人工合成的對(duì)鱗翅目害蟲(chóng)高毒力殺蟲(chóng)基因及應(yīng)用的制作方法

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人工合成的對(duì)鱗翅目害蟲(chóng)高毒力殺蟲(chóng)基因及應(yīng)用的制作方法與工藝

本發(fā)明屬于生物防治技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及人工合成的對(duì)鱗翅目害蟲(chóng)高毒力的殺蟲(chóng)基因基因序列及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

蟲(chóng)害是世界農(nóng)作物減產(chǎn)的一個(gè)重要因素，平均每年因此損失糧食總產(chǎn)量的10％左右，直接經(jīng)濟(jì)損失達(dá)100億美元以上。過(guò)去幾十年的防治主要依賴化學(xué)農(nóng)藥，在為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)做出巨大貢獻(xiàn)的同時(shí)，化學(xué)農(nóng)藥卻造成了環(huán)境污染、人畜中毒、生態(tài)失衡等嚴(yán)重后果。在這些巨大的代價(jià)面前，全球都在尋找和開(kāi)辟新的病蟲(chóng)害防治策略和技術(shù)。

蘇云金芽胞桿菌(Bacillus thuringiensis,簡(jiǎn)稱Bt)是一種分布極其廣泛的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌。它在形成芽胞的同時(shí)，能產(chǎn)生蛋白性質(zhì)的伴胞晶體(parasporal crystal)，對(duì)鱗翅目(Lepidoptera)、雙翅目(Diptera)、鞘翅目(Coleoptera)、膜翅目(Hymenoptera)、同翅目(Homoptera)、直翅目(Orthoptera)、食毛目(Mallophaga)等多種昆蟲(chóng)，以及線蟲(chóng)、螨類(lèi)和原生動(dòng)物具有特異性的殺蟲(chóng)活性(Schnepf E.et al,1998,Microbiology and Molecular Biology Review,62(3):775-806)。這種殺蟲(chóng)晶體蛋白(Insecticidal Crystal Proteins,ICPs)又稱δ-內(nèi)毒素(Delta-endotoxin)，在昆蟲(chóng)中腸首先溶解，成為原毒素，之后被腸道蛋白酶降解為具有專一活性的毒素，與中腸上特異的受體進(jìn)行結(jié)合(Craig,2007,Microbiology and Molecular Biology Review,71(2):255–281)，導(dǎo)致昆蟲(chóng)死亡，蘇云金芽胞桿菌對(duì)人畜無(wú)害，不污染環(huán)境，因而B(niǎo)t在害蟲(chóng)的生物防治中得到了廣泛應(yīng)用。

目前人們已經(jīng)克隆了825種編碼殺蟲(chóng)晶體蛋白的Bt殺蟲(chóng)基因，它們分屬318種模式基因(可參見(jiàn)http://www.lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt//holo2.html)。

1987年，Vaeck等人首次將Bt殺蟲(chóng)晶體蛋白基因轉(zhuǎn)入煙草，開(kāi)創(chuàng)了人類(lèi)利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)防治害蟲(chóng)的先河(Vaeck et al,1987，Nature,328:33-37)。但是在轉(zhuǎn)基因研究中人們發(fā)現(xiàn)將來(lái)源于Bt的殺蟲(chóng)蛋白基因直接轉(zhuǎn)入植物，存在著表達(dá)產(chǎn)物不穩(wěn)定、表達(dá)量少的缺陷(van Aarssen et al,1995,Plant Molecular Biology,28:513-524)。具體問(wèn)題包括：1)天然Bt基因高含AT，超過(guò)60％，在植物體內(nèi)這樣的基因表達(dá)的mRNA極易被植物降解；2)天然Bt基因中存在類(lèi)似真核基因的內(nèi)含子切點(diǎn)、轉(zhuǎn)錄終止子序列，從而造成轉(zhuǎn)錄不完整、mRNA異常剪切等；3)天然Bt基因中使用的密碼子與植物存在較大差異，會(huì)造成蛋白翻譯效率降低；4)天然Bt基因作為原核生物來(lái)源的基因，其結(jié)構(gòu)與植物等真核生物差異顯著，如真核生物含有5’-UTR序列，3’末端的polyA尾序列。因此，這些關(guān)鍵問(wèn)題的解決是實(shí)現(xiàn)Bt基因在植物中高效、穩(wěn)定表達(dá)的重要保證。隨著這些技術(shù)的改進(jìn)和完善，自1996年以來(lái)的二十年內(nèi)，轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)玉米、馬鈴薯、水稻等作物相繼研制成功，并逐步進(jìn)入應(yīng)用階段(James C，ISAAA Briefs，2016)。

