一種合成卡貝縮宮素的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種合成卡貝縮宮素的技術(shù)，解決了現(xiàn)有技術(shù)存在的成本高，純度低，雜質(zhì)多的問題。本發(fā)明的具體步驟為：首先，在wang樹脂上依次偶聯(lián)7個氨基酸，偶聯(lián)氨基酸順序為：Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Tyr(Me)-OH；然后，去保護基Fmoc后，連接4-氯丁酸，裂解得到?；目ㄘ惪s宮素7肽線性肽，在堿性條件下液環(huán)得到卡貝縮宮素7肽環(huán)肽粗肽，粗肽經(jīng)純化凍干后得到卡貝縮宮素7肽環(huán)肽精肽；最后，純化凍干后的卡貝縮宮素7肽環(huán)肽片段和H-Gly-NH2.HCl偶聯(lián)，得到卡貝縮宮素。本發(fā)明提供了一種成本低、收率較高，適合規(guī)?；a(chǎn)的卡貝縮宮素的合成工藝。
【專利說明】一種合成卡貝縮宮素的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種多肽類藥物的合成方法，是一種合成的具有激動劑性質(zhì)的長效催產(chǎn)素卡貝縮宮素的合成方法。
【背景技術(shù)】
[0002]卡貝縮宮素，英名為=Carbetocin,為一種環(huán)狀多肽，是一種合成的具有激動劑性質(zhì)的長效催產(chǎn)素九肽類似物。硬膜外或腰麻下剖腹產(chǎn)術(shù)后可以立即單劑量靜脈給藥，以預(yù)防子宮張力不足和產(chǎn)后出血?？ㄘ惪s宮素的臨床和藥理特性與天然產(chǎn)生的催產(chǎn)素類似。像催產(chǎn)素一樣，卡貝縮宮素與子宮平滑肌的催產(chǎn)素受體結(jié)合，引起子宮的節(jié)律性收縮，在原有的收縮基礎(chǔ)上，增加其頻率和增加子宮張力。在非妊娠狀態(tài)下，子宮的催產(chǎn)素受體含量很低，在妊娠期間增加，分娩時達高峰。因此卡貝縮宮素對非妊娠的子宮沒有作用，但是對妊娠的子宮和剛生產(chǎn)的子宮具有有效的子宮收縮作用。
[0003]捷克專利CS255616率先使用固相多肽合成方法合成卡貝縮宮素，具體步驟為:(I)合成 Z-1le-Gln-Asn-Cys(Bzl)-Pro-Leu-Gly-O-樹脂，(2)裂解得到 Z-1le-Gln-Asn-Cys (Bzl) -Pro-Leu-Gly-NH2, (3)氫化去保護得到 Ile-Gln-Asn-Cys-Pro-Leu-Gly-NH2, (4)Ile-Gln-Asn-Cys-Pro-Leu-Gly-NH2 與 4-溴丁酸反應(yīng)，得到 Ile-Gln-Asn-Cys(C3H6COOH)-Pro-Leu-Gly-NH2, (5) Ile-Gln-Asn-Cys (C3H6COOH) -Pro-Leu-Gly-NH2 與 X-Tyr (Me) -OH 反應(yīng)，脫保護，環(huán)化得到卡貝縮宮素。該方法使用氫化去保護法，工業(yè)化生產(chǎn)設(shè)備操作安全隱患較大，同時該工藝需要多步液相合成，都需要對產(chǎn)物分離純化或沉淀以便除去未反應(yīng)的原料和副產(chǎn)物，這個 過程相當(dāng)費時、繁瑣，操作帶來的損失非常大?？傊摲椒ú焕诠I(yè)生產(chǎn)、應(yīng)用價值不高。
[0004]西班牙專利ES2115543公開了一種卡貝縮宮素的制備方法，具體步驟為:(1)合成主肽鏈結(jié)構(gòu)，N末端氨基與4-氯丁酸連接，(2)半胱氨酸巰基脫保護基團，同時斷開多肽鏈與樹脂的連接，(3)堿性條件下通過巰基的親核進攻反應(yīng)形成成硫醚鍵進行分子內(nèi)的環(huán)化。該工藝為液相環(huán)化合成工藝，操作復(fù)雜，步驟相當(dāng)費時，不利于工業(yè)生產(chǎn)、應(yīng)用價值不高。
[0005]中國專利CN102477082 —種液相合成法合成卡貝縮宮素的方法，具體步驟為先分別合成中間體 1:4-Bromobutyryl-Tyr (me)-1le-OH、中間體 II:H-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-ome和中間體II1:H-Pro-Leu_Gly-NH2,接著中間體1、II和III在液相中縮合成未成環(huán)產(chǎn)品IV，最后IV在堿性條件下環(huán)化得到卡貝縮宮素。該方法為液相合成三個片段后再合成目的肽法，每次接肽以后都需要對產(chǎn)物分離純化或沉淀以便除去未反應(yīng)的原料和副產(chǎn)物，這個過程相當(dāng)費時、繁瑣，操作帶來的損失非常大，因此不利于工業(yè)生產(chǎn)、應(yīng)用價值不聞。
