專利名稱：胰島素受體拮抗劑及相關(guān)組合物、用途和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及具有胰島素受體拮抗劑活性的分子、相關(guān)藥物組合物、 與其相關(guān)的另外組合物、此類組合物和分子的用途、以及各種其他相關(guān) 方法。
背景技術(shù)：
由于其在葡萄糖穩(wěn)態(tài)維持中的重要性，胰島素是研究最多的肽激素
之一。就其晶形和溶液中的結(jié)構(gòu)而言，這種51-aa激素得到了非常充分 表征。
針對胰島素的細(xì)胞應(yīng)答經(jīng)由胰島素受體介導(dǎo)，所述胰島素受體是由 2個相同的結(jié)合胰島素的細(xì)胞外a亞基和2個相同的具有細(xì)胞內(nèi)酪氨酸 激酶活性的跨膜卩亞基組成的四聚蛋白質(zhì)。Goldfine, Endocr. Rev., 8: 235 (1987)。當(dāng)胰島素與a亞基結(jié)合時，|3亞基酪氨酸激酶被活化，并且 胰島素作用隨之發(fā)生(導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)事件級聯(lián))。
高胰島素血癥是由血液中異常高水平的胰島素限定的狀況。高胰島 素血癥的原因包括胰島素瘤和胰島素抵抗，其可以由先天性高胰島素血 癥或其他狀況引起，所述其他狀況例如活性的缺乏、肥胖或多嚢性卵巢 綜合征。胰島素瘤是產(chǎn)生過量胰島素的胰腫瘤。高胰島素水平引起低血 糖癥、或低血糖(糖)。高胰島素血癥是生命的最初幾小時后的新生兒 低血糖癥的最常見原因。此類狀況的治療通常是必需的，以預(yù)防癲癇發(fā) 作開始和神經(jīng)病學(xué)后遺癥。
一般而言，低血糖癥可以是輕度的，并且導(dǎo)致癥狀，例如焦慮和饑 餓，但患者也處于嚴(yán)重低血糖癥的危險中，所述嚴(yán)重低血糖癥可以引起 癲癇發(fā)作、昏迷和甚至死亡?；颊哧愒V的與低血糖癥相關(guān)的一般癥狀包 括疲勞、虛弱、震顫和饑餓。許多患者必須經(jīng)常進食以預(yù)防由于低血糖 的癥狀。由于低血糖，某些患者可能發(fā)展出精神病癥狀。
通常，患有胰島素瘤或其他嚴(yán)重形式的高胰島素血癥的患者通過外 科手術(shù)例如部分胰切除術(shù)或通過施用藥物例如在某些情況下減少胰島 素生產(chǎn)的二氮喚或促生長素抑制素進行治療。在某些情況下必須連續(xù)輸注葡萄糖。不存在減少循環(huán)胰島素作用的現(xiàn)有治療。
除了某些胰島素受體抗體(參見，例如，Roth等人，J Biol Chem. 1983 Oct 25; 258( 20 ): 12094-7; Morgan等人，Proc Natl Acad Sci USA. 1986 Jan; 83 ( 2 ) : 328-32; Taylor等人，Biochem J. 1987 Feb 15; 242 ( 1 ): 123-9; Nagy等人，Endocrinology. 1990 Jan; 126 ( 1 ): 45-52;和Fujita 等人，ActaDiabetol. 2002 Dec; 39 (4) : 22卜7)以外，只有少數(shù)胰島 素受體(IR)拮抗劑先前已得到描述。參見，例如，美國專利公開號 20030236190、 20030195147和20040023887以及Pillutla等人，腸/. C/zem. 277 ( 25 ) : 22590-22594, 2002和Schaffer等人，尸簡.脂/. S". 100 ( 8) : 4435-4439,2003。
發(fā)明概述
本文描述的本發(fā)明存在幾個方面。在一個示例性方面，本發(fā)明提供 了具有胰島素受體拮抗劑活性的新肽、蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)衍生物。在另一 個方面，本發(fā)明提供了包含此類新肽分子的藥物組合物。在另外一個方 面，本發(fā)明提供了各種另外的有用組合物(例如，包含編碼此種肽的序 列的核酸，包含此種核酸的載體和細(xì)胞，針對此種肽和蛋白質(zhì)的抗體 等)。在另外一個方面，本發(fā)明涉及此種組合物和分子的新用途(例如， 在病癥或狀況的篩選/測試中、在各種病癥和狀況的治療中、在用于治療 和診斷應(yīng)用的抗體的生產(chǎn)中、用于制備蛋白質(zhì)才莫擬物(mimetics)等)， 和各種其他相關(guān)方法。這些和另外的示例性本發(fā)明的方面和本發(fā)明的特 征在本文中得到進一 步詳細(xì)地描述。
附圖簡述


圖1。在SGBS細(xì)胞中胰島素刺激的葡萄糖攝取和通過添加S661抑 制次最大的胰島素刺激的葡萄糖攝取。
圖2。靜脈內(nèi)(i.v.)施用不同劑量的肽胰島素受體拮抗劑S661,隨 后腹膜內(nèi)(i.p.)施用人胰島素后，Zucker Obese (ZO)雄性大鼠中的葡 萄糖概況。
圖3。 i.v.施用胰島素受體拮抗劑S661,隨后不同次通過i.p.施用人 胰島素后，ZO大鼠中的葡萄糖概況。本發(fā)明尤其涉及如下發(fā)現(xiàn)具有某些物理特征包括包含特定氨基酸 序列的某些新非抗體肽、蛋白質(zhì)和相關(guān)蛋白質(zhì)衍生物("肽分子，，)可以 用作肽胰島素受體(IR)拮抗劑(此種肽分子在本文中通常被稱為"肽 胰島素受體拮抗劑"或"PIRAs")。
本發(fā)明進一步涉及包含治療有效量的本發(fā)明的一種或多種PIRAs 的新藥學(xué)上可接受的組合物(作為單獨的活性藥理學(xué)試劑或與一種或多 種"次級"試劑或"次級活性劑"組合)。
本發(fā)明還涉及此種PIRAs的新用途，例如使用此種PIRAs生產(chǎn)藥物， 以及治療其中IR活性減少將^L為有利的或有用的狀況和病癥的方法。
然而，這些僅是本發(fā)明的一些有利方面。給定本文提供的本發(fā)明的 描述，這些和其他方面對于技術(shù)人員將是顯而易見的。
一般而言，PIRAs的特征可以是包含至少一個"核心基序"的肽分子， 所述"核心基序"包含(a)式1或式1樣("式1型"或"F1T")氨基酸序 列("FITS")和(b )式6或式6樣("式6型"或"F6T")氨基酸序列(F6TS ), 其中FITS和F6TS在包含于(或構(gòu)成)PIRA的肽鏈中彼此接近定位， 從而使得PIRA與IR結(jié)合并且充當(dāng)IR拮抗劑。F1T和F6T序列在本文 中進一步詳細(xì)討論。PIRA可以包括這種F1TS/F6TS"核心基序"的許多重 復(fù)或包括超過一個FITS或F6TS,但一般地PIRA包含單個"核心基序" 中包含的單個FITS和單個F6TS。 一般而言，本文提供的FIT和F6T 序列的討論集中于"核心基序"中包含的FIT和F6T序歹'J 。
PIRAs可以顯示對于一種或多種IRs的^f壬何合適水平的親和力(優(yōu) 選地，PIRA將顯示對于人IR的親和力)。在一個方面，本發(fā)明提供了 對于人IR具有的親和力比得上由胰島素對于人IR顯示的親和力的 PIRAs (例如，PIRA對于人IR具有的親和力是胰島素那種的至少約35 %、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約60%、至少約70 o/0、至少約80%、至少約90%、約100%的親和力等)。
PIRAs的特征可以是或不是不含其他功能結(jié)構(gòu)域。因此，在一個方 面，PIRA的特征可以是包含至少一個次級肽結(jié)構(gòu)域的融合蛋白，所述 次級肽結(jié)構(gòu)域誘導(dǎo)或促進生理學(xué)應(yīng)答(例如，結(jié)合和調(diào)節(jié)除IR外的受 體)。在另一個方面，本發(fā)明提供了不含此種另外結(jié)構(gòu)域的PIRAs。在 一個方面，本發(fā)明提供了基本上由單個式1序列(或F1TS)和單個式6序列或F6TS (任選地由合適的接頭分開和/或與合適的TDM結(jié)合)組成 的PIRAs。
在本發(fā)明上下文中的"拮抗作用"指當(dāng)在胰島素和IR的存在下時， 化合物(例如，PIRA)可檢測地減少胰島素作用的能力。拮抗劑可以阻 斷胰島素與IR的結(jié)合，在胰島素結(jié)合后減少一種或多種胰島素介導(dǎo)的 IR活性(其中的幾個例子已得到充分表征)，或兩者。 一般而言，PIRAs 可以顯示任何可檢測水平的IR拮抗作用。在一個方面，本發(fā)明提供了 這樣的PIRAs，其使胰島素介導(dǎo)的IR活性減少至少約10% 、至少約20 %、至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%或更多。
在具體方面，本發(fā)明提供了這樣的PIRAs，其具有增加血糖和/或使 哺乳動物宿主中的胰島素作用減少至少約4小時、至少約5小時、至少 約6小時、至少約7小時、至少約8小時、或甚至至少約9小時的時間 段的能力。
一般地，PIRA核心基序的F6TS位于相關(guān)FITS的C末端(即，核 心基序F6TS在核心基序中相對于FITS定位，從而使得F6TS的N末端 部分最接近F1TS的C末端部分定位)，從而使得PIRAs—般可以被說 成具有式l,式6-方向(或Fl/F6方向)。
PIRA—般可以具有任何合適的大小、構(gòu)象等。PIRAs的特征可以是 (且一般地，且通常有利地，是)長度約50個氨基酸或更少的單鏈肽， 例如長度約30 -45個氨基酸(例如，長度35 - 44個氨基酸)。然而， 包含此種大小和組成的PIRA部分或序列的含IRA的較大蛋白質(zhì)、多聚 體蛋白、多肽鏈蛋白質(zhì)衍生物、或復(fù)合蛋白質(zhì)等，也可以使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù) 產(chǎn)生，并且^見為本發(fā)明的另一個特征。PIRAs的特征可以在于缺乏IR抗 體的特征。因此，例如，PIRAs —般不包含IR抗體中發(fā)現(xiàn)的構(gòu)架區(qū)和 CDR序列。此外，PIRAs—般缺乏已知的抗IR抗體的結(jié)構(gòu)(例如，缺 乏IgG分子的經(jīng)典四聚結(jié)構(gòu))。
式1序列被定義為包含序列GSLDESFYDWFERQLG ( Gly Ser Leu Asp Glu Ser Phe Tyr Asp Trp Phe Glu Arg Gln Leu Gly) (SEQIDNO: 1) 的氨基酸序列("式1")。式1樣序列可以被定義為與SEQ ID NO: 1 非常相似的序列(即，與SEQ ID NO: 1具有至少約60%、至少約65 %、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90 %、或至少約95%的同一性，但小于100%的同一性的序列(此類相似序列可以被稱為式1樣序列))，其可以與F6TS—起組合在核心基序 中以產(chǎn)生PIRA。在一個方面，本發(fā)明提供了其中式l的約1-6個N末 端殘基被缺失和/或置換(例如，殘基l-5被缺失、殘基2-6被缺失、 殘基1 - 4被缺失以及殘基5和6被其他合適的殘基置換等)的PIRAs。 因此，例如，在一個方面，本發(fā)明提供了包含F(xiàn)1TS的PIRAs,所述F1TS 基本上由序列FYDWFERQLG (SEQIDNO: 2)組成。在另一個方面， 本發(fā)明提供了僅僅以包含這樣的序列為特征的PIRAs,所述序列包含基 序FYDWF (SEQIDNO: 3)。在另一個方面，本發(fā)明提供了同樣可以 或可替代地以具有這樣的序列為特征的FlTSs,所述序列標(biāo)記為式1 Asp9殘基(或與其對應(yīng)的殘基)被Gly殘基(或類似的等價殘基)置換， 從而使得PIRA包含基序FYGWF ( SEQ ID NO: 4 ),例如在基本上由 FYGWFERQL(K SEQ ID NO: 5 )或GSLDESFYGWFERQLG( SEQ ID NO: 6)組成的FITS的背景中。在另外一個方面，本發(fā)明提供了包含F(xiàn)ITS 的PIRAs，所述FITS同樣(除了一個或多個前述特征外)或可替代地 以式1殘基Gly16 (或與其對應(yīng)的殘基)的缺乏或置換為特征。 GSLDESFYDWFERQL ( SEQ ID NO: 7 ) 、 GSLDESFYGWFERQL ( SEQ ID NO: 8 ) 、 FYDWFERQL ( SEQ ID NO: 9 )和FYGWFERQL ( SEQ ID NO: 10)是此種FITSs的例子。在另外一個方面，本發(fā)明提供了包含 FlTS的PIRAs,所述F1TS同樣(即，除了 一個或多個前述特征外)或 可替代地以式1的Arg13 (或相應(yīng)的殘基)的缺失或置換為特征。如已 指出的，這些各種具體修飾可以進行組合，從而使得本發(fā)明提供了例如 PIRAs,其特征在于包含才艮據(jù)式Xaa22 Xaa23 Xaa24Xaa25 Xaa26Xaa27 Phe Tyr Xaa3o Trp Phe Glu Xaa34 Gin Leu Xaa37 ( SEQ ID NO: 11)的FITS, 其中Xaa22是任選存在的Gly殘基；Xaa23是任選存在的Ser殘基；Xaa24 是任選存在的Leu殘基；Xaa25是任選存在的Asp殘基；Xaa26是任選存 在的Glu殘基；Xaa27是任選存在的Ser殘基；Xaa3o是Asp或Gly殘基； Xaa34是任何合適的氨基酸殘基(在一個方面Xaaw選自Gln、 His、 Lys、 Glu、 Asn、 Asp牙口 Ser; 在另 一個方面Xaa34選自Ala、 Cys、 Phe、 His、 Ile、 Leu、 Met、 Thr、 Val、 Trp和Tyr;和在另外一個方面Xaa34選自 Glu、 Gln、 Thr、 Lys、 Ser、 Gly、 Pro、 Asp和Glu) , 4旦一4殳地是Arg (雖然在一個方面特征是不是Arg);且Xaa37是任選存在的Gly (式 1A)。