本申請涉及植物生物
技術領域：
，具體涉及Bt抗蟲基因及其表達載體的應用。
背景技術：
：蟲害是造成農作物減產的重要原因之一，減少蟲害的損失是增加糧食與飼料作物產量與品質的重要途徑。據統(tǒng)計全球糧食與飼料作物總產量每年因蟲害造成的損失達14％，直接給農業(yè)生產造成的經濟損失高達數千億美元。采用噴施化學農藥和生物殺蟲劑等防治手段固然可以減輕害蟲對農作物的為害，但化學農藥造成環(huán)境污染，生物殺蟲劑成本較高。長期以來，大量噴施化學殺蟲劑，不僅會增強害蟲的抗藥性，使益蟲及其它生態(tài)區(qū)系遭受破壞，而且嚴重污染環(huán)境，提高生產成本，破壞生態(tài)平衡。因此，減少殺蟲劑使用量，發(fā)展現代生物技術，已成為可持續(xù)發(fā)展農業(yè)中必須正視的問題。玉米是重要的飼料和工業(yè)原料作物。當前玉米蟲害以玉米螟為主，發(fā)生嚴重并造成玉米大量減產，因此采取有效措施控制其危害對提高玉米產量、增加農民收入具有重要的意義。玉米螟俗稱玉米鉆心蟲，其危害是造成玉米常年減產的重要生物災害之一，嚴重影響玉米的產量和質量，包括亞洲玉米螟(Ostriniafurnacalis)和歐洲玉米螟(Ostrinianubilalis)。中國是亞洲玉米螟的多發(fā)區(qū)和重發(fā)區(qū)，幾乎每兩年就大規(guī)模發(fā)生一次。一般年份玉米受玉米螟危害減產10％-15％，大發(fā)生年減產可達30％以上，甚至絕收。因玉米螟造成的危害，每年損失的玉米產量就達600-900萬噸。玉米螟不僅直接造成玉米產量損失，而且還誘發(fā)并加重玉米穗腐病的發(fā)生，使玉米的品質下降。目前防治玉米螟的主要方式仍然以殺蟲劑農藥防治為主。通過轉基因技術可以將Bt抗蟲基因導入玉米品種中，進而提高轉基因玉米的 抗蟲性，降低農藥的使用量，節(jié)省人力、物力及社會資源。Bt基因編碼殺蟲晶體蛋白，來自蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis，簡稱Bt)，為革蘭氏陽性土壤桿菌。它在芽孢形成過程中產生稱為δ-內毒素的殺蟲伴胞晶體蛋白，這些蛋白具有很高的殺蟲活性。其作用原理為這種抗蟲蛋白能被堿性腸液溶解，水解為更小的活性毒素片段——核心片段(HofteandWhiteley，1989)。核心片段能避開被蛋白酶的進一步水解，被激活的蛋白質結合在昆蟲腸道上的刷狀小泡上，引起穿孔從而影響滲透平衡，細胞膨脹并溶解，靶標生物停止取食并最后死亡。研究表明許多Bt蛋白靶標害蟲的腸道上皮細胞都具有高親和性的結合位點(HofteandWhiteley，1989)。在過去的幾十年里，已確定數十種蘇云金芽孢桿菌菌系及130多種它們編碼的殺蟲晶體蛋白。研究證明，Bt晶體蛋白對人體、哺乳動物、鳥類、魚類以及很多有益昆蟲均無毒害作用，不污染環(huán)境，所以Bt制劑已作為一種無公害的天然微生物殺蟲劑在農業(yè)、林業(yè)及環(huán)境衛(wèi)生等方面應用了近50年。Bt晶體蛋白質必須被昆蟲取食到才能發(fā)揮殺蟲功能，但自然環(huán)境下Bt晶體蛋白質穩(wěn)定性差，殺蟲效果受天氣影響大，太陽照后則易降解，也不能滲透到植物組織內部，易被雨水、露水沖刷掉，這些因素極大的限制了其發(fā)展應用。Vaeck等人(Nature328:33-37，1987)首次獲得轉Bt殺蟲蛋白抗蟲煙草，獲得的轉基因煙草能檢測到微弱的抗蟲性，其表達蛋白幾乎檢測不到，只占可溶性蛋白的0.001％。Willbur等人(PlantPhysiol.92:1-11，1990)的研究表明，低等生物細菌和高等植物在密碼子使用上存在很大差異。另外，有證據表明植物中的tRNA的不穩(wěn)定的ATTTA和AATAA等序列轉錄出的mRNA不完整，故翻譯出的蛋白質太短無殺蟲活性。技術實現要素：本申請?zhí)峁┝丝稍谥参镏斜磉_并產生抗蟲效果的抗蟲基因Cry1Ab/Cry1AcZM，及包含其的載體和宿主細胞。本申請亦提供了上述抗蟲基因、表達載體和宿主細胞在轉基因植物抗蟲性中的應用。在一方面，本申請?zhí)峁┝朔蛛x的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子包含SEQIDNO:1所示核苷酸序列，或其互補序列。在一實施方案中，本申請?zhí)峁┝伺c該基因具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的序列。在又一方面，本申請?zhí)峁┝吮磉_盒，其特征在于，包含上述核酸分子。在一實施方案中，所述核酸分子與Ubi啟動子和Ocs終止子、或Ubi啟動子和Nos終止子、或CaMV35S啟動子和Ocs終止子、或CaMV35S啟動子和Nos終止子可操作地連接。在又一方面，本申請?zhí)峁┝吮磉_載體，其特征在于，包含上述表達盒。在一實施方案中，所述表達載體還包含Ω序列。在一實施方案中，所述表達載體還包含Kozak序列。在一實施方案中，所述表達載體還包含PolyA序列。在一實施方案中，所述表達載體還包含Bar基因。在又一方面，本申請?zhí)峁┝怂拗骷毎?，其特征在于，包含上述表達載體。在一實施方案中，所述宿主細胞為植物細胞或原核生物細胞。在一實施方案中，所述宿主細胞為大腸桿菌或農桿菌細胞。在又一方面，本申請?zhí)峁┝水a生轉基因植物的方法，其特征在于，用上述表達載體或上述宿主細胞轉化植物，得到轉基因植物。在一實施方案中，所述植物為單子葉植物。在一實施方案中，所述植物選自：玉米、水稻、小麥、燕麥、大麥、青稞、粟、高粱和甘蔗。在又一方面，本申請?zhí)峁┝水a生轉基因種子的方法，其特征在于，從上述方法產生的轉基因植物產生轉基因種子。在又一方面，本申請?zhí)峁┝丝刂器[翅目害蟲群體的方法，包括使所述鱗翅目害蟲群體進食通過上述方法獲得的轉基因植物。在一實施方案中，所述植物為單子葉植物。在一實施方案中，所述植物選自：玉米、水稻、小麥、燕麥、大麥、粟、高粱和甘蔗。在一實施方案中，所述鱗翅目害蟲為亞洲玉米螟(Ostriniafurnacalis)和歐洲玉米螟(Ostrinianubilalis)。在又一方面，本申請?zhí)峁┝藲⑺厉[翅目害蟲的方法，包括向所述鱗翅目害蟲喂食殺蟲有效量的通過上述方法獲得的轉基因植物。在一 實施方案中，所述植物為單子葉植物。在一實施方案中，所述植物選自：玉米、水稻、小麥、燕麥、大麥、粟、高粱和甘蔗。在一實施方案中，所述鱗翅目害蟲為亞洲玉米螟(Ostriniafurnacalis)和歐洲玉米螟(Ostrinianubilalis)。在又一方面，本申請?zhí)峁┝藴p輕鱗翅目害蟲對植物的傷害的方法，包括將表達載體穩(wěn)定整合進植物的基因組，其特征在于，所述表達載體包含編碼抗鱗翅目害蟲基因的核酸分子，所述核酸分子包含SEQIDNO:1所示核苷酸序列或與SEQIDNO:1具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的核苷酸序列，或以上的互補序列。在一實施方案中，所述植物為單子葉植物。在一實施方案中，所述植物選自：玉米、水稻、小麥、燕麥、大麥、粟、高粱和甘蔗。在一實施方案中，所述鱗翅目害蟲為亞洲玉米螟(Ostriniafurnacalis)和歐洲玉米螟(Ostrinianubilalis)。在又一方面，本申請?zhí)峁┝宿D基因植物，其包括整合進其基因組的表達盒，其特征在于，所述表達盒包含編碼抗鱗翅目害蟲基因的核酸分子，所述核酸分子包含SEQIDNO:1所示核苷酸序列或與SEQIDNO:1具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的核苷酸序列，或以上的互補序列。