專利名稱：對鱗翅目昆蟲高毒力的Bt cry1Ah基因及其表達產物的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物防治技術領域。進一步，本發(fā)明涉及對鱗翅目害蟲具有高毒力的Btcry1Ah基因及其一種部分核苷酸序列和由該基因及其部分序列所編碼的蛋白質及多肽。
本發(fā)明的研究背景蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis，簡稱Bt)是一種革藍氏陽性產芽孢土壤細菌，廣泛分布于土壤、蟲尸、植物根圍、糧倉塵埃等區(qū)域。眾所周知，它在芽孢形成期能產生蛋白性質的晶體，對鱗翅目、鞘翅目、雙翅目、膜翅目、食毛目、同翅目等昆蟲，甚至線蟲等動物均具有毒殺活性，而對人類、高等動物、植物等非靶標生物安全無害，已被廣泛地應用于農業(yè)、林業(yè)、衛(wèi)生害蟲的防治。
1981年，Schnepf和Whiteley等克隆了第一個Bt殺蟲蛋白基因cry1Aa，于1985年完成了核苷酸序列分析，該基因對鱗翅目害蟲具有活性。隨后，對鞘翅目、雙翅目等害蟲有活性的菌株和基因相繼被發(fā)現和分離克隆(Krieg，A.et al，J.Appli.Entomology，1983，96500-508；Ward，E.S.，andD J.Ellar.1986.J.Mol.Biol.1911-11.Herrnstadt，C.et al，Gene，1987，57(1)37-46；Payne，J.，K.E.Narva，and J.Fu.December 1996.U.S.Patent 5,589,382.)。隨著生物技術的突飛猛進，Bt轉基因工程菌和抗蟲植物的商業(yè)化取得巨大成功，各國均加大投入，以期獲得新的高毒力、新活性的Bt菌株和基因。截止到2004年10月底，全球共發(fā)現和公布了323種Bt殺蟲蛋白基因(可參見http//www.biols.susx.ac.uk/home/Neil Crickmore/Bt/list.html)。
1996年全世界第一例轉基因抗蟲植物在美國獲準應用，它所使用的基因主要部分就是來自Bt cry1Ac。在接下來的幾年里，轉cry1Ab基因的抗蟲玉米、轉cry3Aa基因的抗蟲土豆等GMO相繼問世，截止到2003年底，在美國抗蟲棉種植面積占總棉花種植的73％，玉米占到40％(Clive James，International Service for the Acquisition ofAgri-Biotech Application，preview，No.30，2003)。在中國，自1998年開始正式推廣含有cry1Ac/1Ab基因的抗蟲棉以來，累計種植已達9千萬畝，僅2004年種植面積就高達3700萬畝。在我國獲準商業(yè)化的還有轉基因抗蟲楊樹，它所使用的基因與抗蟲棉幾乎相同。與此同時，國內相關研究單位正在進行環(huán)境釋放的抗蟲轉基因植物有水稻(cry1Ac/1Ab或者cry1Ab)、玉米(cry1Ac/Ab)。但無論是已商品化還是處于研究評價階段的抗蟲工程植物所用的基因都具有種類單一的缺點，因此如果大面積推廣這些抗蟲作物將存在害蟲避難所減少、抗藥性上升過快的風險。解決這一問題的有效方法是尋找新的高毒力基因或基因組合作為新的替代和補充。美國孟山都公司的第二代抗蟲棉就采用了對棉鈴蟲高毒的cry2Ab基因進行組合(Bruce E.Tabashnik et al.，APPLIEDAND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY，Aug.2002，p.3790-3794；Nicholas，D.et al，Transgenic Plant and Insect Pests Biocontrol，John Wiley & Sons Press，USA，1997，1-18)。
因此，篩選分離克隆新的、高毒力的Bt殺蟲蛋白基因，將能豐富殺蟲基因資源，為轉基因工程菌和抗蟲植物的研制提供新的基因來源，提高Bt轉基因產品的抗蟲效果，并有望降低害蟲對Bt毒蛋白的抗性風險，避免新的生態(tài)災難降臨，具有重要的經濟、社會和生態(tài)效益。
本發(fā)明的內容本發(fā)明的目的針對目前世界上防治鱗翅目害蟲所使用的Bt制劑以及轉基因產品基因品種單一、害蟲易于產生抗性、殺蟲譜較窄和毒力較低等不足，本發(fā)明從國內Bt菌株中分離克隆了新的基因cry1Ah，該基因表達產物對多種鱗翅目害蟲毒力顯著強于目前已知的Cry蛋白。這種新的基因可以應用于轉化微生物和植物，使之表現對相關害蟲的高毒性，并克服、延緩害蟲對工程菌和轉基因植物抗藥性的產生。
本發(fā)明的技術方案1.出發(fā)菌株Bt BT8菌株中cry基因的鑒定采用Kuo(Kuo and Chak，Appl.Environ.Micro.1996，6280-86)和宋福平的PCR-RFLP鑒定體系對國內Bt分離株(宋福平、張杰、黃大昉等，《中國農業(yè)科學》，1998，第31卷，第3期，第13-18頁)進行cry基因分析，發(fā)現該菌株中存在cry1Aa、cry1Ba cry2Aa、cry2Ab等已知基因，同時發(fā)現了一種尚不能定名的新基因cry1X。
2.BT8菌株中cry1Ah基因的克隆采用快速克隆方法對該菌株中的新cry基因進行分離克隆。
按照Narva(Narva，K.E.et al，EP0462721 A2，1991，8)等的方法從Bt BT8菌株(該菌株來自于中國農業(yè)科學院植物保護研究所生物技術實驗室，可向公眾提供)中提取質粒DNA，用Sau3AI酶部分消化質粒DNA，從凝膠中回收4-7kb DNA片段，純化后與經BamHI消化、堿性磷酸酶處理的pUCP18載體進行連接(Schweizer HP，Gene，1991 Jan2；97(1)109-21.)，轉化大腸桿菌JM107(購自美國NEBiolab公司，32 Tozer Road Beverly，MA01915-5599，USA)后，用cry1基因通用引物K5un2/K3un2對能在抗生素Amp上正常生長的陽性轉化子進行PCR擴增鑒定，篩選含有Bt cry基因的陽性轉化子。引物分別為正向引物(Forward primer)TCCTGCAGTTGACTTCAAATAGG；反向引物(Reverse primer)CAGTCGACTCATCCGATAAACACGCCAC’通過附圖6所示的程序及條件對pHT59進行亞克隆。對篩選得到的重組質粒pHT59，進行DNA序列分析，結果表明該質粒含有cry1Ah基因全長DNA片段。該基因全序列如SEQ ID NO 1所示，共含有3549bp；由其編碼的蛋白質的氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示，該蛋白質共由1182個氨基酸組成，分子量為134kDa，等電點為pI 4.985。Btδ--內毒素基因國際命名委員會把該基因命名為cry1Ah1。
