本申請(qǐng)涉及植物基因工程及作物育種技術(shù)領(lǐng)域。具體地說，本申請(qǐng)涉及改造抗鱗翅目害蟲的新基因及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

蘇云金芽胞桿菌(Bacillus thuringiensis)可以分泌毒蛋白，對(duì)鱗翅目、鞘翅目昆蟲(比如小菜蛾)有很強(qiáng)的殺傷作用。人類很早就研究利用Bt菌來殺滅害蟲，迄今有100多年的歷史。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展和基因克隆、DNA操作等技術(shù)的出現(xiàn)，人類開始從Bt菌中克隆其毒蛋白基因到工程菌中，制作生物農(nóng)藥。

Bt毒素主要分為內(nèi)毒素和外毒素。外毒素指細(xì)菌在生命活動(dòng)過程中排出體外的代謝物，包括α-外毒素、β-外毒素、γ-外毒素、不穩(wěn)定外毒素和水溶性外毒素等。內(nèi)毒素又稱δ-內(nèi)毒素、晶體毒素或殺蟲晶體蛋白伴胞晶體，由一種或多種殺蟲晶體蛋白組成。內(nèi)毒素在Bt對(duì)昆蟲的致死過程中起主要作用。本申請(qǐng)涉及的cry1Ca基因編碼的殺蟲蛋白屬于內(nèi)毒素，即殺蟲晶體蛋白。

許多Bt殺蟲晶體蛋白的氨基酸序列存在不同程度的同源性。1989年，Hofte和Whiteley根據(jù)Bt殺蟲晶體蛋白的殺蟲譜和氨基酸序列的同源性，將當(dāng)時(shí)發(fā)現(xiàn)的42個(gè)Bt基因分為五大類、十四個(gè)亞類(Hofte H and Whiteley HR，Microbio.Rev.,53:241-255)。其中，前四大類為晶體蛋白的基因家族cry，第五類為細(xì)胞溶解蛋白基因cyt。cry基因可劃分為四群，即cryI為鱗翅目特異性，cryⅡ?yàn)轺[翅目和雙翅目特異性，cryⅢ為鞘翅目特異性，cryIV為雙翅目特異性。由于當(dāng)時(shí)發(fā)現(xiàn)的基因數(shù)目少，彼此之間有明顯的差異，因此各個(gè)基因的分類地位比較明確，從而使得Hofte和Whiteley的分類系統(tǒng)被廣泛地接受和采用。本申請(qǐng)涉及的基因cry1C適用這個(gè)分類系統(tǒng)，屬于鱗翅目特異性殺蟲基因。

近年來，不斷發(fā)現(xiàn)的殺蟲晶體蛋白及其基因使得原先分類系統(tǒng)中的氨基酸序列與殺蟲活性間產(chǎn)生了不協(xié)調(diào)性，而且隨著新基因的發(fā)現(xiàn)，這種分類方法越來越不能滿足這兩個(gè)條件，使得分類難以確定。Crickmore等在1995年國際無脊椎動(dòng)物病理學(xué)會(huì)年會(huì)(SIP)上提出了以殺蟲晶體蛋白氨基酸序列的同源性為唯一依據(jù)區(qū)別Bt基因的新分類系統(tǒng)，現(xiàn)已被各國廣泛采納。具體來說，殺蟲晶體蛋白氨基酸同源性在45％以下，為第一等級(jí)，用阿拉伯?dāng)?shù)字表示；同源性在45％～78％之間，為第二等級(jí)，用大寫英文字母表示；同源性在78％～95％之間，為第三等級(jí)，用小寫英文字母表示；同源性在95％以上，為第四等級(jí)，用阿拉伯?dāng)?shù)字表示。例如本申請(qǐng)涉及的cry1Ca5為第四等級(jí)。

Obukowics等學(xué)者在1986年將cryIA(b)基因經(jīng)轉(zhuǎn)座子Tn5介導(dǎo)引入到植物的假單孢桿菌中，使植物具有抗蟲性，從而創(chuàng)造了第一代Bt轉(zhuǎn)基因抗蟲植物，這也是Bt毒蛋白基因使植物獲得抗蟲性的最早報(bào)道。真正的Bt毒蛋白轉(zhuǎn)基因植物是第二代Bt抗蟲植物，第一個(gè)成功的例子是由比利時(shí)的植物遺傳系統(tǒng)公司在1987年6月報(bào)道的(Vaeck等，Nature，328:33-37，1987)，他們用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法成功地將完整的cryIA(b)基因和3’、5’端缺失后只保留5’端編碼毒蛋白核心區(qū)的不同長度的cryIA(b)基因?qū)霟煵莴@得了抗煙草天蛾的轉(zhuǎn)基因煙草植株。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

在一方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┝朔蛛x的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子包含SEQ ID NO:1所示核苷酸序列，或其互補(bǔ)序列。本申請(qǐng)還提供了與SEQ ID NO:1具有至少70％同一性的序列。在一實(shí)施方案中，本申請(qǐng)?zhí)峁┝伺c該基因具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％序列同一性的序列。在一實(shí)施方案中，所述核酸分子包含SEQ ID NO:1所示核苷酸序列。在一實(shí)施方案中，所述核酸分子由SEQ ID NO:1所示核苷酸序列組成。

在又一方面，本申請(qǐng)涉及表達(dá)盒，其特征在于，包含上述分離的核酸分子。在一實(shí)施方案中，所述核酸分子與35S啟動(dòng)子和nos終止子可操作地連接。

在又一方面，本申請(qǐng)涉及表達(dá)載體，其包含上述表達(dá)盒。在一實(shí)施方案中，所述表達(dá)載體還包含PolyA序列和omega增強(qiáng)子。

在又一方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┝怂拗骷?xì)胞，其特征在于，包含上述表達(dá)載體。在一實(shí)施方案中，所述宿主細(xì)胞為植物細(xì)胞或原核生物細(xì)胞。在一實(shí)施方案中，所述宿主細(xì)胞為大腸桿菌或農(nóng)桿菌細(xì)胞。

在又一方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┝水a(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物的方法，其特征在于，用上述表達(dá)載體或宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)化植物，得到轉(zhuǎn)基因植物。在一實(shí)施方案中，所述植物為單子葉植物。在一實(shí)施方案中，所述植物選自：玉米、水稻、小麥、燕麥、大麥、青稞、粟、高粱和甘蔗。

