專(zhuān)利名稱(chēng)：：?jiǎn)萎惲u肟酯酯的釩絡(luò)合物和含其的藥用組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及單異羥肟酸酯的釩絡(luò)合物和可用于治療糖尿病的含單異羥肟酸酯的釩絡(luò)合物的藥用組合物?？s寫(xiě)Asp(β)HXM，L-天冬氨酸β-單異羥肟酸酯；CytPTK，胞質(zhì)蛋白-酪氨酸激酶；Glu(γ)HXM，L-谷氨酸γ-單異羥肟酸酯；HXM，單異羥肟酸酯；InsTRK，胰島素受體酪氨酸激酶；IRS-1，胰島素受體底物1；PTK，蛋白酪氨酸激酶；KRB，KrebsRinger碳酸氫鹽；NaVO3，偏釩酸鈉；STZ，streptozocin；VOSO4，硫酸氧釩；VOCl2，氯化氧釩。
背景技術(shù)：
：在最近20年內(nèi)，對(duì)釩的胰島素模擬效應(yīng)進(jìn)行了充分的研究(在Shechter等，1995中進(jìn)行了綜述)。在體外，釩鹽模擬胰島素對(duì)該激素主要靶組織的大多數(shù)效應(yīng)，在體內(nèi)，它們誘導(dǎo)血糖量正常，并改善胰島素缺乏和胰島素抗性糖尿病嚙齒動(dòng)物的葡萄糖體內(nèi)平衡(在Brichard和Henquin，1995中進(jìn)行了綜述)。在基礎(chǔ)研究的前沿，繼續(xù)積累的數(shù)據(jù)表面，釩鹽通過(guò)替代途徑表現(xiàn)出胰島素樣代謝效應(yīng)，所述替代途徑不涉及胰島素受體酪氨酸激酶的激活，也不涉及胰島素受體底物1(IRS-1)的磷酸化。該后備系統(tǒng)的主要參與者看來(lái)涉及蛋白-磷酸酪氨酸磷酸酶的抑制和非受體蛋白酪氨酸激酶的激活(在Brichard和Henquin，1995中進(jìn)行了綜述)。在哺乳動(dòng)物中，釩是超微量元素。膳食攝入在10-60μg／天之間變化，細(xì)胞內(nèi)的濃度約為20nM(在Shechter等，1995以及Brichard和Henquin，1995中進(jìn)行了綜述)。大部分胞內(nèi)釩可能為氧釩基(+4)形式。急性口服釩化合物證明有中等毒性。然而，口服釩療法在胰島素缺乏和胰島素抗性糖尿病嚙齒動(dòng)物中的廣泛的抗糖尿病效應(yīng)(在Brichard和Henquin，1995中進(jìn)行了綜述)鼓舞人們開(kāi)始臨床研究。小劑量的釩(100-125mg／人／天，3周的時(shí)間)是允許的，盡管這低于大多數(shù)動(dòng)物研究中所用濃度的10倍，但觀(guān)察到幾種有益效應(yīng)(Cohen等，1995)。在促進(jìn)胰島素在體外(Li等，1996)和在體內(nèi)在STZ大鼠中(Skurai等，1995)的代謝效應(yīng)方面，有機(jī)螯合的釩(+4)絡(luò)合物的效力比游離釩(+4)高5倍以上。其理論基礎(chǔ)仍在研究中，這可能是將更具效力的胰島素樣釩種類(lèi)穩(wěn)定化的結(jié)果。釩鹽在體外通過(guò)替代的非胰島素依賴(lài)性機(jī)制組分模擬胰島素的代謝效應(yīng)，在糖尿病嚙齒動(dòng)物體內(nèi)可以消除胰島素抗性狀態(tài)。因此，釩療法可以成為胰島素療法的有用的、有吸引力的補(bǔ)充方法，只要釩鹽的毒性較低，或可以進(jìn)行某些操作，以不用過(guò)量的外源釩源或用減少量的外源釩源進(jìn)行釩療法。Israel的專(zhuān)利第99666號(hào)和相同申請(qǐng)人的相應(yīng)的美國(guó)專(zhuān)利5，338，759號(hào)，描述了下式的二異羥肟酸酯的氧釩基絡(luò)合物R2R3C｛CH2O(CH2)mCO[NHCHR(CH2)qCO]nNOHR1｝2該絡(luò)合物被認(rèn)為可用于治療糖尿病，但本發(fā)明人后來(lái)發(fā)現(xiàn)，在體內(nèi)不適用于在糖尿病大鼠模型中使血液葡萄糖水平正常化。表明異羥肟酸衍生物參與鐵的微生物轉(zhuǎn)運(yùn)，因此提示可用于治療鐵缺乏病癥。它們也是脲酶活性的抑制劑，表明可用于治療肝昏迷。其大多數(shù)生物活性涉及其螯合多種金屬的效力。在大多數(shù)異羥肟酸形成的金屬螯合物中，通過(guò)將OH基團(tuán)去質(zhì)子化，并且隨后(O，O)與羰基氧和去質(zhì)子化的OH配位，發(fā)生配位。氨基酸單異羥肟酸酯是簡(jiǎn)單的氨基酸無(wú)毒衍生物。表明D-天冬氨酸β-異羥肟酸酯(D-Asp(β)HXM)在體內(nèi)和體外均對(duì)鼠白血病L5178Y具有抗腫瘤活性，在體外具有抗Friend白血病細(xì)胞活性(Toumaire等，1994)。L-谷氨酸(γ)-單異羥肟酸酯(Glu(γ)HXM)在體外對(duì)白血病L1210細(xì)胞有細(xì)胞毒性，在體內(nèi)對(duì)白血病L1210和黑素瘤B16細(xì)胞有細(xì)胞毒性(Vila等，1990)。