番茄黃化曲葉病抗病基因ty-5的分子標(biāo)記引物及其應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及分子標(biāo)記技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種番茄黃化曲葉病抗病基因ty-5的分子標(biāo)記引物及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：
番茄(Solanumlycopersicum)是世界上重要的蔬菜作物，在促進(jìn)農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)發(fā)展、農(nóng)民增收方面發(fā)揮著巨大的作用。種植過程中易受到多種病害的影響，導(dǎo)致產(chǎn)量下降，選育抗病品種十分重要。番茄黃化曲葉病(TomatoyellowleafcurldiseaseTYLCD)是番茄的重要病害，該病害是由雙生病毒科(Geminiviridae)菜豆金色花葉病毒屬(Begomovirus)的番茄黃化曲葉病毒(TomatoyellowleafcurlvirusTYLCV)引起，主要通過煙粉虱(Bemisiatabaci)傳播。該病害最早報(bào)道于以色列，隨著國際貿(mào)易往來的深入，TYLCV逐漸向全球范圍擴(kuò)展，20世紀(jì)90年代，該病害傳入我國，目前已經(jīng)遍布我國所有的番茄主產(chǎn)區(qū)，對番茄生產(chǎn)造成嚴(yán)重危害，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。TYLCV危害番茄后，通過農(nóng)業(yè)防治、化學(xué)防治不僅效果差，甚至還會(huì)對生態(tài)環(huán)境造成破壞，選育和種植抗病品種是最經(jīng)濟(jì)、有效、環(huán)保的防治方法。由于TYLCV自身的變異，使得只含有Ty-1和Ty-2的番茄材料在一些區(qū)域喪失了抗性，而目前國內(nèi)市場的番茄品種中均不含有ty-5基因，為了加快ty-5基因分子標(biāo)記輔助育種(marker-assistedselection，MAS)的進(jìn)程，開發(fā)與ty-5緊密連鎖的標(biāo)記，選育含有ty-5基因的材料具有重要的意義。目前在ty-5連鎖標(biāo)記研究方面，只確定1個(gè)CAPS標(biāo)記SlNAC1連鎖，連鎖距離尚不明確；(參見HuttonSF，ScottJW，SchusterDJ.RecessiveResistancetoTomatoyellowleafcurlvirusfromtheTomatoCultivarTykingIsLocatedintheSameRegionasTy-5onChromosome4.Hortscience，2012，47(3)：324-327)，并且該標(biāo)記類型在進(jìn)行檢測時(shí)，需要對PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切，實(shí)驗(yàn)成本高，操作繁瑣。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種番茄黃化曲葉病抗病基因ty-5的分子標(biāo)記引物，用于篩選與TYLCV抗性基因ty-5緊密連鎖的分子標(biāo)記。為解決上述問題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案如下：番茄黃化曲葉病抗病基因ty-5的分子標(biāo)記引物，該分子標(biāo)記引物包括上游引物從5’端到3’端為：TAACAAAGCCCTCAAAGC；下游引物5’端到3’端為：GTCTCCGAAACGTAATCC。本發(fā)明另一個(gè)目的在于提供了一種番茄黃化曲葉病抗病基因ty-5的分子標(biāo)記，解決常規(guī)育種中，抗性鑒定工作量大、周期長、成本高的問題；番茄黃化曲葉病抗病基因ty-5的分子標(biāo)記為InDel標(biāo)記類型，是利用上述茄黃化曲葉病抗病基因ty-5的分子標(biāo)記引物，經(jīng)過PCR擴(kuò)增得到的與ty-5緊密連鎖的共顯性DNA分子標(biāo)記，該分子標(biāo)記的核苷酸序列為SEQIDNo.3或SEQIDNo.4所示。本發(fā)明的第三個(gè)目的在于提供一種番茄黃化曲葉病抗病基因ty-5的分子標(biāo)記分子標(biāo)記方法，克服ty-5標(biāo)記需要酶切的缺陷，應(yīng)用分子生物學(xué)方法，以含有ty-5基因番茄自交系A(chǔ)VTO1227為材料，篩選與TYLCV抗性基因ty-5緊密連鎖的分子標(biāo)記。