本發(fā)明涉及一種環(huán)肽的制備方法，具體涉及卡貝縮宮素的固相合成方法。
背景技術(shù)：
卡貝縮宮素(Carbetocin)是一種合成的具有激動劑性質(zhì)的長效催產(chǎn)素九肽類似物。硬膜外或腰麻下剖腹產(chǎn)術(shù)后可以立即單劑量靜脈給藥，以預防子宮張力不足和產(chǎn)后出血。
卡貝縮宮素的臨床和藥理特性與天然產(chǎn)生的催產(chǎn)素類似。像催產(chǎn)素一樣，卡貝縮宮素與子宮平滑肌的催產(chǎn)素受體結(jié)合，引起子宮的節(jié)律性收縮，在原有的收縮基礎(chǔ)上，增加其頻率和增加子宮張力。在非妊娠狀態(tài)下，子宮的催產(chǎn)素受體含量很低，在妊娠期間增加，分娩時達高峰。因此卡貝縮宮素對非妊娠的子宮沒有作用，但是對妊娠的子宮和剛生產(chǎn)的子宮具有有效的子宮收縮作用。
研究表明，當硬膜外或腰麻下剖腹產(chǎn)術(shù)后立即單劑量靜脈給予卡貝縮宮素100ug，在預防子宮張力不足和減少產(chǎn)后出血方面，卡貝縮宮素明顯優(yōu)于安慰劑。在產(chǎn)后的早期給予卡貝縮宮素也可以促進子宮的復舊。
卡貝縮宮素具有以下結(jié)構(gòu)：
用氨基酸縮寫表示為：
卡貝縮宮素及其類似物的制備方法早期主要是液相合成工藝，操作復雜，不利于工業(yè)生產(chǎn)、應用價值不高；目前在國外卡貝縮宮素申報的專利合成方面的也不多，其中包括一家西班牙公司的ES2115543，是固液相結(jié)合的合成方法，主要方法是：用常規(guī)固相多肽合成，采用HOBt/DIC體系得到 4-chlorobutyl-Tyr(OMe)-Ile-Gln-Asn-Cys(Trt)-Pro-Leu-Gly-PAL-Nle-pMBHA,然后用TFA/1-Dodecanethiol/H2O＝8:1:1裂解2小時(注：1-Dodecanethiol十二硫醇)，得到線形肽4-chlorobutyl-Tyr(OMe)-Ile-Gln-Asn-Cys-Pro-Leu-Gly－NH2，線性肽用1：1的乙腈和水作溶劑，用1M NaOH調(diào)pH＝9，環(huán)化得到卡貝縮宮素。其所用的堿還包括LiOH，NaHCO3，DIEA，DMAP。
捷克專利CS：8605461，先用固相多肽合成方法合成肽樹脂再裂解得到Z-Ile-Gln-Asn-Cys(Bzl)-Pro-Leu-Gly-NH2，再氫化得到Ile-Gln-Asn-Cys-Pro-Leu-Gly-NH2再跟4-Bromobutyric acid反應，得到Ile-Gln-Asn-Cys(C3H6COOH)-Pro-Leu-Gly-NH2再跟X-Tyr(OMe)-OH反應，脫保護，環(huán)化得到卡貝縮宮素。
在這些專利描述的方法中，都以液相方法進行環(huán)合，國內(nèi)專利用液相環(huán)合的還有杭州和錦的專利(申請?zhí)枺?01010560715.4)，上海蘇豪逸明制藥的專利(申請?zhí)枺?01110001400.0)以及蘇州天馬的專利(申請?zhí)?01510001735.0)，這種方法需要反應原料在極稀溶液中反應，且副反應較多，在規(guī)?；a(chǎn)中需大量溶劑，隨即產(chǎn)生大量廢液。本發(fā)明利用固相假稀釋原理，開發(fā)了固相高效環(huán)合方法，反應時間縮短至2～3小時，反應廢液降為液相反應的1/10以下。并且能有效減少副反應，提高粗肽純度，進而提高收率。