在一實施方案中，本申請?zhí)峁┝伺c該基因具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的序列。在一些實施方案中，所述核酸分子包含SEQIDNO:1所示核苷酸序列或所述核酸分子由SEQIDNO:1所示核苷酸序列組成。在一些實施方案中，所述植物為單子葉植物。在一些實施方案中，所述植物選自：玉米、水稻、小麥、燕麥、大麥、粟、高粱和甘蔗。在一實施方案中，本申請還涉及該植物的器官、組織、細胞及通過由所述植物產生的加工品，如食物、飼料等。在一些實施方案中，本申請?zhí)峁┑目瓜x基因Cry1Ab/Cry1AcZM可在植物中穩(wěn)定高效表達，具有良好的抗蟲效果。附圖說明圖1A-K為中間載體和轉化載體示意圖。其中：圖1A為載體 pZZ01205；圖1B為載體pZZ00015；圖1C為轉化載體pZHZH25017；圖1D為載體pZZ01206；圖1E為轉化載體pZHZH25018；圖1F為載體pZZ01207；圖1G為載體pZZ00005；圖1H為轉化載體pZHZH25020；圖1J為載體pZZ01228；圖1K為轉化載體pZHZH25022。圖1A到圖1K各載體圖譜英文及各縮寫含義列舉如下：Ubipromoter：泛素啟動子omega：歐米茄序列Cry1Ab/Cry1AcZM：優(yōu)化的Bt基因序列polyA：多聚腺苷酸序列T-NOS：胭脂堿合成酶終止子T-OCS:章魚堿合成酶終止子pMB1rep:pMB1復制子Amp(R):氨芐青霉素抗性EGFP:綠色熒光蛋白T-Border(right)：T-DNA右邊界序列CaMV35Spromoter：黃瓜花葉病毒35S啟動子BAR：抗草胺膦基因序列CaMV35SpolyA：黃瓜花葉病毒35S多聚腺苷酸序列T-Border(left)：T-DNA左邊界序列Bp：堿基對Kanamycin(R)：卡那霉素抗性序列pBR322ori：pBR322起始區(qū)序列pBR322born：pBR322骨架區(qū)序列pVS1rep：pVS1復制子pVS1sta：pVS1轉錄起始區(qū)圖2為通過PCR鑒定T0代植株的結果，其中1-6泳道為不同的T0代轉基因事件，呈陽性，7泳道為陰性對照，陽性條帶分子量為333bp。圖3為玉米轉化事件基因組DNASouthern印跡檢測結果圖。載體pZHZH25017轉化事件T1代株系玉米基因組DNA分別由HindIII和NcoI酶切與Cry1Ab/Cry1AcZM特異探針分子雜交結果，探針長度333bp。1、 6泳道為陰性對照祥249；2、7泳道為T1-1；3、8泳道為T1-2；4、9泳道為T1-3；5、10泳道為T1-4材料。兩種酶切條件下分別顯示一條陽性帶，表明外源基因單拷貝插入。M為分子量標記泳道，標出了堿基對數。圖4為免疫試紙鑒定T0代植株結果圖，其中1-2號(轉化載體pZHZH25017)；3-4號(轉化載體pZHZH25018)；5號(轉化載體pZHZH25020)；和6號(轉化載體pZHZH25022)樣品呈陽性，7號樣品為陰性對照。圖5A為T0代玉米葉片離體抗蟲生測結果圖，1.抗性葉片(轉化載體pZHZH25018)；2.陰性對照祥249；3.陽性對照(Cry1Ac)。圖5B為T0代玉米花絲離體抗蟲生測結果圖。1.抗性葉片(轉化載體pZHZH25018)；2.陰性對照祥249；3.陽性對照(Cry1Ac)。具體實施方式除非另有所指，核酸以5’至3’方向從左向右書寫；氨基酸序列以氨基至羧基方向從左向右書寫。氨基酸在本文可以用其通常所知的三字母符號或IUPAC-IUB生物化學命名委員會推薦的單字母符號來表示。同樣地，可以用通常接受的單字母碼表示核苷酸。數字范圍包括限定該范圍的數字。如本文所用，“核酸”包括涉及單鏈或雙鏈形式的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸多聚物，并且除非另有限制，包括具有天然核苷酸基本性質的已知類似物(例如，肽核酸)，所述類似物以與天然存在的核苷酸類似的方式與單鏈核酸雜交。如本文所用，術語“編碼”或“所編碼的”用于特定核酸的上下文時，指該核酸包含指導該核苷酸序列翻譯成特定蛋白的必需信息。使用密碼子表示編碼蛋白的信息。如本文所用，涉及特定多核苷酸或其所編碼的蛋白的“全長序列”指具有天然(非合成)內源序列的整個核酸序列或整個氨基酸序列。全長多核苷酸編碼該特定蛋白的全長、催化活性形式。本文可互換地使用術語“多肽”、“肽”和“蛋白”，以指氨基酸殘基的多聚物。該術語用于氨基酸多聚物，其中一個或多個氨基酸殘基是 相應天然存在的氨基酸的人工化學類似物。該術語還用于天然存在的氨基酸多聚物。本文可互換地使用術語“殘基”或“氨基酸殘基”或“氨基酸”，以指被并入蛋白、多肽或肽(統(tǒng)稱“蛋白”)的氨基酸。氨基酸可以是天然存在的氨基酸，并且除非另有限制，可以包括天然氨基酸的已知類似物，所述類似物可以以與天然存在的氨基酸相似的方式起作用。如本文所用，可以互換地使用術語“分離的”和“純化的”，以涉及核酸或多肽或其生物學活性部分，其基本上或本質上不含如在其天然存在的環(huán)境中所發(fā)現的通常伴隨或反應于該核酸或多肽的組分。因而，用重組技術產生分離的或純化的核酸或多肽時，分離的或純化的核酸或多肽基本上不含其它細胞物質或培養(yǎng)基，或者化學合成分離的或純化的核酸或多肽時，基本上不含化學前體或其它化學品。“分離的”核酸通常不含在該核酸所衍生自的生物體的基因組DNA中天然側翼于該核酸(即位于該核酸5’和3’端的序列)的序列(諸如，例如編碼蛋白的序列)。例如，在各種實施方案中，所分離的核酸可以包含在該核酸所衍生自的細胞的基因組DNA中天然側翼于該核酸的少于約0.5kb的核苷酸序列。在本申請中，將詞語“包括”、“包含”或其變體應理解為除所描述的元素、數或步驟外，還包含其它元素、數或步驟。如本文所用，術語“影響蟲害”指對任何發(fā)育階段的昆蟲進食、生長和/或行為的有影響的改變，包括但不限于殺滅昆蟲、延遲生長、阻礙生殖能力、拒食素活性等等。如本文所用，術語“殺蟲活性”是指生物體或物質(諸如，例如蛋白)的活性，其測量可以通過但不限于害蟲死亡率、害蟲體重減少、害蟲驅避性以及進食和暴露適當長時間后害蟲的其它行為和物理變化。因而，具有殺蟲活性的生物體或物質不利地影響至少一種可測量的害蟲健康參數。例如，“殺蟲蛋白”是自身顯示或與其它蛋白組合顯示殺蟲活性的蛋白。如本文所用，術語“殺蟲有效量”指存在于害蟲環(huán)境的具有殺蟲活性的物質或生物體的量。類似地，當害蟲是昆蟲時，“殺昆蟲有效量” 可以用于指“殺蟲有效量”。應理解如本文所用，術語“轉基因的”包括基因型已通過異源核酸的存在而被改變的任何細胞、細胞系、愈傷組織、組織、植物部分或者植物，包括最初如此改變的那些轉基因，以及通過有性雜交或無性繁殖從所述最初的轉基因產生的那些。如本文所用，術語“轉基因的”不包括借助常規(guī)植物育種方法或者借助天然發(fā)生的事件對基因組(染色體或染色體外)的改變，所述天然發(fā)生的事件諸如隨機異花受精、非重組病毒感染、非重組細菌轉化、非重組轉座或者自發(fā)突變?！笆茉囍参铩被颉笆茉囍参锛毎笔侵高z傳改造已經生效的植物或植物細胞，或者如此改造的植物或細胞的子代細胞，該子代細胞包含所述改造?！皩φ铡被颉皩φ罩参铩被颉皩φ罩参锛毎碧峁┯糜跍y量受試植物或植物細胞表型改變的參考點。對照植物或植物細胞可以包括，例如：(a)野生型植物或細胞，即與遺傳改造起始材料具有相同基因型的植物或細胞，所述遺傳改造產生受試植物或細胞；(b)與所述起始材料具有相同基因型但已用空構建體(即用對目的性狀無已知效果的構建體，諸如包含標志物基因的構建體)轉化的植物或植物細胞；(c)是受試植物或植物細胞的非轉化分離子的植物或植物細胞；(d)與所述受試植物或植物細胞在遺傳上一致但未暴露于會誘導目的基因表達的條件或刺激物的植物或植物細胞；或(e)受試植物或植物細胞自身，其處于目的基因不被表達的條件下。