本發(fā)明涉及一種抗腫瘤蛋白內(nèi)皮抑素的衍生物及應(yīng)用，屬于生物醫(yī)藥抗腫瘤藥物領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

腫瘤生長(zhǎng)依賴血管的形成，而血管的形成又受到血管生長(zhǎng)因子和抑制因子的調(diào)節(jié)，抑制腫瘤血管的生長(zhǎng)是治療腫瘤的有效方法。內(nèi)皮抑素(Endostatin)具有抑制血管生成的功能，所以在腫瘤的抗新生血管治療中受到了重視。內(nèi)皮抑素是膠原蛋白XVIII的水解而產(chǎn)生的C端184個(gè)氨基酸片斷，它能有效抑制多種不同種類(lèi)腫瘤，生物學(xué)作用呈廣譜性，也無(wú)耐藥性，是迄今發(fā)現(xiàn)的最好的血管生成抑制因子(Exp Cell Res,312,594-607,2006)。

但是，在猴子實(shí)驗(yàn)和人的臨床試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮抑素的半衰期很短，呈現(xiàn)指數(shù)級(jí)降解，10小時(shí)前后內(nèi)皮抑素的體內(nèi)含量遞減百倍甚至接近為零(Acta Pharmacol Sin,26,124-128,2005；J Clin Oncol,20,3792-3803,2002)，表明它在動(dòng)物體內(nèi)很不穩(wěn)定，這將大大影響內(nèi)皮抑素的抗腫瘤治療效果。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供半衰期長(zhǎng)、抗腫瘤生物活性高的抗腫瘤蛋白內(nèi)皮抑素的衍生物。

本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供抗腫瘤蛋白內(nèi)皮抑素的衍生物在制備抗癌藥物的應(yīng)用。

本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供編碼上述內(nèi)皮抑素的衍生物的DNA片斷在制備抗腫瘤藥物的應(yīng)用。

一種抗腫瘤蛋白內(nèi)皮抑素的衍生物，所述內(nèi)皮抑素的氨基酸序列用SEQ.ID.NO4所示；所述衍生物包括：內(nèi)皮抑素與抗體IgG不變區(qū)連接；或在內(nèi)皮抑素的N端前面引入Arg；或在內(nèi)皮抑素的N端前面、或C端后面、或N端前面和C端后面引入糖基化位點(diǎn)的氨基酸短肽；或內(nèi)皮抑素的氨基酸序列的Arg62Arg63其中一個(gè)Arg發(fā)生點(diǎn)突變、或Arg128Arg129其中一個(gè)Arg發(fā)生點(diǎn)突變、或Arg62Arg63其中一個(gè)Arg發(fā)生點(diǎn)突變的同時(shí)Arg128Arg129其中一個(gè)Arg發(fā)生點(diǎn)突變?；騼?nèi)皮抑素與抗體IgG不變區(qū)連接，在內(nèi)皮抑素的N端前面引入Arg，在內(nèi)皮抑素的N端前面、或C端后面、或N端前面和C端后面引入糖基化位點(diǎn)的氨基酸短肽，內(nèi)皮抑素的氨基酸序列的Arg62Arg63其中一個(gè)Arg發(fā)生點(diǎn)突變、或Arg128Arg129其中一個(gè)Arg發(fā)生點(diǎn)突變、或Arg62Arg63其中一個(gè)Arg發(fā)生點(diǎn)突變的同時(shí)Arg128Arg129其中一個(gè)Arg發(fā)生點(diǎn)突變。

IgG不變區(qū)為CH1、CH1CH2或CH1CH2CH3，所述內(nèi)皮抑素與CH1連接的氨基酸序列為SEQ.ID.NO8；所述內(nèi)皮抑素與CH1CH2連接的氨基酸序列為SEQ.ID.NO10；內(nèi)皮抑素與CH1CH2CH3連接的氨基酸序列為SEQ.ID.NO12。

內(nèi)皮抑素的N端前面引入Arg為在內(nèi)皮抑素的N端前面連接一個(gè)短肽，所述短肽中含有一個(gè)以上的Arg。

糖基化位點(diǎn)為Asn-X-Ser或Asn-X-Thr，其中X為其它氨基酸。

Arg發(fā)生點(diǎn)突變?yōu)镠is。

抗腫瘤蛋白內(nèi)皮抑素的衍生物的氨基酸序列最好是SEQ.ID.NO20所示。

編碼權(quán)利要求6所述的抗腫瘤蛋白內(nèi)皮抑素的衍生物的核酸序列是SEQ.ID.NO19所示。

上述抗腫瘤蛋白內(nèi)皮抑素的衍生物在制備抗癌藥物的應(yīng)用。

編碼上述抗腫瘤蛋白內(nèi)皮抑素的衍生物的DNA片斷在制備抗癌藥物的應(yīng)用。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)

本發(fā)明的抗腫瘤蛋白內(nèi)皮抑素衍生物在體內(nèi)穩(wěn)定，半衰期長(zhǎng)、抗腫瘤生物活性高。

附圖說(shuō)明

圖1是實(shí)施例1的前置序列-內(nèi)皮抑素分別連接抗體IgG不變區(qū)CH1、不變區(qū)CH1CH2、不變區(qū)CH1CH2CH3所構(gòu)建的融合蛋白的抗腫瘤活性的實(shí)驗(yàn)。圖中1：生理鹽水；2：前置序列-內(nèi)皮抑素；3：前置序列-內(nèi)皮抑素-抗體IgG部分不變區(qū)CH1融合蛋白；4：前置序列-內(nèi)皮抑素-抗體IgG部分不變區(qū)CH1CH2融合蛋白；5：前置序列-內(nèi)皮抑素-抗體IgG不變區(qū)CH1CH2CH3融合蛋白。

圖2是實(shí)施例1的前置序列-內(nèi)皮抑素分別連接抗體IgG不變區(qū)CH1、不變區(qū)CH1CH2、不變區(qū)CH1CH2CH3所構(gòu)建的融合蛋白以及內(nèi)皮抑素在小鼠體內(nèi)半衰期的實(shí)驗(yàn)。圖中樣品(從上到下)，●前置序列-內(nèi)皮抑素-抗體IgG不變區(qū)CH1CH2CH3融合蛋白；▲前置序列-內(nèi)皮抑素-抗體IgG部分不變區(qū)CH1CH2融合蛋白；■前置序列-內(nèi)皮抑素-抗體IgG部分不變區(qū)CH1融合蛋白；◆前置序列-內(nèi)皮抑素

圖3是實(shí)施例2的前置序列-內(nèi)皮抑素-抗體IgG不變區(qū)融合蛋白中的內(nèi)皮抑素N端前面短肽中的Arg的點(diǎn)突變的實(shí)驗(yàn)。圖中：樣品1：前置序列-內(nèi)皮抑素-抗體IgG不變區(qū)融合蛋白；樣品2：前置序列-內(nèi)皮抑素-抗體IgG不變區(qū)融合蛋白N端的點(diǎn)突變體1；樣品3：前置序列-內(nèi)皮抑素-抗體IgG不變區(qū)融合蛋白N端的點(diǎn)突變體2；樣品4：前置序列-內(nèi)皮抑素-抗體IgG不變區(qū)融合蛋白N端的點(diǎn)突變體3；樣品5：生理鹽水(對(duì)照)。

圖4是實(shí)施例3的引入糖基化位點(diǎn)短肽的前置序列-內(nèi)皮抑素-抗體IgG不變區(qū)融合蛋白的抗腫瘤活性的實(shí)驗(yàn)。樣品1：前置序列-內(nèi)皮抑素-抗體IgG不變區(qū)融合蛋白(SEQ ID NO.12)；樣品2：前置序列-內(nèi)皮抑素-抗體IgG不變區(qū)融合蛋白糖基化位點(diǎn)突變體1(SEQ ID NO.14)；樣品3：前置序列-內(nèi)皮抑素-抗體IgG不變區(qū)融合蛋白糖基化位點(diǎn)突變體2(SEQ ID NO.16)；樣品4：前置序列-內(nèi)皮抑素-抗體IgG不變區(qū)融合蛋白糖基化位點(diǎn)突變體3(SEQ ID NO.18)

