本發(fā)明涉及針對人肝癌標志物的單鏈抗體，用于制備它們的方法，包含它們的檢測試劑和試劑盒，及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

原發(fā)性肝癌(PLC,簡稱肝癌)是臨床上最常見的惡性腫瘤之一，起病隱匿，侵襲生長迅速，治療后易復(fù)發(fā)，預(yù)后極差，被稱為“癌中之王”。全世界半數(shù)左右的肝癌患者集中在中國，每年我國約有11萬人死于肝癌，居惡性腫瘤死亡率的第二位。目前，手術(shù)切除及肝移植是肝癌最有效的治療方法，但絕大多數(shù)肝癌患者就診時已到中晚期，無法手術(shù)，手術(shù)切除率僅為10-30％。對于不能手術(shù)的病例，傳統(tǒng)的放、化療效果不佳，患者生存期一般不超過半年。由此可見肝癌早期診斷至關(guān)重要，是臨床診療和預(yù)后的關(guān)鍵。

早期肝癌檢出率低的現(xiàn)狀反映出目前肝癌的診斷方法還有很大局限性。當(dāng)前肝癌的診斷主要依靠血清學(xué)檢查和影像學(xué)診斷。血清學(xué)檢查主要檢測血清中的腫瘤標志物，目前主要是依靠AFP的檢測，但AFP在小肝癌中的敏感度僅為40％左右。由此可見，單獨使用一種腫瘤標志物無法準確診斷腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，聯(lián)合檢測多種腫瘤標志物才能提高檢出的準確率，避免或減少漏診和假陽性。應(yīng)用新的檢測技術(shù)、選擇更有診斷價值的標志物組合，提高現(xiàn)有腫瘤標志物檢測的靈敏度和特異性對肝癌早期診斷極為重要。目前，常用的肝癌標志物主要包括：甲胎蛋白(AFP)、谷氨酰轉(zhuǎn)移酶同工酶Ⅱ(GGTⅡ)、α-L-巖藻糖甘酶(AFU)、肝細胞生長因子(HGF)、硫酸肝素蛋白多糖3(GPC3)、癌胚抗原(CEA)等。

單克隆抗體能識別各種生物活性物質(zhì)如蛋白、多糖、脂蛋白、神經(jīng)肽、核酸等的單一抗原決定簇并與其特異性結(jié)合，又由于單克隆抗體的均質(zhì)性極易大量生產(chǎn)，使得單克隆抗體在生命科學(xué)研宄領(lǐng)域中得到極為廣泛的應(yīng) 用。單鏈抗體(scFv)是抗體分子中保留抗原結(jié)合部分的最小功能片段，分子量約為完整抗體的1/6，是用基因工程方法將抗體重鏈和輕鏈可變區(qū)通過一段連接肽連接而成的重組蛋白。單鏈抗體優(yōu)越性在于可通過包含體大量表達，尤其易于構(gòu)建抗體融合蛋白，具有分子小、免疫原性低、無Fc端、不易與具有Fc受體的靶細胞結(jié)合、對腫瘤組織的穿透力強等特點。利用單克隆抗體和單鏈抗體，用于早期肝癌的檢測，具有無可比擬的優(yōu)勢。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明包括特異性結(jié)合于人肝癌標志物的單鏈抗體，所述人肝癌標志物選自由以下組成的組：甲胎蛋白(AFP)、谷氨酰轉(zhuǎn)移酶同工酶II(GGT II)、α-L-巖藻糖甘酶(AFU)、肝細胞生長因子(HGF)和硫酸肝素蛋白多糖3(GPC3)。

優(yōu)選所述單鏈抗體，其特征在于包含輕鏈可變結(jié)構(gòu)域和重鏈可變結(jié)構(gòu)域，其中

a)對于針對AFP的抗體，所述輕鏈可變結(jié)構(gòu)域包含SEQ ID NO:21的CDR1區(qū),SEQ ID NO:22的CDR2區(qū)和SEQ ID NO:23的CDR3區(qū),并且所述重鏈可變結(jié)構(gòu)域包含SEQ ID NO:24的CDR1區(qū),SEQ ID NO:25的CDR2區(qū)和SEQ ID NO:26的CDR3區(qū)；

b)對于針對AFU的抗體，所述輕鏈可變結(jié)構(gòu)域包含SEQ ID NO:27的CDR1區(qū),SEQ ID NO:28的CDR2區(qū)和SEQ ID NO:29的CDR3區(qū),并且所述重鏈可變結(jié)構(gòu)域包含SEQ ID NO:30的CDR1區(qū),SEQ ID NO:31的CDR2區(qū)和SEQ ID NO:32的CDR3區(qū)；

c)對于針對GGT II的抗體，所述輕鏈可變結(jié)構(gòu)域包含SEQ ID NO:33的CDR1區(qū),SEQ ID NO:34的CDR2區(qū)和SEQ ID NO:35的CDR3區(qū),并且所述重鏈可變結(jié)構(gòu)域包含SEQ ID NO:36的CDR1區(qū),SEQ ID NO:37的CDR2區(qū)和SEQ ID NO:38的CDR3區(qū)；

d)對于針對HGF的抗體，所述輕鏈可變結(jié)構(gòu)域包含SEQ ID NO:39的CDR1區(qū),SEQ ID NO:40的CDR2區(qū)和SEQ ID NO:41的CDR3區(qū),并且所述重鏈可變結(jié)構(gòu)域包含SEQ ID NO:42的CDR1區(qū),SEQ ID NO:43的CDR2區(qū)和SEQ ID NO:44的CDR3區(qū)；和

e)對于針對GPC3的抗體，所述輕鏈可變結(jié)構(gòu)域包含SEQ ID NO:45的CDR1區(qū),SEQ ID NO:46的CDR2區(qū)和SEQ ID NO:47的CDR3區(qū),并且所述重鏈可變結(jié)構(gòu)域包含SEQ ID NO:48的CDR1區(qū),SEQ ID NO:49的CDR2區(qū)和SEQ ID NO:50的CDR3區(qū)。

優(yōu)選地，所述單鏈抗體其特征在于包含：

a)SEQ ID NO：1的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域和SEQ ID NO：2的重鏈可變結(jié)構(gòu)域；

b)SEQ ID NO：3的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域和SEQ ID NO：4的重鏈可變結(jié)構(gòu)域；

c)SEQ ID NO：5的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域和SEQ ID NO：6的重鏈可變結(jié)構(gòu)域；

d)SEQ ID NO：7的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域和SEQ ID NO：8的重鏈可變結(jié)構(gòu)域；或

e)SEQ ID NO：9的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域和SEQ ID NO：10的重鏈可變結(jié)構(gòu)域。

優(yōu)選地，所述單鏈抗體其特征在于來源于人IgG2亞類、人IgG1亞類或人IgM亞類的單克隆抗體。

優(yōu)選地，所述單鏈抗體是scFv。

本發(fā)明的另一個實施方案是包含本發(fā)明所述的單鏈抗體的測定或診斷用試劑盒或試劑。

優(yōu)選地，所述試劑盒或試劑用于ELISA測定、Western Blotting測定、免疫組織化學(xué)測定或免疫熒光測定，特別是用于診斷肝癌。

本發(fā)明的另一個實施方案是本發(fā)明所述的單鏈抗體在制備測定或診斷用試劑盒或試劑中的應(yīng)用，優(yōu)選所述試劑盒或試劑用于ELISA測定、Western Blotting測定、免疫組織化學(xué)測定或免疫熒光測定，特別是用于診斷肝癌。

本發(fā)明的另一個實施方案是編碼本發(fā)明所述的單鏈抗體的核酸。

本發(fā)明的另一個實施方案是包含本發(fā)明所述的核酸的表達載體，優(yōu)選所述載體用于在原核宿主細胞或真核宿主細胞中表達特異性結(jié)合于人肝癌標志物的單鏈抗體，所述人肝癌標志物選自由以下組成的組：甲胎蛋白 (AFP)、谷氨酰轉(zhuǎn)移酶同工酶II(GGT II)、α-L-巖藻糖甘酶(AFU)、肝細胞生長因子(HGF)和硫酸肝素蛋白多糖3(GPC3)。

本發(fā)明的另一個實施方案是包含本發(fā)明所述的載體的原核宿主細胞或真核宿主細胞。

本發(fā)明還包括用于產(chǎn)生根據(jù)本發(fā)明所述的重組人或人源化的抗體(單鏈抗體)的方法，其特征在于在原核或真核宿主細胞中表達根據(jù)本發(fā)明所述的核酸，并且從所述細胞或細胞培養(yǎng)上清液中回收所述抗體(單鏈抗體)。本發(fā)明還包括可通過所述重組方法獲得的抗體(單鏈抗體)。

根據(jù)本發(fā)明所述的單鏈抗體特別用于ELISA測定、Western Blotting測定、免疫組織化學(xué)測定或免疫熒光測定，特別是用于診斷肝癌。

發(fā)明詳述

本發(fā)明公開了針對五種肝癌標志物的單克隆抗體和單鏈抗體，及其制備方法和科研醫(yī)療用途，屬于細胞工程技術(shù)領(lǐng)域。它們以市售AFP和本實驗室制備的HGF、AFU、GGTⅡ、GPC3融合蛋白為抗原，免疫Balb/c小鼠得到分泌抗體的B細胞，與骨髓瘤細胞融合后篩選具有分泌單克隆抗體的融合細胞；所制備單克隆抗體能很好應(yīng)用于ELISA、Western Blotting、免疫組織化學(xué)、免疫熒光等對相應(yīng)抗原的檢測；此外，本發(fā)明還利用基因工程方法分別制備了只含有每種抗體重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的單鏈抗體(ScFv)，所構(gòu)建的單鏈抗體具有分子小、免疫原性低、無Fc端、對腫瘤組織的穿透力強等特點。將這些抗體聯(lián)用，有望開發(fā)出應(yīng)用于肝癌患者早期血清學(xué)診斷的有效試劑盒。

具體地，本發(fā)明提供以下各項：

1、五種單克隆抗體，HGF、AFP、AFU、GGTⅡ、GPC3單克隆抗體，其特征在于它們是以市售AFP和自行制備的HGF、AFU、GGTⅡ、GPC3融合蛋白為抗原，免疫Balb/c小鼠得到分泌抗體的B細胞，與骨髓瘤細胞融合后篩選具有分泌單克隆抗體的融合細胞，注射到小鼠腹腔得到含有抗體的腹水，純化后即得到單克隆抗體，HGF抗體為IgG2b和IgG2a，AFP抗體為IgG2a，AFU抗體為IgM，GPC3抗體為IgG2b，GGTⅡ抗體為IgG2b和IgG1。