發(fā)明概述按照本發(fā)明，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，某些氨基酸單異羥肟酸酯(HXM)、特別是L形式的谷氨酸γ-單異羥肟酸酯(Glu(γ)HXM)和天冬氨酸β-異羥肟酸酯(D-Asp(β)HXM)，與釩(+4)和釩(+5)相互作用。在1∶1或2∶1HXM∶釩摩爾化學(xué)計(jì)量下，它們?cè)隗w外主要增強(qiáng)釩(+4)和(+5)的胰島素模擬效力，而在體內(nèi)使streptozocin處理的大鼠的血液葡萄糖水平正?；?。本發(fā)明涉及式(Ⅰ)的單異羥肟酸酯的新的釩絡(luò)合物R-CO-NHOH．X(Ⅰ)其中R為選自以下的殘基(ⅰ)H2N-CH(COY)-(CH2)n-(ⅱ)H2N-CH(COOH)-CH2-S-CH2-；和(ⅲ)吡啶基、哌啶基或四氫異喹喔啉基；其中n為1、2或3，而Y為OH或NH2；X為選自氧釩基(VO2+)、偏釩酸(VO3-)或釩酸(VO43+)鹽的釩化合物。按照本發(fā)明，在以上(ⅰ)的單異羥肟酸酯中，n優(yōu)選為1或2，即分別為L(zhǎng)-天冬氨酸和L-谷氨酸的β-和γ-單異羥肟酸酯。在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述氨基酸單異羥肟酸酯為Glu(γ)HXM，發(fā)現(xiàn)它與各種α-氨基酸單異羥肟酸酯相比，在大鼠脂肪細(xì)胞中胰島素代謝效應(yīng)的表現(xiàn)中最有效。非常有趣的是，在文獻(xiàn)中公開(kāi)的所有已知釩螯合劑中，諸如乙酰丙酮化物、bispicolinato和上述US5，338，759中描述的二異羥肟酸酯RL-252，在缺乏外部加入的釩的情況下，氨基酸單異羥肟酸酯在其體外產(chǎn)生胰島素效應(yīng)的能力方面是獨(dú)特的，表明氨基酸單異羥肟酸酯可能能夠?qū)⑽⑿×康奈挥诎麅?nèi)的釩(+4，～20nM)轉(zhuǎn)換為胰島素模擬活性的種類(lèi)。進(jìn)一步的體外研究表明，Glu(γ)HXM促進(jìn)所有的胰島素生理相關(guān)生物效應(yīng)。這些包括己糖攝入的激活和對(duì)異丙基腎上腺素介導(dǎo)的脂解的抑制。相當(dāng)重要的是，由Glu(γ)HXM引起的激活對(duì)于飽和濃度的胰島素產(chǎn)生的最大效應(yīng)為加性的。在以上(ⅲ)的單異羥肟酸酯中，優(yōu)選3-吡啶基，即煙酸異羥肟酸酯、2-或3-哌啶基和3-四氫異喹喔啉基。用于本發(fā)明的單異羥肟酸酯可溶于水，相比之下，上述US5，338，759的二異羥肟酸酯是水不溶性的。因此，通過(guò)將單異羥肟酸酯和所述釩鹽簡(jiǎn)單地溶于水，制備本發(fā)明的釩絡(luò)合物。用于形成本發(fā)明組合物中所用的絡(luò)合物中的釩鹽實(shí)例為但不限于VOCl2(+4)、VOSO4(+4)、NaVO3(+5)和Na3VO4(+5)。本發(fā)明設(shè)計(jì)了所述絡(luò)合物的各種HXM∶釩鹽化學(xué)計(jì)量摩爾比，但優(yōu)選1∶1和2HXM∶1釩鹽的摩爾比。通過(guò)將所述單異羥肟酸酯和所述釩鹽的水溶液混合，冷凍并凍干所述溶液，由此獲得可以例如于室溫下貯存的干粉，可以制備本發(fā)明的式Ⅰ絡(luò)合物。本發(fā)明還提供可用于治療糖尿病、特別是在糖尿病患者中降低血液葡萄糖水平和誘導(dǎo)血糖量正常的藥用組合物，包含作為活性組分的式(Ⅰ)的單異羥肟酸酯的釩絡(luò)合物和可任選的藥學(xué)上可接受的載體。所述組合物可以用于治療胰島素依賴(lài)性糖尿病(IDDM)和非胰島素依賴(lài)性糖尿病(NIDDM)。給予的劑量將取決于糖尿病患者的病況，劑量范圍可以為每日0．2mg／kg至2mg／kg。因?yàn)樵谀壳暗呐R床試驗(yàn)中，容許用于糖尿病患者的釩劑量約為2mg／kg／天，所以本發(fā)明提供的最小量代表增加10倍的效力。包含式Ⅰ的釩絡(luò)合物的本發(fā)明組合物以可溶性形式存在，諸如滴劑或膠囊或片劑形式，最好口服?？梢詫⑺鼈儐为?dú)給予或與胰島素聯(lián)合給予。式Ⅰ的釩絡(luò)合物也可以通過(guò)分別給予所述釩鹽和所述單異羥肟酸酯在體內(nèi)產(chǎn)生。本發(fā)明因此還包括包含以下藥用組合物的藥物包裝藥用組合物，包含式R-CO-NHOH的單異羥肟酸酯，其中R為選自以下的殘基(ⅰ)H2N-CH(COY)-(CH2)m-；(ⅱ)H2N-CH(COOH)-CH2-S-CH2-；和(ⅲ)吡啶基、哌啶基或四氫異喹喔啉基；n為1、2或3，而Y為OH或NH2；和藥用組合物，包含選自氧釩基(VO2+)、偏釩酸(VO3-)或釩酸(VO43+)鹽的釩化合物，并含有如何使用它們的說(shuō)明書(shū)。包含所述釩鹽的組合物最好在所述單異羥肟酸酯組合物之前給予。所述兩種組分也可以由非透性膜分開(kāi)，包含在單一組合物的一個(gè)區(qū)室內(nèi)，例如在膠囊中。