[0006]中國專利CN102260326、CN102796178、CN101555272都是通過固相合成法依次連接具有Fmoc保護基團的氨基酸，脫保護基，環(huán)化，得到卡貝縮宮素。該方法在合成過程中非常容易產(chǎn)生多甘和缺甘現(xiàn)象，且該方法多采用氨基樹脂，價格昂貴，不適用于工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)。[0007]中國專利CN102146122通過固相合成法依次連接具有Fmoc保護基團的氨基酸，脫去半胱氨基酸的側(cè)鏈保護基，接入溴丁酸，去末端氨基的Fmoc保護，環(huán)化，得到卡貝縮宮素。該方法合成中兩次去保護，費時、繁瑣，且固相環(huán)化收率不高。
[0008]現(xiàn)有卡貝縮宮素的固相合成過程中，由于合成步驟較多，純度和收率不高，原料價格昂貴，不適于工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)。
[0009]本發(fā)明人用現(xiàn)有的合成方法，制備卡貝縮宮素，發(fā)現(xiàn)合成步驟較多，原料價格昂貴，純度和收率不高，不適于工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)。為此，本發(fā)明人對卡貝縮宮素的合成方法進行了研究，從而得到了本發(fā)明的技術(shù)方案。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010]本發(fā)明的目的是提供一種卡貝縮宮素的固相合成方法。本發(fā)明需要解決的技術(shù)問題是:(I)選擇一種合適的樹脂等原料，解決氨基樹脂價格昂貴、不適用于工業(yè)化生產(chǎn)的問題，(2)選擇一種合適的工藝路線，解決卡貝縮宮素合成過程中容易出現(xiàn)多甘或缺甘等雜質(zhì)的現(xiàn)象，以得到純度和收率更高的產(chǎn)品(3)選擇一種成本低廉且便于工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)的卡貝縮宮素的固相合成方法。
[0011]本發(fā)明的合成 路線如圖1所示:如圖1所示，首先在wang樹脂上依次偶聯(lián)上圖1中所示的7個氨基酸，偶聯(lián)氨基酸順序為:Fmoc-Leu_0H、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Cys (Trt)-OH、Fmoc-Asn (Trt) -OH、Fmoc-Gln (Trt) -OH、Fmoc-1le_0H、Fmoc-Tyr (Me) -OH,去完保護基 Fmoc后，再在樹脂上連接上4-氯丁酸，然后裂解得到圖中的7肽線性肽，最后在堿性條件下液環(huán)得到7肽環(huán)肽片段，最后用純化后的7肽環(huán)肽片段和H-Gly-NH2偶聯(lián)，得到收率和純度都較高的卡貝縮宮素。
[0012]本發(fā)明中一些常用的縮寫具有以下含義；
Fmoc:荷甲氧羰基
Fmoc-AA:荷甲氧羰基保護的氨基酸
tBu:叔丁基
HOBt:1_羥基苯駢三唑
DIC:N，f - 二異丙基碳化二亞胺
Tyr(Me):酪氨酸側(cè)鏈用甲基保護
Ile:異亮氨酸
Gln:谷氨酰胺
Asn:天門冬酰胺
Cys:半胱氨酸
Pro:脯氨酸
Leu:亮氨酸
Gly:甘氨酸
Trt:三苯甲基
Me:甲基
DMF:N，N' - 二甲基甲酰胺 Piperidine:六氫吡唳TFA:三氟醋酸
TIS:三異丙基硅烷
MeOH:甲醇
DCM:二氯甲烷
DMAP:4_ 二甲氨基吡啶
Kniser test檢測試劑為:卻三酮
DCC:N, N1-二環(huán)己基碳二亞胺
為此本發(fā)明提供一種卡貝縮宮素的合成方法，其步驟如下:
步驟1，固相合成?；目ㄘ惪s宮素7肽線性肽樹脂；
步驟2，去保護基Fmoc后，連接4-氯丁酸，然后裂解得到?；目ㄘ惪s宮素7肽線性
肽；
