本發(fā)明涉及生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種芒果乙烯受體基因。
背景技術(shù)：
：芒果(MangniferaindicaL.)是著名的熱帶水果，風(fēng)味獨特，肉質(zhì)嫩滑，營養(yǎng)價值高，有“熱帶果王”的美譽，在世界熱帶水果產(chǎn)量中僅次于香蕉位居第二，在世界生產(chǎn)與貿(mào)易中均占有重要地位。近年來，全球芒果年產(chǎn)量達(dá)到2700萬噸。芒果屬于典型的呼吸躍變型果實，采后果實成熟過程中有明顯的呼吸躍變，果實達(dá)到完熟時呼吸強(qiáng)度最大，之后隨著果實組織衰老逐漸降低。芒果采后對乙烯非常敏感，躍變開始之前，組織內(nèi)乙烯濃度極低，在即將發(fā)生躍變之前，乙烯明顯上升，引起呼吸躍變(張勁，等.《6個芒果品種品質(zhì)特性評價研究》.食品科技，2011.)。芒果采收正值夏季，采后不耐貯，易腐爛，代謝旺盛，果實容易后熟而變黃、變軟，低溫貯藏中極易受到冷害，導(dǎo)致果皮快速褐變，溫度較高時又易發(fā)生病害，從而降低芒果的食用價值，制約芒果生產(chǎn)發(fā)展。乙烯(Ethylene)是一種重要的植物激素，幾乎所有的高等植物都能合成乙烯，并在植物整個生長發(fā)育過程中起作用。種子萌發(fā)、器官衰老與脫落、果實成熟、環(huán)境脅迫和病原反應(yīng)等過程都受乙烯的調(diào)控，特別是在果蔬成熟和衰老過程中乙烯起獨特的調(diào)控作用，但乙烯需要通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑與乙烯受體結(jié)合，才能對植物的諸多生理過程產(chǎn)生影響。乙烯受體是乙烯信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的關(guān)鍵信號傳遞因子，是乙烯的應(yīng)答順利進(jìn)行所必需(Jiang和Fu，2002；李麗秀和賴鐘雄，2013)。通過控制乙烯受體的表達(dá)可以影響乙烯信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，使植物成熟和采后壽命等相關(guān)變化得以延緩或中斷。乙烯受體基因家族這類乙烯信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中關(guān)鍵因子的克隆及表達(dá)特性的確定，對研究果實發(fā)育成熟有著重要的意義。乙烯受體成員在果實成熟過程中可能具有多種調(diào)控模式，不同類型果實的乙烯受體基因的表達(dá)是復(fù)雜多樣的。乙烯受體在植物中由多基因家族所編碼，根據(jù)其編碼蛋白結(jié)構(gòu)不同，可分為ETR1和ETR2家族兩大類。ETR1家族又可分為ETR1亞類和ERS1亞類，它們主要區(qū)別在于是否存在反應(yīng)調(diào)節(jié)器結(jié)構(gòu)域。ETR1處于乙烯信號傳導(dǎo)其他基因座的最上游。研究表明，ETR1編碼的ETR1蛋白在乙烯受體家族具有支配地位。因為在乙烯信號傳導(dǎo)途徑初期，只有ETR1蛋白能夠結(jié)合乙烯，其他受體不直接結(jié)合乙烯，只是與ETR1蛋白形成受體復(fù)合物。ETR1蛋白廣泛存在于各種植物組織中，其結(jié)構(gòu)和功能具有很大的保守性，目前至少有37種植物先后成功克隆出ETR1基因片段，這些植物多以果樹和觀賞植物為主。通過調(diào)節(jié)乙烯受體基因ETR1的表達(dá)水平調(diào)控果實成熟衰老進(jìn)程，是實現(xiàn)利用生物技術(shù)延緩果實后熟軟化的一個重要途徑。乙烯受體由多基因家族編碼，它們在結(jié)構(gòu)和基因時空表達(dá)上各有特點。目前在擬南芥和水稻中均分離了5個乙烯受體基因，在模式植物的基礎(chǔ)上，乙烯受體在果實中的研究也取得了一些進(jìn)展。番茄果實存在至少6個乙烯受體成員，蘋果可能具有5個，梨果實中含有4個，研究者又相繼從香蕉、冬棗、柑橘、柿等果實中分離得到了多個乙烯受體同源基因。由此可見，每一種水果內(nèi)可能同時存在多個乙烯受體基因，而隨著研究的深入，可能每一種果實中將會有更多的乙烯受體基因不斷被克隆。且乙烯受體基因在不同植物中可能存在著不同的表達(dá)模式。通過基因工程等技術(shù)手段調(diào)控乙烯受體基因的功能，從而降低果實對乙烯的敏感性，是延緩果實成熟衰老進(jìn)程的有效途徑之一，這已在番茄果實中得到了證實。目前，雖然對于芒果果實乙烯釋放以及乙烯反應(yīng)已經(jīng)有很多報道，但是有關(guān)芒果果實成熟衰老進(jìn)程中乙烯信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的研究，尤其是乙烯受體的表達(dá)與調(diào)控機(jī)制尚不清楚，還未克隆出芒果果實乙烯受體基因家族成員。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的發(fā)明目的在于：針對上述問題，提供一種芒果乙烯受體基因及其編碼的蛋白質(zhì)。