圖5是實(shí)施例3的引入糖基化短肽的前置序列-內(nèi)皮抑素-抗體IgG不變區(qū)融合蛋白在小鼠體內(nèi)半衰期的實(shí)驗(yàn)。樣品(從上到下)：●前置序列-內(nèi)皮抑素-抗體IgG不變區(qū)融合蛋白糖基化位點(diǎn)突變體3(SEQ ID NO.18)；▲前置序列-內(nèi)皮抑素-抗體IgG不變區(qū)融合蛋白糖基化位點(diǎn)突變體2(SEQ ID NO.16)；■前置序列-內(nèi)皮抑素-抗體IgG不變區(qū)融合蛋白糖基化位點(diǎn)突變體1(SEQ ID NO.14)；◆前置序列-內(nèi)皮抑素-抗體IgG不變區(qū)融合蛋白(SEQ ID NO.12)。

圖6是實(shí)施例4的前置序列-內(nèi)皮抑素-抗體IgG不變區(qū)融合蛋白糖基化位點(diǎn)突變體2(SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16)在引入的糖基化位點(diǎn)(Asn210-Ser211-Thr212)上再進(jìn)行點(diǎn)突變的各種點(diǎn)突變體的抗腫瘤活性的實(shí)驗(yàn)。樣品1：點(diǎn)突變體Asn210-Ser211-Thr212；樣品2：點(diǎn)突變體Asn210-Ala211-Thr212；樣品3：點(diǎn)突變體Asn210-Tyr211-Thr212；樣品4：點(diǎn)突變體Asn210-Ser211-Ser212；樣品5：點(diǎn)突變體Asn210-Ala211-Ser212；樣品6：沒(méi)有引入糖基化位點(diǎn)的前置序列-內(nèi)皮抑素-抗體IgG不變區(qū)融合蛋白。

圖7是實(shí)施例4的圖6中的各種點(diǎn)突變體融合蛋白在小鼠體內(nèi)半衰期的實(shí)驗(yàn)。樣品(從上到下)x點(diǎn)突變體(Asn210-Tyr211-Thr212)；+點(diǎn)突變體(Asn210-Ser211-Ser212)；■點(diǎn) 突變體(Asn210-Ser211-Thr212)；▲點(diǎn)突變體(Asn210-Ala211-Thr212)；●點(diǎn)突變體(Asn210-Ala211-Ser212)；◆沒(méi)有引入糖基化位點(diǎn)的前置序列-內(nèi)皮抑素-抗體IgG不變區(qū)融合蛋白。

圖8是實(shí)施例5的以前置序列-內(nèi)皮抑素-抗體IgG不變區(qū)CH1CH2CH3融合蛋白(SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12)作為實(shí)驗(yàn)材料，對(duì)于Arg85-Arg86位置進(jìn)行點(diǎn)突變的各種點(diǎn)突變體的抗腫瘤活性的實(shí)驗(yàn)。1：點(diǎn)突變體1(Ala85-Arg86)；2：點(diǎn)突變體2(Ser85-Arg86)；3：點(diǎn)突變體3(His85-Arg86)；4：點(diǎn)突變體4(Arg85-Ala86)；5：點(diǎn)突變體5(Arg85-Ser86)；6：點(diǎn)突變體6(Arg85-His86)；7：沒(méi)有突變?nèi)诤系鞍?SEQ ID NO.12)。

圖9是實(shí)施例5的圖8中的各種點(diǎn)突變體融合蛋白在小鼠體內(nèi)半衰期的實(shí)驗(yàn)。樣品(從上到下)，+點(diǎn)突變體6(Arg85-His86)；x點(diǎn)突變體3(His85-Arg86)；▲點(diǎn)突變體2(Ser85-Arg86)；●點(diǎn)突變體5(Arg85-Ser86)；■點(diǎn)突變體1(Ala85-Arg86)；*點(diǎn)突變體2(Ser85-Arg86)；◆沒(méi)有突變?nèi)诤系鞍?SEQ ID NO.12)。

圖10是實(shí)施例5的以前置序列-內(nèi)皮抑素-抗體IgG不變區(qū)CH1CH2CH3融合蛋白(SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12)作為實(shí)驗(yàn)材料，對(duì)于Arg151-Arg152位置進(jìn)行點(diǎn)突變的各種點(diǎn)突變體的抗腫瘤活性的實(shí)驗(yàn)。1：點(diǎn)突變體7(Ala151-Arg152)；2：點(diǎn)突變體8(Ser151-Arg152)；3：點(diǎn)突變體9(His151-Arg152)；4：點(diǎn)突變體10(Arg151-Ala152)；5：點(diǎn)突變體11(Arg151-Ser152)；6：點(diǎn)突變體12(Arg151-His152)；7：沒(méi)有突變?nèi)诤系鞍?SEQ ID NO.12)。

圖11是實(shí)施例5的圖10中的各種點(diǎn)突變體融合蛋白在小鼠體內(nèi)半衰期的實(shí)驗(yàn)。樣品(從上到下)，x點(diǎn)突變體9(His151-Arg152)；+點(diǎn)突變體12(Arg151-His152)；*點(diǎn)突變體10(Arg151-Ala152)；■點(diǎn)突變體7(Ala151-Arg152)；▲點(diǎn)突變體8(Ser151-Arg152)；●點(diǎn)突變體11(Arg151-Ser152)；◆沒(méi)有突變?nèi)诤系鞍?SEQ ID NO.12)。

圖12是實(shí)施例6的內(nèi)皮抑素的N端前面和C端后面的各加入糖基化位點(diǎn)以及內(nèi)皮抑素內(nèi)的2組ArgArg的改造的融合蛋白的抗腫瘤活性的實(shí)驗(yàn)。樣品1：前置序列-內(nèi)皮抑素-抗體IgG不變區(qū)CH1CH2CH3融合蛋(SEQ ID NO.12)；樣品2：前置序列-內(nèi)皮抑素-抗體IgG不變區(qū)CH1CH2CH3融合蛋點(diǎn)突變體1(His85-Arg86和His151-Arg152)；樣品3：前置序列-內(nèi)皮抑素-抗體IgG不變區(qū)CH1CH2CH3融合蛋點(diǎn)突變體2(Arg85-His86和Arg151-His152)；樣品4：前置序列-內(nèi)皮抑素(N端前面和C端后面的各加入糖基化位點(diǎn))-抗體IgG不變區(qū)CH1CH2CH3融合蛋白(SEQ ID NO.18)；樣品5：前置序列-內(nèi)皮抑素(N端前面和C端后面的各加入糖基化位點(diǎn))-抗體IgG不變區(qū)CH1CH2CH3融合蛋白點(diǎn)突變體1(Arg94His95和Arg160His161)；樣品6：前置序列-內(nèi)皮抑素(N端前面和C端后面的各加入糖基化位點(diǎn))-抗體IgG不變區(qū)CH1CH2CH3融合蛋白點(diǎn)突變體2(His94Arg95和His160Arg161)(SEQ ID NO.20)。

圖13是實(shí)施例6的圖12中的各種突變體的融合蛋白在小鼠體內(nèi)半衰期的實(shí)驗(yàn)。樣品(從上到下)，●內(nèi)皮抑素的N端前面和C端后面的各加入糖基化位點(diǎn)的融合蛋白點(diǎn)突變體2(His94Arg95和His160Arg161)(SEQ ID NO.20)；+內(nèi)皮抑素的N端前面和C端后面的各加入糖基化位點(diǎn)的融合蛋白點(diǎn)突變體1(Arg94His95和Arg160His161)；■前置序列-內(nèi)皮抑素-抗體IgG不變區(qū)CH1CH2CH3融合蛋點(diǎn)突變體1(His85-Arg86和His151-Arg152)；x內(nèi)皮抑素的N端前面和C端后面的各加入糖基化位點(diǎn)的融合蛋白(SEQ ID NO.18)；▲前置序列-內(nèi)皮抑素-抗體IgG不變區(qū)CH1CH2CH3融合蛋點(diǎn)突變體2(Arg85-His86和Arg151-His152)；◆前置序列-內(nèi)皮抑素-抗體IgG不變區(qū)CH1CH2CH3融合蛋(SEQ ID NO.12)。