在本發(fā)明的氨基酸序列背景中的同 一 性可以通過Needleman-Wunsch比對分析(參見Needleman和Wunsch, J. tWo/. S,'o/. O970 ) 48: 443-453 )進行測定，例如通過使用BLOSUM50評分矩陣用ALIGN 2.0 分析，其中起始缺口罰分為-12和延伸罰分為-2 (關(guān)于引入ALIGN程序 中的全局比對技術(shù)的討論參見Myers和Miller, CABIOS( 1989 )4: 11-17 )。 ALIGN 2.0程序的拷貝可通過San Diego Supercomputer ( SDSC ) Biology Workbench獲得。因為Needleman-Wunsch比對提供了 2個序列之間的 全面或全局同 一 性測量，所以應(yīng)認(rèn)識到可以是較大肽序列的部分或子序 列的耙序列可以以類似于完整序列的方式使用，或可替代地，局部比對 值可以用于評估子序列之間的關(guān)聯(lián)，如通過例如Smith-Waterman比對 U嵐腸/. ) 147: 195-197)測定的，所述Smith-Waterman比對可以通過可用的程序獲得(可能適合于分析同 一性的其他局部比對 法包括應(yīng)用啟發(fā)式局部比對算法的程序，例如FastA和BLAST程序)。 用于評估同 一性的進一步相關(guān)的方法在例如國際專利申請WO 03/048185中得到描述。除了具有FITS夕卜，PIRAs進一步特征在于包含至少一個(且一般 地僅有1個)根據(jù)式XaaLeu Xaa Xaa Glu Trp Ala Xaa Xaa Gin Cys Glu Val Xaa Gly Arg Gly Cys Pro Ser Xaa ( SEQ ID NO: 12 )的氨基酸序列， 其中Xaa表示任何合適的氨基酸殘基(式6)。在本發(fā)明的具體方面，PIRA的F1T序列和F6T序列直接互相接觸。在本發(fā)明的具體且通常有利的方面，本發(fā)明提供了包含F(xiàn)1T序列和 F6T序列(所述F6T序列位于F1T序列的C末端)的PIRAs,其中所述 F1T序列和F6T序列由接頭分開。在一個方面，接頭是非氨基酸部分。 此種部分的例子包括脂族或芳族碳鏈和基于一個或多個聚乙二醇(PEG)如美國專利申請20030195147、 20030236190、 20040023887,以及國際 專利申請PCT/EP2005/054095和WO 2005082404中找到)。在具體通 常有利的方面，本發(fā)明提供了包含F(xiàn)IT序列和F6T序列(以式1,式6-方向)的PIRAs，其中所述F1T序列和F6T序列由一個或多個氨基酸殘 基分開。在具體方面，F(xiàn)1T序列(F1TS)和F6T序列(F6TS )由1 - 10 個氨基酸殘基分開，例如1-8個氨基酸殘基，例如l-7個、2-7個、 2-6個、l-6個、2-5個、l-5個、3-6個、3 - 7個或3 - 5個氨基酸殘基，或通過包含在此類范圍內(nèi)的任何數(shù)目的殘基(例如1個、2個、 3個、4個、5個、6個或7個殘基)。除非另有說明，任何合適的氨基 酸序列接頭都可以用于連接F1TS和F6TS。合適的接頭序列的性質(zhì)是本 領(lǐng)域眾所周知的，并且因此無需在本文中詳細(xì)討論。 一般而言，氨基酸 序列接頭一般主要由"柔性"氨基酸殘基組成(至少50%、至少70%、 至少85%、至少90%組成等)。被視為柔性且通常單獨或組合用作接 頭序列的天然存在的氨基酸殘基包括絲氨酸殘基、甘氨酸殘基等(例如， 在一個方面本發(fā)明提供了包含接頭的PIRAs,所述接頭包含根據(jù)式Xaau XaaL2XaaL3 XaaL4 XaaL5 XaaL6的序列，其中XaaLi XaaL2 XaaL3 XaaL4 XaaL5 XaaL6中的每一個獨立地是Gly或Ser (此類接頭的例子在包含序列Gly Gly Ser Gly Gly Ser ( SEQ ID NO: 13 )的接頭中具體體現(xiàn))。然而，Gln、 Thr、 Lys、 Pro、 Asp、 Phe和Arg殘基也可以被一見為足夠"柔性的"，盡 管一般地如果存在的話許多此種殘基的包括是較不優(yōu)選的。也可以使用 具有類似"柔性"的合成和經(jīng)修飾的氨基酸殘基。接頭中某一百分比的殘 基也可以取自"非柔性"殘基，例如當(dāng)接頭被賦予其他生物學(xué)功能時。在 這個和其他背景中可以適當(dāng)?shù)負(fù)饺隤IRAs內(nèi)的各種非常見氨基酸殘基是 本領(lǐng)域已知的并且在本文引入的參考文獻(xiàn)中得到描述，并且選擇具有所 需性質(zhì)的殘基在普通技術(shù)人員僅使用常規(guī)實驗的技術(shù)范圍內(nèi)。例如，當(dāng) 需要a螺旋接頭時，可以使用非天然氨基酸例如Aib (氨基異丁酸)， 并且如果需要卩轉(zhuǎn)角，那么接頭可以包含Gly-Pro序列或非天然序列。 一般而言，氨基酸序列接頭限于氨基酸，并且不包含任何非氨基酸接頭 部分。在可替代方面，可以使用由一個或多個氨基酸殘基和非氨基酸連 接部分組成的4妾頭。在一個方面，本發(fā)明提供了包含F(xiàn)1T序列和F6T序列(以式1，式6 方向)的PIRAs,其中PIRA以包含末端衍生部分("TDM")為特征。 一般而言，末端書f生部分可以是促進PIRA在體內(nèi)(即，在哺乳動物宿 主中)的穩(wěn)定性和/或為PIRA提供具有其他所需性質(zhì)例如改善的溶解度 或改善的藥學(xué)穩(wěn)定性的任何衍生部分。此類性質(zhì)的測量可以通過常規(guī)使 用的方法來完成。一般的TDMs包括酰基(例如，乙?；?和酰胺基(換言之， 一般 的TDM相關(guān)的PIRAs包含至少一個(且一般地僅有1個或2個)?；?衍生或酰胺衍生的氨基酸基)。含TDM的PIRA還可以任選地以包含使F1TS和F6TS分開的接頭為特征，例如氨基酸序列接頭。 一般地， 包含TDM的任何類型的PIRA將包含位于(直接地或經(jīng)由接頭(氨基 酸序列接頭或非氨基酸序列接頭)，但一般直接地)F6TS的C末端的 TDM (且通常PIRA將包含僅1個如此定位的TDM),通常其中F6TS 的末端構(gòu)成PIRA的末端。在具體方面，本發(fā)明提供了包含式l,式6方向的FITS和F6TS的 PIRAs，其中所述FITS和F6TS通過氨基酸序列接頭進行連接或分開， 其中F6TS的特征是不選自WLDEEWAQVQCEVYGRGCPS ( SEQ ID NO: 14)。在另一個方面，本發(fā)明提供了具有此種特征的PIRAs,其中 所述F6TS的特征是不選自 WLDEEWAQVQCEVYGRGCPS或 WLDQEWAWVQCEVYGRGCPS ( SEQIDNO: 15)。在另外一個方面， 本發(fā)明提供了具有FT6序列的PIRAs,所述FT6序列的特征是與SEQ ID NO: 14、 SEQIDNO: 15或SEQ ID NO: 14和SEQ ID NO: 15兩者具 有約95%或更少、約90%或更少、約85%或更少、約80%或更少、或 甚至約75%或更少的同一性。在更具體的方面，本發(fā)明提供了包含這樣 的F6TS的PIRAs,所述F6TS與SEQIDNO: 14或SEQ ID NO: 15具 有70 - 95 % 、 75 - 95 % 、 80 - 95 % 、 85 - 95 % 、 90- 95 % 、 70- 90 % 、 75 - 90%、 75 - 85%、 75 - 80%、 80 - 90%、 80 - 85 % 、約80%、或約 85 %的同 一性。此類PIRAs可以任選地進一步以包含一個或多個TDMs 為特征。在另一個方面，本發(fā)明提供了包含這樣的F6TS的PIRAs,所述F6TS 的特征是與SLEEEWAQIQCEVWGRGCPSY ( SEQ ID NO: 16 )具有約 70 - 95%的同一性，例如約75 - 95%、 80 - 95%、 85 - 95%、 90-95 %、 90%、 95%、 85%、 80%、 75%、 75 - 90 %或80 — 90 %的同 一性。 此種PIRAs可以任選地與FITS和F6TS之間的接頭結(jié)合，所述接頭一 般是氨基酸序列接頭。此種PIRAs還可以與一個或多個TDMs結(jié)合或可 替代地與一個或多個TDMs結(jié)合。例如，此種PIRA可以包含位于F6TS 的C末端Tyr殘基處(所述C末端殘基通常充當(dāng)PIRA的C末端)或替 代Tyr殘基或另 一個近末端殘基的殘基(例如在其中F6TS缺乏Tyr21的 此種F6TS的情況下將視為與Ser2Q "對應(yīng)"的殘基)處的單個TDM。在一個方面，本發(fā)明提供了包含F(xiàn)6TS的PIRAs,其中式6中包含 的1個或2個Cys殘基(或F6TS中的相應(yīng)Cys殘基)被缺失或置換。此種F6TS還可以顯示本文描述的就F6TSs而言的任何特征或特征組合 (例如，在其他方面包含根據(jù)式6a (下文討論的)的序列-即，本發(fā)明 提供了包含根據(jù)式6a的序列的PIRAs，但其中它的1個或2個Cys殘基 獨立地(如果2個Cys殘基都受影響)被缺失或被另 一個合適的殘基或 部分置換)。在另 一 個方面，本發(fā)明提供了以保留定位類似地式6的Cys殘基的 2個Cys殘基為特征的PIRAs。此種F6TS可以顯示本文描述的就F6TSs 而言的任何特征或特征組合。在另一個示例性和具體方面，本發(fā)明提供了 IPRAs,其包含根據(jù)式 Xaai Leu Xaa3 Xaa4 Glu Trp Ala Xaa8 Xaa9 Gin Cys Glu Val XaaM Gly Arg Gly Cys Pro Ser Xaa" ( SEQ ID NO: 17 )的F6TS,其中Xaa!是任何合 適的氨基酸殘基；Xaas是Asp、 Glu或另 一種合適的酸性殘基；Xaa4是 任何合適的氨基酸殘基(一般地選自C、 D、 E、 H、 K、 N、 Q、 R、 S 和T的殘基；更一般地選自N、 E、 Q、 H、 R和K的殘基；且甚至更一 般地選自N、 E、 Q和K的殘基)；Xaag是任何合適的氨基酸殘基；Xaa9 是任何合適的氨基酸殘基(但一般地選自I、 L、 V、 M、 F、 G和A;更 一般地選自I、 L、 V和M;且甚至更一般地選自I、 L或V) ; Xaa,4是 環(huán)烯基結(jié)合的氨基酸殘基(例如，W、 F、 Y或H; —般地W、 F或Y); 且Xaau不存在或是不帶電的親水性或極性氨基酸殘基(例如，S、 T、 N、 Q、 Y、 C或G)(式6a)。包含式6a序列的PIRAs可以以包含如 上文討-〖侖的TDM,和/或包括FlTS和式6a序列(如上文描述的)之間 的接頭(例如，氨基酸序列接頭)為特征。式6a PIRAs還可以或可替代 地以下述限制為特征式6a序列不是WLDEEWAQVQCEVYGRGCPS (即，SEQ ID NO: 14 ) 、 WLDQEWAWVQCEVYGRGCPS (即，SEQ ID NO: 15)或SLEEEWAQIQCEVWGRGCPSY (即，SEQ ID NO: 16), 并且在更具體方面，此種PIRAs可以以下述事實為特征其中包含的式 6a序列與SEQ ID NOs: 14 - 16中的一個或多個約70 _ 95 % 、例如約 75 - 90%、例如約75 - 85%、例如約75 - 80%、例如約80 - 90%、例 如約75%、 80%、 85%或90%相同。在另外一個示例性和具體方面，本發(fā)明提供了 PIRAs，其包含根據(jù) 式Xaai Leu Xaa3 Xaa4 Glu Trp Ala Xaag Xaa9 Gin Cys Glu Val Xaa" Gly Arg Gly Cys Pro Ser Xaa21 ( SEQ ID NO: 18 )的F6TS,其中Xaa!是Trp13或Ser, Xaa3是Glu或Asp; Xaa4是Glu或Gin; Xaa8是Gin或Trp; Xaa9 是lie或Val; Xaa^是Trp或Tyr;且Xaa21不存在或是Tyr (式6b)。包含式6b序列的PIRAs可以以包含如上文討論的TDM，和/或包括 FlTS和式6b序列(如上文描述的)之間的接頭(例如，氨基酸序列接 頭)為特征。式6b PIRAs還可以或可替代地以下述限制為特征式6b 序列不是WLDEEWAQVQCEVYGRGCPS (即，SEQ ID NO: 14)、 WLDQEWAWVQCEVYGRGCPS (即，SEQ ID NO: 15)或 SLEEEWAQIQCEVWGRGCPSY (即，SEQ ID NO: 16),并且在更具 體方面，此種PIRAs可以以下述事實為特征其中包含的式6b序列與 SEQIDNOs: 14 - 16中的一個或多個約70 - 95 % 、例如約75 - 90%、 例如約75 - 85 % 、例如約75 - 80 % 、例如約80 - 90 % 、例如約75 % 、 80 % 、 85 %或90 %相同。在另外一個方面，本發(fā)明提供了包含選自 WLDEEWAQVQCEVYGRGCPS (即，SEQ ID NO: 14)、 WLDQEWAWVQCEVYGRGCPS (即，SEQ ID NO: 15)、和 SLEEEWAQIQCEVWGRGCPS (即，SEQ ID NO: 16 )的F6TS的PIRAs。 如同本文描述的其他PIRAs,此種PIRAs可以包含F(xiàn)ITS和F6TS之間的 接頭(例如，氨基酸序列接頭)和/或TDM ( —般地位于F6TS的C末 端處或位于接近F6TS末端定位的殘基處)。在另一個方面，本發(fā)明提供了以包含一個或多個先前描述的特性為 特征的PIRAs,其中PIRA的式6型序列不包含序列 SLEEEWAQIQCEVWGRGCPS ( SEQ ID NO: 19)。