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：一種芒果乙烯受體基因，所述基因名稱為MiETR1,所述MiETR1的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO：1所示。一種芒果乙烯受體蛋白，所述蛋白名稱MiETR1蛋白，所述MiETR1蛋白是如下述1)或2)所述的蛋白質(zhì)：1)其氨基酸序列由序列表SEQIDNO：2所示；2)由序列表SEQIDNO：1所述的堿基序列編碼。一種表達(dá)載體，包含權(quán)利要求1所述基因MiETR1。本發(fā)明的芒果乙烯受體基因MiETR1來源是芒果(MangniferaindicaL.),為漆樹科芒果屬的栽培品種臺農(nóng)1號，產(chǎn)地廣西百色。基因MiETR1的堿基序列如序列表中SEQIDNO：1所示；共2570堿基序列，包括一個包含113個3’不翻譯區(qū),1個多聚腺苷酸尾巴和1個有2220個堿基序列的開放解碼區(qū)?；騇iETR1編碼的蛋白質(zhì)含有739個氨基酸，其氨基酸序列由序列表SEQIDNO：2所示。MiETRlb蛋白分子總量為86385.1，等電點pI9.09，5’不翻譯區(qū)和3’不翻譯區(qū)序列分別位于總長度的164和309核苷酸。負(fù)電荷和正電荷的氨基酸殘基總數(shù)分別為75和88，其分子式為C3891H6264N1064O1080S36，總原子數(shù)為12335，脂肪系數(shù)106.84，不穩(wěn)定系數(shù)為39.39，親水性為0.065，說明它是一個穩(wěn)定的疏水蛋白?；騇iETR1與NCBI數(shù)據(jù)庫中已報道序列未找到重合的。經(jīng)nnPredict軟件預(yù)測分析MiETRl蛋白的二級結(jié)構(gòu)，結(jié)構(gòu)顯示：含有α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲3種結(jié)構(gòu)，其中MiETRl蛋白α-螺旋所占的比例分別為24.37％、；β-轉(zhuǎn)角占9.97％；無規(guī)則卷曲占42.93％。故MiETRl蛋白二級結(jié)構(gòu)以無規(guī)則卷曲為主。經(jīng)SWISS-MODEL工具對MiETRl蛋白的三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測，預(yù)測結(jié)果如圖2所示。含有上述基因的重組載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。擴(kuò)增上述基因的全長或其任一片段的引物對也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。一種權(quán)利要求1所述芒果乙烯受體基因的應(yīng)用，在芒果調(diào)控成熟過程和/或延長芒果保質(zhì)期中的應(yīng)用。一種權(quán)利要求1所述芒果乙烯受體基因的應(yīng)用，在抑制芒果乙烯受體表達(dá)中的應(yīng)用。一種延長芒果保質(zhì)期的方法，運用乙烯抑制劑作用于權(quán)利要求1所述基因MiETR1。優(yōu)化的，所述乙烯抑制劑選自1-甲基環(huán)丙烯、1-戊基環(huán)丙烯、1-已基環(huán)丙烯、1-丙基環(huán)丙烯和1-辛基環(huán)丙烯中的任一種或幾種。通過運用乙烯抑制劑針對性的作用于本發(fā)明乙烯受體基因MiETR1或基因MiETR1編碼的蛋白質(zhì)，可以實現(xiàn)阻斷乙烯合成，達(dá)到減少芒果內(nèi)乙烯量的目的，從而達(dá)到延長芒果保質(zhì)期的目的。同理，在芒果成熟前，也可以使用化化學(xué)物質(zhì)或生物物質(zhì)作用于本發(fā)明乙烯受體基因MiETR1或基因MiETR1編碼的蛋白質(zhì)，可以實現(xiàn)加速乙烯合成，促進(jìn)芒果提前成熟，從而達(dá)到調(diào)節(jié)芒果成熟過程目的。綜上所述，由于采用了上述技術(shù)方案，本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明從芒果中分離克隆得到了芒果乙烯受體基因MiETR1，通過乙烯抑制劑作用于乙烯受體基因MiETR1可以顯著抑制乙烯受體基因MiETR1的表達(dá)，從而減少乙烯釋放量和延緩乙烯釋放高峰。本發(fā)明為芒果采后保持品質(zhì)，延緩衰老提供了一種新的手段。為芒果采后保藏提供一種新的方法。本發(fā)明所述基因編碼序列短，易于克隆和基因工程操作，所需材料易于獲取?！靖綀D說明】圖1實施例1中1.1RNA的提取方法RNA電泳圖；圖2實施例1下1.6半定量RT-PCR分析RNA電泳檢測圖；電泳圖順序依次為：空白組處理組0、2、4、6、8天，1-MCP處理組0、2、4、6、8天。