3.穿梭表達載體的構建根據cry1Ah1全長基因3549bp的核苷酸序列設計一對引物，并在引物5’端加上限制性酶位點，用于基因與表達載體的連接，引物序列如下正向引物5’CGGGATCCATGAAAAACAGTATCAA 3’BamHI反向引物5’ACGCGTCGACCTATTCCTCCATAAGGAG 3’SalI3549bp的PCR產物經BamHI、SalI消化后克隆于含有Bt復制子的Bt-E.coli穿梭質粒pSXY422(7.3kb)。該質粒由pUC18改造而成，加入了Bt質粒的復制子、Bt cry基因營養(yǎng)期表達啟動子Pcry3Aa和來自pET21b質粒的多克隆位點，成為穿梭表達載體(該質粒來自于中國農業(yè)科學院植物保護研究所生物技術實驗室，可向公眾提供)。所獲得的重組表達載體質粒命名為pSXY422-1Ah。采用Lereclus等轉化方法(Lereclus，D.et al，FEMSMicrobiology Letters，1989，60211-217)，利用pSXY422-1Ah轉化Bt無晶體突變株HD73--(該菌株來自于中國農業(yè)科學院植物保護研究所生物技術實驗室，可向公眾提供)。對能在紅霉素抗性平板上生長出的陽性轉化子進行多種分子檢測，證明轉化成功。將該轉化子命名為工程菌Biot1Ah。該菌能在Bt無晶體突變株HD73-穩(wěn)定遺傳，穩(wěn)定性大于90％。
4.工程菌的培養(yǎng)和觀察采用GT培養(yǎng)基(配方為液體GT每升中加入10ml 0.8％CaCl2，10ml G-Tris鹽(0.025％FeSO4.7H2O，0.05％CuSO4.5H2O，0.05％ZnSO4.7H2O，0.5％MnSO4.H2O，2.0％MgSO4)，10ml20％(NH4)2SO4，10ml 5％ K2HPO4，10ml 20％葡萄糖，50ml 1M Tris-HCl，pH7.5，1.5g酵母提取物，pH7.4；固體GT在液體GT中加入1.3％瓊脂)、1/2 LB培養(yǎng)基(配方為液體LBTryptone 1％，酵母提取物0.5％，NaCl 1％，pH7.0；固體LB在液體培養(yǎng)基中加1.3％瓊脂)分別培養(yǎng)Biot1Ah工程菌，用電子掃描顯微鏡和光學顯微鏡觀察結果。結果顯示在Biot1Ah中存在雙錐體形晶體，證明該基因正常表達。
5.cry1Ah1基因5’-端活性區(qū)確定和表達研究根據其它cry1A基因活性區(qū)大于1.8kb的情況，設計引物B.2001bp部分基因引物正向引物5’CGGGATCCATGAAAAACAGTATCAA 3’BamHI反向引物5’ ACGCGTCGACTGATCAATATGATAATCCG 3’SalI把2001bp的PCR產物經BamHI、SalI消化后克隆于E.coli表達載體pET21(購自于美國Novagen Inc，601 Science Drive Madison，Wi 53711)，把所獲得的重組表達載體質粒命名為pET1Ah-2。利用pET1Ah-2轉化大腸桿菌BL21(DE3)(Dubendorff，J.W.and Studier，F.W.1991，J.Mol.Biol.219，45-59.)，經過IPTG誘導表達了75kD的多肽。
6.殺蟲生物活性測定利用的鱗翅目害蟲包括小菜蛾(Plutella xylostella)為二齡幼蟲；棉鈴蟲(Helicoverpaarmigera)、亞洲玉米螟(Ostrina furnacalis)、水稻二化螟(Chilo supperssalis)為一齡幼蟲。上述測試昆蟲為標準實驗室飼養(yǎng)種群。
還有大豆食心蟲(Leguminivora glycinivorella)在自然種植的大豆田中誘捕成蟲，室內產卵孵化的1～2幼蟲。
以不同濃度的Bt毒蛋白為樣品進行單獨測試和組合測試，時間4-7天。實驗數據按標準進行相關處理。
本發(fā)明的有益效果本發(fā)明分離克隆的Bt cry1Ah基因和其一種部分序列及其它們的基因表達產物能夠對鱗翅目害蟲產生強毒力，這種毒力強于目前國際上發(fā)現的同類自然菌株的基因。通過cry1Ah基因與cry1Ab、cry1Ba、cry2Ab等基因表達產物組合，可擴大對鱗翅目、鞘翅目、雙翅目害蟲的殺蟲譜。通過應用于轉化微生物和植物，使它們表現出對相關害蟲的毒性，可克服或延緩昆蟲對工程菌和轉基因植物抗藥性的產生。


圖1為BT8 cry1型基因的PCR擴增產物及RFLP。
其中M代表pUC DNA混合Marker(1116，883，692，501，489，404，331，242，190，147，111，110bps)，1為Kun3引物PCR擴增產物1.4kb，2為1/PstI and EcoRI酶切，3為4/PstI andXbaI酶切，4為Kun2引物擴增產物1.6kb。
圖2為含有目的基因的重組質粒pHT59 PCR-RFLP鑒定。
其中M代表pUC DNA混合Marker，1為Kun2引物擴增產物/PstI+XbaI，2為Kun3引物擴增產物/PstI+EcoRI。
圖3為pHT59單酶切分析。
其中1、2、3、4、5、6和M分別代表pHT59/EcoRI、HindIII、KpnI、PstI、SacI、XbaI和λDNA/Ecol30I marker(19.1，7.7，6.2，4.2，3.4，2.7，1.9，1.5，0.9，0.4kb)。
圖4為pHT59質粒雙酶切分析。
其中1、2、3、4、5、6、7和M分別代表pHT59/EcoRI and XbaI、pHT59/EcoRI and KpnI、pHT59/EcoRI and HindIII、pHT59/EcoRI and PstI、pHT59/EcoRI and SacI、pHT59/SacIand PstI、pHT59質粒和λDNA/EcoO130I marker。
圖5亞克隆質粒pHT59-32、pHT59-15、pHT59-22的酶切分析。
其中1、2代表pHT59-15/HindIII，3、4代表pHT59-32/HindIII，5、6代表pHT59-22/HindIII，M為λDNA/EcoO130I marker。
圖6為cry1Ah基因/pHT59的亞克隆流程圖。
圖7為cry1Ah全長基因穿梭表達載體pSXY422-1Ah酶切分析。