在更具體的示例性方面，本發(fā)明提供了包含根據(jù)式 GSLDESFYDWFERQL-ZrSLEEEWAQIQCEVWGRGCPS-Z2 ( SEQ ID NO: 20)的氨基酸序列(核心基序序列)的PIRAs，其中表示氨基 酸接頭，且Z2表示任選存在的末端衍生部分、氨基酸或氨基酸序列(例 如，穩(wěn)定序列，例如清蛋白或清蛋白衍生的序列)、衍生的氨基酸殘基、 或包含C末端衍生的氨基酸殘基的氨基酸序列。由本發(fā)明提供的具體的示例性PIRA是("S661")。在另外一個方面，本發(fā)明提供了包含核心基序的PIRAs,所述核心基(SEQ ID NO: 19 )具有約65 - 95 %的同 一性，例如約70 - 95 % 、 75 - 95 %、 80 -95%、 85 - 95%、 90 - 95 % 、 65 -90%、 70-90%、 75 -90%、 85 -90%、 65 - 85%、 70- 85%、 75 - 85%、 65%、 70%、 75%、 80%、 85 %或90 %的同 一性。此種"S661樣PIRAs"可以以包含TDM為特征，所 述TDM —般與C末端Tyr殘基(或?qū)⒁暈榕c其"對應(yīng)"的殘基-如通過例 如序列比對分析測定的)結(jié)合。PIRAs可以通過任何合適的方法進行制備。例如，PIRAs,特別是 非衍生PIRAs可以作為融合蛋白在任何合適的表達(dá)系統(tǒng)中生產(chǎn)。與重組 融合蛋白生產(chǎn)相關(guān)的方法和原理是本領(lǐng)域眾所周知的并且無需在本文 中詳細(xì)討論。標(biāo)準(zhǔn)肽合成(例如，固相肽合成)也可以用于產(chǎn)生PIRAs。 可以對此種重組生產(chǎn)或合成的肽進一步實施衍生、綴合、多聚化等，以 形成在本發(fā)明范圍內(nèi)的更復(fù)雜的分子。PIRAs同樣可以通過任何合適的 技術(shù)進行純化。例如，包含例如特定的純化"標(biāo)記"(純化促進序列或部 分)的"PIRA融合蛋白"可以通過已知方法產(chǎn)生并且用作用于獲得純化的 PIRA分子的手段。對于非融合蛋白PIRAs的直接純化，方法例如差示 電泳、層析、離心也可以如同針對非融合蛋白PIRA的特征的親和力(例 如基于抗體的)方法那樣使用。PIRAs還包括蛋白質(zhì)"衍生物"(或"PIRA衍生物")，所述蛋白質(zhì)"衍 生物"包括但不限于，如上所述的TDM結(jié)合的PIRAs。術(shù)語"衍生物"一 般指其中包含的一個或多個氨基酸殘基已進行化學(xué)修飾(例如通過烷基 化、?；?、酯形成、酰胺形成或其他相似類型的修飾)或與一個或多個 其他異源取代基(例如，親脂取代基、PEG部分、由合適的有機部分接 頭連接的肽側(cè)鏈等)共價結(jié)合的蛋白質(zhì)或肽。一般而言，本文描述的PIRAs可以通過包括任何合適數(shù)目的此種經(jīng) 修飾的氨基酸和/或與此種綴合的取代基結(jié)合進行修飾。在這個背景中的 適合性一般由衍生物相對于相應(yīng)的"棵露"(即，非衍生)配對物PIRA 充當(dāng)IR拮抗劑的能力來確定。 一個或多個經(jīng)修飾的氨基酸的包括在下 述方面可以是有利的，例如(a)增加多肽血清半衰期，(b)減少多肽 抗原性，或(c)增加多肽保存穩(wěn)定性。 一個或多個氨基酸例如在重組 生產(chǎn)期間共翻譯或翻譯后地進行修飾(例如，在哺乳動物細(xì)胞中的表達(dá) 期間在N-X-S/T基序處的N聯(lián)糖基化)或通過合成方法進行修飾。經(jīng)修飾的氨基酸的非限制性例子包括糖基化氨基酸、硫酸化氨基酸、異戊二烯化(prenlyated)(例如，法尼基化、雜牛兒基櫳牛兒基化)氨基酸、 乙酰化氨基酸、?；被?、聚乙二醇化(PEGylated)氨基酸、生物素 化氨基酸、羧基化氨基酸、磷酸化氨基酸等。在氨基酸修飾中足以指導(dǎo) 技術(shù)人員的參考在文獻(xiàn)中自始至終充滿。示例性規(guī)程在例如Walker (1998 ) PROTEIN PROTOCOLS ON CD-ROM Humana Press, Towata, NJ 中找到。 一般地，經(jīng)修飾的氨基酸選自糖基化氨基酸、聚乙二醇化氨基 酸、法尼基化氨基酸、?；被?、生物素化氨基酸、與脂質(zhì)部分綴合 的氨基酸、和與有機衍生劑綴合的氨基酸。PIRAs可以通過與聚合物共價綴合進行化學(xué)修飾以例如增加其循環(huán) 半衰期。示例性聚合物以及使此類聚合物與肽附著的方法在例如美國專 利號4,766,106; 4,179,337; 4,495,285;和4,609,546中舉例說明。另外 的舉例說明性聚合物包括聚氧乙基化多元醇和聚乙二醇(PEG )部分(例 如，PIRA可以與PEG綴合，所述PEG的分子量為約1,000 -約40,000, 例如約2000 -約20,000,例如約3,000- 12,000，并且甚至更特別地約 5,000)。因此，可以對本發(fā)明的肽實施本領(lǐng)域已知的一種或多種修飾，所述 修飾可以用于處理保存穩(wěn)定性、藥物代謝動力學(xué)和/或肽的生物活性的任 何方面，例如效力、選擇性和藥物相互作用?？梢詫﹄膶嵤┑幕瘜W(xué)修飾 包括但不限于，肽與下述中一種或多種的綴合聚乙二醇(PEG)、單 甲氧基-聚乙二醇、葡聚糖、聚(N-乙烯吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均 聚物、環(huán)氧丙烷/環(huán)氧乙烷共聚物、聚丙二醇、聚氧乙基化多元醇(例如， 甘油)和聚乙烯醇、多聚乙酰神經(jīng)氨酸或其他基于碳水化合物的聚合物、 氨基酸聚合物和生物素衍生物。蛋白質(zhì)在Cys殘基處的PEG綴合公開于 例如Goodson, R. J.和Katre, N. V.( 1990 )Bio/Technology 8, 343和Kogan, T, P. ( 1992 ) Synthetic Comm. 22, 2417中。其他有用的修飾包括但不限于酰化，所述?；梢允褂脴?biāo)準(zhǔn)和已知 方法來進行，例如，使用例如美國專利系列號6,251，856和WO 00/55119 中描述的方法和組合物。在一個方面，本發(fā)明提供了制備長效(高度穩(wěn) 定)的PIRA衍生物的方法，和此種衍生PIRAs。在一個方面，長效PIRA 通過制備包含"PIRA部分"和一種或多種"融合配偶體部分"的融合蛋白 來獲得，所述"融合配偶體部分"包含與增加的體內(nèi)穩(wěn)定性相關(guān)的結(jié)構(gòu)域、序列等。此種融合配偶體序列的例子包括衍生自清蛋白、運鐵蛋白 和抗體序列的序列。清蛋白融合蛋白的例子、生產(chǎn)此種融合蛋白的方法、和合適的清蛋白融合配偶體序列在例如美國專利5,876,969和5,766,883 中得到描述。在另一個方面，長效PIRA通過經(jīng)由化學(xué)修飾例如酰化(通 過合適的接頭)使PIRA衍生來獲得，所述酰化可以例如導(dǎo)致具有與清 蛋白結(jié)合的同時充當(dāng)PIRA的可能性的強清蛋白結(jié)合。后者也可以通過 修飾肽序列或用序列使其延伸來達(dá)到，所述序列能夠與較大的蛋白質(zhì) (例如，成骨生長肽(OGP),其與a2-巨球蛋白結(jié)合)結(jié)合。PIRAs 二i以至少基本上純-^式使用且提-。"基本上純的，，分子 是在其中發(fā)現(xiàn)它的組合物中相對于它所屬的分子種類是占優(yōu)勢種類的 分子(例如，基本上純的蛋白質(zhì)是在其中發(fā)現(xiàn)它的組合物中占優(yōu)勢的蛋 白質(zhì)種類)?；旧霞兊姆N類構(gòu)成組合物中至少約50%的分子類型，且 一般將構(gòu)成組合物中至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約 90%、至少約95%或更大重量百分比的分子種類。通常，包含PIRA的 組合物在組合物中所有存在的肽種類的背景中對于PIRA或在預(yù)期用途 的背景中至少相對于基本上活性的肽種類將顯示出至少約98 % 、 98 %或 99%的同質(zhì)性。例如，肽穩(wěn)定劑/緩沖劑例如清蛋白可以有意地包括在最 終的藥物制劑中，而不妨礙PIRAs的活性，并且因此可以從此種純度計 算中排除。在基本上純的組合物的背景中不干擾基本活性的雜質(zhì)的存在 也是可接受的。純度可以通過適合于給定化合物的方法(例如，層析法； 瓊脂糖和/或聚丙烯酰胺凝膠電泳；HPLC分析；等)進行測量。在一個方面，本發(fā)明涉及包含"分離的"PIRA的組合物。"分離的分 子"指不與顯著水平(例如，超過約1%、超過約2%、超過約3%、或 超過約5% )的任何外來和不希望有的生物分子結(jié)合的分子，所述生物 分子例如在其中生產(chǎn)PIRA的細(xì)胞、細(xì)胞培養(yǎng)物、化學(xué)介質(zhì)或動物內(nèi)包 含的非PIRA生物分子。分離的分子還指由于人為干預(yù)(無論是自動化、 手工還是兩者)已通過此種純度階段顯著時間量(例如，至少約10分 鐘、至少約20分鐘、至少約1小時或更長)的任何分子。在由本發(fā)明 提供的各種組合物中的許多中，例如在包含一種或多種藥學(xué)上可接受的 載體的組合物中，就組合物中的總分子種類數(shù)目而言PIRA可以以相對 少量存在(例如，在包含大量藥學(xué)上可接受的載體、穩(wěn)定劑和/或防腐劑的組合物情況下)。在一些情況下，另外的肽，例如牛血清清蛋白(BSA) 可以與先前純化的PIRA—起包括在此種組合物中。然而，^假如組合物 的此種另外的組成成分對于PIRA的預(yù)期應(yīng)用是可接受的，那么此種組 合物仍可以被描述為包含分離的PIRA。換言之，術(shù)語"分離的"不意欲排 除與其他化合物或材料的人工或合成混合物，例如可以形成藥學(xué)上可接受的制劑的部分。在一個方面，本發(fā)明提供了包含基本上不含其他IR結(jié)合分子的一 種或多種PIRAs的組合物。在另一個方面，本發(fā)明提供了包含具有不同特征的許多PIRAs的組 合物(例如，本發(fā)明在一個方面提供了具有不同特征的PIRAs的"混合 物(cocktail)")。用于藥學(xué)用途的PIRA組合物一般包含至少生理學(xué)有效量并且通常 希望地包含治療有效量的PIRA、 PIRAs的組合、或一種或多種PIRA( s) 和另外的活性/治療劑。術(shù)語例如"治療有效量，，指當(dāng)以合適的劑量和合適的時間段遞送給 一般對化合物或組合物響應(yīng)的宿主時，足以在宿主中達(dá)到所需治療結(jié)果 和/或一般能夠在基本上相似的宿主(例如，具有與待治療患者相似特征 的患者)中達(dá)到此種治療結(jié)果的生物學(xué)上活性化合物或組合物的量。 PIRA的治療有效量可以根據(jù)因素如疾病狀態(tài)，個體的年齡、性別和重 量，以及PIRA在個體中引發(fā)所需應(yīng)答的能力而變。治療有效量還是其 中治療有利作用超過試劑的任何毒性或有害作用的量。示例性療效包括 例如，(a)特定受試者或基本上相似的受試者群體中的疾病、病癥或 相關(guān)狀況嚴(yán)重度中的減少；(b)與疾病、病癥或狀況相關(guān)的一種或多 種癥狀或生理狀況中的減少；和/或(c)預(yù)防效果。疾病嚴(yán)重度的減少 可以包括例如，(a)病癥傳播中可測量的減少；(b)受試者中積極結(jié) 果變化中的增加(例如，至少約5%、 10%、 15%、 2(T/q、 25%或更多 的增加)；(c)存活或壽命增加的機會；和/或(d)與疾病狀態(tài)存在相 關(guān)的 一種或多種生物標(biāo)記中可測量的減少(例如癥狀量和/或嚴(yán)重度中的 減少；等)。治療有效量可以在個別受試者的背景中，或更通常地在基 本上相似的受試者群體的背景中(例如，參加涉及PIRA組合物的臨床 試驗的具有相似病癥的許多人類患者，或在臨床前實驗的背景中用于測 試PIRA的具有相似特征組的許多非人類哺乳動物)進行測量。用于人治療應(yīng)用/方案的PIRA的合適劑量預(yù)期為約1-200 nmol/kg，例如約1 - 100 nmol/kg。PIRAs還可以以預(yù)防有效量遞送給宿主作為疾病/病癥預(yù)防計劃的 部分或用于以其他方式增加 一般健康。"預(yù)防有效量"指在所需劑量和時 間|殳時在 一般對此種化合物或組合物響應(yīng)的宿主中有效以在宿主中達(dá) 到所需預(yù)防結(jié)果，或一般能夠在基本上相似的宿主中達(dá)到此種結(jié)果的活 性化合物或組合物的量。示例性預(yù)防效果包括與未接受預(yù)防方案的相似 患者中的相比較，發(fā)展病癥的可能性中的減少、病癥強度或傳播中的減 少、在危急病癥期間存活可能性中的增加、疾病狀況開始中的延遲、危 急狀況傳播中的減少等。 一般地，因為預(yù)防劑量在疾病前或在疾病早期 時在受試者中使用，所以對于特定PIRA預(yù)防有效量將小于治療有效量。 預(yù)防效果還可以包括例如與未接受PIRA組合物的基本上相似患者相比 較，開始的預(yù)防、開始時間中的延遲、疾病后續(xù)嚴(yán)重度中的減少等。在另一個方面，PIRAs可以以"生理學(xué)有效"量遞送給宿主或細(xì)胞。 生理學(xué)有效量是施用于通常對此種試劑響應(yīng)的宿主后，導(dǎo)致與IR拮抗 作用相關(guān)的至少 一種生理效應(yīng)的誘導(dǎo)、促進和/或增強的活性劑的量。在包含一種或多種PIRAs的藥學(xué)上可接受的組合物制備背景中， PIRA可以與適合于一種或多種預(yù)期施用途徑的一種或多種載體(稀釋 劑、賦形劑等)組合，以提供藥學(xué)上可接受的組合物。PIRAs可以例如與乳糖、蔗糖、粉末(例如，淀粉粉末)、鏈烷酸 的纖維素酯、硬脂酸、滑石、硬脂酸鎂、氧化鎂、磷酸和硫酸的鈉和4丐 鹽、阿拉伯樹膠、明膠、藻酸鈉、聚乙烯吡咯烷和/或聚乙烯醇混合，且 任選地進一步制成片劑或膠嚢用于常規(guī)施用。可替代地，PIRA可以溶 解于鹽水、水、聚乙二醇、丙二醇、羧甲基纖維素膠體溶液、乙醇、玉 米油、花生油、棉籽油、芝麻油、黃蓍膠、和/或各種緩沖劑。其他載體、 佐劑和施用模式是藥學(xué)領(lǐng)域眾所周知的。載體或稀釋劑可以包括時間延 遲材料，例如單獨或與蠟一起的單硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯，或 其他功能上相似的材料。藥學(xué)上可接受的載體一般還包括與PIRA生理學(xué)相容的任何和所有 合適的溶劑、分散介質(zhì)、包衣、抗細(xì)菌劑和抗真菌劑、等滲和吸收延遲 劑等。藥學(xué)上可接受的載體的例子包括水、鹽水、磷酸緩沖鹽水(PBS)、 葡萄糖、甘油、乙醇等，及其任何組合。在許多情況下，可能需要在此種組合物中包括等滲劑例如糖，多元醇例如甘露糖醇、山梨糖醇、或氯 化鈉。藥學(xué)上可接受的物質(zhì)例如濕潤劑或少量的輔助物質(zhì)例如濕潤劑或
