專利名稱：IFN-γ受體基因(B8R)缺失的天壇株重組痘苗病毒及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及IFN-γ受體基因(B8R)缺失的天壇株重組痘苗病毒減毒載體以及基于此載體構(gòu)建的表達HIV-1各種抗原(單價及多價)的IFN-γ受體基因(B8R)缺失的天壇株重組痘苗病毒艾滋病疫苗。本發(fā)明的天壇株重組痘苗病毒減毒載體能夠顯著降低痘苗病毒載體的毒力，可以用于構(gòu)建表達同一病原多種抗原、不同病原多種抗原的多價重組痘苗病毒。本發(fā)明的重組痘苗病毒艾滋病疫苗能夠誘導(dǎo)高水平的抗人類免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus，HIV)的體液和細胞免疫應(yīng)答，并有效提高重組痘苗病毒艾滋病疫苗的安全性及免疫原性。
背景技術(shù)：
痘苗病毒天壇株(vaccine virus TianTan strain，VTT)為我國消滅天花作出巨大貢獻，在活載體疫苗研究應(yīng)用也十分活躍，重組痘苗病毒疫苗具有效果好、對熱穩(wěn)定性好，接種方便，不需佐劑等優(yōu)點，然而痘苗病毒接種人體后產(chǎn)生較重的局部反應(yīng)，特別是在一定比例的免疫缺陷患者中可引起嚴重的并發(fā)癥。表達某些免疫原的重組痘苗病毒未能達到理想的免疫效果，如何能在增強重組痘苗病毒的免疫原性同時進一步提高痘苗病毒載體的安全性，學(xué)者們作出很多深入的研究。隨著新的病毒疾病不斷出現(xiàn)，對宿主抗病毒免疫機理的深入了解，構(gòu)建表達同一病原多種抗原、不同病原多種抗原的多價重組痘苗病毒載體，尋找更多穩(wěn)定有效的外源基因插入?yún)^(qū)意義重大。
痘苗病毒基因組編碼一些特殊蛋白抑制宿主免疫系統(tǒng)，據(jù)文獻報道和基因分析，可知痘苗病毒天壇株B8R基因與IFN-γ受體膜外區(qū)域具有高度同源性[1]。IFN-γ在抗病毒及免疫調(diào)節(jié)方面具有重要的作用。本發(fā)明構(gòu)建缺失IFN-γ受體基因的天壇株重組痘苗病毒載體，研究其毒力改變及B8R缺失區(qū)插入外源基因表達的穩(wěn)定性。進一步提高天壇株痘苗病毒載體安全性、研制表達多價抗原重組痘苗病毒載體。
HIV-1全球流行導(dǎo)致了極高的致病率和病死率，為防治HIV-1的感染，傳統(tǒng)的化學(xué)藥物治療、免疫治療以及新的方法得以不斷研究、發(fā)展，對多數(shù)HIV感染者進行HAART，雖可有效抑制病毒血癥，延緩病程，但不能清除潛伏的病毒。保護性的疫苗接種是解決防治HIV-1感染全球性問題的最佳途徑?？茖W(xué)家們開展了減毒活疫苗、滅活疫苗、重組亞單位疫苗、各種活載體疫苗(腺病毒、金絲雀痘病毒、流感病毒、痘苗病毒、狂犬病毒、VSV、傷寒桿菌、鏈球菌等載體)的研究，傳統(tǒng)的減毒活疫苗及滅活疫苗在HIV防治中存在一些問題。雖然減毒活疫苗在SIV模型證實有效，但在初免疫成年獼猴中存在一定致死率。被HIV-1感染的猩猩仍可被第二種不相關(guān)的HIV-1感染。由于活減毒株風(fēng)險性以及有證據(jù)表明無廣泛保護性，減毒活疫苗應(yīng)用的爭議尚待進一步研究。在猩猩模型有研究表明，滅活疫苗不能保護HIV-1攻擊，不能誘導(dǎo)CTL反應(yīng)。病毒活載體疫苗和DNA疫苗都既可以誘導(dǎo)細胞免疫，又可以誘導(dǎo)體液免疫反應(yīng)，表達HIV-1抗原重組痘苗病毒和HIV-1DNA疫苗的聯(lián)合免疫成為新的疫苗研究策略。

發(fā)明內(nèi)容
為了進一步提高重組痘苗病毒疫苗的安全性及有效性，本發(fā)明目的在于提供一種同源重組構(gòu)建B8R基因缺失區(qū)插入外源基因的的IFN-γ受體基因(B8R)缺失的天壇株重組痘苗病毒VTTΔB8RlacZ及其在制備重組痘苗病毒疫苗中的應(yīng)用。
具體涉及一種B8R基因缺失、表達HIV-1抗原的VTKgpeΔB8R(B8R基因缺失不帶lacZ選擇標(biāo)記，TK區(qū)插入B’/C型CN54株HIV-1 gagpolenv基因)的天壇株重組痘苗病毒recombinant vaccinia virius VTKgpe的艾滋病疫苗，該重組痘苗病毒recombinant vaccinia virius VTKgpe于2004年2月24日在北京保藏，保藏單位是中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其保藏號為CGMCC No.1099；涉及一種B8R基因缺失表達HIV-1抗原的VTKgpeΔB8RlacZ(B8R基因缺失為lacZ所取代，TK區(qū)插入B’/C型CN54株HIV-1 gagpol env基因)的天壇株重組痘苗病毒的艾滋病疫苗；還涉及一種B8R基因缺失、表達乙型肝炎病毒HBSAg抗原，IL-2的(B8R基因缺失插入HBSAg抗原，TK區(qū)插入IL-2基因)的天壇株重組痘苗病毒的乙型肝炎病疫苗。
本發(fā)明的目的在于提供用于以痘苗病毒VTT為母本病毒，構(gòu)建B8R區(qū)缺失，同時在該區(qū)插入各種外源基因的重組痘苗病毒轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pSKB8R、pSKB8RLacZ、pSKB8RNeo、pSKB8RPNeo和它們的構(gòu)建方法。
本發(fā)明提供了一種用于轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pSKB8RLacZ構(gòu)建的質(zhì)粒pSC65，含有該質(zhì)粒的大腸埃希氏菌Esherichia coli已于2004年2月24日在北京保藏，保藏單位是中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其保藏號為CGMCC No.1097。