其中1、2為cry1Ah全長基因PCR擴增產物，3為穿梭載體pSXY422/BamHI and SalI，4為pSXY422-1Ah/BamHI and SalI，M代表λDNA/EcoO130I marker。
圖8為cry1Ah基因2.0kb片段PCR擴增檢測。
其中1、2為E.coli表達載體pET21b/BamHI and SalI，3、4代表cry1Ah基因5’端2.0kb片段PCR擴增產物，M代表λDNA/EcoO130I marker。
圖9為含有cry1Ah基因2.0kb片段重組質粒pET1Ah-2酶切分析。
其中1、M分別代表pET1Ah-2/BamHI and SalI和λDNA/EcoO130I marker。
圖10為cry1Ah基因2.0kb片段在E.coli中表達產物SDS-PAGE檢測。
其中1、2代表表達細胞形成的包含體蛋白組分，3為可溶性蛋白組分，4為陰性對照菌(BL21pET21b)，M代表分子量marker(212，116，97，66，40kD)。
圖11為不同培養(yǎng)時間BT8中各種cry基因的表達。
其中12、18、24、30、36分別代表細菌培養(yǎng)時間(小時)，M代表分子量marker(212，116，97，66，40kD)。
圖12為不同培養(yǎng)時間工程菌Biot1Ah中cry1Ah基因的表達。
其中18、24、30、36、48分別代表細菌培養(yǎng)時間(小時)，M代表分子量marker(212，116，97，66，40kD)。
圖13為Cry1Ah蛋白晶體(工程菌Biot1Ah)的掃描電鏡結果。
圖14為cry1Ah全長基因與其它cry1類基因核苷酸序列同源進化樹。
圖15為cry1Ah 2.0kb基因與其它cry1類基因相同長度核苷酸序列同源進化樹。
圖16為Cry1Ah蛋白與其它Cry1類蛋白全長氨基酸序列同源進化樹。
圖17為Cry1Ah蛋白與其它Cry1類蛋白N-末端667個氨基酸序列同源進化比較。
本發(fā)明的具體實施方案以下敘述本發(fā)明的實施例。應該說明的是，本發(fā)明的實施例對于本發(fā)明只有說明作用，而沒有限制作用。
實施例1、BT8菌株的基因型鑒定按照Narva(Narva，K.E.et al，EP0462721 A2，1991)的方法從Bt菌株BT8中提取質粒DNA。以B-8-G菌株質粒DNA為模板，用cry1的3’端引物(K5un2和K3un2)、5’端引物(K5un3和K3un3)進行PCR擴增，PCR循環(huán)參數分別為94℃1分鐘，54℃1分鐘，72℃3分鐘，32個循環(huán)，72℃延伸10分鐘。分別獲得了cry1型基因3’端的1.6kb、5’端的1.4kb兩種片段PCR產物，該DNA片段經過氯仿抽提純化后進行限制性內切酶消化反應，37℃1-2小時，瓊脂糖凝膠電泳分析酶切片段的多態(tài)性(附圖1)。分析結果(見表1)表明BT8菌株含有cry1Aa，cry1Ba，cry2Aa，cry2Ab和一個未知的新的cry1基因(cry2基因結果從略)。
表1 BT8菌株cry1型基因的PCR擴增產物和限制性酶切長度多態(tài)性基因 PCR擴增產物(K5un3/K3un3)(bp) EcoRI和PstI酶切片段(bp)cry1Aa1463 726，493，244cry1BaNPcry1Ax1460 940，520基因 PCR擴增產物(K5un2/K3un2)(bp) XbaI和PstI酶切片段(bp)cry1Aa1635 1117，518cry1Ba1686 1015，655，16cry1？1630 780 540 310實施例2、BT8菌株新基因的克隆經鑒定BT8菌株中含有一個未知的新的cry1基因，采用以下方法進行分離克隆。BT8質粒經Sau3AI部分酶切，回收4-7kb片段，與BamHI酶切的載體pUCP19連接轉化JM107，經PCR擴增和RFLP分析(附圖2)獲得含有BT8菌株新cry1型基因的陽性轉化子ETG59，把重組質粒命名為pHT59。
依據已有的cry1類基因的酶切圖譜分析，選擇EcoRI、HindIII、KpnI、PstI、SacI、XbaI等分別對pTG59進行單一酶切分析(附圖3)，結果表明pHT59上克隆的外源片段為6.9kb。經過EcoRI和XbaI、EcoRI和KpnI、EcoRI和HindIII、EcoRI和PstI、EcoRI和SacI、SacI和PstI雙酶切分析(附圖4)，構建了該基因大片段的物理圖譜。根據多種酶切分析結果選擇HindIII酶切片段進行亞克隆，pHT59經HindIII完全消化為6.7kb(2.2kb和pUCP19 4.5kb)、3.2kb、1.5kb三個片段，分別將3.2kb、1.5kb與HindIII酶切的pBlueScriptSK+連接，6.7kb片段自連，轉化大腸桿菌，經質粒酶切分析篩選獲得了三個亞克隆，所含重組質粒命名為pHT59-32、pHT59-15、pHT59-22(附圖5)。附圖6為此亞克隆流程圖。
對三個亞克隆進行序列測定，再與其它cry1基因進行同源序列比較，表明該基因為全長新基因。該基因編碼區(qū)3549bps(SEQ ID NO 1)，編碼1182個氨基酸的蛋白(SEQ ID NO2)，分子量為134kDa，等電點為pH4.985。該基因由Btδ內毒素基因國際命名委員會命名為cry1Ah1。
實施例3、cru1Ah全長基因穿梭載體的構建為了便于克隆和表達，根據cry1Ah1基因編碼區(qū)全長核苷酸序列，設計了一對分別含有BamHI和SalI酶切位點的特異性引物。PCR擴增條件為94℃1分鐘，54℃1分鐘，72℃3分鐘，32個循環(huán)，72℃延伸10分鐘，采用高保真性能的pfu聚合酶進行擴增。獲得了3.5kbcry1Ah全長片段，如附圖7中A的第1、2樣品所示。經BamHI和SalI雙酶切完全反應后，進行電泳，從凝膠中回收該片段，與經同樣的酶切處理的Bt-E.coli穿梭表達載體pSXY422進行連接反應，12℃12小時；取連接產物2μL轉化E.coli受體菌JM110，以Amp抗性平板篩選陽性重組質粒。將所獲得的陽性重組質粒分別接種于液體LB試管中，37℃230rpm培養(yǎng)12小時，以常用的堿解法提取質粒，分別進行BamHI和SalI的單、雙酶切反應，通過凝膠電泳鑒別得到含有cry1Ah基因全長片段3.5kb的重組表達克隆pSXY422-1Ah，附圖7中B為雙酶切檢測結果，其中3號為pSXY422空載體，4號為pSXY422-1Ah。
