)差。測(cè)定結(jié)果如表7所示，CK為野生型煙草植株， 轉(zhuǎn)基因植株為陽(yáng)性T2代轉(zhuǎn)GmPLPl煙草植株。野生型煙草和T2代轉(zhuǎn)PBI121煙草植株結(jié)果無(wú)顯著差異。表7高鹽，干旱，高溫和低溫條件下轉(zhuǎn)基因植株的脯氨酸含量、根系活力和SOD活性變化處理方法未處理20% PEG 5MNaCl低溫高溫生理值變轉(zhuǎn)基轉(zhuǎn)基轉(zhuǎn)基轉(zhuǎn)基轉(zhuǎn)基化CK 因煙 CK 因煙 CK 因煙 CK 因煙 CK 因煙草草草草草脯氨酸含 13.81 12.22 14.80 10.25 15.75 7.95 19.76 11.92 14.55 4.87量(yg/g) 士士 士士 士士士士 士士0.36 0.23 0.36 0.38 0.30 0.09 0.30 0.31 0.31 0.26根系活為 0.268 0.207 0.284 0.216 0.321 0.287 0.560 0.542 0.296 0.282mg/g *h 士士士士士士士士士士0.009 0.015 0.005 0.007 0.007 0.006 0.014 1.012 0.003 0.003SOD 活性 0.815 0.614 1. 234 1. 150 1. 105 0.924 0.814 0. 733 1. 754 1.646U/g士士士士士士士士士士0.042 0.011 0.028 0.033 0.078 0.029 0.008 0.002 0.020 0.007結(jié)果顯示在高鹽，干旱，高溫和低溫條件下，轉(zhuǎn)基因煙草的脯氨酸含量比野生型煙草植株低，根系活力增加幅度也小于野生型煙草植株，SOD酶活性活力比野生型煙草植株要小，再次驗(yàn)證了過(guò)量表達(dá)該基因降低了植物對(duì)逆境適應(yīng)能力(在逆境脅迫下，脯氨酸、根系活力、SOD酶活性都應(yīng)該大幅度提高以抵御不良環(huán)境對(duì)植物細(xì)胞的破壞，這些值升高的越少，對(duì)逆境的適應(yīng)能力就越低。)。實(shí)施例3、過(guò)量表達(dá)GmPLPl基因的轉(zhuǎn)基因大豆植株的獲得和表型研究一、GmPLPl過(guò)表達(dá)大豆的獲得
1、下胚軸轉(zhuǎn)化法將大豆(Glycine max(L. )Merri 11.)(品種黑農(nóng)44，購(gòu)自北大荒種業(yè)集團(tuán)有限公司，以下成為野生型大豆。)氯氣滅菌16小時(shí)后，種植于萌發(fā)培養(yǎng)基(MS+3%蔗糖+0.8% 瓊脂，pH5. 8)，七天后切取Icm長(zhǎng)的下胚軸作為外植體，在由實(shí)施例2中得到的LBA4404/ pBI121-GmPLPl菌液中浸泡30min ；用無(wú)菌濾紙吸干植物材料表面的菌液，將下胚軸平放在鋪有一層濾紙的共培養(yǎng)培養(yǎng)基(1/2MS大量鹽+MS鐵鹽+1. 67mg/L 6-芐氨基喋呤+40 μ M 乙酰丁香酮+lmg/L硫代硫酸鈉+lmg/L半胱氨酸+1. Omg/L 二硫蘇糖醇+3%蔗糖+0. 8%瓊脂，PH5.6，)上；25°C暗培養(yǎng)3天；將共培養(yǎng)后的下胚軸轉(zhuǎn)移至芽分化培養(yǎng)基(1/2MS大量鹽 +MS鐵鹽+3mg/L 6-BA+3%蔗糖+20mg/L頭孢曲松鈉+0. 8%瓊脂，pH5. 8)，生長(zhǎng)點(diǎn)朝上插入培養(yǎng)基中，培養(yǎng)一周，光照周期為Wh/8h (光照/黑暗)；之后轉(zhuǎn)移至芽篩選培養(yǎng)基(1/2MS 大量鹽+MS鐵鹽+lmg/L 6-芐氨基喋呤+0. 2mg/L吲哚-3- 丁酸+75mg/L卡那霉素+20mg/ L頭孢曲松鈉+3%蔗糖+0. 8%瓊脂，pH5. 8,)培養(yǎng)1_2月，期間每隔10天繼代一次，直至抗性芽生長(zhǎng)至Icm高時(shí)，切下小芽轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基(1/2MS大量鹽+MS鐵鹽+lmg/L吲哚-3-丁酸+75mg/L卡那霉素+20mg/L頭孢曲松鈉+3%蔗糖+0. 8%瓊脂，pH5. 8)，15天后形成不定根，移栽得到12株Ttl代過(guò)量表達(dá)GmPLPl大豆幼苗，過(guò)程見(jiàn)圖13。