本領域技術人員會容易地認同，諸如位點特異性誘變和隨機誘變、聚合酶鏈式反應方法和蛋白工程化技術的分子生物學領域的進步提供了廣泛的適當的工具和操作步驟，以用于改造或者工程化農業(yè)上感興趣的蛋白的氨基酸序列和潛在的基因序列。在一些實施方案中，可以對本申請的核苷酸序列進行改變，以進行保守氨基酸替換。保守氨基酸替換的原則和實例在下文中進一步描述。在某些實施方案中，可以依照圖1中公開的單子葉密碼子偏好性對本申請的核苷酸序列進行不改變氨基酸序列的替換，例如可以用單子葉植物偏好的密碼子替換編碼同一氨基酸序列的密碼子，而不改變該核苷酸序列所編碼的氨基酸序列。本申請還涉及對SEQIDNO:1進一步優(yōu)化所得的核苷酸序列。該方法的更多細節(jié)描述于Murray等人(1989)NucleicAcidsRes.17:477-498。優(yōu)化核苷酸序列可用于提高殺蟲蛋白在植物中的表達，所述植物例如單子葉植物，例如禾本科植物，例如玉米(Zeamays)。如本文所用，術語“突變核苷酸序列”或“突變”或“誘變的核苷酸序列”指經誘變或改變而包含一個或多個核苷酸殘基(例如堿基對)的核苷酸序列，所述核苷酸殘基不存在于相應的野生型序列中。在一些實施方案中，以編碼同一氨基酸序列的不同密碼子替換本申請中的部分核苷酸序列，從而在改變核苷酸序列的同時不改變其編碼的氨基酸序列。保守變體包括由于遺傳密碼子簡并性而編碼實施方案的殺蟲多肽中的一種的氨基酸序列的那些序列。在一些實施方案中，根據單子葉植物偏好密碼子替換本申請中的部分核苷酸序列。在一些實施方案中，突變體核苷酸序列還包括衍生的核苷酸序列，諸如使用例如位點定向誘變而產生的仍編碼實施方案的殺蟲蛋白的那些，諸如突變體毒素。在一些實施方案中，突變體核苷酸序列包括一個或多個核酸殘基的添加、缺失或替換。在一些實施方案中，這樣的添加、移除或替換可以導致相應的氨基酸殘基的添加、移除或替換。一般來講，實施方案的特定核苷酸序列的變體將與該特定核苷酸序列具有至少約90％或更高的序列一致性。通過下文所述的序列比對程序確定序列一致性。實施方案的突變體核苷酸序列與本申請的序列的差異可以少至1-15個核苷酸、少至1-10個(例如6-10個)，少至5個，少至4、3、2或甚至1個核苷酸。在一些實施方案中，突變體核苷酸序列可以編碼具有改良的或降低的殺昆蟲活性的突變體蛋白。這樣的殺蟲活性相對天然蛋白可以是不同的或者是改良的，或者它可以是不變的，只要保留了殺蟲活性。突變體蛋白包括衍生自天然蛋白的多肽，所述衍生是通過缺失(所謂的截短)天然蛋白N末端和/或C末端的一個或多個氨基酸或將一個或多個氨基酸添加至所述天然蛋白的N末端和/或C末端；在天然蛋白的一個或多個位點缺失或添加一個或多個氨基酸；或者在天然蛋白的一個或多個位點取代一個或多個氨基酸。實施方案包括的突變體蛋白具有生物學活性，即它們繼續(xù)具有天然蛋白的所需的生物學活性，所述活性即本文所述的殺蟲活性。所述變體可以得自例如基因多態(tài)性或人類的操作。本領域技術人員會理解，只要所編碼多肽保留殺蟲活性，任何有用的突變可以被添加至實施方案的序列。在一些實施方案中，突變體蛋白的氨基酸序列將與本申請的蛋白的氨基酸序列具有至少約90％或更高的序列一致性。在一些實施方案中，突變體蛋白與本申請的蛋白的差異可以少至1-15個氨基酸殘基。在一些實施方案中，也可以突變序列，以致所編碼多肽對蛋白酶的蛋白水解消化具有抗性。突變可以保護該多肽免于蛋白酶降解，所述保護例如是通過從不同區(qū)域移除諸如推定的絲氨酸蛋白酶位點和彈性蛋白酶識別位點的推定的蛋白水解位點?？梢砸瞥蚋脑爝@些推定位點的一些或全部，以致原始位點位置的蛋白水解被降低?？梢酝ㄟ^比較突變體多肽和野生型毒素或者通過比較氨基酸序列各不相同的突變體毒素，來評價蛋白水解的變化。蛋白水解位點和推定的蛋白水解位點包括但不限于以下序列：胰蛋白酶切割位點、糜蛋白酶位點和胰蛋白酶位點。只要所述多肽的殺蟲活性被提高，可以通過添加或缺失任意數目和種類的氨基酸殘基來改造這些位點。因而，相對于天然序列或背景序列，由包含突變的核苷酸序列編碼的多肽將包含至少一個氨基酸改變或添加，或者50或更多個氨基酸改變或添加。本領域技術人員會認識到氨基酸添加和/或取代通?；诎被醾孺溔〈南鄬ο嗨菩?，例如，所述取代基的疏水性、電荷、大小等等。具有各種前述所考慮性質的示例性氨基酸取代基團為本領域技術人員所公知，并且包括精氨酸與賴氨酸；谷氨酸和天門冬氨酸；絲氨酸和蘇氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；以及纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸。關于不影響目的蛋白生物學活性的適當氨基酸取代的指南可以在Dayhoff等人(1978)AtlasofProteinSequenceandStructure(蛋白序列和結構圖集)(Natl.Biomed.Res.Found.,Washington,D.C)(通過引用并入本文)的模型中找到?？梢赃M行諸如將一個氨基酸換作具有相似性質的另一個氨基酸的保守性取代。當在進行取代、缺失或插入前，難以預測其確切效果時，本領域技術人員將理解所述效果將通過諸如昆蟲進食分析的常規(guī)篩選分析來評價。參見，例如，通過引用并入本文的Marrone等人(1985)J.Econ.Entomol.78:290-293和CzaplaandLang(1990)J.Econ.Entomol.83:2480-2485。在一些實施方案中，可以在實施方案的核苷酸序列和其它已知的Cry核苷酸序列的對應部分之間重組全長編碼序列、編碼目的結構域的序列基序或者實施方案的核苷酸序列的任意片段，從而獲得具有改良性質的新基因。受到關注的性質包括但不限于每單位殺蟲蛋白的殺蟲活性、蛋白穩(wěn)定性、對非靶物種、特別是對人類、家畜以及表達實施方案的殺蟲多肽的植物和微生物的毒性。實施方案不受特定重排策略的限制，重排可以僅涉及本文所公開的核苷酸序列，或者可以另外涉及重排本領域已知的其它核苷酸序列。DNA重排策略為本領域所已知。序列一致性的鑒定包括雜交技術。例如，將已知核苷酸序列的全部或部分用作與其它相應核苷酸序列選擇性雜交的探針，所述其它相應核苷酸序列存在于來自所選生物體的已克隆基因組DNA片段或cDNA片段群(即基因組文庫或cDNA文庫)。所述雜交探針可以是基因組DNA片段、cDNA片段、RNA片段或其它寡核苷酸，并且可以用諸如32P的可檢測基團或其它可檢測標志物來標記。因而，例如，可以通過標記基于實施方案序列的合成寡核苷酸制備雜交探針。制備雜交探針和構建cDNA及基因組文庫的方法通常為本領域已知。在一些實施方案中，可以將本文公開的完整序列或者其一個或多個部分用作能夠與對應序列和信使RNA特異性雜交的探針。為在各種條件下完成特異性雜交，所述探針包含獨特于實施方案序列并且通常長至少約10或20個核苷酸的序列?？梢允褂盟鎏结?，以通過PCR從所選生物體擴增相應的Cry序列?？梢允褂迷摷夹g，以從所需生物體分離其它編碼序列，或將該技術用作診斷分析，以確定生物體是否存在編碼序列。雜交技術包括雜交篩選所接種的DNA文庫?？梢栽趪谰o條件下進行所述序列的雜交。如本文所用，術語“嚴緊 條件”或“嚴緊雜交條件”表示如下條件，即在該條件下，相對于與其它序列雜交，探針將以可檢測的更大程度(例如，背景的至少2倍、5倍或10倍)與其靶序列雜交。嚴緊條件是序列依賴性的并且在不同環(huán)境中有所不同。通過控制雜交嚴緊性和/或控制清洗條件，可以鑒定與所述探針100％互補的靶序列(同源探針法)。可選擇地，可以調節(jié)嚴緊條件，以允許一些序列錯配，以便檢測較低的相似度(異源探針法)。通常，探針長度少于約1000或500個核苷酸。