實施例4、Bt工程菌Biot1Ah的構建將來自JM110的重組表達克隆pSXY422-1Ah用電激方法轉化E.coli甲基化突變株SCS110，電激條件為2500V，400Ω，25μF，100μL感受態(tài)細胞，1μL質粒DNA。37℃溫浴1小時，100rpm；從SCS110中提取去甲基化的pSXY422-1Ah質粒。
制備Bt無晶體突變株HD-73-感受態(tài)，用電激轉化方法將去甲基化的pSXY422-1Ah質粒導入其中。電激條件2200V，1000Ω，25μF，100μL感受態(tài)細胞，1μL質粒DNA。30℃溫浴2小時，100rpm；以25μg/mL Ery(紅霉素)平板篩選陽性轉化子。經過提取質粒、酶切分析、PCR擴增等分子檢測，獲得了含有pSXY422-1Ah表達質粒的Bt陽性轉化子，將該轉化子命名為工程菌Biot1A。
實施例5、Bt工程菌Biot1Ah的培養(yǎng)、觀察和檢測活化工程菌Biot1Ah(30℃，12小時)；1％接種于1LGT培養(yǎng)基中，加入紅霉素，終濃度為25μg/mL，30℃，230rpm，振蕩培養(yǎng)20～48小時；在培養(yǎng)期間，每隔6小時取1mL培養(yǎng)液，進行蛋白表達的時空研究；同時培養(yǎng)出發(fā)菌株BT8，作為參照。取少量培養(yǎng)物進行光學顯微鏡檢測，觀察細胞裂解、芽孢的釋放和晶體的形成。待40％的營養(yǎng)體細胞裂解時，停止培養(yǎng)，離心收集菌體，加入100mL 1M NaCl/10mM Tris·Cl(pH7.5)溶液洗滌2次，無菌水洗滌3次，以除去發(fā)酵次生代謝物和鹽分，4℃，6,000rpm，離心10分鐘(這些培養(yǎng)物可以-20℃保存?zhèn)溆?。取上述胞晶混合物進行掃描電鏡的觀察和記錄。結果(附圖13)顯示，cry1Ah基因在Bt無晶體突變株HD-73-中能正常表達，形成cry1基因所特有的雙錐體型晶體。
取上述胞晶混合物20mg，懸浮于100μL水中，加入25μL0.5N NaOH，25℃作用5分鐘；加入65μL 3×樣品緩沖液，100℃煮沸5分鐘，離心去除沉淀；分別進行SDS-PAGE電泳檢測，結果如附圖11和12所示。圖11表明在出發(fā)菌株BT8中，130kD左右的蛋白自18小時能夠被檢測到，至36小時均能穩(wěn)定存在和積累，晶體數量相應較多。而在工程菌Biot1Ah中，自24小時以后可以檢測到134kDa的Cry1Ah蛋白(圖12)，并隨著培養(yǎng)時間延長而不斷積累，能形成相當數量的穩(wěn)定的雙錐體狀晶體(圖13)，與天然菌株相同。連續(xù)繼代和稀釋涂板測定，結果表明工程菌遺傳穩(wěn)定性在98％以上。
實施例6、cry1Ah基因活性區(qū)2.0kb片段克隆、表達與檢測克隆根據cryAh1基因從5’-段其始密碼子ATG至2001bp處核苷酸序列，設計了一對分別含有BamHI和SalI酶切位點的特異性引物。PCR擴增條件為94℃1分鐘，54℃ 1分鐘，72℃2分鐘，30個循環(huán)，72℃延伸10分鐘，反應用酶為pfu聚合酶。擴增獲得2.0kbcry1Ah活性區(qū)片段(見附圖8中第3、4樣品)，經BamHI和SalI雙酶切完全反應后，進行電泳，從凝膠中回收該片段，與經同樣的酶切處理的E.coli表達載體pET21b進行連接反應，18℃4小時，取連接產物2μL轉化E.coli受體菌BL21，以Amp抗性平板篩選陽性重組質粒。將所獲得的陽性重組質粒接種于LB試管中37℃ 230rpm培養(yǎng)12小時，提取質粒，分別進行BamHI和SalI的單、雙酶切反應，得到含有cry1Ah基因2.0kb片段的陽性克隆pET1Ah2，附圖9為雙酶切檢測結果。
誘導表達活化陽性克隆BL21(pET1Ah2)(37℃，12小時)；1％接種于1L LB培養(yǎng)基中，37℃，230rpm，振蕩培養(yǎng)至OD600為0.5～0.8，(約2小時)；加入誘導物IPTG，終濃度為0.7mM，150rpm，20℃低溫誘導18小時；離心收集菌體，加入50mL 10mM Tris·Cl(pH8.0)懸??；超聲波破碎細胞壁(B.Braun U Labsonic，230V，T間隔＝0.5sec)，處理10分鐘，反應控制在0℃；4℃，12,000rpm，離心10分鐘；收集上清及沉淀，分別進行SDS-PAGE電泳檢測。
SDS-PAGE電泳對上述蛋白樣品的處理取100μL上清液，或包涵體沉淀懸浮于100μL 10mM Tris·Cl緩沖液中，分別加入50μL 3x樣品緩沖液(25μL上樣緩沖液+75μLβ-巰基乙醇)，100℃煮沸5分鐘，離心除去沉淀；將樣品依次加入濃縮膠中，4℃下電泳；完成染色、脫色和凝膠掃描和數據記錄分析。在Cry1Ah活性區(qū)2.0kb表達產物為75kD，與預測結果一致。cry1Ah基因2001kb的部分核苷酸序列如SEQ ID NO 3，其編碼的多肽即Cry1Ah的一半共667個氨基酸的序列如SEQ ID NO 4所示。
實施例7、Cry1Ah對幾種害蟲毒力測定1.小菜蛾采用甘藍葉片稱重后浸葉法，取100g新鮮葉片，Cry1Ah全長蛋白按不同樣品稀釋濃度浸葉10秒，取出后室溫自然涼干，置于廣口瓶中，每瓶接2齡幼蟲20頭，25℃，每日光∶暗為12∶12小時，設Cry1Ac等不同的Bt Cry蛋白作為對照，96小時調查結果。
2.棉鈴蟲、亞洲玉米螟、水稻二化螟生測采用一齡幼蟲，將Cry1Ah全長蛋白樣品按預試驗結果設計適宜的濃度梯度，按10g人工飼料/mL蛋白樣品比例均勻混合，分裝于指形管、24孔板等器皿中25～26℃培養(yǎng)，96、120、168小時分別調查，計算LC50。
3.大豆食心蟲將在田間捕到的三千頭成蟲(雌雄比接近1∶1)放入事先罩好網的大豆田(已接莢)內飼養(yǎng)，讓其自然產卵，待孵化后1～2幼蟲即用于生測。
以不同濃度的Bt Cry1Ah全長蛋白為樣品進行測試。將青豆在稀釋好的待測樣品浸濕10秒鐘，晾干，放入剝開的豆莢中，然后把該豆莢謝謝生測瓶中，每瓶接蟲20頭，每個處理重復3次，25℃培養(yǎng)24、48、96小時調查大豆食心蟲死亡數。計算死亡率、校正死亡率。
Cry1Ah全長蛋白生物活性測定結果詳見表2-表5。