圖3實施例1下2.3熒光定量PCR檢測中樣品的樣品的GADPH擴(kuò)增曲線；圖4實施例1下2.3熒光定量PCR檢測中樣品的MiETR1擴(kuò)增曲線；圖5實施例1下2.3熒光定量樣品的GADPH溶解曲線；圖6實施例1下2.3熒光定量樣品的MiETR1溶解曲線；圖7實施例2中MiETRl的三級結(jié)構(gòu)預(yù)測圖；圖8實施例2中MiETRl的蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建圖；圖9實施例3中1-MCP處理對MiETRl表達(dá)的影響結(jié)果圖；圖10實施例3中1-MCP處理對芒果25℃貯藏條件下乙烯產(chǎn)生速率的影響；圖11實施例3中1-MCP處理對芒果4℃貯藏條件下乙烯產(chǎn)生速率的影響?！揪唧w實施方式】下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。下述實施例中，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。本發(fā)明的完成所依賴的遺傳資源為：芒果(MangniferaindicaL.)是漆樹科芒果屬的栽培品種臺農(nóng)1號，產(chǎn)地廣西。實施例1芒果乙烯受體基因MiETR1提取本發(fā)明中，總RNA的提取和cDNA合成總RNA的提取參照Bioteke(北京百泰克生物技術(shù)有限公司生產(chǎn))通用植物總RNA提取試劑盒(離心柱型)說明書操作，并保存于-80℃冰箱。cDNA第一鏈合成參照RevertAidTMFirst-StrandSynthesisSystem說明書操作，合成的cDNA用于保守區(qū)克隆、3′RACE及ORF克隆。5′RACEcDNA第一鏈的合成參照TransScriptⅡFirst-StrandcDNASynthesisSuperMix試劑盒進(jìn)行，cDNA第一鏈的合成時加入0.2μL2pmol/0.2μL5′ETR特異引物GSP：5′-GCTGCCATCTTCAAGCCT-3′；cDNA第一鏈合成產(chǎn)物純化、加同聚物尾及cDNA第二鏈的合成均參照5′RACESystemforRapidAmplificationofcDNAEnds，Version2.0的試劑盒。1.1RNA的提取方法1)勻漿處理：取100mg芒果組織在液氮中迅速研磨成粉末，加入500μLBufferRLS，立即渦旋劇烈震蕩混勻。2)然后于4℃12,000rpm(～13,400×g)離心2分鐘。3)將上清液轉(zhuǎn)入已裝入收集管的過濾柱(SpinColumnsFS)中，4℃12,000rpm離心1分鐘，小心吸取收集管中的上清并轉(zhuǎn)移至新的RNase-Free離心管(自備)中，槍頭盡量避免接觸收集管中的細(xì)胞碎片沉淀。4)緩慢加入0.5倍上清體積的無水乙醇，混勻(此時可能會出現(xiàn)沉淀)，將得到的溶液和沉淀一起轉(zhuǎn)入已裝入收集管的吸附柱(SpinColumnsRM)中。4℃12,000rpm離心1分鐘，棄廢液，將吸附柱重新放回收集管中。5)向吸附柱RM中加入350μLBufferRW1，4℃12,000rpm離心1分鐘，棄廢液，將吸附柱重新放回收集管中。6)配制DNaseI混合液：取52μLRNase-FreeWater，向其中加入8μL10×ReactionBuffer和20μLDNaseI(1U/μL)，混勻，配制成終體積為80μL的反應(yīng)液。7)向吸附柱中直接加入80μLDNaseI混合液，20-30℃孵育15分鐘。8)向吸附柱RM中加入350μLBufferRW1，4℃12,000rpm離心1分鐘，棄廢液，將吸附柱重新放回收集管中。9)向吸附柱RM中加入500μLBufferRW2,4℃12,000rpm離心1分鐘，棄廢液，將吸附柱重新放回收集管中。10)重復(fù)步驟9。11)4℃12,000rpm離心2分鐘。12)將吸附柱RM裝入新的RNase-FreeCentrifugeTubes(1.5mL)中，向吸附膜的中間部位懸空滴加30-50μLRNase-FreeWater，室溫放置2分鐘，4℃12,000rpm離心1分鐘，得到的RNA溶液保存在-70℃。RNA電泳圖詳見圖1。1.2引物設(shè)計以電子克隆得到的2570bp的cDNA序列為基礎(chǔ)，利用DNAMAN6.0和Primer5.0軟件設(shè)計引物，由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成。MiETRl基因克隆引物信息1.3目的片段的擴(kuò)增以合成的cDNA第一鏈為模板，P1F、P1R為引物進(jìn)行保守區(qū)擴(kuò)增，用3′GSP與3P、3NP為上下游引物進(jìn)行3′RT-PCR2輪擴(kuò)增；以5′RACEcDNA為模板，用5′GSP與3P、3NP為上下游引物進(jìn)行5′RACE擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為：cDNA模板1μL，2×TaqPCRMasterMix12.5μL，上游引物1μL，下游引物1μL，加ddH2O9.5μL至總體積25μL。PCR反應(yīng)程序如下：94℃預(yù)變性3min，94℃變性1min，TM℃退火1min，延伸tmin，72℃再延伸10min結(jié)束反應(yīng)，35個循環(huán)。