本發(fā)明提供了一種用于轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pSKB8Rneo構(gòu)建的質(zhì)粒pVI75，含有該質(zhì)粒的大腸埃希氏菌Esherichia coli已于2004年2月24日在北京保藏，保藏單位是中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其保藏號為CGMCC No.1098。
本發(fā)明所涉及的一種B8R基因缺失為lacZ所取代的重組病毒VTTΔB8R1acZ可以作為同源重組構(gòu)建B8R基因缺失區(qū)插入外源基因的疫苗株的親本毒株。VTTΔB8RlacZ構(gòu)建方法即將痘苗病毒天壇株VTT(北京生物制品所保藏，Tiantan株752-1)與轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pSKB8RLacZ共轉(zhuǎn)染CEF細胞進行同源重組，經(jīng)藍白篩選、連續(xù)單斑純化、鑒定獲得B8R基因缺失為lacZ所取代的重組病毒VTTΔB8RlacZ。提取DNA，進行PCR擴增及DOTBLOT鑒定、檢測重組病毒B8R基因缺失的穩(wěn)定性，表明VTTΔB8RlacZ在CEF細胞連續(xù)培養(yǎng)傳代15代B8R基因缺失穩(wěn)定。VTTΔB8RlacZ在CEF細胞連續(xù)培養(yǎng)傳代15代插入外源基因lacZ穩(wěn)定表達。重組缺失病毒VTTΔB8RlacZ在CEF、TK-143、CV-1細胞中的繁殖生長曲線測定，結(jié)果表明VTTΔB8RlacZ的生長曲線與VTT生長曲線相似。B8R基因缺失對重組缺失病毒在細胞中的繁殖復(fù)制沒有影響。兔皮內(nèi)毒力實驗表明VTT752-1形成紅腫痘皰面積顯著大于VTTΔB8RlacZ形成痘皰，VTT752-1形成紅腫痘皰而后出現(xiàn)潰破接痂，VTTΔB8RlacZ形成痘皰無潰破接痂，VTTΔB8RlacZ形成痘皰消褪較VTT752-1形成痘皰消褪早。B8R基因缺失顯著降低痘苗病毒天壇株病毒毒力。
本發(fā)明涉及的一種B8R基因缺失、表達HIV-1抗原的VTKgpeΔB8R(B8R基因缺失不帶lacZ選擇標(biāo)記，TK區(qū)插入B’/C型CN54株HIV-1 gagpolenv基因)的天壇株重組痘苗病毒的艾滋病疫苗及一種B8R基因缺失表達HIV-1抗原的VTKgpe/ΔB8RlacZ(B8R基因缺失為lacZ所取代，親本毒株VTTΔB8RlacZ的TK區(qū)插入B’/C型CN54株HIV-1 gagpol env基因)的天壇株重組痘苗病毒的艾滋病疫苗。即將VTKgpe(TK區(qū)插入B’/C型CN54株HIV-1 gagpol env基因的天壇株重組痘苗病毒)與轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pSKB8RLacZ共轉(zhuǎn)染CEF細胞進行同源重組，經(jīng)藍白篩選、連續(xù)單斑純化、鑒定獲得B8R基因缺失為lacZ所取代的重組病毒VTKgpeΔB8RlacZ，再以VTKgpeΔB8RlacZ為親本株與pSKB8RNeo共轉(zhuǎn)染CEF細胞進行同源重組，經(jīng)G418壓力篩選、藍白斑篩選、連續(xù)單斑純化、鑒定獲得B8R基因缺失不帶lacZ選擇標(biāo)記的重組病毒VTKgpeΔB8R。裸鼠毒力實驗表明VTKgpeΔB8R毒力較VTKgpe顯著降低，腹腔接種VTT(104pfu)及VTKgpe(106pfu)15天裸鼠死亡，接種VTKgpeΔB8R(107pfu)裸鼠存活。胞內(nèi)IFN-γ.染色流式細胞儀分析、T淋巴細胞增殖、CTL檢測顯示B8R基因缺失顯著提高表達HIV-1基因的天壇株重組痘苗病毒特異性細胞免疫。本發(fā)明上述所涉及的TK區(qū)是指Tiantan株Genebank，gi6969640基因組的79799bp-81271bp的一段核苷酸序列。
本發(fā)明涉及B8R基因缺失、表達HIV-1和乙型肝炎病毒各種單價或多價抗原的天壇株重組痘苗病毒的艾滋病及乙型肝炎病疫苗。
本發(fā)明涉及B8R基因缺失、表達外源基因單價或多價抗原的天壇株重組痘苗病毒包括重組疫苗、表達外源基因重組痘苗病毒以及它們在制備治療病毒病的重組痘苗病毒疫苗藥物中的應(yīng)用。
以上本發(fā)明所描述的技術(shù)特征目前國內(nèi)外未見任何報道，所以本發(fā)明具有創(chuàng)造性、新穎性和實用性。對人類病毒病的重組痘苗病毒疫苗藥物治療將帶來十分重要的意義。


圖1顯示轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pSKB8R、pSKB8RLacZ、pSKB8RNeo的構(gòu)建路線圖2顯示pSKB8R酶切確認分析結(jié)果，圖中泳道2，3分子量標(biāo)記DL2000，DL15000(購自大連寶生物工程有限公司)，泳道1pSKB8R(NdeI和BgLII)。
圖3顯示pSKB8RlacZ酶切確認分析結(jié)果，圖中泳道1分子量標(biāo)記DL15000，泳道2pSKB8RLacZ(SpeI)，泳道3pSKB8RLacZ(SacI)，泳道4pSKB8RLacZ(NdeI)。
圖4顯示pSKB8RNeo酶切確認分析結(jié)果，圖中泳道1分子量標(biāo)記DL15000，泳道2pSKB8RNeo(BamHI和BgLII)。
圖5顯示pSKB8RPNeo酶切確認分析結(jié)果，圖中泳道12分子量標(biāo)記DL2000，15000，泳道3pSKB8RPNeo(SaLI/SmaLI)。
圖6顯示重組病毒VTTΔB8RlacZ、VTKgpeΔB8RlacZ、VTKgpeΔB8R構(gòu)建示意圖。