來(lái)源于蘇云金芽胞桿菌的殺蟲(chóng)基因cry2Ah1被證明對(duì)鱗翅目害蟲(chóng)玉米螟有體重抑制活性，對(duì)棉鈴蟲(chóng)有生長(zhǎng)抑制活性，同時(shí)對(duì)Cry1Ac抗性棉鈴蟲(chóng)也有很好的生長(zhǎng)抑制活性(Shu et al,Journal of Invertebrate Pathology,2013,114:31-33)。目前還未有對(duì)cry2Ah轉(zhuǎn)入植物的相關(guān)報(bào)道。影響外源基因在植物中的表達(dá)因素很多，包括不同啟動(dòng)子、增強(qiáng)子(enhancer)的應(yīng)用、基因的密碼子優(yōu)化形式及終止信號(hào)識(shí)別序列等，不同的調(diào)控元件及不同的基因密碼子序列將會(huì)產(chǎn)生不同的轉(zhuǎn)基因事件(event)，產(chǎn)生的抗蟲(chóng)效果也不盡相同。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供對(duì)鱗翅目害蟲(chóng)具有高毒力的Bt cry2Ah，cry2Ah-vp，cry2Ah-sp基因的人工優(yōu)化、改造并合成的新的DNA序列，以及通過(guò)轉(zhuǎn)化使植物具有抗蟲(chóng)特性。

一種用于植物轉(zhuǎn)化的mcry2Ah-vp的人工合成序列，其特征是該具有SEQ ID NO 3所示的核苷酸序列。

一種用于植物轉(zhuǎn)化的mcry2Ah-sp的人工合成序列，其特征是該具有SEQ ID NO 4所示的核苷酸序列。

一種植物表達(dá)載體，其特征是該植物表達(dá)載體含有上述的人工合成序列和在大腸桿菌和根癌農(nóng)桿菌中穿梭的雙元載體。

所述雙元載體為pCAMBIA2300載體。

所述植物表達(dá)載體為pCSm2Ah-vpN和pCSm2Ah-spN，其結(jié)構(gòu)分別如圖3、圖4所示。

上述植物表達(dá)載體在轉(zhuǎn)化植物使之生產(chǎn)抗蟲(chóng)特性方面的應(yīng)用。

所述轉(zhuǎn)化的方法為農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，所述植物為煙草或玉米。

所述抗蟲(chóng)為抗棉鈴蟲(chóng)及鱗翅目害蟲(chóng)。

所述植物表達(dá)載體為pCSm2Ah-spN，所述植物為煙草。

本發(fā)明對(duì)Bt cry2Ah(SEQ ID NO：1)和它的兩個(gè)突變體cry2Ah-vp,cry2Ah-sp的核苷酸序列進(jìn)行了密碼子優(yōu)化，并通過(guò)人工合成的方式合成了新基因，構(gòu)建植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化植物，獲得了高抗蟲(chóng)的轉(zhuǎn)基因植物，提高Bt cry2Ah，cry2Ah-vp，cry2Ah-sp基因在轉(zhuǎn)基因過(guò)程中的轉(zhuǎn)化成功率，同時(shí)提高在轉(zhuǎn)基因植物中的表達(dá)量和穩(wěn)定表達(dá)的特性。與轉(zhuǎn)mcry2Ah(SEQ ID NO：2)和mcry2Ah-vp(SEQ ID NO：3)植物相比，轉(zhuǎn)mcry2Ah-sp(SEQ ID NO：4)基因的植物表現(xiàn)出對(duì)抗性害蟲(chóng)的高毒力，所以mcry2Ah-sp基因是用于延緩害蟲(chóng)對(duì)Bt基因產(chǎn)生抗性及抗性害蟲(chóng)治理的重要候選基因，有很好的應(yīng)用潛力。

