本發(fā)明涉及一種雜交楊抗銹菌的ERF轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子基因及其引物和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子家族廣泛參與植物體生長發(fā)育和對外界刺激的反應(yīng)，對各種逆境和發(fā)育信號做出反應(yīng)，在植物的生理活動中發(fā)揮著重要的作用。AP2/ERF家族轉(zhuǎn)錄因子通過參與乙烯、脫落酸、茉莉酸和水楊酸等信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，調(diào)控下游基因的表達(dá)，從而綜合提高植物的抗逆性。ERF(Ethylene responsive transcription factors)轉(zhuǎn)錄因子即乙烯應(yīng)答因子，又稱為乙烯應(yīng)答件結(jié)合蛋白(Ethylene-responsive element binding protein，EREBP)是AP2/ERF家族的一個重要的亞族，為植物所特有。這類亞家族的成員與AP2/ERF家族其它成員一樣，都有一個58-59氨基酸的保守序列，即為該類轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合域，它可以特異地結(jié)合DNA序列中的靶序列，從而調(diào)控基因的表達(dá)。目前為止，在擬南芥中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)65個ERF家族的基因，水稻中發(fā)現(xiàn)79個，近些年來，又相繼從煙草、大豆、葡萄、棉花、辣椒、楊樹等多種植物中發(fā)現(xiàn)該類轉(zhuǎn)錄因子。目前，在擬南芥、煙草等模式植物中，利用過量表達(dá)和插入突變體材料，已經(jīng)研究明確一些ERF轉(zhuǎn)錄因子在植物抗病反應(yīng)中的功能。大部分ERF基因過量表達(dá)后，能增強(qiáng)對某一種病害的抗性，或具有一定的廣譜抗病性。

楊樹是重要的用材林樹種，具有較大的經(jīng)濟(jì)效益和生態(tài)效益。由落葉松-楊柵銹菌(Melampsora larici-populina)引起的楊銹病是楊樹的主要病害之一。近年來，其危害日趨嚴(yán)重。利用基因工程技術(shù)培育抗銹病楊樹品種是重要的防病手段，該技術(shù)依賴于對楊樹抗病相關(guān)基因及其調(diào)控元件的認(rèn)識。楊樹抗病反應(yīng)是多種生理過程相互調(diào)控的綜合反應(yīng)，ERF類轉(zhuǎn)錄因子基因受多種植物激素和生物與非生物脅迫誘導(dǎo)，參與植物體內(nèi)多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，在植物體的抗逆性調(diào)控中發(fā)揮著不可替代的作用；不僅如此，ERF轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)控植物的生長發(fā)育中也發(fā)揮著一定的作用。植物體內(nèi)與生長發(fā)育有關(guān)的信號，以及外界干旱、高鹽、激素、病害等信號通過一系列的傳遞，激發(fā)轉(zhuǎn)錄因子，通過轉(zhuǎn)錄因子與順式作用元件的相互作用，調(diào)控相應(yīng)基因的表達(dá)，最后通過基因產(chǎn)物的作用調(diào)節(jié)植物的生長發(fā)育以及對外界環(huán)境的應(yīng)答反應(yīng)。因此，轉(zhuǎn)錄因子的主要作用是直接或者間接的參與調(diào)控基因的表達(dá)。正因?yàn)樵擃愞D(zhuǎn)錄因子與植物的抗逆性密切相關(guān)，所以對其調(diào)控過程進(jìn)入深入研究，或可揭示楊樹基因在銹菌侵染過程中的表達(dá)調(diào)控模式，為楊樹抗銹菌研究應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐開辟新道路。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

基于以上不足之處，本發(fā)明提供一種雜交楊抗銹菌的ERF轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子基因及其引物和應(yīng)用。

本發(fā)明所采用的技術(shù)如下：一種雜交楊抗銹菌的ERF轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子基因pe-ERF31，其序列如序列表SEQ No.1所示。

本發(fā)明還具有如下技術(shù)特征：

1、一種用于構(gòu)建雜交楊抗銹菌的ERF轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子基因pe-ERF31的引物組，如下：

上游引物ERF31-F：如序列表SEQ No.2所示，

下游引物ERF31-R：如序列表SEQ No.3所示。

2、如上所述的一種雜交楊抗銹菌的ERF轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子基因pe-ERF31在雜交楊對銹病的抗性育種中的應(yīng)用。

本發(fā)明的該基因在銹菌接種后表達(dá)上調(diào)，表明該基因在楊樹抗銹菌侵染過程中起作用。通過對該基因的研究，在楊樹抗病育種中具有重要的生物學(xué)意義和潛在的應(yīng)用價(jià)值。