2、根據(jù)以上1所述的單克隆抗體，其特征在于其制備方法包括的步驟：

1)用HGF、AFP、AFU、GGTⅡ、GPC3抗原蛋白分別免疫Balb/c小鼠，ELISA法測效價后，取小鼠脾臟從而得到能分泌相應(yīng)抗體的B細胞；

2)用細胞融合技術(shù)將小鼠脾細胞與骨髓瘤細胞系SP2/0融合，利用無限稀釋法、有限稀釋法結(jié)合ELISA法篩選得到具有分泌單克隆抗體功能的雜交瘤細胞；

3)將雜交瘤細胞注射入提前注射過pristine的Balb/c小鼠腹腔內(nèi)，得到小鼠腹水，經(jīng)鹽析法和透析袋透析后，應(yīng)用HiTrap Protein G HP柱純化單克隆抗體；

4)利用AKTA蛋白分離純化儀洗脫結(jié)合好的純化柱，得到單克隆抗體。

3、根據(jù)以上1所述的單克隆抗體，其特征在于所制備的HGF單克隆抗體能很好應(yīng)用于酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)和Western Blotting對HGF的檢測；所制備的AFP單克隆抗體能很好應(yīng)用于ELISA、Western Blotting和免疫組織化學(xué)(IHC)對AFP的檢測；所制備的AFU單克隆抗體能夠很好地應(yīng)用于Western Blotting對AFU的檢測；所制備的GGTⅡ單克隆抗體能很好應(yīng)用于ELISA、Western Blotting和免疫熒光(IF)對GGTⅡ的檢測；所制備的GPC3單克隆抗體能很好地應(yīng)用于ELISA、Western Blotting和IF對GPC3的檢測。

4、根據(jù)以上3所述的單克隆抗體應(yīng)用，其特征在于其包括的步驟：

1)ELISA法：在酶標板上包被所制備的單克隆抗體，檢測HCC患者血清和正常人血清，孵育羊抗鼠二抗后OPD顯色，檢測吸光度；

2)Western Blotting法：將不同肝癌細胞蛋白(HepG2、Hep3b、7721、7702等)上樣電泳轉(zhuǎn)膜后，孵育所制備的單克隆抗體作為一抗，孵育二抗后ECL顯色，暗室曝光；

3)免疫組織化學(xué)法(IHC)：使用肝癌組織石蠟切片，經(jīng)脫蠟、抗原修復(fù)、滅活內(nèi)源性過氧化物酶后，孵育所制備的單克隆抗體作為一抗，孵育二抗后DAB顯色，經(jīng)復(fù)染、脫水步驟后封片拍照；

4)免疫熒光法(IF)：將肝癌細胞HepG2鋪種于放有蓋玻片的十二孔板，經(jīng)固定及打孔后，孵育所制備的單克隆抗體作為一抗，孵育二抗及 DAPI染核后封片拍照。

5、五種單鏈抗體，其特征在于它們分別根據(jù)已制備的HGF、AFP、AFU、GGTⅡ和GPC3單克隆抗體的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)序列，經(jīng)過Overlap PCR、質(zhì)粒構(gòu)建及蛋白表達純化等步驟制備而成的，具有分子小、免疫原性低、無Fc端、對腫瘤組織的穿透力強等特點。

6、根據(jù)以上5所述的單鏈抗體，其特征在于各自的堿基序列，詳見專利說明書。

7、根據(jù)以上5所述的單鏈抗體，其特征在于其制備方法所包括的步驟：

1)提取雜交瘤細胞的RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄后PCR擴增重鏈可變區(qū)V_H、輕鏈可變區(qū)V_L片段，與載體連接后轉(zhuǎn)化入感受態(tài)DH5α，挑選V_H和V_L陽性克隆。

2)用PCR法分別擴增出相應(yīng)單克隆抗體的V_H和V_L，之后用Overlap PCR法連接V_H、V_L片段。

3)用重組技術(shù)構(gòu)建Payz-HGF(AFP、AFU、GGTⅡ、GPC3)ScFv質(zhì)粒，在大腸桿菌16C9中大量表達，應(yīng)用HitrapFF親和層析柱純化單鏈抗體。

根據(jù)具體地，本發(fā)明提供了針對不同肝癌標志物抗原的五類抗體，分別為AFP單克隆抗體及單鏈抗體，AFU單克隆抗體及單鏈抗體，GGTⅡ單克隆抗體及單鏈抗體，HGF單克隆抗體及單鏈抗體，GPC3單克隆抗體及單鏈抗體。

本發(fā)明所述的五種單克隆抗體的抗原AFP為市售，純度大于95％以上，HGF、AFU、GGTⅡ和GPC3抗原為本實驗室制備，在大腸桿菌中表達，為原核表達的融合蛋白。

本發(fā)明所述的五種單克隆抗體的制備所包括的步驟為：

1)用HGF、AFP、AFU、GGTⅡ、GPC3抗原蛋白分別免疫Balb/c小鼠，ELISA法測效價后，取小鼠脾臟從而得到能分泌相應(yīng)抗體的B細胞；

2)用細胞融合技術(shù)將小鼠脾細胞與骨髓瘤細胞系SP2/0融合，利用無限稀釋法、有限稀釋法結(jié)合ELISA法篩選得到具有分泌單克隆抗體功能的雜交瘤細胞；

3)將雜交瘤細胞注射入提前注射過pristine的Balb/c小鼠腹腔內(nèi)，得 到小鼠腹水，經(jīng)鹽析法和透析袋透析后，應(yīng)用HiTrap Protein G HP柱純化單克隆抗體；

4)利用AKTA蛋白分離純化儀洗脫結(jié)合好的純化柱，得到單克隆抗體。

本發(fā)明所制備的單克隆抗體應(yīng)用的步驟為：

1)ELISA法：在酶標板上包被所制備的單克隆抗體，檢測HCC患者血清和正常人血清，孵育生物素標記單克隆抗體和HRP標記親和素后OPD顯色，檢測吸光度；

2)Western Blotting法：將不同肝癌細胞蛋白(HepG2、Hep3b、7721、7702等)上樣電泳轉(zhuǎn)膜后，孵育所制備的單克隆抗體作為一抗，孵育二抗后ECL顯色，暗室曝光；

3)免疫組織化學(xué)法(IHC)：使用肝癌組織石蠟切片，經(jīng)脫蠟、抗原修復(fù)、滅活內(nèi)源性過氧化物酶后，孵育所制備的單克隆抗體作為一抗，孵育二抗后DAB顯色，經(jīng)復(fù)染、脫水步驟后封片拍照；

4)免疫熒光法(IF)：將肝癌細胞HepG2鋪種于放有蓋玻片的十二孔板，經(jīng)固定及打孔后，孵育所制備的單克隆抗體作為一抗，孵育二抗及DAPI染核后封片拍照；

本發(fā)明篩選出的5種抗體穩(wěn)定性非常好，雜交瘤細胞株經(jīng)過多次鑒定都保持了強分泌抗體的特性?？贵w制備過程中采用鏡下直接吸取細胞株的方法，大大提高了得到單克隆株的概率，有效縮短了分選的時間。本發(fā)明所采用的抗原純度高，免疫原性強，從源頭上保證了所制備抗體的質(zhì)量。

本發(fā)明所制備的HGF單克隆抗體能很好應(yīng)用于ELISA和Western Blotting對HGF的檢測；所制備的AFP單克隆抗體能很好應(yīng)用于ELISA、Western Blotting和IHC對AFP的檢測；所制備的AFU單克隆抗體能夠很好地應(yīng)用于ELISA和Western Blotting對AFU的檢測；所制備的GGTⅡ單克隆抗體能很好應(yīng)用于ELISA、Western Blotting和IF對GGTⅡ的檢測；所制備的GPC3單克隆抗體能很好地應(yīng)用于ELISA、Western Blotting和IF對GPC3的檢測。

單鏈抗體(scFv)是抗體分子中保留抗原結(jié)合部分的最小功能片段，分子量約為完整抗體的1/6，是用基因工程方法將抗體重鏈和輕鏈可變區(qū) 通過一段連接肽連接而成的重組蛋白，具有分子小、免疫原性低、無Fc端、對腫瘤組織的穿透力強等特點。為了更好地將肝癌標志物抗體應(yīng)用于肝癌檢測，本發(fā)明分別根據(jù)已制備的HGF、AFP、AFU、GGTⅡ和GPC3單克隆抗體的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)序列，制備了相應(yīng)的單鏈抗體。

本發(fā)明所述的五種單鏈抗體的制備所包括的步驟為：

1)提取雜交瘤細胞的RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄后PCR擴增重鏈可變區(qū)V_H、輕鏈可變區(qū)V_L片段，與載體連接后轉(zhuǎn)化入DH5α，挑選V_H和V_L陽性克隆。

2)用PCR法分別擴增出相應(yīng)單抗的V_H和V_L，之后用Overlap PCR法連接V_H、V_L片段。

2)用重組技術(shù)構(gòu)建Payz-HGF(AFP、AFU、GGTⅡ、GPC3)ScFv質(zhì)粒，在大腸桿菌16C9中大量表達，應(yīng)用HitrapFF親和層析柱純化單鏈抗體。

定義

術(shù)語“抗體”涵蓋抗體結(jié)構(gòu)的多種形式，包括但不限于完整的抗體和抗體片段。根據(jù)本發(fā)明所述的抗體優(yōu)選地是人源化的抗體、嵌合抗體或其它遺傳改造的抗體，只要根據(jù)本發(fā)明的特征性質(zhì)仍舊保留。

抗體的“類別”是指其重鏈具有的恒定結(jié)構(gòu)域或恒定區(qū)的類型。有五個主要類別的抗體：IgA，IgD，IgE，IgG和IgM，并且這些中的一些可以進一步被劃分為亞類(同種型)，例如，IgG₁，IgG₂，IgG₃，IgG₄，IgA₁和IgA₂。對應(yīng)于不同類別的免疫球蛋白的重鏈恒定結(jié)構(gòu)域分別被稱為α，δ，ε，γ和μ。

“抗體片段”是指不同于完整抗體的分子，其包含完整抗體的部分，所述部分結(jié)合完整抗體結(jié)合的抗原?？贵w片段的實例包括但不限于Fv，F(xiàn)ab，F(xiàn)ab'，F(xiàn)ab’-SH，F(xiàn)(ab')₂；雙抗體；線性抗體；單鏈抗體分子(例如scFv)；和由抗體片段形成的多特異性抗體。