由于上式R-CO-NHOH的單異羥肟酸酯、特別是Glu(γ)HXM，本身可以結(jié)合內(nèi)源胞內(nèi)釩，將后者修飾為激發(fā)胰島素代謝應(yīng)答的活性種類(lèi)，本發(fā)明還設(shè)想用于治療糖尿病的藥用組合物，包含式R-CO-NHOH的單異羥肟酸酯，其中R為選自以下的殘基(ⅰ)H2N-CH(COY)-(CH2)n-；(ⅱ)H2N-CH(COOH)-CH2-S-CH2-；和(ⅲ)吡啶基、哌啶基或四氫異喹喔啉基；而n為1、2或3，Y為OH或NH2。本發(fā)明還涉及式R-CO-NHOH的單異羥肟酸酯用于制備治療糖尿病的藥用組合物的用途，其中R為選自以下的殘基(ⅰ)H2N-CH(COY)-(CH2)n-；(ⅱ)H2N-CH(COOH)-CH2-S-CH2-；和(ⅲ)吡啶基、哌啶基或四氫異喹喔啉基；而n為1、2或3，Y為OH或NH2。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及降低糖尿病患者血液葡萄糖水平的方法，所述方法包括單獨(dú)或聯(lián)合胰島素治療給予所述患者有效量的本文式(Ⅰ)的單異羥肟酸酯釩絡(luò)合物、或有效量的本文式R-CO-NHOH的單異羥肟酸酯和選自氧釩基(VO2+)、偏釩酸(VO3-)或釩酸(VO43+)鹽的釩化合物、或有效量的本文式R-CO-NHOH的單異羥肟酸酯。在再一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及誘導(dǎo)糖尿病患者血糖量正常的方法，所述方法包括單獨(dú)或聯(lián)合胰島素治療給予所述患者有效量的本文式(Ⅰ)的單異羥肟酸酯釩絡(luò)合物、或有效量的本文式R-CO-NHOH的單異羥肟酸酯和選自氧釩基(VO2+)、偏釩酸(VO3-)或釩酸(VO43+)鹽的釩化合物、或有效量的本文式R-CO-NHOH的單異羥肟酸酯。附圖簡(jiǎn)述圖1顯示與游離VOCl2和游離Glu(γ)HXM相比，1∶1-1∶5的Glu(γ)HXM∶VOCl2絡(luò)合物對(duì)脂肪生成的濃度依賴(lài)性激活。圖2顯示與游離VOCl2相比，1∶1的Glu(γ)HXM∶VOCl2(+4)絡(luò)合物增強(qiáng)釩在STZ大鼠中的血糖量正常效應(yīng)。圖3顯示Glu(γ)HXM∶NaVO3(1∶1絡(luò)合物)、游離NaVO3和游離Glu(γ)HXM對(duì)脂肪生成的濃度依賴(lài)性激活。圖4顯示游離Glu(γ)HXM、游離NaVO3和2∶1的Glu(γ)HXM∶NaVO3絡(luò)合物在兩種不同濃度下刺激己糖流入。圖5顯示與游離Glu(γ)HXM和游離NaVO3相比，G1u(γ)HXM∶NaVO3(2∶1絡(luò)合物)降低STZ處理的大鼠的血液葡萄糖水平。圖6顯示游離Glu(γ)HXM在缺乏外部加入釩的情況下，激活大鼠脂肪細(xì)胞中的脂肪生成。圖7顯示在星形孢菌素濃度增加下，由或者游離Glu(γ)HDXM、游離NaVO3或胰島素激發(fā)的脂肪生成程度。圖8顯示在正常的脂肪細(xì)胞和富集釩的脂肪細(xì)胞中由濃度增加的游離Glu(γ)HXM激發(fā)的脂肪生成激活的比較。圖9顯示于室溫下貯存的游離Glu(γ)HXM、VOCl2和NaVO3以及Glu(γ)HXM∶VOCl2和Glu(γ)HXM∶NaVO32∶1絡(luò)合物的干粉的脂肪生成能力的比較。優(yōu)選實(shí)施方案的描述按照本發(fā)明，用釩的某些單異羥肟酸酯絡(luò)合劑達(dá)到獨(dú)特和特異性地增強(qiáng)釩的胰島素模擬效力。具體地說(shuō)，L-谷氨酸(γ)單異羥肟酸酯(Glu(γ)HXM)在釩(+5)激活大鼠脂肪細(xì)胞葡萄糖代謝方面增強(qiáng)約7-10倍，將釩在STZ處理的糖尿病大鼠中體內(nèi)降低血液葡萄糖水平方面的效力提高5-7倍。在2∶1的L-Glu(γ)HXM∶釩摩爾比下，增強(qiáng)最大。L-Glu(γ)HXM未修飾的α-氨基部分和α-羧基部分是所述增強(qiáng)作用必需的。此外，L-Glu(γ)HXM的協(xié)同作用是立體特異性的，不因D-Glu(γ)HXM增強(qiáng)，盡管后者也與釩絡(luò)合。非常有趣的是，在所有文獻(xiàn)記載的增強(qiáng)釩胰島素模擬作用的釩絡(luò)合劑中，在缺乏外部加入釩的情況下，在激活大鼠脂肪細(xì)胞脂肪生成方面L-Glu(γ)HXM也是獨(dú)特的。本文通過(guò)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)還確立，這種效應(yīng)通過(guò)釩途徑表現(xiàn)，表明L-Glu(γ)HXM能夠?qū)⒋笫笾炯?xì)胞中生理上微小量的內(nèi)源存在的釩轉(zhuǎn)換為胰島素模擬活性種類(lèi)。對(duì)該活性絡(luò)合物的化學(xué)物理研究顯示出獨(dú)特的物理化學(xué)特征。釩在生理pH值下維持+5氧化狀態(tài)，如果用氧釩基+4陽(yáng)離子制備，也處于平衡。