表2 Cry1Ah蛋白對小菜蛾(Plutella.Xylostella)二齡幼蟲殺蟲活性濃度 正 LC50樣品 試蟲數 蟲數 ％ug/ml ％ ug/mlCK 60 2 3.3312.8 60 59 98.3398.276.4 60 55 91.6791.381.393.2 60 46 76.6775.87Cry1Ah(1.15-1.67)1.6 60 29 48.3346.550.8 60 18 30 27.590.4 60 11 18.3315.52表3 Cry1Ah蛋白對棉鈴蟲(Helicoverpa armigera)一齡幼蟲殺蟲活性濃度 蟲 正 LC50樣品 試蟲ug/ml 數 ％ ％ ug/mlCK 48 0 0.004548 33 68.75 68.7512.8 48 28 58.33 58.336.066.4 48 23 47.92 47.92Cry1Ah (3.99-11.94)2.56 48 19 39.58 39.581.6 48 14 29.17 29.170.8 48 11 22.92 22.92表4 Cry1Ah蛋白對二化螟(Chilo supperssalis)一齡幼蟲殺蟲活性正濃度 LC50樣品 試蟲 蟲數g/g ％ g/g％CK 502 4.00205048 96.00 95.83105042 84.00 83.330.9045 5038 76.00 75.00Cry1Ah (0.142-1.922)2 5036 72.00 70.831 5031 62.00 60.420.5 5015 30.00 27.08表5 Cry1Ah蛋白對玉米螟(Ostrina furnacalis)一齡幼蟲殺蟲活性濃度蟲數 正 LC50樣品 濃度 試蟲ug/g％％ ug/gCK 144 9 6.25 0.05012Cry1Ah 18144 144 100.00100.00 (0.024-0.096)5 144 143 99.31 99.261 144 139 96.53 96.30
0.1 144 9364.5862.220.01 144 4531.2526.670.005144 106.94 0.74根據上述各表結果可知，Cry1Ah對小菜蛾、棉鈴蟲、亞洲玉米螟、水稻二化螟均具有顯著的殺蟲活性，對四種測試害蟲的LC50數值分別低于幾種已知的高毒力Bt殺蟲蛋白。目前國際上所發(fā)現的對這四種害蟲毒力最高的Bt Cry蛋白分別為小菜蛾，Cry1Ac(LC50＝1.85μg/ml)；棉鈴蟲，Cry1Ac(LC50＝12.26μg/ml；亞洲玉米螟，Cry1Ac(LC50＝0.134μg/g)；水稻二化螟Cry1Ab(LC50＝1.81μg/g)。
由此可知本發(fā)明的Cry1Ah的毒力均強于這幾種已知的殺蟲蛋白。
以上結果均為Cry1Ah全長蛋白134kDa組分殺蟲活性。
對于Cry1Ah活性區(qū)的研究表明，自起始密碼子ATG至200lbp(如SEQ ID NO 3所示)共667個氨基酸的多肽片段(75kDa)(如SEQ ID NO 4所示)同樣具有高毒力，是活性必需區(qū)段，對大豆食心蟲、小菜蛾、棉鈴蟲和二化螟的毒殺作用與全長的Cry1Ah蛋白相當。此片段完全能用于抗蟲轉基因植物的構建。
實施例8、cry1Ah全長基因和2.0kb片段與其它Bt cry1基因同源性比較同源比較的結果分別如下表6、7、8、9所示表6 cry1Ah全長基因與其它Bt cry1A基因同源性比較

表7 cry1Ah基因2kb片段與其它Bt cry1A基因同源性比較

表8 Cry1Ah全長蛋白與其它Bt Cry1A蛋白同源性比較

表9 Cry1Ah 75kDa多肽與其它Bt Cry1A多肽同源性比較

同源比較結果表明，cry1Ah全長基因和2kb片段與cry1Ac全長基因核苷酸同源性最高，達到84％(表6，7)；Cry1Ah蛋白與Cry1Ac蛋白氨基酸同源性為86％(見表8)；而Cry1Ah74kDa多肽與Cry1Ac蛋白氨基酸同源性則為82％(見表9)，與其它Cry1A蛋白的同源性均低于此值，例如與Cry1Ab同源性為67％，與Cry1Aa同源性為59％。
附圖14-圖17分別為cry1Ah全長基因與其它cry1類基因核苷酸序列、cry1Ah 2.0kb基因與其它cry1類基因相同長度核苷酸序列、Cry1Ah蛋白與其它Cry1類蛋白全長氨基酸序列、Cry1Ah蛋白與其它Cry1類蛋白N-末端667個氨基酸序列的同源進化樹。無論是從核苷酸序列還是從氨基酸序列的分析比對，也無論是全長還是半長，cry1Ah(Cry1Ah)與cry1Ac(Cry1Ac)、cry1Ab(Cry1Ab)、cry1Ae(Cry1Ae)、cry1Ad(Cry1Ad)和cry1Af(Cry1Af)的遺傳距離較近；但是在生物活性上卻相差較大。
因此可得知，若選用cry1Ah半長基因(2001kb，SEQ ID NO 3)作為轉基因抗蟲植物的研制材料，能夠更為有效地克服目前基因同源性高、種類單一的問題，同時可望獲得抗蟲性能更好的工程植物。
附本發(fā)明所涉及的DNA序列和蛋白質序列SEQ ID NO 1(cry1Ah基因的核苷酸序列)atgaaaaaca gtatcaaatt atcagaactt tggtatttca atgaaagaaa atggaggtat 60tttatggaga tagtgaataa tcagaatcaa tgcgtgcctt ataattgttt gaataatccc120gaaatcgaaa tattagaagg cggaagaata tcagttggta ataccccaat tgatatttct180ctttcgctta ctcagtttct tttgagtgaa tttgtcccag gtgcggggtt tgtattagga240ttaattgatt taatatgggg atttgtaggt ccttcccaat gggacgcatt tcttgctcaa300gtggaacagt taattaacca aagaatagca gaagctgtaa gaaatacagc aattcaggaa360ttagagggaa tggcacgggt ttatagaacc tatgctactg cttttgctga gtgggaaaaa420gctcctgatg acccagagct aagagaagca ctacgtacac aatttacagc aactgagact480tatataagtg gaagaatatc cgttttaaaa attcaaactt ttgaagtaca gctgttatca540gtgtttgccc aagctgcaaa tttacattta tctttattaa gagacgttgt gttttttggg600caaagatggg gtttttcaac gacaaccgta aataattact acaatgattt aacagaaggg660attagtacct atacagatta tgctgtacgc tggtacaata cgggattaga acgtgtatgg720ggaccggatt ctagagattg ggtaaggtat aatcaattta