本發(fā)明涉及高分子化學(xué)、生物醫(yī)用材料及納米技術(shù)研究領(lǐng)域，更具體地，涉及側(cè)鏈帶PAMAM的聚合物膠束及其制備方法。

背景技術(shù)：

惡性腫瘤的治療長(zhǎng)期以來(lái)是一個(gè)世界性的難題，在癌癥的臨床治療中，腫瘤化療仍然是其主要的治療手段，但其效果卻受到了腫瘤細(xì)胞耐藥性的限制。腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物所產(chǎn)生的多藥耐藥(multidrug resistance，MDR)是導(dǎo)致癌癥臨床治療失敗的重要原因。研究表明很多類型的腫瘤細(xì)胞的耐藥機(jī)制均與其細(xì)胞膜上過(guò)量表達(dá)P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)有關(guān)。近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的小干擾RNA(small interferin RNA，siRNA)技術(shù)因其特異性強(qiáng)、易包封、安全高效而顯示出廣闊的應(yīng)用前景。研究表明，只需將抗MDR的siRNA導(dǎo)入細(xì)胞就可以有效的抑制P-gp的表達(dá)，從而逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥性。但另一方面，由于siRNA分子本身在生理環(huán)境中易降解，血液循環(huán)的半衰期短，進(jìn)入細(xì)胞的能力弱，因此siRNA的系統(tǒng)給藥問(wèn)題成為其在治療中應(yīng)用的主要障礙。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)上述存在的問(wèn)題，本發(fā)明提供一種基于點(diǎn)擊化學(xué)合成的側(cè)鏈帶PAMAM的聚合物膠束，該聚合物膠束利用聚合物載體這一類有前途的siRNA輸送體系，該siRNA輸送體系在水溶液中，水溶性陽(yáng)離子聚合物載體可以通過(guò)靜電相互作用與siRNA形成納米尺度的復(fù)合物，從而保護(hù)siRNA，提高進(jìn)入細(xì)胞的能力；聚酰胺-胺型樹(shù)枝狀高分子(Polyamidoamine dendrimer，PAMAM)由于其獨(dú)特的樹(shù)枝狀結(jié)構(gòu)和較強(qiáng)的質(zhì)子化能力而使其具有很好的siRNA傳遞性能；本發(fā)明利用點(diǎn)擊化學(xué)合成了這一種側(cè)鏈帶有 G2.0-PAMAM的聚合物，并最終制成了聚合物膠束，通過(guò)對(duì)膠束粒徑、Zeta電位以及臨界膠束濃度等方面性質(zhì)的表征，證明了其具有載siRNA的性質(zhì)，為進(jìn)一步研究做了巨大的貢獻(xiàn)。

本發(fā)明提供了一種基于點(diǎn)擊化學(xué)合成的側(cè)鏈帶PAMAM的聚合物膠束，其特征在于，所述聚合物膠束是側(cè)鏈帶有G2.0-PAMAM的聚合物乙縮醛-聚乙二醇-聚己內(nèi)酯-G2.0(Acetal-PEO-b-PCL-G2.0)，其中，G2.0代表2代的聚酰胺-胺型樹(shù)枝狀大分子(G2.0-PAMAM)，所述聚合物膠束的化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下所示：