本發(fā)明所用的體外篩選測(cè)定表明，除Glu(γ)HXM外，L-Asp(β)HXM和煙酸-HXM(1∶1的摩爾比)也增強(qiáng)釩(+4)的胰島素模擬效力。其協(xié)同效應(yīng)約為85％，Glu(γ)HXM施加的協(xié)同效應(yīng)約為57％。相反，α-氨基酸異羥肟酸酯以及Glu(γ)HXM和Glu(γ)HXM的D-異構(gòu)體不增強(qiáng)的VOCl2胰島素模擬效力?，F(xiàn)在將通過(guò)以下非限制性實(shí)施例說(shuō)明本發(fā)明。實(shí)驗(yàn)步驟(a)材料。D-[U-14C]葡萄糖和2-脫氧-D-[G-3H]葡萄糖購(gòu)自NewEnglandNuclear(BostonMA)。I型膠原酶(134U／mg)得自WorthingtonBiochemicals(Freehold，NJ)。豬胰島素購(gòu)自EliLillyCo．(Indianapolis，IN)。根皮素、2脫氧葡萄糖、L-谷氨酸γ-單異羥肟酸酯(Glu(γ)HXM)、甘氨酸異羥肟酸酯(Gly-HXM)、L-異亮氨酸異羥肟酸酯(isoleu-HXM)、L-色氨酸異羥肟酸酯(Trp-HXM)、L-酪氨酸異羥肟酸酯(Tyr-HXM)和L-胱氨酸二異羥肟酸酯(胱氨酸(HXM2)購(gòu)自SigmaChemicalCo．，St．Louis，MO。Krebs-Ringer碳酸氫鹽(KRB)緩沖液(pH7．4)含有110mMNaCl、25mMNaHCO3、5mMKCl、1．2mMKH2PO4、1．3mMCaCl2、1．3mMMgSO4。用于該研究的所有其它化學(xué)藥品和試劑均為分析級(jí)。(b)Streptozocin(STZ)處理的大鼠通過(guò)單次靜脈內(nèi)注射新鮮制備的streptozocin(55mg／kg體重)的0．1M檸檬酸緩沖液(pH4．5)溶液，誘導(dǎo)糖尿病。在誘導(dǎo)糖尿病后14天，測(cè)定測(cè)試化合物對(duì)血液葡萄糖水平的效應(yīng)。(c)細(xì)胞制備和脂肪生成的生物測(cè)定基本上通過(guò)Rodbell，1964的方法制備大鼠脂肪細(xì)胞。將雄性Wistar大鼠的頰脂墊用剪刀切為小片，懸浮于3mlKRB緩沖液。在25ml撓性塑料瓶中，在卡波金氛圍(95％O2，5％CO2)下，于37℃用膠原酶(1型，134單位／mg；1mg／ml)在劇烈攪拌下消化40分鐘。消化后至少3小時(shí)，根據(jù)錐蟲(chóng)藍(lán)排除，表明細(xì)胞制劑的存活率高于95％。然后加入5ml緩沖液，使細(xì)胞通過(guò)網(wǎng)篩。然后讓細(xì)胞于室溫下在塑料試管中靜置數(shù)分鐘，飄浮，并去除下面的緩沖液。重復(fù)該步驟(懸浮、飄浮和去除下面的緩沖液)3次。在脂肪生成測(cè)定中，為了測(cè)定葡萄糖的攝入及其向脂質(zhì)中的摻入(脂肪生成)，將脂肪細(xì)胞懸液(3×105細(xì)胞／ml)分裝到塑料管制瓶(0．5ml／管制瓶)中，在或者缺乏或者存在胰島素(100ng／ml)的情況下，在卡波金氛圍下，于37℃與0．2mM[U-14C]葡萄糖(4-7mCi／mol)和測(cè)試絡(luò)合物一起孵育60分鐘。加入基于甲苯的閃爍液(1．0ml／管制瓶)終止脂肪生成，并對(duì)所提取的脂質(zhì)的放射活性進(jìn)行計(jì)數(shù)(Moody等，1974)。在一個(gè)典型試驗(yàn)中，胰島素刺激的脂肪生成高于基礎(chǔ)4-5倍。V基礎(chǔ)≈2000cpm／3×105／h；V胰島素≈8，000-10，000cpm／3×105／h。實(shí)施例實(shí)施例1．等摩爾濃度的單異羥肟酸酯體外增強(qiáng)低濃度VOCl2(10mM)的脂肪生成能力。發(fā)現(xiàn)以下方案在體外是一個(gè)可靠的測(cè)定，它是STZ-大鼠體內(nèi)所述氨基酸單異羥肟酸酯對(duì)釩(+4)增強(qiáng)作用的指標(biāo)。如試驗(yàn)步驟(c)小節(jié)中所述，用10μM不同的游離氨基酸單異羥肟酸酯(HXM)溶液、10μMVOCl2(+4)溶液或10μM新鮮制備的氨基酸-HXM∶VOCl2的1∶1絡(luò)合物溶液，進(jìn)行脂肪生成的激活。測(cè)試以下氨基酸單異羥肟酸酯L-谷氨酸γ-單異羥肟酸酯(Glu(γ)HXM)、甘氨酸異羥肟酸酯(Gly-HXM)、L-異亮氨酸異羥肟酸酯(Ile-HXM)、L-色氨酸異羥肟酸酯(Trp-HXM)、L-酪氨酸異羥肟酸酯(Tyr-HXM)、L-胱氨酸二異羥肟酸酯(Cys(HXM2)、L-賴(lài)氨酸異羥肟酸酯(Lys-HXM)、煙酸異羥肟酸酯(Nic-HXM)、L-精氨酸異羥肟酸酯(Arg-HXM)、L-組氨酸異羥肟酸酯(His-HXM)、D-谷氨酸γ-單異羥肟酸酯[D-Glu(γ)HXM]、N-乙酰-L-谷氨酸γ-單異羥肟酸酯[N-乙酰-Glu(γ)HXM]、L-天冬氨酸β-單異羥肟酸酯[Asp(β)HXM]、氨基丁酸單異羥肟酸酯[Aib-HXM]。