gaagagaatt aacactaact780gtattagata tcgttgctct gttcccgaat tatgatagta gaagatatcc aattcgaaca840gtttcccaat taacaagaga aatttataca aacccagtat tagaaaattt tgatggtagt900tttcgaggct cggctcaggg catagaaaga agtattagga gtccacattt gatggatata960cttaacagta taaccatcta tacggatgct cataggggtt attattattg gtcagggcat 1020caaataatgg cttctcctgt cggtttttcg gggccagaat tcacgtttcc gctatatgga 1080accatgggaa atgcagctcc acaacaacgt attgttgctc aactaggtca gggcgtgtat 1140agaacattat cctctacttt ttatagaaga ccttttaata tagggataaa taatcaacaa 1200ctatctgttc ttgacgggac agaatttgct tatggaacct cctcaaattt gccatccgct 1260gtatacagaa aaagcggaac ggtagattcg ctggatgaaa taccaccaca gaataacaac 1320gtgccaccta ggcaaggatt tagtcatcga ttaagccatg tttcaatgtt tcgttcaggc 1380tctagtagta gtgtaagtat aataagagct cctatgttct cttggataca tcgtagtgct 1440gaatttaata atataattgc atcggatagt attactcaaa tccctgcagt gaagggaaac 1500tttcttttta atggttctgt aatttcagga ccaggattta ctggtgggga cttagttaga 1560ttaaatagta gtggaaataa cattcagaat agagggtata ttgaagttcc aattcacttc 1620ccatcgacat ctaccagata tcgagttcgt gtacggtatg cttctgtaac cccgattcac 1680ctcaacgtta attggggtaa ttcatccatt ttttccaata cagtaccagc tacagctacg 1740tcattagata atctacaatc aagtgatttt ggttattttg aaagtgccaa tgcttttaca 1800tcttcattag gtaatatagt aggtgttaga aattttagtg ggactgcagg agtgataata 1860gacagatttg aatttattcc agttactgca acactcgagg ctgaatataa tctggaaaga 1920gcgcagaagg cggtgaatgc gctgtttacg tctacaaacc aactagggct aaaaacaaat 1980gtaacggatt atcatattga tcaagtgtcc aatttagtta cgtgtttatc ggatgaattt 2040tgtctggatg aaaagcgaga attgtccgag aaagtcaaac atgcgaagcg actcagtgat 2100gaacgcaatt tactccaaga ttcaaatttc aaagacatta ataggcaacc agaacgtggg 2160tggggcggaa gtacagggat taccatccaa ggagtggatg acgtatttaa agaaaattac 2220gtcacactat caggtacctt tgatgagtgc tatccaacat atttgtatca aaaaatcgat 2280gaatcaaaat taaaagcctt tacccgttat caattaagag ggtacatcga agatagtcaa 2340gatttagaag tttatttgat ccgttacaat gcaaaacacg aaacgttaaa cgtgccaggt 2400
acgggttcct tatggccact tgcagttaaa agtccaattg gaaggtgcgg tgaaccgaat2460cgatgtgcac atcattccca tcatttctcc ttggacattg atgtaggatg tacagactta2520aatgaggatt taggcgtatg ggtgatattc aagattaaga cacaagatgg ccatgcgaaa2580ataggaaatc tagaatttct cgaagagaag cttttattag gagaagcatt agcacgtgtg2640aagaaagcgg agaaaaaatg gagagacaaa cgcgaaaaat tggaatggga aacaaatatt2700gtttataaag aggcaaaaga atctgtagat gctttattcg tagattctca atataataga2760ttacaaacgg atacgaacat tgcgatgatt catgcggcag ataaacgcgt tcatcgaatc2820cgagaagcgt atttgccaga gttatctgtg attccgggtg tcaatgcggc tattttcgaa2880gaattagaag gtcttatttt caccgcattc tccctatatg atgcgagaaa tgtcattaaa2940aacggagatt tcaattatgg tttatcatgc tggaatgtga aagggcatgt agatgtagaa3000gaacaaaaca accaccgttc cgtccttgtt atcccagaat gggaagcaga agtgtcccaa3060gaagttcgtg tctgtccagg tcgtggctat atccttcgtg ttacagcgta caaagaggga3120tatggagagg gctgcgtaac gatccatgag atcgaagaca atacagacga actgaaattc3180agcaactgtg tagaagagga agtatatcca