本發(fā)明還提供了一種基于點(diǎn)擊化學(xué)合成側(cè)鏈帶PAMAM的聚合物膠束的方法，所述方法包括以下步驟：1)聚合物Acetal-PEO-P(α-Br-CL)的合成：將乙縮醛-聚乙二醇和辛酸亞錫溶解于甲苯，得到第一混合物，然后將ε-己內(nèi)酯和α-溴代-ε-己內(nèi)酯加入到所述第一混合物中，在惰性氣體保護(hù)下進(jìn)行反應(yīng)，引發(fā)ε-己內(nèi)酯和α-溴代-ε-己內(nèi)酯發(fā)生開(kāi)環(huán)聚合反應(yīng)，將所得產(chǎn)物在冰乙醚里沉淀，得到固體聚合物Acetal-PEO-P(α-Br-CL)；2)聚合物Acetal-PEO-b-P(α-N_3-CL)的合成：將聚合物Acetal-PEO-P(α-Br-CL)、NaN₃溶于N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，在惰性氣體保護(hù)下進(jìn)行反應(yīng)，將反應(yīng)產(chǎn)物透析純化，然后經(jīng)凍干得到側(cè)鏈帶有疊氮基團(tuán)的聚合物Acetal-PEO-b-P(α-N_3-CL)；3)PAMAM-G2.0樹(shù)枝狀大分子的合成：將3-炔丙胺溶于甲醇中，然后向溶液中滴加丙烯酸甲酯，在惰性氣體保護(hù)下攪拌48-72h，旋干溶劑，將所得的第二混合物過(guò)硅膠柱進(jìn)行提純，得到淡黃色 液體PAMAM-G0.5，將得到的PAMAM-G0.5溶于甲醇中，向溶液中滴加乙二胺，在惰性氣體保護(hù)下攪拌48-72h，旋干溶劑，將所得的第三混合物溶于甲醇并且在冰乙醚里沉淀以除去未反應(yīng)的乙二胺，得到淡黃色液體產(chǎn)物PAMAM-G1.0；將所述PAMAM-G1.0溶于甲醇中，然后向溶液中滴加丙烯酸甲酯，在惰性氣體保護(hù)下攪拌48-72h，旋干溶劑，將所得的第四混合物過(guò)硅膠柱進(jìn)行提純，得到淡黃色液體PAMAM-G1.5，將得到的PAMAM-G1.5溶于甲醇中，向溶液中滴加乙二胺，在惰性氣體保護(hù)下攪拌48-72h，旋干溶劑，將所得的第五混合物溶于甲醇并且在冰乙醚里沉淀以除去未反應(yīng)的乙二胺，得到淡黃色液體產(chǎn)物PAMAM-G2.0；4)利用點(diǎn)擊化學(xué)合成聚合物Acetal-PEO-b-PCL-G2.0：將聚合物Acetal-PEO-b-P(α-N₃-CL)和PAMAM-G2.0溶于二甲基亞砜(DMSO)中得到混合液，在氬氣保護(hù)下，將五水硫酸銅溶液和抗壞血酸鈉溶液依次滴加到所述混合液中以發(fā)生反應(yīng)，將所得的第六混合物進(jìn)行透析、凍干，得到黃褐色粉末Acetal-PEO-b-PCL-G2.0；5)聚合物Acetal-PEO-b-PCL-G2.0膠束的制備：將聚合物Acetal-PEO-b-PCL-G2.0溶于二甲基亞砜(DMSO)中配置成溶液并且進(jìn)行溶脹，在攪拌下滴加超純水得到膠束粗產(chǎn)品，然后將膠束粗產(chǎn)品透析，對(duì)透析液進(jìn)行超濾、凍干，制得所述聚合物膠束。

在上述方法中，其中，在步驟1)中，乙縮醛-聚乙二醇、辛酸亞錫、ε-己內(nèi)酯和α-溴代-ε-己內(nèi)酯的摩爾比為1:0.05:10:5，乙縮醛-聚乙二醇與甲苯的用量比為1mmol：25mL。

在上述方法中，其中，在步驟2)中，聚合物Acetal-PEO-P(α-Br-CL)與N,N-二甲基甲酰胺的用量比為1mmol:60mL。

在上述方法中，其中，在步驟3)的合成PAMAM-G0.5的反應(yīng)中，3-炔丙胺、丙烯酸甲酯與甲醇的摩爾比為1:4:20。

在上述方法中，其中，在步驟3)的合成PAMAM-G1.0的反應(yīng)中，PAMAM-G0.5、乙二胺與甲醇的摩爾比為1:15:20，并且其中，在將所得的第三混合物溶于甲醇時(shí)，所述第三混合物和甲醇的體積比為1:2。