1.4目的片段的回收、連接轉(zhuǎn)化及測序用DNA回收試劑盒回收目的片段，將目的片段與PMD18-T載體連接并轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂在含有1μLAmp：1mLLB的平板中培養(yǎng)，12h后挑起單菌落進(jìn)行重組子菌液鑒定，陽性克隆子送到北京六合華大基因科技股份有限公司測序。1.5序列分析用GenBank上的Blast檢索已有序列與分析其保守結(jié)構(gòu)域，采用DNAMAN6.0和primer5.0軟件進(jìn)行引物設(shè)計、序列拼接及翻譯氨基酸。用ExPASy數(shù)據(jù)庫中的ProtParam工具和ProtScale工具預(yù)測分析推測蛋白質(zhì)理化性質(zhì)，蛋白質(zhì)跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測與分析采用TMPRED(http://www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html)，磷酸化位點預(yù)測用NetPhos2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos)，利用MEGA5.0構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。利用NCBI網(wǎng)站的CD-Search服務(wù)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)分析芒果乙烯受體基因MiETR1氨基酸序列的保守結(jié)構(gòu)域。1.6半定量RT-PCR分析對25℃條件下分別貯藏0、2、4、6、8、10天的芒果進(jìn)行取樣。4℃條件下分別貯藏0、3、6、9、12、15、18和21天的芒果進(jìn)行取樣?？俁NA的提取和反轉(zhuǎn)錄方法同1.1。1)主要儀器和試劑德國AnalytikJenaqTOWERE2.2熒光定量PCR儀引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。RNA提取試劑盒：康為世紀(jì)生物科技公司的OminiPlantRNAKit(DNaseI)(CW2598S)反轉(zhuǎn)錄試劑：全式金TransScriptOne-StepgDNARemovalandcDNASynthesisSuperMix(#AT311)定量PCR試劑：諾唯贊AceQqPCRSYBRGreenMasterMix6×DNALoadingDye，10×TAE(400mMTris-acetateand10mMEDTA，pH8.0)，等其他試劑均購于生工生物工程(上海)股份有限公司。2)內(nèi)參基因詳細(xì)信息No.GeneSymbol基因信息(如Accession#)引物是否設(shè)計合成1GADPH是3)目的基因信息No.GeneSymbol基因信息(如Accession#)引物是否設(shè)計合成1ETRl是4)引物序列引物名稱引物序列(5’-3’)產(chǎn)物大小ETRl-FCCTACAACTTCAACTCGGAACTTETRl-RTTCATCACCAACAGCATACTCAG145bpGADPH-FGTGGCTGTTAACGATCCCTTGADPH-RGTGACTGGCTTCTCATCGAA150bp5)RNA提取5.1實驗試劑康為世紀(jì)生物科技公司的OminiPlantRNAKit(DNaseI)5.2詳細(xì)操作步驟具體操作步驟詳見說明書。5.3RNA電泳檢測結(jié)果見圖2。附圖中，電泳圖順序依次為：空白組處理組0、2、4、6、8天，1-MCP處理組0、2、4、6、8天，2.2.反轉(zhuǎn)錄2.2.1實驗試劑TransScriptOne-StepgDNARemovalandcDNASynthesisSuperMix(北京全式金生物技術(shù)有限公司)。2.2.2cDNA第一鏈合成和gDNA去除1.將RNA模板、PrimerMix、2×TSReactionMix、RT/RIEnzymeMix、gDNARemover和RNase-FreeWater溶解并置于冰上備用。2.根據(jù)以下表格配置反應(yīng)體系，總體積為20μL。試劑20μl反應(yīng)體系終濃度RNATemplate4μL1μg-5μgPrimerMix1μL2×TSReactionMix10μLRT/RIEnzymeMix1uLgDNARemover1uLRNase-FreeWaterTo20uL3.先將RNA模板、引物與RNase-FreeWater混勻，65℃孵育5分鐘，冰浴2分鐘，然后再加入其它反應(yīng)組分。4.輕輕混勻，25℃10分鐘，50℃15分鐘，85℃5秒失活。反應(yīng)結(jié)束后，短暫離心，置于冰上冷卻。5.逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物直接用于熒光定量PCR反應(yīng)。2.3.熒光定量PCR檢測2.3.1實驗樣本將cDNA樣品稀釋10倍作為模板上機(jī)檢測。