術(shù)語“單克隆抗體”或“單克隆抗體組合物”用于本文中時，指單一氨基酸組成的抗體分子制劑。

“可變結(jié)構(gòu)域”(輕鏈(V_L)的可變結(jié)構(gòu)域，重鏈(V_H)的可變結(jié)構(gòu)域)用于本 文中時，表示直接參與抗體與抗原結(jié)合的每對輕鏈和重鏈結(jié)構(gòu)域。可變輕鏈和重鏈的結(jié)構(gòu)域具有相同的一般結(jié)構(gòu)且每個結(jié)構(gòu)域包括4個構(gòu)架(FR)區(qū)，所述構(gòu)架區(qū)的序列普遍保守，其通過3個“高變區(qū)”(或互補決定區(qū),CDRs)相連接。構(gòu)架區(qū)采用β-折疊構(gòu)象且CDR可以形成連接β-折疊結(jié)構(gòu)的環(huán)。每條鏈中的CDR通過構(gòu)架區(qū)以其三維結(jié)構(gòu)保持并與來自另一條鏈的CDR一起形成抗原結(jié)合位點?？贵w重鏈和輕鏈CDR3區(qū)在按照本發(fā)明的抗體的結(jié)合特異性/親和力方面發(fā)揮特別重要的作用并因此提供本發(fā)明的另一個目的。

用于本文時，術(shù)語“抗體的抗原結(jié)合部分”指負責(zé)抗原結(jié)合的抗體的氨基酸殘基。抗體的抗原結(jié)合部分包括來自“互補決定區(qū)”或“CDRs”的氨基酸殘基?！皹?gòu)架”或“FR”區(qū)是除本文中定義的高變區(qū)殘基之外的那些可變結(jié)構(gòu)域區(qū)域。因此，抗體的輕鏈和重鏈可變結(jié)構(gòu)域從N端到C端包括結(jié)構(gòu)域FR1,CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。特別地，重鏈的CDR3是最有助于抗原結(jié)合的區(qū)域并且限定抗體的性質(zhì)。按照Kabat,E.A.,等，免疫目的的蛋白質(zhì)序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest)，第5版，公眾健康服務(wù)，國家健康研究所(Public Health Service，National Institutes of Health)，Bethesda，MD.(1991))的標準定義確定CDR和FR區(qū)域,和/或來自“高變環(huán)”的那些殘基。

術(shù)語“核酸”或“核酸分子”，用于本文時，意欲包括DNA分子和RNA分子。核酸分子可以是單鏈或雙鏈的，但是優(yōu)選是雙鏈DNA。

術(shù)語”氨基酸”在本申請中使用時指天然存在的羧基α氨基酸的組，其包括丙氨酸(三字母編碼:ala,一字母編碼:A),精氨酸(arg,R),天冬酰胺(asn,N),天冬氨酸(asp,D),半胱氨酸(cys,C),谷氨酰胺(gln,Q),谷氨酸(glu,E),甘氨酸(gly,G),組氨酸(his,H),異亮氨酸(ile,I),亮氨酸(leu,L),賴氨酸(lys,K),甲硫氨酸(met,M),苯丙氨酸(phe,F),脯氨酸(pro,P),絲氨酸(ser,S),蘇氨酸(thr,T),色氨酸(trp,W),酪氨酸(tyr,Y),和纈氨酸(val,V)。

用于本文中時，表述“細胞”、“細胞系”和“細胞培養(yǎng)物”可交替使用，且全部這些名稱都包括子代。因此，詞語“轉(zhuǎn)化體”和“轉(zhuǎn)化的細胞”包括原代受試細胞和由其來源的培養(yǎng)物，而不考慮轉(zhuǎn)移的次數(shù)。還理解所有的子 代的DNA含量可能不精確一致，這歸因于有意或無意的突變。包括在最初轉(zhuǎn)化的細胞中篩選的具有相同功能或生物學(xué)活性的變異子代。

根據(jù)本發(fā)明所述的抗體可以由重組方式產(chǎn)生。因此，本發(fā)明的一個方面是編碼根據(jù)本發(fā)明所述的抗體的核酸，并且另一個方面是包含編碼根據(jù)本發(fā)明抗體的所述核酸的細胞。用于重組生產(chǎn)的方法是現(xiàn)有技術(shù)中廣泛已知的并且包含在原核細胞和真核細胞中的蛋白表達，以及隨后的抗體分離和通常純化為藥用純度。對于將前述抗體在宿主細胞中的表達，將編碼各個修飾的輕鏈和重鏈的核酸通過標準方法插入表達載體中。在適合的原核或真核宿主細胞如CHO細胞,NS0細胞,SP2/0細胞,HEK293細胞,COS細胞,PER.C6細胞,酵母,或大腸桿菌細胞中進行表達，并且將所述抗體從細胞(上清液或裂解后的細胞)中回收。用于重組生產(chǎn)抗體的一般方法是現(xiàn)有技術(shù)中公知的，并且例如在Makrides,S.C.,Protein Expr.Purif.17(1999)183-202；Geisse,S.,等,Protein Expr.Purif.8(1996)271-282；Kaufman,R.J.,分子生物技術(shù)(Mol.Biotechnol.)16(2000)151-161；Werner,R.G.,J.Drug Res(藥物研究雜志).48(1998)870-880的綜述文章中描述。

根據(jù)本發(fā)明所述的抗體適當(dāng)?shù)貜呐囵B(yǎng)基中通過常規(guī)免疫球蛋白純化方法分離，所述純化方法如，例如蛋白A-瓊脂糖,羥基磷灰石層析法，凝膠電泳，透析或親和層析法。編碼所述單克隆抗體的DNA和RNA容易地使用常規(guī)方法進行分離和測序。雜交瘤細胞可以充當(dāng)所述DNA和RNA的來源。一旦被分離，可以將DNA插入表達載體中，所述表達載體接著被轉(zhuǎn)染到不另外產(chǎn)生免疫球蛋白的宿主細胞如HEK 293細胞,CHO細胞,或骨髓瘤細胞中，從而在宿主細胞中獲得重組單克隆抗體的合成。

提供下列實施例，序列表和附圖來輔助理解本發(fā)明，其真實范圍在后附的權(quán)利要求中提出。需要理解可以在不背離本發(fā)明實質(zhì)的情況下對本發(fā)明進行改動。

氨基酸和核苷酸序列描述

SEQ ID NO：1抗AFP單克隆抗體的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列

SEQ ID NO：2抗AFP單克隆抗體的重鏈可變結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列

SEQ ID NO：3抗AFU單克隆抗體的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列

SEQ ID NO：4抗AFU單克隆抗體的重鏈可變結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列

SEQ ID NO：5抗GGT II單克隆抗體的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列

SEQ ID NO：6抗GGT II單克隆抗體的重鏈可變結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列

SEQ ID NO：7抗HGF單克隆抗體的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列

SEQ ID NO：8抗HGF單克隆抗體的重鏈可變結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列

SEQ ID NO：9抗GPC3單克隆抗體的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列

SEQ ID NO：10抗GPC3單克隆抗體的重鏈可變結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列

SEQ ID NO：11編碼抗AFP單克隆抗體的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列

SEQ ID NO：12編碼抗AFP單克隆抗體的重鏈可變結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列

SEQ ID NO：13編碼抗AFU單克隆抗體的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列

SEQ ID NO：14編碼抗AFU單克隆抗體的重鏈可變結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列

SEQ ID NO：15編碼抗GGT II單克隆抗體的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列

SEQ ID NO：16編碼抗GGT II單克隆抗體的重鏈可變結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列

SEQ ID NO：17編碼抗HGF單克隆抗體的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列

SEQ ID NO：18編碼抗HGF單克隆抗體的重鏈可變結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列

SEQ ID NO：19編碼抗GPC3單克隆抗體的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列

SEQ ID NO：20編碼抗GPC3單克隆抗體的重鏈可變結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列

SEQ ID NO：21抗AFP單克隆抗體的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的CDR1序列

SEQ ID NO：22抗AFP單克隆抗體的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的CDR2序列

SEQ ID NO：23抗AFP單克隆抗體的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的CDR3序列

SEQ ID NO：24抗AFP單克隆抗體的重鏈可變結(jié)構(gòu)域的CDR1序列

SEQ ID NO：25抗AFP單克隆抗體的重鏈可變結(jié)構(gòu)域的CDR2序列

SEQ ID NO：26抗AFP單克隆抗體的重鏈可變結(jié)構(gòu)域的CDR3序列

SEQ ID NO：27抗AFU單克隆抗體的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的CDR1序列

SEQ ID NO：28抗AFU單克隆抗體的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的CDR2序列

SEQ ID NO：29抗AFU單克隆抗體的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的CDR3序列

SEQ ID NO：30抗AFU單克隆抗體的重鏈可變結(jié)構(gòu)域的CDR1序列

SEQ ID NO：31抗AFU單克隆抗體的重鏈可變結(jié)構(gòu)域的CDR2序列

SEQ ID NO：32抗AFU單克隆抗體的重鏈可變結(jié)構(gòu)域的CDR3序列

SEQ ID NO：33抗GGT II單克隆抗體的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的CDR1序列

SEQ ID NO：34抗GGT II單克隆抗體的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的CDR2序列

SEQ ID NO：35抗GGT II單克隆抗體的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的CDR3序列

SEQ ID NO：36抗GGT II單克隆抗體的重鏈可變結(jié)構(gòu)域的CDR1序列

SEQ ID NO：37抗GGT II單克隆抗體的重鏈可變結(jié)構(gòu)域的CDR2序列

SEQ ID NO：38抗GGT II單克隆抗體的重鏈可變結(jié)構(gòu)域的CDR3序列

SEQ ID NO：39抗HGF單克隆抗體的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的CDR1序列

SEQ ID NO：40抗HGF單克隆抗體的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的CDR2序列

SEQ ID NO：41抗HGF單克隆抗體的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的CDR3序列

SEQ ID NO：42抗HGF單克隆抗體的重鏈可變結(jié)構(gòu)域的CDR1序列

SEQ ID NO：43抗HGF單克隆抗體的重鏈可變結(jié)構(gòu)域的CDR2序列

SEQ ID NO：44抗HGF單克隆抗體的重鏈可變結(jié)構(gòu)域的CDR3序列

SEQ ID NO：45抗GPC3單克隆抗體的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的CDR1序列

SEQ ID NO：46抗GPC3單克隆抗體的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的CDR2序列