乳化劑、防腐劑或緩沖劑，其理想地可以增強PIRA、相關(guān)組合物或組
合的保存期限或有效性。關(guān)于藥物組合物的載體和其他組分的適合性可
以基于對PIRA、相關(guān)組合物或組合的所需生物學(xué)性質(zhì)的顯著負(fù)面影響 的缺乏來確定(例如，111拮抗作用中小于約20%、 15%、 10%、 5%或 1%的減少)。
根據(jù)本發(fā)明的PIRA組合物、相關(guān)組合物和組合可以以多種合適的 形式呈遞、制備和/或施用。此種形式包括例如液體、半固體和固體劑型， 例如液體溶液(例如，可注射和可輸注溶液)、分散體或懸浮液、乳劑、 微乳、片劑、丸劑、粉末、脂質(zhì)體、樹狀聚體和其他納米顆粒(nanoparticle ) (參見，例如，Baek等人，Methods Enzymol. 2003; 362: 240-9; Nigavekar 等人，Pharm Res. 2004 Mar; 21 ( 3 ) : 476-83 )、微粒和栓劑。關(guān)于任 何PIRA相關(guān)組合物的最佳形式取決于預(yù)期施用方式、組合物或組合的 性質(zhì)、和治療應(yīng)用或其他預(yù)期用途。制劑還可以包括例如粉末、糊劑、 軟膏、凝膠劑、蠟、油、脂質(zhì)、含脂質(zhì)(陽離子或陰離子)的載體、DNA 綴合物、無水吸收糊劑、水包油乳劑和油包水乳劑、乳劑、聚乙二醇(各 種分子量的聚乙二醇)、半固體凝膠、和含聚乙二醇的半固體混合物。 前述混合物中的任何一種在依照本發(fā)明的處理和治療中可以是合適的， 前提是經(jīng)由PIRA的IR拮抗作用未受制劑的顯著抑制，且制劑是生理學(xué) 相容的且與施用途徑容許的。關(guān)于與藥物化學(xué)家眾所周知的賦形劑和載 體有關(guān)的另夕卜4言息,還參見,例々口, Powell等人"Compendium of excipients for parenteral formulations"PDA J Pharm Sci Technol. 52: 238-311 ( 1998 ) 和其中的引用。
在具體方面，PIRAs可以在脂質(zhì)體中進行配制和施用。在另一個方 面，PIRAs在脂質(zhì)體中與一種或多種次級試劑一起施用。
PIRA組合物還包括包含PIRA肽和相關(guān)鹽的任何合適組合的組合 物。任何合適的鹽，例如任何合適形式的堿土金屬鹽(例如，緩沖鹽) 都可以在PIRAs的穩(wěn)定化中使用(優(yōu)選地鹽的量是這樣的，從而使得 PIRA的氧化和/或沉淀被避免)。合適的鹽一般包括氯化鈉、琥珀酸鈉、 硫酸鈉、氯化鉀、氯化鎂、硫酸鎂和氯化鈣。還提供了包含堿和一種或 多種PIRAs的組合物。用于遞送PIRA組合物的一般模式是經(jīng)由腸胃外施用(例如，靜脈 內(nèi)、皮下、腹膜內(nèi)和/或肌內(nèi)施用)。在一個方面，PIRA通過靜脈內(nèi)輸 注或注射施用于人患者。在另一個方面，PIRA經(jīng)由肌內(nèi)或皮下注射施 用。在某些治療方案中(例如，在胰島素瘤治療的情況下)瘤內(nèi)施用也 可以是有用的。
PIRAs可以以例如固體制劑(包括，例如，顆粒、粉末、發(fā)射物顆 粒或栓劑)、半固體形式(凝膠、乳膏等)，或以液體形式(例如，溶 液、懸浮液或乳劑)進行配制。PIRAs可以應(yīng)用于多種溶液中。用于依 照本發(fā)明使用的合適溶液一般是無菌的，溶解足夠量的PIRA和組合物 的其他組分，在用于制備和貯藏的條件下穩(wěn)定，并且對于提議的應(yīng)用對 受試者是無害的?？梢詫IRA實施常規(guī)藥物操作，例如滅菌，和/或其 可以包含常規(guī)佐劑，例如防腐劑、穩(wěn)定劑、濕潤劑、乳化劑、緩沖劑等。 組合物還可以被配制成溶液、微乳、分散體、粉末、巨乳劑 (macroemulsion )、脂質(zhì)體或適合于高藥物濃度的其他有序結(jié)構(gòu)。溶液 的所需流動性性質(zhì)可以通過下述被維持，例如，使用包衣例如卯磷脂， 在分散體的情況下維持所需顆粒大小，和使用表面活性劑?？勺⑸浣M合 物的延長吸收可以通過在組合物包括延遲吸收的試劑例如單硬脂酸鹽 和明膠來達(dá)到。本發(fā)明的藥學(xué)上可接受的組合物的這些和其他組分可以 賦予有利的性質(zhì)，例如改善的轉(zhuǎn)移、遞送、耐受等。
用于藥學(xué)用途的包含一種或多種PIRAs的組合物可以包括各種稀 釋劑、填充物、鹽、緩沖劑、去污劑(例如，非離子去污劑例如Tween-80 )、 穩(wěn)定劑(例如，糖或無蛋白質(zhì)的氨基酸)、防腐劑、組織固定劑、增溶 劑和/或適合于包括在用于藥學(xué)用途的組合物中的其他材料。合適組分的 例子也在例如Berge等人，J. Pharm. Sci., 6661 ) , 1-19 ( 1977) ; Wang 和Hanson, J. Parenteral. Sci. Tech: 42, S4國S6( 1988 );美國專利6,165,779 和6,225,289;以及本文引用的其他文件中得到描述。此種藥物組合物還 可以包括防腐劑、抗氧化劑、或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其他添加劑。另 外的藥學(xué)上可接受的載體是本領(lǐng)域已知的并且在下述參考文獻(xiàn)中得到 描述，例如，Urquhart等人，Lancet, 16, 367 ( 1980 ) , Lieberman等人， Pharmaceutical Dosage Forms-Disperse Systems (第2版,第3巻，1998 ); Ansel等人，Pharmaceutical Dosage Forms & Drug Delivery Systems (第7 版2000 ) ; Martindale, The Extra Pharmacopeia (第31版)，Remington'sPharmaceutical Sciences (第16 - 20版)；The Pharmacological Basis Of Therapeutics, Goodman和Gilman,編輯(第9版國1996) ; Wilson和 Gisvolds' Textbook Of Organic Medicinal And Pharmaceutical Chemistry, Delgado和Remers,編輯(第10版-1998)，以及美國專利5,708,025和 5,994，106。藥學(xué)上可接受的組合物的配制原理也在下述參考文獻(xiàn)中得到 描述，例如，Piatt, CHn. Lab Med., 7: 289-99 ( 1987 ) , Aulton, Pharmaceutics: The Science Of Dosage Form Design, Churchill Livingstone (New York ) ( 1988 ) , Extemporaneous Oral Liquid Dosage Preparations, CSHP ( 1998 ),和"Drug Dosage," J. Kans. Med. Soc., 70 (I) , 30-32 (1969)。特別適合于施用PIRA組合物和相關(guān)組合物(例如，包含PIRA 編碼核酸的組合物或包含PIRA編碼核酸的載體)的另外藥學(xué)上可接受 的載體在例如國際專利申請WO 98/32859中得到描述。
PIRA組合物可以與載體一起進行制備，所述載體將保護化合物免 于快速釋放，例如控釋制劑，包括植入體、經(jīng)皮貼劑和微膠嚢化遞送系 統(tǒng)?？梢允褂蒙锟山到獾?、生物相容的聚合物，例如乙烯乙酸乙烯酯、 聚酐、聚乙醇酸、膠原、聚原酸酯和聚乳酸及其任何的組合，以便提供 此種組合物。用于制備此種組合物的方法是已知的。參見，例如， Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, 編輯，Marcel Dekker, Inc., New York， 1978 。
在另 一個方面，本發(fā)明的組合物與用于經(jīng)口施用的賦形劑 一起配 制，例如，與惰性稀釋劑或可同化的食用載體(具體的經(jīng)口施用制劑和 方法也分別在本文其他地方得到描述)。PIRA化合物(和若需要的其 他成分)也可以封裝在硬或軟殼明膠膠嚢中，壓縮成片劑，或直接摻入 受試者的々大食內(nèi)。對于經(jīng)口治療施用，化合物可以4參入賦形劑并且以可 攝食片劑、口腔含化片劑、錠劑、膠嚢、酏劑、懸浮液、糖漿、薄片(wafer) 等形式使用。為了經(jīng)由除腸胃外施用外施用本發(fā)明的化合物，可能必須 用材料包被化合物，或使化合物與材料一起共施用，以防止其滅活。
在另一個方面，將PIRA組合物制備為注射劑，如液體溶液或懸浮 液，然而，也可以制備適合于在注射前在液體中溶解或懸浮的固體形式。 制劑還可以進行乳化。活性治療成分通常與藥學(xué)(即，生理學(xué))上可接 受的且與活性成分相容的賦形劑一起混合。合適的賦形劑是例如水、鹽 水、葡萄糖、甘油、乙醇等及其組合。此外，若需要，組合物可以包含增強活性成分有效性的少量的輔助物質(zhì)，例如濕潤或乳化劑、pH緩沖 劑。
可替代地PIRA可以被配制成作為中和的生理學(xué)上可接受的鹽形式 的藥物組合物。合適的鹽包括酸加成鹽(即，由肽分子的游離氨基形成) 以及由無才幾酸例如鹽酸或磷酸，或此種有機酸如乙酸、草酸、酒石酸、 扁桃酸等形成的鹽。由游離羧基形成的鹽也可以衍生自無機堿，例如氫 氧化鈉、鉀、銨、鈣、或鐵，和此種有機堿如異丙胺、三曱胺、2-乙氨 基乙醇、組氨酸、普魯卡因等。在組合組合物(在下文中進一步討論) 的情況下，PIRAs可以與 一種或多種另外的治療劑共配制和/或共施用。 此種組合療法可能需要較低劑量的PIRA和/或共施用的試劑，以便避免 與各種單一療法有關(guān)的可能毒性或并發(fā)癥。
在另一個方面，本發(fā)明提供了 PIRA編碼核酸(即，包含一種或多 種序列的核酸，所述序列共同或分別編碼PIRA在一種或多種合適的宿 主細(xì)胞中的表達(dá))。PIRA編碼核酸可以具有任何合適的特征且包含任 何合適的特性。因此，例如，PIRA編碼核酸可以是DNA、 RNA或其雜 交物的形式，并且可以包括非天然存在的堿基或核苷酸類似物、糖部分 的置換、另外分子(例如，攝取促進分子)的綴合；經(jīng)修飾的主鏈(例 如，促進核酸穩(wěn)定性的硫代磷酸酯(phosphothioate)主鏈)的包括、二 級結(jié)構(gòu)促進序列、或此類特征的組合。核酸一般有利地包含促進在一種 或多種靶宿主細(xì)胞中的所需表達(dá)、復(fù)制和/或選擇的部件。此種部件的例 子包括復(fù)制起點組分、選擇基因組分、啟動子組分、增強子元件組分、 多腺苷酸化序列組分、終止組分等，其眾多合適的例子是已知的。
在進一步的方面，本發(fā)明提供了包含一種或多種PIRA編碼核酸的 載體。"載體"指促進PIRA編碼核酸的表達(dá)、PIRA肽的生產(chǎn)、靶細(xì)胞的 轉(zhuǎn)染/轉(zhuǎn)化、PIRA編碼核酸的復(fù)制，促進核酸的穩(wěn)定性，促進核酸和/ 或轉(zhuǎn)化/轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的^r測，或以其他方式對PIRA編碼核酸賦予有利的 生物學(xué)和/或生理化學(xué)功能的遞送載體。本發(fā)明背景中的載體可以是任何 合適的載體，包括染色體的、非染色體的、和合成核酸載體(包含合適 的表達(dá)控制元件組的核酸序列)。此種載體的例子包括SV40衍生物、 細(xì)菌質(zhì)粒、噬菌體DNA、桿狀病毒、酵母質(zhì)粒、衍生自質(zhì)粒和噬菌體 DNA組合的載體、以及病毒核酸(RNA或DNA)載體。在一個示例性 方面，PIRA編碼核酸包含在棵DNA或RNA載體中，包括例如線性表