通常，嚴緊條件是如下的條件，即在該條件中，鹽濃度為pH7.0至8.3下，少于約1.5MNa離子，通常約0.01M至1.0MNa離子濃度(或其它鹽)，并且溫度條件為：當用于短探針時(例如10到50個核苷酸)，至少約30℃；當用于長探針時(例如大于50個核苷酸)，至少約60℃。還可以通過添加諸如甲酰胺的去穩(wěn)定劑來實現嚴緊條件。示例性的低嚴緊條件包括37℃下使用30％至35％的甲酰胺緩沖液、1MNaCl、1％SDS(十二烷基硫酸鈉)雜交，50℃至55℃下在1×至2×SSC(20×SSC＝3.0MNaCl/0.3M檸檬酸三鈉)中清洗。示例性的中度嚴緊條件包括37℃下在40％至45％甲酰胺、1.0MNaCl、1％SDS中雜交，55℃至60℃下在0.5×至1×SSC中清洗。示例性的高嚴緊條件包括37℃下在50％甲酰胺、1MNaCl、1％SDS中雜交，60℃至65℃下在0.1×SSC中最后清洗至少約20分鐘。任選地，清洗緩沖液可以包含約0.1％至約1％SDS。雜交持續(xù)時間通常少于約24小時，通常為約4小時至約12小時。特異性通常依賴雜交后的清洗，關鍵因素在于最后清洗溶液的離子強度和溫度。DNA-DNA雜合體的Tm(熱力學熔點)可以近似自MeinkothandWahl(1984)Anal.Biochem.138:267-284的公式：Tm＝81.5℃+16.6(logM)+0.41(％GC)-0.61(％甲酰胺)-500/L；其中M是一價陽離子的克分子濃度，％GC是DNA中鳥苷和胞嘧啶核苷酸的百分數，“甲酰胺％”是雜交溶液的甲酰胺百分數，而L是雜合體的堿基對長度。Tm是(確定的離子強度和pH下)50％的互補靶序列與完全匹配的探針雜交時的溫度。通常將清洗至少進行至達到平衡，并且達到低的雜交背景水平，諸如進行2小時、1小時或30分鐘。每1％的錯配對應使Tm降低約1℃；因而，可以調節(jié)Tm、雜交和/或清洗條件，從而與所需一致性的序列雜交。例如，如果需要≥90％一致性的序列，可以將Tm降低10℃。通常，將嚴緊條件選擇為比確定離子強度和pH下的特異序列及其互補序列的Tm低約5℃。然而，在非常嚴緊的條件下，可以在比所述Tm低4℃下進行雜交和/或清洗；在中度嚴緊條件下，可以在比所述Tm低6℃下進行雜交和/或清洗；在低嚴緊條件下，可以在比所述Tm低11℃下進行雜交和/或清洗。在一些實施方案中，還包括核苷酸序列及其編碼的氨基酸序列的片段。如本文所用，術語“片段”指實施方案的多核苷酸的核苷酸序列的一部分或者多肽的氨基酸序列的一部分。核苷酸序列的片段可以編碼蛋白片段，所述蛋白片段保留天然或相應全長蛋白的生物學活性，并因而具有殺蟲活性。突變體蛋白包括天然蛋白的生物活性片段，其包含保留天然蛋白生物學活性，即具有殺蟲活性的足夠數目的連續(xù)氨基酸殘基。本領域已知Bt毒素的殺蟲活性通常通過各種蛋白酶在昆蟲腸內對所述肽的切割被活化。因為肽在昆蟲腸內不總是以全效切割，所以全長毒素的片段相對于全長毒素自身可以具有增強的殺蟲活性。在一些實施方案中，還可以通過截短天然或全長序列來提高多肽的殺蟲活性。因而，在一些實施方案中，本申請涉及全長殺蟲多肽的截短形式或片段。在一些實施方案中，所述多肽片段、變異體和突變中的一些將相對于其衍生自的天然存在的殺昆蟲多肽的活性，具有增強的殺蟲活性。在一些實施方案中，所述多肽片段、變異體和突變中的一些將相對于其衍生自的天然存在的殺昆蟲多肽的活性，具有減弱的殺蟲活性。編碼實施方案的殺蟲蛋白生物學活性部分的實施方案的核苷酸序列片段將編碼至少50個連續(xù)的氨基酸，或者編碼多達實施方案的殺蟲多肽中存在的全部數量的氨基酸。作為實施方案核苷酸序列片段的核酸包括至少150個核苷酸，或者多達本文公開的核苷酸序列中所存在數量的核苷酸。特定實施方案涉及衍生自(例如產生自)實施方案的第 一核酸的片段，其中所述片段編碼以殺蟲活性為特征的截短的毒素。實施方案的多核苷酸片段所編碼的截短的多肽的特征在于等價或改良的殺蟲活性，所述等價或改良是相對于該片段衍生自的第一核酸所編碼的相應全長多肽的活性。所涉及的是實施方案的該核酸片段可以在天然或相應全長編碼序列的3’端被截短。核酸片段還可以在天然或相應全長編碼序列的5’和3’端均被截短。本申請涉及表達盒，其特征在于，包含上述分離的核酸分子。本申請不限定表達盒中具體使用的啟動子和終止子，只要其適于在植物中表達即可。在一實施方案中，所述核酸分子與35S啟動子和nos終止子可操作地連接。本申請還涉及表達載體，其包含上述分離的核酸分子。在一些實施方案中，表達載體包含上述表達盒。在一些實施方案中，所述表達載體還包含PolyA序列和omega增強子。在一些實施方案中，表達載體還包含可以用于檢測所述表達載體在細胞中表達情況的其他表達盒。一些實施方案還包括轉化的微生物，例如農桿菌或大腸桿菌。所述轉化使用至少一種實施方案的核酸、包含所述核酸的表達盒或者包含所述表達盒的載體。在一些實施方案中，所述微生物是依靠植物增殖的微生物。一些實施方案還包括轉化的植物細胞或轉基因植物，其包含至少一種實施方案的核苷酸序列。在一些實施方案中，使用表達載體轉化植物，所述表達載體包含至少一種實施方案的核苷酸序列以及與其可操作地連接的在植物細胞中驅動表達的啟動子。轉化的植物細胞和轉基因植物表示基因組內包含異源多核苷酸的植物細胞或植物。一般來說，所述異源多核苷酸在轉化的植物細胞或轉基因植物的基因組內穩(wěn)定地整合，以致將所述多核苷酸傳遞給后代?？梢詫⑺霎愒炊嗪塑账釂为毜鼗蜃鳛楸磉_載體的一部分整合進基因組。在一些實施方案中，本申請涉及的植物為單子葉植物；任選地，所述植物選自：玉米、水稻、小麥、燕麥、大麥、青稞、粟、高粱和甘蔗。在一些實施方案中，本申請涉及的植物包括植物細胞、植物原生質體、可以再生出植物的植物細胞組織培養(yǎng)物、植物愈傷組織、植物團塊和植物細胞，其為完整的植物或者植物的部分，諸如胚胎，花粉，胚珠，種子，葉，花，枝，果實，果仁，穗，穗軸，殼，秸稈，根，根尖，花藥等等。本申請還包括源于本申請的轉基因植物或其子代、并因而至少部分地包含本申請的核苷酸序列的植物細胞、原生質體、組織、愈傷組織、胚胎以及花、莖、果實、葉以及根。雖然實施方案不依賴特定生物學機制來增加植物對植物害蟲的抗性，但是實施方案的核苷酸序列在植物中的表達可以導致產生實施方案的殺蟲蛋白以及提高所述植物對植物害蟲的抗性。實施方案的植物可以用于農業(yè)上影響蟲害的方法。某些實施方案提供轉化的農作物植物，其可以用于影響該植物的蟲害的方法，所述蟲害諸如鱗翅目害蟲。鱗翅目害蟲包括但不限于夜蛾科(Noctuidae)的害蟲：秋粘蟲(Spodopterafrugiperda)、甜菜夜蛾(Spodopteraexigua)、斜紋夜蛾(Spodopteralitura)、蓓帶夜蛾(Mamestraconfigurata)、甘藍夜蛾(Mamestrabrassicae)、黑切根蟲(Agrotisipsilon)、西部切根蟲(Agrotisorthogonia)、黃地老虎(Agrotissegetum)，木棉蟲(Alabamaargillacea)、粉紋夜蛾(Trichoplusiani)、大豆夜蛾(Pseudoplusiaincludens)、黎豆夜蛾(Anticarsiagemmatalis)、苜蓿綠夜蛾(Hypenascabra)、煙芽夜蛾(Heliothisvirescens)、一星粘蟲(Pseudaletiaunipuncta)、粗皮夜蛾(Athetismindara)、暗緣地老虎(Euxoamessoria)、埃及金剛鉆(Eariasinsulana)、翠紋金剛鉆(Eariasvittella)、美洲棉鈴蟲(Helicoverpaarmigera)、谷實夜蛾(Helicoverpazea)；螟蛾科(Pyralidae)的害蟲：亞洲玉米螟(Ostriniafurnacalis)、歐洲玉米螟(Ostrinianubilalis)、臍橙螟(Amyeloistransitella)、地中海粉螟(Anagastakuehniella)、干果斑螟(Cadracautella)、二化螟(Chilosuppressalis)、斑禾草螟(Chilopartellus)、米蛾(Corcyracephalonica)、玉米根結網毛蟲(Crambuscaliginosellus)、藍草結網毛蟲(Crambusteterrellus)、稻縱卷葉野螟(Cnaphalocrocismedinalis)、葡萄卷葉蟲(Desmiafuneralis)、甜瓜絹野螟(Diaphaniahyalinata)、西南玉米螟(Diatraeagrandiosella)、小蔗螟 (Diatraeasaccharalis)、墨西哥稻螟(Eoreumaloftini)、煙草粉螟(Ephestiaelutella)、蠟螟(Galleriamellonella)、水稻切葉野螟(Herpetogrammalicarsisalis)、向日葵斑螟(Homoeosomaelectellum)、南美玉米苗斑螟(Elasmopalpuslignosellus)、小蠟螟(Achroiagrisella)、草地螟(Loxostegesticticalis)、豆野螟(Marucatestulalis)、印度谷螟(Plodiainterpunctella)、三化螟(Scirpophagaincertulas)、溫室螟(Udearubigalis)；以及卷蛾科(Tortricidae)的害蟲：黑頭長翅卷蛾(Aclerisvariana)、果樹黃卷蛾(Archipsargyrospila)、歐洲卷葉蛾(Archipsrosana)、桔帶卷蛾(Argyrotaeniacitrana)、玫瑰色卷蛾(Choristoneurarosaceana)；以及其他：棉褐帶卷蛾(Adoxophyesorana)、條紋向日葵螟(Cochylishospes)、榛小卷蛾(Cydialatiferreana)、蘋果蠹蛾(Cydia.pomonella)、雜色卷葉蛾(Platynotaflavedana)、荷蘭石竹小卷蛾(Platynotastultana)、歐洲葡萄花翅小卷葉蛾(Lobesiabotrana)、蘋白小卷蛾(Spilonotaocellana)、葡萄果實蛀蟲(Endopizaviteana)、女貞細卷蛾(Eupoeciliaambiguella)、巴西蘋果卷葉蛾(Bonagotasalubricola)、梨小食心蟲(Grapholitamolesta)和向日葵芽蛾(Suleimahelianthana)等。鱗翅目的所選其它農藝害蟲包括但不限于：秋星尺蠖(Alsophilapometaria)、棉潛蛾(Bucculatrixthurberiella)、苜蓿黃蝶(Coliaseurytheme)、胡桃黃蝶(Datanaintegerrima)、白尺蠖(Ennomossubsignaria)、菩提尺蠖(Erannistiliaria)、黃毒蛾(Euproctischrysorrhoea)、黑擬蛉蛾(Harrisinaamericana)、美國白蛾(Hyphantriacunea)、番茄蠹蛾(Keiferialycopersicella)、二尾蛺蝶(Lambdinafiscellariafiscellaria)、西部鐵杉尺蠖(Lambdinafiscellarialugubrosa)、柳毒蛾(Leucomasalicis)、舞毒蛾(Lymantriadispar)、番茄天蛾(Manducaquinquemaculata)、煙草天蛾(Manducasexta)、冬尺蠖(Operophterabrumata)、春尺蠖(Paleacritavernata)、大鳳蝶(Papiliocresphontes)、加州株蟲(Phryganidiacalifornica)、柑橘潛葉蛾(Phyllocnistiscitrella)、斑幕潛葉蛾(Phyllonorycterblancardella)、大菜粉蝶(Pierisbrassicae)、小菜粉蝶(Pierisrapae)、暗脈菜粉蝶(Pierisnapi)、小菜蛾(Plutellaxylostella)、棉紅鈴蟲(Pectinophoragossypiella)、雜食尺蠖(Sabulodes aegrotata)、麥蛾(Sitotrogacerealella)、松異舟蛾(Thaumetopoeapityocampa)、袋衣蛾(Tineolabisselliella)、番茄斑潛蠅(Tutaabsoluta)和蘋果巢蛾(Yponomeutapadella)。實施例實施例1.抗蟲基因的設計與合成本申請的基因以經過融合與改造的Cry1Ab和Cry1AcN端608個氨基酸序列為基礎，并用植物偏愛的密碼子置換編碼序列。排除了DNA序列中存在的造成植物轉錄不穩(wěn)定的富含AT序列以及常用限制性酶切位點，然后通過置換密碼子的方法進行改正消除；并在3’端加上終止密碼子TAA，獲得一個改造的DNA序列；確定并化學合成改造的Bt基因如序列SEQIDNO:1。改造后的DNA序列編碼的蛋白質含有3個功能區(qū)段，其中N端兩個功能區(qū)高度同源于Cry1Ab對應部分，C端的功能區(qū)高度同源于Cry1Ac，因此本申請基因定名為Cry1Ab/Cry1AcZM。將該序列與郭三堆等人的序列(CN1037913C，1996)及孟山都轉基因玉米事件Mon810的Cry1Ab進行了同源性比對(結果見表1)，并計算了GC含量(結果見表2)。表1、DNA序列同源性比較比對DNA序列Cry1Ab/Cry1AcZMCN1037913C74.9％Mon81071.4％表2、Cry1Ab/Cry1AcZM及近緣序列GC含量百分比序列名稱GC比例％Cry1Ab/Cry1AcZM58CN1037913C48Mon81061實施例2.載體構建根據在植物中表達基因功能的需要，進一步對Cry1Ab/Cry1AcZM基因編碼區(qū)上下游進行了表達優(yōu)化設計，以此提高基因在轉錄水平上的強度和蛋白質翻譯的效率，包括在5’端增加了一段67個核苷酸的歐米茄(Ω)序列和3個核苷酸(acc)的Kozak序列(SEQIDNO:2)用來增強真核基因的翻譯效率，以及一段在3’端真核生物mRNA的poly(A)尾巴序列(SEQIDNO:3)，以增加由胞核向胞質的運輸及mRNA的穩(wěn)定性和翻譯效率。在合成的SEQIDNO:1的5’端添加HindIII和PstI酶切位點，3’端添加PmeI酶切位點，并將合成的序列克隆在Puc57simple載體上，命名為pzz01194。構建了4個植物表達載體，分述如下：(一)pZHZH25017的構建：限制酶HindIII和BamHI處理pzz00002獲得Ubi啟動子片段用T4DNA聚合酶補平產生的粘末端。限制酶PstI處理pzz01194，用T4DNA聚合酶補平產生的粘末端，將Ubi啟動子通過平末端連接方式連入，獲得含有Ubi-Cry1Ab/Cry1AcZM片段的載體，命名為pzz01201。EcoRI單酶切處理pzz01188獲得Tnos終止子片段，用T4DNA聚合酶補平產生的粘末端。PmeI處理pzz01201，將Tocs終止子通過平末端連接方式連入，獲得含有Ubi-Cry1Ab/Cry1AcZM-Tnos片段的載體，命名為pzz01205(圖1A)。HindIII+BamHI處理pzz00002獲得Ubi啟動子片段，用T4DNA聚合酶補平產生的粘末端。PstI處理pzz01194，用T4DNA聚合酶補平產生的粘末端，將Ubi啟動子通過平末端連接方式連入，獲得含有Ubi-Cry1Ab/Cry1AcZM片段的載體，命名為pzz01201。已有含有Tnos終止子(5’端有EcoRI酶切位點，3’端有PmeI，EcoRI位點)的載體，命名為pzz01188，Tnos終止序列可通過EcoRI單酶切 pzz01188獲得。