在又一方面，本申請(qǐng)還涉及轉(zhuǎn)基因植物，其包括穩(wěn)定整合進(jìn)其基因組的表達(dá)盒，其特征在于，所述表達(dá)盒包含編碼抗鱗翅目害蟲基因的核酸分子，所述核酸分子包含SEQ ID NO:1所示核苷酸序列或與SEQ ID NO:1具有至少70％序列同一性的核苷酸序列，或以上的互補(bǔ)序列。在一實(shí)施方案中，本申請(qǐng)?zhí)峁┝伺c該基因具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％序列同一性的序列。在一些實(shí)施方案中，所述核酸分子包含SEQ ID NO:1所示核苷酸序列或所述核酸分子由SEQ ID NO:1所示核苷酸序列組成。在一些實(shí)施方案中，所述植物為單子葉植物。在一些實(shí)施方案中，所述植物選自：玉米、水稻、小麥、燕麥、大麥、粟、高粱和甘蔗。在一實(shí)施方案中，本申請(qǐng)還涉及該植物的器官、組織、細(xì)胞及通過由所述植物產(chǎn)生的加工品，如食物、飼料等。

在又一方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┝水a(chǎn)生轉(zhuǎn)基因種子的方法，其特征在于，從上述轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因種子。本申請(qǐng)還提供了通過該方法產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因種子。

在又一方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┝丝刂器[翅目害蟲群體的方法，包括使所述鱗翅目害蟲群體進(jìn)食通過上述方法獲得的轉(zhuǎn)基因植物。在一實(shí)施方案中所述植物為單子葉植物。在一實(shí)施方案中，所述植物選自：玉米、水稻、小麥、燕麥、大麥、粟、高粱和甘蔗。在一實(shí)施方案中，所述植物為玉米。在一實(shí)施方案中，所述鱗翅目害蟲為歐洲玉米螟(Pyrausta nubilalis)或亞洲玉米螟(Ostrinia furnacalis)。本申請(qǐng)還提 供了殺死鱗翅目害蟲的方法，包括向所述鱗翅目害蟲喂食殺蟲有效量的通過上述方法獲得的轉(zhuǎn)基因植物。

在又一方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┝藴p輕鱗翅目害蟲對(duì)植物的傷害的方法，包括將表達(dá)載體穩(wěn)定整合進(jìn)植物的基因組，其特征在于，所述表達(dá)載體包含編碼抗鱗翅目害蟲基因的核酸分子，所述核酸分子包含SEQ ID NO:1所示核苷酸序列或與SEQ ID NO:1具有至少90％序列同一性的核苷酸序列，或以上的互補(bǔ)序列。在一實(shí)施方案中，所述核酸分子包含SEQ ID NO:1所示核苷酸序列。在一實(shí)施方案中，所述核酸分子由SEQ ID NO:1所示核苷酸序列組成。

在又一方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┝撕Y選抗鱗翅目害蟲基因的方法，其特征在于，包括以下步驟：

以殺蟲蛋白氨基酸序列為模板，根據(jù)單子葉植物密碼子偏好性改造獲得G+C含量高、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的基因序列；

設(shè)計(jì)高效穩(wěn)定表達(dá)基因的載體表達(dá)盒，構(gòu)建表達(dá)載體；

用所述表達(dá)載體轉(zhuǎn)化單子葉植物，獲得轉(zhuǎn)基因植物并鑒定轉(zhuǎn)基因事件；

挑選低拷貝轉(zhuǎn)基因植物事件，利用鱗翅目害蟲進(jìn)行殺蟲活性生物測定。

在一實(shí)施方案中，該方法還包括對(duì)比不同抗蟲基因的抗蟲效果或驗(yàn)證改造后基因的抗蟲效果。

在一實(shí)施方案中，所述殺蟲蛋白由cry1Ca5編碼。

本申請(qǐng)具有以下一種或多種優(yōu)勢：1、所提供的人工基因、含有該基因的表達(dá)盒、包含該基因的表達(dá)載體、包含所述基因的宿主細(xì)胞、用該基因轉(zhuǎn)化的植物在植物育種方面有廣泛的用途；2、本申請(qǐng)?zhí)峁┝丝刂器[翅目害蟲的方法；3、本申請(qǐng)為大規(guī)模培育抗蟲性強(qiáng)的優(yōu)良品系提供了基因基礎(chǔ)和技術(shù)平臺(tái)；4、本申請(qǐng)的方法可用于抗蟲化學(xué)制劑的開發(fā)與應(yīng)用。

附圖說明

圖1為單子葉植物密碼子使用偏好性歸納圖

圖2為載體P35s-cry1CgerZm-Tnos區(qū)域示意圖，其長度為2990bp，P35s為35S啟動(dòng)子，T-nos為nos終止子。

圖3為實(shí)時(shí)PCR檢測示例示意圖：內(nèi)參基因標(biāo)識(shí)玉米內(nèi)參IVR(單拷貝)擴(kuò)增曲線，目標(biāo)基因標(biāo)識(shí)cry1CgerZm基因擴(kuò)增曲線，骨架標(biāo)識(shí)ORI片段擴(kuò)增曲線

具體實(shí)施方式

除非另有所指，核酸以5’至3’方向從左向右書寫；氨基酸序列以氨基至羧基方向從左向右書寫。氨基酸在本文可以用其通常所知的三字母符號(hào)或IUPAC-IUB生物化學(xué)命名委員會(huì)推薦的單字母符號(hào)來表示。同樣地，可以用通常接受的單字母碼表示核苷酸。

數(shù)字范圍包括限定該范圍的數(shù)字。

如本文所用，“核酸”包括涉及單鏈或雙鏈形式的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸多聚物，并且除非另有限制，包括具有天然核苷酸基本性質(zhì)的已知類似物(例如，肽核酸)，所述類似物以與天然存在的核苷酸類似的方式與單鏈核酸雜交。

如本文所用，術(shù)語“編碼”或“所編碼的”用于特定核酸的上下文時(shí)，指該核酸包含指導(dǎo)該核苷酸序列翻譯成特定蛋白的必需信息。使用密碼子表示編碼蛋白的信息。如本文所用，涉及特定多核苷酸或其所編碼的蛋白的“全長序列”指具有天然(非合成)內(nèi)源序列的整個(gè)核酸序列或整個(gè)氨基酸序列。全長多核苷酸編碼該特定蛋白的全長、催化活性形式。

本文可互換地使用術(shù)語“多肽”、“肽”和“蛋白”，以指氨基酸殘基的多聚物。該術(shù)語用于氨基酸多聚物，其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基是相應(yīng)天然存在的氨基酸的人工化學(xué)類似物。該術(shù)語還用于天然存在的氨基酸多聚物。

本文可互換地使用術(shù)語“殘基”或“氨基酸殘基”或“氨基酸”，以指被并入蛋白、多肽或肽(統(tǒng)稱“蛋白”)的氨基酸。氨基酸可以是天然存在的氨基酸，并且除非另有限制，可以包括天然氨基酸的已知類似物，所述類似物可以以與天然存在的氨基酸相似的方式起作用。

如本文所用，可以互換地使用術(shù)語“分離的”和“純化的”，以涉及核酸或多肽或其生物學(xué)活性部分，其基本上或本質(zhì)上不含如在其天然存在的環(huán)境中所發(fā)現(xiàn)的通常伴隨或反應(yīng)于該核酸或多肽的組分。因而，用重組技術(shù)產(chǎn)生分離的或純化的核酸或多肽時(shí)，分離的或純化的核酸或多肽基本上不含其它細(xì)胞物質(zhì)或培養(yǎng)基，或者化學(xué)合成分離的或純化的核酸或多肽時(shí)，基本上不含化學(xué)前體或其它化學(xué)品。