附圖說(shuō)明

圖1植物表達(dá)載體pCS2AhN構(gòu)建示意圖，

圖2植物表達(dá)載體pCSm2AhN構(gòu)建示意圖，

圖3植物表達(dá)載體pCSm2Ah-vpN構(gòu)建示意圖，

圖4植物表達(dá)載體pCSm2Ah-spN構(gòu)建示意圖，

圖5轉(zhuǎn)cry2Ah基因煙草的PCR檢測(cè)，

其中M DNA分子量Marker；1以pCS2AhN質(zhì)粒為模板的PCR擴(kuò)增；2以非轉(zhuǎn)基因煙草基因組DNA為模板的PCR擴(kuò)增；3～6以轉(zhuǎn)化植株基因組DNA為模板的PCR擴(kuò)增；7以H₂O為模板的空白對(duì)照；

圖6轉(zhuǎn)mcry2Ah基因煙草的PCR檢測(cè)，

其中M DNA分子量Marker；1以pCSm2AhN質(zhì)粒為模板的PCR擴(kuò)增；2以非轉(zhuǎn)基因煙草基因組DNA為模板的PCR擴(kuò)增；3～6以轉(zhuǎn)化植株基因組DNA為模板的PCR擴(kuò)增；7以H₂O為模板的空白對(duì)照；

圖7轉(zhuǎn)mcry2Ah-vp基因煙草的PCR檢測(cè)，

其中M DNA分子量Marker；1以pCSm2Ah-vpN質(zhì)粒為模板的PCR擴(kuò)增；2以非轉(zhuǎn)基因煙草基因組DNA為模板的PCR擴(kuò)增；3～10以轉(zhuǎn)化植株基因組DNA為模板的PCR擴(kuò)增；11以H₂O為模板的空白對(duì)照；

圖8轉(zhuǎn)mcry2Ah-sp基因煙草的PCR檢測(cè)，

其中M DNA分子量Marker；1以pCSm2Ah-spN質(zhì)粒為模板的PCR擴(kuò)增；2以非轉(zhuǎn)基因煙草基因組DNA為模板的PCR擴(kuò)增；3～15以轉(zhuǎn)化植株基因組DNA為模板的PCR擴(kuò)增；16以H₂O為模板的空白對(duì)照；

圖9轉(zhuǎn)基因煙草的southern blot檢測(cè)

其中P以pCSm2AhN質(zhì)粒中的mcry2Ah表達(dá)盒為正對(duì)照；1～3轉(zhuǎn)mcry2Ah-sp基因煙草；4～5轉(zhuǎn)mcry2Ah-vp基因煙草；6轉(zhuǎn)mcry2Ah基因煙草；N非轉(zhuǎn)基因煙草；B空白對(duì)照；

圖10轉(zhuǎn)基因煙草的ELISA檢測(cè)

圖11轉(zhuǎn)基因煙草的qRT-PCR檢測(cè)

圖12轉(zhuǎn)基因煙草對(duì)敏感棉鈴蟲(chóng)的抗蟲(chóng)性鑒定

其中A非轉(zhuǎn)基因煙草葉片和轉(zhuǎn)cry2Ah基因煙草葉片的抗蟲(chóng)性檢測(cè)；B轉(zhuǎn)mcry2Ah1基因煙草葉片的抗蟲(chóng)性檢測(cè)；C轉(zhuǎn)mcry2Ah1-vp基因煙草葉片的抗蟲(chóng)性檢測(cè)；D轉(zhuǎn)mcry2Ah1-sp基因煙草葉片的抗蟲(chóng)性檢測(cè)；

圖13轉(zhuǎn)基因煙草對(duì)Cry1Ac抗性棉鈴蟲(chóng)的抗蟲(chóng)性鑒定

其中A非轉(zhuǎn)基因和轉(zhuǎn)cry2Ah基因煙草葉片的抗蟲(chóng)性檢測(cè)；B轉(zhuǎn)mcry2Ah1基因煙草葉片的抗蟲(chóng)性檢測(cè)；C轉(zhuǎn)mcry2Ah1-vp基因煙草葉片的抗蟲(chóng)性檢測(cè)；D轉(zhuǎn)mcry2Ah1-sp基因煙草葉片的抗蟲(chóng)性檢測(cè)；