SEQ ID NO：47抗GPC3單克隆抗體的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的CDR3序列

SEQ ID NO：48抗GPC3單克隆抗體的重鏈可變結(jié)構(gòu)域的CDR1序列

SEQ ID NO：49抗GPC3單克隆抗體的重鏈可變結(jié)構(gòu)域的CDR2序列

SEQ ID NO：50抗GPC3單克隆抗體的重鏈可變結(jié)構(gòu)域的CDR3序列

附圖說明

圖1.實施例3中HGF單克隆抗體純化圖譜；

圖2.實施例3中AFP單克隆抗體純化圖譜；

圖3.實施例3中GGTⅡ單克隆抗體純化圖譜；

圖4.實施例7中HGF H1及H2單克隆抗體(H1為IgG2a類型，H2為IgG2b類型，對第一種進行了測序)對不同細胞系中HGF表達的檢測；

圖5.實施例7中AFP單克隆抗體對不同細胞系中AFP表達的檢測；

圖6.實施例7中GGTⅡ單克隆抗體對不同細胞系中GGTⅡ表達的檢測；

圖7.實施例7中GPC3單克隆抗體對不同細胞系中GPC3表達的檢測；

圖8.實施例6中ELISA法對人血清HGF含量的檢測；

圖9.實施例8中AFP單克隆抗體免疫組織化學(xué)法檢測肝癌組織AFP 的表達；

圖10.實施例9中GGTⅡ單克隆抗體免疫熒光法檢測肝癌細胞GGTⅡ的表達；

圖11.實施例9中GPC3單克隆抗體免疫熒光法檢測肝癌細胞GPC3的表達；

圖12.實施例5中HGF單鏈抗體SDS-PAGE圖；

圖13.實施例4中overlap PCR連接AFP VH和AFP VL片段電泳圖；

圖14.實施例8中HGF單克隆抗體免疫組織化學(xué)法檢測肝癌組織AFP的表達(結(jié)論：抗體可以應(yīng)用于人肝細胞肝癌免疫組化)；

圖15.實施例8中AFU單克隆抗體免疫組織化學(xué)法檢測肝癌組織AFP的表達(結(jié)論：抗體可以應(yīng)用于人肝細胞肝癌免疫組化)；

圖16.實施例1中各免疫原蛋白的氨基酸序列(注：所用AFP抗原為市售蛋白)；

圖17.實施例10AFP、AFU、HGF、GPC3和GGT2在四組受試者血清中含量統(tǒng)計圖；

圖18.實施例10在全人群篩查肝癌時AFP、AFU、HGF、GPC3和GGT2單獨檢測全期肝癌患者血清的ROC曲線圖；

圖19.實施例10在全人群篩查肝癌時HGF單指標納入受試者年齡和性別檢測全期肝癌和早期肝癌患者血清的ROC曲線圖；

圖20.實施例10在全人群篩查肝癌時，雙指標納入受試者性別檢測全期肝癌和早期肝癌患者血清的ROC曲線圖；

圖21.實施例10在全人群篩查肝癌時，雙指標納入受試者年齡檢測全期肝癌和早期肝癌患者血清的ROC曲線圖；

圖22.實施例10在全人群篩查肝癌時，三指標檢測全期肝癌和早期肝癌患者血清的ROC曲線圖；

圖23.實施例10在全人群篩查肝癌時，四指標檢測全期肝癌和早期肝癌患者血清的ROC曲線圖；

圖24.實施例10在全人群篩查肝癌時，五指標聯(lián)合檢測全期及早期肝癌患者血清的ROC曲線圖；

圖25.實施例10在肝炎患者中篩查肝癌時，HGF單指標及HGF納入 受試者年齡性別檢測全期肝癌和早期肝癌的ROC曲線圖；

圖26.實施例10在肝炎患者中篩查肝癌時，雙指標納入受試者性別檢測全期肝癌和早期肝癌患者血清的ROC曲線圖；

圖27.實施例10在肝炎患者中篩查肝癌時，雙指標納入受試者年齡檢測全期肝癌和早期肝癌患者血清的ROC曲線圖；

圖28.實施例10在肝炎患者中篩查肝癌時，三指標檢測全期肝癌和早期肝癌患者血清的ROC曲線圖；

圖29.實施例10在肝炎患者中篩查肝癌時，四指標檢測全期肝癌和早期肝癌患者血清的ROC曲線圖；

圖30.實施例10在肝炎患者中篩查肝癌時，五指標檢測全期肝癌和早期肝癌患者血清的ROC曲線圖；

圖31.實施例10在肝硬化患者中篩查肝癌時，HGF單指標及HGF納入受試者年齡性別檢測全期肝癌和早期肝癌的ROC曲線圖；

圖32.實施例10在肝硬化患者中篩查肝癌時，雙指標納入受試者性別或年齡檢測全期肝癌和早期肝癌患者血清的ROC曲線圖；

圖33.實施例10在肝硬化患者中篩查肝癌時，三指標檢測全期肝癌和早期肝癌患者血清的ROC曲線圖；

圖34.實施例10在肝硬化患者中篩查肝癌時，四指標檢測全期肝癌和早期肝癌患者血清的ROC曲線圖；

圖35.實施例10在肝硬化患者中篩查肝癌時，五指標檢測全期肝癌和早期肝癌患者血清的ROC曲線圖；和

圖36.實施例10中AFP、AFU、HGF、GPC3和GGT2在肝癌病人血清，乙肝病人血清，肝硬化病人血清及正常人血清中檢測值模型驗證。

具體實施方式

下面通過實施例對本發(fā)明進行具體描述，它們只用于對本發(fā)明進行進一步的說明，不能理解為對本發(fā)明保護范圍的限制，本領(lǐng)域的技術(shù)人員根據(jù)上述本發(fā)明的內(nèi)容做出一些非本質(zhì)的改進和調(diào)整，均屬本發(fā)明保護范圍。

實施例1：制備HGF抗體動物免疫及免疫效價測定(以HGF為例， 其余抗體步驟相同或類似)

1)7周大小雌性Balb/c小鼠3只，首次免疫采用100μg HGF融合蛋白(任選地例如帶有標簽蛋白如His的HGF蛋白)/每只鼠，加等體積福氏完全佐劑，通過三通來乳化混勾形成油包水的乳糜狀，皮下多點注射。

2)間隔三周后抗原劑量減半，加福氏不完全佐劑及生理鹽水混勻，腹腔注射。同法免疫四次后釆取靜脈血測效價。

3)包被HGF蛋白，4ng/ml。4℃過夜；

4)PBS清洗一遍后，0.2％BSA室溫封閉1h；

5)血清分別稀釋成1:200、1:400、1:800、1:2000、1:4000、1:8000、1:20000。PBS為空白對照，未免疫過的小鼠血清作為陰性對照。37℃孵育2h；

6)PBS清洗三遍后，羊抗鼠二抗1:5000，37℃孵育1h；

7)PBS清洗五遍后，OPD顯色5-10min；

8)終止液終止，492nm波長下檢測吸光度。

實施例2：細胞融合及融合細胞的篩選

1)處死7周大小Balb/c小鼠2只，取巨噬細胞作為飼養(yǎng)細胞鋪在6塊96孔板內(nèi)；

2)取靜脈沖擊三天后的小鼠處死后取脾臟，與骨髓瘤細胞SP2/0融合后無限稀釋法鋪成6個96孔板。培養(yǎng)條件為含20％FBS的1×HAT的DMEM/F12培養(yǎng)液；

3)10天后觀察克隆生長，期間補充兩次含血清的1×HAT的DMEM/F12培養(yǎng)液；

4)顯微鏡下觀察雜交瘤細胞，又圓又亮葡萄串生長的即可以開始檢測特異性。用ELISA法篩選出能與抗原特異性結(jié)合的陽性孔進行亞克隆化；

5)有限稀釋法亞克?。喝【捺导毎鳛樵~養(yǎng)細胞鋪在6塊96孔板內(nèi)。調(diào)整陽性孔細胞數(shù)為1×10³/ml左右，加入含血清的1×HT的RPMI1640培養(yǎng)液使每孔細胞分別為2個/孔，1個/孔，0.5個/孔；

6)4-5天后觀察，用ELISA法對上清進行抗體檢測，再得到陽性孔擴大培養(yǎng)再進行克隆化，直到得到單克隆抗體細胞；

7)篩選出的陽性單克隆株擴大化培養(yǎng)，凍存至液氮罐，定期復(fù)蘇檢查細胞活性和分泌抗體的穩(wěn)定性。本發(fā)明篩選出的5種抗體穩(wěn)定性非常好，雜交瘤細胞株經(jīng)過多次鑒定都保持了強分泌抗體的特性。

實施例3：腹水的制備與純化

1)準備10周大左右的雌性Balb/c小鼠5只，腹腔注射500μl pristine/只，待7-21天后每只鼠腹腔注射2×10⁶個處于對數(shù)生長期的雜交瘤細胞，10天后密切觀察小鼠，待腹水盡可能多時處死小鼠取出腹水。3000rpm，15min離心去雜質(zhì)，去油脂。

2)鹽析法沉淀免疫球蛋白：用PBS將腹水稀釋一倍，加入飽和硫酸銨使終濃度為33％。邊滴加邊搖晃。4℃放置4小時以上。12000rpm，離心15min后棄去上清。沉淀用適量PBS溶解，放入透析袋，4℃透析過夜。

3)取出透析液，使用泳動泵將液體上柱，免疫球蛋白會特異性與Protein G結(jié)合，將留出的液體再上柱一遍使結(jié)合更加完全，用PB buffer不斷過柱，將雜蛋白洗脫下來；

4)將結(jié)合好的柱子裝在AKTA蛋白分離純化儀上，PB buffer平衡后，將流動相換成0.1M甘氨酸洗脫液，觀察UV吸收峰。洗脫液管保存冰上，以免蛋白降解；

5)將洗脫液轉(zhuǎn)移到50ml濃縮管(100KD)，2000rpm，4℃離心4小時。不斷加入PB buffer置換，直到剩下1ml左右蛋白溶液，吸出至EP管，檢測OD值，測定濃度；

6)將單克隆抗體稀釋到1mg/ml，加入甘油，分裝，-20℃保存。

實施例4：HGF單鏈抗體載體的構(gòu)建(以HGF為例，其余抗體步驟相同或類似)

1)選取處于對數(shù)生長期，能持續(xù)分泌單克隆抗體的雜交瘤細胞2×10⁷個，使用TRIZOL裂解液提取RNA。

2)將RNA用DEPC水稀釋到300ng/μl，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進行RNA逆轉(zhuǎn)錄，得到的cDNA用于進行PCR擴增。