步驟3，液環(huán)得到卡貝縮宮素7肽環(huán)肽粗肽，然后純化凍干后得到卡貝縮宮素7肽環(huán)肽精妝；
步驟4，純化凍干后的卡貝縮宮素7肽環(huán)肽片段和H-Gly-NH2.HCl偶聯(lián)，得到卡貝縮宮素。
[0013]其中，步驟I所述的固相合成方法，以低成本的wang樹脂為起始原料，依次偶聯(lián) 7 個氨基酸，偶聯(lián)氨基酸順序為:Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Cys (Trt) -OH>Fmoc-Asn (Trt) -OH、Fmoc-Gln (Trt) -OH、Fmoc-1 le_0H、Fmoc-Tyr (Me) -OH。
[0014]其中，步驟2所述去保護基Fmoc后，連接4-氯丁酸所用縮合試劑為:DIC，H0Bt，操作過程為:將4-氯丁酸和HOBt用溶劑DMF溶解，冰浴冷卻溫度為0-10°C，加入DIC，激活5分鐘后加入到反應(yīng)柱中與脫完保護的樹脂進行反應(yīng)，25-35°C下反應(yīng)2小時。裂解條件為:裂解液為VTFA:VTis=95:5，裂解溫度20-30°C，裂解時間2小時。
[0015]其中，步驟3所述的液環(huán)溶劑為VH2Q: Vacn=50:50,反應(yīng)濃度為lmg/mL，反應(yīng)溫度:20-25 °C，反應(yīng)液使用TEA調(diào)pH值至7_10。
[0016]其中，步驟4所述的卡貝縮宮素7肽環(huán)肽片段和H-Gly-NH2.HCl偶聯(lián)條件為:縮合試劑為:H0Bt、DCC，反應(yīng)溶劑為:DMF，反應(yīng)溫度:在O0C反應(yīng)2小時，然后在25°C反應(yīng)6小時。
[0017]本發(fā)明的方法是經(jīng)過篩選獲得的，篩選過程如下:
1、卡貝縮宮素7肽環(huán)肽片段=H-Gly-NH2HCl:H0Bt =DCC的摩爾比的選擇:
卡貝縮宮素7肽環(huán)肽片段=H-Gly-NH2 HCl:H0Bt =DCC的摩爾比為:1:1:1:1和1:1.2:1.2:1.1 ；
2、反應(yīng)溫度的選擇:
25°C 和 35°C 和 45°C
3、反應(yīng)時間的選擇:
反應(yīng)時間為:4小時、6小時和8小時。
[0018]為此提出了 6種實驗條件:
實驗條件1:0.61g (0.62mmol)卡貝縮宮素7肽環(huán)肽片段、82.2mg (0.74 mmol)H-Gly-NH2.HCl 和 100.6mg (0.74mmol) HOBt、108 μ I (0.74mmol)三乙胺加入 5ml DMF 中攪拌溶解，冷卻到0°C，將140.7mg(0.68mmol)DCC加入上述溶液中，在0°C反應(yīng)2小時，然后在25°C反應(yīng)6小時，過濾，油泵真空旋蒸除去DMF，經(jīng)反相HPLC純化、凍干后得到卡貝縮宮素精妝；
實驗條件2:0.61g (0.62mmol)卡貝縮宮素7肽環(huán)肽片段、68.5mg (0.62 mmol)H-Gly-NH2.HCl 和 83.8mg (0.62mmol) H0Bt、89.6 μ I (0.62mmol)三乙胺加入 5ml DMF 中攪拌溶解，冷卻到0°C，將127.9mg (0.62mmol) DCC加入上述溶液中，在0°C反應(yīng)2小時，然后在25°C反應(yīng)6小時，過濾，油泵真空旋蒸除去DMF，經(jīng)反相HPLC純化、凍干后得到卡貝縮宮素精妝；
實驗條件3:0.61g (0.62mmol)卡貝縮宮素7肽環(huán)肽片段、82.2mg (0.74 mmol)H-Gly-NH2.HCl 和 100.6mg (0.74mmol) HOBt、108 μ I (0.74mmol)三乙胺加入 5ml DMF 中攪拌溶解，冷卻到0°C，將140.7mg(0.68mmol)DCC加入上述溶液中，在0°C反應(yīng)2小時，然后在35°C反應(yīng)6小時，過濾，油泵真空旋蒸除去DMF，經(jīng)反相HPLC純化、凍干后得到卡貝縮宮素精妝；
實驗條件4:0.61g (0.62mmol)卡貝縮宮素7肽環(huán)肽片段、82.2mg (0.74 mmol)H-Gly-NH2.HCl 和 100.6mg (0.74mmol) HOBt、108 μ I (0.74mmol)三乙胺加入 5ml DMF 中攪拌溶解，冷卻到0°C，將140.7mg(0.68mmol)DCC加入上述溶液中，在0°C反應(yīng)2小時，然后在45°C反應(yīng)6小時，過濾，油泵真空旋蒸除去DMF，經(jīng)反相HPLC純化、凍干后得到卡貝縮宮素精妝；