“分離的”核酸通常不含在該核酸所衍生自的生物體的基因組DNA中天然側(cè)翼于該核酸(即位于該核酸5’和3’端的序列)的序列(諸如，例如編碼蛋白的序列)。例如，在各種實(shí)施方案中，所分離的核酸可以包含在該核酸所衍生自的細(xì)胞的基因組DNA中天然側(cè)翼于該核酸的少于約5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb或0.1kb的核苷酸序列。

貫穿申請(qǐng)文件，將詞語“包括”、“包含”或其變體理解成提示包含所稱元素、整數(shù)或步驟，或者元素、整數(shù)或步驟的組，而非排除任何其它元素、整數(shù)或步驟，或者元素、整數(shù)或步驟的組。

如本文所用，術(shù)語“影響蟲害”指對(duì)任何發(fā)育階段的昆蟲進(jìn)食、生長和/或行為的有影響的改變，包括但不限于殺滅昆蟲、延遲生長、阻礙生殖能力、拒食素活性等等。

如本文所用，術(shù)語“殺蟲活性”是指生物體或物質(zhì)(諸如，例如蛋白)的活性，其測量可以通過但不限于害蟲死亡率、害蟲體重減少、害蟲驅(qū)避性以及進(jìn)食和暴露適當(dāng)長時(shí)間后害蟲的其它行為和物理變化。因而，具有殺蟲活性的生物體或物質(zhì)不利地影響至少一種可測量的害蟲健康參數(shù)。例如，“殺蟲蛋白”是自身顯示或與其它蛋白組合顯示殺蟲活性的蛋白。

如本文所用，術(shù)語“殺蟲有效量”指存在于害蟲環(huán)境的具有殺蟲活性的物質(zhì)或生物體的量。類似地，當(dāng)害蟲是昆蟲時(shí)，“殺昆蟲有效量”可以用于指“殺蟲有效量”。

應(yīng)理解如本文所用，術(shù)語“轉(zhuǎn)基因的”包括基因型已通過異源核酸的存在而被改變的任何細(xì)胞、細(xì)胞系、愈傷組織、組織、植物部分或者植物，包括最初如此改變的那些轉(zhuǎn)基因，以及通過有性雜交或無性 繁殖從所述最初的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)生的那些。如本文所用，術(shù)語“轉(zhuǎn)基因的”不包括借助常規(guī)植物育種方法或者借助天然發(fā)生的事件對(duì)基因組(染色體或染色體外)的改變，所述天然發(fā)生的事件諸如隨機(jī)異花受精、非重組病毒感染、非重組細(xì)菌轉(zhuǎn)化、非重組轉(zhuǎn)座或者自發(fā)突變。

“受試植物”或“受試植物細(xì)胞”是指遺傳改造已經(jīng)生效的植物或植物細(xì)胞，或者如此改造的植物或細(xì)胞的子代細(xì)胞，該子代細(xì)胞包含所述改造。“對(duì)照”或“對(duì)照植物”或“對(duì)照植物細(xì)胞”提供用于測量受試植物或植物細(xì)胞表型改變的參考點(diǎn)。

對(duì)照植物或植物細(xì)胞可以包括，例如：(a)野生型植物或細(xì)胞，即與遺傳改造起始材料具有相同基因型的植物或細(xì)胞，所述遺傳改造產(chǎn)生受試植物或細(xì)胞；(b)與所述起始材料具有相同基因型但已用空構(gòu)建體(即用對(duì)目的性狀無已知效果的構(gòu)建體，諸如包含標(biāo)志物基因的構(gòu)建體)轉(zhuǎn)化的植物或植物細(xì)胞；(c)是受試植物或植物細(xì)胞的非轉(zhuǎn)化分離子的植物或植物細(xì)胞；(d)與所述受試植物或植物細(xì)胞在遺傳上一致但未暴露于會(huì)誘導(dǎo)目的基因表達(dá)的條件或刺激物的植物或植物細(xì)胞；或(e)受試植物或植物細(xì)胞自身，其處于目的基因不被表達(dá)的條件下。

本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)容易地認(rèn)同，諸如位點(diǎn)特異性誘變和隨機(jī)誘變、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法和蛋白工程化技術(shù)的分子生物學(xué)領(lǐng)域的進(jìn)步提供了廣泛的適當(dāng)?shù)墓ぞ吆筒僮鞑襟E，以用于改造或者工程化農(nóng)業(yè)上感興趣的蛋白的氨基酸序列和潛在的基因序列。

在一些實(shí)施方案中，可以對(duì)本申請(qǐng)的核苷酸序列進(jìn)行改變，以進(jìn)行保守氨基酸替換。保守氨基酸替換的原則和實(shí)例在下文中進(jìn)一步描述。在某些實(shí)施方案中，可以依照?qǐng)D1中公開的單子葉密碼子偏好性對(duì)本申請(qǐng)的核苷酸序列進(jìn)行不改變氨基酸序列的替換，例如可以用單子葉植物偏好的密碼子替換編碼同一氨基酸序列的密碼子，而不改變?cè)摵塑账嵝蛄兴幋a的氨基酸序列。

本申請(qǐng)還涉及對(duì)SEQ ID NO:1進(jìn)一步優(yōu)化所得的核苷酸序列。該方法的更多細(xì)節(jié)描述于Murray等人(1989)Nucleic Acids Res.17:477-498。優(yōu)化核苷酸序列可用于提高殺蟲蛋白在植物中的表達(dá)，所述植物例如單子葉植物，例如禾本科植物，例如玉米(Zea mays)。 如本文所用，術(shù)語“突變核苷酸序列”或“突變”或“誘變的核苷酸序列”指經(jīng)誘變或改變而包含一個(gè)或多個(gè)核苷酸殘基(例如堿基對(duì))的核苷酸序列，所述核苷酸殘基不存在于相應(yīng)的野生型序列中。

在一些實(shí)施方案中，以編碼同一氨基酸序列的不同密碼子替換本申請(qǐng)中的部分核苷酸序列，從而在改變核苷酸序列的同時(shí)不改變其編碼的氨基酸序列。保守變體包括由于遺傳密碼子簡并性而編碼實(shí)施方案的殺蟲多肽中的一種的氨基酸序列的那些序列。在一些實(shí)施方案中，根據(jù)單子葉植物偏好密碼子替換本申請(qǐng)中的部分核苷酸序列。

