本發(fā)明屬于多肽藥物制備領域，具體涉及一種卡貝縮宮素的制備方法。
背景技術：
卡貝縮宮素(Carbetocin)是一種合成的具有激動劑性質的長效催產素九肽類似物。硬膜外或腰麻下剖腹產術后可以立即單劑量靜脈給藥，以預防子宮張力不足和產后出血。
卡貝縮宮素的臨床和藥理特性與天然產生的催產素類似。像催產素一樣，卡貝縮宮素與子宮平滑肌的催產素受體結合，引起子宮的節(jié)律性收縮，在原有的收縮基礎上，增加其頻率和增加子宮張力。在非妊娠狀態(tài)下，子宮的催產素受體含量很低，在妊娠期間增加，分娩時達高峰。因此卡貝縮宮素對非妊娠的子宮沒有作用，但是對妊娠的子宮和剛生產的子宮具有有效的子宮收縮作用。
研究表明，當硬膜外或腰麻下剖腹產術后立即單劑量靜脈給予卡貝縮宮素100ug，在預防子宮張力不足和減少產后出血方面，卡貝縮宮素明顯優(yōu)于安慰劑。在產后的早期給予卡貝縮宮素也可以促進子宮的復舊。
卡貝縮宮素具有以下結構：
用氨基酸縮寫表示為：
卡貝縮宮素及其類似物的制備方法早期主要是液相合成工藝，操作復雜，不利于工業(yè)生產、應用價值不高；目前在國外卡貝縮宮素申報的專利合成方面的也不多，其中包括一家西班牙公司的ES2115543，是固液相結合的合成方法，主要方法是：然后用常規(guī)固相多肽合成，采用HOBt/DIC體系得到 4-chlorobutyl-Tyr(OMe)-Ile-Gln-Asn-Cys(Trt)-Pro-Leu-Gly-PAL-Nle-pMBHA,然后用TFA/1-Dodecanethiol/H2O＝8:1:1裂解2小時(注：1-Dodecanethiol十二硫醇)，得到線形肽4-chlorobutyl-Tyr(OMe)-Ile-Gln-Asn-Cys-Pro-Leu-Gly－NH2，線性肽用1：1的乙腈和水作溶劑，用1M NaOH調pH＝9,環(huán)化得到卡貝縮宮素。它所用的堿還包括LiOH，NaHCO3，DIEA，DMAP。
捷克專利CS：8605461，先用固相多肽合成方法合成肽樹脂再裂解得到Z-Ile-Gln-Asn-Cys(Bzl)-Pro-Leu-Gly-NH2,再氫化得到Ile-Gln-Asn-Cys-Pro-Leu-Gly-NH2再與4-Bromobutyric acid反應，得到Ile-Gln-Asn-Cys(C3H6COOH)-Pro-Leu-Gly-NH2再跟X-Tyr(OMe)-OH反應，脫保護，環(huán)化得到卡貝縮宮素。
在這些專利描述的方法中，都以液相方法進行環(huán)合，國內專利用液相環(huán)合的還有杭州和錦的專利(申請?zhí)枺?01010560715.4)，上海蘇豪逸明制藥的專利(申請?zhí)枺?01110001400.0)以及蘇州天馬的專利(申請?zhí)?01510001735.0)，這種方法需要反應原料在極稀溶液中反應，且副反應較多，在規(guī)?；a中需大量溶劑，隨即產生大量廢液。本發(fā)明利用固相假稀釋原理，開發(fā)了固相高效環(huán)合方法，反應時間縮短至2～3小時，反應廢液降為液相反應的1/10以下。并且能有效減少副反應，提高粗肽純度，進而提高收率。
國內專利中有多篇也使用固相方法環(huán)化，根據先成硫醚鍵還是先成酰胺鍵可分為兩類：第一類是先將溴代丁酸通過酰胺偶聯(lián)與肽鏈的酪氨酸氨基偶聯(lián)，再用堿(如DIPEA、NMM、LiCl、DMAP)作用下消除溴化氫形成硫醚鍵而關環(huán)。采用該方法的專利有深圳翰宇藥業(yè)的專利(申請?zhí)?00910106889.0)和杭州湃肽的專利(申請?zhí)?01410461695.3)；另一類是先將羧基保護的丁酸連接到半胱氨酸的巰基上，偶聯(lián)完所有殘基后脫除丁酸羧基保護基，再通過酰胺偶聯(lián)與肽鏈上的酪氨酸氨基偶聯(lián)環(huán)合，采用該方法的專利有深圳健元藥業(yè)的專利(申請?zhí)?01010544419.5)，成都圣諾科技的專利(申請?zhí)?01110151928.6)，無錫凱利的專利(申請?zhí)?01210255959.0)，成都天臺山藥業(yè)的專利(申請?zhí)?01410331088.5)。前一類采用溴代丁酸為原料，由于溴比較活潑，在偶聯(lián)中副反應比較多，致使雜質較多，收率不高；后一類方法由于要先保護羧基，增加了原料的成本和脫羧基保護引起的副反應，雜質情況并沒有比前一類方法改善，反而增加了成本和操作的復雜性