23達(dá)元件(如在例如Sykes和Johnston ( 1997) Nat Biotech 17: 355-59中 描述的)，致密核酸載體(如在例如美國專利6,077,835和/或國際專利 申請WO 00/70087中描述的)，質(zhì)粒載體例如pBR322、 pUC 19/18或 pUC 118/119,"蠓(midge)"具有最低限度大小的核酸載體(如在例如 Schakowski等人(2001 ) Mol Ther 3: 793-800中描述的),或作為沉淀 的核酸載體構(gòu)建體，例如CaP(V沉淀的構(gòu)建體(如在例如國際專利申請 WO 00/46147， Benvenisty和Reshef ( 1986 ) Proc Natl Acad Sci USA 83: 9551-55, Wigler等人(1978 ), Cell 14: 725，以及Coraro和Pearson( 1981 ) Somatic Cell Genetics 7: 603中描述的)。此種核酸載體及其使用是本 領(lǐng)域眾所周知的(參見,例如，美國專利5,589,466和5,973,972)。在 一個方面，本發(fā)明提供了包含PIRA編碼核酸的載體，其中所述載體適 合于在細(xì)菌細(xì)胞中表達(dá)PIRA。此種載體的例子包括例如，指導(dǎo)容易純 化的融合蛋白高水平表達(dá)的載體(例如，多功能的大腸桿菌(E. coli) 克隆和表達(dá)載體例如BLUESCRIPT ( Stratagene ) , pIN載體(Van Heeke 和Schuster, J Biol Chem 264: 5503-5509 ( 1989 ) ; pET載體(Novagen, Madison WI);等)。合適的PIRA表達(dá)載體也可以是或可替代地可以 是例如，適合于在酵母系統(tǒng)中表達(dá)的載體。適合于在酵母系統(tǒng)中表達(dá)的 任何載體都可以使用。用于在例如啤酒糖酵母(Sacc/^ramycw cewWw'ae )中使用的合適載體包括例如，包含組成型或誘導(dǎo)型啟動子例 如a因子、醇氧化酶和PGH的載體(在例如Ausubel，同上和Grant等 人，Methods in Enzymol 153: 516-544 ( 1987)中綜述)。
核酸和/或載體還可以包含編碼分泌/定位序列的核酸序列，其可以 使多肽例如新生多肽鏈靶向所需細(xì)胞區(qū)室、膜或細(xì)胞器，或其指導(dǎo)多肽 分泌至周質(zhì)間隙或細(xì)胞培養(yǎng)基內(nèi)。此種序列是本領(lǐng)域已知的，并且包括 分泌前導(dǎo)或信號肽、細(xì)胞器靶向序列(例如，核定位序列、ER保留信 號、線粒體轉(zhuǎn)運序列、葉綠體轉(zhuǎn)運序列)、膜定位/錨定序列(例如，終 止轉(zhuǎn)移序列、GPI錨定序列)等。
PIRA表達(dá)載體可以包含任何合適的啟動子、增強子和其他表達(dá)促 進元件，或與任何合適的啟動子、增強子和其他表達(dá)促進元件結(jié)合。此 種元件的例子包括強表達(dá)啟動子(例如，人CMV IE啟動子/增強子、RSV 啟動子、SV40啟動子、SL3-3啟動子、MMTV啟動子或HIVLTR啟動 子)、有效的聚腺普酸終止序列、關(guān)于在大腸桿菌中的質(zhì)粒產(chǎn)物的復(fù)制起點、抗生素抗性基因如選擇標(biāo)記、和/或方便的克隆位點(例如，多接
i;(技術(shù)人員口將認(rèn)識到:匕種術(shù)語i際上是在某些條件下相對程度的基因 表達(dá)的描述符)。在一個方面，本發(fā)明提供了包含編碼PIRA的序列的 核酸，所述序列與組織特異性啟動子可操作地連接。
在另一個方面，PIRA編碼核酸經(jīng)由病毒載體放置于宿主細(xì)胞或宿 主動物中，和/或遞送給宿主細(xì)胞或宿主動物。任何合適的病毒載體都可 以在這方面使用，并且?guī)追N是本領(lǐng)域已知的。病毒載體可以包含單獨或 與一種或多種病毒蛋白質(zhì)組合的任何數(shù)目的病毒多核苷酸，其促進本發(fā) 明的核酸在所需宿主細(xì)胞中的遞送、復(fù)制和/或表達(dá)。病毒載體可以是包 含所有或部分病毒基因組的多核苷酸、病毒蛋白質(zhì)/核酸綴合物、病毒樣 顆粒(VLP)、類似于美國專利5,849,586和國際專利申請WO 97/04748 中描述的那些的載體，或包含病毒核酸和本發(fā)明的核酸的完整病毒顆 粒。病毒顆粒病毒載體可以包含野生型病毒顆?；蚪?jīng)修飾的病毒顆粒。 病毒載體可以是需要另一種載體或野生型病毒的存在以用于復(fù)制和/或 表達(dá)的載體(即，病毒載體可以是依賴于輔助病毒的病毒)，例如腺病 毒載體擴增子。 一般地，此種病毒載體基本上由野生型病毒顆粒，或在
其蛋白質(zhì)和/或核酸含量方面進行修飾以增加轉(zhuǎn)基因容量或幫助核酸轉(zhuǎn) 染和/或表達(dá)的病毒顆粒組成(此種載體的例子包括皰滲病毒/AAV擴增 子)。 一般地，病毒載體類似于和/或衍生自通常感染人的病毒。在這方 面合適的病毒載體顆粒包括例如，腺病毒載體顆粒(包括腺病毒科的任 何病毒，或衍生自腺病毒科病毒的任何病毒)、腺伴隨病毒載體顆粒
(AAV載體顆粒)或其他細(xì)小病毒和細(xì)小病毒載體顆粒、乳頭瘤病毒載 體顆粒、黃病毒載體、a病毒載體、皰滲病毒載體、痘病毒載體、逆轉(zhuǎn) 錄病毒載體，包括慢病毒載體。此種病毒和病毒載體的例子在下述參考 文獻(xiàn)中得到描述，例如Fields等人,編輯，Virology Raven Press, Ltd., New York(第3版，1996和第4版，2001 ); Encyclopedia Of Virology, R. G. Webster等人，編輯，Academic Press(笫2版，1999 ); Fundamental Virology, Fields等人，編輯，Lippincott國Raven(第3版，1995 ), Levine,
"Viruses," Scientific American Library No. 37 ( 1992 ) , medical Virology, D. O. White等人，編輯，Acad. Press (第2版，1994),和 Introduction To Modern Virology, Dimock, N. J.等人，編輯，Blackwell Scientific Publications, Ltd. ( 1994)?？梢耘c本發(fā)明的多核苷 酸和其他核酸以及本文描述的方法一起使用的病毒載體因此包括例如， 腺病毒病毒載體；腺伴隨病毒(AAV)載體；乳頭瘤病毒載體；皰疹病 毒載體；逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，包括慢病毒載體，痘病毒載體(例如，痘苗 病毒載體)；等。
本發(fā)明還提供了包含PIRA編碼核酸、載體或其任一或兩者的組合 的重組細(xì)胞，例如酵母、細(xì)菌和哺乳動物細(xì)胞(例如，無限增殖化的哺 乳動物細(xì)胞)。例如，在一個示例性方面，本發(fā)明提供了包含穩(wěn)定整合 到細(xì)胞基因組內(nèi)的核酸的細(xì)胞，所述核酸包含編碼本發(fā)明的PIRA表達(dá) 的序列。在另一個方面，本發(fā)明提供了包含非整合的核酸例如質(zhì)粒、粘 粒、噬菌粒、或線性表達(dá)元件的細(xì)胞，所述非整合的核酸包含編碼PIRA 表達(dá)的序列。
核酸、載體和細(xì)胞在本文描述的大多數(shù)本發(fā)明方法中可以用作本發(fā) 明的PIRA蛋白質(zhì)的替代物，例如以便將一種或多種PIRAs"遞送"給培 養(yǎng)中的細(xì)胞或宿主(與通過上述的其他方法"施用"PIRA相對照(例如， 肽化合物組合物注射、吸入等))。因此，例如，本發(fā)明提供了在哺乳 動物細(xì)胞中拮抗IR的方法，所述方法包括在適合于核酸表達(dá)和PIRA生 產(chǎn)的條件下，將包含PIRA編碼核酸的載體引入合適的細(xì)胞，從而使得 表達(dá)的PIRA與包含對其響應(yīng)的IRs的細(xì)胞接觸以便拮抗此種IRs的活 性。
本發(fā)明還提供了包含PIRA編碼核酸或包含其的載體的轉(zhuǎn)基因生 物。合適的轉(zhuǎn)基因生物包括小鼠、大鼠、雞、植物、牛、山羊、豚鼠、 猴和其他非人類靈長類動物。轉(zhuǎn)基因動物可以通過根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)穩(wěn)定引
入PIRA編碼核酸來生產(chǎn)。
本發(fā)明的另 一個方面在PIRAs、 PIRA組合物以及相關(guān)分子和組合物 (例如，PIRA編碼核酸，相關(guān)載體等)的新用途中具體體現(xiàn)。
在一個方面，本發(fā)明提供了治療受試者(例如，哺乳動物宿主，例 如家庭寵物、家畜或人患者)中其中IR拮抗作用是有利的疾病、病癥 或狀況的方法，所述方法包括將治療有效量的PIRA施用(或遞送，除 非另有說明，這些術(shù)語一般在本文中是可互換的)于受試者，以便治療 疾病、病癥或狀況。術(shù)語例如"治療"指以預(yù)防任何癥狀或疾病狀態(tài)發(fā)展 為目的，或以減輕、改善或根除(治愈)已發(fā)展的此類癥狀或疾病狀態(tài)為目的，遞送(例如，施用)有效量的治療上活性的本發(fā)明PIRA化合 物或組合物。術(shù)語"治療"因此一般意欲包括預(yù)防治療。然而，應(yīng)當(dāng)理解 本發(fā)明的治療方案和預(yù)防方案也可以被^L為本發(fā)明分開和獨立的方面。 在另一個方面，本發(fā)明提供了 PIRAs在此種病癥和狀況治療中有用的藥 物生產(chǎn)中的用途。如上所述，PIRAs可以個別地或與其他藥理學(xué)活性劑 組合施用。應(yīng)當(dāng)理解此種組合療法包含不同的治療方案，包括但不限于， 在單一劑型中或在不同的、個別劑型中共同施用多種試劑。如果試劑以 不同劑型呈現(xiàn)，那么施用可以是同時或接近同時的或可以遵循包含不同 試劑施用的任何預(yù)定方案。
在一個方面，本發(fā)明提供了治療受試者中的高胰島素血癥的方法， 所述方法包括給受試者遞送有效量的PIRA以便治療所述狀況。在一個 方面，本發(fā)明提供了治療患有高胰島素血癥的受試者(例如，人受試者) 的方法，所述高胰島素血癥的特征是對于群體組(例如，具有正常葡萄 糖耐量和無糖尿病史或藥療法使用的非肥胖男性群體)具有對應(yīng)于至少 約第75百分位空腹胰島素水平(例如，至少約第80百分位、第85百 分位、第90百分位、第95百分位等)的血液胰島素水平。在一個方面， 患有高胰島素血癥的受試者^皮定義為具有約10 ^U/mL (60 pmol/L)或 更多的空腹胰島素水平，例如約12pU/mL (72pmol/L)或更多(例如， 至少約13 |aU/mL ( 78 pmol/L )、至少約14 pU/mL ( 84 pmol/L )、至少 約15 ^U/mL ( 90 pmol/L)、至少約16 ^U/mL ( 96 pmol/L)、至少約17 ^U/mL( 102 pmol/L )、至少約18 pU/mL( 108 pmol/L )、至少約19 |nU/mL (114 pmol/L )、至少約20 |uU/mL ( 120 pmol/L )、或超過20 |LiU/mL ( 120 pmol/L))。
在具體方面，本發(fā)明提供了減少受試者中與高胰島素血癥相關(guān)的病 癥和癥狀開始的可能性的方法，例如減少焦慮、異常饑餓、異常疲勞、 暴食、與低血糖相關(guān)的精神病癥狀、和/或低血糖癥(包括低血糖癥相關(guān) 性癲癇發(fā)作、昏迷和死亡)。本發(fā)明的方法可以應(yīng)用于治療各種類型的 持續(xù)性高胰島素血癥狀況，例如胰島母細(xì)胞增生癥(KATP-HI彌散性疾 病、KATP-HI局灶性疾病或"PHHI") 、 GDH-HI (胰島素過多/高氨血癥 綜合征(HI/HA)、亮氨酸敏感性低血糖癥或二氮。秦敏感性低血糖癥)、 胰島細(xì)胞調(diào)節(jié)異常綜合征、嬰兒期特發(fā)性低血糖癥、嬰兒期持續(xù)性高胰 島素血癥低血糖癥(PHHI)、先天性胰島素過多和胰島素瘤。在另一個方面，施用或以其他方式遞送PIRA以治療或預(yù)防高胰島素血癥的本發(fā) 明方法可以應(yīng)用于患有多嚢性卵巢綜合征(PCOS)或處于發(fā)展PCOS 的逼近危險中的受試者，所述PCOS通常與高胰島素血癥相關(guān)。
在另一個具體方面，本發(fā)明提供了通過給受試者施用有效量的
PIRA,減少受試者中發(fā)展高胰島素血癥相關(guān)的低血糖癥的可能性和/或 延遲其開始時間(和/或最終嚴(yán)重度)的方法。
在另外一個具體方面，本發(fā)明提供了治療(提供關(guān)于其的療法和/ 或預(yù)防)由高胰島素血癥帶來的新生兒低血糖癥(或其他"暫時的高胰 島素血癥")的方法，所述方法包括給嬰兒受試者遞送有效量的PIRA, 以便治療狀況或預(yù)防相關(guān)狀況，減少相關(guān)狀況的可能性，或延遲相關(guān)狀 況的開始，所述相關(guān)狀況如癲癇發(fā)作和神經(jīng)病學(xué)后遺癥。
在另 一 個方面，本發(fā)明提供了減少患有高胰島素血癥相關(guān)狀況的患 者中的低血糖癥嚴(yán)重度的方法。
在另外 一個方面，本發(fā)明提供了改善或維持診斷為具有發(fā)展胰島素 瘤或處于發(fā)展胰島素瘤的重大危險中的患者健康的方法，所述方法包括 給宿主遞送有效量(治療有效量或預(yù)防有效量)的PIRA。
在另外一個方面，本發(fā)明提供了用于維持或改善個體中的健康(和 /或調(diào)節(jié)個體中的IR活性)的方法，例如具有與高胰島素血癥的高危險 相關(guān)特征的個體(例如，高胰島素血癥相關(guān)狀況的已知家族史或具有高 胰島素血癥的相對高發(fā)生的群體組成員，例如在日本人種起源的男性 中)，所述方法包括給個體施用(或以其他方式遞送)生理學(xué)有效量(例 如，預(yù)防有效量)的PIRA。
在另一個方面，本發(fā)明提供了用于拮抗細(xì)胞中(例如在體外合適的 細(xì)胞群體中或在合適的脊推動物(例如，脊索動物)宿主中)的IR活 性的方法，所述方法包括給細(xì)胞遞送生理學(xué)有效量的PIRA。
在另外一個方面，本發(fā)明提供了減少受試者中循環(huán)胰島素的作用的 方法，所述方法包括給受試者遞送生理學(xué)有效量的PIRA。
在另一個方面，本發(fā)明涉及關(guān)于高胰島素血癥或高胰島素血癥相關(guān) 狀況(例如高胰島素血癥相關(guān)的低血糖癥)的療法，其中所述療法包括 遞送與相對減少量的次級試劑(例如胰高血糖素)組合的有效量PIRA， 如與不連同PIRA使用以達(dá)到類似療效的量相比較的。