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明。

下面所涉及的生物材料在本申請(qǐng)人的實(shí)驗(yàn)室均有保藏，可以對(duì)外發(fā)放。

1、Bt cry2Ah，cry2Ah-vp，cry2Ah-sp基因的密碼子改造和優(yōu)化

Bt cry2Ah1基因(GenBank No.ACL13555.1)是中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所張杰課題組從國(guó)內(nèi)分離的Bt菌株中克隆的基因，基因的編碼區(qū)有1899bp，核酸序列見(jiàn)SEQ ID NO 1，其編碼的蛋白質(zhì)由632個(gè)氨基酸殘基組成，通過(guò)對(duì)Cry2Ah1蛋白序列結(jié)構(gòu)域分析，存在三個(gè)保守的結(jié)構(gòu)域：結(jié)構(gòu)域Ⅰ(Endotoxin_N)、結(jié)構(gòu)域Ⅱ(Endotoxin_M)和結(jié)構(gòu)域Ⅲ(Endotoxin_C)。按照植物偏好的密碼子對(duì)cry2Ah1基因序列的632個(gè)氨基酸的編碼序列進(jìn)行了優(yōu)化，原始cry2Ah1基因GC含量34％，改造后基因的GC含量為61.6％，與原始cry2Ah1核酸序列的相似性為65.82％，有535個(gè)氨基酸的編碼堿基發(fā)生改變，核酸序列見(jiàn)SEQ ID NO 2。Cry2Ah-vp突變體蛋白是將Cry2Ah1蛋白354位纈氨酸(Val)后增加一個(gè)脯氨酸(Pro)，核酸序列上在mcry2Ah序列的1062bp位后增加3個(gè)堿基CCC，編碼脯氨酸。Cry2Ah-sp突變體蛋白是將Cry2Ah1蛋白354位纈氨酸(Val)突變?yōu)榻z氨酸(Ser)和脯氨酸(Pro)，核酸序列上在mcry2Ah序列的1059bp后去掉3個(gè)堿基GTG并增加6個(gè)堿基AGCCCC，編碼絲氨酸-脯氨酸。mcry2Ah-vp和mcry2Ah-sp基因的核酸序列見(jiàn)SEQ ID NO 3和SEQ ID NO 4。

2、植物表達(dá)載體的構(gòu)建

在Btcry2Ah1基因、人工合成的mcry2Ah，mcry2Ah-vp，mcry2Ah-sp基因的兩端分別增加了多克隆位點(diǎn)，5’端含有HindIII、XbaI、XmaI、SmaI和BamHI，3’端含有KpnI、XhoI和EcoRI，原始基因和合成的基因構(gòu)建到pUC57載體，分別稱為pU2Ah、pUm2Ah、pUm2Ah-vp和pUm2Ah-sp(質(zhì)粒保存在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所郎志宏課題組，可以向公眾提供)。pE35SN是一個(gè)中間載體，載體含有兩個(gè)enhancer的CaMV35S啟動(dòng)子和一個(gè)nos終止子(質(zhì)粒保存在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所郎志宏課題組，可以向公眾提供)，用BamHⅠ和KpnⅠ雙酶切pU2Ah、pUm2Ah、pUm2Ah-vp和pUm2Ah-sp，分別回收2Kb的片段，連接到用同樣酶切的pE35SN上，再將四個(gè)載體的表達(dá)盒轉(zhuǎn)入pCSN載體上(pCSN載體是由商用載體pCAMBIA2300改造而來(lái)，在pCAMBIA2300載體的BstXI和EcoRI之間引入一對(duì)T-DNA LR序列，質(zhì)粒保存在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所郎志宏課題組，可以向公眾提供)，構(gòu)建獲得的載體稱為pCS2AhN、pCSm2AhN、pCSm2Ah-vpN和pCSm2Ah-spN(載體構(gòu)建示意圖見(jiàn)圖1，圖2，圖3和圖4)。