2、分子鑒定Ttl代過(guò)量表達(dá)GmPLPl大豆幼苗移栽一周后，采取葉片并提取基因組DNA， 進(jìn)行PCR鑒定。由于在大豆基因組中存在GmPLPl基因，因此PCR鑒定采用的引物是35SCaMV啟動(dòng)子和基因結(jié)合引物(正義引物ATGACGCACAATCCCACTATCC ；反義引物 GAACCCGAAATCCCTCACTCC)。反應(yīng)條件94°C 5min ；35 個(gè)循環(huán)94°C 20s, 58°C 30s, 72°C Imin ； 72°C 5min。結(jié)果見(jiàn)圖14，質(zhì)粒為pBI121_GmPLPl，1_5為T(mén)tl代過(guò)量表達(dá)GmPLPl大豆植株， ck為野生型大豆，得到大小為668bp的片段為陽(yáng)性Ttl代過(guò)量表達(dá)GmPLPl大豆植株，共得到 3株陽(yáng)性Ttl代過(guò)量表達(dá)GmPLPl大豆植株，將Ttl代轉(zhuǎn)GmPLPl大豆植株自交產(chǎn)生的種子及由它所長(zhǎng)成的植株命名為T(mén)1代過(guò)量表達(dá)GmPLPl大豆植株，將T1代過(guò)量表達(dá)GmPLPl大豆植株自交后代命名為T(mén)2代過(guò)量表達(dá)GmPLPl大豆植株。采用同樣的方法將空載體pBI121轉(zhuǎn)入大豆(黑農(nóng)44)中，得到Ttl代轉(zhuǎn)pBI121 大豆植株，將Ttl代轉(zhuǎn)GmPLPl大豆植株自交產(chǎn)生的種子及由它所長(zhǎng)成的植株命名為T(mén)1代轉(zhuǎn)pBI121大豆植株，將T1代轉(zhuǎn)pBI121大豆植株自交后代命名為T(mén)2代轉(zhuǎn)pBI121大豆植株。采用上述方法進(jìn)行PCR鑒定(正義引物ATGACGCACAATCCCACTATCC ；反義引物 GAACCCGAAATCCCTCACTCC)，結(jié)果為外源的GmPLPl未轉(zhuǎn)入轉(zhuǎn)pBI121大豆植株中。將上述得到的T2代過(guò)量表達(dá)GmPLPl大豆幼嫩葉片，提取RNA進(jìn)行RT-PCR。T2代過(guò)量表達(dá)GmPLPl大豆植株用PBI121載體上的選擇標(biāo)記基因NPTII的引物(具體序列見(jiàn)表 8)，鑒定結(jié)果見(jiàn)圖15，圖15中，質(zhì)粒為pBI121-GmPLPl，其余泳道均為T(mén)2代過(guò)量表達(dá)GmPLPl 大豆植株，ck為野生型大豆，結(jié)果為得到661bp的片段，表明，外源GmPLPl可在大豆中過(guò)表達(dá)。表8轉(zhuǎn)基因大豆鑒定所用引物NPTII基因引物引物序列(5’ 一 3’ )正義引物GATTGCACGCAGGTTCTCC反義引物CGGGTAGCCAACGCTATGTC
二、GmPLPl基因過(guò)量表達(dá)大豆的表型觀察將T2代過(guò)量表達(dá)GmPLPl大豆和野生型大豆植株在10 %草炭土的泥土中，25°C， 長(zhǎng)日照(16h/ !光/暗)光照培養(yǎng)箱條件生長(zhǎng)90天，觀察T2代過(guò)量表達(dá)GmPLPl大豆植株和野生型大豆植株的形態(tài)差異，具體數(shù)據(jù)如下統(tǒng)計(jì)T2代過(guò)量表達(dá)GmPLPl植株和野生型的株高，葉片大小(葉面積)，節(jié)數(shù)，節(jié)間距，開(kāi)花時(shí)間，莖直徑，分枝情況的差異，以T2代轉(zhuǎn)pBI121大豆植株為對(duì)照，其中，陽(yáng)性T2代過(guò)量表達(dá)GmPLPl煙草植株共3株，編號(hào)分別為 GmPLPl-I、GmPLP 1-2, GmPLPl-3，野生型大豆共 3 株，編號(hào)分別為 ck_l、ck_2、ck_3 ；T2 代轉(zhuǎn) PBI121大豆共3株。具體統(tǒng)計(jì)數(shù)值見(jiàn)表9:表9過(guò)量表達(dá)GmPLPl大豆的表型觀察編號(hào)株高節(jié)間距葉面積莖直徑節(jié)數(shù)開(kāi)花時(shí)間是否(cm) (cm) (cm2)(mm)(天)分枝ck-1 46. 8 7. 1 45. 59 4. 2 6 47否ck-2 46. 9 6. 5 48. 13 4. 