在一些實(shí)施方案中，突變體核苷酸序列還包括衍生的核苷酸序列，諸如使用例如位點(diǎn)定向誘變而產(chǎn)生的仍編碼實(shí)施方案的殺蟲蛋白的那些，諸如突變體毒素。在一些實(shí)施方案中，突變體核苷酸序列包括一個(gè)或多個(gè)核酸殘基的添加、缺失或替換。在一些實(shí)施方案中，這樣的添加、移除或替換可以導(dǎo)致相應(yīng)的氨基酸殘基的添加、移除或替換。一般來講，實(shí)施方案的特定核苷酸序列的變體將與該特定核苷酸序列具有至少約70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列一致性。通過下文所述的序列比對(duì)程序確定序列一致性。實(shí)施方案的突變體核苷酸序列與本申請(qǐng)的序列的差異可以少至1-15個(gè)核苷酸、少至1-10個(gè)(例如6-10個(gè))，少至5個(gè)，少至4、3、2或甚至1個(gè)核苷酸。

在一些實(shí)施方案中，突變體核苷酸序列可以編碼具有改良的或降低的殺昆蟲活性的突變體蛋白。這樣的殺蟲活性相對(duì)天然蛋白可以是不同的或者是改良的，或者它可以是不變的，只要保留了殺蟲活性。突變體蛋白包括衍生自天然蛋白的多肽，所述衍生是通過缺失(所謂的截短)天然蛋白N末端和/或C末端的一個(gè)或多個(gè)氨基酸或?qū)⒁粋€(gè)或多個(gè)氨基酸添加至所述天然蛋白的N末端和/或C末端；在天然蛋白的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)缺失或添加一個(gè)或多個(gè)氨基酸；或者在天然蛋白的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)取代一個(gè)或多個(gè)氨基酸。

實(shí)施方案包括的突變體蛋白具有生物學(xué)活性，即它們繼續(xù)具有天然蛋白的所需的生物學(xué)活性，所述活性即本文所述的殺蟲活性。所述變體可以得自例如基因多態(tài)性或人類的操作。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)理解， 只要所編碼多肽保留殺蟲活性，任何有用的突變可以被添加至實(shí)施方案的序列。在一些實(shí)施方案中，突變體蛋白的氨基酸序列將與本申請(qǐng)的蛋白的氨基酸序列具有至少約60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列一致性。在一些實(shí)施方案中，突變體蛋白與本申請(qǐng)的蛋白的差異可以少至1-15個(gè)氨基酸殘基、少至1-10個(gè)(例如6-10個(gè))，少至5個(gè)，少至4、3、2或甚至1個(gè)氨基酸殘基。

在一些實(shí)施方案中，也可以突變序列，以致所編碼多肽對(duì)蛋白酶的蛋白水解消化具有抗性。突變可以保護(hù)該多肽免于蛋白酶降解，所述保護(hù)例如是通過從不同區(qū)域移除諸如推定的絲氨酸蛋白酶位點(diǎn)和彈性蛋白酶識(shí)別位點(diǎn)的推定的蛋白水解位點(diǎn)。可以移除或改造這些推定位點(diǎn)的一些或全部，以致原始位點(diǎn)位置的蛋白水解被降低?？梢酝ㄟ^比較突變體多肽和野生型毒素或者通過比較氨基酸序列各不相同的突變體毒素，來評(píng)價(jià)蛋白水解的變化。蛋白水解位點(diǎn)和推定的蛋白水解位點(diǎn)包括但不限于以下序列：胰蛋白酶切割位點(diǎn)、糜蛋白酶位點(diǎn)和胰蛋白酶位點(diǎn)。只要所述多肽的殺蟲活性被提高，可以通過添加或缺失任意數(shù)目和種類的氨基酸殘基來改造這些位點(diǎn)。因而，相對(duì)于天然序列或背景序列，由包含突變的核苷酸序列編碼的多肽將包含至少一個(gè)氨基酸改變或添加，或者2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、32、35、38、40、45、47、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300或更多個(gè)氨基酸改變或添加。

本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到氨基酸添加和/或取代通?；诎被醾?cè)鏈取代基的相對(duì)相似性，例如，所述取代基的疏水性、電荷、大小等等。具有各種前述所考慮性質(zhì)的示例性氨基酸取代基團(tuán)為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知，并且包括精氨酸與賴氨酸；谷氨酸和天門冬氨酸；絲氨酸和蘇氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；以及纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸。關(guān)于不影響目的蛋白生物學(xué)活性的適當(dāng)氨基酸取代的指南可以在Dayhoff等人(1978)Atlas of Protein Sequence and Structure(蛋白序列 和結(jié)構(gòu)圖集)(Natl.Biomed.Res.Found.,Washington,D.C)(通過引用并入本文)的模型中找到?？梢赃M(jìn)行諸如將一個(gè)氨基酸換作具有相似性質(zhì)的另一個(gè)氨基酸的保守性取代。

當(dāng)在進(jìn)行取代、缺失或插入前，難以預(yù)測其確切效果時(shí)，本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解所述效果將通過諸如昆蟲進(jìn)食分析的常規(guī)篩選分析來評(píng)價(jià)。參見，例如，通過引用并入本文的Marrone等人(1985)J.Econ.Entomol.78:290-293和Czapla and Lang(1990)J.Econ.Entomol.83:2480-2485。

在一些實(shí)施方案中，可以在實(shí)施方案的核苷酸序列和其它已知的Cry核苷酸序列的對(duì)應(yīng)部分之間重組全長編碼序列、編碼目的結(jié)構(gòu)域的序列基序或者實(shí)施方案的核苷酸序列的任意片段，從而獲得具有改良性質(zhì)的新基因。

受到關(guān)注的性質(zhì)包括但不限于每單位殺蟲蛋白的殺蟲活性、蛋白穩(wěn)定性、對(duì)非靶物種、特別是對(duì)人類、家畜以及表達(dá)實(shí)施方案的殺蟲多肽的植物和微生物的毒性。實(shí)施方案不受特定重排策略的限制，重排可以僅涉及本文所公開的核苷酸序列，或者可以另外涉及重排本領(lǐng)域已知的其它核苷酸序列。DNA重排策略為本領(lǐng)域所已知。

序列一致性的鑒定包括雜交技術(shù)。例如，將已知核苷酸序列的全部或部分用作與其它相應(yīng)核苷酸序列選擇性雜交的探針，所述其它相應(yīng)核苷酸序列存在于來自所選生物體的已克隆基因組DNA片段或cDNA片段群(即基因組文庫或cDNA文庫)。所述雜交探針可以是基因組DNA片段、cDNA片段、RNA片段或其它寡核苷酸，并且可以用諸如³²P的可檢測基團(tuán)或其它可檢測標(biāo)志物來標(biāo)記。因而，例如，可以通過標(biāo)記基于實(shí)施方案序列的合成寡核苷酸制備雜交探針。制備雜交探針和構(gòu)建cDNA及基因組文庫的方法通常為本領(lǐng)域已知。