圖14是腫瘤模型的小鼠解剖的照片，圖中1：實(shí)施例1中的作為對(duì)照的注射生理鹽水的小鼠；2：實(shí)施例6中的注射樣品6融合蛋白(內(nèi)皮抑素的N端前面和C端后面的各加入糖基化位點(diǎn)的融合蛋白點(diǎn)突變體2)(SEQ ID NO.20)的小鼠；箭頭所指的是腫瘤。

圖15是實(shí)施例7的內(nèi)皮抑素及各種內(nèi)皮抑素衍生物抗腫瘤的實(shí)驗(yàn)。1：內(nèi)皮抑素；2：前置序列-內(nèi)皮抑素蛋白(內(nèi)皮抑素的N端前面有2個(gè)Arg)；3：糖基化位點(diǎn)短肽-內(nèi)皮抑素-糖基化位點(diǎn)短肽蛋白；4：發(fā)生點(diǎn)突變(His62Arg63和His128Arg129)的內(nèi)皮抑素；5：內(nèi)皮抑素-抗體IgG不變區(qū)融合蛋白；6：前置序列-內(nèi)皮抑素(N端前面和C端后面各加入糖基化位點(diǎn))-抗體IgG不變區(qū)融合蛋白點(diǎn)突變體2(His94Arg95和His160Arg161)(SEQ ID NO.20)；7：生理鹽水。

圖16是實(shí)施例7的圖15中的內(nèi)皮抑素及各種內(nèi)皮抑素衍生物在小鼠體內(nèi)半衰期的實(shí)驗(yàn)。樣品(從上到下)，●前置序列-內(nèi)皮抑素(N端前面和C端后面各加入糖基化位點(diǎn))-抗體IgG不變區(qū)融合蛋白點(diǎn)突變體2(His94Arg95和His160Arg161)(SEQ ID NO.20)；+內(nèi)皮抑素-抗體IgG不變區(qū)融合蛋白；▲糖基化位點(diǎn)短肽-內(nèi)皮抑素-糖基化位點(diǎn)短肽蛋白；x發(fā)生點(diǎn)突變(His62Arg63和His128Arg129)的內(nèi)皮抑素；■前置序列-內(nèi)皮抑素蛋白(內(nèi)皮抑素的N端前面有2個(gè)Arg)；◆內(nèi)皮抑素。

具體實(shí)施方式

下面通過(guò)具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明。

改造方法一：內(nèi)皮抑素衍生物包括內(nèi)皮抑素與抗體不變區(qū)連接而構(gòu)建的融合蛋白，本發(fā)明把內(nèi)皮抑素與抗體不變區(qū)連接，特別是IgG抗體的不變區(qū)CH1、CH1CH2或CH1CH2CH3。同時(shí)在內(nèi)皮抑素的前面連接一個(gè)前置序列，它是由人白蛋白的信號(hào)肽和成熟后白蛋白的N端的5個(gè)氨基酸短肽組成，信號(hào)肽是為了讓表達(dá)的融合蛋白能夠分泌到動(dòng)物細(xì)胞外。這樣，通過(guò)增加蛋白的分子量來(lái)提高內(nèi)皮抑素衍生物的半衰期。

改造方法二：內(nèi)皮抑素衍生物是以前置序列-內(nèi)皮抑素-IgG抗體不變區(qū)CH1CH2CH3融合蛋白為實(shí)驗(yàn)材料，在內(nèi)皮抑素的N端前面引入精氨酸(Arg)，通過(guò)額外的Arg來(lái)加強(qiáng)內(nèi)皮抑素的抗腫瘤的生物活性。

改造方法三：內(nèi)皮抑素衍生物是以前置序列-內(nèi)皮抑素-IgG抗體不變區(qū)CH1CH2CH3融合蛋白為實(shí)驗(yàn)材料，在內(nèi)皮抑素的前面或后面引入糖基化位點(diǎn)。包括動(dòng)物在內(nèi)的真核生物的蛋白的糖鏈發(fā)生在Asn-X-Ser/Thr位置上，其中X是除了Pro、Asp或Glu以外的氨基酸，糖鏈?zhǔn)沁B接在Asn上。為了提高前置序列-內(nèi)皮抑素-IgG抗體不變區(qū)CH1CH2CH3融合蛋白的半衰期，本發(fā)明在前置序列-內(nèi)皮抑素-IgG抗體不變區(qū)CH1CH2CH3融合蛋白中的內(nèi)皮抑素的N端前面或C端后面引入糖基化位點(diǎn)或N端前面和C端后面同時(shí)引入糖基化位點(diǎn)，選擇的糖基化位點(diǎn)的氨基酸是AsnSerThr，在這個(gè)位點(diǎn)的前后再加入額外的短肽GlyAlaSer，這樣最后的結(jié)構(gòu)是GlyAlaSerAsnSerThrGlyAlaSer，其中AsnSerThr是糖基化位置。

改造方法四：內(nèi)皮抑素衍生物是以前置序列-內(nèi)皮抑素-IgG抗體不變區(qū)CH1CH2CH3融合蛋白為實(shí)驗(yàn)材料，改造內(nèi)皮抑素(SEQ ID NO.4)中的2組ArgArg，即Arg62Arg63和Arg128Arg129。堿性氨基酸常常是蛋白酶的底物，本發(fā)明是在這2組ArgArg中只保留一個(gè)Arg，以提高內(nèi)皮抑素的穩(wěn)定性。雖然Arg被認(rèn)為對(duì)于肝素結(jié)合很重要，但是為了降低內(nèi)皮抑素被蛋白酶水解的數(shù)量，這樣的改造還是有助于提高內(nèi)皮抑素的生物活性。

各種蛋白的核酸和氨基酸序列的基本信息

SEQ ID NO.2是人白蛋白的信號(hào)肽和成熟后人白蛋白的N端5個(gè)氨基酸的序列，其中1-18 是信號(hào)肽，19-23是成熟后人白蛋白的N端5個(gè)氨基酸，SEQ ID NO.1是SEQ ID NO.2的核酸編碼序列，GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的信息是NP_000468.1和NM_000477.5，SEQ ID NO.2這個(gè)序列稱為前置序列。

SEQ ID NO.4是人來(lái)源的內(nèi)皮抑素的氨基酸序列，SEQ ID NO.3是它的核酸編碼序列，GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的信息是NP_569712.2和NM_130445.3，這里的內(nèi)皮抑素共有183個(gè)氨基酸。

SEQ ID NO.6是人抗體IgG不變區(qū)的氨基酸序列，SEQ ID NO.5是它的核酸編碼序列，GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的信息是M87789.1，其中，根據(jù)氨基酸序列，1-118是CH1片斷，119-225是CH2片斷，226-330是CH3片斷。

實(shí)驗(yàn)材料和方法

動(dòng)物表達(dá)載體采用寶生物公司(Takara)的pHEK293 Ultra Expression Vector II，含有外源基因片斷插入位置即限制內(nèi)切酶位點(diǎn)SmaI-XhoI-BamHI-XbaI-SalI-PstI-SphI-HindIII，這里選擇的插入切酶位點(diǎn)是XhoI-BamHI-XbaI和SphI-HindIII，即基因片斷的前端含有XhoI-BamHI-XbaI，后端含有SphI-HindIII，另外在SphI-HindIII前面增加一個(gè)His-tag以及終止信號(hào)tag，即catcatcatcatcatcattag。表達(dá)載體的構(gòu)建在大腸桿菌中篩選完成，然后可轉(zhuǎn)染到HEK293細(xì)胞進(jìn)行各種蛋白的瞬時(shí)表達(dá)。這些載體中的基因片斷的合成是由寶生物公司和上海生物工程公司等完成的。