5 5 46否ck-3 47. 2 5. 2 49. 22 4. 0 5 48否GmPLPl-I 64. 2 6.8 76. 14 4. 2 9 42是GmPLP 1-2 68.4 8. 1 60. 26 4.0 8 39是GmPLP 1-3 59. 2 9. 7 68. 57 4. 2 7 41否野生型大豆以及T2代轉(zhuǎn)PBI121大豆植株結(jié)果無(wú)顯著差異。拍照如圖16所示，其中，A為陽(yáng)性T2代過(guò)量表達(dá)GmPLPl大豆，B為野生型大豆， 結(jié)合表9和圖16可以看出，與野生型大豆植株相比，T2代過(guò)量表達(dá)GmPLPl大豆植株分枝增力口，但是植株高大，葉片變大，花期和成熟期均提前。成熟期是指全株90%或100%干莢時(shí)間，在T2代過(guò)量表達(dá)GmPLPl大豆植株在大約95天時(shí)葉片和莢已經(jīng)開(kāi)始黃化進(jìn)入熟期，比對(duì)照植株的成熟期很明顯提早將近7-10天左右。野生型大豆(黑農(nóng)44)與1~2代轉(zhuǎn)PBI121 大豆植株的結(jié)果無(wú)顯著差異。從上述實(shí)驗(yàn)可以看出，轉(zhuǎn)化的煙草(Nicotiana tabacum,品種為Petite HavanaSRl為一種長(zhǎng)日照作物)和大豆((Glycine max(L.)Merri 11.品種黑農(nóng)44為一種短日照作物)是兩種不同光周期性植物，過(guò)量表達(dá)該基因在這兩種作物上對(duì)開(kāi)花時(shí)間和植株形態(tài)的改變是正好相反的。
1權(quán)利要求
1.一種蛋白質(zhì)，是如下1)或幻的蛋白質(zhì)1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；2)將序列2的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物性狀相關(guān)的由1)衍生的蛋白質(zhì)；所述植物性狀為如下1)-10)中的至少一種1)分枝數(shù)；2)開(kāi)花時(shí)間；3)株高；4)葉片面積；5)節(jié)間距；6)根長(zhǎng)；7)光合速率；8)耐逆性；9)莖直徑；10)節(jié)數(shù)。
2.權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)的編碼基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述編碼基因，其特征在于所述編碼基因?yàn)槿缦?)、2)、3)、4) 或5)的基因1)序列表中序列1所示的DNA分子；2)序列表中序列1自5’末端第3-1706位核苷酸所示的DNA分子；3)序列表中序列1自5，末端的第345-1575位核苷酸所示的DNA分子；4)在嚴(yán)格條件下與1)或幻或幻限定的DNA分子雜交且與植物性狀相關(guān)蛋白編碼基因的DNA分子；5)與1)或2)或3)限定的DNA序列至少具有80%同源性且與植物性狀相關(guān)蛋白編碼基因的DNA分子；所述植物性狀為如下1)-8)中的至少一種1)分枝數(shù)；2)開(kāi)花時(shí)間；3)株高；4)葉片面積；5)節(jié)間距；6)根長(zhǎng)；7)光合速率；8)耐逆性。
4.含有權(quán)利要求2或3所述編碼基因的重組載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系、重組菌或表達(dá)盒。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組載體或重組菌，其特征在于所述重組載體為在載體 PBI121的多克隆位點(diǎn)插入權(quán)利要求2或3所述編碼基因得到的重組載體；所述重組菌為將權(quán)利要求4所述的重組載體導(dǎo)入宿主菌得到的重組菌。
6.擴(kuò)增權(quán)利要求2或3所述編碼基因全長(zhǎng)或任一片段的引物對(duì)，所述引物對(duì)如下所示 一條引物序列如序列表中序列4所示，另一條引物序列如序列表中序列5所示。