aacaacacgg taacgtgtaa tgattatact3240gcgactcaag aagaatatga gggtacgtac acttctcgta atcgaggata tgacggagcc3300tatgaaagca attcttctgt accagctgat tatgcatcag cctatgaaga aaaagcgtat3360acagatggac gaagagacaa tccttgtgaa tctaacagag gatataggga ttacacacca3420ctaccagctg gctatgtgac aaaagaatta gagtacttcc cagaaaccga taaggtatgg3480attgagatcg gagaaacgga aggaacattc attgtggata gcgtggaatt actccttatg3540gaggaatag3549SEQ ID NO 2(cry1Ah基因編碼的蛋白質序列)MKNSIKLSEL WYFNERKWRY FMEIVNNQNQ CVPYNCLNNP EIEILEGGRI SVGNTPIDIS 60LSLTQFLLSE FVPGAGFVLG LIDLIWGFVG PSQWDAFLAQ VEQLINQRIA EAVRNTAIQE120LEGMARVYRT YATAFAEWEK APDDPELREA LRTQFTATET YISGRISVLK IQTFEVQLLS180VFAQAANLHL SLLRDVVFFG QRWGFSTTTV NNYYNDLTEG ISTYTDYAVR WYNTGLERVW240GPDSRDWVRY NQFRRELTLT VLDIVALFPN YDSRRYPIRT VSQLTREIYT NPVLENFDGS300FRGSAQGIER SIRSPHLMDI LNSITIYTDA HRGYYYWSGH QIMASPVGFS GPEFTFPLYG360TMGNAAPQQR IVAQLGQGVY RTLSSTFYRR PFNIGINNQQ LSVLDGTEFA YGTSSNLPSA420VYRKSGTVDS LDEIPPQNNN VPPRQGFSHR LSHVSMFRSG SSSSVSIIRA PMFSWIHRSA480EFNNIIASDS ITQIPAVKGN FLFNGSVISG PGFTGGDLVR LNSSGNNIQN RGYIEVPIHF540PSTSTRYRVR VRYASVTPIH LNVNWGNSSI FSNTVPATAT SLDNLQSSDF GYFESANAFT600SSLGNIVGVR NFSGTAGVII DRFEFIPVTA TLEAEYNLER AQKAVNALFT STNQLGLKTN660VTDYHIDQVS NLVTCLSDEF CLDEKRELSE KVKHAKRLSD ERNLLQDSNF KDINRQPERG720WGGSTGITIQ GVDDVFKENY VTLSGTFDEC YPTYLYQKID ESKLKAFTRY QLRGYIEDSQ780DLEVYLIRYN AKHETLNVPG TGSLWPLAVK SPIGRCGEPN RCAHHSHHFS LDIDVGCTDL840NEDLGVWVIF KIKTQDGHAK IGNLEFLEEK LLLGEALARV KKAEKKWRDK REKLEWETNI900VYKEAKESVD ALFVDSQYNR LQTDTNIAMI HAADKRVHRI REAYLPELSV IPGVNAAIFE960ELEGLIFTAF SLYDARNVIK NGDFNYGLSC WNVKGHVDVE EQNNHRSVLV IPEWEAEVSQ1020EVRVCPGRGY ILRVTAYKEG YGEGCVTIHE IEDNTDELKF SNCVEEEVYP NNTVTCNDYT1080ATQEEYEGTY TSRNRGYDGA YESNSSVPAD YASAYEEKAY TDGRRDNPCE SNRGYRDYTP1140LPAGYVTKEL EYFPETDKVW IEIGETEGTF IVDSVELLLM EE 1182SEQ ID NO 3(cry1Ah2k基因核苷酸序列)
atgaaaaaca gtatcaaatt atcagaactt tggtatttca atgaaagaaa atggaggtat 60tttatggaga tagtgaataa tcagaatcaa tgcgtgcctt ataattgttt gaataatccc120gaaatcgaaa tattagaagg cggaagaata tcagttggta ataccccaat tgatatttct180ctttcgctta ctcagtttct tttgagtgaa tttgtcccag gtgcggggtt tgtattagga240ttaattgatt taatatgggg atttgtaggt ccttcccaat gggacgcatt tcttgctcaa300gtggaacagt taattaacca aagaatagca gaagctgtaa gaaatacagc aattcaggaa360ttagagggaa tggcacgggt ttatagaacc tatgctactg cttttgctga gtgggaaaaa420gctcctgatg acccagagct aagagaagca ctacgtacac aatttacagc aactgagact480tatataagtg gaagaatatc cgttttaaaa attcaaactt ttgaagtaca gctgttatca540gtgtttgccc aagctgcaaa tttacattta tctttattaa gagacgttgt gttttttggg600caaagatggg gtttttcaac gacaaccgta aataattact acaatgattt aacagaaggg660attagtacct atacagatta tgctgtacgc tggtacaata cgggattaga acgtgtatgg720ggaccggatt ctagagattg ggtaaggtat aatcaattta gaagagaatt aacactaact780gtattagata tcgttgctct gttcccgaat tatgatagta gaagatatcc aattcgaaca840gtttcccaat taacaagaga aatttataca aacccagtat tagaaaattt tgatggtagt900tttcgaggct cggctcaggg catagaaaga