圖7顯示PCR擴增檢測重組病毒VTTΔB8RlacZ B8R基因缺失1，6DNA標(biāo)準(zhǔn)2VTTDNA PCR擴增產(chǎn)物(引物B8RLF、B8RRR)3VTTDNA擴增產(chǎn)物(引物B8RF、B8RRR)圖8Dot Blot檢測病毒基因組中B8R基因提取痘苗病毒VTT752-1DNA及重組病毒VTTΔB8RlacZ傳代15代DNA，以B8R基因地高辛標(biāo)記探針進行Dot Blot檢測。VTT752-1Dot Blot結(jié)果顯示雜交印跡斑點，VTTΔB8RlacZ傳代15代Dot Blot結(jié)果未顯示雜交印跡斑點，表明VTTΔB8RlacZ在CEF細胞連續(xù)培養(yǎng)傳代15代B8R基因穩(wěn)定缺失圖9顯示重組缺失病毒VTTΔB8RlacZ細胞中的繁殖曲線測定以VTTΔB8RlacZ重組病毒在CEF中增殖，其不同時間收獲的病毒PFU值，繪制病毒繁殖曲線(與TK-143、Wish、CV-1細胞上繁殖曲線相似)。結(jié)果表明VTTΔB8RlacZ的繁殖曲線與對照VTT繁殖曲線相似。B8R基因缺失對重組缺失病毒在細胞中的繁殖復(fù)制沒有影響。48h病毒繁殖高峰達107PFU/ml。(生長曲線縱軸為PFU對數(shù)值)圖10顯示兔皮內(nèi)毒力實驗結(jié)果兔背皮內(nèi)左側(cè)接種1×106PFU的VTTΔB8RlacZ，右側(cè)接種1×106PFU/ml的VTT752-1，將0.1ml 1×107pfu/ml VTTΔB8RlacZ重組病毒，對兔背皮內(nèi)注射后，逐日觀察皮膚紅腫面積，第5天可見紅腫痘皰，明顯小于對照痘苗病毒，且無潰破，消褪較早。表明重組病毒VTTΔB8RlacZ毒力比對照VTT752-1顯著減弱。
圖11顯示PCR擴增檢測重組病毒VTKgpeΔB8R B8R基因缺失提取重組病毒DNA為模板，以引物B8RLF、B8RRR進行PCR擴增。重組病毒VTKgpeΔB8R由于B8R基因缺失，PCR擴增出1244bp片段，包括B8R基因外左側(cè)同源序列B8RL片段583bp、右側(cè)同源序列B8RR片段661bp。而對照VTTDNA為模板擴增出2Kb片段，包括B8R基因外左側(cè)同源序列B8RL片段583bp、B8R基因818bp、右側(cè)同源序列B8RR片段661bp。結(jié)果表明VTKgpeΔB8R在CEF細胞連續(xù)培養(yǎng)傳代15代B8R基因穩(wěn)定缺失。
圖12、Dot Blot檢測病毒VTKgpeΔB8R基因組中B8R基因1、VTT752-1 2、VTKgpeΔB8R提取痘苗病毒VTT752-1DNA及重組病毒VTKgpeΔB8R傳代15代DNA，以B8R基因地高辛標(biāo)記探針進行Dot Blot檢測。VTT752-1Dot Blot結(jié)果顯示雜交印跡斑點，VTKgpeΔB8R傳代15代Dot Blot結(jié)果未顯示雜交印跡斑點，表明VTKgpeΔB8R在CEF細胞連續(xù)培養(yǎng)傳代15代B8R基因穩(wěn)定缺失圖13顯示胞內(nèi)IFN-γ.染色流式細胞儀分析結(jié)果。DNA+VTKgpeΔB8R免疫組小鼠脾細胞T淋巴細胞，在體外經(jīng)表位肽刺激后，分泌IFN-γ的CD8+T淋巴細胞占脾臟總CD8+T淋巴細胞的百分比數(shù)顯著高于DNA+VTKgpe免疫組。VTKgpeΔB8R免疫組小鼠脾細胞分泌IFN-γ.CD8百分比數(shù)顯著高于VTKgpe免疫組。
圖14顯示T淋巴細胞增殖3H-TdR法檢測結(jié)果。DNA+VTKgpeΔB8R免疫組小鼠脾細胞T淋巴細胞，在體外經(jīng)表位肽刺激后，刺激指數(shù)(SI)顯著高于DNA+VTKgpe免疫組。
圖15顯示CTL乳酸脫氫酶法檢測結(jié)果。DNA+VTKgpeΔB8R免疫組小鼠脾細胞T淋巴細胞，特異性殺傷顯著高于DNA+VTKgpe免疫組。VTKgpeΔB8R免疫組高于VTKgpe免疫組圖16 Western Blot分析VTKgpeΔB8R目的基因表達1 VTT感染CEF細胞 2，3，4VTKgpeΔB8R感染CEF細胞5預(yù)染蛋白Marker
具體實施方案實施例一、轉(zhuǎn)移質(zhì)粒的構(gòu)建1.質(zhì)粒pBR-SK的構(gòu)建5’PBR322-SACI-FORGGAGCTCCGACCGATGCCCTTGAGAGCC3’PBR322-KPNI-REGGGGTACCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGPCR擴增商業(yè)質(zhì)粒pBR322包括全部功能元件的序列，記為pBR。
反應(yīng)體系10×Pyrobest Buffer 5μldNTPMisture(各2.5mM)5μl3’PBR322-KPNI-RE(50μM)0.5μl5’PBR322-SACI-FOR(50μM) 0.5μlpBR322 0.5μlPyrobest DNA Polymerase(5U/ml) 0.5μlddH2O38μl反應(yīng)條件94℃預(yù)變性2min；94℃30s，68℃5min，共35個循環(huán)；72℃7min；4℃。
純化 大連寶生物的KpnI和SacI共酶切PCR產(chǎn)物pBR，跑膠回收。
用大連寶生物的KpnI和SacI共酶切質(zhì)粒pBS-SK，得到多克隆位點序列(小片段)，記為SK，跑1.5％瓊脂糖膠回收。
連接酶切回收產(chǎn)物pBR和SK，轉(zhuǎn)化Top10大腸桿菌感受態(tài)，并篩選出正確克隆子，記為pBR-SK。