3)PCR擴增HGF V_H、HGF V_L片段：以逆轉(zhuǎn)錄合成的HGF cDNA為 模板，分別以P1，P2和P3，P4為引物擴增重輕鏈可變區(qū)片段，反應(yīng)體系為50μl。

擴增重鏈輕鏈可變區(qū)的簡并性引物：

P1：重鏈上游5’-SAGGTGMAGCTKCASSARTCWGG

P2：重鏈下游5’-TGGGGSTGTYGTTTTGGCTGMRGAGACRGTGA

P3:κ上游5’-GACATTGTKMTSACMCAGYMKYCM

P4:κ下游5’-GGATACAGTTGGTGCAGCATCATCAGCCCGTTT

4)反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)1.2％瓊脂糖凝膠電泳分離，采用切膠回收試劑盒純化回收。

5)將切膠回收的HGF V_H DNA、HGF V_L DNA分別與pMD 19T Vector連接，連接產(chǎn)物分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，使用藍白篩選挑選陽性克隆，測序正確后提取質(zhì)粒。

6)以測序陽性的克隆為模板，PCR法分別擴增HGF V_H和HGF V_L，通過overlap PCR將HGF V_H和HGF V_L通過GlyGlyGlyGlySer(G4S)基因片段連接。

7)利用限制性內(nèi)切酶Mlu I，Sph I酶切HGF V_H-V_L基因片段，與用同樣酶切的Payz Vector進行連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化16C9感受態(tài)細菌，通過菌落PCR挑選陽性克隆，測序正確后用于融合蛋白的表達。

本發(fā)明獲得的單克隆抗體的輕鏈和重鏈可變結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列及其編碼核苷酸序列如以下和序列表中所示。

本發(fā)明所述的五個單鏈抗體的堿基序列為：

1)HGF SCFV(IgG2b)

GAGCTCGATATTCAGATGATACAGTCTCCATCCTCCGTGGAGGCAGCTGTGGGAGGCACAGTCACCATCAAGTGCCAGGCCAGTGAGGATATTAGTAGTAATTTAGCCTGGTGTCAGCAGAAACCAGGACAGCCTCCCAAGCTCCTGATCTATGGTGCATCCACTCTGGCATCTGGGGTCCCATCGCGGTTCAAAGGCAGTGGATCTGGGACACAGTATACTCTCACCATCAGCGACGTGCAGTGTGACGATGCTGCCACTTACTACTGTGCAGGCGGTTATAGTCGTGGTAGTGATACTTTTGCTTTCGGCGTGGGGACCAAGCTGGAAATAAAAGGTGGTTCCTCTAGATCTTCCCTCGAGGTGAAGCTGATGGAATCTGGGGCTGAGCTGGTGAGGCCTGGGGCTTCAGTGACGCTGTCCTGCAAGGCTTCGGGCTACACATTTACTGACTATGAAATGCACTGGGTGAAGCAGACACCTGTGCATGGCCTGGAATGGATTGGAGCTATTGATCCTGAAACTGGTGGTACTGCCTACAGTCAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACACTGACTGCAGACAAATCTTCCAGCACAGCCTACATGGAGCTCCGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCCGTCTATTACTGT ACGCTAAGGATTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCAGAGAGTCAGTCCTTCCCAAATGTCACTAGTGGAGGTGGAGGTAAAGGAGGTGGAGGTGGCCAGGCCGGCCAGCACCATCACCATCACCATGGCGCATACCCGTACGACGTTCCGGACTACGCTTCTTAG

2)AFP SCFV(IgG2a)

GCGCACGCTGAGGTGCAGCTGCAGCAGTCAGGGGCTGAACTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGTTGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTCACCAACTACTATATGTACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGGACAAGGCCTTGAGTGGATTGGAGAGATTAATCCTAGCAATGGTGATACTAACTTCAATGAGAAGTTCAAGAGCAAGGCCACACTGACTGTAGACAAATCCTCCAGCACAGCATACATGCAACTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTACAAGATGGAGGGCAACTCGGACTATAGGGTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCAGCCAAAACGACAGCCCCAGACATTGTGCTCACCCAGTCGCCCGCCTCCCTATCTGTATCTGTGGGAGAAACTGTCACCATCACATGTCGAGCAAGTGAGAATATTTACAGTGAATTAACATGGTATCAGCAGAAACAGGGAAAATCTCCTCAGCTCCTGGTCTATGTTGCAAGAAACTTAGCAGATGGTGTGCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGCACACAATATTCCCTCAAGATCAACAGCCTGCAGTCTGAAGATTTTGGAATTTATTACTGTCAACATTTTTGGGGTACTCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAACGGGCTGATGCTGCACCAACTGTATCCCATCACCATCACCATCATTGAGCGC

3)AFU SCFV(IgM)

GAGCTCGATATTAAGATAACCCAGTCTCCATCTTATCTTGCTGCATCTCCTGGAGAAACCATTACTATTAATTGCAGGGCAAGTAAGAGCATTAGCAAATATTTAGCCTGGTATCAAGAGAAACCTGGGAAAACTAATAAGCTTCTTATCTACTCTGGATCCACTTTGCAATCTGGAATTCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGTACAGATTTCACTCTCACCATCAGTAGCCTGGAGCCTGAAGATTTTGCAATGTATTACTGTCAACAGCATAATGAATACCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAGCTGAAAGGTGGTTCCTCTAGATCTTCCCTCGAGGTGAAGCTTGAGGAGTCTGGGGCTGAGCTGGTGAGGCCTGGAGTCTCAGTGAAGATTTCCTGCAAGGGTTCTGGCTACACGCTCACTGATTATGCTATGCACTGGGTGAGGCAGAGTCCTGCAAAGAGTCTAGAGTGGATTGGAGTTATTAGTACATACTATGGTGATGCTAACTACAACCAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACAATGACTGTTGACAGACCCTCCAGCACAGCCTATATGGAACTTGCCAGACTGACATCTGAGGATTCTGCCATCTATTACTGTGCAAGAGATGGTTACGACGTCTTCTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCAGAGAGTCAGTCCTTCCCAAATGTCACTAGTGGAGGTGGAGGTAAAGGAGGTGGAGGTGGCCAGGCCGGCCAGCACCATCACCATCACCATGGCGCATACCCGTACGACGTTCCGGACTACGCTTCTTAG

4)GGT Ⅱ SCFV(IgG2b)

GAGCTCGACATTTTGATGACTCAGACTCCACTCTCCCTGTCTGTCAGtCTTGGAGATCAAGCCTCCATCTCTTGCAGATCTAATCGGAGCCTTGTACACAGTAATGGAAACACCTATTTACATTGGTACCTGCAGAAGCCAGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTGATCTACAAAGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTCAAGATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATCTGGGAGTTTATTTCTGCTCTCAAAGTACACATGTTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGA CCAAGCTGGAGCTGAAAGGTGGTTCCTCTAGATCTTCCCTCGAGGTGCAGCTGCAGCAGTCTGGGGCTGAGCTGGTGAGGCCTGGAGTCTCAGTGAAGATTTCCTGCAAGGGTTCTGGCTACACGTTCACTGATTATGCTATGCACTGGGTGAGGCAGAGTCCTGCAAAGAGTCTAGAGTGGATTGGAGTTATTAGTACATACTATGGTGATGCTAACTACAACCAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACAATGACTGTTGACAGATCCTCCAGCACAGCCTATATGGAACTTGCCAGACTGACATCTGAGGATTCTGCCATCTATTACTGTGCAAGAGATGGTTACGACGTCTTCTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCAGCCAAAACAACAGCCCCATCTGTCACTAGTGGAGGTGGAGGTAAAGGAGGTGGAGGTGGCCAGGCCGGCCAGCACCATCACCATCACCATGGCGCATACCCGTACGACGTTCCGGACTACGCTTCTTAG

5)GPC3 SCFV(IgG2b)

GAGCTCGACATTGTGTTGACACAGTCTCCAGCCACCCTGTCTGTGTCTCCTGGGGAAACAGCCACCCTCTCCTGCTGGGCCAGTCAGAGTATTGGCACCTACTTAGCCTGGTACCAACAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTACGGTGCATTCACCAGGGCCGCTGGTGTCCCAGACAGGTTCACTGGCAGTGGCTCTGGGACACTCTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGTCTGAAGATTTTGCAATTTATTATTGTCAGCAGTTTAATAACTGGCCTCGGACGTTCGGCCGGGGGACCAAGCTGGAAATCAAAGGTGGTTCCTCTAGATCTTCCCTCGAGGTGCAGCTGAAGGAGTCGGGACCTGGCCTGGTGAAACCTTCTCAGTCTCTGTCCCTCACCTGCACTGTCACTGGCTACTCAATCACCAGTGATTATGGCTGGAACTGGATCCGGCAGTTTCCAGGAAACAAACTGGAGTGGATGGGCTACATAAGCTACAGTGGTGGCACTAGCTACAACCCATCTCTCAAAAGTCGAATCTCTATCACTCGAGACACATCCAAGAACCAGTTCTTCCTGCAGTTGAATTCTGTGACTACTGAGGACACAGCCACATATTTCTGTGCAAGAGATCCTGGGGAATATTACTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCCCAGCCAAAACGACACCCCCATCTGTCACTAGTGGAGGTGGAGGTAAAGGAGGTGGAGGTGGCCAGGCCGGCCAGCACCATCACCATCACCATGGCGCATACCCGTACGACGTTCCGGACTACGCTTCTTAG

AFP的重鏈、輕鏈可變區(qū)氨基酸序列及其編碼核苷酸序列，其中加粗、加下劃線部分為CDR區(qū)序列：輕鏈：

GGATACAGTTGGTGCAGCATCAGCCCGTTTGATTTCCAGCTTGGTGCCTCCACCGAACGTCCACGGAGTACCCCAAAAATGTTGACAGTAATAAATTCCAAAATCTTCAGACTGCAGGCTGTTGATCTTGAGGGAATATTGTGTGCCTGATCCACTGCCACTGAACCTTGATGGCACACCATCTGCTAAGTTTCTTGCAACATAGACCAGGAGCTGAGGAGATTTTCCCTGTTTCTGCTGATACCATGTTAATTCACTGTAAATATTCTCACTTGCTCGACATGTGATGGTGACAGTTTCTCCCACAGATACAGATAGGGAGGCGGGCGACTGGGTGAGCACAATGTC