HEK293細(xì)胞的培養(yǎng)基是10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基。

關(guān)于蛋白的分離純化，由于蛋白擁有信號(hào)肽，所以表達(dá)是分泌型的，蛋白的分離純化是利用His-tag方法，即將培養(yǎng)基離心，除去細(xì)胞，然后利用His·Bind Purification Kit試劑盒(Novagen公司)對(duì)于上清液進(jìn)行純化，上柱前先加入Binding Buffer，然后將蛋白樣品上柱，用Wash Buffer漂洗，再用Elute Buffer洗脫。如果融合蛋白含有抗體IgG不變區(qū)，就可以采用ProteinA柱，即使用GE Healthcare公司的HiTrap Protein A HP或HiTrap rProtein A FF，漂洗液是PBS，洗脫液是0.1M檸檬酸(pH2.7)。用His-tag或ProteinA柱方法得到的蛋白都用蛋白電泳進(jìn)行鑒定，將純度為一條帶的蛋白用于以后的實(shí)驗(yàn)。

關(guān)于腫瘤模型，小鼠是C57BL/6，約20-24克，每次實(shí)驗(yàn)的小鼠數(shù)為30只，腫瘤細(xì)胞是小鼠肺癌Lewis lung carcinoma(LLC)細(xì)胞株，先將LLC細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，然后注射到C57BL/6小鼠腹腔進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)，最后取出腹腔內(nèi)的LLC腫瘤細(xì)胞，將2x10⁶腫瘤細(xì)胞接種于小鼠的右腋下。

蛋白的生物活性是用小鼠腫瘤生長(zhǎng)抑制率和小鼠體內(nèi)半衰期等來(lái)評(píng)價(jià)，蛋白劑量都是50pmol。

實(shí)施例1 一種抗腫瘤蛋白內(nèi)皮抑素的衍生物，衍生物包括內(nèi)皮抑素與抗體IgG不變區(qū)連接的融合蛋白，其抗腫瘤活性以及該融合蛋白在小鼠體內(nèi)的半衰期。

蛋白樣品

樣品1：前置序列-內(nèi)皮抑素；SEQ ID NO.4所示的內(nèi)皮抑素前面連接SEQ ID NO.2所示的前置序列，前置序列中的信號(hào)肽是為了讓表達(dá)的內(nèi)皮抑素能夠分泌到細(xì)胞外。

樣品2：前置序列-內(nèi)皮抑素-抗體IgG部分不變區(qū)CH1的融合蛋白(SEQ ID NO.8所示，編碼SEQ ID NO.8的核酸序列是SEQ ID NO.7所示)。

樣品3：前置序列-內(nèi)皮抑素-抗體IgG部分不變區(qū)CH1CH2融合蛋白(SEQ ID NO.10所示，編碼SEQ ID NO.10的核酸序列是SEQ ID NO.9所示)。

樣品4：前置序列-內(nèi)皮抑素-抗體IgG不變區(qū)CH1CH2CH3融合蛋白(SEQ ID NO.12所示，編碼SEQ ID NO.12的核酸序列是SEQ ID NO.11所示)。

將上面的基因合成片斷插入pHEK293 Ultra Expression Vector II質(zhì)粒，

樣品1和樣品2用His-tag方法純化，樣品3和樣品4用ProteinA柱方法純化。

對(duì)照樣品是注射生理鹽水。

第1天將2x10⁶LLC腫瘤細(xì)胞接種于小鼠的右腋下，第2天、第5天、第8天分別靜脈注射各種蛋白(劑量都是50pmol)以及對(duì)照樣品生理鹽水，各組小鼠的數(shù)量是30只，第10天殺死小鼠，取出腫瘤并稱重。圖1是抗腫瘤的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，表明隨著融合蛋白的分子量增加，腫瘤抑制效果越好。

對(duì)于蛋白的小鼠體內(nèi)的半衰期實(shí)驗(yàn)，給小鼠一次注射各種蛋白(100ug/0.2ml)，用抗內(nèi)皮抑素抗血清來(lái)檢測(cè)內(nèi)皮抑素或內(nèi)皮抑素融合蛋白的含量，第1天的檢測(cè)是在注射后2小時(shí)內(nèi)進(jìn)行，連續(xù)檢測(cè)13天。圖2是各種蛋白在小鼠體內(nèi)13天的含量變化，結(jié)果顯示，分子量越大則體內(nèi)含量越高。

由于前置序列-內(nèi)皮抑素-抗體IgG不變區(qū)CH1CH2CH3融合蛋白在體內(nèi)更穩(wěn)定，所以抑制腫瘤的效果最好。

實(shí)施例2 內(nèi)皮抑素衍生物即內(nèi)皮抑素N端前面的新引入的Arg的評(píng)估

選擇實(shí)施例1樣品4的前置序列-內(nèi)皮抑素-抗體IgG不變區(qū)融合蛋白(SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12)作為實(shí)驗(yàn)材料，用氨基酸序列(SEQ ID NO.12)來(lái)說(shuō)明，1-23氨基酸來(lái)源于白蛋白，1-18是白蛋白的信號(hào)肽，19-23是成熟后的白蛋白的N端的5個(gè)氨基酸，其中有兩個(gè)Arg，24-206是內(nèi)皮抑素，207-536是抗體IgG不變區(qū)，它由CH1、CH2和CH3組成。各種實(shí)驗(yàn)蛋白：

樣品1：前置序列-內(nèi)皮抑素-抗體IgG不變區(qū)融合蛋白，由SEQ ID NO.12所示，其中19-23是Arg-Gly-Val-Phe-Arg。

樣品2：前置序列-內(nèi)皮抑素-抗體IgG不變區(qū)融合蛋白點(diǎn)突變體1，其中19-23是Ala-Gly-Val-Phe-Arg，將第19的Arg的agg點(diǎn)突變成gcg；

樣品3：前置序列-內(nèi)皮抑素-抗體IgG不變區(qū)融合蛋白點(diǎn)突變體2，其中19-23是Arg-Gly-Val-Phe-Ala，將第23的Arg的cgt點(diǎn)突變成gct；

樣品4：前置序列-內(nèi)皮抑素-抗體IgG不變區(qū)融合蛋白點(diǎn)突變體3，其中19-23是Ala-Gly-Val-Phe-Ala，將第19的Arg的agg點(diǎn)突變成gcg及將第23的Arg的cgt點(diǎn)突變成gct。

注射生理鹽水作為對(duì)照。

選擇實(shí)施例1中表達(dá)前置序列-內(nèi)皮抑素-抗體IgG不變區(qū)CH1CH2CH3融合蛋白(SEQ ID NO.12所示，編碼SEQ ID NO.12的核酸序列SEQ ID NO.11)的質(zhì)粒(pHEK293 Ultra Expression Vector II)進(jìn)行各種點(diǎn)突變就得到上面各種內(nèi)皮抑素-抗體IgG不變區(qū)融合蛋白突變體。

各種融合蛋白用ProteinA柱方法純化。

第1天將2x10⁶LLC腫瘤細(xì)胞接種于小鼠的右腋下，第2天、第5天、第8天分別靜脈注射各種蛋白(劑量都是50pmol)，各組小鼠的數(shù)量是30只，第10天殺死小鼠，取出腫瘤并稱重。圖3是抗腫瘤的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，N端有2個(gè)Arg的前置序列-內(nèi)皮抑素-抗體IgG不變區(qū)融合蛋白抑制腫瘤的效果最好。