番茄黃化曲葉病抗病基因ty-5的分子標(biāo)記方法，包括以下步驟：1)提取番茄基因組DNA；2)以上述番茄基因組DNA為模板與上述番茄黃化曲葉病抗病基因ty-5的分子標(biāo)記引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對PCR反應(yīng)的產(chǎn)物進(jìn)行分離、鑒定、顯色后，檢測判斷番茄黃化曲葉病抗病基因ty-5。進(jìn)一步的，上述分子標(biāo)記方法所述的步驟2)中，PCR反應(yīng)體系為：10ng/μL模板DNA1μL；4pmmol/L分子標(biāo)記引物1.0μL；10×PCRBuffer1.0μL；25mmol/LMgCl21.0μL；10mmol/LdNTPs0.25μL；5U/μLrTaqDNAPolymerase0.1μL；ddH2O5.65μL；PCR反應(yīng)擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5min；每個(gè)循環(huán)94℃變性30s，48℃退火30s，72℃延伸30，共38個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸7min。本發(fā)明的第四個(gè)目的在于提供番茄黃化曲葉病抗病基因ty-5的分子標(biāo)記引物在番茄黃化曲葉病毒病抗性基因ty-5的檢測中和在ty-5基因的分子標(biāo)記輔助育種中應(yīng)用。番茄黃化曲葉病毒病抗性基因ty-5檢測方法：以番茄基因組DNA為模板與上述番茄黃化曲葉病抗病基因ty-5的分子標(biāo)記引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，對電泳后條帶進(jìn)行記錄，根據(jù)條帶大小確定是否含有ty-5基因；其中PCR反應(yīng)體系為：反應(yīng)體系共10μL，10ng/μL模板DNA1.0μL；4pmmol/L分子標(biāo)記引物1.0μL、10×PCRBuffer1.0μL、25mmol/LMgCl21.0μL、10mmo1/LdNTPs0.25μL、5U/μLrTaqDNAPolymerase0.1μL、ddH2O5.65μL；PCR反應(yīng)擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5min；每個(gè)循環(huán)94℃變性30s，48℃退火30s，72℃延伸30，共38個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸7min。相比現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果在于：1.本發(fā)明所述的分子標(biāo)記引物能TYLCV抗性基因ty-5緊密連鎖，可以用TYLCV抗性基因ty-5的篩選和檢測；2.本發(fā)明所述的分子標(biāo)記是一種InDel標(biāo)記，利用一種廣泛分布在作物基因組上，根據(jù)堿基序列插入或缺失設(shè)計(jì)的標(biāo)記，為共顯性標(biāo)記，其在基因組上的分布廣泛，與CAPS標(biāo)記相比，不需要經(jīng)過酶切就可以進(jìn)行多態(tài)性的分析，操作方便、簡潔，實(shí)驗(yàn)成本小；3.本發(fā)明通過開發(fā)與ty-5連鎖的InDel標(biāo)記，在分離群體中篩選與ty-5緊密連鎖的標(biāo)記，以實(shí)現(xiàn)TYLCV分子標(biāo)記輔助育種，加速對含有ty-5基因的番茄品種選育進(jìn)程；4.本發(fā)明的分子標(biāo)記可以與其他的連鎖標(biāo)記結(jié)合，確定ty-5在染色體上的位置，為該基因的精細(xì)定位和此后對該基因的克隆奠定了基礎(chǔ)；5.本發(fā)明的分子標(biāo)記應(yīng)用于對ty-5基因抗性材料的選育，可降低生產(chǎn)過程中化學(xué)農(nóng)藥的施用，減輕病害的傳播流行，節(jié)約生產(chǎn)成本，保障番茄生產(chǎn)的順利開展，提高番茄產(chǎn)業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益。