在一些實(shí)施方案中，可以將本文公開的完整序列或者其一個(gè)或多個(gè)部分用作能夠與對(duì)應(yīng)序列和信使RNA特異性雜交的探針。為在各種條件下完成特異性雜交，所述探針包含獨(dú)特于實(shí)施方案序列并且通常長至少約10或20個(gè)核苷酸的序列?？梢允褂盟鎏结槪酝ㄟ^PCR從所選生物體擴(kuò)增相應(yīng)的Cry序列。可以使用該技術(shù)，以從所需生物 體分離其它編碼序列，或?qū)⒃摷夹g(shù)用作診斷分析，以確定生物體是否存在編碼序列。雜交技術(shù)包括雜交篩選所接種的DNA文庫。

可以在嚴(yán)緊條件下進(jìn)行所述序列的雜交。如本文所用，術(shù)語“嚴(yán)緊條件”或“嚴(yán)緊雜交條件”表示如下條件，即在該條件下，相對(duì)于與其它序列雜交，探針將以可檢測的更大程度(例如，背景的至少2倍、5倍或10倍)與其靶序列雜交。嚴(yán)緊條件是序列依賴性的并且在不同環(huán)境中有所不同。通過控制雜交嚴(yán)緊性和/或控制清洗條件，可以鑒定與所述探針100％互補(bǔ)的靶序列(同源探針法)?？蛇x擇地，可以調(diào)節(jié)嚴(yán)緊條件，以允許一些序列錯(cuò)配，以便檢測較低的相似度(異源探針法)。通常，探針長度少于約1000或500個(gè)核苷酸。

通常，嚴(yán)緊條件是如下的條件，即在該條件中，鹽濃度為pH 7.0至8.3下，少于約1.5M Na離子，通常約0.01M至1.0M Na離子濃度(或其它鹽)，并且溫度條件為：當(dāng)用于短探針時(shí)(例如10到50個(gè)核苷酸)，至少約30℃；當(dāng)用于長探針時(shí)(例如大于50個(gè)核苷酸)，至少約60℃。還可以通過添加諸如甲酰胺的去穩(wěn)定劑來實(shí)現(xiàn)嚴(yán)緊條件。示例性的低嚴(yán)緊條件包括37℃下使用30％至35％的甲酰胺緩沖液、1M NaCl、1％SDS(十二烷基硫酸鈉)雜交，50℃至55℃下在1×至2×SSC(20×SSC＝3.0M NaCl/0.3M檸檬酸三鈉)中清洗。示例性的中度嚴(yán)緊條件包括37℃下在40％至45％甲酰胺、1.0M NaCl、1％SDS中雜交，55℃至60℃下在0.5×至1×SSC中清洗。示例性的高嚴(yán)緊條件包括37℃下在50％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS中雜交，60℃至65℃下在0.1×SSC中最后清洗至少約20分鐘。任選地，清洗緩沖液可以包含約0.1％至約1％SDS。雜交持續(xù)時(shí)間通常少于約24小時(shí)，通常為約4小時(shí)至約12小時(shí)。

特異性通常依賴雜交后的清洗，關(guān)鍵因素在于最后清洗溶液的離子強(qiáng)度和溫度。DNA-DNA雜合體的T_m(熱力學(xué)熔點(diǎn))可以近似自Meinkoth and Wahl(1984)Anal.Biochem.138:267-284的公式：T_m＝81.5℃+16.6(log M)+0.41(％GC)-0.61(％甲酰胺)-500/L；其中M是一價(jià)陽離子的克分子濃度，％GC是DNA中鳥苷和胞嘧啶核苷酸的百分?jǐn)?shù)，“甲酰胺％”是雜交溶液的甲酰胺百分?jǐn)?shù)，而L是雜合體的堿 基對(duì)長度。T_m是(確定的離子強(qiáng)度和pH下)50％的互補(bǔ)靶序列與完全匹配的探針雜交時(shí)的溫度。通常將清洗至少進(jìn)行至達(dá)到平衡，并且達(dá)到低的雜交背景水平，諸如進(jìn)行2小時(shí)、1小時(shí)或30分鐘。

每1％的錯(cuò)配對(duì)應(yīng)使T_m降低約1℃；因而，可以調(diào)節(jié)T_m、雜交和/或清洗條件，從而與所需一致性的序列雜交。例如，如果需要≥90％一致性的序列，可以將T_m降低10℃。通常，將嚴(yán)緊條件選擇為比確定離子強(qiáng)度和pH下的特異序列及其互補(bǔ)序列的T_m低約5℃。然而，在非常嚴(yán)緊的條件下，可以在比所述T_m低1℃、2℃、3℃或4℃下進(jìn)行雜交和/或清洗；在中度嚴(yán)緊條件下，可以在比所述T_m低6℃、7℃、8℃、9℃或10℃下進(jìn)行雜交和/或清洗；在低嚴(yán)緊條件下，可以在比所述T_m低11℃、12℃、13℃、14℃、15℃或20℃下進(jìn)行雜交和/或清洗。

在一些實(shí)施方案中，還包括核苷酸序列及其編碼的氨基酸序列的片段。如本文所用，術(shù)語“片段”指實(shí)施方案的多核苷酸的核苷酸序列的一部分或者多肽的氨基酸序列的一部分。核苷酸序列的片段可以編碼蛋白片段，所述蛋白片段保留天然或相應(yīng)全長蛋白的生物學(xué)活性，并因而具有殺蟲活性。突變體蛋白包括天然蛋白的生物活性片段，其包含保留天然蛋白生物學(xué)活性，即具有殺蟲活性的足夠數(shù)目的連續(xù)氨基酸殘基。

本領(lǐng)域已知Bt毒素的殺蟲活性通常通過各種蛋白酶在昆蟲腸內(nèi)對(duì)所述肽的切割被活化。因?yàn)殡脑诶ハx腸內(nèi)不總是以全效切割，所以全長毒素的片段相對(duì)于全長毒素自身可以具有增強(qiáng)的殺蟲活性。在一些實(shí)施方案中，還可以通過截短天然或全長序列來提高多肽的殺蟲活性。

因而，在一些實(shí)施方案中，本申請(qǐng)涉及全長殺蟲多肽的截短形式或片段。在一些實(shí)施方案中，所述多肽片段、變異體和突變中的一些將相對(duì)于其衍生自的天然存在的殺昆蟲多肽的活性，具有增強(qiáng)的殺蟲活性。在一些實(shí)施方案中，所述多肽片段、變異體和突變中的一些將相對(duì)于其衍生自的天然存在的殺昆蟲多肽的活性，具有減弱的殺蟲活性。

