1.一種豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)雙拷貝感染性克隆在間接ELISA檢測(cè)方法中的應(yīng)用，該P(yáng)CV2雙拷貝感染性克隆經(jīng)細(xì)胞轉(zhuǎn)染、傳代后再經(jīng)濃縮純化作為固相抗原載體用于間接酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)方法中的應(yīng)用，用于PCV2相關(guān)疾病的診斷和治療。該豬圓環(huán)病毒2型雙拷貝感染性克隆的拯救方法包括以下四個(gè)步驟：
步驟一：雙拷貝感染性克隆pEGFP-N1-BD的構(gòu)建：
(1)PCV2 DNA的提取
a、從臨床PMWS癥狀豬群中分離得到PCV2毒株，進(jìn)行基因比對(duì)和序列分析，取含PCV2-GD毒株的細(xì)胞培養(yǎng)物200μL，加入20μLProteinase K溶液，混勻；
b、加入200μL緩沖液GB，充分顛倒混勻，70℃放置10分鐘，待溶液變清亮簡(jiǎn)短離心以去除管蓋內(nèi)壁的水珠，加入200μL無水乙醇，充分震蕩混勻15秒，簡(jiǎn)短離心去除管壁蓋內(nèi)壁的水珠；
c、將上一步所得溶液加入到試劑盒配的吸附柱CB3中，12000rpm離心30秒，倒掉廢液，將吸附柱放回收集管中，向吸附柱CB3中加入500μL緩沖液GD(使用前加入適量無水乙醇)，12000rpm離心30秒，倒掉廢液，將吸附柱放回收集管中；
d、向吸附柱CB3中加入600μL緩沖液PW(使用前加入適量無水乙醇)，12000rpm離心30秒，倒掉廢液，將吸附柱放回收集管中，該步驟重復(fù)兩次，然后將吸附柱CB3放回收集管中，12000rpm離心2分鐘，倒掉廢液，將吸附柱CB3置于室溫放置數(shù)分鐘，徹底晾干吸附柱中殘余的漂洗液，將吸附柱CB3轉(zhuǎn)入干凈的離心管中，向吸附膜中間部位懸空滴加60μL洗脫液TE，室溫放置2-5分鐘，12000rpm離心2分鐘，收集病毒基因組DNA，-20℃保存?zhèn)溆茫?/p>
(2)設(shè)計(jì)引物和選擇酶切位點(diǎn)
第一對(duì)引物：GDF1：cg ctcgag gctggctgaacttttg，GDR1 cga ccgcgg aaatttctgacaaacg，上游引物GDF1下劃線部分是Xho I酶切位點(diǎn)，下游引物GDR1下劃線部分是Sac II酶切位點(diǎn)；
第二對(duì)引物：GDF2：cat ccgcgg gctggctgaacca，GDR2 ca ggatccaaatttctgacaaacgttacaggg，上游引物GDF2下劃線部分是Sac II酶切位點(diǎn)，下游引物GDR2下劃線部分是BamH I酶切位點(diǎn)；
(3)全基因擴(kuò)增
以上述DNA為模板，利用設(shè)計(jì)的2對(duì)PCR引物GDF1/GDR1，GDF2/GDR2分別擴(kuò)增兩個(gè)拷貝的PCV2全基因組片段(即片段B、D)；擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)變性4min，94℃變性1min，54℃退火1min30s，72℃延伸3min，30個(gè)循環(huán)，72℃延伸10min；PCR反應(yīng)體系如下：高保真酶Primer STAR 1μL，10×Buffer 5μL，dNTP Mix 8μL，PCV2 DNA 1μL，GDF1/GDF2 2.5μL，GDR1/GDR2 2.5μL，dd H2O 30μL，總共計(jì)50μL；
PCR結(jié)束后取5μL PCR產(chǎn)物在10g/L的瓊脂糖凝膠上電泳檢測(cè)；
(4)雙拷貝全基因感染性分子克隆的構(gòu)建
將純化后的B片段與pEGFP-N1質(zhì)粒用Xho I酶、Sac II酶進(jìn)行同步雙酶切，切膠回收后再將二者按一定比例相連，連接采用10μL體系：B片段4μL，雙酶切的載體pEGFP-N1 1μL，連接酶Ligation High(含Buffer)5μL，隨后轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂卡那抗性板，篩選并提取陽性重組質(zhì)粒pEGFP-N1-B，再用Sac II酶、BamH I酶將D片段和重組質(zhì)粒pEGFP-N1-B進(jìn)行同步雙酶切，切膠回收后再將二者高效連接酶Ligation High按一定比例相連：D片段4μL，雙酶切的載體pEGFP-N1-B 1μL，連接酶Ligation High(含Buffer)5μL，轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂卡那抗性板，篩選并提取質(zhì)粒pEGFP-N1-BD，經(jīng)菌液PCR、 雙酶切鑒定以及序列測(cè)定，最終成功構(gòu)建雙拷貝重組質(zhì)粒pEGFP-N1-BD；
(5)重組質(zhì)粒雙酶切鑒定