附圖說明下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明；圖1InDel標(biāo)記ty5-17在親本和極抗、極感單株的擴(kuò)增圖譜；其中M：100bpMarker；P1：抗病親本AVTO1227；P2：感病親本moneymaker；1-5：F2極抗病單株；6-10：F2極感病單株；圖2InDel標(biāo)記ty5-17在親本和任意37株F2單株的擴(kuò)增圖譜；其中M：100bpmarker；P1：抗病親本AVTO1227；P2：感病親本moneymaker；F2單株；由moneymaker×AVTO1227的F1自交獲得的任意37株F2單株；圖3InDel標(biāo)記ty5-17在不同番茄材料及品種組合中的擴(kuò)增圖譜；其中，M：100bpmarker；P1：抗病親本AVTO1227；P2：感病親本moneymaker；1：1106-7-0；2∶9210；3∶9320；4：FJ-1；5：CLN2026D；6：CLN2777A；7：金陵美玉；8：金陵寶玉9：蘇粉11號(hào)；10：蘇粉14號(hào)；11：moneymaker×AVTO1227。具體實(shí)施方式番茄黃化曲葉病抗病基因ty-5的分子標(biāo)記引物，該分子標(biāo)記引物包括上游引物從5’端到3’端為：TAACAAAGCCCTCAAAGC(SEQIDNo.1)；下游引物5’端到3’端為：GTCTCCGAAACGTAATCC(SEQIDNo.2)。具體的，番茄黃化曲葉病抗病基因ty-5的分子標(biāo)記引物為InDel標(biāo)記類型，能與ty-5基因緊密連鎖。本發(fā)明另一個(gè)目的在于提供了一種番茄黃化曲葉病抗病基因ty-5的分子標(biāo)記，解決常規(guī)育種中，抗性鑒定工作量大、周期長、成本高的問題；番茄黃化曲葉病抗病基因ty-5的分子標(biāo)記為InDel標(biāo)記類型，是利用上述茄黃化曲葉病抗病基因ty-5的分子標(biāo)記引物，經(jīng)過PCR擴(kuò)增得到的與ty-5緊密連鎖的共顯性DNA分子標(biāo)記，該分子標(biāo)記的核苷酸序列為SEQIDNo.3或SEQIDNo.4所示。本發(fā)明的第三個(gè)目的在于提供一種番茄黃化曲葉病抗病基因ty-5的分子標(biāo)記分子標(biāo)記方法，克服ty-5標(biāo)記需要酶切的缺陷，應(yīng)用分子生物學(xué)方法，以含有ty-5基因番茄自交系A(chǔ)VTO1227為材料，篩選與TYLCV抗性基因ty-5緊密連鎖的分子標(biāo)記。番茄黃化曲葉病抗病基因ty-5的分子標(biāo)記方法，包括以下步驟：1)提取番茄基因組DNA；2)以上述番茄基因組DNA為模板與上述番茄黃化曲葉病抗病基因ty-5的分子標(biāo)記引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對PCR反應(yīng)的產(chǎn)物進(jìn)行分離、鑒定、顯色后，檢測判斷番茄黃化曲葉病抗病基因ty-5。進(jìn)一步的，上述分子標(biāo)記方法所述的步驟2)中，PCR反應(yīng)體系為：10ng/μL模板DNA1μL；4pmmol/L分子標(biāo)記引物1.0μL；10×PCRBuffer1.0μL；25mmol/LMgCl21.0μL；10mmol/LdNTPs0.25μL；5U/μLrTaqDNAPolymerase0.1μL；ddH2O5.65μL；PCR反應(yīng)擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5min；每個(gè)循環(huán)94℃變性30s，48℃退火30s，72℃延伸30，共38個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸7min。本發(fā)明的第四個(gè)目的在于提供番茄黃化曲葉病抗病基因ty-5的分子標(biāo)記引物在番茄黃化曲葉病毒病抗性基因ty-5的檢測中和在ty-5基因的分子標(biāo)記輔助育種中應(yīng)用。番茄黃化曲葉病毒病抗性基因ty-5檢測方法：以番茄基因組DNA為模板與上述番茄黃化曲葉病抗病基因ty-5的分子標(biāo)記引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，對電泳后條帶進(jìn)行記錄，根據(jù)條帶大小確定是否含有ty-5基因；其中PCR反應(yīng)體系為：反應(yīng)體系共10μL，10ng/μL模板DNA1.0μL；4pmmol/L分子標(biāo)記引物1.0μL、10×PCRBuffer1.0μL、25mmol/LMgCl21.0μL、10mmol/LdNTPs0.25μL、5U/μLrTaqDNAPolymerase0.1μL、ddH2O5.65μL；PCR反應(yīng)擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5min；每個(gè)循環(huán)94℃變性30s，48℃退火30s，72℃延伸30，共38個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸7min。