編碼實(shí)施方案的殺蟲蛋白生物學(xué)活性部分的實(shí)施方案的核苷酸序列片段將編碼至少15、25、30、50、100、200、300、400、500或600個(gè)連續(xù)的氨基酸，或者編碼多達(dá)實(shí)施方案的殺蟲多肽中存在的全部數(shù)量的氨基酸。作為實(shí)施方案核苷酸序列片段的核酸包括至少16、20、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、1,000、1,200、1,400、1,600或1,800個(gè)核苷酸，或者多達(dá)本文公開的核苷酸序列中所存在數(shù)量的核苷酸。特定實(shí)施方案涉及衍生自(例如產(chǎn)生自)實(shí)施方案的第一核酸的片段，其中所述片段編碼以殺蟲活性為特征的截短的毒素。實(shí)施方案的多核苷酸片段所編碼的截短的多肽的特征在于等價(jià)或改良的殺蟲活性，所述等價(jià)或改良是相對(duì)于該片段衍生自的第一核酸所編碼的相應(yīng)全長多肽的活性。所涉及的是實(shí)施方案的該核酸片段可以在天然或相應(yīng)全長編碼序列的3’端被截短。核酸片段還可以在天然或相應(yīng)全長編碼序列的5’和3’端均被截短。

本申請(qǐng)涉及表達(dá)盒，其特征在于，包含上述分離的核酸分子。本申請(qǐng)不限定表達(dá)盒中具體使用的啟動(dòng)子和終止子，只要其適于在植物中表達(dá)即可。在一實(shí)施方案中，所述核酸分子與35S啟動(dòng)子和nos終止子可操作地連接。

本申請(qǐng)還涉及表達(dá)載體，其包含上述分離的核酸分子。在一些實(shí)施方案中，表達(dá)載體包含上述表達(dá)盒。在一些實(shí)施方案中，所述表達(dá)載體還包含PolyA序列和omega增強(qiáng)子。在一些實(shí)施方案中，表達(dá)載體還包含可以用于檢測所述表達(dá)載體在細(xì)胞中表達(dá)情況的其他表達(dá)盒。

一些實(shí)施方案還包括轉(zhuǎn)化的微生物，例如農(nóng)桿菌或大腸桿菌。所述轉(zhuǎn)化使用至少一種實(shí)施方案的核酸、包含所述核酸的表達(dá)盒或者包含所述表達(dá)盒的載體。在一些實(shí)施方案中，所述微生物是依靠植物增殖的微生物。

一些實(shí)施方案還包括轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞或轉(zhuǎn)基因植物，其包含至少一種實(shí)施方案的核苷酸序列。在一些實(shí)施方案中，使用表達(dá)載體轉(zhuǎn)化植物，所述表達(dá)載體包含至少一種實(shí)施方案的核苷酸序列以及與其可操作地連接的在植物細(xì)胞中驅(qū)動(dòng)表達(dá)的啟動(dòng)子。轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞和轉(zhuǎn) 基因植物表示基因組內(nèi)包含異源多核苷酸的植物細(xì)胞或植物。一般來說，所述異源多核苷酸在轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞或轉(zhuǎn)基因植物的基因組內(nèi)穩(wěn)定地整合，以致將所述多核苷酸傳遞給后代?？梢詫⑺霎愒炊嗪塑账釂为?dú)地或作為表達(dá)載體的一部分整合進(jìn)基因組。

在一些實(shí)施方案中，本申請(qǐng)涉及的植物為單子葉植物；任選地，所述植物選自：玉米、水稻、小麥、燕麥、大麥、青稞、粟、高粱和甘蔗。

在一些實(shí)施方案中，本申請(qǐng)涉及的植物包括植物細(xì)胞、植物原生質(zhì)體、可以再生出植物的植物細(xì)胞組織培養(yǎng)物、植物愈傷組織、植物團(tuán)塊和植物細(xì)胞，其為完整的植物或者植物的部分，諸如胚胎，花粉，胚珠，種子，葉，花，枝，果實(shí)，果仁，穗，穗軸，殼，秸稈，根，根尖，花藥等等。本申請(qǐng)還包括源于本申請(qǐng)的轉(zhuǎn)基因植物或其子代、并因而至少部分地包含本申請(qǐng)的核苷酸序列的植物細(xì)胞、原生質(zhì)體、組織、愈傷組織、胚胎以及花、莖、果實(shí)、葉以及根。

雖然實(shí)施方案不依賴特定生物學(xué)機(jī)制來增加植物對(duì)植物害蟲的抗性，但是實(shí)施方案的核苷酸序列在植物中的表達(dá)可以導(dǎo)致產(chǎn)生實(shí)施方案的殺蟲蛋白以及提高所述植物對(duì)植物害蟲的抗性。實(shí)施方案的植物可以用于農(nóng)業(yè)上影響蟲害的方法。某些實(shí)施方案提供轉(zhuǎn)化的農(nóng)作物植物，其可以用于影響該植物的蟲害的方法，所述蟲害諸如鱗翅目害蟲。

鱗翅目害蟲包括但不限于夜蛾科(Noctuidae)的害蟲：秋粘蟲(Spodoptera frugiperda)、甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)、斜紋夜蛾(Spodoptera litura)、蓓帶夜蛾(Mamestra configurata)、甘藍(lán)夜蛾(Mamestra brassicae)、黑切根蟲(Agrotis ipsilon)、西部切根蟲(Agrotis orthogonia)、黃地老虎(Agrotis segetum)，木棉蟲(Alabama argillacea)、粉紋夜蛾(Trichoplusia ni)、大豆夜蛾(Pseudoplusia includens)、黎豆夜蛾(Anticarsia gemmatalis)、苜蓿綠夜蛾(Hypena scabra)、煙芽夜蛾(Heliothis virescens)、一星粘蟲(Pseudaletia unipuncta)、粗皮夜蛾(Athetis mindara)、暗緣地老虎(Euxoa messoria)、埃及金剛鉆(Earias insulana)、翠紋金剛鉆(Earias vittella)、美洲棉鈴蟲(Helicoverpa armigera)、谷實(shí)夜蛾(Helicoverpa zea)；螟蛾科(Pyralidae)的害蟲：歐 洲玉米螟(Ostrinia nubilalis)、亞洲玉米螟(Ostrinia furnacalis)、臍橙螟(Amyelois transitella)、地中海粉螟(Anagasta kuehniella)、干果斑螟(Cadra cautella)、二化螟(Chilo suppressalis)、斑禾草螟(Chilo partellus)、米蛾(Corcyra cephalonica)、玉米根結(jié)網(wǎng)毛蟲(Crambus caliginosellus)、藍(lán)草結(jié)網(wǎng)毛蟲(Crambus teterrellus)、稻縱卷葉野螟(Cnaphalocrocis medinalis)、葡萄卷葉蟲(Desmia funeralis)、甜瓜絹野螟(Diaphania hyalinata)、西南玉米螟(Diatraea grandiosella)、小蔗螟(Diatraea saccharalis)、墨西哥稻螟(Eoreuma loftini)、煙草粉螟(Ephestia elutella)、蠟螟(Galleria mellonella)、水稻切葉野螟(Herpetogramma licarsisalis)、向日葵斑螟(Homoeosoma electellum)、南美玉米苗斑螟(Elasmopalpus lignosellus)、小蠟螟(Achroia grisella)、草地螟(Loxostege sticticalis)、豆野螟(Maruca testulalis)、印度谷螟(Plodia interpunctella)、三化螟(Scirpophaga incertulas)、溫室螟(Udea rubigalis)；以及卷蛾科(Tortricidae)的害蟲：黑頭長翅卷蛾(Acleris variana)、果樹黃卷蛾(Archips argyrospila)、歐洲卷葉蛾(Archips rosana)、桔帶卷蛾(Argyrotaenia citrana)、玫瑰色卷蛾(Choristoneura rosaceana)；以及其他：棉褐帶卷蛾(Adoxophyes orana)、條紋向日葵螟(Cochylis hospes)、榛小卷蛾(Cydia latiferreana)、蘋果蠹蛾(Cydia.pomonella)、雜色卷葉蛾(Platynota flavedana)、荷蘭石竹小卷蛾(Platynota stultana)、歐洲葡萄花翅小卷葉蛾(Lobesia botrana)、蘋白小卷蛾(Spilonota ocellana)、葡萄果實(shí)蛀蟲(Endopiza viteana)、女貞細(xì)卷蛾(Eupoecilia ambiguella)、巴西蘋果卷葉蛾(Bonagota salubricola)、梨小食心蟲(Grapholita molesta)和向日葵芽蛾(Suleima helianthana)等。