實(shí)施例3 檢查糖基化位點(diǎn)對(duì)于內(nèi)皮抑素融合蛋白活性的影響

以實(shí)施例1的前置序列-內(nèi)皮抑素-抗體IgG不變區(qū)CH1CH2CH3融合蛋白(SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12)作為實(shí)驗(yàn)材料構(gòu)建衍生物，即在內(nèi)皮抑素的N端前面或C端后面加入糖基化的氨基酸短肽Gly-Ala-Ser-Asn-Ser-Thr-Gly-Ala-Ser，其中Asn-Ser-Thr是糖基化的位置，糖鏈?zhǔn)沁B接在Asn上。選擇實(shí)施例1中表達(dá)前置序列-內(nèi)皮抑素-抗體IgG不變區(qū)CH1CH2CH3融合蛋白(SEQ ID NO.12所示，編碼SEQ ID NO.12的核酸序列SEQ ID NO.11)的質(zhì)粒(pHEK293Ultra Expression Vector II)進(jìn)行各種基因操作，也可以直接合成這些突變體的基因片斷，然后插入質(zhì)粒(pHEK293 Ultra Expression Vector II)進(jìn)行各種蛋白的表達(dá)。

樣品1：前置序列-內(nèi)皮抑素-抗體IgG不變區(qū)融合蛋白(SEQ ID NO.12)，內(nèi)皮抑素的N端前面或C端后面沒(méi)有糖基化的氨基酸短肽；

樣品2：前置序列-內(nèi)皮抑素-抗體IgG不變區(qū)融合蛋白糖基化位點(diǎn)突變體1(SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14)，內(nèi)皮抑素N端前面加入一個(gè)糖基化位點(diǎn)的氨基酸短肽；

樣品3：前置序列-內(nèi)皮抑素-抗體IgG不變區(qū)融合蛋白糖基化位點(diǎn)突變體2(SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16)，內(nèi)皮抑素C端后面加入一個(gè)糖基化位點(diǎn)的氨基酸短肽；

樣品4：前置序列-內(nèi)皮抑素-抗體IgG不變區(qū)融合蛋白糖基化位點(diǎn)突變體3(SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.18)，內(nèi)皮抑素的N端前面和C端后面各加入一個(gè)糖基化位點(diǎn)的氨基酸短肽。

各種融合蛋白用ProteinA柱方法純化。

第1天將2x10⁶LLC腫瘤細(xì)胞接種于小鼠的右腋下，第2天、第5天、第8天分別靜脈注射各種蛋白(劑量都是50pmol)以及生理鹽水，各組小鼠的數(shù)量是30只，第10天殺死小鼠，取出腫瘤并稱重。圖4是抗腫瘤的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，表明內(nèi)皮抑素前后都有糖基化位點(diǎn)的氨基酸短肽的融合蛋白的抑制腫瘤的效果最好。

對(duì)于蛋白的小鼠體內(nèi)的半衰期實(shí)驗(yàn)，給小鼠一次注射各種蛋白(100ug/0.2ml)，用抗內(nèi)皮抑素抗血清來(lái)檢測(cè)內(nèi)皮抑素融合蛋白的含量，第1天的檢測(cè)是在注射后2小時(shí)內(nèi)進(jìn)行，連續(xù)檢測(cè)13天。圖5是各種蛋白在小鼠體內(nèi)13天的含量變化，結(jié)果顯示，內(nèi)皮抑素前后都有糖基化位點(diǎn)的融合蛋白在小鼠體內(nèi)含量最高。

這里的實(shí)驗(yàn)表明由于內(nèi)皮抑素衍生物即前置序列-內(nèi)皮抑素-抗體IgG不變區(qū)融合蛋白糖基化位點(diǎn)突變體3(內(nèi)皮抑素N端前面和C端后面都有糖基化位點(diǎn))在體內(nèi)更穩(wěn)定，所以抑制腫瘤的效果最好。

實(shí)施例4 對(duì)于同一糖基化位點(diǎn)的氨基酸再進(jìn)行點(diǎn)突變

包括動(dòng)物在內(nèi)的真核生物的蛋白的糖鏈發(fā)生在Asn-X-Ser/Thr位置上，其中X是除了Pro、Asp或Glu以為的氨基酸，糖鏈?zhǔn)沁B接在Asn上。這里，以實(shí)施例3中的前置序列-內(nèi)皮抑素-抗體IgG不變區(qū)融合蛋白糖基化位點(diǎn)突變體2(SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16)即內(nèi)皮抑素后面加入一個(gè)糖基化位點(diǎn)的氨基酸短肽的融合蛋白為材料進(jìn)行新的點(diǎn)突變，它的糖基化位點(diǎn)是Asn210-Ser211-Thr212，核酸序列是aacagcacg(628-636)，新增加的點(diǎn)突變體作為實(shí)驗(yàn)樣品。

樣品1：點(diǎn)突變體Asn210-Ser211-Thr212(SEQ ID NO.16)

樣品2：點(diǎn)突變體Asn210-Ala211-Thr212(將編碼Ser211的agc點(diǎn)突變?yōu)間cc)

樣品3：點(diǎn)突變體Asn210-Tyr211-Thr212(將編碼Ser211的agc點(diǎn)突變?yōu)閠ac)

樣品4：點(diǎn)突變體Asn210-Ser211-Ser212(將編碼Thr212的acg點(diǎn)突變?yōu)閠cg)

樣品5：點(diǎn)突變體Asn210-Ala211-Ser212(將編碼Ser211的agc點(diǎn)突變?yōu)間cc以及將編碼Thr212的acg點(diǎn)突變?yōu)閠cg)

樣品6：沒(méi)有引入糖基化位點(diǎn)的前置序列-內(nèi)皮抑素-抗體IgG不變區(qū)融合蛋白(SEQ ID NO.12)

以含有實(shí)施例3中的前置序列-內(nèi)皮抑素-抗體IgG不變區(qū)融合蛋白糖基化位點(diǎn)突變體2(SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16)即內(nèi)皮抑素后面加入一個(gè)糖基化的氨基酸短肽的融合蛋白的表達(dá)質(zhì)粒(pHEK293 Ultra Expression Vector I I)進(jìn)行各種突變體點(diǎn)的基因操作。各種融合蛋白用ProteinA柱方法純化。

第1天將2x10⁶LLC腫瘤細(xì)胞接種于小鼠的右腋下，第2天、第5天、第8天分別靜脈注射各種蛋白(劑量都是50pmol)以及生理鹽水，各組小鼠的數(shù)量是30只，第10天殺死小鼠，取出腫瘤并稱重。

圖6是抗腫瘤的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，顯示在同一位置上進(jìn)行糖基化位點(diǎn)改造的融合蛋白都有很好的抑制腫瘤的效果。

對(duì)于蛋白的小鼠體內(nèi)的半衰期實(shí)驗(yàn)，給小鼠一次注射各種蛋白(100ug/0.2ml)，用抗內(nèi)皮抑素抗血清來(lái)檢測(cè)內(nèi)皮抑素融合蛋白的含量，第1天的檢測(cè)是在注射后2小時(shí)內(nèi)進(jìn)行，連續(xù)檢測(cè)13天。圖7是各種蛋白在小鼠體內(nèi)13天的含量變化，結(jié)果顯示，經(jīng)過(guò)糖基化位點(diǎn)改造的融合蛋白在小鼠體內(nèi)的含量都很高，這表明只要引入Asn-X-Ser/Thr特征的糖基化的修飾就可以提高融合蛋白的抑制腫瘤活性和蛋白在體內(nèi)的穩(wěn)定性。

實(shí)施例5內(nèi)皮抑素衍生物即改造內(nèi)皮抑素中的2組ArgArg

以實(shí)施例1的前置序列-內(nèi)皮抑素-抗體IgG不變區(qū)CH1CH2CH3融合蛋白(SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12)作為實(shí)驗(yàn)材料，然后對(duì)內(nèi)皮抑素內(nèi)部的2組ArgArg進(jìn)行點(diǎn)突變。

前置序列-內(nèi)皮抑素-抗體IgG不變區(qū)CH1CH2CH3融合蛋白(SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12)中的內(nèi)皮抑素內(nèi)部的2組ArgArg在內(nèi)皮抑素的氨基酸序列(SEQ ID NO.4)中分別位于Arg62-Arg63和Arg128-Arg129，在前置序列-內(nèi)皮抑素-抗體IgG不變區(qū)CH1CH2CH3融合蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO.12)中分別位于Arg85-Arg86和Arg151-Arg152，在編碼它的核酸序列(SEQ ID NO.11)中的位置是253-258(cgccgt)和451-456(cgcagg)。