2.3.2實時定量PCR試驗材料及儀器定量PCR試劑：AceQqPCRSYBRGreenMasterMix定量PCR儀：德國AnalytikJenaqTOWERE2.22.3.3PCR反應(yīng)步驟配制反應(yīng)混合液PCR循環(huán)條件儀器的操作完成上述步驟后，把加好樣品的96孔板放在AnalytikJenaqTOWERE2.2熒光定量PCR儀中進(jìn)行反應(yīng)。實驗結(jié)果上述實驗結(jié)果，樣品的樣品的GADPH擴(kuò)增曲線見圖3，樣品的MiETR1擴(kuò)增曲線見圖4，樣品的GADPH溶解曲線見圖5，樣品的MiETR1溶解曲線見圖6。實施例2芒果乙烯受體基因MiETR1的驗證或表達(dá)特性分析用ProtParam工具分析MiETRl核苷酸推導(dǎo)的氨基酸序列，結(jié)果表明：MiETRl蛋白分子總量為86385.1，等電點pI9.09，負(fù)電荷和正電荷的氨基酸殘基總數(shù)分別為75和88，其分子式為C3891H6264N1064O1080S36，總原子數(shù)為12335，脂肪系數(shù)106.84，不穩(wěn)定系數(shù)為39.39，親水性為0.065，說明它是一個穩(wěn)定的疏水蛋白；ProtScale分析親水性和疏水性預(yù)測表明：MiETRl最大疏水性值為+4.500，最小親水性值為-4.500，并且有20處最大疏水峰，值在+2.000以上；14個親水峰，值在-2.000以下。其疏水性氨基酸明顯多于親水性氨基酸，且軟件預(yù)測結(jié)果為疏水性，故推測蛋白整條肽鏈呈現(xiàn)疏水性。經(jīng)NetPhos2.0軟件分析MiETRl蛋白磷酸化位點，MiETRl肽鏈中的Ser、Thr和Tyr均有可能發(fā)生磷酸化，分之在0.5以上的氨基酸位點有89個，其中，含有Ser磷酸化位點有48個，分別位于肽鏈第7、32、45、67、80、122、138、166、186、211、217、231、236、243、250、256、275、279、297、331、334、335、348、351、355、393、398、400、415、420、436、449、492、493、498、502、520、533、599、605、609、634、652、664、669、670、685、718處；Thr磷酸化位點有29個，分別位于肽鏈第1、11、86、98、144、152、161、182、195、212、230、272、274、284、414、416、489、508、、516、555、573、590、591、657、694、697、705、719、782處；Tyr磷酸化位點有12個，分別位于肽鏈第100、131、136、225、399、433、463、524、556、675、691、774處。經(jīng)TMPRED推測，MiETRl蛋白是跨膜蛋白，蛋白MiETRl的N末端在氨基酸119-139,302-325及765-785有3處跨膜區(qū)域。經(jīng)SignaIP4.0Serve分析MiETRl蛋白，結(jié)果表明在整個肽鏈上不含有信號肽，推測蛋白均為非分泌蛋白。利用COILS程序分析MiETRl蛋白的卷曲螺旋結(jié)構(gòu)，以window14,21和28為參數(shù)，按照幾率>50％可形成螺旋的原則，結(jié)果表明：MiETRl蛋白質(zhì)在整條肽鏈上不形成卷曲螺旋結(jié)構(gòu)。蛋白的保守結(jié)構(gòu)域含有GAF結(jié)構(gòu)域、HisKA結(jié)構(gòu)域、HATPase_c結(jié)構(gòu)域及REC結(jié)構(gòu)域。經(jīng)nnPredict軟件預(yù)測分析MiETRl蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)，結(jié)構(gòu)顯示：MiETRlb蛋白含有α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲3種結(jié)構(gòu)，其中MiETRl蛋白α-螺旋所占的比例分別為24.37％；β-轉(zhuǎn)角占9.97％；無規(guī)則卷曲占42.93％。故MiETRl蛋白二級結(jié)構(gòu)以無規(guī)則卷曲為主。經(jīng)SWISS-MODEL工具對MiETRl蛋白的三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測，預(yù)測結(jié)果如圖7所示。MiETRl蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建如圖8所示。MiETRl氨基酸序列與甜橙Citrussinensis(KDO50509.1)和克萊門柚Citrusclementina(XP006442239.1)相似度90％以上。實施例31-甲基環(huán)丙烯抑制基因MiETR1表達(dá)對芒果衰老影響研究1.1-MCP處理對MiETRl表達(dá)的影響1-MCP即1-甲基環(huán)丙烯(1-methylcyclopropene,1-MCP)是一種新型乙烯受體抑制劑,具有無毒無味,使用方便,成本低廉,安全高效等優(yōu)點。