3、轉(zhuǎn)基因煙草的獲得

用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將構(gòu)建的pCS2AhN、pCSm2AhN、pCSm2Ah-vpN和pCSm2Ah-spN轉(zhuǎn)化煙草，轉(zhuǎn)化方法是常規(guī)的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化雙子葉植物方法，首先將煙草無(wú)菌苗的葉片切成大小0.4x0.6cm²的小塊，放在農(nóng)桿菌侵染液里10min，取出煙草葉片，用滅菌濾紙吸干菌液，放置到鋪有一層濾紙的MS培養(yǎng)基中，在黑暗中繼續(xù)共培養(yǎng)3d，3d后將煙草葉片移至MS篩選分化培養(yǎng)基(MS鹽+100mg/L卡那霉素+500mg/L Cab(羧芐青霉素)+2mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA(萘乙酸)+30g/L sugar(蔗糖)+7g/L agar(瓊脂),pH 5.8)兩周，經(jīng)過(guò)兩周的篩選，在葉片邊緣有綠色愈傷點(diǎn)出現(xiàn)，一周后愈傷點(diǎn)分化成小植株，在生根培養(yǎng)基生根。將生根狀態(tài)良好的植株在溫室煉苗1～2d后，移入營(yíng)養(yǎng)缽中，保濕，待苗子成活后移到大花盆生長(zhǎng)，獲得抗性植株。

4、轉(zhuǎn)基因植株P(guān)CR鑒定

提取轉(zhuǎn)化植株的基因組DNA，按照cry2Ah1原始基因以及mcry2Ah，mcry2Ah-vp，mcry2Ah-sp序列設(shè)計(jì)引物，cry2Ah1引物序列：cry2Ah1F：5’-TTTAATATTTCCTAG-3’，cry2Ah1R：5’-GTCGTGTTGCTTTGT-3’；mcry2Ah，mcry2Ah-vp，mcry2Ah-sp共用引物序列：mcry2AhF：5’-CCTCATCTTCCCGTC-3’，mcry2AhR：5’-GTGTTGCTCTGCTCG-3’，擴(kuò)增轉(zhuǎn)cry2Ah1基因和mcry2Ah1基因煙草獲得片段大小為1350bp，擴(kuò)增轉(zhuǎn)mcry2Ah1-vp基因和轉(zhuǎn)mcry2Ah1-sp基因煙草獲得片段大小為1353bp；

反應(yīng)體系為：

反應(yīng)條件：

94℃2min；94℃30s，54℃30s，72℃1min，30cycles；72℃10min，4℃pause。

PCR產(chǎn)物結(jié)果圖見(jiàn)圖5，6，7，8。

在轉(zhuǎn)cry2Ah1，mcry2Ah，mcry2Ah-vp，mcry2Ah-sp基因的煙草轉(zhuǎn)化中，分別獲得10株、29株、45株和62株轉(zhuǎn)化植株，經(jīng)過(guò)PCR檢測(cè)陽(yáng)性植株分別為4株、15株、28株、46株，陽(yáng)性率為40％、51.7％、62.2％和74.2％。

5、轉(zhuǎn)基因煙草的Southern blot檢測(cè)

選取部分轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株提取基因組DNA，HindIII完全酶切基因組DNA后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳并將DNA轉(zhuǎn)移至尼龍膜(N+)上。mcry2Ah表達(dá)盒(3.1Kb)為陽(yáng)性對(duì)照,非轉(zhuǎn)基因煙草基因組DNA為陰性對(duì)照，水為空白對(duì)照。檢測(cè)探針為mcry2Ah，mcry2Ah-vp，mcry2Ah-sp基因共有的一段862bp序列，通過(guò)PCR DIG Probe Synthesis Kit擴(kuò)增并標(biāo)記DIG-11-dUTP，擴(kuò)增引物序列：mcry2Ah-probe-F:5’-GAGTGGATGGAGTGGAAG-3’，mcry2Ah-probe-R為：5’-CGATGTTTGGGAAGGTCT-3’。Southern blot檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖9。

6、轉(zhuǎn)基因煙草的ELISA檢測(cè)

提取轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株葉片的可溶性蛋白，利用QuantiPlateTM Kit for Cry2A(Envirologix)對(duì)轉(zhuǎn)基因植株中的Cry2Ah1蛋白進(jìn)行定量。不同濃度梯度的純化Cry2Ah1蛋白繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。ELISA檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖10。