首先對(duì)于第1組Arg85-Arg86，核酸位置253-258(cgccgt)進(jìn)行點(diǎn)突變。

點(diǎn)突變體1：Ala85-Arg86(將編碼前面Arg的cgc點(diǎn)突變?yōu)間cc)

點(diǎn)突變體2：Ser85-Arg86(將編碼前面Arg的cgc點(diǎn)突變?yōu)閍gc)

點(diǎn)突變體3：His85-Arg86(將編碼前面Arg的cgc點(diǎn)突變?yōu)閏ac)

點(diǎn)突變體4：Arg85-Ala86(將編碼后面Arg的cgt點(diǎn)突變?yōu)間ct)

點(diǎn)突變體5：Arg85-Ser86(將編碼后面Arg的cgt點(diǎn)突變?yōu)閍gt)

點(diǎn)突變體6：Arg85-His86(將編碼后面Arg的cgt點(diǎn)突變?yōu)閏at)

然后對(duì)于第2組Arg151-Arg152，核酸位置451-456(cgcagg)進(jìn)行點(diǎn)突變。

點(diǎn)突變體7：Ala151-Arg152(將編碼前面Arg的cgc點(diǎn)突變?yōu)間cc)

點(diǎn)突變體8：Ser151-Arg152(將編碼前面Arg的cgc點(diǎn)突變?yōu)閍gc)

點(diǎn)突變體9：His151-Arg152(將編碼前面Arg的cgc點(diǎn)突變?yōu)閏ac)

點(diǎn)突變體10：Arg151-Ala152(將編碼后面Arg的agg點(diǎn)突變?yōu)間cg)

點(diǎn)突變體11：Arg151-Ser152(將編碼后面Arg的agg點(diǎn)突變?yōu)閍gc)

點(diǎn)突變體12：Arg151-His152(將編碼后面Arg的agg點(diǎn)突變?yōu)閏ac)

選擇實(shí)施例1中的前置序列-表達(dá)內(nèi)皮抑素-抗體IgG不變區(qū)CH1CH2CH3融合蛋白(SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12)的質(zhì)粒(pHEK293 Ultra Expression Vector II)進(jìn)行各種突變體點(diǎn)的基因操作。

各種融合蛋白用ProteinA柱方法純化。

第1天將2x10⁶LLC腫瘤細(xì)胞接種于小鼠的右腋下，第2天、第5天、第8天分別靜脈注射各種蛋白(劑量都是50pmol)以及生理鹽水，各組小鼠的數(shù)量是30只，第10天殺死小鼠，取出腫瘤并稱重。

第1個(gè)實(shí)驗(yàn)是針對(duì)第1組Arg85-Arg86，核酸位置253-258(cgccgt)的基因片斷(SEQ ID NO.11)進(jìn)行，樣品有點(diǎn)突變體1-6以及沒(méi)有突變的融合蛋白(SEQ ID NO.12)作為對(duì)照樣品。

圖8是抗腫瘤的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，表明點(diǎn)突變體3(His85-Arg86)和點(diǎn)突變體6(Arg85-His86)的融合蛋白的抑制腫瘤的效果很好。

對(duì)于蛋白的小鼠體內(nèi)的半衰期實(shí)驗(yàn)，給小鼠一次注射各種蛋白(100ug/0.2ml)，用抗內(nèi)皮抑素抗血清來(lái)檢測(cè)內(nèi)皮抑素融合蛋白的含量，第1天的檢測(cè)是在注射后2小時(shí)內(nèi)進(jìn)行，連續(xù)檢測(cè)13天。圖9是各種蛋白在小鼠體內(nèi)13天的含量變化，結(jié)果顯示，各種點(diǎn)突變體在體內(nèi)的含量的差別不大，但比沒(méi)有點(diǎn)突變的融合蛋白的體內(nèi)含量都高。

這里的實(shí)驗(yàn)表明由于內(nèi)皮抑素第1組Arg85-Arg86發(fā)生了改變，保持了蛋白的穩(wěn)定性即不容易被蛋白酶降解，所以有了較高的抗腫瘤活性，點(diǎn)突變體3(His85-Arg86)和點(diǎn)突變體6(Arg85-His86)中，His代替了Arg，但仍然保持了堿性氨基酸的性質(zhì)，所以體現(xiàn)了很高的抑制腫瘤的活性和很高的蛋白含量。

現(xiàn)在按照上面第1個(gè)實(shí)驗(yàn)方法開(kāi)展針對(duì)第2組Arg151-Arg152，核酸位置451-456(cgcagg)的基因片斷(SEQ ID NO.11)進(jìn)行點(diǎn)突變,樣品有點(diǎn)突變體7-12以及沒(méi)有突變的融合蛋白(SEQ ID NO.12)作為對(duì)照樣品。

圖10是抗腫瘤的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，表明點(diǎn)突變體9(His151-Arg152)和點(diǎn)突變體12(Arg151-His152)的融合蛋白的抑制腫瘤的效果很好。

圖11是各種蛋白在小鼠體內(nèi)13天的含量變化，結(jié)果顯示，各種點(diǎn)突變體在體內(nèi)的含量的差別不大，但比沒(méi)有點(diǎn)突變的融合蛋白的體內(nèi)含量都高。

再一次說(shuō)明：以前置序列-內(nèi)皮抑素-抗體IgG不變區(qū)CH1CH2CH3融合蛋白(SEQ ID NO.12)作為實(shí)驗(yàn)材料，融合蛋白中的內(nèi)皮抑素內(nèi)部的Arg85-Arg86和Arg151-Arg152分別對(duì)應(yīng)于以SEQ ID NO.4所示內(nèi)皮抑素序列中的Arg62-Arg63和Arg128-Arg129。

實(shí)施例6對(duì)于內(nèi)皮抑素的N端前面和C端后面的各加入糖基化位點(diǎn)以及內(nèi)皮抑素內(nèi)的2組ArgArg的改造的再評(píng)估

根據(jù)實(shí)施例5的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以前置序列-內(nèi)皮抑素-抗體IgG不變區(qū)CH1CH2CH3融合蛋白(SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12)作為實(shí)驗(yàn)材料，再構(gòu)建2種點(diǎn)突變體：

點(diǎn)突變體1：His85-Arg86和His151-Arg152

將編碼Arg85的cgc點(diǎn)突變?yōu)閏ac

將編碼Arg151的cgc點(diǎn)突變?yōu)閏ac

點(diǎn)突變體2：Arg85-His86和Arg151-His152

將編碼Arg86的cgt點(diǎn)突變?yōu)閏at

將編碼Arg152的agg點(diǎn)突變?yōu)閏ac

說(shuō)明：以SEQ ID NO.12序列為實(shí)驗(yàn)材料融合蛋白中的內(nèi)皮抑素內(nèi)部的第85、第86、第151、第152的氨基酸位置分別對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO.4所示內(nèi)皮抑素序列中的第62、第63、第128、第129。

根據(jù)實(shí)施例3的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以內(nèi)皮抑素的N端前面和C端后面的各加入糖基化位點(diǎn)的融合蛋白(SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.18)作為實(shí)驗(yàn)材料，對(duì)它的2組ArgArg進(jìn)行改造，

第1組ArgArg的氨基酸位置是Arg94Arg95(SEQ ID NO.18)，核酸位置(SEQ ID NO.17)是280-285(cgccgt)；第2組ArgArg的氨基酸位置是Arg160Arg161(SEQ ID NO.18)，核酸位置(SEQ ID NO.17)是478-483(cgcagg)。