技術實現要素：
本發(fā)明的目的是提供了一種高收率、低成本、反應條件溫和、環(huán)境污染小、有利于實現產業(yè)化的卡貝縮宮素的固相合成工藝。
本發(fā)明一個方面涉及一種卡貝縮宮素的全固相制備方法，其包括如下步驟：
1)以固相合成樹脂為載體，通過連接受保護的氨基酸，脫除氨基保護基，再 連接受保護的氨基酸的方法依次連接氨基和側鏈經過保護的甘氨酸(Gly)、亮氨酸、脯氨酸(Pro)、半胱氨酸(Cys)、天冬酰胺(Asn)、谷氨酰胺(Gln)、異亮氨酸(Ile)、酪氨酸(Tyr)，得到末端氨基經過保護的線性八肽片段樹脂；
2)脫除末端氨基保護后，連接4-氯丁酸，得到全保護九肽片段樹脂；
3)脫除半胱氨酸巰基保護基，得到裸露巰基的九肽片段樹脂；
4)在DBU作用下，末端氯基團與半胱氨酸側鏈巰基偶聯(lián)成環(huán)，得到卡貝縮宮素肽樹脂；
5)裂解卡貝縮宮素肽樹脂，得到卡貝縮宮素。
進一步地，其中所述氨基經過保護的甘氨酸選自Fmoc-Gly-OH；所述氨基經過保護的亮氨酸選自Fmoc-Leu-OH；所述氨基和側鏈經過保護的脯氨酸選自Fmoc-Pro-OH；所述氨基和側鏈經過保護的半胱氨酸選自Fmoc-Cys(Mmt)-OH；所述氨基和側鏈經過保護的天冬酰胺選自Fmoc-Asn(Trt)-OH；所述氨基和側鏈經過保護的谷氨酰胺選自Fmoc-Gln(Trt)-OH；所述氨基和側鏈經過保護的異亮氨酸選自Fmoc-Ile-OH；所述氨基和側鏈經過保護的酪氨酸選自Fmoc-Tyr(Me)-OH。
進一步地，步驟1)中所述的固相合成方法是Fmoc固相多肽合成方法，選用的偶聯(lián)劑為DIPCDI+A或者DIPEA+A+B，其中A選自HOBt或HOAt，B選自PyBOP、PyAOP、HATU、HBTU、TBTU中的一種或多種；優(yōu)選地，偶聯(lián)劑中各成分的比例以摩爾比例計為DIPCDI:A＝1.1～1.5:1.0～1.4，DIPEA:A:B＝1.8～2.2:1.0～1.4:0.95～1.05；更優(yōu)選為DIPCDI:A＝1.3:1.2，DIPEA:A:B＝2.0:1.2:1.0
進一步地，其中，步驟1)中所述的固相載體為Rink Amide樹脂Rink Amide-AM樹脂或Rink Amide-MBHA樹脂，優(yōu)選地，樹脂替代度為0.2-0.9mmol/g，更優(yōu)選0.4～0.6mmol/g。
進一步地，步驟3)的脫除試劑為三氟乙酸和三異丙基硅烷的二氯甲烷溶液，三氟乙酸濃度為2～5％，三異丙基硅烷濃度為3～8％。
進一步地，步驟4)所述溶劑優(yōu)選為DMF或N-甲基吡咯烷酮，反應時間為2-3小時。
進一步地，步驟5)采用的裂解試劑為TFA：TIS：H2O＝85～95:2～8:2～8(V:V)。
進一步地，步驟5)獲得產物后，還包括純化步驟，優(yōu)選所述純化步驟選自重結晶、反相高壓液相方法。
具體實施方式
實施例1：卡貝縮宮素肽樹脂的制備
稱取替代度為0.557mmol/g的Rink Amide樹脂52.8g(29.4mmol)，加入到固相反應柱中，用DMF洗滌2次，用DMF溶脹樹脂30分鐘后，DBLK脫保護6min+8min，DMF洗滌6次。稱取26.2g(88.2mmol)Fmoc-Gly-OH和13.1g(97.0mmol)HOBT用DMF溶解，加入15.2mL(106mmol)DIPCDI活化3min后，將混合液加入到反應柱中，室溫反應2小時，以茚三酮檢測反應終點(如樹脂無色透明則終止反應；如樹脂顯色則延長反應1小時)。
反應結束，用DMF洗滌樹脂3次，加入DBLK脫保護5min+7min，DMF洗滌樹脂6次，茚三酮檢測樹脂有顏色。稱取31.2g(88.2mmol)Fmoc-Leu-OH和13.1g(97.0mmol)HOBT用DMF溶解，冰水浴下加入15.2mL(105.8mmol)DIPCDI活化3min后，將混合液加入到反應柱中，室溫反應2小時，以茚三酮檢測反應終點(如樹脂無色透明則終止反應；如樹脂顯色則延長反應1小時)。