在上述方法中，在步驟3)的合成PAMAM-G1.5的反應(yīng)中，PAMAM-G1.0、丙烯酸甲酯與甲醇的摩爾比為1:8:15。

在上述方法中，在步驟3)的合成PAMAM-G2.0的反應(yīng)中，PAMAM-G1.5、乙二胺與甲醇的摩爾比為1:20:50，并且其中，在將所得的第五混合物溶于甲醇時(shí)，所述第五混合物和甲醇的體積比為1:2。

在上述方法中，其中，在步驟4)中，聚合物Acetal-PEO-b-P(α-N₃-CL)、PAMAM-G2.0與二甲基亞砜的摩爾比為1:5:100。

在上述方法中，其中，在步驟5)中，聚合物Acetal-PEO-b-PCL-G2.0、二甲基亞砜與超純水的用量比為5mg:1ml:15ml。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是：

1)在聚合物的合成過(guò)程中，主要涉及到開(kāi)環(huán)聚合反應(yīng)，Michael加成反應(yīng)和點(diǎn)擊反應(yīng)，以上幾種反應(yīng)機(jī)理明確，反應(yīng)條件成熟，操作簡(jiǎn)單，且應(yīng)用廣泛。其中點(diǎn)擊反應(yīng)作為一種重要的化學(xué)反應(yīng)，即在Cu(I)化合物催化疊氮化合物與炔基化合物反應(yīng)生成1,2,3-三唑五元環(huán)化合物，該方法具有產(chǎn)率高、副反應(yīng)少、反應(yīng)條件溫和、分離提純簡(jiǎn)單、環(huán)境污染小等特點(diǎn)，因此得到了廣泛的運(yùn)用。特別是在功能聚合物、生物大分子、表面修飾、生物和化學(xué)傳感器等方面取得了矚目的成就；

2)PAMAM作為一類樹(shù)枝狀大分子，具有較強(qiáng)的質(zhì)子化能力，因此具有很好的siRNA傳遞性能；不同代數(shù)的PAMAM分子，載siRNA的能力不同，因此可以實(shí)現(xiàn)siRNA傳遞系統(tǒng)的優(yōu)化；并且合成過(guò)程簡(jiǎn)單，易于分離提純，產(chǎn)率高；

3)最終合成的聚合物膠束，粒徑較小，且表面帶有大量正電荷，作為siRNA載體性能優(yōu)越，具有良好的應(yīng)用前景。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明中所合成的各種聚合物的FT-IR圖。

圖2為本發(fā)明所合成的聚合物Acetal-PEO-b-PCL-G2.0的NMR圖。

圖3為本發(fā)明制備的聚合物膠束的粒徑分布圖。

圖4為本發(fā)明制備的膠束在測(cè)定CMC時(shí)的熒光分光光度圖。

圖5為本發(fā)明制備的膠束在測(cè)定CMC時(shí)所作的數(shù)據(jù)處理圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明，以更好地理解本發(fā)明。

基于點(diǎn)擊化學(xué)合成的側(cè)鏈帶PAMAM的聚合物膠束是側(cè)鏈帶有G2.0-PAMAM的聚合物乙縮醛-聚乙二醇-聚己內(nèi)酯-G2.0(Acetal-PEO-b-PCL-G2.0)，其中G2.0代表2代的聚酰胺-胺型樹(shù)枝狀大分子(G2.0-PAMAM)，該聚合物膠束的化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下所示：

該聚合物膠束的制備方法的步驟如下：

1)聚合物Acetal-PEO-P(α-Br-CL)的合成

稱取2g的乙縮醛-聚乙二醇(Acetal-PEO)、3mg的辛酸亞錫溶解于10mL甲苯中；再稱取0.64g的ε-己內(nèi)酯和0.37g的α-溴代-ε-己內(nèi)酯，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，加入到溶解有Acetal-PEO)和辛酸亞錫的甲苯中，于140℃反應(yīng)24h，將所得產(chǎn)物在200mL的冰乙醚里進(jìn)行沉淀，最終得到固體產(chǎn)物Acetal-PEO-P(α–Br-CL)，稱重為2.8g，產(chǎn)率為93.3％，其中，乙縮醛-聚乙二醇(Acetal-PEO)為引發(fā)劑，辛酸亞錫為催化劑，甲苯為溶劑。使用凝膠滲透色譜儀(Waters 1525，美國(guó)Waters公司)測(cè)定聚合物的分子量，Mn＝22391，PDI＝1.42。計(jì)算得出y＝4，z＝29。反應(yīng)式如下所示：