氨基酸序列：

DIVLTQSPASLSVSVGETVTITCRASENIYSELTWYQQKQGKSPQLLVYVARNLADGVPSRFSGSGSGTQYSLKINSLQSEDFGIYYCQHFWGTPWTFGGGTKLEIKRADAAPTVS

重鏈：

GAGGTGCAGCTGCAGCAGTCAGGGGCTGAACTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGTTGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTCACCAACTACTATATGTACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGGACAAGGCCTTGAGTGGATTGGAGAGATTAATCCTAGCAATGGTGATACTAACTTCAATGAGAAGTTCAAGAGCAAGGCCACACTGACTGTAGACAAATCCTCCAGCACAGCATACATGCAACTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTACAAGATGGAGGGCAACTCGGACTATAGGGTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCAGCCAAAACGACAGCCCCA

氨基酸序列：

EVQLQQSGAELVKPGASVKLSCKASGYTFTNYYMYWVKQRPGQGLEWIGEINPSNGDTNFNEKFKSKATLTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCTRWRATRTIGFAYWGQGTLVTVSAAKTTAP

AFU的重鏈、輕鏈可變區(qū)氨基酸序列及其編碼核苷酸序列：

輕鏈

GAGCTCGATATTAAGATAACCCAGTCTCCATCTTATCTTGCTGCATCTCCTGGAGAAACCATTACTATTAATTGCAGGGCAAGTAAGAGCATTAGCAAATATTTAGCCTGGTATCAAGAGAAACCTGGGAAAACTAATAAGCTTCTTATCTACTCTGGATCCACTTTGCAATCTGGAATTCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGTACAGATTTCACTCTCACCATCAGTAGCCTGGAGCCTGAAGATTTTGCAATGTATTACTGTCAACAGCATAATGAATACCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAGCTGAAA

氨基酸序列：

ELDIKITQSPSYLAASPGETITINCRASKSISKYLAWYQEKPGKTNKLLIYSGSTLQSGIPSRFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAMYYCQQHNEYPYTFGGGTKLELK

重鏈

CTCGAGGTGAAGCTTGAGGAGTCTGGGGCTGAGCTGGTGAGGCCTGGAGTCTCAGTGAAGATTTCCTGCAAGGGTTCTGGCTACACGCTCACTGATTATGCTATGCACTGGGTGAGGCAGAGTCCTGCAAAGAGTCTAGAGTGGATTGGAGTTATTAGTACATACTATGGTGATGCTAACTACAACCAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACAATGACTGTTGACAGACCCTCCAGCACAGCCTATATGGAACTTGCCAGACTGACATCTGAGGATTCTGCCATCTATTACTGTGCAAGAGATGGTTACGACGTCTTCTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCAGAGAGTCAGTCCTTCCCAAATGTCACTAGTGGAGGTGGAGGTAAAGGAGGTGGAGGT

氨基酸序列：

LEVKLEESGAELVRPGVSVKISCKGSGYTLTDYAMHWVRQSPAKSLEWIGVISTYYGDANYNQKFKGKATMTVDRPSSTAYMELARLTSEDSAIYYCARDGYDVFYAMDYWGQGTSVTVSSESQSFPNVTSGGGGKGGGG

GGT2的重鏈、輕鏈可變區(qū)氨基酸序列及其編碼核苷酸序列：

輕鏈

GAGCTCGACATTTTGATGACTCAGACTCCACTCTCCCTGTCTGTCAGtCTTGGAGATCAAGCCTCCATCTCTTGCAGATCTAATCGGAGCCTTGTACACAGTAATGGAAACACCTATTTACATTGGTACCTGCAGAAGCCAGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTGATCTACAAAGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTCAAGATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATCTGGGAGTTTATTTCTGCTCTCAAAGTACACATGTTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAGCTGAAA

氨基酸序列：

ELDILMTQTPLSLSVSLGDQASISCRSNRSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTHVPYTFGGGTKLELK

重鏈

CTCGAGGTGCAGCTGCAGCAGTCTGGGGCTGAGCTGGTGAGGCCTGGAGTCTCAGTGAAGATTTCCTGCAAGGGTTCTGGCTACACGTTCACTGATTATGCTATGCACTGGGTGAGGCAGAGTCCTGCAAAGAGTCTAGAGTGGATTGGAGTTATTAGTACATACTATGGTGATGCTAACTACAACCAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACAATGACTGTTGACAGATCCTCCAGCACAGCCTATATGGAACTTGCCAGACTGACATCTGAGGATTCTGCCATCTATTACTGTGCAAGAGATGGTTACGACGTCTTCTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCAGCCAAAACAACAGCCCCATCTGTCACTAGTGGAGGTGGAGGTAAAGGAGGTGGAGGT

氨基酸序列：

LEVQLQQSGAELVRPGVSVKISCKGSGYTFTDYAMHWVRQSPAKSLEWIGVISTYYGDANYNQKFKGKATMTVDRSSSTAYMELARLTSEDSAIYYCARDGYDVFYAMDYWGQGTSVTVSSAKTTAPSVTSGGGGKGGGG

HGF的重鏈、輕鏈可變區(qū)氨基酸序列及其編碼核苷酸序列：

輕鏈

GAGCTCGATATTCAGATGATACAGTCTCCATCCTCCGTGGAGGCAGCTGTGGGAGGCACAGTCACCATCAAGTGCCAGGCCAGTGAGGATATTAGTAGTAATTTAGCCTGGTGTCAGCAGAAACCAGGACAGCCTCCCAAGCTCCTGATCTATGGTGCATCCACTCTGGCATCTGGGGTCCCATCGCGGTTCAAAGGCAGTGGATCTGGGACACAGTATACTCTCACCATCAGCGACGTGCAGTGTGACGATGCTGCCACTTACTACTGTGCAGGCGGTTATAGTCGTGGTAGTGATACTTTTGCTTTCGGCGTGGGGACCAAGCTGGAAATAAAA

氨基酸序列：

ELDIQMIQSPSSVEAAVGGTVTIKCQASEDISSNLAWCQQKPGQPPKLLIYGASTLASGVPSRFKGSGSGTQYTLTISDVQCDDAATYYCAGGYSRGSDTFAFGVGTKLEIK

重鏈

CTCGAGGTGAAGCTGATGGAATCTGGGGCTGAGCTGGTGAGGCCTGGGGCTTCAGTGACGCTGTCCTGCAAGGCTTCGGGCTACACATTTACTGACTATGAAATGCACTGGGTGAAGCAGACACCTGTGCATGGCCTGGAATGGATTGGAGCTATTGATCCTGAAACTGGTGGTACTGCCTACAGTCAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACACTGACTGCAGACAAATCTTCCAGCACAGCCTACATGGAGCTCCGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCCGTCTATTACTGTACGCTAAGGATTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCAGAGAGTCAGTCCTTCCCAAATGTCACTAGTGGAGGTGGAGGTAAAGGAGGTGGAGGT

氨基酸序列：

LEVKLMESGAELVRPGASVTLSCKASGYTFTDYEMHWVKQTPVHGLEWIGAIDPETGGTAYSQKFKGKATLTADKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCTLRIAYWGQGTLVTVSAESQSFPNVTSGGGGKGGGG

GPC3的重鏈、輕鏈可變區(qū)氨基酸序列及其編碼核苷酸序列：

輕鏈

GAGCTCGACATTGTGTTGACACAGTCTCCAGCCACCCTGTCTGTGTCTCCTGGGGAAACAGCCACCCTCTCCTGCTGGGCCAGTCAGAGTATTGGCACCTACTTAGCCTGGTACCAACAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTACGGTGCATTCACCAGGGCCGCTGGTGTCCCAGACAGGTTCACTGGCAGTGGCTCTGGGACACTCTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGTCTGAAGATTTTGCAATTTATTATTGTCAGCAGTTTAATAACTGGCCTCGGACGTTCGGCCGGGGGACCAAGCTGGAAATCAAA

氨基酸序列：

ELDIVLTQSPATLSVSPGETATLSCWASQSIGTYLAWYQQKPGQAPRLLIYGAFTRAAGVPDRFTGSGSGTLFTLTISSLQSEDFAIYYCQQFNNWPRTFGRGTKLEIK

重鏈

CTCGAGGTGCAGCTGAAGGAGTCGGGACCTGGCCTGGTGAAACCTTCTCAGTCTCTGTCCCTCACCTGCACTGTCACTGGCTACTCAATCACCAGTGATTATGGCTGGAACTGGATCCGGCAGTTTCCAGGAAACAAACTGGAGTGGATGGGCTACATAAGCTACAGTGGTGGCACTAGCTACAACCCATCTCTCAAAAGTCGAATCTCTATCACTCGAGACACATCCAAGAACCAGTTCTTCCTGCAGTTGAATTCTGTGACTACTGAGGACACAGCCACATATTTCTGTGCAAGAGATCCTGGGGAATATTACTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCCCAGCCAAAACGACACCCCCATCTGTCACTAGTGGAGGTGGAGGTAAAGGAGGTGGAGGT

氨基酸序列：

LEVQLKESGPGLVKPSQSLSLTCTVTGYSITSDYGWNWIRQFPGNKLEWMGYISYSGGTSYNPSLKSRISITRDTSKNQFFLQLNSVTTEDTATYFCARDPGEYYYAMDYWGQGTSVTVSPAKTTPPSVTSGGGGKGGGG

實施例5：單鏈抗體的表達與純化(以HGF為例，其余抗體步驟相同)

1)將重組的融合蛋白表達載體Payz-HGF V_H-V_L轉(zhuǎn)化大腸桿菌16C9，將測序正確的單菌落接種于15ml含氨芐青霉素100μg/ml的2×YT培養(yǎng)基中，在恒溫搖瓶箱中37℃，200rpm，震蕩培養(yǎng)過夜。將培養(yǎng)好的小量菌液移入1000ml含氨芐青霉素100μg/ml的2×YT培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)，在4℃，8000rpm，離心10min,，收集菌體。

2)將收集到的菌體在室溫與-20℃間反復(fù)凍融幾次，增加細菌壁的通透性，便于裂解；按照培養(yǎng)基：裂解液體積比為40:1的比例，向化凍后的菌體內(nèi)加入50ml細菌周質(zhì)腔裂解液，輕輕震蕩混勻后，置于4℃輕搖1h；4℃，12000rpm離心10min，取上清；

3)將含有目的蛋白的上清液放入預(yù)先處理過(經(jīng)EDTA和碳酸氫鈉混合煮沸5min取出，EDTA再煮沸5min)的透析袋內(nèi)，用1×PBS透析24h，前4h內(nèi)每2h換一次透析液，后20h內(nèi)逐漸延長更換透析液間隔直至過夜；