國內(nèi)專利中有多篇也使用固相方法環(huán)化，根據(jù)先成硫醚鍵還是先成酰胺鍵可分為兩類：第一類是先將溴代丁酸通過酰胺偶聯(lián)與肽鏈的酪氨酸氨基偶聯(lián)，再用堿(如DIPEA、NMM、LiCl、DMAP)作用下消除溴化氫形成硫醚鍵而關(guān)環(huán)。采用該方法的專利有深圳翰宇藥業(yè)的專利(申請?zhí)?00910106889.0)和杭州湃肽的專利(申請?zhí)?01410461695.3)；另一類是先將羧基保護的丁酸連接到半胱氨酸的巰基上，偶聯(lián)完所有殘基后脫除丁酸羧基保護基，再通過酰胺偶聯(lián)與肽鏈上的酪氨酸氨基偶聯(lián)環(huán)合，采用該方法的專利有深圳健元藥業(yè)的專利(申請?zhí)?01010544419.5)，成都圣諾科技的專利(申請?zhí)?01110151928.6)，無錫凱利的專利(申請?zhí)?01210255959.0)，成都天臺山藥業(yè)的專利(申請?zhí)?01410331088.5)。
采用片段偶聯(lián)的專利國內(nèi)也有兩篇。杭州諾泰的專利(申請?zhí)?01310412014.X)，單獨將碳端的谷氨酰胺作為一個片段，其余8個殘基作為一個片段，環(huán)化采用液相方法進行。海南雙成的專利(申請?zhí)?01410076731.4)采用將碳端的Pro-Leu-Gly作為一個片段，其余6個殘基作為一個片段，采用溴丁酸為丁酸殘基原料，固相環(huán)化的堿采用DIPEA、TEA或LiOH。
以液相方法進行環(huán)合的方法需要反應原料在極稀溶液中反應，且副反應較多，在規(guī)?；a(chǎn)中需大量溶劑，隨即產(chǎn)生大量廢液。本發(fā)明利用固相假稀釋原理，開發(fā)了固相高效環(huán)合方法，反應時間縮短至2～3小時，反應廢液降為液相反應的1/10以下。并且能有效減少副反應，提高粗肽純度，進而提高收率。
采用片段合成，可以解決按次序逐個偶聯(lián)造成的粗產(chǎn)物純度不高。片段法可 以選擇分段的位點有三處，為Cys-Pro-Leu-Gly之間的三個位點。選擇Cys-Pro之間(如201410076731.4)，則Cys為片段的起始連接氨基酸，由于Fmoc-Cys(Mmt)-OH在與Wang樹脂偶聯(lián)時容易出現(xiàn)消旋，使Cys對映體雜質(zhì)明顯增大(見對比例1)，而Cys對映體雜質(zhì)對純化影響很大，會大幅降低精肽收率。選擇Leu-Gly之間的位點(如201310412014.X)，則單獨一個甘氨酸作為片段，會造成偶聯(lián)對接時，反應位阻較大，產(chǎn)物中缺甘氨酸雜質(zhì)升高，給純化帶來不便。因此本申請選擇Pro-Leu之間的位點。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明一個方面涉及1、一種卡貝縮宮素的固相片段制備方法，其包括以下步驟：
1)以固相合成樹脂為載體，通過連接受保護的氨基酸，脫除氨基保護基，再連接受保護的氨基酸的方法依次連接氨基和側(cè)鏈經(jīng)過保護的脯氨酸(Pro)、半胱氨酸(Cys)、天冬酰胺(Asn)、谷氨酰胺(Gln)、異亮氨酸(Ile)、酪氨酸(Tyr)，得到末端氨基經(jīng)過保護的線性六肽片段樹脂；
2)脫除末端氨基保護后，連接4-氯丁酸，得到全保護七肽片段樹脂；