2.轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pSKB8R的構(gòu)建在載體質(zhì)粒pBR-SK插入痘苗病毒天壇株B8R基因外左側(cè)同源序列B8RL片段、右側(cè)同源序列B8RR片段。見圖1。采用PCR技術(shù)分別以痘苗病毒DNA擴增痘苗病毒天壇株B8R基因外左側(cè)同源序列B8RL片段(引物B8RLF、B8RLR)右側(cè)同源序列B8RR片段(引物B8RRF、B8RRR)，B8RL片段、B8RR片段分別用BgLII切連接，以連接產(chǎn)物為模板PCR擴增(引物B8RLF、B8RRR)B8R基因外左右側(cè)同源序列連接大片段B8RLR。大片段B8RLR、pBRSK質(zhì)粒分別以KpnI/BamHI酶切、T4DNALigase連接構(gòu)建帶有天壇株B8R基因外左右側(cè)同源臂的轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pSKB8R。引物序列B8RLFgtaataggtaccgtagcatcctattcg B8RLRtataatagatcttatggtgttgtttgB8RRFaactaaagatctcggtagcac B8RRRattcgtggatccattgtaacaagatatcB8RL片段(引物B8RLF、B8RLR)，B8RR片段(引物B8RRF、B8RRR)，，連接大片段B8RLR(引物B8RLF、B8RRR)PCR擴增反應(yīng)采用大連寶生物工程有限公司的試劑盒，反應(yīng)體系如下模板DNA 1μl正、反向引物 各1μl10×Pyrobest緩沖液 5μldNTP混合物(各2.5mM) 5μlPyrobest DNA聚合酶(5U/ml)0.5μlddH2O37.5μlPCR反應(yīng)條件94℃預(yù)變性2min；94℃30s，58℃30s，72℃30s，共20個循環(huán)；72℃7min；4℃。
大片段B8RLR延伸產(chǎn)物用Omega公司的E.Z.N.A Cycle-Pure Kit進行純化回收，回收產(chǎn)物KpnI/BamHI共酶切(Takara公司產(chǎn))。pBRSK質(zhì)粒載體KpnI/BamHI共酶切(Takara公司產(chǎn))。用Omega公司E.Z.N.A.GelExtraction Kit進行電泳純化回收.。二者T4DNALigase(Takara公司產(chǎn))連接構(gòu)建帶有天壇株B8R基因外左右側(cè)同源臂的轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pSKB8R。連接產(chǎn)物分別轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌Top10，涂含氨芐青霉素的LB平板，37℃培養(yǎng)12-16小時。提取質(zhì)粒，用相應(yīng)限制性內(nèi)切酶酶切分析鑒定，酶切鑒定結(jié)果分別參見圖2。
3.轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pSKB8RLacZ的構(gòu)建在pSKB8R左側(cè)同源序列B8RL片段、右側(cè)同源序列B8RR片段間插入痘苗病毒啟動子序列pE/L、p7.5及下游LacZ序列。以質(zhì)粒pSC65為模板擴增痘苗病毒啟動子序列pE/L、p7.5及下游LacZ序列(引物pSC65F、pSC65R)。pE/L、p7.5及下游LacZPCR擴增片段(引物pSC65F、pSC65R)以BamHI酶切、轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pSKB8R以BgLII酶切，二者T4DNALigase連接構(gòu)建轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pSKB8RLacZ。pSKB8RLacZ帶有痘苗病毒啟動子序列pE/L、p7.5和p7.5下游的LacZ序列以及兩側(cè)的B8R基因外同源臂。pSC65Ftctttcggatccttgttgaattagatcg pSC65RgtttgccatacgctcacagaagpE/L、p7.5及下游LacZPCR擴增片段PCR擴增反應(yīng)采用大連寶生物工程有限公司的試劑盒，反應(yīng)體系如下質(zhì)粒pSC65 1μl正、反向引物(pSC65F、pSC65R) 各1μl10×Pyrobest緩沖液 5μldNTP混合物(各2.5mM)5μlPyrobest DNA聚合酶(5U/ml) 0.5μlddH20 37.5μlPCR反應(yīng)條件94℃預(yù)變性2min；94℃30s，58℃30s，72℃30s，共20個循環(huán)；72℃7min；4℃。
pE/L、p7.5及下游LacZPCR擴增片段延伸產(chǎn)物用Omega公司的E.Z.N.A Cycle-Pure Kit進行純化回收，回收產(chǎn)物BamHI酶切(Takara公司產(chǎn))。轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pSKB8R載體BgLII酶切(Takara公司產(chǎn))。用Omega公司E.Z.N.A.Gel Extraction Kit進行電泳純化回收.。二者T4DNALigase(Takara公司產(chǎn))連接構(gòu)建pSKB8RlacZ。連接產(chǎn)物分別轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌Top10，涂含氨芐青霉素的LB平板，37℃培養(yǎng)12-16小時。提取質(zhì)粒，用相應(yīng)限制性內(nèi)切酶酶切分析鑒定，酶切鑒定結(jié)果分別參見圖3。
4轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pSKB8Rneo的構(gòu)建即在pSKB8R左側(cè)同源序列B8RL片段、右側(cè)同源序列B8RR片段外側(cè)插入痘苗病毒啟動子序列pH6及下游Neo序列。以質(zhì)粒pVI75為模板擴增痘苗病毒啟動子序列pH6及下游Neo序列(引物NeoF，NeoR)，BamHI、SacII酶切pH6+Neo片段、轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pSKB8RBamHI、SacII酶切，二者T4DNALigase連接構(gòu)建轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pSKB8RNeo。引物NeoFcgcggatcctcgatccccagattacaaacaactagg，引物NeoRtccccgcggacagatttctccgtgatagggatcgpH6及下游Neo序列PCR擴增反應(yīng)采用大連寶生物工程有限公司的試劑盒，反應(yīng)體系如下質(zhì)粒1μl正、反向引物(NeoF，NeoR)各1μl10×Pyrobest緩沖液 5μldNTP混合物(各2.5mM) 5μlPyrobest DNA聚合酶(5U/ml) 0.5μlddH2O 37.5μlPCR反應(yīng)條件94℃預(yù)變性2min；94℃30s，58℃30s，72℃60s，共20個循環(huán)；72℃7min；4℃。
pH6及下游Neo序列PCR擴增片段延伸產(chǎn)物用Omega公司的E.Z.N.ACycle-Pure Kit進行純化回收，回收產(chǎn)物SacII/BamHI酶切(Takara公司產(chǎn))。轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pSKB8R載體SacII/BamHI酶切(Takara公司產(chǎn))。用Omega公司E.Z.N.A.Gel Extraction Kit進行電泳純化回收.。二者T4DNALigase(Takara公司產(chǎn))連接構(gòu)建轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pSKB8RNeo。連接產(chǎn)物分別轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌Top10，涂含氨芐青霉素的LB平板，37℃培養(yǎng)12-16小時。提取質(zhì)粒，用相應(yīng)限制性內(nèi)切酶酶切分析鑒定，酶切鑒定結(jié)果分別參見圖4。
5轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pSKB8RPNeo的構(gòu)建即在pSKB8RNeo左側(cè)同源序列B8RL片段、右側(cè)同源序列B8RR片段間插入兩個互為反向的痘苗病毒啟動子序列pE/L、p7.5。以質(zhì)粒pSC65為模板擴增痘苗病毒啟動子序列pE/L、p7.5及多克隆位點。pE/L、p7.5及多克隆位點擴增片段(引物PMF，PMR)以BamHI酶切、轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pSKB8R以BgLII酶切，二者T4DNALigase連接構(gòu)建pSKB8RP。質(zhì)粒pSKB8RPSacII/BamHI酶切，pH6及下游Neo序列PCR擴增片段延伸產(chǎn)物用SacII/BamHI酶切(Takara公司產(chǎn))，二者T4DNALigase連接構(gòu)建轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pSKB8RPNeo。PMFcgggatccgtcgacttcgaacttattt PMRcgggatcccccgggctcgagttatgatcttpE/L、p7.5及多克隆位點擴增片段PCR擴增反應(yīng)采用大連寶生物工程有限公司的試劑盒，反應(yīng)體系如下質(zhì)粒pSC65 1μl正、反向引物(PMF，PMR) 各1μl10×Pyrobest緩沖液 5μldNTP混合物(各2.5mM) 5μlPyrobest DNA聚合酶(5U/ml) 0.5μlddH2O 37.5μlPCR反應(yīng)條件94℃預(yù)變性2min；94℃30s，58℃30s，72℃30s，共20個循環(huán)；72℃7min；4℃。
pE/L、p7.5及多克隆位點擴增片段延伸產(chǎn)物用Omega公司的E.Z.N.ACycle-Pure Kit進行純化回收，回收產(chǎn)物BamHI酶切(Takara公司產(chǎn))。轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pSKB8R載體BglII酶切(Takara公司產(chǎn))。用Omega公司E.Z.N.A.Gel Extraction Kit進行電泳純化回收.。二者T4DNALigase(Takara公司產(chǎn))連接構(gòu)建pSKB8RP。
質(zhì)粒pSKB8RP SacII/BamHI酶切，pH6及下游Neo序列PCR擴增片段(如前)用SacII/BamHI酶切(Takara公司產(chǎn))，二者T4DNALigase連接構(gòu)建轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pSKB8RPNeo。圖5。
實施例二B8R基因缺失為lacZ所取代的重組病毒VTTΔB8RlacZ的構(gòu)建。圖6。
將痘苗病毒天壇株VTT與轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pSKB8RLacZ共轉(zhuǎn)染CEF細胞進行同源重組，經(jīng)藍白篩選、連續(xù)單斑純化、鑒定獲得B8R基因缺失為lacZ所取代的重組病毒VTTΔB8RlacZ。以0.1~0.01PFU/cell病毒量VTT752-1感染80％成片CEF細胞吸附1~1.5h后，采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)(參照美國INVITROGEN公司Lipofectin試劑盒)將重組質(zhì)粒pSKB8RLacZ轉(zhuǎn)染CEF細胞中。48小時后收獲重組病毒液，用含200μg/ml X-gal營養(yǎng)瓊脂鋪斑，隨機挑取孤立藍斑病毒，連續(xù)單斑純化5代，以待鑒定獲得B8R基因缺失為lacZ所取代的重組病毒VTTΔB8RlacZ。