4)透析過的周質(zhì)腔蛋白液經(jīng)0.22μm的濾膜過濾后，HitrapFF親和層析柱純化。洗脫并濃縮蛋白后分裝后保存于-20℃，即為HGF單鏈抗體。

5)SDS-PAGE凝膠電泳檢測純化后的單鏈抗體。

實施例6：ELISA法驗證所制備的單克隆抗體(以HGF為例，其余抗體步驟相同)

1)酶標板包被HGF單克隆抗體，4℃過夜；

2)PBS清洗一遍后，0.2％BSA室溫封閉1h；

3)將30例HCC患者血清和30例正常人血清分別1:2稀釋后加入酶標板微孔中，PBS為空白對，37℃孵育2h；

4)加入生物素標記的HGF抗體1:500稀釋，37℃孵育1h；

4)PBS清洗三遍后，加入親和素-辣根過氧化物酶(Advin-HRP)，37℃孵育1h；

5)PBS清洗五遍后，OPD顯色5-10min；

6)終止液終止，492nm波長下檢測吸光度。

實施例7：Western Blotting法驗證所制備的單克隆抗體

1)將培養(yǎng)好的肝癌細胞HepG2(ATCC HB-8065)、Hep3b(ATCC HB-8064)、SMMC-7721(可商購自上海復(fù)祥生物科技有限公司)、HL-7702(可商購自通派(上海)生物科技有限公司)等使用SDS裂解液提取蛋白，使用BCA法測定蛋白濃度后上樣或-80℃保存。

2)配置10％的SDS-PAGE分離膠和5％的濃縮膠。

3)取30-50μg蛋白上樣，上樣前在蛋白中加入5×loading buffer，95℃變性5min；選擇合適分子量的蛋白marker作為標尺。

4)電泳：開始時恒壓60V，待條帶進入分離膠后，將電壓調(diào)至120V，電泳至溴酚藍跑到膠的底部即可停止，進行考馬斯亮藍染色或者轉(zhuǎn)膜。

5)考馬斯亮藍染色：用至少5倍體積的考馬斯亮藍染色液浸泡凝膠，在搖床上孵育3-4h，吸走染色液后用脫色液脫至目的條帶清晰，將凝膠掃描。

6)如不染色則進行轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜夾中放置海綿、濾紙、PVDF膜和膠(正極方向先是一層海綿墊—再放三層濾紙—將PVDF膜放在濾紙上—膠—三層濾紙—海綿墊—負極)，裝到轉(zhuǎn)膜儀中，250mA恒流，根據(jù)目的蛋白分子量的大小轉(zhuǎn)膜1-3h。

7)轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將PVDF膜用TBST清洗一遍，用5％脫脂奶粉或BSA室溫孵育1h封閉抗原。

8)加入一抗：用脫脂奶粉將抗體稀釋到合適的濃度，his-tag(1:1000)，單克隆培養(yǎng)上清液或腹水(1:1000-1:5000)加在膜上，4℃孵育過夜，TBST 清洗三次，每次10min。

9)室溫孵育二抗1h，二抗用1％脫脂奶粉或者1％的BSA稀釋到合適濃度(1:5000-1:10000)，TBST清洗三次，每次10min。

10)化學(xué)發(fā)光法(ECL)顯色，暗室曝光。

實施例8：免疫組織化學(xué)法驗證所制備的單克隆抗體

1)肝癌組織石蠟切片脫蠟：干烤65℃過夜——二甲苯I 20min——二甲苯II 20min——無水乙醇I 5～10min——無水乙醇II 5～10min——95％乙醇2min——85％乙醇2min——75％乙醇2min——60％乙醇2min——蒸餾水清洗。

2)抗原熱修復(fù)：切片中加入400ml PBS+8ml抗原修復(fù)液，使用高壓鍋140℃，維持2min，室溫自然冷卻。

3)滅活內(nèi)源性過氧化物酶：片子甩、擦干，3％H₂O₂常溫避光作用10min(在濕盤中操作，每張片子50～60μl的液量)。

4)孵育一抗(單克隆抗體)：PBS清洗3次×2min；用3％BSA將單克隆抗體稀釋至適合濃度(1:500～1:2000)加到切片上，一抗室溫半小時孵育后，4℃過夜。

5)孵育二抗：從4℃拿出的切片首先在室溫孵育半小時，PBS清洗3次×2min；用3％BSA將二抗稀釋至適合濃度(1:500)加到切片上，37℃孵育箱30～40min。

6)DAB顯色。

7)復(fù)染：①蘇木素3～5min，自來水沖洗；②鹽酸酒精約30秒，自來水沖洗，紫—深紅—淺紅(觀察顏色)；③0.5％氨水1～2min，自來水沖洗。鏡下觀察細胞染色，染色深則分化時間(鹽酸酒精)稍長些即可；染色淺則再置于蘇木素中染色即可。

8)脫水：70％乙醇3min——85％乙醇3min——95％乙醇3min——無水乙醇I 5～10min——無水乙醇II 5～10min——二甲苯I 1小時——二甲苯II 1小時(時間不定)。

9)用中性樹脂封片，保存，照相。

實施例9：免疫熒光法驗證所制備的單克隆抗體

1)實驗前一天將含2-3×10⁴細胞(HepG2)的單細胞懸液鋪種在放有蓋玻片的十二孔盤中一個孔中(要保證有單個細胞)。每個條件做兩個附孔，待細胞貼壁12～24h后，用于實驗分析。

2)用PBS洗滌細胞3次，1ml/孔4％的PFA于室溫固定10min。吸出PFA，用PBS洗3次，加入1ml的50mM氯化銨于室溫孵育10min，吸取氯化銨，PBS洗3次。

3)加入1ml的0.2％Triton X-100，10min；吸出Triton，PBS洗3次；

4)加入1ml 3％的BSA封閉，室溫1h，可在搖床上晃動；吸出BSA，用PBS洗10min。

5)加一抗(單克隆抗體)，稀釋比例為1：200-1：500，將抗體(雙染各加20μl，單染加40μl)到保鮮膜或封口膜上，將蓋玻片從十二孔盤中取出，吸干多余的水分，有細胞的一面接觸抗體，室溫>1h或4℃過夜。

6)將玻片重新放回到十二孔盤中，有細胞的一面朝上，用PBS洗3次，10min/次；加二抗，稀釋比例一般為1：400，避光室溫反應(yīng)1h。

7)將玻片重新放回到十二孔盤中，有細胞的一面朝上，PBS洗3次，10min/次。加DAPI染細胞核，一般稀釋比例為1：1000，每個蓋玻片20μl，避光于室溫反應(yīng)10min。

8)將玻片重新放回到十二孔盤中，有細胞的一面朝上，PBS洗2次，10min/次。把封片劑(mowoil)滴在載玻片上，每片15μl，將有細胞的面朝下，勿有氣泡。等封片劑干后室溫約30min后放在4℃，避光保存。

9)熒光顯微鏡下觀察染色結(jié)果。

如從附圖中可以看出，本發(fā)明所制備的HGF單克隆抗體能很好應(yīng)用于ELISA和Western Blotting對HGF的檢測；所制備的AFP單克隆抗體能很好應(yīng)用于ELISA、Western Blotting和IHC對AFP的檢測；所制備的AFU單克隆抗體能夠很好地應(yīng)用于ELISA和Western Blotting對AFU的檢測；所制備的GGTⅡ單克隆抗體能很好應(yīng)用于ELISA、Western Blotting和IF對GGTⅡ的檢測；所制備的GPC3單克隆抗體能很好地應(yīng)用于ELISA、Western Blotting和IF對GPC3的檢測。

實施例10.本發(fā)明抗體或其組合診斷肝癌的應(yīng)用

在天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院，分別收集肝癌患者、乙肝患者及正常者外周血各60-300例。在實驗中收集了肝癌患者血清288例，乙肝患者血清87例，肝硬化患者80例，正常者血清241例。

外周血收集1小時內(nèi)，3000g離心5-10分鐘，取血清移入新的離心管，-80℃冰箱保存。

通過使用上述實施例中制備的單克隆抗體或單鏈抗體，通過ELISA檢測待測血清中AFP、AFU、GPC3、GGT2和HGF的濃度。

1)診斷試驗評價指標及選擇

采用靈敏度(真陽性率，Sensitivity)、特異度(真陰性率，Specificity)、陽性預(yù)測值(PPV)、陰性預(yù)測值(NPV)評價待測指標的診斷效果：

靈敏度＝TP/(TP+FN)×100％

特異度＝TN/(TN+FP)×100％

陽性預(yù)測值＝TP/(TP+FP)×100％

陰性預(yù)測值＝TN/(TN+FN)×100％

正確指數(shù)(Youden index)＝(靈敏度+特異度)-100％

其中，TN(true negative)＝真陰性；FP(false positive)＝假陽性；TP(true positive)＝真陽性；FN(false negative)＝假陰性。

選用受試者工作曲線(receiver operating characteristic curve，ROC)對所有可能的切點作計算顯示靈敏度和特異度之間相互關(guān)系。通過改變切點，獲得多對真陽性率(即靈敏度)與假陽性率(1-特異度)值，以假陽性率為橫坐標，以靈敏度為縱坐標，繪制ROC曲線，從而動態(tài)、客觀地反映診斷系統(tǒng)的效能。ROC曲線下面積(AUC)表示診斷系統(tǒng)中陽性和陰性診斷結(jié)果分布的重疊程度，反映診斷系統(tǒng)區(qū)分陽性和陰性診斷結(jié)果的能力大小，也就是診斷試驗的價值大小。通過找到ROC曲線上正確指數(shù)最大點確定診斷指標臨界值，并通過Bootstrap方法隨機抽樣1000次，確定臨界值95％可信區(qū)間。

2)統(tǒng)計模型的構(gòu)建

通過logistic回歸模型實現(xiàn)單指標、多指標聯(lián)合診斷試驗HCC，并分別應(yīng)用于健康正常人、HBV感染者、肝硬化患者，在三組和病人群中進 行ROC分析。根據(jù)疾病狀態(tài)建立logistic回歸模型，通過形成的預(yù)測概率或聯(lián)合預(yù)測因子為分析指標，并結(jié)合非參數(shù)模型和雙正態(tài)模型建立ROC曲線。