鱗翅目的所選其它農(nóng)藝害蟲包括但不限于：秋星尺蠖(Alsophila pometaria)、棉潛蛾(Bucculatrix thurberiella)、苜蓿黃蝶(Colias eurytheme)、胡桃黃蝶(Datana integerrima)、白尺蠖(Ennomos subsignaria)、菩提尺蠖(Erannis tiliaria)、黃毒蛾(Euproctis chrysorrhoea)、黑擬蛉蛾(Harrisina americana)、美國白蛾(Hyphantria cunea)、番茄蠹蛾(Keiferia lycopersicella)、二尾蛺蝶(Lambdina fiscellaria fiscellaria)、西部鐵杉尺蠖(Lambdina fiscellaria lugubrosa)、 柳毒蛾(Leucoma salicis)、舞毒蛾(Lymantria dispar)、番茄天蛾(Manduca quinquemaculata)、煙草天蛾(Manduca sexta)、冬尺蠖(Operophtera brumata)、春尺蠖(Paleacrita vernata)、大鳳蝶(Papilio cresphontes)、加州株蟲(Phryganidia californica)、柑橘潛葉蛾(Phyllocnistis citrella)、斑幕潛葉蛾(Phyllonorycter blancardella)、大菜粉蝶(Pieris brassicae)、小菜粉蝶(Pieris rapae)、暗脈菜粉蝶(Pieris napi)、小菜蛾(Plutella xylostella)、棉紅鈴蟲(Pectinophora gossypiella)、雜食尺蠖(Sabulodes aegrotata)、麥蛾(Sitotroga cerealella)、松異舟蛾(Thaumetopoea pityocampa)、袋衣蛾(Tineola bisselliella)、番茄斑潛蠅(Tuta absoluta)和蘋果巢蛾(Yponomeuta padella)。

實(shí)施例

實(shí)施例1合成的cry1CgerZM編碼序列及其特征分析

以編碼蘇云金芽孢桿菌殺蟲晶體蛋白的基因cry1Ca5為模板，根據(jù)單子葉植物密碼子偏好性(單子葉植物密碼子使用偏好性如圖1所示)，改造獲得基因cry1CgerZM序列，如序列SEQ ID NO:1所示。改造合成的cry1CgerZM基因具有如下特點(diǎn)：密碼子偏好指數(shù)(CAI)達(dá)86％；G+C含量達(dá)60.13％；去除了11個(gè)限制性酶作用位點(diǎn)和13個(gè)順式作用元件；去除了重復(fù)序列。

對(duì)cry1Ca5進(jìn)行改造的具體步驟包括：去除其3’端128個(gè)氨基酸編碼序列，保留5’端630個(gè)氨基酸序列；利用氨基酸序列反推其編碼核苷酸序列，根據(jù)單子葉植物密碼子偏好性優(yōu)選使用單子葉植物基因密碼子高頻使用序列，得到初步改造序列；對(duì)初步改造序列中常用的限制性內(nèi)切酶作用位點(diǎn)、富含AT的位點(diǎn)以及其他有可能形成不穩(wěn)定二級(jí)結(jié)構(gòu)的序列進(jìn)行氨基酸序列保守的密碼子替換以避免產(chǎn)生上述位點(diǎn)，最終獲得改造序列。

實(shí)施例2載體構(gòu)建

為提高基因轉(zhuǎn)錄本在植物細(xì)胞中的表達(dá)水平，設(shè)計(jì)載體表達(dá)盒，載體P35s-cry1CgerZm-Tnos區(qū)域如圖2所示，包含cry1CgerZM基因 的表達(dá)盒還包括如下元件：35S啟動(dòng)子、PolyA序列結(jié)構(gòu)、omega增強(qiáng)子和T-nos終止子。根據(jù)SEQ ID NO:1所示的序列，人工合成cry1CgerZm基因，同時(shí)從pCambia3300載體上PCR擴(kuò)增bar基因，同時(shí)為其兩端添加BamHI和SacI位點(diǎn)。構(gòu)建到同一遺傳轉(zhuǎn)化載體pZHZH25025中。

載體pZHZH25025的具體構(gòu)建過程為：將PCR得到的bar基因片段用BamHI和SacI酶切，將PU130載體(該載體為pCambia3300的衍生載體，其構(gòu)建過程是：pCambia3300經(jīng)XhoI和HindIII酶切處理，用玉米泛素啟動(dòng)子Pubi取代P35s-bar部分得到PU130)用BglII和SacI酶切，連接后得到骨架載體Pubi-bar-T35spolyA；PCR擴(kuò)增35S啟動(dòng)子并在其兩端分別添加HindIII和BamHI酶切位點(diǎn)，PCR擴(kuò)增nos終止子并在其兩端添加EcoRI和PmeI酶切位點(diǎn)；人工合成cry1CgerZm基因片段，5’端添加增強(qiáng)子元件omega增強(qiáng)子，另添加酶切位點(diǎn)5’-HindIII-BamHI和EcoRI-PmeI-3’，將該基因克隆到合成公司提供的克隆載體pUC57simple上形成中間載體pUC57-cry1CgerZm；分別用HindIII和BamHI切割P35S片段和中間載體pUC57-cry1CgerZm，連接后得到中間載體P35S-cry1CgerZm；再分別使用EcoRI和PmeI切割nos和中間載體P35S-cry1CgerZm，連接后得到中間載體P35S-cry1CgerZm-Tnos。使用HindIII和PmeI雙酶切骨架載體Pubi-bar-T35spolyA以及中間載體P35S-cry1CgerZm-Tnos。連接上述處理后的骨架片段和插入片段P35S-cry1CgerZm-Tnos，構(gòu)建得到pZHZH25025載體。