實驗條件5:0.61g (0.62mmol)卡貝縮宮素7肽環(huán)肽片段、82.2mg (0.74 mmol)H-Gly-NH2.HCl 和 100.6mg (0.74mmol) HOBt、108 μ I (0.74mmol)三乙胺加入 5ml DMF 中攪拌溶解，冷卻到0°C，將140.7mg(0.68mmoll)DCC加入上述溶液中，在0°C反應(yīng)2小時，然后在25°C反應(yīng)4小時，過濾，油泵真空旋蒸除去DMF，經(jīng)反相HPLC純化、凍干后得到卡貝縮宮素精肽；
實驗條件6:0.61g (0.62mmol)卡貝縮宮素7肽環(huán)肽片段、82.2mg (0.74 mmol)H-Gly-NH2.HCl 和 100.6mg (0.74mmol) HOBt、108 μ I (0.74mmol)三乙胺加入 5ml DMF 中攪拌溶解，冷卻到0°C，將140.7mg(0.68mmol)DCC加入上述溶液中，在0°C反應(yīng)2小時，然后在25°C反應(yīng)8小時，過濾，油泵真空旋蒸除去DMF，經(jīng)反相HPLC純化、凍干后得到卡貝縮宮素精妝。
[0019]實驗結(jié)果如下:
【權(quán)利要求】
1.一種合成卡貝縮宮素的方法，所述方法步驟如下: 步驟1，固相合成?；目ㄘ惪s宮素7肽線性肽樹脂； 步驟2，去保護基Fmoc后，連接4-氯丁酸，然后裂解得到酰化的卡貝縮宮素7肽線性肽； 步驟3，液環(huán)得到卡貝縮宮素7肽環(huán)肽粗肽，然后純化凍干后得到卡貝縮宮素7肽環(huán)肽精妝； 步驟4，純化凍干后的卡貝縮宮素7肽環(huán)肽片段和H-Gly-NH2.HCl偶聯(lián)，得到卡貝縮宮素。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是: 其中，步驟I所述的固相合成方法，以低成本的wang樹脂為起始原料，依次偶聯(lián) 7 個氨基酸，偶聯(lián)氨基酸順序為:Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Cys (Trt) -OH、Fmoc-Asn (Trt) -OH、Fmoc-Gln (Trt) -OH、Fmoc-1le_OH、Fmoc-Tyr (Me) -OH ； 其中，步驟2所述去保護基Fmoc后，連接4-氯丁酸所用縮合試劑為:DIC，HOBt，操作過程為:將4-氯丁酸和HOBt用溶劑DMF溶解，冰浴冷卻溫度為0-10°C，加入DIC，激活5分鐘后加入到反應(yīng)柱中與脫完保護的樹脂進行反應(yīng)，25-35°C下反應(yīng)2小時，裂解條件為:裂解液為VTFA:VTis=95:5，裂解溫度20-30°C，裂解時間2小時； 其中，步驟3所述的液環(huán)溶劑為VH2(): Vacn=50:50,反應(yīng)濃度為lmg/mL，反應(yīng)溫度:20-25 0C，反應(yīng)液使用TEA調(diào)pH值至7_10 ； 其中，步驟4所述的卡貝縮宮素7肽環(huán)肽片段和H-Gly-NH2.HCl偶聯(lián)條件為:縮合試劑為:H0Bt、DCC,反應(yīng)溶劑為:DMF，反應(yīng)溫度:在O0C反應(yīng)2小時，然后在25°C反應(yīng)6小時。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是:固相合成時，起始樹脂選用Wang樹脂，降低了成本。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:先得到卡貝縮宮素7肽環(huán)肽片段，然后再將其與H-Gly-NH2.HCl偶聯(lián)，有效避免了多甘和缺甘等雜質(zhì)，得到高收率和高純度的卡貝縮宮素。
【文檔編號】C07K1/06GK103992390SQ201310412014
【公開日】2014年8月20日 申請日期:2013年9月10日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月10日
【發(fā)明者】程麗, 楊東暉, 路楊, 周亮 申請人:杭州諾泰制藥技術(shù)有限公司