3)脫除半胱氨酸巰基保護基，得到裸露巰基的七肽片段樹脂；
4)在堿性條件下，在縮合劑作用下，末端氯基團與半胱氨酸側(cè)鏈巰基偶聯(lián)成環(huán)，得到環(huán)七肽片段樹脂；
5)裂解環(huán)七肽片段樹脂，得到環(huán)七肽片段；
6)以固相合成樹脂為載體，通過連接受保護的氨基酸，脫除氨基保護基，再連接受保護的氨基酸的方法依次連接氨基經(jīng)過保護的甘氨酸(Gly)和亮氨酸(Leu)，得到二肽樹脂；
7)將步驟5)所得環(huán)七肽片段連接到二肽樹脂上，得到卡貝縮宮素肽樹脂；
8)裂解卡貝縮宮素肽樹脂，得到卡貝縮宮素。
進一步地，其中所述氨基和側(cè)鏈經(jīng)過保護的脯氨酸選自Fmoc-Pro-OH；所述氨基和側(cè)鏈經(jīng)過保護的半胱氨酸選自Fmoc-Cys(Mmt)-OH；所述氨基和側(cè)鏈經(jīng)過保護的天冬酰胺選自Fmoc-Asn(Trt)-OH；所述氨基和側(cè)鏈經(jīng)過保護的谷氨酰胺選自Fmoc-Gln(Trt)-OH；所述氨基和側(cè)鏈經(jīng)過保護的異亮氨酸選自Fmoc-Ile-OH；所述氨基和側(cè)鏈經(jīng)過保護的酪氨酸選自Fmoc-Tyr(Me)-OH；所述氨基經(jīng)過保護的甘氨酸選自Fmoc-Gly-OH；所述氨基經(jīng)過保護的亮氨酸選自Fmoc-Leu-OH。
進一步地，步驟1)和/或步驟7)中所述的固相合成方法是Fmoc固相多肽合成方法，選用的偶聯(lián)劑為DIPCDI+A或者DIPEA+A+B，其中A選自HOBt或HOAt，B選自PyBOP、PyAOP、HATU、HBTU、TBTU中的一種或多種；優(yōu)選地，偶聯(lián)劑中各成分的比例以摩爾比例計為DIPCDI:A＝1.1～1.5:1.0～1.4，DIPEA:A:B＝1.8～2.2:1.0～1.4:0.95～1.05；更優(yōu)選為DIPCDI:A＝1.3:1.2， DIPEA:A:B＝2.0:1.2:1.0。
進一步地，步驟3)的脫除試劑為三氟乙酸和三異丙基硅烷的二氯甲烷溶液，三氟乙酸濃度為2～5％，三異丙基硅烷濃度為3～8％。
進一步地，步驟4)所用的堿為DBU或LiCl/DIPEA組合，優(yōu)選DBU；步驟4)所述溶劑優(yōu)選為DMF或N-甲基吡咯烷酮，反應終點采用Ellman反應檢測。
進一步地，步驟1)所用的樹脂為wang樹脂、2-CTC樹脂，步驟6)所用的樹脂為Rink Amide樹脂、Rink Amide-AM樹脂，Rink Amide-MBHA樹脂，優(yōu)選地，步驟1)為wang樹脂，步驟6)為Rink Amide樹脂。，步驟6)所用的樹脂為Rink Amide樹脂，優(yōu)選地，步驟6)中所述樹脂替代度為0.2-0.9mmol/g，更優(yōu)選0.4～0.6mmol/g。
進一步地，步驟5)和/或步驟8)獲得產(chǎn)物，還包括純化步驟，優(yōu)選所述純化步驟選自重結(jié)晶、反相高壓液相方法；更優(yōu)選地，重結(jié)晶方法為將粗肽溶于THF，然后向其中加入MTBE。
進一步地，步驟5)采用的裂解試劑為TFA：TIS：H2O＝85～95:2～8:2～8(V:V)。
本發(fā)明的反應流程如下所示：
具體實施方式
實施例1：制備Fmoc-Pro-Wang樹脂