表Ⅰ和表Ⅱ總結(jié)了所述結(jié)果。如表1所示，Glu(γ)HXM(10μM)、VOCl2(10mm)或其1∶1的絡(luò)合物分別產(chǎn)生22％、40％和117％的最大胰島素應(yīng)答。因此凈增強(qiáng)效應(yīng)為51％。Nic-HXM也增強(qiáng)VOCl2的脂肪生成能力(表Ⅰ中的凈增強(qiáng)效應(yīng)為29％)。研究的其它氨基酸異羥肟酸酯不增強(qiáng)釩(+4)的效應(yīng)。這同樣適用于D-Glu(γ)HXM和N-乙酰-Glu(γ)HXM，表明Glu(γ)HXM、游離α-氨基和L-異構(gòu)體形式是增強(qiáng)所必需的。表Ⅰ．等摩爾濃度的氨基酸單異羥肟酸酯增強(qiáng)低濃度VOCl2(10μM)的脂肪生成能力胰島素最大效應(yīng)的百分率<tablesid="table1"num="001"><table>僅氨基酸-HXM(10μM)僅VOCl2(10μM)VOCl2∶HXM1∶1(10μM)凈增強(qiáng)效應(yīng)(％)Glu(γ)HXM22％40％117％51％Nic-HXM11％40％80％29％Aib-HXM0％(-3％)40％22％0Lys-HXM0％(-4％)40％36％0D-Glu(γ)HXM1％40％17％0N-乙酰Glu(γ)HXM0％40％24％0L-Asp(β)HXM8％11％73％54％Arg-HXM4％11％17％～2％Trp-HXM2％11％22％～9％His-HXM4％11％18％～3％</table></tables>表Ⅱ．與L-Glu(γ)HXM∶VOCl2(1∶1)相比，各種VOCl2∶HXM(1∶1)的胰島素模擬效應(yīng)VOCl2的1∶1絡(luò)合物和∶相對(duì)Glu(γ)HXMVOCl2的活性％L-Glu(γ)HXM100％L-Asp(β)HXM，Nic-HXM70％D-Glu(γ)HXM，N-乙酰Glu(γ)HXM，D-Asp(β)HXM0％Aib-HXM，Lys-HXM，Arg-HXM，Trp-HXM，His-HXM實(shí)施例2．與游離VOCl2和游離Glu(γ)HXM相比，Glu(γ)HXMVOCl2的1∶1至1∶5絡(luò)合物濃度依賴(lài)性地體外激活脂肪生成。為了測(cè)定Glu(γ)HXM∶VOCl2絡(luò)合物協(xié)同釩胰島素模擬效力的最有效的比率，如試驗(yàn)步驟(c)小節(jié)所述，用Glu(γ)HXM∶VOCl2的1∶1至5∶1絡(luò)合物、游離VOCl2和游離Glu(γ)HXM，進(jìn)行脂肪生成。圖1所示的結(jié)果表明，與單獨(dú)的5mMVOCl2和與濃度增加的Glu(γ)HXM(5-25μM)絡(luò)合的VOCl2的脂肪生成效力相比，發(fā)現(xiàn)這兩者1∶1化學(xué)計(jì)量的絡(luò)合物最有效地協(xié)同釩(+4)的胰島素模擬效力。實(shí)施例3．Glu(γ)HXM∶VOCl2(1∶1絡(luò)合物)對(duì)STZ-大鼠的血液葡萄糖水平(BGL)的效應(yīng)；與單獨(dú)的低濃度VOCl2比較。為了表明釩(+4)氨基酸單異羥肟酸酯螯合劑體內(nèi)增強(qiáng)釩的血糖量正常效應(yīng)，給STZ-大鼠(參見(jiàn)試驗(yàn)步驟(b)小節(jié))腹膜內(nèi)注射或者VOCl2(0．02mmol／kg／天)或VOCl2∶Glu(γ)HXM1∶1絡(luò)合物(0．02mmol／kg／天)。在12天內(nèi)測(cè)定血液葡萄糖水平。結(jié)果描述于圖2，表明每日腹膜內(nèi)注射低劑量的VOCl2本身(約2mg釩／kg／天)對(duì)降低血液葡萄糖水平?jīng)]有顯著效應(yīng)，而Glu(γ)HXM∶VOCl2的1∶1絡(luò)合物(約1mg／kg／天)有效，并在STZ-大鼠中導(dǎo)致顯著降低血液葡萄糖水平趨向正常值。在給予所述絡(luò)合物后2天之內(nèi)已經(jīng)達(dá)到穩(wěn)定的血糖量正常，并且在給予后持續(xù)數(shù)天(圖2，虛線(xiàn)代表對(duì)照健康大鼠的血液葡萄糖水平)。誘導(dǎo)血糖量正常所需的游離釩(+4)量為9．3mg／kg／天(腹膜內(nèi)給予)。Glu(γ)HXM∶VOCl2絡(luò)合物(1∶1)將日劑量降至約1mg／kg／天(腹膜內(nèi)給予)。因此，在該體內(nèi)STZ-大鼠模型中，釩(+4)與Glu(γ)HXM的絡(luò)合看來(lái)增強(qiáng)釩(+4)約9倍。實(shí)施例4．單異羥肟酸酯也協(xié)同釩(+5)L-Glu(γ)HXM的胰島素模擬效力，高度增強(qiáng)釩(+5)對(duì)大鼠脂肪細(xì)胞葡萄糖代靜的激活。為了測(cè)試Glu(γ)HXM與釩(+5)絡(luò)合時(shí)的協(xié)同效應(yīng)，如試驗(yàn)步驟(c)小節(jié)所述，分別用濃度范圍為10μM-50μM的Glu(γ)HXM∶VO4+3(+5)1∶1絡(luò)合物、游離的Na3VO4和游離的Glu(γ)HXM，進(jìn)行脂肪生成。