EcoRI單酶切處理pzz01188獲得Tnos終止子片段，用T4DNA聚合酶補平產生的粘末端。PmeI處理pzz01201，將Tocs終止子通過平末端連接方式連入，獲得含有Ubi-Cry1Ab/Cry1AcZM-Tnos片段的載體pzz00015(圖1B)。取已構建好載體pzz00015(圖1B)，以該載體的pCambia3300(帶有35s-BAR-T35spolyA元件)為骨架通過HindIII+PmeI雙酶切加入Ubi-EGFP-T35spolyA元件，通過HindIII+PmeI去除Ubi-EGFP-T35spolyA，然后在該位點添加新元件。HindIII+PmeI處理pzz01205載體，獲得Ubi-Cry1Ab/Cry1AcZM-Tnos片段。HindIII+PmeI處理pzz00015載體，切口處連入Ubi-Cry1Ab/Cry1AcZM-Tnos，獲得含有Ubi-Cry1Ab/Cry1AcZM-Tnos和35s-BAR-T35spolyA兩個表達元件的表達載體命名為pZHZH25017，見圖1C。(二)pZHZH25018的構建：利用限制內切酶PstI處理pzz01194，用T4DNA聚合酶補平末端，將Ubi啟動子通過平末端連接方式連入，獲得含有Ubi-Cry1Ab/Cry1AcZM片段的載體，命名為pzz01201。利用限制內切酶HindIII+BamHI處理含有ubi啟動子的載體pzz00002獲得Ubi啟動子片段，用T4DNA聚合酶補平末端。已有含有Tocs終止子(5’端有EcoRI酶切位點，3’端有PmeI，EcoRI位點)的載體，命名為pzz01131，Tocs終止序列可通過EcoRI單酶切pzz01131獲得。EcoRI處理pzz01131獲得Tocs終止子片段，用T4DNA聚合酶補平產生的粘末端。PmeI處理pzz01201，將Tocs終止子通過平末端連接方式連入，獲得含有Ubi-Cry1Ab/Cry1AcZM-Tocs片段的載體，命名為pzz01206(見圖1D)。已構建好載體pzz00015，以該載體pCambia3300(帶有35s-BAR-T35spolyA元件)為骨架通過HindIII+PmeI雙酶切加入Ubi-EGFP-T35spolyA元件構成，可通過HindIII+PmeI去除Ubi-EGFP-T35spolyA，然后在該位點添加新元件。HindIII+PmeI處理pzz01206載體，獲得Ubi-Cry1Ab/Cry1AcZM-Tocs片段。HindIII+PmeI處理pzz00015載體，切口處連入Ubi-Cry1Ab/Cry1AcZM-Tocs，獲得含有Ubi-Cry1Ab/Cry1AcZM-Tocs和35s-BAR-T35spolyA兩個表達元件的表達載體命名為pZHZH25018(圖1E)。(三)pZHZH25020的構建1、已有含35S啟動子(5’端有SalI酶切位點，3’端有BamHI酶切位點)的載體，命名為pzz01143。2、SalI+BamHI雙酶切處理pzz01143獲得35S啟動子片段，用T4DNA聚合酶補平產生的粘末端。3、已有含有Rbcs-Cry1Ab/Cry1AcZM-Tnos片段的載體pzz01191，片段上的Rbcs啟動子可通過HindIII+PstI雙酶切去除。4、HindIII+PstI雙酶切處理pzz01191，去除Rbcs啟動子片段，剩下片段用T4DNA聚合酶補平粘末端。將步驟4獲得的35S啟動子片段連入，獲得含有35S-Cry1Ab/Cry1AcZM-Tnos的載體，命名為pzz01207(圖1F)。5、已構建好載體pzz00005(圖1G)，該載體以pCambia3300(帶有Ubi-BAR-T35spolyA元件)為骨架，帶有HindIII，PmeI酶切位點，可以通過這兩個位點添加外源片段。6、HindIII+PmeI處理pzz01207載體，獲得35S-Cry1Ab/Cry1AcZM-Tnos片段。7、HindIII+PmeI處理pzz00005載體，切口處連入35S-Cry1Ab/Cry1AcZM-Tnos，獲得含有35S-Cry1Ab/Cry1AcZM-Tnos和Ubi-BAR-T35spolyA兩個表達元件的表達載體，命名為 pZHZH25020(見圖1H)。(四)pZHZH25022的構建1.利用克隆載體pzz01194開展構建；2.已有含Ubi-Cry1Ab/Cry1AcZM-Tocs片段的載體(Cry1Ab/Cry1AcZM上的PolyA片段連同Tocs可通過EcoRI+PmeI雙酶切獲得)的載體，命名為pzz01206。3.已有含35S-Cry1Ab/Cry1AcZMZm-Tnos片段的載體(Cry1Ab/Cry1AcZM上的PolyA片段連同Tnos可通過EcoRI+PmeI雙酶切去除)的載體，命名為pzz01207。4.EcoRI+PmeI雙酶切處理pzz01206，獲得polyA+Tocs片段。5.EcoRI+PmeI雙酶切處理pzz01207，去除polyA+Tnos片段。將步驟5獲得的polyA+Tocs片段連入，獲得含有35S-Cry1Ab/CryAcZm-Tocs的載體，命名為pzz01228(圖1J)。6.已構建好載體pzz00005，該載體以pCambia3300(帶有Ubi-BAR-T35spolyA元件)為骨架，帶有HindIII，PmeI酶切位點，可以通過這兩個位點添加外源片段。7.HindIII+PmeI處理pzz01228載體，獲得35S-Cry1Ab/Cry1AcZm-Tocs片段。8.HindIII+PmeI處理pzz00005載體，切口處連入35S-Cry1Ab/Cry1AcZm-Tocs，獲得含有35S-Cry1Ab/Cry1AcZMZm-Tocs和Ubi-BAR-T35spolyA兩個表達元件的表達載體，命名為pZHZH25022(見圖1K)。表3、轉化載體表達盒結構序號載體號啟動子結構基因終止子其他基因1pZHZH25017UbiCry1Ab/Cry1AcZMNosBar2pZHZH25018UbiCry1Ab/Cry1AcZMOcsBar3pZHZH25020CaMV35SCry1Ab/Cry1AcZMNosBar4pZHZH25022CaMV35SCry1Ab/Cry1AcZMOcsBar實施例3.遺傳轉化(1)玉米的遺傳轉化：將載體DNApZHZH25017、pZHZH25018、pZHZH25020、pZHZH25022等質粒分別通過電擊法轉化到農桿菌EHA105中，鑒定后備用。玉米自交系祥249自交后取長度1.5mm左右的幼胚用于轉化。收集約200個果穗的幼胚為一批之后，置于EP管中把懸浮液吸出，加入含有200μM乙酰丁香酮的農桿菌菌液，共培養(yǎng)5分鐘，然后把幼胚轉移到共培養(yǎng)基上，暗培養(yǎng)三天。將暗培養(yǎng)后的幼胚放至愈傷誘導培養(yǎng)基上，有愈傷長出后，放至含5mg/L雙丙氨膦的篩選培養(yǎng)基上，篩選培養(yǎng)，每兩周繼代一次。當抗性愈傷長出時，挑選出狀態(tài)良好的胚性愈傷轉到分化培養(yǎng)基上，培養(yǎng)條件為26℃，每日3000Lux光強，光照16小時，兩周后出現再生小苗。將再生的小植株移到生根培養(yǎng)基中，待小苗長出二級次根后，移栽于混有營養(yǎng)土和蛭石(1∶3)的小盆中。同時取葉片樣品提取DNA，PCR測定確定陽性株，然后移栽至大花盆中。植株生長到7個葉后開展抗蟲性生測，自交或者雜交獲得T1代種子。(2)水稻的遺傳轉化：本申請以粳型水稻“空育131”為轉化受體，測試了Cry1Ab/Cry1AcZM在水稻中的表達。利用載體pZHZH25020，通過農桿菌介導的遺傳轉化方法將抗蟲和抗除草基因導入到水稻中。