式中：x為125，Sn(Oct)₂為辛酸亞錫。

2)聚合物Acetal-PEO-b-P(α-N_3-CL)的合成

將1g的聚合物Acetal-PEO-P(α-Br-CL)與30mg的NaN₃溶于20mL的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，80℃攪拌反應(yīng)24h。所得產(chǎn)物在3500分子量的透析袋中經(jīng)透析純化，除去未反應(yīng)的NaN₃和殘留溶劑DMF。在冷凍干燥機(jī)里凍干，最終得到Acetal-PEO-b-P(α-N_3-CL)，稱重為0.93g，產(chǎn)率為92.9％。反應(yīng)式如下所示：

3)PAMAM-G2.0樹(shù)枝狀大分子的合成

①PAMAM-G1.0的合成

稱取1.1g的3-炔丙胺，將其溶于10mL的甲醇中，向溶液中滴加6.5mL丙烯酸甲酯，優(yōu)選地，丙烯酸甲酯是重蒸過(guò)的。在氬氣保護(hù)下，于30℃攪拌48～72h。旋干溶劑，將所得混合物過(guò)硅膠柱，在石油醚/乙酸乙酯(體積比為2/1)的展開(kāi)劑下，純化得到淡黃色液體PAMAM-G0.5，稱重為2.8g，產(chǎn)率為84.8％。稱取0.92g的PAMAM-G0.5，溶于5mL的甲醇中，向溶液中滴加5.0mL乙二胺。在氬氣保護(hù)下，于30℃攪拌48～72h。將溶劑旋干，所得混合物溶于2mL甲醇，在150mL的冰乙醚里沉淀，除去未反應(yīng)的乙二胺，得到淡黃色液體產(chǎn)物PAMAM-G1.0，稱重為1.23g，產(chǎn)率為92.3％。

②PAMAM-G2.0的合成

稱取1.13g的PAMAM-G1.0，將其溶于10mL的甲醇中，向溶液中滴加2.5mL的丙烯酸甲酯，優(yōu)選地，丙烯酸甲酯是重蒸過(guò)的。在氬氣保護(hù)下，于30℃攪拌48～72h。旋干溶劑，將所得混合物過(guò)硅膠柱，在乙酸乙酯/甲醇為(體積比為10/1)的展開(kāi)劑下純化，得到淡黃色液體PAMAM-G1.5，稱重為2.35g，產(chǎn)率為92.1％。稱取1.35g的PAMAM-G1.5，溶于5mL的甲醇中，向溶液中滴加2.8mL乙二胺。在氬氣保護(hù)下，于30℃攪拌48～72h。旋干溶劑，所得混合物按體積比1:1溶于甲醇，在冰乙醚里沉淀，除去未反應(yīng)的乙二胺，得到淡黃色液體產(chǎn)物PAMAM-G2.0，稱重為1.42g，產(chǎn)率為89.3％。反應(yīng)式如下所示：

4)利用點(diǎn)擊化學(xué)合成聚合物Acetal-PEO-b-PCL-G2.0

稱取0.1g的聚合物Acetal-PEO-b-P(α-N_3-CL)和16.3mg的PAMAM-G2.0，溶于10mL的DMSO中，用氬氣保護(hù)。稱取8.85mg的抗壞血酸鈉和5.5mg的五水硫酸銅，分別溶于1ml蒸餾水中，制成水溶液，作為反應(yīng)的催化劑。在氬氣保護(hù)下，將五水硫酸銅溶液和抗壞血酸溶液依次滴加到上述DMSO溶液中，在80℃下反應(yīng)24h。將所得混合物在分子量3500的透析袋中進(jìn)行透析，除去DMSO和未反應(yīng)的PAMAM-G2.0。經(jīng)凍干，最終得到黃褐色粉末Acetal-PEO-b-PCL-G2.0，稱重為103mg，產(chǎn)率為91.3％。反應(yīng)式如下所示：