Logistic回歸模型：

且有

常數(shù)項β₀表示暴露劑量為0時個體發(fā)病(HCC)與不發(fā)病(HBV感染者、肝硬化患者、健康人，或三者之和)概率之比的自然對數(shù)?；貧w系數(shù)β₀，β₁，…β_n表示自變量xi改變一個單位時的改變量。對于研究變量(5個蛋白)在某個連續(xù)的截斷點P_k有：βY≥g(P_k)，Y_ik＝1；βY|g(P_k)，Y_ik＝0。而同于多指標結(jié)合的診斷試驗，其圖形為一個平面從而獲得靈敏度和特異度構(gòu)建ROC曲線。

分析和統(tǒng)計結(jié)果參見附圖。

結(jié)果和討論：

早期肝癌檢出率低的現(xiàn)狀反映出目前肝癌的診斷方法還有很大局限性。當(dāng)前肝癌的診斷主要依靠血清學(xué)檢查和影像學(xué)診斷。血清學(xué)檢查主要檢測血清中的腫瘤標志物，目前主要是依靠AFP的檢測，但AFP在小肝癌中的敏感度僅為40％左右。

利用本發(fā)明制備的特異性結(jié)合于人肝癌標志物的抗體或其單鏈抗體片段，在AFP、AFU、HGF、GPC3和GGT2五個標志物中，進行HGF單指標檢測，以及HGF聯(lián)合其它標志物進行雙指標、三指標、四指標及五指標檢測時，能夠與乙肝患者、肝硬化患者和健康者區(qū)別開來而檢測肝癌。

在全部人群(肝癌、乙肝、肝硬化和正常人)中篩查肝癌，在乙肝患者中篩查肝癌，以及在肝硬化患者中篩查肝癌時，HGF單指標檢測全期肝癌和早期肝癌均有很高的敏感度和特異性。通過利用本發(fā)明制備的特異性結(jié)合于HGF的單鏈抗體，利用所述的肝癌血清學(xué)檢測方法，使用HGF單指標在全部人群(肝癌、乙肝、肝硬化和正常人)中篩查肝癌，其檢測全期肝癌的敏感度為90.3％，特異性為90.5％，在巴塞羅那分期的早期(A 期)肝癌患者中，檢測的敏感度為90.2％，特異性為84.1％，納入受試者的年齡和性別后，HGF在全期肝癌中的敏感度為91.3％，特異性為90.9％，在早期肝癌中的敏感度為86.3％，特異性為90.5％；在乙肝患者中篩查肝癌，HGF單指標檢測全期肝癌的敏感度為94.4％，特異性為91.8％，檢測早期肝癌的敏感度為90.2％，特異性為91.9％，納入受試者年齡性別后，檢測全期肝癌的敏感度為90.8％，特異性為95.2％，檢測早期肝癌的敏感度為92.2％，特異性為90.2％；在肝硬化患者中篩查肝癌，HGF單指標檢測全期肝癌和早期肝癌的敏感度和特異性均可達72％和73％以上，顯著優(yōu)于臨床常用的AFP，說明單獨檢測血清中HGF的含量，必要時并綜合受試者年齡和性別可以滿足臨床肝癌診斷的需要。

檢測兩個指標在全部人群篩查肝癌，在乙肝患者中篩查肝癌，以及在肝硬化患者中篩查肝癌時，HGF與AFP、AFU、GPC3、GGT2四個標志物之一分別聯(lián)用，檢測全期肝癌和早期肝癌均可達到很高的敏感度和特異性，對于原發(fā)性肝癌患者的診斷具有顯著意義，特別是HGF與AFP的聯(lián)合為肝癌患者血清學(xué)診斷及早期診斷的最佳組合。

特別地，檢測兩個指標在全部人群篩查肝癌時，只納入受試者性別進行統(tǒng)計后，HGF與AFP聯(lián)用檢測全期肝癌的敏感度為90.8％，特異性為93.1％，HGF與AFU聯(lián)用檢測全期肝癌的敏感度為87.2％，特異性為94.6％，HGF與GPC3聯(lián)用檢測全期肝癌的敏感度為91.8％，特異性為90.6％，HGF與GGT2聯(lián)用檢測全期肝癌的敏感度為89.3％，特異性為93.1％；只納入受試者年齡后，HGF與AFP聯(lián)用檢測全期肝癌的敏感度為92.3％，特異性為90.9％，HGF與AFU聯(lián)用檢測全期肝癌的敏感度為90.8％，特異性為91.6％，HGF與GPC3聯(lián)用檢測全期肝癌的敏感度為90.3％，特異性為90.9％，HGF與GGT2聯(lián)用檢測全期肝癌的敏感度為89.3％，特異性為92.3％。在檢測早期肝癌時，將HGF與AFP，HGF與AFU，HGF與GPC3，HGF與GGT2分別聯(lián)用，納入年齡或性別之一后，均可達到86％以上的敏感度和和84％以上的特異性。

而在乙肝患者中篩查肝癌時，只納入受試者性別進行統(tǒng)計后，HGF與AFP聯(lián)用檢測全期肝癌敏感度為92.9％，特異性為95.2％，HGF與AFU聯(lián)用檢測全期肝癌敏感度為93.4％，特異性為93.5％，HGF與GPC3聯(lián)用 檢測全期肝癌敏感度為93.4％，特異性為93.5％，HGF與GGT2聯(lián)用檢測全期肝癌敏感度為92.3％，特異性為93.5％。；只納入受試者年齡進行統(tǒng)計后，HGF與AFP聯(lián)用檢測全期肝癌敏感度為92.3％，特異性為93.5％，HGF與AFU聯(lián)用檢測全期肝癌敏感度為93.9％，特異性為93.4％，HGF與GPC3聯(lián)用檢測全期肝癌敏感度為93.9％，特異性為93.4％，HGF與GGT2聯(lián)用檢測全期肝癌敏感度為93.4％，特異性為95.1％。在檢測早期肝癌時，將HGF與AFP，HGF與AFU，HGF與GPC3，HGF與GGT2分別聯(lián)用，納入年齡或性別之一后，均可達到86.3％以上的敏感度和和83.9％以上的特異性。在肝硬化患者中篩查肝癌時，納入年齡或性別之一后，HGF與其他四個標志物分別聯(lián)用，檢測全期肝癌和早期肝癌均可達到較高的敏感度和特異性。說明HGF與其他四個指標單獨聯(lián)合檢測，并綜合受試者年齡或性別后，對于原發(fā)性肝癌患者的診斷具有顯著意義，特別是HGF與AFP的聯(lián)合為肝癌患者血清學(xué)診斷及早期診斷的最佳組合。

檢測三個指標在全部人群中篩查肝癌，檢測全期肝癌時，HGF+AFP+AFU聯(lián)用，HGF+AFP+GPC3聯(lián)用，HGF+AFP+GGT2聯(lián)用，HGF+AFU+GPC3聯(lián)用時，均可達到91.8％以上的敏感度和90.2％以上的特異性，檢測早期肝癌時，HGF+AFP+AFU聯(lián)用，HGF+AFP+GPC3聯(lián)用，以及HGF+AFP+GGT2聯(lián)用時，均可達86.3％以上的敏感度和85.5％以上的特異性，在乙肝患者中篩查肝癌時，HGF+AFP+AFU，HGF+AFP+GPC3，HGF+AFP+GGT2，HGF+AFU+GPC3以及HGF+GPC3+GGT2聯(lián)合應(yīng)用，檢測全期肝癌的敏感度均可達92.3％以上，特異性可達93.5％以上，檢測早期肝癌也有較好效果，特別是HGF+AFP+AFU的組合，敏感度達90.2％，特異性達98.4％；在肝硬化患者中篩查肝癌時，HGF與另兩種標志物聯(lián)用，也可達到較滿意的效果，說明HGF與另外兩種標志物聯(lián)合檢測，可以滿足臨床肝癌血清學(xué)診斷及早期診斷的需求。

檢測四個指標篩查肝癌時，敏感度和特異性均有提高，在全部人群中篩查肝癌時，HGF、AFP、GPC3和GGT2的組合檢測全期肝癌的敏感度為91.3％，特異性為92.0％，檢測早期肝癌的敏感度為86.3％，特異性為90.5％，在乙患者中篩查肝癌時，HGF、AFP、AFU和GGT2的組合檢測全期肝癌的敏感度為91.8％，特異性為98.4％，檢測早期肝癌的敏感度為 92.2％，特異性為98.4％，在肝硬化患者中篩查肝癌時，HGF與另外三種指標聯(lián)用時，均可達到較高的敏感度和特異性。

五種標志物聯(lián)合應(yīng)用，敏感度和特異性進一步提高，在全人群中篩查肝癌時，其檢測全期肝癌的敏感度可達91.2％，特異性可達93％，檢測早期肝癌的敏感度為84.3％，特異性可達87.2％，在乙肝患者中篩查肝癌時，檢測全期肝癌的敏感度為91.8％，特異性為98.4％，檢測早期肝癌的敏感度為92.2％，特異性為98.4％，在肝硬化患者中篩查肝癌時，檢測全期肝癌的敏感度為91.3％，特異性為76.2％，檢測早期肝癌的敏感度為92.2％，特異性為66.7％。顯著優(yōu)于目前臨床肝癌檢測的金標準AFP。

為了驗證檢測結(jié)果的準確性，本發(fā)明將五種標志物在肝癌病人血清，正常人血清和乙肝病人血清中的檢測值建立了模型，將全部研究對象的危險系數(shù)(RS)從小到大排列，分割為高危組(RS≥0.5)和低危組(RS<0.5)，大部分肝癌患者被正確分到高危組，散點圖趨勢明顯，說明模型結(jié)果符合事實情況。該模型可以用于分析AFP、AFU、HGF、GPC3、GGT2五種標志物檢測值與肝癌的相關(guān)性。

本發(fā)明通過大量樣本驗證和統(tǒng)計學(xué)分析，通過利用本發(fā)明制備的單克隆抗體或其單鏈抗體片段，證明HGF可以作為肝癌標志物單獨用于肝癌的篩查和早期診斷，其檢測靈敏度和特異性均大幅優(yōu)于臨床的金標準AFP，HGF與其它一個或多個指標的聯(lián)合使用，可作為HGF檢測的補充，進一步提高肝癌血清學(xué)診斷的靈敏度和特異性。

雖然為了清楚的理解，已經(jīng)借助于附圖和實施例在一些細節(jié)上描述了上述發(fā)明，但是說明書和實施例不應(yīng)當(dāng)被視為限制本發(fā)明的范圍。本文中引用的所有專利和科學(xué)文獻的公開內(nèi)容通過引用完整地清楚并入。