在進一步的方面，本發(fā)明提供了用于降低受試者中的血糖水平的方法，所述方法包括給受試者遞送生理學(xué)有效量的PIRA。
在另外一個方面，本發(fā)明提供了減少受試者中胰島素的作用的方 法，所述方法包括給受試者施用生理學(xué)有效量的PIRA。
在另一個方面，本發(fā)明提供了用于增加受試者中的胰島素分泌的方 法，所述方法包括給受試者施用或以其他方式遞送生理學(xué)有效量的 PIRA,以便增加其中的胰島素分泌。不希望被任何具體理論束縛，在測 試哺乳動物中與PIRA施用相關(guān)的實驗證據(jù)暗示胰島素分泌得到增加， 推測是由于其中IR介導(dǎo)的反饋系統(tǒng)的關(guān)閉。在另一個方面，本發(fā)明提 供了治療I型糖尿病、II型糖尿病、肥胖、葡萄糖耐量降低、和/或空腹 葡萄糖耐量降低的方法，所述方法包括給受試者如，診斷為有此需 要的人受試者)施用(或以其他方式遞送)預(yù)防或治療有效量的PIRA， 任選地與適合于治療待治療病癥的 一種或多種其他治療活性劑(例如， 抗糖尿病劑)組合。在另一個方面，本發(fā)明涉及PIRA (或相關(guān)化合物/ 組合物-例如編碼PIRA的核酸)在用于治療下述病癥的藥物制備中的 用途I型糖尿病、II型糖尿病、肥胖、葡萄糖耐量降低、和/或空腹葡 萄糖耐量降低。
在另一個方面，本發(fā)明涉及用于任何上述治療方案或本文描述的其 他治療目的的藥物制備，其通過使用一種或多種PIRAs，任選地與本文 描述的其他次級治療劑一起實現(xiàn)。因此，例如，在具體方面，本發(fā)明提 供了 PIRA在用于治療高胰島素血癥的藥物制備中的用途。
如本文其他地方所述，適當(dāng)時，在本文描述的治療方法的實踐中(包 含此類試劑組合的組合物也是本發(fā)明的特征)，PIRA (s)可以與次級 試劑一起共施用，或與次級試劑結(jié)合施用，所述次級試劑可以包括例如 一種或多種抗胰島素過多(例如，胰島素生產(chǎn)減少)試劑和/或抗低血糖 癥試劑例如二氮。秦、善得定、硝苯地平、奧曲肽、胰高血糖素、或其任 何或全部的組合。PIRA施用也可以與用于治療高胰島素血癥相關(guān)狀況 的外科手術(shù)例如胰切除術(shù)結(jié)合提供。
一般而言，在本文描述的本發(fā)明方法的實踐中，PIRAs可以通過任 何合適的方式遞送，例如通過在把宿主細(xì)胞中由編碼PIRA生產(chǎn)的核酸 表達(dá)(例如，通過在誘導(dǎo)型啟動子的控制下且包含在合適的基因轉(zhuǎn)移載 體中由PIRA編碼核酸表達(dá)，例如耙向的和復(fù)制缺陷型基因轉(zhuǎn)移載體)。 一般地，PIRAs通過給受體宿主直接施用PIRA或PIRA組合物來遞送。因此，PIRAs和PIRA組合物可以作為藥物組合物來施用和/或通過基因 療法來遞送，所述藥物組合物包含本領(lǐng)域已知的用于遞送蛋白質(zhì)和肽的 標(biāo)準(zhǔn)載體。 一般而言，并且適當(dāng)時，術(shù)語施用和遞送在本文中應(yīng)被解釋 為提供彼此的支持(例如， 一般應(yīng)當(dāng)認(rèn)識到作為PIRA蛋白質(zhì)直接施用 的可替代方法，PIRA編碼核酸可以用于將棵PIRAs遞送給靶宿主組織)， 盡管還應(yīng)當(dāng)認(rèn)識到就任何具體分子而言每種此種方法是本發(fā)明的獨特 方面，和一些分子(例如包含降解抗性有才幾部分的綴合的PIRAs) <又順 應(yīng)某些遞送/施用方式。用于施用蛋白質(zhì)、核酸和相關(guān)組合物(例如，載 體和宿主細(xì)胞)的方法是眾所周知的，并且因此僅在本文中簡要描述。
PIRA組合物、相關(guān)組合物和組合組合物可以經(jīng)由任何合適的途徑 進行施用，例如經(jīng)口、粘膜、口腔含化、鼻內(nèi)、可吸入、靜脈內(nèi)、皮下、 肌內(nèi)、腸胃外或局部途徑。此類蛋白質(zhì)還可以經(jīng)由微泵或其他合適的裝 置連續(xù)施用。
PIRA或其他PIRA —般將在疾病狀況存在時施用，前提是蛋白質(zhì)促 使?fàn)顩r停止惡化或改善。PIRA —般將作為藥學(xué)上可接受的組合物的部 分施用，例如，如本文其他地方詳細(xì)描述的。
一4殳而言，PIRA或相關(guān)化合物/組合物可以通過任何合適的途徑施 用，但一般地以包含常規(guī)藥學(xué)上可接受的載體、佐劑等(穩(wěn)定劑、崩解 劑、抗氧化劑等)的劑量單位制劑腸胃外施用。如本文所使用的，術(shù)語 "腸胃夕卜"包括皮下、靜脈內(nèi)、動脈內(nèi)、肌內(nèi)、胸骨內(nèi)、腱內(nèi)、脊柱內(nèi)、 顱內(nèi)、胸內(nèi)、輸注技術(shù)和腹膜內(nèi)遞送。因此，在一個方面，在本發(fā)明的 治療方法的實踐中，PIRA組合物靜脈內(nèi)或皮下施用。注射途徑還包括 注射到肌肉內(nèi)(肌內(nèi)IM);在皮膚下注射(皮下(s.c.));注射到靜 脈內(nèi)(靜脈內(nèi)(IV));注射到腹腔內(nèi)(腹膜內(nèi)(IP));和其他遞送 到皮膚內(nèi)/穿過皮膚(皮內(nèi)遞送，通常經(jīng)由多次注射，這可以包括生物彈 射(biolistic )注射)。
在一個方面，本發(fā)明提供了調(diào)節(jié)宿主中的IR活性的方法，所述方 法包括施用藥物組合物，所述藥物組合物包括藥學(xué)(即，生理學(xué))上可 接受的載體、賦形劑或稀釋劑與作為活性劑成分的一種或多種IR激動 劑PIRAs (它可以進一步與如其他地方描述的次級活性劑組合)的混合 物。
本發(fā)明的藥物組合物可以通過口或腸胃外途徑全身地施用。非限制性腸胃外施用途徑包括皮下、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、經(jīng)皮、吸入、鼻 內(nèi)、動脈內(nèi)、鞘內(nèi)、腸內(nèi)、舌下或直腸。由于一般的氨基酸序列的不穩(wěn) 定性質(zhì)，腸胃外施用可以是有利的。有利的施用方式包括例如，用于鼻
或支氣管吸收的氣溶膠；用于靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、胸骨內(nèi)或皮下注射的懸浮 液；和用于經(jīng)口施用的4匕合物。
靜脈內(nèi)施用例如可以通過注射單位劑量來進行。當(dāng)關(guān)于本發(fā)明的藥 物組合物使用時，術(shù)語"單位劑量，，指適合作為用于人的單一劑量的物理 上不連續(xù)單位，每個單位包含與所需稀釋劑結(jié)合的計算產(chǎn)生所需療效的 預(yù)定量活性材料；即，用于稀釋濃縮的或純物質(zhì)(液體或固體)，從而 使得那種物質(zhì)變成用于使用的正確(稀釋)濃度的液體。對于可注射的 施用，組合物在無菌溶液或懸浮液中或可以在藥學(xué)上和生理學(xué)上可接受 的水性或含油載體中乳化，所述載體可以包含防腐劑、穩(wěn)定劑和用于使 得溶液或懸浮液與受體體液(即，血液)等滲的材料。
適合于與一般制劑一起使用的賦形劑包括水、磷酸緩沖鹽水、氯化
鈉水溶液、葡萄糖、甘油、稀釋乙醇等、及其混合物。舉例說明性穩(wěn)定 劑是聚乙二醇、蛋白質(zhì)、糖類、氨基酸、無機酸和有機酸，其可以獨立 地或作為混合物使用。使用的量或數(shù)量、以及施用途徑基于個體進行確 定，并且對應(yīng)于本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的相似類型的應(yīng)用或適應(yīng)癥中使用 的量。
藥物組合物一般可以以與劑量制劑相容的方式，并且以治療有效量 進行施用。待施用的量取決于待治療的受試者和所需IR調(diào)節(jié)程度(例 如，所需治療或預(yù)防結(jié)果或效應(yīng))。待施用的所需活性成分的精確量取 決于從業(yè)者的判斷并且對每個個體是特異的。然而，合適的劑量可以為 約1 - 200 nmol(例如，約10 - 200——例如約1 - 100,例如約10 - 100 ) nmol活性肽/千克個體體重/天，并且取決于施用途徑。用于最初施用和 加強注射的合適方案也是可變的，但具有最初施用隨后為以一個或更多 個小時時間間隔通過后續(xù)注射或其他施用的重復(fù)給藥的特征?？商娲?地，足以維持血液中的皮摩爾濃度(例如約IpM-約10nM)的連續(xù)靜 脈內(nèi)輸注是預(yù)期的。
在另 一個具體方面，PIRA或PIRA組合物通過可注射的泵以用于由 此種裝置使用的液體或其他合適的制劑進行遞送。PIRAs也可以通過例 如目前用于遞送胰島素產(chǎn)品的筆(pen)施用。經(jīng)皮貼劑(例如基質(zhì)貼劑中的藥物)的^f吏用也可以用于遞送PIRAs (例如，通過^皮動遞送或經(jīng) 由離子電滲療法的遞送)。
藥物制劑制備中的進一步指導(dǎo)可以在下述參考文獻(xiàn)中找到，例如， Gilman等人(纟扁專辱)，1990, G/Zma"k.. 7Tze尸/za廠waco/og/ca/
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為了更好地舉例說明具體方面，本文進一步提供了劑量原則的詳細(xì) 討論。
在一個方面，本發(fā)明的方法包括在1個月的時間段內(nèi)施用或以其他 方式遞送2種不同的PIRAs,療法的開始涉及第一種PIRA的第一次遞 送后約1-3周(例如，約10天)開始的第二種PIRA,或當(dāng)宿主中發(fā) 展出針對第一種PIRA的顯著免疫應(yīng)答，從而使得第一種PIRA的繼續(xù) 使用已變得對患者有害時，在任何時候開始的第二種PIRA。
本發(fā)明的特別有利的方面在配制用于經(jīng)口施用的藥學(xué)上可接受的 組合物和此種組合物在IR活性調(diào)節(jié)中的用途(例如，在治療糖尿病或 相關(guān)狀況例如IR調(diào)節(jié)的代謝紊亂的背景中)中具體體現(xiàn)，所述組合物 包含治療和/或預(yù)防有效量的一種或多種消化酶穩(wěn)定的PIRAs(包含如上 所述的一種或多種罕見的降解抗性氨基酸殘基和/或降解抗性部分)。與 較大的蛋白質(zhì)例如抗體(它在大小方面可以是數(shù)百個氨基酸，跨越至少 2條氨基酸鏈散布)相比較， 一般PIRAs的相對小尺寸和簡單結(jié)構(gòu)(例 如，在許多PIRAs的情況下約40個氨基酸殘基的單鏈)本身且自然地 被認(rèn)為幫助此種蛋白質(zhì)的經(jīng)口遞送。N和/或C末端阻斷修飾(特別地， 例如分別地乙酰化(或其他?；?和酰胺化)的添加祐j人為增加此種分 子被經(jīng)口遞送的能力。與目前已知的胰島素和胰島素類似物形式相比 較，降解抗性的罕見氨基酸殘基和/或有機部分的包括也被認(rèn)為或可替代 地:故認(rèn)為顯著增加此種肽通過經(jīng)口途徑有效遞送的能力。包含此種特征 組合的PIRAs被認(rèn)為對于經(jīng)口遞送合適的治療劑是特別有利的。在一個 方面，本發(fā)明提供了在經(jīng)口施用后與腸胃外注射相比較，可以顯示出至 少約1%、至少約5%、至少約10%、至少約15%、至少約20%或更多的相對生物利用度的PIRA經(jīng)口制劑。PIRAs的固有經(jīng)口遞送能力可以 通過用經(jīng)口遞送增強組合物配制PIRAs得到增強，其中使用本領(lǐng)域已知 的和已證實在增強小肽的經(jīng)口遞送和利用率方面有效的方法。 一般地， 經(jīng)口制劑試圖抑制或調(diào)節(jié)使肽降解的蛋白水解活性；增強肽的細(xì)胞旁 (paracellular)和/或跨細(xì)胞轉(zhuǎn)運；改善肽通過粘液屏障的穿透(特別是 在快速溶解形式和氣溶膠遞送或噴霧遞送的經(jīng)口施用形式的情況下)； 和/或增加肽在循環(huán)中的半衰期(特別是對于需要持續(xù)存在用于治療效果 的肽)。i殳備可以幫助此種遞送。例如，PIRA組合物可以配制用于通 過氣溶膠噴霧設(shè)備遞送，所述設(shè)備允許將組合物遞送至其中可以發(fā)生制 劑吸收的頰粘膜和口咽區(qū)域。用于遞送小肽例如胰島素的此類設(shè)備的例 子是本領(lǐng)域已知的。
在一個方面，本發(fā)明提供了 PIRA經(jīng)口制劑組合物，其中與不使用 穩(wěn)定綴合或包裝材料的PIRA穩(wěn)定性相比較，PIRA與載體分子綴合或形 成膠嚢以改善PIRA的穩(wěn)定性。PEG綴合物和一般地穩(wěn)定和遞送增強綴 合材料的例子。PIRAs可以例如與基于PEG的兩親寡聚體綴合，所述寡 聚體增加GI吸收和/或減少PIRA的蛋白水解降解。在另一個示例性方 面，包裹PIRA組合物的磷酸4丐-PEG-胰島素-酪蛋白(CAPIC)顆粒用 作經(jīng)口遞送形式(微粒和納米顆粒形式在這個部分中的其他地方進一步 描述)。
在 一個方面，PIRA與促進被動跨細(xì)胞轉(zhuǎn)運的遞送試劑或載體綴合。 理想地，此類載體或試劑進行工程改造以便在循環(huán)中與PIRA解離(例 如，達(dá)到暴露于低pH條件的某一水平后)。
在另一個方面，PIRA在包含一種或多種經(jīng)口遞送促進賦形劑，例 如膽酸鈉和/或胰蛋白酶抑制劑的包有腸溶衣的微膠嚢或片劑中進行配 制。在另外一個進一步的方面，提供了包含有效量的去污劑組分的PIRA 經(jīng)口制劑，所述去污劑組分增加肽的溶解度，減少與腸粘液的相互作用， 和/或增強細(xì)胞旁轉(zhuǎn)運。
在另外一個方面，PIRA與一種或多種(一般地幾種)低分子量 (LMW)聚合物綴合物進行綴合，所述綴合物通過例如就相關(guān)/相似的 棵PIRAs而言增加針對酶促降解的抗性，和/或允許更佳的胃腸轉(zhuǎn)運(例 如，通過構(gòu)成屏障的細(xì)胞和組織的水和脂肪部分的改善擴散，以沿著胃 腸途徑吸收和進入血流內(nèi))來促進經(jīng)口遞送。用于構(gòu)建經(jīng)口遞送增強小肽綴合物的組合物、方法和相關(guān)原理在例如，美國專利5,359,030; 5,438,040;5,681,811;和6,309,633中提供。