另外構(gòu)建2種點(diǎn)突變體：

點(diǎn)突變體1：Arg94His95和Arg160His161

將編碼Arg95的cgt點(diǎn)突變?yōu)閏at

將編碼Arg161的agg點(diǎn)突變?yōu)閏ac

點(diǎn)突變體2：His94Arg95和His160Arg161

將編碼Arg94的cgc點(diǎn)突變?yōu)閏ac

將編碼Arg160的cgc點(diǎn)突變?yōu)閏ac

(核酸序列SEQ ID NO.19和氨基酸序列SEQ ID NO.20)

說(shuō)明：以SEQ ID NO.18序列為實(shí)驗(yàn)材料融合蛋白中的內(nèi)皮抑素內(nèi)部的第94、第95、第160、第161的氨基酸位置分別對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO.4所示內(nèi)皮抑素序列中的第62、第63、第128、第129。

現(xiàn)在實(shí)驗(yàn)所采用的樣品：

樣品1：前置序列-內(nèi)皮抑素-抗體IgG不變區(qū)CH1CH2CH3融合蛋(SEQ ID NO.12)

樣品2：前置序列-內(nèi)皮抑素-抗體IgG不變區(qū)CH1CH2CH3融合蛋點(diǎn)突變體1(His85-Arg86和His151-Arg152)

樣品3：前置序列-內(nèi)皮抑素-抗體IgG不變區(qū)CH1CH2CH3融合蛋點(diǎn)突變體2(Arg85-His86和Arg151-His152)

樣品4：前置序列-內(nèi)皮抑素(N端前面和C端后面的各加入糖基化位點(diǎn))-抗體IgG不變區(qū)CH1CH2CH3融合蛋白(SEQ ID NO.18)

樣品5：前置序列-內(nèi)皮抑素(N端前面和C端后面的各加入糖基化位點(diǎn))-抗體IgG不變區(qū)CH1CH2CH3融合蛋白點(diǎn)突變體1(Arg94His95和Arg160His161)

樣品6：前置序列-內(nèi)皮抑素(N端前面和C端后面的各加入糖基化位點(diǎn))-抗體IgG不變區(qū)CH1CH2CH3融合蛋白點(diǎn)突變體2(His94Arg95和His160Arg161)(SEQ ID NO.20)

第1天接種LLC腫瘤細(xì)胞，第2天、第5天、第8天分別靜脈注射各種蛋白(劑量都是50pmol)以及生理鹽水，各組小鼠的數(shù)量是30只，第10天殺死小鼠，取出腫瘤并稱重。

圖12是抗腫瘤的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，表明同時(shí)引入2個(gè)糖基化位點(diǎn)以及對(duì)2組2組ArgArg改造的樣品5和樣品6有著很好的抑制腫瘤效果。

對(duì)于蛋白的小鼠體內(nèi)的半衰期實(shí)驗(yàn)，給小鼠一次注射各種蛋白(100ug/0.2ml)，用抗內(nèi)皮抑素抗血清來(lái)檢測(cè)內(nèi)皮抑素融合蛋白的含量，第1天的檢測(cè)是在注射后2小時(shí)內(nèi)進(jìn)行，連續(xù)檢測(cè)13天。圖13是各種蛋白在小鼠體內(nèi)13天的含量變化，結(jié)果顯示，同時(shí)引入2個(gè)糖基化 位點(diǎn)以及對(duì)2組ArgArg改造的樣品5和樣品6在體內(nèi)的含量都很高。

圖14是實(shí)施例1中的作為對(duì)照的注射生理鹽水的小鼠和實(shí)施例6中的注射樣品6融合蛋白(內(nèi)皮抑素的N端前面和C端后面的各加入糖基化位點(diǎn)的融合蛋白點(diǎn)突變體2)(SEQ ID NO.20)的小鼠的解剖照片。

實(shí)施例7對(duì)于內(nèi)皮抑素及各種內(nèi)皮抑素衍生物的生物活性進(jìn)行比較

對(duì)于所有插入質(zhì)粒pHEK293 Ultra Expression Vector II的DNA合成片斷，片斷前端含有XhoI-BamHI-XbaI，后端含有SphI-HindIII，另外在SphI-HindIII前面增加一個(gè)His-tag以及終止信號(hào)tag，即catcatcatcatcatcattag。

樣品1：內(nèi)皮抑素

即把SEQ ID NO.1所示的核酸序列中編碼信號(hào)肽的1-54的DNA片斷的后面連接SEQ ID NO.3所示的編碼內(nèi)皮抑素的核酸序列，合成這樣的DNA片斷，然后把這個(gè)DNA片斷插入到質(zhì)粒pHEK293 Ultra Expression Vector II，得到內(nèi)皮抑素。

樣品2：前置序列-內(nèi)皮抑素蛋白(內(nèi)皮抑素的N端前面有2個(gè)Arg)

即把SEQ ID NO.1所示的編碼前置序列的核酸序列后面連接上SEQ ID NO.3所示的編碼內(nèi)皮抑素的核酸序列，合成這樣的DNA片斷，然后把這個(gè)DNA片斷插入到質(zhì)粒pHEK293 Ultra Expression Vector II，得到前置序列-內(nèi)皮抑素蛋白，在這個(gè)前置序列-內(nèi)皮抑素蛋白中，內(nèi)皮抑素的N端前面有2個(gè)Arg。

樣品3：糖基化位點(diǎn)短肽-內(nèi)皮抑素-糖基化位點(diǎn)短肽蛋白

首先設(shè)計(jì)下面的DNA片斷：

片斷1：SEQ ID NO.1所示的核酸序列中編碼信號(hào)肽的1-54的DNA片斷

片斷2：ggggcctccaacagcacgggggcctcc(編碼包含糖基化位點(diǎn)的短肽GlyAlaSerAsnSerThrGlyAlaSer)

片斷3：SEQ ID NO.3所示的編碼內(nèi)皮抑素的核酸序列

合成這樣的DNA序列：片斷1-片斷2-片斷3-片斷2，然后把這個(gè)DNA片斷插入到質(zhì)粒pHEK293 Ultra Expression Vector II，得到糖基化位點(diǎn)短肽-內(nèi)皮抑素-糖基化位點(diǎn)短肽蛋白。

樣品4：發(fā)生點(diǎn)突變(His62Arg63和His128Arg129)的內(nèi)皮抑素

SEQ ID NO.3所示是編碼內(nèi)皮抑素的核酸序列，第184-189是cgccgt，它所對(duì)應(yīng)的氨基酸是Arg62Arg63，將第185的g突變?yōu)閍，這樣，第184-189變成caccgt，從而產(chǎn)生了His62Arg63；同樣，第382-387是cgcagg，它所對(duì)應(yīng)的氨基酸是Arg128Arg129，將第383g突變?yōu)閍，這樣，第382-387變成cacagg，從而產(chǎn)生了His128Arg129。把這個(gè)編碼發(fā)生點(diǎn)突變內(nèi)皮抑素的DNA片斷的前面連接信號(hào)肽(SEQ ID NO.1所示的核酸序列中編碼信號(hào)肽的1-54的DNA片斷)，得到了發(fā)生點(diǎn)突變(His62Arg63和His128Arg129)內(nèi)皮抑素的DNA片斷，合成這個(gè)片斷并插入到質(zhì)粒pHEK293 Ultra Expression Vector II，得到發(fā)生點(diǎn)突變(His62Arg63和His128Arg129)的內(nèi)皮抑素蛋白。

樣品5：內(nèi)皮抑素-抗體IgG不變區(qū)融合蛋白

首先設(shè)計(jì)下面的DNA片斷：

片斷1：SEQ ID NO.1所示的核酸序列中編碼信號(hào)肽的1-54的DNA片斷

片斷2：SEQ ID NO.3所示的編碼內(nèi)皮抑素的核酸序列

片斷3：SEQ ID NO.5所示的編碼抗體IgG不變區(qū)的核酸序列

合成這樣的DNA序列：片斷1-片斷2-片斷3，然后把這個(gè)DNA片斷插入到質(zhì)粒pHEK293Ultra Expression Vector II，得到內(nèi)皮抑素-抗體IgG不變區(qū)融合蛋白。