實(shí)施例3轉(zhuǎn)基因玉米的獲得

根據(jù)申請(qǐng)人在審的申請(qǐng)公布號(hào)為CN104745622A的專利申請(qǐng)所描述的方法，將重組pZHZH25025載體通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法導(dǎo)入到中國種子集團(tuán)有限公司提供的玉米自交系祥249中，得到轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米。

具體地，將轉(zhuǎn)化載體pZHZH25025通過電擊法轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105中。將玉米自交系祥249的新鮮 剝?nèi)〉淖越皇诜酆?0天的幼胚(大小為1.0-2.0mm)放入含有懸浮液的2ml塑料離心管中。吸去懸浮液后，加入農(nóng)桿菌菌液，侵染5min，倒入共培養(yǎng)基上，并用移液器吸去表面多余的農(nóng)桿菌菌液，于23℃黑暗共培養(yǎng)3天。共培養(yǎng)后，將幼胚轉(zhuǎn)移到休息培養(yǎng)基中，于28℃黑暗培養(yǎng)6天后，放至含適當(dāng)濃度雙丙胺膦的篩選培養(yǎng)基上，篩選培養(yǎng)2個(gè)周期，每個(gè)周期為2周。將抗性愈傷組織轉(zhuǎn)移至分化培養(yǎng)基I中，25℃，5000lx，光照培養(yǎng)1周。再將愈傷組織轉(zhuǎn)移至分化培養(yǎng)基II中，光照培養(yǎng)2周；將分化出的小苗轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基上，25℃，5000lx，光照培養(yǎng)至生根；將小苗轉(zhuǎn)入小盆中生長，同時(shí)取樣用于分子檢測。

實(shí)施例4轉(zhuǎn)基因玉米的分子檢測

T0代轉(zhuǎn)化苗的分子檢測包括陽性、拷貝數(shù)和骨架檢測。采用天根試劑盒Tiagen DP320對(duì)玉米基因組DNA進(jìn)行抽提。實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)體系如下表所示，內(nèi)參基因IVR的正向(F)和反向引物(R)如下所示；目標(biāo)基因cry1CgerZm的正向和反向引物如下所示；骨架片段ORI的正向和反向引物如下所示。

玉米內(nèi)參IVR(單拷貝)引物序列:

F-ACTAGGCATCCAAGGCGAACG

R-AGTGCGAGAAGAACGAGTGTCC

目標(biāo)基因cry1CgerZm引物序列：

F-CGACATTTCCCTCTCCCTGGTTC

R-AGGTTAGCGATAGCAGCGTTCC

骨架片段ORI引物序列：

F-AACAAGACGAACTCCAATTCACTG

R-TGTTGATTGTAACGATGACAGAGC

表1 實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)體系

PCR反應(yīng)在ABI 7900上進(jìn)行，反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性10分鐘；30個(gè)以下循環(huán)：95℃變性10秒，60℃復(fù)性與延伸55秒，檢測示例示意圖如圖3所示。

實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)完成后，根據(jù)儀器生成的內(nèi)參基因和目標(biāo)基因的平均Ct(擴(kuò)增循環(huán)數(shù))值和推算公式RQ＝2^-ΔCt，計(jì)算對(duì)應(yīng)樣本的RQ值。內(nèi)參基因IVR為玉米單拷貝基因。根據(jù)RQ值，可以計(jì)算出目的基因的相對(duì)拷貝數(shù)。具體依據(jù)為：單拷貝RQ值為0.5左右，雙拷貝RQ值為1.0左右。

檢測結(jié)果如表2所示，選擇RQ值在0.1-1.0范圍內(nèi)的材料，即外源基因低拷貝插入玉米基因組的材料進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

表2 T0代轉(zhuǎn)基因玉米實(shí)時(shí)PCR檢測結(jié)果

實(shí)施例5轉(zhuǎn)基因玉米抗蟲性鑒定

采用離體倒二葉鑒定法對(duì)轉(zhuǎn)基因玉米抗蟲性進(jìn)行鑒定：當(dāng)玉米長到6-7葉時(shí)，剪取倒二葉葉端部分，放入直徑9cm的培養(yǎng)皿中，皿底 以1300μL蒸餾水打濕濾紙以保持高濕。每皿中接亞洲玉米螟(Ostrinia furnacalis)初孵幼蟲10頭，并用透氣性較好的醫(yī)用膠布封口。每株3個(gè)重復(fù)，以未轉(zhuǎn)基因的自交系作對(duì)照。溫度28℃、濕度75％、光照(L):黑暗(D)＝14:10條件下培養(yǎng)。4天后檢查每皿的死蟲頭數(shù)，并計(jì)算幼蟲死亡率及校正死亡率。

校正死亡率(％)＝(處理死亡率-對(duì)照死亡率)/(1-對(duì)照死亡率)

取兩個(gè)含有不同版本的對(duì)照cry1C基因的T0代抗蟲基因低拷貝(1-2個(gè)拷貝)插入的轉(zhuǎn)基因玉米材料作為對(duì)照植物與本申請(qǐng)的轉(zhuǎn)cry1CgerZm基因的玉米做抗蟲鑒定對(duì)比實(shí)驗(yàn)。這兩種版本cry1C基因分別是：cry1C*(CN 1483823A)和cry1C(US 6043415)。為消除載體元件對(duì)于基因表達(dá)的影響因素，實(shí)驗(yàn)所用的三個(gè)轉(zhuǎn)化載體，除抗蟲基因不同，載體其他元件一致，對(duì)照植物的轉(zhuǎn)化步驟及生長條件也與轉(zhuǎn)化植物相同。對(duì)照植物的制備參照實(shí)施例2和3的步驟。

實(shí)驗(yàn)室生物測定結(jié)果如表3所示，單子葉植物密碼子偏好性優(yōu)化的cry1CgerZm基因的殺蟲效果最好，平均矯正死亡率為63％，供試的10個(gè)T0代轉(zhuǎn)化事件中有1個(gè)達(dá)100％的矯正死亡率，而cry1C*和cry1Cger兩個(gè)基因的轉(zhuǎn)化事件均無達(dá)100％的矯正死亡率，且平均矯正死亡率均低于cry1CgerZm基因的轉(zhuǎn)化事件，分別為32％和41％。方差分析顯示，3個(gè)版本cry1C基因轉(zhuǎn)化事件玉米螟的矯正死亡率達(dá)顯著差異(p＝0.02，＜0.05)。

表3 不同版本cry1C基因轉(zhuǎn)化載體的T0代轉(zhuǎn)化事件的抗蟲鑒定

雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實(shí)施方案對(duì)本申請(qǐng)作了詳盡的描述，但在本申請(qǐng)基礎(chǔ)上，可以對(duì)之作一些修改或改進(jìn)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本申請(qǐng)精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本申請(qǐng)要求保護(hù)的范圍。