在另一個方面，本發(fā)明提供了包含基于氨基酸的膠嚢系統(tǒng)的經(jīng)口遞 送PIRA制劑，所述膠嚢系統(tǒng)促進腸襯里(lining)通過且抑制PIRA的 酶促降解。
在另外一個方面，本發(fā)明提供了包含PIRA或PIRA組合物的脂質(zhì) 或脂質(zhì)體膠嚢化的PIRA經(jīng)口遞送制劑，其促進通過一種或多種上皮屏 障的傳輸和/或保護PIRA免于酶促降解。理想地，此類脂質(zhì)制劑促進藥 物組合物經(jīng)由口粘膜的顯著吸收，>^人而避免"首過(firstpass)"效應(yīng)。
在另一個方面，本發(fā)明提供了其中PIRA包含在微粒內(nèi)的PIRA經(jīng) 口遞送制劑，所述制劑直接施用或插入膠嚢、包等內(nèi)，用于直接經(jīng)口施 用或經(jīng)由經(jīng)口遞送設(shè)備施用(本文描述的其他經(jīng)口遞送形式一般也可以 通過此種方法遞送給宿主)。在具體方面，本發(fā)明提供了由藻酸鹽小球 體組成的PIRA經(jīng)口遞送制劑。理想地，藻酸鹽是由US FDA分類為公 認(rèn)安全的天然存在的藻酸鹽，且任選地還誘導(dǎo)或促進對上胃腸道粘膜的 保護作用。在另一個方面，提供了包被的晶體制劑。擠出團成球狀
(extrusion spheronization)是允許高濃度的活性物質(zhì)凈皮包括在高藥物濃 度的小丸內(nèi)且可以應(yīng)用于PIRA制劑的技術(shù)。
在另一個方面，PIRA組合物呈現(xiàn)為在瓶或其他容器(例如，單位 劑量容器)中的包被顆粒的干糖漿懸浮液用于液體經(jīng)口施用。
一般而言，本文描述的制劑可以是持續(xù)釋放配制、味覺掩蔽或包有 腸溶衣的組合物。
在另 一個方面，本發(fā)明提供了在相對硬的明膠膠嚢中的半固體基質(zhì) 系統(tǒng)用于經(jīng)口施用。 一般地，此種膠嚢進一步包含遞送促進試劑，例如 脂質(zhì)肽遞送系統(tǒng)。本發(fā)明還提供了包含包被微粒的軟小丸片劑。可以是 水惰性(hydro-inert)和/或脂惰性(lipo-inert)的骨架片是另一種潛在 合適的經(jīng)口遞送形式。 一般地，此種片劑包含PIRA組合物的包被微粒 和任選地肽酶抑制劑和/或穿透增強劑或其他合適的賦形劑。合適的穿透 增強劑可以包括表面活性劑、脂肪酸、膽汁鹽、檸檬酸鹽和螯合劑(例 如，EDTA),盡管其他合適的穿透增強劑也可以包括在這些組合物或 本文描述的其他經(jīng)口遞送形式中。例如，環(huán)糊3睛可以用于增強PIRA樣t 粒、綴合物或其他藥物形式的穿透。在另外的方面，本發(fā)明提供了包含一般促進與GI道結(jié)合的生物粘 附聚合物或其他生物粘附材料的PIRA組合物。此種聚合物的例子包括 聚卡波非和殼聚糖。如已提及的，載體系統(tǒng)例如納米顆粒、小球體、脂 質(zhì)體等(例如，單層小脂泡(SUVs);含清蛋白的納米顆粒；含曱基丙 烯酸曱酯的納米顆粒；和含清蛋白的小球體(例如，清蛋白/氧化鐵磁性 和可耙向小球體或其他可粑向微粒/納米顆粒制劑)也可以用于或可替代 地可以用于促進PIRA組合物給患者的經(jīng)口施用。此種制劑可以進行工 程改造以增強來自GI道的各個區(qū)域的吸收和/或防止PIRA組合物的降 解。
乳劑和微乳也可以用作關(guān)于PIRAs的經(jīng)口遞送制劑。例如，包含疏 水相；不連續(xù)的水性親水相；和用于使包含PIRA組合物的親水相(疏 水相一般形成乳劑的約5-10重量％ )分散于疏水相(其一般以乳劑中 約65-80重量％存在)中的至少一種表面活性劑(例如，泊洛沙姆124, 聚乙二醇化的甘油酯(polyglycolized glyceride ),失水山梨糖醇月桂酸 酯，聚氧乙烯山梨糖醇酐單油酸酯，或類似表面活性劑可以包括在此種 乳劑和相關(guān)預(yù)制乳劑濃縮物中)的油包水乳劑作為油包水乳劑在促進 PIRA組合物的經(jīng)口遞送中可以是有用的，所述疏水相包含油酸、順9-二十石友烯酸、芥酸、亞油酸、亞麻酸、蓖麻油酸、花生四烯酸、此種酸 的甘油酯、油醇、d-a-生育酚聚乙二醇琥珀酸酯，其任何的組合、或相 似分子，所述PIRA組合物可以包括醇、鹽溶液等)。乳劑可以包被在 包腸溶衣材料中，相對于適合于本發(fā)明的經(jīng)口遞送制劑的其他包衣材 料，所述包腸溶衣材料在如提及的酸性水環(huán)境中可以是可溶的。
在另一個方面，本發(fā)明提供了包含與硫醇化聚合物藥物載體基質(zhì)或 聚合物結(jié)合的PIRA的經(jīng)口遞送制劑。此種聚合物的例子是2-亞氨基硫 雜環(huán)戊烷(Iminothiolane )。在一個方面，此種聚合物與殼聚糖共價連 接以形成殼聚糖綴合物。任選地，酶抑制劑(例如，Bowman-Birk抑制 劑和/或彈性酶抑制劑)可以與綴合物的殼聚糖組分綴合。同樣或可替代 地，滲透介質(zhì)可以與PIRA組合物一起包括在由此種殼聚糖形成的片劑 中。硫醇基在聚合物上的固定可以增強此種制劑的粘膜粘著劑/粘合劑性 質(zhì)。
膠嚢化包衣可以包括藥學(xué)活性成分例如親水性表面活性劑、親脂性 表面活性劑和甘油三酯的不同組合。用于經(jīng)口施用劑型的持續(xù)釋放的經(jīng)
35口遞送系統(tǒng)和/或腸溶衣也是預(yù)期的，例如下迷美國專利號中描述的那
些于1987年11月3日頒發(fā)的美國專利號4,704,295,于1985年12月 3曰頒發(fā)的美國專利號4,556,552,于1982年1月5日頒發(fā)的美國專利 號4,309,404和于1982年1月5日頒發(fā)的美國專利號4,309,406。固體載 體的另外例子包括皂土、硅石等。另外的示例性材料在本文其他地方得 到描述。
在進一步的方面，提供了包含水凝膠的PIRA經(jīng)口遞送形式。PIRAs 可以在例如甲基丙烯酸乙二醇接枝共聚物的水凝膠中摻入并且經(jīng)口遞 送。PIRAs還可以與水凝膠復(fù)合。pH響應(yīng)的復(fù)合水凝膠，例如包含懸垂 葡萄糖(P ( MAA-co-MEG ))或枝接的LMW (例如，約200 MW ) PEG 鏈(P (MAA-g-EG))的水凝膠可以有利地用作PIRA經(jīng)口遞送試劑。
納米球體(nanosphere)、小球體和其他納米顆粒/微粒可以由曱基 丙烯酸的交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)形成和/或接枝有PEG (s)的丙烯酸可以是有用的經(jīng) 口遞送制劑。用于使藥物產(chǎn)物在低pH (例如，約3)下截留在此種納米 球體中，但在生理學(xué)pH(例如，約7)下作為可釋放試劑的方法是本領(lǐng) 域已知的。用于棵的和綴合的小肽遞送的另外的示例性微粒制劑以及相 關(guān)方法和原理在例如美國專利6,191,105中闡述。
經(jīng)口遞送制劑還可以呈現(xiàn)為選自氣溶膠、噴霧劑和干粉的可吸入組 合物。本發(fā)明的此種藥物制劑可以以氣溶膠噴霧劑的形式施用，使用例 如如下述美國專利號中描述的那些噴霧器于1986年11月25日頒發(fā) 的美國專利號4,624,251;于1972年11月21日頒發(fā)的美國專利號 3,703,173;于1971年2月9日頒發(fā)的美國專利號3,561,444和于1971 年1月13日頒發(fā)的美國專利號4,635,627。其他氣溶膠遞送系統(tǒng)例如如 下述參考文獻(xiàn)中公開的加壓計量劑量吸入器(MDI)和干粉吸入器可以 在本發(fā)明實踐時使用:Newman, S. P. in Aerosols and the Lung, Clarke, S. W.和Davia, D.編輯，第197-224頁，Butterworths, London, England, 1984。
在進一步的方面，PIRA組合物被配制成設(shè)計為將治療劑量的PIRA (s)遞送到患者的體循環(huán)內(nèi)的粘膜粘著劑腸貼劑。此種腸貼劑^1認(rèn)為 使結(jié)合的PIRA定位于接近粘膜并且保護其免于蛋白水解降解。此種貼 劑與腸的安全附著已由胰島素制劑得到證實，且此種貼劑已顯示對于肽 藥物遞送是有效的。
本文描述的經(jīng)口遞送制劑可以應(yīng)用于本文具體描述的新PIRAs、其變體(如本文所描述的)、衍生自先前專利文件中描述的PIRAs的PIRAs (如通過本發(fā)明的各種方面中的一個或多個修飾的)，或甚至先前專利 文件中描述的未修飾的PIRAs,前提是在此種組合物中包括此種未修飾 和先前表征的PIRAs導(dǎo)致經(jīng)口施用中的有效性增加。此種組合物在本發(fā) 明的各種方法中的用途是本發(fā)明的另 一個方面。
在另一個方面，本發(fā)明提供了用于PIRAs或PIRA組合物(例如包 含PIRAs和/或PIRA與次級試劑組合的組合物)的肺遞送的制劑。PIRAs 可以直接施用于肺或在標(biāo)準(zhǔn)藥物制劑中施用于肺(由于此種分子用于這 些遞送形式的上述有利特征)，但更一般地在被工程改造用于肺遞送的 制劑中施用，例如在可以作為用于吸入的氣溶膠遞送的顆粒中。PIRA 組合物可以例如^皮制備為用于通過干粉(并且在遞送前貯藏于合適的組 合物中例如泡罩包裝)吸入器施用的干粉。用于此種系統(tǒng)的干粉制劑中 的顆粒的顆粒大小直徑小于約5 ,且對于藥物組合物此種顆粒一般為 約90%或更純。此種組合物可以通過已知的"玻璃穩(wěn)定化技術(shù)"進行制 備?？商娲?，PIRA組合物可以在水性組合物中進行配制(同樣任選 地貯藏于泡罩包裝中)且通過水性霧吸入器(例如，經(jīng)工程改造以確保 正確給藥的微處理器控制的水性霧吸入器)。此種裝置可以提供遞送中 超過常規(guī)噴霧器至少約5倍，例如約10倍的增加。噴霧器、計量劑量 吸入器(MDIs)和干粉吸入器(DPIs)可以用于此種制劑的遞送。許多 此種設(shè)備和類似設(shè)備已開發(fā)用于肽藥物的肺遞送。制劑還可以就遞送后 的長期IR調(diào)節(jié)活性進行工程改造，例如，在顆粒藥物的情況下，通過 使用增強劑和/或通過使用長效促進顆粒特征(例如，包含大量例如至少 約50%乳酸乙醇酸共聚物的多孔顆粒；具有小空氣動力學(xué)尺寸(例如， 約1 - 3)Lim),低密度(例如，約0.1 gm/ml或更少)，和大幾何學(xué)顆粒 大小(例如，約10-20 pm)的干燥顆粒。
PIRA組合物可以包含增強此種分子的肺遞送的PIRA衍生物，例如 低分子量聚乙二醇化的PIRAs。在另一個方面，PIRA組合物以PEG顆 粒、磷酸4丐(CAP)顆粒、或PEG-CAP顆粒(一般在懸浮液中)的形 式遞送給肺，所述顆?？梢允褂脴?biāo)準(zhǔn)技術(shù)(例如，受控制的沉淀技術(shù)) 進^f亍制備。此種顆粒組合物可以通過例如氣管內(nèi)滴注和/或噴霧滴注特異 地遞送給肺。此種顆粒還可以任選地與一種或多種酪蛋白結(jié)合(例如， 作為用于PEG、 CAP或PEG-CAP顆粒的包衣-通過向酪蛋白溶液中添加顆粒且允許酪蛋白在顆粒周圍聚集和/或與顆粒復(fù)合而形成)。類似組 合物還可以用于經(jīng)口遞送形式或鼻遞送形式(例如，經(jīng)口噴霧制劑)， 且此種分子可以以其他形式(例如，水凝膠)使用。
用于小肽例如胰島素的肺和經(jīng)口遞送的許多策略、組合物和設(shè)備已
在本領(lǐng)域中得到開發(fā)和描述，其同樣可以應(yīng)用于本發(fā)明的PIRA和PIRA 組合物(例如，通過修飾類似于其中描述的胰島素分子的PIRA;配制 類似于其中描述的胰島素制劑的PIRA組合物；使用類似于其中描述的 那些的方法和/或設(shè)備施用PIRA)?？赡茉诖朔N制劑制備中有用的此種 方法、原理、遞送設(shè)備和類似組合物的例子在例如下述參考文獻(xiàn)中得到 描述例如，Garcia-Contreras等人，AAPS PharmSci 2003; 5 ( 2 ) Article 9 (2003 ); Steiner等人，Exp Clin Endocrinol Diabetes. 2002 Jan; 110 (1 ): 17-21; Pfutzner等人，Diabetes Technol Ther. 2002; 4( 5 ): 589-94; Gonda, I.等人Journal of Controlled Release 1998; 53: 269-274; Schuster, 丄等人Pharmaceutical Research 1997; 14 ( 3 ): 354-357; Farr， S丄等 人，Interpharm Press Inc., Buffalo Grove, Illinois. 1996,第175-184頁； Thippawong， J.等人,Diabetes Technology & Therapeutics 2002; 4(4): 499-504; Sangwan, S.等人，Journal of Aerosol Medicine. 2001; 14 ( 2 ): 185-195， Mudumba S.等人，Respiratory Drug Delivery VII. Dalby R.N.等 人(編輯)Serentec Press, Raliegh, NC. 2000.第329-332頁;Brinda， Curr Opin Investig Drugs. 2002 May; 3 ( 5 ): 758-62; Brunner, G.A.等人， Diabetologia 1991 ; 44 : 305-308 ; 美國專利申請20040096401 ; 20040089290; 20030216542; 20030148925; 20030113273; 20020046750; 20010039260; 20030150446;以及美國專利6,635,617; 6,518,239; 6,349,719; 6,335,316; 6,098,615; 6,024,090; 5,672,581; 5,915,378; 5,970,240;和5,813,358。