具體的步驟為：將構建的表達載體轉化入農桿菌中；將農桿菌菌液侵染水稻的胚性愈傷組織；將愈傷組織轉移到添加了草胺膦的選擇培養(yǎng)基上進行篩選，挑選抗性愈傷組織；將抗性愈傷組織轉入分化培養(yǎng)基分化，將分化形成的再生苗轉入生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)，幼苗生根后煉苗、移栽，得到T0代轉基因水稻轉化體200余株。對這些轉化事件進行PCR分析，篩選到陽性植株自交后得到種子，鑒定出50多個轉化事件的T1株系。播種出苗后對T1代材料進行Bt蛋白質表達分析。實施例4.利用PCR和Southern印跡進行轉基因事件的DNA分子鑒定(1)PCR檢測采用天根生化技術公司的DNA提取試劑盒抽提T0代轉基因玉米 基因組DNA。將下列試劑從-20度冰箱中取出解凍：10倍PCR緩沖液(Takara)、脫氧核苷酸混合物(10mM，Sigma)、正反向引物(正向引物CSP759(SEQIDNO:4)：5’-CACGCAGATTCCAGCGGTCAA-3’；反向引物CSP760(SEQIDNO:5)：5’-GACGAGGTGAAGGCGTTAGCA-3’)以及玉米葉片DNA模板。所有試劑解凍完畢后，簡短離心數秒，置于冰上待用。配制PCR反應體系的混合液，混勻，簡短離心數秒。PCR反應體系(20μl)：2μl10倍PCR緩沖液(Takara)，0.5μl脫氧核苷酸混合物(10mM，Sigma)，0.8μl正反向引物混合物(5μM)，0.2μlr-Taq(5U，Takara)，1μl玉米葉片DNA模板，其余為ddH2O。將混合液分裝至200μl規(guī)格的PCR管中，再加入1μl模板DNA，對于不同樣品分別做好標記以便區(qū)分。將PCR反應管放入Thermo9700型PCR擴增儀，選擇預設PCR擴增程序，開始運行反應。PCR反應程序為：94℃預變性2分鐘；30個以下循環(huán)：94℃變性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸30秒；最后72℃延伸5分鐘。PCR結束后，取5μlPCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。配制1.5％的瓊脂糖凝膠，150V電泳25分鐘后在溴化已啶(EB)中染色10分鐘，在紫外凝膠成像系統(tǒng)中拍照。Cry1Ab/Cry1AcZM基因為轉化載體所特有，這樣能擴增出該基因特異帶的轉基因植株即為陽性植株，否則即為陰性材料。圖2顯示出了玉米轉化苗T0的檢測結果，1-6泳道分別為不同的T0代轉基因事件，見附圖說明。T1代株系為T0代中選植株自交或雜交的后代，其PCR檢測結果亦為陽性。得到的陽性株和株系見表4。表4、常規(guī)PCR鑒定轉化植株情況序號載體號T0代陽性株數T1代陽性株系數1pZHZH25017120702pZHZH25018150803pZHZH2502090554pZHZH250229565注：T1代陽性株系數為T0代自交結實后的株系(2)Southern印跡鑒定提取轉基因玉米基因組總DNA，獲得的DNA沉淀干燥后溶于無離子水，測定濃度后備用。以pZHZH25018質粒DNA為模板制備探針。以序列4(SEQNO4，CSP759：CACGCAGATTCCAGCGGTCAA和CSP760：GACGAGGTGAAGGCGTTAGCA)為引物，采用羅氏公司PCR地高辛探針合成試劑盒(貨號：11636090910)合成用于Cry1Ab/Cry1AcZM的探針，探針大小為333bp。擴增體系包含：DNA模板5μL(50pg)，CSP759引物0.5μL，CSP760引物0.5μL，PCRDIG混合物5μL，DNA聚合酶0.75μL，PCR緩沖液(10倍)5μL，ddH2O33.25μL。PCR反應程序為：94℃預變性5分鐘；35個以下循環(huán)：94℃變性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸45秒；最后72℃延伸7分鐘。待PCR擴增完畢，產物于12℃保存，以1％凝膠檢測標記效果。進行樣品酶切及酶切片段回收，200μL酶切體系中含有20μg玉米基因組DNA、20μl限制性內切酶、20μl10倍緩沖液，加ddH2O補齊至200μl。酶切16h后取20μl進行電泳檢測，檢測酶切效果是否徹底。酶切產物加ddH2O補齊至400μl，加入1/10體積的3M醋酸鈉溶液(pH5.2)，加入4μl的Dr.GenTLEPrecipitationCarrier，加入2.5倍體積的無水乙醇，充分混勻，12,000rpm4℃離心15分鐘。將沉淀用50μlddH2O溶解，加5μl6倍上樣緩沖液。將DNA通過0.8％凝膠，20V電泳16h。切掉多余泳道及點樣孔，剩余凝膠用變性溶液處理2次，每次15分鐘，在搖床上輕搖。再用中和緩沖液處理2次，每次15分鐘，在搖床上輕搖。超純水清洗一次。20倍SSC處理10分鐘中，用whatman系統(tǒng)進行轉膜4小時以上。轉膜結束后，將膜放置在用10倍SSC浸潤的Whatman3MM濾紙上，紫外交聯儀交聯3-5分鐘。用ddH2O簡單洗膜，于空氣中干燥。雜交及顯影過程均按照羅氏地高辛檢測試劑盒I(貨號：11745832910)的操作手冊進行。本實驗檢測外源基因整合到玉米基因組的拷貝數以及轉化事件的異同。通過HindIII和NcoI內切酶分別切割基因組DNA，得到了整合到玉米基因組拷貝數的結果(圖3)。圖3示出了一轉化事件T1代株系玉米基因組DNA由HindIII酶切與Cry1Ab/Cry1AcZM特異探針分子雜交結果，探針長度333bp。1、6泳道為陰性對照祥249；2、7泳道為T1-1；3、8泳道為T1-2；4、9泳道為T1-3；5、10泳道為T1-4材料。M為分子量標記泳道，有堿基對數標出。兩種酶切條件下分別顯示一條陽性帶，表明外源基因單拷貝插入。通過這種方法鑒定出一批不同轉化載體和不同插入位點的單拷貝轉化事件。4個載體中(pZHZH25017，pZHZH25018，pZHZH25020，pZHZH25022)，每個轉化載體鑒定出超過15個以上單拷貝轉化事件。實施例5.轉基因植物中Bt蛋白質表達測定分別用免疫試紙條和酶聯免疫反應定量(ELISA)兩種方法測定了抗蟲蛋白在轉基因植物體內的含量。(一)免疫試紙鑒定利用生物技術公司產品AntiCry1Ab(Cry1Ac)試紙條通過如下步驟檢測植物組織中的蛋白。取樣：定量取測定組織(葉片、花絲等)，加PBS水溶液磨碎樣品(0.2克樣品加1ml溶液)，離心取上清液待測。檢測時取試紙條，檢測端浸入樣品；5-10分鐘后觀察結果。對照線顯出表示試驗正常，檢測線是否顯出表示溶液中是否含有檢測蛋白。如圖所示，PCR檢測呈陽性的轉基因植株全部可以檢測出條帶來，而野生型對照材料沒有檢測出條帶。表明外源的Cry1Ab/Cry1Ac基因可以在轉基因玉米細胞內表達出蛋白質。圖4示出了玉米轉化苗T0代6個植株的免疫測定結果，其中：1-6號材料為陽性，7材料為陰性。通過這種方法鑒定了一批不同轉化載體的單拷貝轉化事件蛋白質表達。4個載體中(pZHZH25017，pZHZH25018，pZHZH25020，pZHZH25022)，每個轉化載體鑒定出超過15個以上的T0代轉化苗。(二)ELISA檢測葉片中抗蟲蛋白質含量利用雙抗體夾心法酶聯免疫定量檢測(ELISA)試劑盒，測定了由Cry1Ab/Cry1AcZM編碼的Bt蛋白質在玉米和水稻不同轉化事件植株葉片中的含量。酶聯免疫定量檢測試劑盒為上海佑隆生物科技有限公司的產品，具體操作流程參照廠家說明書。利用TecaninfiniteM200pro酶標儀，配置軟件i-control1.10，在450nm處檢測并讀取數據。根據標準蛋白質樣品濃度和讀出的OD值繪制標準曲線，計算待測樣品的Bt蛋白質含量(μg/g鮮重材料)。