與US5，338．759中所述命名為RL-252的二異羥肟酸酯不同，Glu(γ)HXM顯著增強(qiáng)釩(+5)的胰島素樣效應(yīng)(圖3)，而發(fā)現(xiàn)RL-252增強(qiáng)釩(+4)的胰島素模擬能力，但對(duì)釩(+5)體外效力不產(chǎn)生影響，并且甚至降低其效力。與或者游離的Na3VO4或游離的G1u(γ)HXM相比，估計(jì)Glu(γ)HXM∶VO4+3(+5)激活脂肪生成的效力高至少7倍。實(shí)施例5．Glu(γ)HXM和-Glu(γ)HXM∶NaVO3(2∶1)絡(luò)合物刺激己糖的流入。為了測(cè)試游離Glu(γ)HXM和Glu(γ)HXM∶NaVO3(2∶1)絡(luò)合物對(duì)葡萄糖進(jìn)入細(xì)胞的特異性效應(yīng)，用2-脫氧-D-[6-3H]葡萄糖(2-DG)進(jìn)行體外測(cè)定。2-DG是一種葡萄糖的非代謝類(lèi)似物，因此該測(cè)定代表化合物對(duì)葡萄糖流入細(xì)胞的影響，與葡萄糖代謝無(wú)關(guān)。在缺乏和存在胰島素(17nM)和指定濃度(20和40μM)Glu(γ)HXM、Glu(γ)HXM∶NaVO3(2∶1)絡(luò)合物和NaVO3的情況下，將新鮮制備的懸浮于含1．0％BSA的KRB緩沖液pH7．4中的脂肪細(xì)胞(3×105細(xì)胞／ml)預(yù)孵育30分鐘。將等份(70μl)的上述樣品轉(zhuǎn)移到含2-脫氧-D-[6-3H]葡萄糖(0．1mM終濃度)的試管中。3分鐘后，加入根皮素(0．1nM)以終止2-DG滲透入細(xì)胞。然后將懸浮細(xì)胞樣品轉(zhuǎn)移至具有硅油的試管中，當(dāng)離心時(shí)，細(xì)胞與KRB培養(yǎng)基和余下的2-DG分離。如圖4所示，發(fā)現(xiàn)游離的Glu(γ)HXM和Glu(γ)HXM∶NaVO3(2∶1)絡(luò)合物激活葡萄糖進(jìn)入細(xì)胞，而與葡萄糖代謝無(wú)關(guān)。效應(yīng)的大小總計(jì)分別為約最大胰島素應(yīng)答的60％和120％。實(shí)施例6．Glu(γ)HXM∶NaVO3(2∶1)絡(luò)合物降低STZ處理大鼠的血液葡萄糖水平。為了表明釩(+5)和單異羥肟酸酯螯合劑的絡(luò)合物增強(qiáng)釩體內(nèi)的血糖量正常效應(yīng)，并測(cè)試游離Glu(γ)HXM體內(nèi)的血糖量正常效應(yīng)，將STZ糖尿病大鼠分為4組，每組4-5只大鼠∶糖尿病對(duì)照大鼠；釩(+5)處理的大鼠；Glu(γ)HXM∶NaVO3(2∶1)絡(luò)合物處理的大鼠；和游離Glu(γ)HXM處理的大鼠。每組每日接受腹膜內(nèi)注射0．05mmol／kg(于11．00a．m．)相應(yīng)化合物。如圖5所示，第一天(于8．00a．m．測(cè)定血液葡萄糖水平)后，所述絡(luò)合物處理組的血液葡萄糖水平降至正常水平。實(shí)施例7．Glu(γ)HXM在缺乏外部加入釩的情況下激活大鼠脂肪細(xì)胞的脂肪生成。為了研究游離Glu(γ)HXM的血糖量正常的潛力，如上所述，用濃度范圍為10-100μM的Glu(γ)HXM進(jìn)行脂肪生成。如圖6所示，在本文測(cè)試的所有釩結(jié)合劑中，Glu(γ)HXM在缺乏外部加入釩的情況下產(chǎn)生胰島素效應(yīng)的能力是特有的。設(shè)想在能夠?qū)⑽⑿×康奈挥诎麅?nèi)的釩(～20nM)轉(zhuǎn)化為胰島素模擬活性種類(lèi)方面，L-Glu(γ)HXM不同于所有其它氨基酸-HXM。實(shí)施例8．星形孢菌素抑制Glu(γ)HXM激發(fā)的大鼠脂肪細(xì)胞的脂肪生成。與星形孢菌素對(duì)胰島素和釩激發(fā)的脂肪生成的效應(yīng)比較。星形孢菌素是一種大鼠脂肪細(xì)胞CytPTK(ki～2nM)的有效抑制劑和InsRTK(Ki～1μM)的弱抑制劑，它優(yōu)先抑制釩刺激脂肪生成的效應(yīng)。為了確定游離Glu(γ)HXM是否也通過(guò)釩途徑起作用，于37℃使脂肪細(xì)胞經(jīng)受各種濃度的星形孢菌素(如圖7所示)處理30分鐘。然后，用如上所述制備的脂肪細(xì)胞，在存在胰島素(17nM)、偏釩酸鈉(0．8mM)或Glu(γ)HXM(100μM)的情況下，進(jìn)行脂肪生成。在缺乏星形孢菌素的情況下，最大激活(100％)為用胰島素、釩酸鹽或Glu(γ)HXM獲得的激活。圖7顯示在濃度增加的星形孢菌素下由游離Glu(γ)HXM、偏釩酸鈉或胰島素激發(fā)的脂肪生成程度。Glu(γ)HXM的脂肪生成激活被星形孢菌素以劑量依賴(lài)性方式抑制。所述抑制曲線(xiàn)類(lèi)似釩酸鹽(非胰島素)激發(fā)的脂肪生成獲得的抑制曲線(xiàn)，表明游離的Glu(γ)HXM通過(guò)釩(非胰島素依賴(lài)性)途徑起作用。