4株cry2Ah1轉(zhuǎn)基因煙草植株沒(méi)有檢測(cè)到Cry2Ah1蛋白表達(dá)，15株mcry2Ah轉(zhuǎn)基因煙草植株中有4株表達(dá)Cry2Ah1蛋白，Cry2Ah1蛋白表達(dá)量4.41-10.27μg/g鮮重,28株mcry2Ah-vp轉(zhuǎn)基因煙草植株中有8株表達(dá)Cry2Ah1蛋白，Cry2Ah1蛋白表達(dá)量8.32-36.35μg/g鮮重,46株mcry2Ah-sp轉(zhuǎn)基因煙草植株中有24株表達(dá)Cry2Ah1蛋白，Cry2Ah1蛋白表達(dá)量5.26-40.28μg/g鮮重(表1)。統(tǒng)計(jì)分析表明mcry2Ah-sp與mcry2Ah-vp轉(zhuǎn)基因煙草植株Cry2Ah1蛋白表達(dá)量差異不顯著，但兩者與mcry2Ah轉(zhuǎn)基因煙草植株Cry2Ah1蛋白表達(dá)量差異顯著，轉(zhuǎn)cry2Ah1原始基因煙草外源蛋白表達(dá)量低于可檢測(cè)到水平，說(shuō)明未進(jìn)行密碼子優(yōu)化的基因難以在植物中高表達(dá)外源蛋白。

7、轉(zhuǎn)基因煙草的qRT-PCR檢測(cè)

提取轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株葉片的總RNA，利用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。Actin基因?yàn)閮?nèi)參基因，引物序列為：actin-qF：GGCATCATACATTTTACAACGAA，actin-qR：ATGGCGACATACATAGCAGGAGT。mcry2Ah1，mcry2Ah1-vp，mcry2Ah1-sp基因共同的檢測(cè)引物為：mcry2Ah1-qF：AGGGCGTACATGGTGAGC，mcry2Ah1-qR：GGATGGGGGAGATGGTGA。

反應(yīng)體系為：

反應(yīng)條件：

94℃30s；94℃5s，60℃30s，40cycles；

qRT-PCR產(chǎn)物結(jié)果圖見(jiàn)圖11，轉(zhuǎn)基因煙草可以檢測(cè)到外源mcry2Ah1基因、mcry2Ah1-vp基因和mcry2Ah1-sp基因在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)。

8、轉(zhuǎn)基因煙草的抗蟲(chóng)性鑒定

選取敏感型或Cry1Ac抗性棉鈴蟲(chóng)初孵幼蟲(chóng)，用于轉(zhuǎn)基因植株與對(duì)照植株的離體葉片飼喂。每天統(tǒng)計(jì)幼蟲(chóng)的死亡數(shù)。發(fā)現(xiàn)飼喂3d后，轉(zhuǎn)基因植株對(duì)敏感型或Cry1Ac抗性棉鈴蟲(chóng)都表現(xiàn)出明顯的抗蟲(chóng)性，其葉片僅被取食幾個(gè)小孔后，幼蟲(chóng)成黑色中毒狀態(tài)死亡，少數(shù)未死亡幼蟲(chóng)，呈現(xiàn)一種僵化狀態(tài)，對(duì)葉片不再有損害(圖12，13)。而非轉(zhuǎn)基因植株(WT)和轉(zhuǎn)cry2Ah基因的植株葉片對(duì)敏感型或Cry1Ac抗性棉鈴蟲(chóng)完全沒(méi)有抗蟲(chóng)作用，其葉片被大量取食(圖12，13)。對(duì)4株轉(zhuǎn)mcry2Ah基因煙草用離體葉片飼喂敏感型或Cry1Ac抗性棉鈴蟲(chóng)，3d后敏感型或Cry1Ac抗性棉鈴蟲(chóng)校正死亡率為95.30-100％和90.84-100％。8株轉(zhuǎn)mcry2Ah-vp基因煙草用離體葉片飼喂敏感型或Cry1Ac抗性棉鈴蟲(chóng)，3d后敏感型或Cry1Ac抗性棉鈴蟲(chóng)校正死亡率為100％和92.09-100％。24株轉(zhuǎn)mcry2Ah-sp基因煙草用離體葉片飼喂敏感型或Cry1Ac抗性棉鈴蟲(chóng)，3d后敏感型或Cry1Ac抗性棉鈴蟲(chóng)校正死亡率為100％和96.34-100％(表1)。統(tǒng)計(jì)分析表明對(duì)于敏感型棉鈴蟲(chóng)而言，mcry2Ah，mcry2Ah-vp，mcry2Ah-sp轉(zhuǎn)基因煙草的抗蟲(chóng)性沒(méi)有顯著差異。對(duì)于Cry1Ac抗性棉鈴蟲(chóng)而言，mcry2Ah與mcry2Ah-sp轉(zhuǎn)基因煙草的抗蟲(chóng)性有顯著差別，mcry2Ah-sp抗蟲(chóng)性高于mcry2Ah；mcry2Ah-vp活性大于mcry2Ah，mcry2Ah-sp的抗蟲(chóng)活性高于mcry2Ah-vp，但在統(tǒng)計(jì)學(xué)上分析無(wú)顯著性差異。綜上所述mcry2Ah，mcry2Ah-vp，mcry2Ah-sp對(duì)敏感型或Cry1Ac抗性棉鈴蟲(chóng)都有明顯的抗蟲(chóng)性，其中mcry2Ah-sp對(duì)Cry1Ac抗性棉鈴蟲(chóng)的抗性最高，可以用于抗蟲(chóng)植物的培育及延緩害蟲(chóng)抗藥性的產(chǎn)生。