提取DNA，進行PCR擴增及DOT BLOT鑒定、檢測重組病毒B8R基因缺失的穩(wěn)定性，表明VTTΔB8RlacZ在CEF細胞連續(xù)培養(yǎng)傳代15代B8R基因缺失穩(wěn)定。VTTΔB8RlacZ在CEF細胞連續(xù)培養(yǎng)傳代15代插入外源基因lacZ穩(wěn)定表達。VTTΔB8RlacZ在CEF細胞連續(xù)培養(yǎng)傳代15代，VTTΔB8RlacZ傳代第5、15代分別感染CEF細胞，檢測其樣品中β-半乳糖苷酶活性，同時設(shè)立VTT感染細胞對照。第5代β-半乳糖苷酶活測定OD420nm值為3.027，第15代OD420nm值為2.819。VTT感染細胞對照OD420nm值為0.04。結(jié)果表明VTTΔB8RlacZ在CEF細胞連續(xù)培養(yǎng)傳代插入外源基因lacZ穩(wěn)定表達.(圖7，圖8)和表1。
表1

重組缺失病毒VTTΔB8RlacZ在CEF、TK-143、CV-1細胞中的繁殖生長曲線測定，結(jié)果表明VTTΔB8RlacZ的生長曲線與VTT生長曲線相似(圖90。B8R基因缺失對重組缺失病毒在細胞中的繁殖復(fù)制沒有影響。兔皮內(nèi)毒力實驗表明VTT752-1形成紅腫痘皰面積顯著大于VTTΔB8RlacZ形成痘皰，VTT752-1形成紅腫痘皰而后出現(xiàn)潰破接痂，VTTΔB8RlacZ形成痘皰無潰破接痂，VTTΔB8RlacZ形成痘皰消褪較VTT752-1形成痘皰消褪早。B8R基因缺失顯著降低痘苗病毒天壇株病毒毒力。見圖10。
實施例三B8R基因缺失表達HIV-1抗原的VTKgpeΔB8RlacZ(B8R基因缺失為lacZ所取代，TK區(qū)插入B’/C型CN54株HIV-1 gagpol env基因)的天壇株重組痘苗病毒的艾滋病疫苗。
即將VTKgpe(TK區(qū)插入B’/C型CN54株HIV-1 gagpol env基因的天壇株重組痘苗病毒)與轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pSKB8RLacZ共轉(zhuǎn)染CEF細胞進行同源重組，經(jīng)藍白篩選、連續(xù)單斑純化、鑒定獲得B8R基因缺失為lacZ所取代的重組病毒VTKgpeΔB8RlacZ。以0.1~0.01PFU/cell病毒量VTKgpe感染80％成片CEF細胞吸附1~1.5h后，采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)(參照美國INVITROGEN公司Lipofectin試劑盒)將重組質(zhì)粒pSKB8RLacZ轉(zhuǎn)染CEF細胞中。48小時后收獲重組病毒液，用含200μg/ml X-gal營養(yǎng)瓊脂鋪斑，隨機挑取孤立藍斑病毒，連續(xù)單斑純化5代，以待鑒定獲得B8R基因缺失為lacZ所取代的重組病毒VTKgpeΔB8RlacZ提取DNA，進行PCR擴增及DOT BLOT鑒定、檢測重組病毒B8R基因缺失的穩(wěn)定性，表明VTKgpeΔB8RlacZ在CEF細胞連續(xù)培養(yǎng)傳代15代B8R基因缺失穩(wěn)定。VTKgpeΔB8RlacZ在CEF細胞連續(xù)培養(yǎng)傳代15代插入外源基因gagpol env穩(wěn)定表達。
實施例四B8R基因缺失、表達HIV-1抗原的VTKgpeΔB8R(B8R基因缺失不帶lacZ選擇標(biāo)記，TK區(qū)插入B’/C型CN54株HIV-1 gagpol env基因)的天壇株重組痘苗病毒的艾滋病疫苗。
再以VTKgpeΔB8RlacZ為親本株與pSKB8RNeo共轉(zhuǎn)染CEF細胞進行同源重組，經(jīng)G418壓力篩選、藍白斑篩選、連續(xù)單斑純化、鑒定獲得B8R基因缺失不帶lacZ選擇標(biāo)記的重組病毒VTKgpeΔB8R。以0.1~0.01PFU/cell病毒量VTKgpeΔB8RlacZ感染80％成片CEF細胞吸附1~1.5h后，采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)(參照美國INVITROGEN公司Lipofectin試劑盒)將重組質(zhì)粒pSKB8RNeo轉(zhuǎn)染CEF細胞中。48小時后收獲重組病毒液，以400ug/mlG418壓傳三代。用含200μg/ml X-gal營養(yǎng)瓊脂鋪斑，隨機挑取孤立白斑病毒，連續(xù)單斑純化5代，以待鑒定獲得B8R基因缺失不帶lacZ選擇標(biāo)記的重組病毒VTKgpeΔB8R。
提取DNA，進行PCR擴增及DOT BLOT鑒定、檢測重組病毒B8R基因缺失的穩(wěn)定性，表明VTKgpeΔB8R在CEF細胞連續(xù)培養(yǎng)傳代15代B8R基因缺失穩(wěn)定。VTKgpe/ΔB8R在CEF細胞連續(xù)培養(yǎng)傳代15代插入外源基因gagpolenv穩(wěn)定表達。
裸鼠毒力實驗表明VTKgpe/ΔB8R毒力較VTKgpe顯著降低，腹腔接種VTT(104pfu)及VTKgpe(106pfu)15天裸鼠死亡，接種VTKgpeΔB8R(107pfu)裸鼠存活(表2)。胞內(nèi)IFN-γ.染色流式細胞儀分析、T淋巴細胞增殖、CTL檢測顯示B8R基因缺失顯著提高表達HIV-1基因的天壇株重組痘苗病毒特異性細胞免疫(圖13，14，15)。
