本發(fā)明屬于生物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種小麥抗旱基因(基因TaH2A.9)及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

干旱嚴(yán)重影響農(nóng)作物產(chǎn)量，特別是隨著工業(yè)的發(fā)展，干旱災(zāi)害愈來愈嚴(yán)重，而且土壤鹽漬化也加劇了干旱災(zāi)害，使得干旱變成了一個全球關(guān)注的社會問題。我國人口眾多，而干旱災(zāi)害更為嚴(yán)重，已經(jīng)成為制約我國經(jīng)濟和社會發(fā)展的重要因素。因此，除了加快科學(xué)灌溉系統(tǒng)建設(shè)、緩解土壤鹽漬化以外，培育抗旱作物新品種已成為當(dāng)前一個十分迫切的任務(wù)。

利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)改良植物將新的性狀轉(zhuǎn)入高生物量植物中，以此開發(fā)高效的轉(zhuǎn)基因植物新品種并用于在旱地種植，是一項具有廣闊應(yīng)用前景的技術(shù)。

目前，利用基因工程技術(shù)開展植物抗旱方面的研究已取得了較大的進(jìn)展，克隆了大量相關(guān)基因，并將這些基因轉(zhuǎn)入植物中，用于抗旱機制研究。一些實驗表明，將植物本身以及其它生物中與抗旱相關(guān)的基因轉(zhuǎn)入植物中，其轉(zhuǎn)錄和翻譯產(chǎn)物可以使轉(zhuǎn)基因植物的抗旱能力得到提高。

檢索表明已發(fā)現(xiàn)了一些能顯著提高植物抗旱能力的基因，但有關(guān)H2A基因在植物抗旱過程中的作用報道較少。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的是提供一種抗旱基因——小麥基因TaH2A.9及其應(yīng)用。

本發(fā)明的技術(shù)方案是：從小麥中分離得到基因TaH2A.9，然后將該基因轉(zhuǎn)化到擬南芥中，進(jìn)行轉(zhuǎn)基因功能驗證(擬南芥轉(zhuǎn)化篩選及旱脅迫表性分析)，以實現(xiàn)研究H2A基因的功能以及抗旱機理。

本發(fā)明所述的小麥抗旱基因，其特征在于：所述基因命名為小麥抗旱基因TaH2A.9，該基因cDNA的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

本發(fā)明還提供了一種含有上述小麥抗旱基因TaH2A.9的植物表達(dá)載體pSTART-TaH2A.9。

本發(fā)明所述小麥抗旱基因TaH2A.9以及含有所述小麥抗旱基因TaH2A.9的植物表達(dá)載體pSTART-TaH2A.9在培育抗旱植物中的應(yīng)用，其中，所述植物優(yōu)選是普通小麥或擬南芥。

本發(fā)明所述的小麥抗旱基因TaH2A.9以及含有所述小麥抗旱基因TaH2A.9的植物表達(dá)載體pSTART-TaH2A.9可廣泛用于培育抗旱農(nóng)作物品種。

將本發(fā)明所述小麥抗旱基因TaH2A.9導(dǎo)入植物細(xì)胞，植物即可相應(yīng)地獲得抗旱能力。為了便于對轉(zhuǎn)基因植物或細(xì)胞系進(jìn)行篩選，可以對含有所述基因TaH2A.9的植物表達(dá)載體(pSTATR-TaH2A.9)進(jìn)行加工，如可以加入選擇標(biāo)記(GUS等)或者具有抗性的抗生素標(biāo)記物(潮霉素，卡那霉素，慶大霉素等)等。

實際上，任何一種可以將外源基因?qū)胫参镏斜磉_(dá)的載體都可以應(yīng)用，本發(fā)明優(yōu)選的載體是pSTART。

本發(fā)明的有益效果是：利用現(xiàn)有的植物基因工程技術(shù)，本發(fā)明首次克隆得到了小麥抗旱基因TaH2A.9，并通過根瘤農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法將該基因轉(zhuǎn)入擬南芥，經(jīng)過比較分析證明，轉(zhuǎn)基因植株的抗旱能力明顯提高，證實本發(fā)明的基因具有廣泛的應(yīng)用前景。

附圖說明

圖1：TaH2A.9基因全長cDNA序列的擴增結(jié)果

其中：M為λDNA/(BamH I+Sac I)Marker，下同；-：陰性對照。

圖2：NaCl脅迫下小麥中TaH2A.9的RT-PCR分析

其中：Leaf表示葉；Root表示根；TaActin表示小麥Actin基因(內(nèi)參)；數(shù)字表示脅迫時間(小時)。

圖3：pSTART-TaH2A.9擬南芥表達(dá)載體構(gòu)建過程

其中：A為帶酶切位點的TaH2A.9片段擴增；B為Xba I和BamH I對pSTART-TaH2A.9載體進(jìn)行雙酶切條帶；C為轉(zhuǎn)化了pSTART-TaH2A.9大腸桿菌的菌體PCR驗證；D為轉(zhuǎn)化了pSTART-TaH2A.9農(nóng)桿菌的菌體PCR驗證。