實(shí)施例9．脂肪生成用Glu(γ)HXM處理的正常脂肪細(xì)胞和釩富集的脂肪細(xì)胞之間的比較。在缺乏外部加入釩的情況下，在激活大鼠脂肪細(xì)胞脂肪生成方面，游離Glu(γ)HXM是獨(dú)特的。本文通過(guò)試驗(yàn)數(shù)據(jù)確立，該效應(yīng)通過(guò)釩途徑表現(xiàn)，表明游離Glu(γ)HXM能夠?qū)⒋笫笾炯?xì)胞中生理微小量的內(nèi)源存在的釩轉(zhuǎn)換為胰島素模擬活性種類(lèi)。為了證實(shí)這種效應(yīng)，雄性Wistar大鼠每日接受皮下注射N(xiāo)aVO3(12mg／kg／天)5天(此后稱(chēng)為“富集釩的大鼠”。如上所述，用游離Glu(γ)HXM進(jìn)行脂肪生成，以比較從非富集釩的大鼠與富集釩的大鼠新鮮制備的大鼠脂肪細(xì)胞。如圖8所示，發(fā)現(xiàn)游離Glu(γ)HXM在富集釩的大鼠中，在高得多的程度上增強(qiáng)胞內(nèi)釩的效應(yīng)。實(shí)施例10．Glu(γ)HXM釩絡(luò)合物是穩(wěn)定的。為了表明當(dāng)作為干粉于室溫下保持時(shí)，在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)Glu(γ)HXM與NaVO3和VOCl2形成保留高度活性的穩(wěn)定絡(luò)合物，通過(guò)分別將所述單異羥肟酸酯和所述釩鹽以2∶1等摩爾濃度溶于水中，制備的Glu(γ)HXM∶NaVO3和Glu(γ)HXM∶VOCl2的2∶1絡(luò)合物。然后將水溶液混合，用液氮冷凍并凍干。讓獲得的干粉于室溫下靜置4周。然后如上所述，用游離Glu(γ)HXM、NaVO3和VOCl2以及作為干粉的Glu(γ)HXM∶NaVO3和Glu(γ)HXM∶VOCl2的2∶1絡(luò)合物進(jìn)行脂肪生成。如圖9所示，兩種絡(luò)合物均保持其胰島素模擬活性水平，表明它們是穩(wěn)定的。參考文獻(xiàn)Brichard，S．M．和Henquin，J．C．(1995)TrendsinPharmacol．Sci．16，265-270．Brown，D．A．，R．A．Coogan，N．J．Fitzpatrick，W．K．Glass，D．E．Abukshima，L．Shiels，M．Ahlgren，K．Smolander，T．t．Pakkanen，T．A．Pakkanen和M．Perakyla(1996)J．Chem．Soc．，PerkinTrans．2，2673-2679．Cohen，N．，Halberstam．M．，Shomovich，P．，Chang，C．R．，Shamoon，H．和Rossetti，L．(1995)J．Clin．Invest．95，2051-2509．Li，J．，Elberg，G．，Crans，D．C．和Shechter，Y．(1996)Biochemistry35，8314-8318．Moody，A，Sta，M．A．，Stan，M．和Glimann，J．(1974)Horm．Metab．Res．6，12-16．Rodbell，M(1964)J．Biol．Chem．239，375-80．Sakurai等(1995)BBRC，214，1095-1101．Shechter，Y．，ShishevaA．，Lazar，R．，Libman，J．和Shanzer，A．(1992)Biochemistry31，2063-68．Shechter，Y．，Li，J．，Meyerovitch，J．，Gefel，D．，Bruck，R．，Elberg，G．，Miller，D．S．和Shisheva，A．，(1995)Molec．Cell．Biochem．153，39-47．Tournaire，R．，S．Malley，F(xiàn)．Hamedi-Sangsari，N．Thomasset，J．Grange，J．F．Dore和J．Vila，(1994)Int．J．Cancer58，420-425．Vila，J．，N．Thomasset，C．Navarro和J．F．Dore(1990)Int．J．Cancer45，737-74權(quán)利要求1．式(Ⅰ)的單異羥肟酸酯釩絡(luò)合物R-CO-NHOH．X(Ⅰ)其中R為選自以下的殘基(ⅰ)H2N-CH(COY)-(CH2)n-其中n為1、2或3，而Y為OH或NH2；(ⅱ)H2N-CH(COOH)-CH2-S-CH2-；和(ⅲ)吡啶基、哌啶基或四氫異喹喔啉基；而X為選自氧釩基(VO2+)、偏釩酸(VO3-)或釩酸(VO43+)鹽的釩化合物。2．按照權(quán)利要求1的下式的L-谷氨酸γ-單異羥肟酸酯的1∶1或2∶1氧釩基絡(luò)合物H2N-CH(COOH)-CH2-CH2-CO-NHOH∶VOCl2。3．按照權(quán)利要求1的下式的L-谷氨酸γ-單異羥肟酸酯的1∶1或2∶1釩酸鹽絡(luò)合物H2N-CH(COOH)-CH2-CH2-CO-NHOH∶NaVO3。