圖1為本發(fā)明所合成的聚合物的FT-IR圖。圖中表明：聚合物側(cè)鏈的-Br先是被-N₃取代，接著發(fā)生點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)，-N₃完全反應(yīng)，最終生成Acetal-PEO-b-PCL-G2.0。

圖2為本發(fā)明所合成的聚合物Acetal-PEO-b-PCL-G2.0的NMR圖。圖中顯示為Acetal-PEO-b-PCL-G2.0的核磁共振氫譜，雖無(wú)明顯的G2-PAMAM的峰，但結(jié)合圖1的紅外譜圖，亦可證明結(jié)構(gòu)正確。

5)聚合物Acetal-PEO-b-PCL-G2.0膠束的制備：

稱取20mg聚合物Acetal-PEO-b-PCL-G2.0溶于4mL的DMSO中，溶脹24h。將上述溶液放于250mL的圓底燒瓶里，劇烈攪拌下，向其滴加60mL超純水，得到膠束粗產(chǎn)品。在分子量3500的透析袋中透析24h。取出透析液超濾10次(冷凍離心機(jī)5000r/min，每次進(jìn)行20min)，最終得到3～4mL膠束。取出0.5mL膠束凍干，所得粉末稱重為2mg，經(jīng)計(jì)算得出膠束溶液的濃度為4mg/mL。

聚合物Acetal-PEO-b-PCL-G2.0膠束的表征：

1)膠束的粒徑和Zeta電位的測(cè)定

首先，先量取0.5mL的濃度為4mg/mL的膠束溶液，溶于3.5mL的超純水中，配制成0.5mg/mL的溶液。使用Nano ZS激光納米粒度測(cè)定儀測(cè)定膠束的粒徑為208.3±15nm，Zeta電位為20.5±0.5mV。

圖3為本專利所制聚合物膠束的粒徑分布圖。圖中表明：聚合物膠束的粒徑為208.3±15nm，成膠束性質(zhì)良好。

2)膠束的臨近膠束濃度(CMC)的測(cè)定。

本發(fā)明采用芘(Pyrene)增溶法測(cè)定聚合物膠束的臨界膠束濃度。首先，準(zhǔn)確量取1mL的濃度為4mg/mL的膠束溶液，加去離子水配制成250μg/mL的膠束溶液16mL。然后，準(zhǔn)確稱量10.017mg的固體芘，加丙酮配制成1×10^-6mol/L的溶液10mL。將180μL芘的丙酮溶液溶于棕色玻璃瓶中，避光通風(fēng)，將丙酮揮干，使得瓶中含芘1.8×10^-6mol。配制不同濃度(μg/mL)梯度的膠束溶液各5mL，濃度分別為0.025、0.05、0.075、0.1、0.25、0.5、0.75、1、2.5、5、7.5、10、25、50、75、100、250μg/mL。分別向18個(gè)棕色瓶中加入以上濃度的膠束溶液3mL，避光的條件下，搖床內(nèi)37℃平衡24h。最后，使用熒光分光光度計(jì)測(cè)定發(fā)射波長(zhǎng)在393nm下300-360nm范圍內(nèi)的激發(fā)光譜(激發(fā)、發(fā)射狹縫均為5nm)。

圖4為本發(fā)明制備的膠束在測(cè)定CMC時(shí)的熒光分光光度圖。圖中表明：特征吸收峰發(fā)生偏移，證明膠束濃度較高時(shí)，芘被包進(jìn)膠束中。芘的表面環(huán)境發(fā)生改變導(dǎo)致峰的偏移。

圖5為本發(fā)明制備的膠束在測(cè)定CMC時(shí)所作的數(shù)據(jù)處理圖。取熒光強(qiáng)度I₃₃₈/I₃₃₅對(duì)LgC(膠束濃度)作圖，所得圖的拐點(diǎn)為臨界膠束濃度，最終計(jì)算出臨界膠束濃度(CMC)為33.8μg/mL。