表2Virus Dose(pfu) Number of deathVTT 1020/41031/41044/4VTKgpe 1040/41050/41063/4VTKgpeΔB8R1050/41060/41070/4實施例五PCR擴增檢測重組病毒VTKgpeΔB8R B8R基因缺失。Westernblot檢測VTKgpeΔB8R傳代15代插入外源基因gagpol env穩(wěn)定表達提取重組病毒DNA為模板，以引物B8RLF、B8RRR進行PCR擴增。重組病毒VTKgpeΔB8R由于B8R基因缺失，PCR擴增出1244bp片段，包括B8R基因外左側(cè)同源序列B8RL片段583bp、右側(cè)同源序列B8RR片段661bp。而對照VTTDNA為模板擴增出2Kb片段，包括B8R基因外左側(cè)同源序列B8RL片段583bp、B8R基因818bp、右側(cè)同源序列B8RR片段661bp(圖11)。結(jié)果表明VTKgpeΔB8R在CEF細胞連續(xù)培養(yǎng)傳代15代B8R基因穩(wěn)定缺失。Dot Blot檢測病毒VTKgpeΔB8R基因組中B8R基因，提取痘苗病毒VTT752-1DNA及重組病毒VTKgpeΔB8R傳代15代DNA，以B8R基因地高辛標(biāo)記探針進行Dot Blot檢測。VTT752-1Dot Blot結(jié)果顯示雜交印跡斑點，VTKgpeΔB8R傳代15代Dot Blot結(jié)果未顯示雜交印跡斑點，表明VTKgpeΔB8R在CEF細胞連續(xù)培養(yǎng)傳代15代B8R基因穩(wěn)定缺失。見圖12。VTKgpeΔB8R感染CEF細胞，48小時后收獲細胞和上清，以人多抗血清(美國國立衛(wèi)生研究院艾滋病研究和參比試劑項目提供)進行WesternBlot分析，出現(xiàn)了特異的反應(yīng)條帶(gp140，p55)說明所構(gòu)建的疫苗可以正確的表達目的基因(圖16)。
實施例六、重組痘苗病毒艾滋病疫苗的效果實驗本例中使用無菌飼養(yǎng)的6-8周齡BALB/c(H-2d)雌性小鼠(體重19-25克，購自中國藥品生物制品檢定所)檢測本發(fā)明疫苗的效力。各DNA疫苗用1×PBS制備成1mg/ml的注射液。每種免疫組含10只小鼠。免疫前24小時每只小鼠左右后肢脛骨前肌各注射50ul 25％(w/v)蔗糖高滲溶液以增加肌肉細胞的通透性，提高攝取質(zhì)粒效率，同時，蔗糖還有一定的佐劑的作用。蔗糖處理24小時后，脛骨前肌注射DNA 100ug/只(每后肢50ug)。每間隔2周以同樣劑量加強免疫3次。第6周時1，2組分別用VTKgpeΔB8R、VTKgpe重組痘苗病毒加強，107pfu/鼠。第4，6周時3，4組分別用VTKgpeΔB8R、VTKgpe重組痘苗病毒免疫，107pfu/鼠。在第9周時取血清及脾淋巴細胞檢測抗體以及細胞因子。對照使用pCDN A空載體、不插入目的基因的痘苗病毒天壇株(天花疫苗，由北京生物制品所惠贈)以及空白鼠對照(表3)。
表3

相關(guān)實驗及結(jié)果如下1、血清Gag特異性抗體IgG水平的檢測為檢測不同重組痘苗病毒單獨免疫和加強免疫所誘導(dǎo)的特異性體液免疫水平，在第四次免疫后兩周及取小鼠血清，用Gag P55抗原(美國國立衛(wèi)生研究院艾滋病研究和參比試劑項目惠贈)包被酶標(biāo)板，間接ELISA法進行Gag特異性IgG抗體水平的檢測。各免疫組Gag特異性IgG抗體滴度列于表4。
表4

2、流式細胞儀檢測體外抗原表位肽刺激后分泌IFN-γ的CD8+T淋巴細胞CD8+T淋巴細胞是一種最重要的抗病毒效應(yīng)細胞，所以檢測了免疫后脾淋巴細胞中分泌IFN-γ的HIV-1特異性CD8+T淋巴細胞。脾淋巴細胞用MHC-I限制性HIV(gag p24(AMQILKDTI)，V3(SIRIGPGQTF YATGD)andpol(NPDIVIYQYMDDLYVGSDL，YMDDLYVGSDLEIGQHRTK，KEPPFLWMGYELHPDKWTV)刺激12小時后，對細胞內(nèi)IFN-γ和CD8，CD3分子進行染色，流式細胞儀(貝克曼·庫爾特公司產(chǎn)品)進行分析。DNA+VTKgpeΔB8R免疫組小鼠脾細胞T淋巴細胞，分泌IFN-γ的CD8+T淋巴細胞占脾臟總CD8+T淋巴細胞的百分比數(shù)顯著高于DNA+VTKgpe免疫組。VTKgpeΔB8R免疫組小鼠脾細胞分泌IFN-γ.CD8百分比數(shù)顯著高于VTKgpe免疫組。
實施例七、B8R基因缺失、表達乙型肝炎病毒HBSAg抗原，IL-2的(B8R基因缺失插入HBSAg抗原，TK區(qū)插入IL-2基因)的天壇株重組痘苗病毒的乙型肝炎病疫苗的構(gòu)建。
構(gòu)建過程將重組痘苗病毒VTKIL-2(TK區(qū)插入IL-2基因)與轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pSKB8RLacZ共轉(zhuǎn)染CEF細胞進行同源重組，經(jīng)藍白篩選、連續(xù)單斑純化、鑒定獲得B8R基因缺失為lacZ所取代的重組病毒VTKIL-2ΔB8RlacZ。將HBSAg基因插入轉(zhuǎn)移質(zhì)粒PSKB8RPNeo中(PSKB8RPNeoSaLI酶切補平，T4DNA連接酶連接HBSAg基因與PSKB8RPNeo)構(gòu)建質(zhì)粒PSKB8RPSNeo，HBSAg基因置于轉(zhuǎn)移質(zhì)粒痘苗病毒啟動子下。將VTKIL-2ΔB8RlacZ與PSKB8RPSNeo共轉(zhuǎn)染CEF細胞進行同源重組，經(jīng)藍白篩選、連續(xù)單斑純化、鑒定獲得B8R基因，缺失lacZ為HBSAg基因所取代的重組病毒VTKIL-2ΔB8RS。
具體方法參見前述的方法。
權(quán)利要求