稱取替代度為1.166mmol/L的Wang樹脂11.949g(13.9mmol)，DMF洗滌2次，用DMF溶脹樹脂30分鐘。稱取DMAP 0.183g(1.39mmol)加入反應柱中。稱取29.69g(83.4mmol)Fmoc-Pro-OH，加適量DCM溶解，冰水浴冷卻下加入8.7ml(55.6mmol)DIPCDI,活化3分鐘后將此溶液加入反應柱中，氮氣鼓泡反應3h。抽除反應液，DMF洗滌3次，加23ml吡啶和28ml乙酐進行封閉反應過夜。抽除反應液，DMF洗滌3次，甲醇收縮樹脂3次，抽干樹脂，得到Fmoc-Pro-Wang樹脂22.51g,檢測替代度為0.627mmol/g。
實施例2：七肽環(huán)肽的制備
稱取實施例1所得的Fmoc-Pro-Wang樹脂15.959g(10mmol)，加入到固相反應柱中，用DMF洗滌2次，用DMF溶脹樹脂30分鐘后，DBLK脫保護6min+8min，DMF洗滌6次。稱取18.47g(30mmol)Fmoc-Cys(Mmt)-OH和4.46g(33mmol)HOBT用DMF/DCM(V:V＝1:1)溶解，冰水浴下加入5.2mL(36mmol)DIPCDI活化3min后，將混合液加入到反應柱中，室溫反應2小時，以茚三酮檢測反應終點(如樹脂無色透明則終止反應；如樹脂顯色則延長反應1小時)。
反應結(jié)束，用DMF洗滌樹脂3次，加入DBLK脫保護5min+7min，DMF洗滌樹脂6次，茚三酮檢測樹脂有顏色。稱取17.90g(30mmol)Fmoc-Asn(Trt)-OH和4.46g(33mmol)HOBT用DMF/DCM(V:V＝1:1)溶解，冰水浴下加入5.2mL(36mmol)DIPCDI活化3min后，將混合液加入到反應柱中，室溫反應2小時，以茚三酮檢測反應終點(如樹脂無色透明則終止反應；如樹脂顯色則延長反應1小時)。
按同樣方法依次偶聯(lián)Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Tyr(Me)-OH.
反應結(jié)束，用DMF洗滌樹脂3次，加入DBLK脫保護5min+7min，DMF洗滌樹脂3次，DCM洗滌樹脂3次，茚三酮檢測樹脂有顏色。稱取12.26g(100mmol)4-氯丁酸用DCM溶解，冰水浴下加入7.2ml(50mmol)DIPCDI活化3min后，將混合液加入到反應柱中，室溫反應2.5小時，以茚三酮檢測反應終點(如樹脂無色透明則終止反應；如樹脂顯色則延長反應0.5小時)。所得即為全保護七肽樹脂。
脫除Mmt保護基：用DCM洗滌樹脂6次,將DCM：TFA：TIS＝93:2:5的脫保護液加入固相反應柱中，氮氣鼓氣反應10分鐘后，抽掉，再加入脫保護液氮氣反應10分鐘，抽掉，再重復兩次脫保護反應。
固相環(huán)化：脫Mmt保護反應結(jié)束后，用DCM洗滌3次，DMF洗滌3次。稱取22.4g(147mmol)DBU用適量DMF溶解加入固相反應柱中，室溫反應2小時后，以DTNB檢測反應終點(如樹脂無色透明則終止反應；如樹脂顯色則延長反應0.5小時，直至樹脂無色)。
反應結(jié)束，抽干反應液，DMF洗滌樹脂3次，抽干液體。甲醇收縮樹脂3次， 肽樹脂真空干燥得到七肽環(huán)肽樹脂25.12g。
將七肽環(huán)肽樹脂加入到500ml三口瓶中，氮氣保護。加入預先配制好的TFA：TIS：H2O＝90:5:5(V:V)250ml，室溫反應2小時，過濾樹脂，收集濾液。用少量TFA洗滌樹脂，合并濾液。將濾液緩慢加入2500ml冰乙醚中沉淀、離心，乙醚洗滌2次，減壓干燥得到粗肽8.0克，HPLC純度88.3％。