圖4：擬南芥TaH2A.9轉(zhuǎn)基因植株的基因組PCR和RT-PCR檢測

其中：V為空載體轉(zhuǎn)基因株系；T1、T2為兩個獨立的轉(zhuǎn)基因株系；C為野生型擬南芥；AtActin為擬南芥Actin基因內(nèi)參；Genomic PCR為通過基因組PCR驗證TaH2A.9整合到擬南芥基因組；RT-PCR為通過RT-PCR驗證TaH2A.9在轉(zhuǎn)基因株系中正常表達(dá)。數(shù)據(jù)顯示，在轉(zhuǎn)基因株系中能夠擴增出TaH2A.9條帶，而在空載體轉(zhuǎn)基因株系及野生型中不能擴增出條帶，表明TaH2A.9整合到擬南芥基因組中并且正常表達(dá)。

圖5：干旱脅迫下轉(zhuǎn)基因植株的生長狀況

其中：WT為未轉(zhuǎn)化擬南芥植株；T1/T2為兩個獨立的轉(zhuǎn)基因株系；VC為空載體對照。數(shù)據(jù)表明，轉(zhuǎn)化TaH2A.9的轉(zhuǎn)基因擬南芥的抗旱能力明顯增加。

具體實施方式

實施例1、TaH2A.9的克隆和表達(dá)分析

1.1提取小麥Total RNA

1.將組織材料放入液氮預(yù)冷的研缽中，在液氮中充分研磨成粉末；

2.待液氮揮發(fā)干，立即轉(zhuǎn)移到2ml的離心管中，每100mg材料約加入1ml的Invitrogen公司的TRIzol提取液，融化后，用加樣槍反復(fù)吸吹，劇烈振蕩混勻樣品，使樣品充分裂解，室溫放置5分鐘；

3.加入0.2ml氯仿，劇烈振蕩混勻15秒，室溫放置10分鐘；

4. 4℃，12000rpm離心15分鐘；

5.用移液器小心吸出上層水相，加入新的1.5ml的離心管中，加入500μl的異丙醇(1:1體積)，充分混勻，-20℃,沉淀30min或過夜；

6. 4℃，12000rpm離心10min，小心棄去上清液；

7. RNA沉淀用1ml的75％乙醇洗滌；4℃，8000rpm離心10min收集沉淀；

8.重復(fù)用75％乙醇洗滌一次RNA沉淀；

9.去上清，RNA沉淀于無菌操作臺上晾干約10-15分鐘，RNA略顯透明，加入適當(dāng)體積(30-50μl)的RNase-free水充分溶解(可放于-80℃長期保存)；

10.紫外分光光度計及1％Agrose凝膠電泳檢測RNA濃度及質(zhì)量。

注：a)用紫外分光光度計檢測RNA的產(chǎn)量，在260nm處的吸光度，1OD＝40μg/ml。根據(jù)在260nm和280nm處的吸光值，檢測RNA的純度，純RNA的OD₂₆₀/OD₂₈₀比值應(yīng)接近2.0(比值最好在1.9～2.1之間)。

b)用1％Agrose凝膠電泳檢側(cè)RNA的質(zhì)量及大小。吸取1μl RNA加入3μl的RNase-free水，加1μl上樣緩沖液65℃變性5分鐘。電泳后用EB染色，另取3μl的1kb DNA Marker作為對照。

1.2cDNA反轉(zhuǎn)錄

反轉(zhuǎn)錄酶：M-MLV Reverse Transcriptase(Invitrogen)。

1. 12μl反應(yīng)體系

2. 65℃變性5min，迅速插入冰中，然后依次加入:

5×First-Strand Buffer 4μl

0.1M DTT 2μl

RNaseOUT(Invitrogen) 1μl

3.輕輕混勻，37℃反應(yīng)2min；

4.加入1μl M-MLV RT，混勻，37℃反應(yīng)50min；

5. 70℃溫育15min使M-MLV RT失活；

6.加入1μl RNase H(Invitrogen)，37℃反應(yīng)20min；

7.用超純水稀釋至合適濃度。作為PCR模板。

1.3開放閱讀框的克隆和序列測定

1.引物序列：根據(jù)測序結(jié)果，設(shè)計基因上下游引物，擴增基因的開放閱讀框。

2. PCR反應(yīng)體系(50μl)：

3. PCR反應(yīng)程序為：94℃預(yù)變性5min；94℃變性45sec，55℃復(fù)性45sec，72℃延伸1.5min，循環(huán)35次；72℃延伸7min。

4.擴增片段回收后與pMD-18T載體連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10B，測序由上海Invirtron公司完成。結(jié)果見圖1。