反應結束，按以上同樣方法依次偶聯(lián)Fmoc-Pro-OH,Fmoc-Cys(Mmt)-OH,Fmoc-Asn(Trt)-OH,Fmoc-Gln(Trt)-OH,Fmoc-Ile-OH和Fmoc-Tyr(OMe)-OH。
反應結束，用DMF洗滌樹脂3次，加入DBLK脫保護5min+7min，DMF洗滌樹脂3次，DCM洗滌樹脂3次，茚三酮檢測樹脂有顏色。稱取36.0g(294mmol)4- 氯丁酸用DCM溶解，冰水浴下加入23.3ml(162mmol)DIPCDI和19.0g DIPEA(147mmol)活化3min后，將混合液加入到反應柱中，室溫反應2.5小時，以茚三酮檢測反應終點(如樹脂無色透明則終止反應；如樹脂顯色則延長反應0.5小時)。
脫除Mmt保護基：用DCM洗滌樹脂6次,將DCM：TFA：TIS＝90:3:7的脫保護液加入固相反應柱中，氮氣鼓氣反應10分鐘后，抽掉，再加入脫保護液氮氣反應10分鐘，抽掉，再重復兩次脫保護反應。
固相環(huán)化：脫Mmt保護反應結束后，用DCM洗滌3次，DMF洗滌3次。稱取22.4g(147mmol)DBU用適量DMF溶解加入固相反應柱中，室溫反應2小時后，以DTNB檢測反應終點(如樹脂無色透明則終止反應；如樹脂顯色則延長反應0.5小時，直至樹脂無色)。
反應結束，抽干反應液，DMF洗滌樹脂3次，抽干液體。甲醇收縮樹脂3次，肽樹脂真空干燥得到78.5g卡貝縮宮素肽樹脂，樹脂增重22.7g,理論增重22.0g，增重率103.2％。
實施例2：卡貝縮宮素精肽的制備
將實施例1得到的卡貝縮宮素肽樹脂78.5克加入到2000ml三口瓶中，氮氣保護。加入預先配制好的TFA：TIS：H2O＝90:5:5(V:V)785ml，室溫反應2小時，過濾樹脂，收集濾液。用少量TFA洗滌樹脂，合并濾液。將濾液緩慢加入7850ml冰乙醚\中沉淀、離心，乙醚洗滌2次，減壓干燥得到粗肽28.7克，HPLC純度87.23％。經過高壓液相制備純化，凍干得到卡貝縮宮素精肽19.7g，純度99.42％，最大單雜0.15％。理論產量29.04g，總收率67.8％。
實施例3：采用溴丁酸為原料的對比例
按照實施例1的方法，將4-氯丁酸改為4-溴丁酸進行固相偶聯(lián)后，得到BrCH2CH2CH2CO-Tyr(Me)-Ile-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Mmt)-Pro-Leu-Gly-Rink Amide樹脂，然后脫除Mmt保護基。固相環(huán)化步驟采用DIPEA，室溫環(huán)化3小時，以DTNB檢測反應終點(如樹脂無色透明則終止反應；如樹脂顯色則延長反應0.5小時，直至樹脂無色)。反應結束，抽干反應液，DMF洗滌樹脂3次，抽干液體。甲醇收縮樹脂3次，肽樹脂真空干燥。采用實施例3的方法裂解得到粗肽，粗肽純度60.4％，明顯低于實施例1。
實施例4：先偶聯(lián)硫醚的對比例
先采用固相偶聯(lián)制備Fmoc-Tyr(Me)-Ile-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Mmt)-Pro-Leu-Gly-Rink Amide樹脂，然后脫除Mmt保護基，脫除Mmt保護基后，稱取溴丁酸和DIPEA溶于DMF后加 入反應柱中。反應0.5h后以DTNB檢測反應終點(如樹脂無色透明則終止反應；如樹脂顯色則延長反應0.5小時，直至樹脂無色)。DMF洗滌樹脂3次后，加入DBLK脫保護5min+7min。DCM洗滌3次，1％TFA/DCM溶液洗滌3次，DMF洗滌3次，得到H-Tyr(Me)-Ile-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(CH2CH2CH2COOH)-Pro-Leu-Gly-Rink Amide樹脂。
環(huán)化：向上述樹脂中加入TBTU和DIPEA的DMF溶液，室溫反應2小時，以茚三酮檢測反應終點(如樹脂無色透明則終止反應；如樹脂顯色則延長反應1小時)。反應完畢，抽干反應液，DMF洗滌樹脂3次，抽干液體。甲醇收縮樹脂3次，肽樹脂真空干燥。采用實施例4的方法裂解得到粗肽，粗肽純度53.3％，
明顯低于實施例1。