表1轉(zhuǎn)基因煙草Cry2Ah蛋白表達(dá)量和抗蟲(chóng)性統(tǒng)計(jì)結(jié)果

SEQUENCE LISTING

<110> 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所

<120> 人工合成的對(duì)鱗翅目害蟲(chóng)高毒力殺蟲(chóng)基因及應(yīng)用

<130> PP17022-SWJ

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1899

<212> DNA

<213> Bt cry2Ah1原始序列

<400> 1

atgaataatg tattgaatag cggaagagct actaatggtg atgcgtataa tgtagtggct 60

catgatccat ttagttttca acataaatca ttagatacca tacaagaaga atggatggag 120

tggaaaaaag ataatcatat tttatatgta gatcctattg ttggaactgt ggctagcttt 180

cttttaaaga aagtggggag tcttgttgaa aaaagaatat taagtgagtt acggaattta 240

atatttccta gtggcagtac aaatctaatg caagatattt taagagagac agaaaaattc 300

ctgaatcaaa gacttaatac agacactctt gcccgtgtaa atgcggaatt gacagggctg 360

caagcaaatg tagaagagtt taatcgacaa gtagataatt ttttgaaccc taaccgaaat 420

gctgttcctt tatcaataac ttcttcagtt aatacaatgc agcaattatt tctaaataga 480

ttaccccagt ttcagatgca aggataccaa ttgttattat tacctttatt tgcacaggca 540

gccaatttac atctttcttt tattagagat gttattctta atgcagatga atggggaatt 600

tcagcagcaa cattacgtac gtatcaaaat cacctgagaa attatacaag agagtactct 660

aattattgta taactacgta tcaaactgcg tttagaggtt taaacacccg tttacacgat 720

atgttagaat ttagaacata tatgttttta aatgtatttg aatatgtatc tatctggtcg 780

ttgtttaaat atcaaagcct tctagtatct tctggcgcta atttatatgc aagtggtagt 840

ggaccacagc agacccaatc atttacttca caagactggc catttttata ttctcttttc 900

caagttaatt caaattatgt gttaaatggc tttagtggcg ctagacttac gcagactttc 960

cctaatattg ttggtttacc tggtactact acaactcacg cattgcttgc tgcaagggtc 1020

aattacagtg gaggagtttc gtctggtgat ataggcgctg tgtttaatca aaattttagt 1080

tgtagtacat ttctcccacc tttgttaaca ccatttgtta gaagttggct agattcaggt 1140

tcagatcggg gggggattaa taccgttacc aattggcaaa cagaatcctt tgagacaact 1200

ttaggtttaa ggagtggtgc ttttacagct cgaggtaatt caaactattt cccagattat 1260

tttatccgta atatttctgg agttccttta gttgttagaa atgaagattt aagaagaccg 1320

ttacactata atcaaataag aaatatagaa agtccttcag gaacacctgg tggattacga 1380

gcttatatgg tatctgtgca taacagaaaa aataatatct atgccgttca tgaaaatggt 1440

actatgattc atttagcgcc ggaagattat acaggattta ctatatcgcc gatacatgca 1500

actcaagtga ataatcaaac gcgaacattt atttctgaaa aatttggaaa tcaaggtgat 1560

tccttaagat ttgaacaaag caacacgaca gctcgttata cccttagagg gaatggaaat 1620

agttacaatc tttatttaag agtatcttca ataggaaatt ccactattcg agttactata 1680

aacggtagag tttatactgc ttcaaatgtt aatactacta caaataacga tggagttaat 1740

gataatggag ctcgtttttc agatattaat atcggtaatg tagtagcaag tgataatact 1800