取1-MCP處理新采摘的芒果樣品，按常規(guī)方法進(jìn)行處理，處理時間分別為0、2、4、6、8、10、12、14、16天，同時設(shè)置空白對照組。每個時間點到之后，分別取芒果樣品按實施例1和2方法提取MiETRl基因，檢測MiETRl基因的表達(dá)水平。結(jié)果表明，經(jīng)1-MCP處理后MiETRl表達(dá)水平顯著降低，且于4-10天降低最為明顯。結(jié)果如圖9所示。2.1-MCP處理對芒果中乙烯釋放量的影響取新采摘的廣西芒果臺農(nóng)1號，分別于25℃和4℃條件下貯藏，采用5μL/L的1–MCP處理芒果0-21天后，檢測芒果內(nèi)乙烯釋放量和按實施例1方法檢測MiETRl表達(dá)水平。同時設(shè)置空白組。實驗結(jié)果表明，貯藏25℃和4℃貯藏條件下，1-MCP處理有利于延緩芒果內(nèi)MiETRl表達(dá)水平，延緩和降低了乙烯釋放高峰和呼吸速率，從而對維持果實品質(zhì)和延長果實采后壽命有顯著的影響。其中在25℃下，經(jīng)1-MCP處理的芒果乙烯釋放量均低于未處理的，釋放高峰也延后；而在4℃時，經(jīng)1-MCP處理的芒果乙烯釋放量在16天前均低于未處理的，16天后反而高于未處理的芒果樣品，且釋放高峰也延后達(dá)5天以上。結(jié)果圖10為1-MCP處理對芒果25℃貯藏條件下乙烯產(chǎn)生速率的影響；圖11為1-MCP處理對芒果4℃貯藏條件下乙烯產(chǎn)生速率的影響?？梢岳斫?，因為1-戊基環(huán)丙烯、1-已基環(huán)丙烯、1-丙基環(huán)丙烯和1-辛基環(huán)丙烯均具有1-甲基環(huán)丙烯的基礎(chǔ)結(jié)果環(huán)丙烯，只是取代基發(fā)生變化，屬于類似物，在化學(xué)上也屬于結(jié)構(gòu)相似的類似物，在化學(xué)實驗中?？梢蕴鎿Q使用，故本發(fā)明中，也可以采用1-戊基環(huán)丙烯、1-已基環(huán)丙烯、1-丙基環(huán)丙烯和1-辛基環(huán)丙烯中的任一種取代1-甲基環(huán)丙烯進(jìn)行試驗，也可同時選擇1-戊基環(huán)丙烯、1-已基環(huán)丙烯、1-丙基環(huán)丙烯、1-辛基環(huán)丙烯和1-甲基環(huán)丙烯中的兩種或多種的混合液進(jìn)行試驗，均可達(dá)到本發(fā)明目的，不影響本發(fā)明的實施。上述說明是針對本發(fā)明較佳可行實施例的詳細(xì)說明，但實施例并非用以限定本發(fā)明的專利申請范圍，凡本發(fā)明所提示的技術(shù)精神下所完成的同等變化或修飾變更，均應(yīng)屬于本發(fā)明所涵蓋專利范圍。SEQUENCELISTING<110>廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所<120>一種芒果乙烯受體基因<160>2<170>PatentInversion3.3<210>1<211>2570<212>DNA<213>Mangiferaindica<400>1acatggggatagaagaaagagagttgagttgtagagaccccccaaaatctcaagtaaatc60gtcaaagtgggtctcatgaattgttcacgggcttaaaggtggttcagtcaacatggagtc120ttgcaactgcattgaaccacaatggccagctgatgaattgttgatgaagtatcaatatat180ttcagatttcttcattgcacttgcttacttttcaattcctctagagctgatctactttgt240gaagaaatctgccgtgtttccatatagatgggtccttgtacagtttggcgctttcattgt300tttgtgtggggcgacacatcttataaacttgtggacttttaatatgcattcaaggactgt360ggcaatagtaatgaccaccgctaaggttttgacagctgcggtttcttgtgcaacggccct420tatgcttgtacatattacacctgatctgttaagtgttaaaactagagaactatttttaaa480aaacaaggctgcacagcttgatagagaaatgggcttgatccgcacacaggaagaaaccgg540tcggcatgttaggatgttgacgcatgagatcagaagcactttggatagacataccatact600aaagaccactcttgtcgaattgggaagaactttggcactggaagagtgtgccttatggat660gccgacgcaaactggtttagagcttcaactctcatacacacttcatcaacagaatcctgt720tgggtatactgtgcccatccaacttcctgtgatcagtcaagtattcaccagcaatcatgc780agtaaagatatcaccaaattgtcatgtggctaggttaaggcctcttgcaggaaaatatat840gcctggcgaggtggttgctgttcgtgttccactcctacatctattaaattttcaaattaa900tgattggccagaactttctacaaaacgctatgctttgatggttttgatgcttccctcaga960tagtgcaaggcagtggcatgtccatgagttggaacttgttgaagtggttgctgatcaggt1020ggctgttgctctttcacatgctgccatcttagaggagtcaatgagagcaagggatcttct1080tgtggtgcagaatatcgcgcttgaccgtgccagaagagaagcagaaacagccattcatgc1140tcgcaacgatttcctggctgttatgaaccatgagatgagaactccaatgcatgcaatcgt1200tgccctttcttctttactgcaagaaactgaattgacacttgagcagcgactgatggttga1260aacaattcttaagagcagtaatctcttagctactctaataaatgatgtattagatctttc1320gaggcttgaagatggtagcctacaacttcaactcggaacttttaatcttcatgctctatt1380caaggaggtccttaatctgatcaagcctattgcatcagtcaagaagttgcggattgcatt1440gaatttggctcctgatcttcctgagtatgctgttggtgatgaaaagcgcttaatgcaaac1500tctcctaaatattgttggcaacgctgtaaagttcacaaaagaaggcaacatctcaatcac1560tgcttttgttgcaaaatcagagtccttacgagactatcgagccccagaattttttccagt1620gccgagtgataatcatttttacctgcgtgtacaggttaaagatacaggatcaggcattaa1680accccaagatattcccaagttatttacaaaatttgcgcaaaatcaatcaatagctaccag1740gaatttcaatggcagtggacttggccttgcaatttgtaagaggtttgttaatcttatgga1800gggacatatatggattgaaagtgaaggtcttggcaagggttccactgctatcttcattgt1860gaaacttgggatccctgagagctcaaatgaatctaagctctctttcatgccaaaaatatc1920aggaccacaggcaaattttacagggctcaaagttcttgtcatggatgataatggagtcag1980cagatcagtcacaaaagggcttttggtgcacctgggatgtgatgtaatgaccgttggctc2040aagtgaggactgcttgcgcgtactatctcatgagcacaaggtggtcttcatggatgttgg2100gatgcctggtatagatggttacgaagttgctgtccttatacaccaaaagtttacaaggcg2160tcatgaaaggccactgatagtagccctgaccggaaatactgacaaagtaaccaaggagaa2220ctgcatgagagttggaatggatggtgttatattgaaacctgtttcactagaaaaaatgag2280gagcgttttactaggccttttggagcatcgagttttctttgaggccgtataagcacagat2340gagccagctgccagatgccatttagcctggaaaaagatggtacaggtaatgcaagtttat2400ctctagagatgtatggttttgtgtacatacccagatggtattagggcattggagtgactg2460agtgctgacaagagacaattattttatcaaaattcatgtttatgaatatatattttttta2520aattaagccctattaaccattgaagcaaaaagaaaaaaaaaaaaaaaaaa2570<210>2<211>739<212>PRT<213>Mangiferaindica<400>1MetGluSerCysAsnCysIleGluProGlnTrpProAlaAspGluLeu151015LeuMetLysTyrGlnTyrIleSerAspPhePheIleAlaLeuAlaTyr202530PheSerIleProLeuGluLeuIleTyrPheValLysLysSerAlaVal354045PheProTyrArgTrpValLeuValGlnPheGlyAlaPheIleValLeu505560CysGlyAlaThrHisLeuIleAsnLeuTrpThrPheAsnMetHisSer65707580ArgThrValAlaIleValMetThrThrAlaLysValLeuThrAlaAla859095ValSerCysAlaThrAlaLeuMetLeuValHisIleThrProAspLeu100105110LeuSerValLysThrArgGluLeuPheLeuLysAsnLysAlaAlaGln115120125LeuAspArgGluMetGlyLeuIleArgThrGlnGluGluThrGlyArg130135140HisValArgMetLeuThrHisGluIleArgSerThrLeuAspArgHis145150155160ThrIleLeuLysThrThrLeuValGluLeuGlyArgThrLeuAlaLeu165170175GluGluCysAlaLeuTrpMetProThrGlnThrGlyLeuGluLeuGln180185190LeuSerTyrThrLeuHisGlnGlnAsnProValGlyTyrThrValPro195200205IleGlnLeuProValIleSerGlnValPheThrSerAsnHisAlaVal210215220LysIleSerProAsnCysHisValAlaArgLeuArgProLeuAlaGly225230235240LysTyrMetProGlyGluValValAlaValArgValProLeuLeuHis245250255LeuLeuAsnPheGlnIleAsnAspTrpProGluLeuSerThrLysArg260265270TyrAlaLeuMetValLeuMetLeuProSerAspSerAlaArgGlnTrp275280285HisValHisGluLeuGluLeuValGluValValAlaAspGlnValAla290295300ValAlaLeuSerHisAlaAlaIleLeuGluGluSerMetArgAlaArg305310315320AspLeuLeuValValGlnAsnIleAlaLeuAspArgAlaArgArgGlu325330335AlaGluThrAlaIleHisAlaArgAsnAspPheLeuAlaValMetAsn340345350HisGluMetArgThrProMetHisAlaIleValAlaLeuSerSerLeu355360365LeuGlnGluThrGluLeuThrLeuGluGlnArgLeuMetValGluThr370375380IleLeuLysSerSerAsnLeuLeuAlaThrLeuIleAsnAspValLeu385390395400AspLeuSerArgLeuGluAspGlySerLeuGlnLeuGlnLeuGlyThr405410415PheAsnLeuHisAlaLeuPheLysGluValLeuAsnLeuIleLysPro420425430IleAlaSerValLysLysLeuArgIleAlaLeuAsnLeuAlaProAsp435440445LeuProGluTyrAlaValGlyAspGluLysArgLeuMetGlnThrLeu450455460LeuAsnIleValGlyAsnAlaValLysPheThrLysGluGlyAsnIle465470475480SerIleThrAlaPheValAlaLysSerGluSerLeuArgAspTyrArg485490495AlaProGluPhePheProValProSerAspAsnHisPheTyrLeuArg500505510ValGlnValLysAspThrGlySerGlyIleLysProGlnAspIlePro515520525LysLeuPheThrLysPheAlaGlnAsnGlnSerIleAlaThrArgAsn530535540PheAsnGlySerGlyLeuGlyLeuAlaIleCysLysArgPheValAsn545550555560LeuMetGluGlyHisIleTrpIleGluSerGluGlyLeuGlyLysGly565570575SerThrAlaIlePheIleValLysLeuGlyIleProGluSerSerAsn580585590GluSerLysLeuSerPheMetProLysIleSerGlyProGlnAlaAsn595600605PheThrGlyLeuLysValLeuValMetAspAspAsnGlyValSerArg610615620SerValThrLysGlyLeuLeuValHisLeuGlyCysAspValMetThr625630635640ValGlySerSerGluAspCysLeuArgValLeuSerHisGluHisLys645650655ValValPheMetAspValGlyMetProGlyIleAspGlyTyrGluVal660665670AlaValLeuIleHisGlnLysPheThrArgArgHisGluArgProLeu675680685IleValAlaLeuThrGlyAsnThrAspLysValThrLysGluAsnCys690695700MetArgValGlyMetAspGlyValIleLeuLysProValSerLeuGlu705710715720LysMetArgSerValLeuLeuGlyLeuLeuGluHisArgValPhePhe725730735GluAlaVal當(dāng)前第1頁1 2 3