pEGFP-N1-BD的雙酶切體系如下：BamHI 2μL，XhoI 2μLBuffer(10×K)2μL，dd H2O 9μL，pEGFP-N1-BD 15μL，共計(jì)30μL；將上述組分充分混勻，置于37℃水浴鍋內(nèi)，酶切過夜，用1％瓊脂糖凝膠對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)；
(6)測(cè)序鑒定
將酶切鑒定后的質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序；
(7)陽性重組質(zhì)粒大量提取
將已構(gòu)建好的雙拷貝重組質(zhì)粒pEGFP-N1-BD提取后測(cè)定濃度和純度，于-20℃保存?zhèn)溆茫唧w提取步驟如下：
a、平衡柱子：向吸附柱CP6中加入2.5ml平衡液BL，8000rpm離心2分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中，取100ml過夜培養(yǎng)的已鑒定為陽性的菌液加入離心管，室溫8000rpm離心3分鐘收集細(xì)菌，盡量吸除上清，用干凈的吸水紙吸去管壁上的水滴；
b、向留有菌體沉淀的離心管中加入8ml溶液P1(已加入適量RNaseA)，漩渦震蕩以徹底懸浮細(xì)菌細(xì)胞沉淀，向離心管中加入8ml溶液P2，立即溫和地上下翻轉(zhuǎn)混勻，室溫放置5分鐘，向離心管中加入8ml溶液P4，立即溫和地上下翻轉(zhuǎn)混勻，待溶液出現(xiàn)白色分散絮狀沉淀后室溫放置10分鐘左右，8000rpm離心10分鐘，使白色沉淀離至管底，將全部溶液小心倒入過濾器CS1中，慢慢推動(dòng)推柄，濾液收集在干凈的50ml干凈的離心管中；
c、向?yàn)V液中加入0.3倍濾液體積的異丙醇，上下顛倒混勻后轉(zhuǎn)移到吸附柱CP6中，室溫8000rpm離心2分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CP6重新放回收集管中，向吸附柱中加入10ml漂洗液PW(已提前加入適量無水乙醇)， 8000rpm離心2分鐘，該步驟重復(fù)2次，向吸附柱中加入3ml無水乙醇，室溫8000rpm離心2分鐘，倒掉廢液；
d、將吸附柱重新放回收集管中，8000rpm離心5分鐘，除去吸附柱中的殘留漂洗液，吸附柱CP6置于一個(gè)干凈的50ml收集管中，向吸附膜的中間部位滴加2ml洗脫液TB，室溫放置5分鐘，然后室溫8000rpm離心2分鐘，將50ml離心管中的洗脫液全部轉(zhuǎn)移到一個(gè)干凈的1.5ml離心管中，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>
步驟二：PCV2感染性克隆在ST細(xì)胞上的轉(zhuǎn)染、傳代以及體外感染性鑒定
(1)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染ST細(xì)胞
復(fù)蘇并傳代培養(yǎng)ST細(xì)胞，選用進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的無PCV1污染的ST細(xì)胞用胰酶按常規(guī)方法消化，以1×106個(gè)細(xì)胞/mL接種6孔板，每孔2mL，37℃5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞鋪滿約90％時(shí)，通過脂質(zhì)體Lipofectamine 2000介導(dǎo)轉(zhuǎn)染無PCV1污染的ST細(xì)胞，具體轉(zhuǎn)染步驟如下：
每孔吸取150μL OPTI-MEM與10μL脂質(zhì)體Lipofectamine2000充分混勻后，再吸取150μLOPTI-MEM+3ug雙拷貝重組質(zhì)粒+3μL reagent plus；將上述兩種溶液混合，室溫下放置5min；與此同時(shí)，將6孔板中的細(xì)胞用無血清MEM輕輕洗滌兩遍后，每孔加入2ml無血清培養(yǎng)基，隨后將質(zhì)粒/脂質(zhì)體復(fù)合物逐滴加入孔中，搖動(dòng)培養(yǎng)板，輕輕混勻，在37℃、5％的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5小時(shí)，同時(shí)設(shè)平行轉(zhuǎn)染空載體pEGFP-N1作為陰性對(duì)照，6小時(shí)后，更換含10％血清的MEM，在37℃、5％的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，期間每隔12小時(shí)置于熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染是否成功，培養(yǎng)72小時(shí)后凍融收獲細(xì)胞培養(yǎng)物，按照普通病毒培養(yǎng)的方法對(duì)其進(jìn)行盲傳；
(2)在ST細(xì)胞上的傳代