1.4基因表達(dá)分析(RT-PCR)

1. RNA的提取

山融3號和濟南177小麥種子正常萌發(fā)，Hangload培養(yǎng)液培養(yǎng)至株高約10cm時(約3周時間)開始施加鹽脅迫(200mM NaCl)，處理0、1、6、12、24小時取幼嫩的葉片和根系提取RNA。

2.反轉(zhuǎn)錄(RT)產(chǎn)生cDNA

反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生cDNA，方法同上。

3. PCR反應(yīng)及電泳

(1)以cDNA為模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)。

(2)PCR體系：

(3)PCR程序：

95℃5min；25～30cycles 95℃20s,57℃60s,72℃60s；72℃7min。

根據(jù)內(nèi)參Actin的擴增情況確定PCR的循環(huán)數(shù)，調(diào)整cDNA模板的加入量。

(4)PCR產(chǎn)物在1％瓊脂糖凝膠上電泳，EB染色。結(jié)果見圖2。

實施例2、植物表達(dá)載體的構(gòu)建

利用植物表達(dá)載體pSTART，選用XbaI和BamHⅠ分別對pSTART和含有目的基因的pMD18-T載體進(jìn)行雙酶切；回收載體大片段和目的基因小片段，用T₄DNA連接酶連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10B感受態(tài)細(xì)胞，鑒定重組子后即得到帶有目的基因的植物表達(dá)載體。

1.雙酶切，以pSTART空載體和pMD18-T為例

堿裂解法提取pSTART空載體和pMD18-T質(zhì)粒，各取10μg酶切，酶切體系如下：

于30℃恒溫水浴鍋酶切2小時以上。雙酶切后以1×TAE為電泳緩沖液，將酶切產(chǎn)物進(jìn)行0.8％瓊脂糖凝膠電泳。在紫外透射儀下用潔凈刀片切下pSTART中14kb的載體大片段和pMD18-T中大約0.45kb的目的基因條帶，回收該條帶。結(jié)果見圖3A。

2. pSTART質(zhì)粒酶切回收的載體大片段的脫磷。

3.經(jīng)酶切和脫磷的pSTART載體片段(約14kb)和pMD18-T雙酶切回收片段(約0.45kb)以摩爾比1:4的比例進(jìn)行16℃連接過夜。

4.利用熱激法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10B感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化菌在含50μg/ml Kan的LB固體平板上37℃培養(yǎng)16小時左右。

5.重組子的鑒定

(1)質(zhì)粒的PCR驗證

挑取單菌落分別接種于5ml含Kan的LB液體培養(yǎng)基中37℃振蕩培養(yǎng)過夜，堿變性法提取質(zhì)粒，用基因特異引物進(jìn)行PCR擴增。

PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性94℃3min；94℃30sec，55℃30sec，72℃1min，35個循環(huán)；72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物用1.0％瓊脂糖凝膠電泳鑒定。結(jié)果間圖3C。

(2)質(zhì)粒酶切鑒定

提質(zhì)粒進(jìn)行XbaI和BamHI雙酶切，酶切體系同上。0.8％瓊脂糖凝膠電泳，檢測是否含有預(yù)期分子量大小的片段，驗證載體的正確構(gòu)建。結(jié)果見圖3B。

實施例3、農(nóng)桿菌感受態(tài)的制備與轉(zhuǎn)化

3.1農(nóng)桿菌AGL1/EHA105感受態(tài)的制備

1.從YEP平板(含50μg/ml利福平)上挑取根癌農(nóng)桿菌單菌落，接種于YEP液體培養(yǎng)基(含50μg/ml利福平)中，200rpm/min，28℃培養(yǎng)過夜。

2.取2ml過夜培養(yǎng)液接種于50ml含相同抗生素的YEP液體培養(yǎng)基中在相同條件下培養(yǎng)至OD₆₀₀達(dá)0.5。

3.菌液冰浴30min，4℃，5000rpm離心10min，收集菌體。

4.將菌體重懸于冰浴的10ml 0.15mol/L的NaCl中，離心收集菌體。

5.再懸浮于1ml 20mmol/L冰預(yù)冷的CaCl₂溶液中，以200μl/管將菌液分裝在1.5ml Eppendorf管中，置液氮中速凍1min，-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

3.2凍融法轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌AGL1/EHA105

1.在室溫下融化農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞，加入1μg表達(dá)載體質(zhì)粒DNA，混勻后冰浴30min。