其他應(yīng)用
PIRAs可以應(yīng)用于涉及胰島素受體的任何化學(xué)或生物化學(xué)過程的研 究。某些PIRAs阻斷胰島素受體與胰島素結(jié)合的能力可以允許研究者測 定胰島素受體在涉及胰島素信號傳導(dǎo)或胰島素清除率和/或降解的體內(nèi) 和體外過程中的重要性。
關(guān)于PIRAs的此種應(yīng)用的一個例子是定量哺乳動物中胰島素或胰島素類似物的受體介導(dǎo)降解的程度。該方法包括在連續(xù)輸注后測量胰島 素或胰島素類似物的穩(wěn)態(tài)血漿濃度，伴隨或不伴隨通過注射或輸注施用
PIRA。根據(jù)伴隨和不伴隨PIRA施用的穩(wěn)態(tài)濃度比，可以估計受體介導(dǎo) 的降解或清除率的貢獻(xiàn)。
此種方法的另一個例子在其他相關(guān)細(xì)胞表面受體例如IGF1受體的 存在下，定量胰島素受體對通過胰島素或胰島素類似物引起的細(xì)胞信號 傳導(dǎo)過程的貢獻(xiàn)中具體體現(xiàn)。該方法包括伴隨或不伴隨合適濃度的PIRA 的添加執(zhí)行研究中的效應(yīng)物測定，以阻斷經(jīng)由胰島素受體激活引發(fā)的效 應(yīng)。伴隨和不伴隨PIRA添加獲得的結(jié)果之間的差異反映了胰島素受體 介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)的貢獻(xiàn)。
此種技術(shù)的另外一個例子是選擇性針對組織(例如，腦)施用PIRA (例如，通過局部化的施用或通過由組織特異性耙向的載體表達(dá)，任選 地其中PIRA編碼序列在組織特異性啟動子的控制下)，以確定阻斷胰 島素受體信號傳導(dǎo)在那種特定組織中的效應(yīng)。此各種方法可以包括在胰 島素的存在下在其中PIRA的效應(yīng)局部化于問題的條件下，遞送阻斷胰 島素與組織結(jié)合的PIRA(例如使用技術(shù)，例如在體內(nèi)研究的情況下先 前提及的那些，或在體外研究的情況下通過獲取組織樣品)，和測量已 知和所需的胰島素胰島素受體反應(yīng)參數(shù)(例如胰島素相關(guān)的IR信號
傳導(dǎo))。
涉及PIRAs的另外一種分析法在鑒定與PIRAs竟?fàn)幣cIR結(jié)合的分 子中具體體現(xiàn)，作為鑒定另外的IR結(jié)合劑和調(diào)節(jié)劑(拮抗劑或激動劑) 的手段。此種方法涉及竟?fàn)幮蜏y定，其中向包含IR的介質(zhì)中添加一種 或多種PIRAs和一種或多種測試化合物，且在PIRA(s)的存在下評估 一種或多種測試化合物與IR結(jié)合且調(diào)節(jié)IR的能力。
在另外一個例子中，可以給哺乳動物(例如，關(guān)于人糖尿病疾病狀 態(tài)的合適的模型動物)施用(或以其他方式遞送)延長時間段的PIRA , 以便誘導(dǎo)胰島素抵抗或糖尿病，從而提供涉及疾病的用于研究的新和有 用的體內(nèi)才莫型，所述疾病包括但不限于糖尿病和肥胖。
示例性實驗方法和數(shù)據(jù)
下述實驗方法用于進 一 步舉例說明本文描述的本發(fā)明方法，但當(dāng)然 不應(yīng)被解釋為以任何方式限制其范圍。("尸/W潛^游都定
為了鑒定作為拮抗劑的胰島素受體結(jié)合肽(PIRA)，候選肽可以在 葡萄糖攝取測定中在例如SGBS細(xì)胞(人脂肪細(xì)胞細(xì)胞系)或原代嚙齒 類動物脂肪細(xì)胞中進行測試。簡言之，使細(xì)胞與各種濃度的胰島素溫育， 且隨后測量"C-葡萄糖攝取。為了就拮抗劑性質(zhì)測試肽，添加次最大的 刺激濃度的胰島素(例如，導(dǎo)致半數(shù)最大胰島素應(yīng)答)以及待測試的肽 的系列稀釋物。如果肽是PIRA,那么伴隨濃度漸增的PIRA胰島素誘導(dǎo) 的應(yīng)答減少至或〗氐于基線應(yīng)答，且PIRA的效力可以由 見察到應(yīng)答減少 所需的PIRA濃度估計。PIRA S661的此種效力測定的例子顯示于圖1 中。此種測定可以應(yīng)用于其他候選PIRAs作為鑒定PIRAs的方法，且在 此種測定中顯示此種性質(zhì)的PIRAs可以視為本發(fā)明的另 一個特征。
9組5或6只雄性、16周大、平均重量約580克的Zucker Obese大 鼠(Charles River)維持不限制Purina 5008和不限制飲用水，且對于實 驗禁食過夜。葡萄糖水平在命名為S661 (上文描述)的PIRA施用前20 分鐘和10分鐘時進4于測試。
溶于PBS或載體的不同劑量S661的靜脈內(nèi)(i.v.)施用隨后為(S661 使用后IO分鐘)溶于PBS或載體的不同量人胰島素的腹膜內(nèi)(i.p.)施 用。在胰島素注射后10、 20、 30、 40、 60、 80、 120和180分鐘時測量 血糖水平。這些實驗的結(jié)果顯示于圖2中。
如由圖2中可見的，在其中施用S661的大鼠中，血糖水平明顯高 于其中單獨施用胰島素或僅有載體的情況下(與對照相比較3 nmol/kg
S661, 30 nmol/kg胰島素導(dǎo)致略微更高的葡萄糖水平，且導(dǎo)致比單獨的 胰島素明顯更高的水平；在所有其他情況下，施用S661時血糖水平中 的差異明顯不同)。
這個實-驗證實PIRAs例如S661在減少哺乳動物受試者中的胰島素 作用方面是有效的。
8組5-7只雄性、15周大、平均重量約550克的Zucker Obese大 鼠(Charles River)維持不限制Purina 5008和不限制飲用水，且對于實 驗禁食過夜。在溶于PBS的30 nmol/kg人胰島素i.p.施用前各個時間點 時以30 nmol/kg i.v.施用溶于PBS的PIRA S661 。這些實馬全的結(jié)果顯示于圖3中。隨著時間過去的血糖測量顯示PIRAS661在施用后6小時仍是 有效的拮抗劑。
為了測試與相關(guān)受體IGF1受體相對PIRA S661對于胰島素受體的 選擇性，使用2種受體及其1251-標(biāo)記的形式的同源配體進行竟?fàn)幗Y(jié)合測 定。鑒于S661對于胰島素受體具有的親和力是人胰島素自身那種的48 %,它對于IGF1受體的親和力太低而無法測量，即，為IGF1的那種的 至少1/200.000。這些結(jié)果指出PIRA S661不會以任何方式干擾IGF1經(jīng) 由IGF1受體的信號傳導(dǎo)。
本文引用的所有參考文獻(xiàn)，包括出版物、專利申請和專利都在此引 入作為參考，其程度與每個參考文獻(xiàn)個別且特別指出引入作為參考且在 本文中整體闡述相同。
除非本文另有說明或上下文明顯相矛盾，在本發(fā)明描述背景中術(shù)語 "一個(a)"和"一種(an)"和"該(the)"及類似指示物的使用應(yīng)被解釋為包含 單數(shù)和復(fù)數(shù)。
除非另有說明或上下文明顯相矛盾，本發(fā)明的任何方面或?qū)嵤┓桨?的本文說明書就一種或多種元件而言使用術(shù)語例如"包含"、"具有"、"包 括"或"含有"意欲提供關(guān)于"由那種具體的一種或多種元件組成"、"基本 上由那種具體的一種或多種元件組成"、或"基本上包含那種具體的一種 或多種元件"的本發(fā)明的類似方面或?qū)嵤┓桨傅闹С?除非另有說明或 上下文明顯相矛盾，例如本文描述為包含具體元件的組合物應(yīng)當(dāng)理解為 同樣描述由那種元件組成的組合物)。
權(quán)利要求
1.一種包含氨基酸序列的肽胰島素受體拮抗劑，所述氨基酸序列包含與Gly Ser Leu Asp Glu Ser Phe Tyr Asp Trp Phe Glu Arg Gln Leu Gly(SEQ ID NO1)具有至少約80％同一性的式1型序列，和根據(jù)式LeuXaa Xaa Glu Trp Ala Xaa Xaa Gln Cys Glu Val Xaa Gly Arg Gly Cys ProSer的式6型序列，其中Xaa表示任何氨基酸殘基；所述式1型序列和式6型序列在所述氨基酸序列中以N至C末端的方向定位；和(a)所述氨基酸序列包含位于所述式1型和式6型序列之間的至少一個氨基酸殘基的氨基酸序列接頭，(b)所述氨基酸序列與增強所述胰島素受體拮抗劑在體內(nèi)的穩(wěn)定性的末端衍生部分結(jié)合，或(c)所述氨基酸序列包含位于所述式1型和式6型序列之間的至少一個氨基酸殘基的氨基酸序列接頭，且所述氨基酸序列與增強所述胰島素受體拮抗劑在體內(nèi)的穩(wěn)定性的末端衍生部分結(jié)合。
2. 權(quán)利要求1的胰島素受體拮抗劑，其中所述式6序列不是 WLDEEWAQVQCEVYGRGCPS (SEQIDNO: 14)或 WLDQEWAWVQCEVYGRGCPS ( SEQIDNO: 15)。
3. 權(quán)利要求1或權(quán)利要求2的胰島素受體拮抗劑，其中所述式1型 序列是GSLDESFYDWFERQLG ( SEQ ID NO: 1 )。
4. 權(quán)利要求1 -3中任一項的胰島素受體拮抗劑，其中所述式6型 序列與SLEEEWAQIQCEVWGRGCPSY ( SEQ ID NO: 16 )至少約85 % 等同。
5. 權(quán)利要求4的胰島素受體拮抗劑，其中所述式6型序列是 SLEEEWAQIQCEVWGRGCPSY (SEQIDNO: 16)。
6. 權(quán)利要求1-5中任一項的胰島素受體拮抗劑，其中所述式6型 序列包含在式Leu Xaa3 Xaa4 Glu Trp Ala Xaa8 Xaa9 Gin Cys Glu Val Xaa14 Gly Arg Gly Cys Pro Ser Xaa21 ( SEQ ID NO: 17 )內(nèi)，其中Xaa3 是Asp或Glu; Xaa4是Cys、 Asp、 Glu、 His、 Lys、 Asn、 Gln、 Arg、 Ser 或Thr; Xaa8是任何氨基酸殘基；Xaa9是Ile、 Leu、 Val、 Met、 Phe、 Gly或Ala; Xaaw是Trp、 Phe或Tyr;和Xaa^不存在或選自Ser、 Thr、 Asn、 Gln、 Tyr、 Cys或Gly。
7. 權(quán)利要求1 - 5中任一項的胰島素受體拮抗劑，其中所述式6型序列包含在式Xaa山eu Xaa3 Xaa4 Glu Trp Ala Xaa8 Xaa9 Gin Cys Glu Val Xaa14 Gly Arg Gly Cys Pro Ser Xaa21 ( SEQ ID NO: 18 )內(nèi)，其中Xaa! 是Trp或Ser， Xaa3是Glu或Asp; Xaa4是Glu或Gin; Xaa8是Gin或Trp; Xaa9是lie或Val; Xaai4是Trp或Tyr;和Xaa21不存在或是Tyr(式6b )。
8.權(quán)利要求1 -2和4-7中任一項的胰島素受體拮抗劑，其中所述
9.權(quán)利要求1 - 8中任一項的胰島素受體拮抗劑，其中所述氨基酸 序列進一步包含位于所述式1型序列和式6型序列之間1 -7個氨基酸 殘基的氨基酸接頭。
10. 權(quán)利要求9的胰島素受體拮抗劑，其中形成所述接頭的大部分 殘基是Gly或Ser殘基。
11. 權(quán)利要求1 - 10中任一項的胰島素受體拮抗劑，其中所述胰島 素受體拮抗劑包含末端衍生部分。
12. 權(quán)利要求11的胰島素受體拮抗劑，其中所述末端衍生部分包含 酰胺衍生的氨基酸殘基，所述氨基酸殘基形成所述式6型序列的C末端 或位于所述式6型序列的C末端的C末端。
13. —種包含根據(jù)所述式 GSLDESFYDWFERQL國Z!國SLEEEWAQIQCEVWGRGCPS國Z2 ( SEQ ID NO: 20)的氨基酸序列的胰島素受體拮抗劑，其中Z!表示氨基酸接頭且Z2表 示任選存在的末端衍生部分、氨基酸或氨基酸序列、衍生的氨基酸殘基、 或包含C末端衍生氨基酸殘基的氨基酸序列。
14. 一種胰島素受體拮抗劑，其包含化合物S661胺)。
15. —種藥物組合物，其包含治療有效量的根據(jù)權(quán)利要求1 - 14中 任一項的胰島素受體拮抗劑。
16. 根據(jù)權(quán)利要求15的組合物，其中所述組合物配制用于皮下注 射、經(jīng)口遞送或肺遞送。
17. —種減少哺乳動物細(xì)胞中的胰島素受體活性的方法，其包括給 所述細(xì)胞遞送生理學(xué)有效量的根據(jù)權(quán)利要求1 - 14中任一項的胰島素受 體拮抗劑，以便減少胰島素受體活性。
18. —種治療受試者中的高胰島素血癥的方法，其包括給所述受試者遞送治療有效量的根據(jù)權(quán)利要求1-14中任一項的胰島素受體拮抗劑，以便治療高胰島素血癥。
19. 一種預(yù)防或改善受試者中的高胰島素血癥相關(guān)的低血糖癥的方 法，其包括給所述受試者遞送治療有效量的根據(jù)權(quán)利要求1 - 14中任一 項的胰島素受體拮抗劑。
20. 根據(jù)權(quán)利要求1 - 14中任一項的胰島素受體拮抗劑在生產(chǎn)治療 高胰島素血癥或高胰島素血癥相關(guān)狀況的藥物中的用途。
全文摘要
提供了新肽胰島素受體拮抗劑(PIRAs)以及相關(guān)化合物和組合物。還提供了PIRAs的新用途和獲得PIRAs的方法。
文檔編號C07K14/62GK101321780SQ200680045601
公開日2008年12月10日 申請日期2006年10月3日 優(yōu)先權(quán)日2005年10月5日
發(fā)明者C·L·布蘭德, J·斯圖里斯, L·沙弗, U·里貝爾 申請人:諾沃-諾迪斯克有限公司