aatgtaccgt tagatataaa tgtgacatta aattcgggta ctcaatttga gcttatgaat 1860

attatgtttg ttccaactaa tcttccacca ctttattaa 1899

<210> 2

<211> 1899

<212> DNA

<213> 人工改造的mcry2Ah序列

<400> 2

atgaacaacg tcctcaacag cggcagggct acgaacggcg acgcgtacaa cgtggtcgcc 60

cacgacccct tctccttcca gcacaagagc ctcgacacca tccaggagga gtggatggag 120

tggaagaagg acaaccacat cctctacgtg gacccgatcg tgggcaccgt cgcctccttc 180

ctcctgaaga aggtcggcag cctcgtcgag aagcgcatcc tctccgagct gaggaacctc 240

atcttcccgt ccggcagcac gaacctcatg caggacatcc tgcgcgagac cgagaagttc 300

ctgaaccagc gcctcaacac ggacaccctg gctagggtca acgctgagct gaccggcctc 360

caggctaacg tcgaggagtt caaccgccag gtggacaact tcctcaaccc gaacaggaac 420

gccgtccccc tgtccatcac gtccagcgtg aacaccatgc agcagctctt cctgaacagg 480

ctcccccagt tccagatgca gggctaccag ctcctgctcc tgccactgtt cgctcaggct 540

gcgaacctcc acctgtcctt catccgcgac gtgatcctga acgctgacga gtggggcatc 600

agcgctgcta cgctcaggac ctaccagaac cacctgcgca actacacgag ggagtactcc 660

aactactgca tcaccacgta ccagacggcg ttccgcggcc tgaacaccag gctccacgac 720

atgctggagt tccgcaccta catgttcctc aacgtgttcg agtatgtgtc catctggagc 780

ctgttcaagt accagagcct cctggtctcc agcggcgcca acctctacgc ttccggcagc 840

ggcccacagc agacgcagtc cttcaccagc caggactggc cgttcctgta ctccctcttc 900

caggtgaaca gcaactacgt cctcaacggc ttctccggcg ctaggctgac gcagaccttc 960

ccaaacatcg tgggcctgcc aggcaccacg accacgcacg cgctcctggc tgctagggtg 1020

aactactccg gcggcgtctc cagcggcgac atcggcgctg tgttcaacca gaacttctcc 1080

tgcagcacgt tcctcccacc actcctgacc ccattcgtcc gcagctggct ggactccggc 1140

agcgacaggg gcggcatcaa cacggtgacc aactggcaga cggagagctt cgagaccacg 1200

ctcggcctgc gctccggcgc cttcaccgcg aggggcaaca gcaactactt cccggactac 1260

ttcatccgca acatctccgg cgtgcccctc gtggtcagga acgaggacct ccgcaggccg 1320

ctgcactaca accagatcag gaacatcgag tccccaagcg gcaccccagg cggcctcagg 1380

gcgtacatgg tgagcgtcca taacaggaag aacaacatct acgcggtcca cgagaacggc 1440

acgatgatcc acctggcccc ggaggactac acgggcttca ccatctcccc catccacgcg 1500

acccaggtga acaaccagac gcgcaccttc atcagcgaga agttcggcaa ccagggcgac 1560

tccctcaggt tcgagcagag caacaccacg gctaggtaca ccctgagggg caacggcaac 1620

tcctacaacc tctacctgcg cgtctccagc atcggcaaca gcacgatccg cgtgaccatc 1680

aacggcaggg tctacaccgc ctccaacgtg aacaccacga ccaacaacga cggcgtgaac 1740

gacaacggcg cgaggttctc cgacatcaac atcggcaacg tggtcgccag cgacaacacg 1800

aacgtccccc tcgacatcaa cgtgacgctg aacagcggca cccagttcga gctgatgaac 1860

atcatgttcg tgccgaccaa cctgccgccc ctctactga 1899

<210> 3

<211> 1902

<212> DNA

<213> 人工改造的mcry2Ah-vp序列

<400> 3