7.一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，為將權(quán)利要求2或3所述的編碼基因?qū)肽康闹参锏玫降霓D(zhuǎn)基因植物，所述轉(zhuǎn)基因植物為如下1)-6)中的至少一種1)所述轉(zhuǎn)基因植物的分枝數(shù)多于所述目的植物；2)所述轉(zhuǎn)基因植物的開(kāi)花時(shí)間早于所述目的植物；3)所述轉(zhuǎn)基因植物的株高高于所述目的植物；4)所述轉(zhuǎn)基因植物的葉片面積大于所述目的植物；5)所述轉(zhuǎn)基因植物的節(jié)間距大于所述目的植物；6)所述轉(zhuǎn)基因植物的節(jié)數(shù)多于所述目的植物；所述目的植物為短日照植物，所述短日照植物優(yōu)選為大豆。
8.一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，為將權(quán)利要求2或3所述的編碼基因?qū)肽康闹参锏玫降霓D(zhuǎn)基因植物，所述轉(zhuǎn)基因植物為如下1)-8)中的至少一種1)所述轉(zhuǎn)基因植物的分枝數(shù)多于所述目的植物；2)所述轉(zhuǎn)基因植物的開(kāi)花時(shí)間晚于所述目的植物；3)所述轉(zhuǎn)基因植物的株高低于所述目的植物；4)所述轉(zhuǎn)基因植物的葉片面積小于所述目的植物；5)所述轉(zhuǎn)基因植物的節(jié)間距短于所述目的植物；6)所述轉(zhuǎn)基因植物的莖直徑小于所述目的植物；7)所述轉(zhuǎn)基因植物的光合速率高于所述目的植物；8)所述轉(zhuǎn)基因植物的耐逆性低于所述目的植物。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于所述轉(zhuǎn)基因植物的分枝數(shù)多于所述目的植物體現(xiàn)在所述轉(zhuǎn)基因植物中的激素含量均高于所述目的植物；所述激素為吲哚乙酸、赤霉素、脫落酸或玉米素；所述轉(zhuǎn)基因植物的光合速率高于所述目的植物體現(xiàn)在所述轉(zhuǎn)基因植物葉片的葉綠素高于所述目的植物；所述耐逆性為耐高鹽、耐干旱、耐高溫和/或耐低溫； 所述轉(zhuǎn)基因植物的耐逆性低于所述目的植物為如下1)-3)中至少一種1)所述轉(zhuǎn)基因植物脯氨酸含量低于所述目的植物；2)所述轉(zhuǎn)基因植物根系活力低于所述目的植物；2)所述轉(zhuǎn)基因植物超氧化物歧化酶酶活性低于所述目的植物；所述高溫為42°C，所述低溫為4°C ；所述目的植物為長(zhǎng)日照植物，所述長(zhǎng)日照植物優(yōu)選為煙草。
10.權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)在育種中的應(yīng)用，或權(quán)利要求2或3所述編碼基因在育種中的應(yīng)用，或權(quán)利要求4或5所述重組載體在育種中的應(yīng)用，或權(quán)利要求4或5所述重組菌在育種中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種大豆光受體GmPLP1及其編碼基因與應(yīng)用。本發(fā)明提供的蛋白質(zhì)，命名為GmPLP1，是如下1)或2)的蛋白質(zhì)1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；2)將序列2的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物性狀相關(guān)的由1)衍生的蛋白質(zhì)；所述植物性狀為如下1)-10)中的至少一種1)分枝數(shù)；2)開(kāi)花時(shí)間；3)株高；4)葉片面積；5)節(jié)間距；6)根長(zhǎng)；7)光合速率；8)耐逆性；9)莖直徑；10)節(jié)數(shù)。本發(fā)明的光受體基因GmPLP1可應(yīng)用在改變植株形態(tài)，增加植株分枝，改變植株的開(kāi)花和成熟時(shí)間，對(duì)于植物育種和光受體基因的功能及作用機(jī)理研究具有重要意義。
文檔編號(hào)C12N1/15GK102453084SQ20101052600
公開(kāi)日2012年5月16日 申請(qǐng)日期2010年10月25日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月25日
發(fā)明者李文濱, 羅秋蘭, 趙琳, 韓英鵬 申請(qǐng)人:東北農(nóng)業(yè)大學(xué)