agtattagga gtccacattt gatggatata960cttaacagta taaccatcta tacggatgct cataggggtt attattattg gtcagggcat 1020caaataatgg cttctcctgt cggtttttcg gggccagaat tcacgtttcc gctatatgga 1080accatgggaa atgcagctcc acaacaacgt attgttgctc aactaggtca gggcgtgtat 1140agaacattat cctctacttt ttatagaaga ccttttaata tagggataaa taatcaacaa 1200ctatctgttc ttgacgggac agaatttgct tatggaacct cctcaaattt gccatccgct 1260gtatacagaa aaagcggaac ggtagattcg ctggatgaaa taccaccaca gaataacaac 1320gtgccaccta ggcaaggatt tagtcatcga ttaagccatg tttcaatgtt tcgttcaggc 1380tctagtagta gtgtaagtat aataagagct cctatgttct cttggataca tcgtagtgct 1440gaatttaata atataattgc atcggatagt attactcaaa tccctgcagt gaagggaaac 1500tttcttttta atggttctgt aatttcagga ccaggattta ctggtgggga cttagttaga 1560ttaaatagta gtggaaataa cattcagaat agagggtata ttgaagttcc aattcacttc 1620ccatcgacat ctaccagata tcgagttcgt gtacggtatg cttctgtaac cccgattcac 1680ctcaacgtta attggggtaa ttcatccatt ttttccaata cagtaccagc tacagctacg 1740tcattagata atctacaatc aagtgatttt ggttattttg aaagtgccaa tgcttttaca 1800tcttcattag gtaatatagt aggtgttaga aattttagtg ggactgcagg agtgataata 1860gacagatttg aatttattcc agttactgca acactcgagg ctgaatataa tctggaaaga 1920gcgcagaagg cggtgaatgc gctgtttacg tctacaaacc aactagggct aaaaacaaat 1980gtaacggatt atcatattga t 2001SEQ ID NO4(crylAh2kb基因編碼的蛋白的氨基酸序列)MKNSIKLSEL WYFNERKWRY FMEIVNNQNQ CVPYNCLNNP EIEILEGGRI SVGNTPIDIS 60LSLTQFLLSE FVPGAGFVLG LIDLIWGFVG PSQWDAFLAQ VEQLINQRIA EAVRNTAIQE120LEGMARVYRT YATAFAEWEK APDDPELREA LRTQFTATET YISGRISVLK IQTFEVQLLS180VFAQAANLHL SLLRDVVFFG QRWGFSTTTV NNYYNDLTEG ISTYTDYAVR WYNTGLERVW240GPDSRDWVRY NQFRRELTLT VLDIVALFPN YDSRRYPIRT VSQLTREIYT NPVLENFDGS300FRGSAQGIER SIRSPHLMDI LNSITIYTDA HRGYYYWSGH QIMASPVGFS GPEFTFPLYG360TMGNAAPQQR IVAQLGQGVY RTLSSTFYRR PFNIGINNQQ LSVLDGTEFA YGTSSNLPSA420
VYRKSGTVDS LDEIPPQNNN VPPRQGFSHR LSHVSMFRSG SSSSVSIIRA PMFSWIHRSA480EFNNIIASDS ITQIPAVKGN FLFNGSVISG PGFTGGDLVR LNSSGNNIQN RGYIEVPIHF540PSTSTRYRVR VRYASVTPIH LNVNWGNSSI FSNTVPATAT SLDNLQSSDF GYFESANAFT600SSLGNIVGVR NFSGTAGVII DRFEFIPVTA TLEAEYNLER AQKAVNALFT STNQLGLKTN660VTDYHID 66權利要求
1.一種對昆蟲具有毒性的Bt crylAh基因，其特征是該基因具有SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列。
2.一種對昆蟲具有毒性的蛋白質，其特征是該蛋白質是由權利要求1的基因所編碼，且具有SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列。
3.一種權利要求1的Bt crylAh基因的部分序列，其特征是該部分序列具有SEQ ID NO3所示的核苷酸序列。
4.一種對昆蟲具有毒性的多肽，其特征是該多肽是由權利要求3的部分序列所編碼，且具有SEQ ID NO 4所示的氨基酸序列。
5.一種轉化微生物或植物的方法，其特征是該方法應用權利要求1的crylAh基因。
6.權利要求5的方法在轉化微生物或植物使之表現出對昆蟲的毒性并克服或延緩昆蟲抗藥性產生中的應用。
7.一種轉化微生物或植物的方法，其特征是該方法應用權利要求3的crylAh基因的部分序列。
8.權利要求7的方法在轉化微生物或植物使之表現出對昆蟲的毒性并克服或延緩昆蟲抗藥性產生中的應用。
全文摘要
本發(fā)明為“對鱗翅目昆蟲高毒力的Bt crylAh基因”，屬于生物防治技術領域。本發(fā)明涉及對鱗翅目害蟲具有抗性的Bt crylAh基因及其一種部分序列和由該基因及其部分序列所編碼的蛋白質及多肽序列。進一步，本發(fā)明還涉及這些基因及其部分序列和由它們所編碼的蛋白質及多肽在鱗翅目害蟲生物防治中的應用。
文檔編號C07K14/32GK1614022SQ200410009918
公開日2005年5月11日 申請日期2004年12月1日 優(yōu)先權日2004年12月1日
發(fā)明者張 杰, 宋福平, 黃大昉, 何康來, 韓嵐嵐 申請人:中國農業(yè)科學院植物保護研究所