2.置液氮速凍1min，迅速移至37℃保溫3min。

3.加入無抗生素的YEP 800μl，28℃震蕩培養(yǎng)3小時。

4. 7000rpm離心30s收集菌體，涂于含50μg/ml利福平、50μg/ml Kan的YEP平板上，28℃倒置暗培養(yǎng)2-3天。

3.3菌體PCR鑒定

挑取2.4的單菌落轉(zhuǎn)移到如前所述的PCR體系(不加DNA模板)中，用基因特異引物進(jìn)行PCR擴增。PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性94℃3min；94℃30sec，55℃30sec，72℃1min，35個循環(huán)；72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物用1.0％瓊脂糖凝膠電泳鑒定。結(jié)果見圖3D。

實施例4、轉(zhuǎn)基因功能驗證－擬南芥轉(zhuǎn)化篩選及抗旱表型分析

4.1擬南芥種植

將種子放入EP管中，70％乙醇中浸泡5min，洗滌10-15min，無菌水沖洗4次，4℃春化72h。向消毒好的種子中加入0.5％agarose(冷卻至40℃)，鋪于1/2MS固體培養(yǎng)基上，超凈臺上吹干。轉(zhuǎn)入人工氣候室中培養(yǎng)一周左右，可移栽。將人工土壤裝入合適大小的培養(yǎng)缽，70℃烘干2小時以上，然后將培養(yǎng)缽放在營養(yǎng)液中，使其充分吸水，將在1/2MS固體培養(yǎng)基上生長7-10天的幼苗移栽于飽含營養(yǎng)液的人工土壤中，蓋上保鮮膜，轉(zhuǎn)入人工氣候室中培養(yǎng)。1-2天后揭去保鮮膜。隔幾天澆一次水(澆在培養(yǎng)缽底下的托盤里)。

4.2擬南芥轉(zhuǎn)化

1.當(dāng)擬南芥(哥倫比亞野生型)花序形成時，將花序頂端減掉以誘導(dǎo)測花序的生成，轉(zhuǎn)化前將材料澆透營養(yǎng)液。

2.轉(zhuǎn)化前一天，取2ml活化的農(nóng)桿菌AGL1加到含相應(yīng)抗生素的200ml YEP培養(yǎng)基中，過夜培養(yǎng)至OD₆₀₀＝1.0-1.2。

3.離心收集菌體，并重懸于浸染液(5％蔗糖，0.04％Silwet L-77)中，使OD₆₀₀＝0.8。

4.將花序浸入浸染液30秒，其間前后擺動花序，使花序上形成一層膜。

5.用保鮮膜覆蓋花序，暗培養(yǎng)一天后揭去保鮮膜，至于19-22℃培養(yǎng)室培養(yǎng)。

6.隔5-7天再同法浸染一次。

7.大約一個月后收獲種子。

4.3小麥和擬南芥轉(zhuǎn)化陽性株系篩選

1.收獲的T₀代種子消毒后，鋪于含50μg/ml Kan的MS篩選培養(yǎng)基上(方法同上)。

2. 4℃春化48h，移到人工氣候室生長7-10天。將抗性小苗移到土中繼續(xù)生長。

3.等植物絕大多數(shù)花苞已經(jīng)結(jié)果莢，用小繩將植物單株綁起，以便單株收種子T₁代種子。

4. PCR擴增以轉(zhuǎn)化株系的基因組DNA為模板，使用基因特異引物進(jìn)行基因組PCR，鑒定陽性克隆。結(jié)果見圖4。

5.T₁種子處理同前，在T₂代植物中挑選抗性比為3:1的單插入獨立株系。

6.將T2代植株種子按照上述方法，鋪于含50μg/ml Kan的MS篩選培養(yǎng)基上，篩選全部Kan抗性的系，移栽到培養(yǎng)缽中，收獲T3帶純系種子，用于后續(xù)分析。

7.從T3帶純系株系上取下1片葉子，按照上述方法提取RNA，進(jìn)行RT-PCR分析，鑒定轉(zhuǎn)基因的表達(dá)情況。結(jié)果見圖4。

4.4擬南芥陽性株系抗旱表型分析

1.按照上述方法將擬南芥種子消毒、鋪在1/2MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)，得到7-10天幼苗，移栽到培養(yǎng)缽中培養(yǎng)至一月大小，進(jìn)行控水試驗。

2.控水試驗：停止?jié)菜?0天后，正常澆水，觀察轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因株系生長情況。結(jié)果見圖5。

序列表

<110>山東大學(xué)

<120>小麥抗旱基因TaH2A.9及其應(yīng)用

<141>2017-03-16

<160> 1

<210> 1

<211>456

<212>cDNA

<213>小麥

<221>小麥抗旱基因TaH2A.9

<222>（1）…（456）

<400>1

atggccggaa ggaagggagg cgacaggaag aaggcggtga ccaggtccgt caaggccggg 60

gttctccagt tccccgtcgg ccgcatcggg cgctacctca agaagggccg ctacgcgcag 120

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