將所得8.0g七肽環(huán)肽粗肽用40mlTHF攪拌溶解，邊攪拌邊滴加240mlMTBE，冰水浴攪拌1小時后，過濾，濾餅真空干燥，得到七肽環(huán)肽為白色固體7.3g,HPLC純度98.1％。合成收率89.3％。
實施例3：卡貝縮宮素肽樹脂的制備
稱取替代度為0.557mmol/g的Rink Amide樹脂5.40g(3.0mmol)，加入到固相反應柱中，用DMF洗滌2次，用DMF溶脹樹脂30分鐘后，DBLK脫保護6min+8min，DMF洗滌6次。稱取2.68g(9mmol)Fmoc-Gly-OH和1.34g(9.9mmol)HOBT用DMF溶解，加入1.55mL(10.8mmol)DIPCDI活化3min后，將混合液加入到反應柱中，室溫反應2小時，以茚三酮檢測反應終點(如樹脂無色透明則終止反應；如樹脂顯色則延長反應1小時)。
反應結(jié)束，用DMF洗滌樹脂3次，加入DBLK脫保護5min+7min，DMF洗滌樹脂6次，茚三酮檢測樹脂有顏色。稱取3.18g(9mmol)Fmoc-Leu-OH和1.34g(9.9mmol)HOBT用DMF/DCM(V:V＝1:1)溶解，冰水浴下加入1.55mL(10.8mmol)DIPCDI活化3min后，將混合液加入到反應柱中，室溫反應2小時，以茚三酮檢測反應終點(如樹脂無色透明則終止反應；如樹脂顯色則延長反應1小時)。
反應結(jié)束，用DMF洗滌樹脂3次，加入DBLK脫保護5min+7min，DMF洗滌樹脂6次，茚三酮檢測樹脂有顏色。稱取7.3g(8.9mmol)七肽環(huán)肽和1.34g(9.9mmol)HOAT用DMF/DCM(V:V＝1:1)溶解，冰水浴下加入2.86g(8.9mmol)TBTU和3.1ml(18mmol)DIPEA活化3min后，將混合液加入到反應柱中，室溫反應2小時，以茚三酮檢測反應終點(如樹脂無色透明則終止反應；如樹脂顯色則延長反應1小時)。
反應結(jié)束，抽干反應液，DMF洗滌樹脂3次，抽干液體。甲醇收縮樹脂3次，肽樹脂真空干燥得到g卡貝縮宮素肽樹脂7.72，樹脂增重2.32g,理論增重2.30g，增重率101％。
實施例4：卡貝縮宮素精肽的制備
將實施例3得到的卡貝縮宮素肽樹脂7.72克加入到125ml三口瓶中，氮氣保護。加入預先配制好的TFA：TIS：H2O＝90:5:5(V:V)78ml，室溫反應2小時，過濾樹脂，收集濾液。用少量TFA洗滌樹脂，合并濾液。將濾液緩慢加入780ml冰 乙醚\中沉淀、離心，乙醚洗滌2次，減壓干燥得到粗肽2.83克，HPLC純度96.23％。經(jīng)過高壓液相制備純化，凍干得到卡貝縮宮素精肽2.53g，純度99.12％，最大單雜0.15％。理論產(chǎn)量2.96g，總收率85.5％。
對比例：制備6環(huán)肽
投料12.49g Wang樹脂，按照實施例1的方法制備Fmoc-Cys(Mmt)-Wang樹脂，得樹脂29.4g，替代度為0.26mmol/g。按照實施例2的方法依次偶聯(lián)Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Tyr(Me)-OH和4-氯丁酸，脫除Mmt保護基，DBU固相環(huán)化，裂解后未經(jīng)重結(jié)晶檢測，粗肽純度64％，消旋雜質(zhì)14％。與實施例2中的片段粗肽純度88.3％有明顯差異。