樣品6：前置序列-內(nèi)皮抑素(N端前面和C端后面各加入糖基化位點(diǎn))-抗體IgG不變區(qū)融合蛋白點(diǎn)突變體2(His94Arg95和His160Arg161)(SEQ ID NO.20)。

對(duì)照樣品是注射生理鹽水。

樣品1-4用His-tag方法純化，樣品5和樣品6用ProteinA柱方法純化。

第1天將2x10⁶LLC腫瘤細(xì)胞接種于小鼠的右腋下，第2天、第5天、第8天分別靜脈注射各種蛋白(劑量都是50pmol)以及生理鹽水，各組小鼠的數(shù)量是30只，第10天殺死小鼠，取出腫瘤并稱重。

圖15是內(nèi)皮抑素及各種內(nèi)皮抑素衍生物抗腫瘤的實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示內(nèi)皮抑素及各種內(nèi)皮抑素衍生物都有抗腫瘤的生物活性，樣品6即前置序列-內(nèi)皮抑素(N端前面和C端后面各加入糖基化位點(diǎn))-抗體IgG不變區(qū)融合蛋白點(diǎn)突變體2(His94Arg95和His160Arg161)(SEQ ID NO.20)抗腫瘤的效果最好。

對(duì)于蛋白的小鼠體內(nèi)的半衰期實(shí)驗(yàn)，給小鼠一次注射各種蛋白(100ug/0.2ml)，用抗內(nèi)皮抑素抗血清來(lái)檢測(cè)內(nèi)皮抑素融合蛋白的含量，第1天的檢測(cè)是在注射后2小時(shí)內(nèi)進(jìn)行，連續(xù)檢測(cè)13天。圖16是各種蛋白在小鼠體內(nèi)13天的含量變化，結(jié)果顯示，含有糖基化位點(diǎn)的內(nèi)皮抑素(樣品3)和發(fā)生點(diǎn)突變(His62Arg63和His128Arg129)的內(nèi)皮抑素(樣品4)始終保留較低的體內(nèi)含量，內(nèi)皮抑素-抗體IgG不變區(qū)融合蛋白(樣品5)具有相當(dāng)高的體內(nèi)含量，而前置序列-內(nèi)皮抑素(N端前面和C端后面各加入糖基化位點(diǎn))-抗體IgG不變區(qū)融合蛋白點(diǎn)突變體2(His94Arg95和His160Arg161)(SEQ ID NO.20)(樣品6)的體內(nèi)含量最高。

可見(jiàn)，同時(shí)擁有這些特點(diǎn)：內(nèi)皮抑素的N端前面有2個(gè)Arg、內(nèi)皮抑素的N端前面和C端后面各加入糖基化位點(diǎn)、發(fā)生點(diǎn)突變(His62Arg63和His128Arg129)的內(nèi)皮抑素、內(nèi)皮抑素與抗體IgG不變區(qū)連接而形成的融合蛋白，這樣的內(nèi)皮抑素衍生物例如SEQ ID NO.20序列所示的蛋白的抗腫瘤和半衰期的生物活性最好。

通過(guò)上面一系列實(shí)施例，內(nèi)皮抑素衍生物的穩(wěn)定性包括半衰期以及抗腫瘤的效果都得到了很大的提高，這些改造手段是：

內(nèi)皮抑素衍生物一、前置序列-內(nèi)皮抑素與抗體IgG不變區(qū)連接而形成的融合蛋白，增加了內(nèi)皮抑素的分子量。值得指出的是，通過(guò)這里的案例，內(nèi)皮抑素與白蛋白等大分子糖蛋白連接而構(gòu)建的融合蛋白也可以得到類(lèi)似的結(jié)果。

內(nèi)皮抑素衍生物二、在內(nèi)皮抑素的N端前面引入Arg，由于內(nèi)皮抑素的Arg對(duì)于它的生物活性很重要，所以新增加的Arg可以提高內(nèi)皮抑素的抗腫瘤活性。

內(nèi)皮抑素衍生物三、在內(nèi)皮抑素的N端前面和C端后面各引入糖基化位點(diǎn)的氨基酸短肽，這里是GlyAlaSerAsnSerThrGlyAlaSer，其中包含AsnSerThr，具有Asn-X-Ser/Thr特征，同時(shí)進(jìn)行了點(diǎn)突變，表明有Asn-X-Ser/Thr特征的突變體具有很高的抗腫瘤活性和穩(wěn)定性。

內(nèi)皮抑素衍生物四、對(duì)于SEQ ID NO.4序列所示的內(nèi)皮抑素中的2組ArgArg(Arg62Arg63和Arg128Arg129)進(jìn)行點(diǎn)突變，可以避免蛋白酶的水解，這里的實(shí)驗(yàn)表明把ArgArg中的一個(gè)Arg點(diǎn)突變成其它氨基酸，就提高了內(nèi)皮抑素融合蛋白的抗腫瘤活性以及穩(wěn)定性，顯然，正是由于提高了內(nèi)皮抑素融融合蛋白的穩(wěn)定性，也就是提高了體內(nèi)內(nèi)皮抑素融融合蛋白的含 量，導(dǎo)致了內(nèi)皮抑素融融合蛋白抗腫瘤效果的提高，同時(shí)實(shí)驗(yàn)顯示了ArgHis或HisArg的組合擁有更好的抗腫瘤活性。

內(nèi)皮抑素衍生物五、實(shí)施例6選擇了一個(gè)最佳組合，構(gòu)建一類(lèi)內(nèi)皮抑素衍生物，同時(shí)擁有：

(1)在內(nèi)皮抑素N端前面和C端后面引入糖基化位點(diǎn)

(2)將內(nèi)皮抑素中的2組ArgArg點(diǎn)突變成ArgHis或HisArg

具有上面2種特征的前置序列-內(nèi)皮抑素-抗體IgG不變區(qū)融合蛋白顯示了相當(dāng)高的抗腫瘤活性以及在體內(nèi)相當(dāng)高的含量。

根據(jù)融合蛋白序列(SEQ ID No.11和SEQ ID No.12)為基礎(chǔ)可以進(jìn)行下面各種改造：

a)在內(nèi)皮抑素N端前面和C端后面引入糖基化位點(diǎn)；

b)針對(duì)內(nèi)皮抑素的內(nèi)部ArgArg的點(diǎn)突變

c)在內(nèi)皮抑素的N端前面引入新的Arg

SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.20所示序列只是描述了具有上面各種優(yōu)點(diǎn)的融合蛋白的一種。

這里還提供了一種制備方法：

a)表達(dá)的宿主細(xì)胞是動(dòng)物細(xì)胞；

b)一種表達(dá)系統(tǒng)可以對(duì)于藥物蛋白進(jìn)行糖基化位點(diǎn)修飾；

c)由于是分泌型表達(dá)，可以從培養(yǎng)基中收集融合蛋白；

d)利用Protein A柱進(jìn)行融合蛋白的分離純化。

上面所述的內(nèi)皮抑素融合蛋白以及它的一系列改造的突變體都可以應(yīng)用于腫瘤癌癥的治療。

上面的各種內(nèi)皮抑素融合蛋白的編碼DNA序列都可以應(yīng)用于抗腫瘤的基因治療。

作為藥物其劑型可以是乳化劑、脂質(zhì)體、分散劑、穩(wěn)定劑等一起制成各種注射、口服、敷貼以及手術(shù)處理等藥物的給藥形式。除了融合蛋白質(zhì)本身可以作為藥物外，編碼融合蛋白質(zhì)的核苷酸片斷或載體還可以作為基因治療形式來(lái)應(yīng)用。

以上實(shí)施例和優(yōu)選實(shí)施方式的描述屬于對(duì)權(quán)利要求限定的本發(fā)明的示意性說(shuō)明，而不是限制本發(fā)明。需要特別指出的是，只要不脫離本發(fā)明的宗旨，所有顯而易見(jiàn)的改變以及具有等價(jià)代換的相似發(fā)明，均包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。