構(gòu)建好的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染ST細(xì)胞72小時(shí)后，將病毒液反復(fù)凍融3次，離心 取上清，將正常ST細(xì)胞按1∶4比例傳代后，用T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶進(jìn)行培養(yǎng)，每瓶9ml細(xì)胞懸液，再吸取1ml轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)72h收獲的細(xì)胞培養(yǎng)物上清輕輕搖晃均勻，置于37℃、5％的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24h后棄掉細(xì)胞瓶中液體，用滅菌的PBS輕輕洗滌細(xì)胞表面2遍，換用2％胎牛血清的MEM營(yíng)養(yǎng)液10ml，繼續(xù)培養(yǎng)48h后病毒液反復(fù)凍融3次，離心取上清，將按此方法繼續(xù)盲傳；
(3)在ST細(xì)胞上的感染性鑒定
借助間接免疫熒光的方法對(duì)病毒在ST細(xì)胞上能否穩(wěn)定增殖進(jìn)行檢測(cè)，具體操作步驟如下：將收獲的病毒液按10％的比例同步接種于消化好的ST細(xì)胞懸液，再接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，100μL/孔，24h后棄掉板內(nèi)液體，37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)，甩棄板內(nèi)液體，用PBS洗滌三遍，倒扣拍干孔內(nèi)液體后再進(jìn)行下面步驟：
a、固定：每孔加入100μL無水乙醇，先在室溫放置15min，再4℃放置1h，棄掉孔內(nèi)無水乙醇，拍干；
b、孵育一抗：用抗體稀釋液將抗PCV2 Cap蛋白鼠源單抗PCV2-A按1∶1000的比例稀釋，充分混勻后每孔加入100μL，37℃孵育1h。棄掉一抗，PBS震蕩洗滌3次，每次5分鐘，拍干；
c、孵育二抗：用抗體稀釋液將FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG按1∶500的比例稀釋，充分混勻后每孔加入100μL，包裹上錫箔紙避光，37℃避光孵育1h。棄掉二抗，PBS震蕩洗滌3次，每次5分鐘，拍干；
d、染核：將DAPI(4′，6-二脒基-2-苯基吲哚)用滅菌水稀釋到1ug/μL，充分混勻后每孔加入100μL，室溫下作用5分鐘后棄之，PBS震蕩洗滌3次，每次5分鐘，拍干；
e、封片：每孔加入碳緩甘油100μL，倒置熒光顯微鏡下觀察。
步驟三：拯救毒株各代次盲傳病毒液PCR檢測(cè)
收獲每一代病毒液保存于-20℃冰箱，抽取部分代次病毒液提取DNA進(jìn)行PCR檢測(cè)。
步驟四：拯救毒株毒價(jià)的初步測(cè)定
抽取盲傳收獲的病毒液部分代次F5，F(xiàn)10，F(xiàn)15，F(xiàn)20，F(xiàn)25，F(xiàn)40，F(xiàn)60做間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)，計(jì)算陽性細(xì)胞孔數(shù)，用Reed-Muench法計(jì)算半數(shù)細(xì)胞培養(yǎng)感染量進(jìn)行檢測(cè)：
a、將長(zhǎng)成單層的ST細(xì)胞用0.25％的胰酶消化，分裝到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，用維持液將待測(cè)病毒液以10倍倍比稀釋后同步接種ST細(xì)胞，每個(gè)稀釋度接種8孔細(xì)胞，每孔100μL，并留兩列ST細(xì)胞做空白對(duì)照，37℃5％CO2中培養(yǎng)24h；
b、棄去96孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)的液體，用MEM細(xì)胞培養(yǎng)液輕輕洗滌細(xì)胞表面2次，加足維持液繼續(xù)培養(yǎng)48h，每孔加入100μL無水乙醇，先在室溫放置15min，再4℃放置1h，棄掉孔內(nèi)無水乙醇，拍干；
c、用抗體稀釋液將抗PCV2 Cap蛋白鼠源單抗PCV2-A按1∶1000的比例稀釋，充分混勻后每孔加入100μL，37℃孵育1h；棄掉一抗，PBS震蕩洗滌3次，每次5分鐘，拍干，用抗體稀釋液將FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG按1∶500的比例稀釋，充分混勻后每孔加入100μL，包裹上錫箔紙避光，37℃避光孵育1h；棄掉二抗，PBS震蕩洗滌3次，每次5分鐘，拍干；
d、將DAPI(4′，6-二脒基-2-苯基吲哚)用滅菌水稀釋到1ug/μL，充分混勻后每孔加入100μL，室溫下作用5分鐘后棄之，PBS震蕩洗滌3次，每次5分鐘，拍干；
e、每孔加入碳緩甘油100μL，倒置熒光顯微鏡下觀察，以出現(xiàn)綠色熒光者為陽性，表示病毒在此孔得到擴(kuò)增；記錄每列中出現(xiàn)綠色熒光的孔數(shù)，按Reed-Muench法計(jì)算病毒的半數(shù)感染量(TCID50)。