1.一種用于同源重組構(gòu)建B8R基因缺失區(qū)插入外源基因的IFN-γ受體基因B8R缺失的天壇株重組痘苗病毒VTTΔB8RlacZ，其構(gòu)建步驟為轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pSKB8R、pSKB8RLacZ、pSKB8RNeo和pSKB8RPNeo的構(gòu)建；將痘苗病毒天壇株VTT與轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pSKB8RLacZ共轉(zhuǎn)染CEF細胞進行同源重組，經(jīng)藍白篩選、連續(xù)單斑純化、鑒定獲得B8R基因缺失為lacZ所取代的天壇株重組痘苗病毒減毒載體VTTΔB8RlacZ。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組痘苗病毒VTTΔB8RlacZ，其轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pSKB8RLacZ，它是在轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pSKB8R左側(cè)同源序列B8RL片段、右側(cè)同源序列B8RR片段間插入痘苗病毒啟動子序列pE/L、p7.5及下游LacZ序列，以質(zhì)粒pSC65為模板擴增痘苗病毒啟動子序列pE/L、p7.5及下游LacZ序列引物為pSC65F、pSC65R得到的。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的重組痘苗病毒VTTΔB8RlacZ，其質(zhì)粒pSC65的保藏號是CGMCC No.1097。
4.權(quán)利要求2所述的重組痘苗病毒VTTΔB8RlacZ，其轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pSKB8R，即在載體質(zhì)粒pBR-SK插入痘苗病毒天壇株B8R基因外左側(cè)同源序列B8RL片段、右側(cè)同源序列B8RR片段的一種轉(zhuǎn)移質(zhì)粒。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組痘苗病毒VTTΔB8RlacZ，其轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pSKB8RNeo是在pSKB8R左側(cè)同源序列B8RL片段、右側(cè)同源序列B8RR片段外側(cè)插入痘苗病毒啟動子序列pH6及下游Neo的一種轉(zhuǎn)移質(zhì)粒。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組痘苗病毒VTTΔB8RlacZ，其轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pSKB8RPNeo是在pSKB8RNeo左側(cè)同源序列B8RL片段、右側(cè)同源序列B8RR片段間插入兩個互為反向的痘苗病毒啟動子序列pE/L、p7.5及多克隆位點的一種轉(zhuǎn)移質(zhì)粒。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組痘苗VTTΔB8RlacZ，其B8R基因缺失、涉及基因缺失TK區(qū)插入外源基因表達病毒各種單價或多價抗原基因的天壇株重組痘苗病毒疫苗構(gòu)建。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的重組痘苗VTTΔB8RlacZ，其天壇株重組痘苗病毒疫苗是一種B8R基因缺失表達HIV-1抗原的VTKgpeΔB8RlacZ，B8R基因缺失為lacZ所取代，TK區(qū)插入B’/C型CN54株HIV-1 gagpol env基因的天壇株重組痘苗病毒的艾滋病疫苗，將VTKgpe，即TK區(qū)插入B’/C型CN54株HIV-1 gagpol env基因的天壇株重組痘苗病毒與轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pSKB8RLacZ共轉(zhuǎn)染CEF細胞進行同源重組，經(jīng)藍白篩選、連續(xù)單斑純化、鑒定獲得B8R基因缺失為lacZ所取代的重組病毒VTKgpeΔB8RlacZ。
9.據(jù)權(quán)利要求7所述的重組痘苗VTTΔB8RlacZ，其天壇株重組痘苗病毒疫苗是一種B8R基因缺失、表達HIV-1抗原的VTKgpeΔB8R，即B8R基因缺失不帶lacZ選擇標(biāo)記，TK區(qū)插入B’/C型CN54株HIV-1 gagpolenv基因的天壇株重組痘苗病毒VTKgpeΔB8R的艾滋病疫苗。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的重組痘苗VTTΔB8RlacZ，其重組痘苗病毒VTKgpeΔB8R的艾滋病疫苗，是IFN-γ受體基因B8R缺失的天壇株重組痘苗病毒recombinant vaccinia virus VTKgpe CGMCC.NO.1099。
11.根據(jù)權(quán)利要求7所述的重組痘苗VTTΔB8RlacZ，其B8R基因缺失、涉及基因缺失插入HBSAg抗原，TK區(qū)插入IL-2基因表達乙型肝炎病毒HBSAg抗原，IL-2的天壇株重組痘苗病毒的乙型肝炎病疫苗。
12.根據(jù)權(quán)利要求1-11所述的重組痘苗VTTΔB8RlacZ，任選其中一項在制備治療病毒病的重組痘苗病毒疫苗藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及IFN－γ受體基因(B8R)缺失的天壇株重組痘苗病毒減毒載體以及基于此載體構(gòu)建的表達HIV－1各種抗原(單價及多價)的IFN－γ受體基因(B8R)缺失的天壇株重組痘苗病毒艾滋病疫苗，一種天壇株重組痘苗病毒recombinan t vaccinia virius VTKgpe毒recombinant vaccinia virus VTKgpe CGMCC.NO.1099和另外一種乙型肝炎病毒HBSAg抗原，IL－2的天壇株重組痘苗病毒的乙型肝炎病疫苗。本發(fā)明在制備治療病毒病的重組痘苗病毒疫苗藥物中的應(yīng)用有著重要的意義。
文檔編號A61K39/295GK1560248SQ200410028279
公開日2005年1月5日 申請日期2004年3月10日 優(yōu)先權(quán)日2004年3月10日
發(fā)明者邵一鳴, 黃薇, 劉穎 申請人:中國疾病預(yù)防控制中心性病艾滋病預(yù)防控制中心, 中國疾病預(yù)防控制中心性病艾滋病預(yù)防