4．按照權(quán)利要求1的下式的L-天冬氨酸β-單異羥肟酸酯的氧釩基絡(luò)合物H2N-CH(COOH)-CH2-CO-NHOH∶VOCl2。5．按照權(quán)利要求1的下式的煙酸異羥肟酸酯的氧釩基絡(luò)合物吡啶基-3-CO-NHOH∶VOCl2。6．藥用組合物，包含活性組分的有效量的權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)要求保護(hù)的單異羥肟酸酯釩絡(luò)合物和可任選的藥學(xué)上可接受的載體。7．按照權(quán)利要求6的藥用組合物，它可用于降低糖尿病患者的血液葡萄糖水平和／或誘導(dǎo)血糖量正常。8．按照權(quán)利要求7的適用于口服形式的藥用組合物。9．治療糖尿病的藥用組合物，包含選自的氧釩基、偏釩酸鹽和釩酸鹽的釩化合物和式R-CO-NHOH的單異羥肟酸酯，其中R為選自以下的殘基(ⅰ)H2N-CH(COY)-(CH2)n-，其中n為1、2或3，而Y為OH或NH2；(ⅱ)H2N-CH(COOH)-CH2-S-CH2-；和(ⅲ)吡啶基、哌啶基或四氫異喹喔啉基；其中所述釩鹽和所述單異羥肟酸酯在所述組合物中相互分離。10．具有兩個(gè)區(qū)室的藥物包裝，第一個(gè)區(qū)室包含選自氧釩基、偏釩酸鹽和釩酸鹽釩化合物，而第二個(gè)區(qū)室包含式R-CO-NHOH的單異羥肟酸酯，其中R為選自以下的殘基(ⅰ)H2N-CH(COY)-(CH2)n-，其中n為1、2或3，而Y為OH或NH2；(ⅱ)H2N-CH(COOH)-CH2-S-CH2-；和(ⅲ)吡啶基、哌啶基或四氫異喹喔啉基；以及如何將其給予以在糖尿病患者中降低血液葡萄糖水平和／或誘導(dǎo)血糖量正常的說(shuō)明書(shū)。11．權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)要求保護(hù)的單異羥肟酸酯釩絡(luò)合物的用途，用于制備可用于在糖尿病患者中降低血液葡萄糖水平和／或誘導(dǎo)血糖量正常的藥用組合物。12．式R-CO-NHOH的單異羥肟酸酯的用途，其中R為選自以下的殘基(ⅰ)H2N-CH(COY)-(CH2)n-，其中n為1、2或3，而Y為OH或NH2；(ⅱ)H2N-CH(COOH)-CH2-S-CH2-；和(ⅲ)吡啶基、哌啶基或四氫異喹喔啉基；用于制備可用于在糖尿病患者中降低血液葡萄糖水平和／或誘導(dǎo)血糖量正常的藥用組合物。13．在糖尿病患者中降低血液葡萄糖水平和／或誘導(dǎo)血糖量正常的方法，所述方法包括給予所述患者有效量的式(Ⅰ)的單異羥肟酸酯釩絡(luò)合物R-CO-NHOH．X(Ⅰ)其中R為選自以下的殘基(ⅰ)H2N-CH(COY)-(CH2)n-其中n為1、2或3，而Y為OH或NH2；(ⅱ)H2N-CH(COOH)-CH2-S-CH2-；和(ⅲ)吡啶基、哌啶基或四氫異喹喔啉基；而X為選自氧釩基(VO2+)、偏釩酸(VO3-)和釩酸(VO43+)鹽的釩化合物。14．按照權(quán)利要求13的方法，其中所述釩絡(luò)合物為下式的L-谷氨酸γ-單異羥肟酸酯的1∶1或2∶1氧釩基絡(luò)合物H2N-CH(COOH)-CH2-CH2-CO-NHOH∶VOCl2。15．按照權(quán)利要求13的方法，其中所述釩絡(luò)合物為下式的L-谷氨酸γ-單異羥肟酸酯的1∶1或2∶1釩酸鹽絡(luò)合物H2N-CH(COOH)-CH2-CH2-CO-NHOH∶NaVO3。16．按照權(quán)利要求13的方法，其中所述釩絡(luò)合物為下式的β-天冬氨酸單異羥肟酸酯的氧釩基絡(luò)合物H2N-CH(COOH)-CH2-CO-NHOH∶VOCl2。17．在糖尿病患者中誘導(dǎo)血糖量正常和／或降低血液葡萄糖水平的方法，所述方法包括給予所述患者有效量的選自氧釩基、偏釩酸鹽和釩酸鹽的釩化合物和給予有效量的式R-CO-NHOH的單異羥肟酸酯，其中R為選自以下的殘基(i)H2N-CH(COY)-(CH2)n-，其中n為1、2或3，而Y為OH或NH2；(ⅱ)H2N-CH(COOH)-CH2-S-CH2-；和(ⅲ)吡啶基、哌啶基或四氫異喹喔啉基。18．按照權(quán)利要求17的方法，其中所述釩化合物在所述異羥肟酸酯化合物之前給予。19．按照權(quán)利要求13-18中任一項(xiàng)的方法，其中所述釩絡(luò)合物口服給予。20．按照權(quán)利要求13-18中任一項(xiàng)的方法，其中所述治療聯(lián)合給予胰島素。全文摘要式(Ⅰ):R－CO－NHOH.X的單異羥肟酸酯釩絡(luò)合物,其中R為選自以下的殘基:(i)H文檔編號(hào)C07C323/60GK1278785SQ98810940公開(kāi)日2001年1月3日申請(qǐng)日期1998年9月10日優(yōu)先權(quán)日1997年9月11日發(fā)明者Y·謝克特爾,M·弗里德金,I·格爾德瓦澤,E·格爾肖諾夫申請(qǐng)人:耶達(dá)研究及發(fā)展有限公司