(1)檢測玉米葉片中Bt蛋白質含量ELISA檢測的過程簡述如下：取T1代(pZHZH25018)9葉一心時期玉米新鮮葉片，取樣后用電子天平(萬分之一克感量)稱量鮮重5mg，加樣品提取液(PBS)250μl，鋼珠法葉片勻漿提取總蛋白質，4000rpm離心5分鐘后吸取上清液稀釋后進行ELISA反應測定。根據廠家提供的Cry1Ab/Cry1Ac蛋白質標準品繪制了標準曲線(R2＝0.993)，用來對待測樣品進行定量。根據標準曲線方程計算出了未知樣品的濃度，以及葉片的Bt蛋白質含量(每克鮮重葉片中所含的微克數)，每組取樣數n＝12。免疫印跡結果在表5A示出。表5A、不同轉化事件的玉米葉片Bt蛋白質含量材料編號平均值(μg/g)標準誤備注15.772684*0.68200925.435507*0.21292735.427482*0.47341245.427482*0.47341254.087210.277786陽性對照60.0150.12陰性對照備注：*為與陽性對照相比差異顯著；供試材料中1-5號材料為中選的轉化事件，5號材料為內部陽性對照，6號材料為陰性對照祥249。統(tǒng)計分析表明1-4號材料Bt蛋白質含量顯著 高于5號材料。實驗證明本申請所測Bt基因在中選轉化事件玉米葉片中表達良好，鮮葉片中Cry1Ab/Cry1Ac蛋白質含量介于5-6μg/g之間。(2)檢測水稻葉片中Bt蛋白質含量ELISA檢測的過程簡述如下：T1代植株(pZHZH25020)7葉一心時期水稻新鮮葉片，取樣后用電子天平(萬分之一克感量)稱量鮮重5mg，加樣品提取液(PBS)250μl，鋼珠法葉片勻漿提取總蛋白質，4000rpm離心5分鐘后吸取上清液稀釋后進行ELISA反應測定。根據廠家提供的Cry1Ab/Cry1Ac蛋白質標準品繪制了標準曲線(R2＝0.997)，用來測定分析待測樣品。根據標準曲線方程計算出了未知樣品的濃度，以及葉片的Bt蛋白質含量(每克鮮重葉片中所含的微克數)，每組取樣數n＝6。測定了5個不同轉化事件的植株葉片，結果列入表5B。表5B、水稻不同轉化事件葉片Bt蛋白質(Cry1Ab/Cry1Ac)含量材料編號平均值(μg/g)標準誤備注T1-14.3459540.77963T1-21.2166330.348865T1-34.585970.77226T1-46.992914*0.423833T1-57.902484*0.883617CK-65.0329860.495962陽性對照CK-7-0.010.1陰性對照注：*為與陽性對照相比差異顯著供試材料中T1-1至T1-5號為中選的水稻轉化事件，6號材料為內部陽性對照，7號材料為陰性對照。統(tǒng)計分析表明4、5號材料蛋白質含量顯著高于內部對照陽性材料6號。實驗證明本申請所測Bt基因在中選轉化事件水稻葉片中表達良好，鮮葉片中其Cry1Ab/Cry1Ac蛋白質含量介于4-8μg/g之間。實施例6.T0和T1抗除草劑性狀鑒定除草劑抗性鑒定：將T0代陽性植株經過自交或者測交得到的種子播種于大棚溫室，對6-8葉片期T1代植株進行除草劑抗性鑒定，去除不含抗性基因的植株。由于Cry1Ab/Cry1AcZM基因與抗草胺膦基因同在T-DNA左右邊界序列內，同時被轉化到受體玉米中。T0代和T1代自交的情況下，T2代株系植株群體除草劑抗性分離比例是判斷基因純合的依據之一。噴施所用除草劑保試達為拜耳作物科學(中國)有限公司生產，有效成分為18％草胺膦可溶液劑。草胺膦耐受性鑒定濃度的確定：該除草劑的推薦用量為150-300ml/畝(兌水30-40公斤)，即稀釋100-267倍，因此本申請采用100倍稀釋的保試達溶液涂抹心葉期(6～8片完全展開葉)玉米轉化事件的倒二葉(剪去葉尖作為考察標記)。4-5天后觀察并記錄除草劑耐性表現。結果表明，本實驗得到了大批葉片高抗草胺磷的轉化事件。4個載體中(pZHZH25017，pZHZH25018，pZHZH25020，pZHZH25022)，每個轉化載體都鑒定出超過50個以上的T0代轉化苗以及隨后的T1和T2的株系。實施例7.轉基因玉米植株抗蟲生測采用離體葉片法和離體花絲法兩種快速測定了T0和T1植株材料抗蟲方法進行了生測實驗。(1)離體葉片鑒定法測定轉基因玉米對玉米螟的離體抗性。當待測玉米長到6-7葉時剪取倒二葉葉端部分，放入直徑9cm的培養(yǎng)皿中，皿底以1300μL蒸餾水打濕濾紙以保持高濕。每皿中接玉米螟初孵幼蟲10頭，并用透氣性較好的醫(yī)用膠布封口。每株3個重復，以未轉基因的自交系祥249作陰性對照，另設內部陽性對照。在溫度28℃、濕度75％、光照：黑暗＝14：10的條件下培養(yǎng)。4天后檢查每皿的死蟲頭數，并計算螟蟲死亡率及校正死亡率。校正死亡率(％)＝(處理死亡率-對照死亡率)/(1-對照死亡率)。結果表明，本實驗得到了葉片高抗玉米螟的轉化事件(見圖5A和表6)。表6、T0代不同Bt基因序列表達盒轉化事件葉片抗蟲表現注：T0代每個載體參試12個陽性植株；(2)離體花絲鑒定法T1代優(yōu)異轉化事件，播種于溫室。在玉米花絲盛期取新鮮花絲帶回室內，整根纏繞幾次后放入培養(yǎng)皿中，接蟲方法和培養(yǎng)條件同離體葉片法，4天后檢查玉米螟幼蟲的存活狀況。結果表明本實驗得到了花絲高抗玉米螟的轉化事件(見圖5B和表7)。表7、T1代不同Bt基因序列表達盒優(yōu)異轉化事件抗蟲表現注：T1代每個載體參試最優(yōu)轉化事件3個，每轉化事件設3個重復，根據結果計算分類。葉片高抗螟蟲的轉基因材料以轉化事件株系為單位，通過自交或者雜交結實，收獲種子。用于進一步的分析鑒定和后代的轉基因育種。實施例8.與現有基因的比較根據現有技術(CN1037913C)中的核苷酸序列，與實施例2-6相同地進行轉化和轉化苗的抗蟲性鑒定。將CN1037913C的序列根據實施例2所述構建了一個由CaMV35S啟動子驅動和具有Nos終止子的載體，命名為pCN1037913C。利用農桿菌轉化技術將pCN1037913C轉入祥249中，并通過分子鑒定獲得了一批具有外源抗蟲Bt基因的植株，均為pCN1037913C載體的不同轉化事件。然后，根據實施例5，將pCN1037913C系列轉化事件與本申請創(chuàng)制的多個不同載體玉米轉化事件在相同條件下進行抗玉米螟蟲特性比較。T0代不同Bt基因序列表達盒轉化事件葉片抗蟲表現結果列入表8。T1代不同Bt基因序列表達盒優(yōu)異轉化事件抗蟲表現結果列入表9。表8、T0代不同Bt基因序列表達盒轉化事件葉片抗蟲表現注：T0代每個載體參試12個陽性植株。表9、不同Bt基因序列表達盒優(yōu)異轉化事件抗蟲表現注：T1代每個載體參試最優(yōu)轉化事件3個，每轉化事件設3個重復，根據結果計算并分類。結果表明，本申請設計的Bt基因Cry1Ab/Cry1AcZM序列殺蟲性能好于已有序列。優(yōu)異轉基因事件中的T0代葉片、T1代葉片和花絲對玉米螟有更強的殺滅能力。本文所引用的所有參考文獻均通過引用整體并入本文并用于所有目的，其程度與單個出版物被明確地并單獨地指出通過引用整體并入本文用于所有目的相同。當通過引用并入的出版物和專利或專利申請與本說明書中包含的公開內容相沖突時，本說明書中的內容替代和/或優(yōu)先于任何這類相沖突的引用材料。用于說明書和權利要求中的表達成分的量、層析條件等的所有數字應當理解為在所有情況下被術語“約”修飾。因此，除非另有所指，說明書和所附權利要求書中陳述的數字參數為近似值，其可根據本申請試圖獲得的所需性能而改變。本文描述的具體實施方案僅通過實例的方式提供，并且不試圖以任何方式具有限制意義。說明書和實施例僅被認為是示例性的，本申請的真實范圍由權利要求書所限定。如對本領域技術人員所顯而易見的，可進行本申請的許多修飾和改變，而不脫離其精神和范圍。因此，在不偏離本申請精神的基礎上所做的這些修改或改進，均屬于本申請要求保護的范圍。當前第1頁1 2 3