附圖說明

圖1為實(shí)施例1中雜交楊葉片總RNA的電泳圖；

圖2為實(shí)施例1中Q-PCR技術(shù)檢驗(yàn)銹菌接種后pe-ERF31基因表達(dá)量變化圖；

具體實(shí)施方式

本發(fā)明提供的調(diào)控雜交楊抗銹菌侵染基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子基因pe-ERF31來源于雜交楊，命名為pe-ERF31，其長度為679bp，其基因序列如SEQ No.1所示，具有典型的ERF結(jié)構(gòu)域。

實(shí)施例1：

調(diào)控雜交楊抗銹菌侵染基因表達(dá)的ERF轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子基因pe-ERF31的獲得及其功能驗(yàn)證。

(一)RNA文庫構(gòu)建及高通量測序：

將落葉松-楊柵銹菌接種于雜交楊葉片，分別取接種落葉松-楊柵銹菌2h、6h、12h、24h、48h、96h和168h共七組健康且新鮮的雜交楊葉片，液氮研磨，CTAB法提取總RNA，并等量均勻混合各組RNA。以相同方法提取未接種落葉松-楊柵銹菌的雜交楊葉片總RNA，并等量均勻混合各組RNA。0.8％瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA質(zhì)量，結(jié)果如圖1所示，圖1中Rust+表示接種落葉松-楊柵銹菌后的雜交楊葉片總RNA，Rust-表示未接種落葉松-楊柵銹菌的雜交楊葉片總RNA，電泳條帶清晰，28S條帶亮度大于18S條帶，亮度比值接近2:1，無拖尾模糊現(xiàn)象。分別取2μl RNA樣品用Eppendorf分光光度計(jì)測定OD 280、OD 260和OD 230值，OD 260/280比值均在1.8-2.0之間，OD 260/230比值均﹥1.8。說明所提取RNA質(zhì)量較好。根據(jù)Illumina/Solexa標(biāo)準(zhǔn)步驟構(gòu)建Rust+和Rust-文庫，構(gòu)建好的文庫送生物公司進(jìn)行測序。

(二)RNA生物信息學(xué)分析

篩選毛果楊(Populus trichocarpa)和擬南芥基因組中的ERF31，結(jié)合測序結(jié)果，構(gòu)建本地?cái)?shù)據(jù)庫，進(jìn)行BLASTP比對(E值<1e-10)，篩選出雜交楊pe-ERF31。比較接種前后的RNA文庫測序結(jié)果可知，該ERF：pe-ERF31在銹菌接種后比接種前表達(dá)量顯著上調(diào)(log₂表達(dá)量＝3.84)。

(三)熒光定量Q-PCR驗(yàn)證

選取接種落葉松-楊柵銹菌2h、6h、12h、24h、48h、96h和168h后雜交楊葉片，液氮研磨后CTAB法提取總RNA。應(yīng)用GoTaq 2-Step RT-qPCR System(Promega A6010)試劑盒進(jìn)行第一鏈cDNA反轉(zhuǎn)錄。

根據(jù)測序結(jié)果合成雜交楊pe-ERF31引物組，

ERF31-F：5`-TCT CTG TGG AGA TGG TGA GAG AA-3`，

ERF31-R：5`-CAG CTC CCA AAT CCT CCA A-3`。

雜交楊18s rRNA基因作為內(nèi)參基因，

18S-F：5`-CGA AGA CGA TCA GAT ACC GTC CTA-3`，

18S-R：5`-TTT CTC ATA AGG TGC TGG CGG AGT-3`。

應(yīng)用Stratagene Mx3000P qPCR system(Agilent,USA)和GoTaq 2-Step RT-qPCR System試劑盒進(jìn)行Q-PCR擴(kuò)增。使用2步法PCR，第一步：預(yù)變性95℃3min。第二步：95℃30s，58℃1min，72℃30s共40個循環(huán)。融解曲線測定從55℃到95℃。對Q-PCR擴(kuò)增采用相對定量法計(jì)算次重復(fù)試驗(yàn)初始模板量比值，兩配對樣本t檢驗(yàn)p<0.01，差異顯著。結(jié)果如圖2所示，pe-ERF31基因在落葉松-楊柵銹菌E4菌株接種后24h，96h以及168h時均有顯著上調(diào)，證實(shí)pe-ERF31基因在E4侵染過程中起到一定抗性作用。

<110> 東北林業(yè)大學(xué)

<120> 雜交楊抗銹菌的ERF轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子基因及其引物和應(yīng)用

<160> 3

<210> 1

<211> 679

<212> DNA

<213> pe-ERF31

<400> 1

atggaaccct cttgttttac cataatcaat acctaaattc agatctctcc cctgaatctt 60

cttttggttc tttagattca tttccatggg atgatctttt tcagagcagt tcccttcctt 120

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<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> ERF31-F

<400> 2

tctctgtgga gatggtgaga gaa 23

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> ERF31-R

<400> 3

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