以下是本發(fā)明具體的實(shí)施例，在下述實(shí)施例中除了給出說明的原料或試劑的來源外，其他材料及試劑均為現(xiàn)有的材料和試劑，可以通過購買方式獲得；在下述實(shí)施例中本發(fā)明所述的番茄黃化曲葉病抗病基因ty-5的分子標(biāo)記引物簡稱為ty5-17。實(shí)施例1番茄黃化曲葉病抗病基因ty-5的分子標(biāo)記，為InDel標(biāo)記類型，是利用下述番茄黃化曲葉病抗病基因ty-5的分子標(biāo)記引物：上游引物從5’端到3’端為：TAACAAAGCCCTCAAAGC下游引物5’端到3’端為：GTCTCCGAAACGTAATCC；經(jīng)過PCR擴(kuò)增得到的與ty-5緊密連鎖的共顯性DNA分子標(biāo)記；PCR反應(yīng)體系為：反應(yīng)體系共10μL，10ng/μL模板DNA1.0μL；4pmmol/L分子標(biāo)記引物1.0μL、10×PCRBuffer1.0μL、25mmol/LMgCl21.0μL、10mmol/LdNTPs0.25μL、5U/μLrTaqDNAPolymerase0.1μL、ddH2O5.65μL；PCR反應(yīng)擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5min；每個(gè)循環(huán)94℃變性30s，48℃退火30s，72℃延伸30，共38個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸7min；該分子標(biāo)記的核苷酸序列為SEQIDNo.3。實(shí)施例2番茄黃化曲葉病抗病基因ty-5的分子標(biāo)記，為InDel標(biāo)記類型，是利用上述番茄黃化曲葉病抗病基因ty-5的分子標(biāo)記引物：上游引物從5’端到3’端為：TAACAAAGCCCTCAAAGC下游引物5’端到3’端為：GTCTCCGAAACGTAATCC；經(jīng)過PCR擴(kuò)增得到的與ty-5緊密連鎖的共顯性DNA分子標(biāo)記；PCR反應(yīng)體系為：反應(yīng)體系共10μL，10ng/μL模板DNA1.0μL；4pmmol/L分子標(biāo)記引物1.0μL、10×PCRBuffer1.0μL、25mmol/LMgCl21.0μL、10mmol/LdNTPs0.25μL、5U/μLrTaqDNAPolymerase0.1μL、ddH2O5.65μL；PCR反應(yīng)擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5min；每個(gè)循環(huán)94℃變性30s，48℃退火30s，72℃延伸30，共38個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸7min；該分子標(biāo)記的核苷酸序列為SEQIDNo.4所示。應(yīng)用實(shí)施例1采用本發(fā)明所述的番茄黃化曲葉病抗病基因ty-5的分子標(biāo)記引物鑒定不同品種的番茄是否含有ty-5基因：1.供試材料父本(P1)：抗番茄黃化曲葉病材料AVTO1227(王銀磊，楊瑪麗，趙麗萍，etal.含Ty-5基因番茄材料的引進(jìn)、評(píng)價(jià)及利用.西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2014，(05)：2090-2094)；母本(P2)：感番茄黃化曲葉病材料moneymaker；群體：moneymaker×AVTO1227雜交制備F1，F(xiàn)1單株自交獲得F1代分離群體；具體的材料及品種組合見詳見表1。2.鑒定步驟如下：1)抗病性鑒定：對4葉1心的幼苗進(jìn)行攜帶TYLCVD煙粉虱的人工接種，接種一周后噴施殺蟲劑，之后將接種后的番茄幼苗定植于大棚；定植4周后調(diào)查植株發(fā)病情況，按照發(fā)病嚴(yán)重程度分為0-4級(jí)：0級(jí)，無任何感病癥狀；1級(jí)，頂端葉邊緣微微變黃化；2級(jí)，頂端小葉稍微變黃并發(fā)生很小的卷曲；3級(jí)，大范圍的葉片變黃，卷曲嚴(yán)重，植株生長量??；4級(jí)，癥狀非常嚴(yán)重，植株矮化，基本停止生長；2)基因組DNA的提取：番茄葉片研磨后立即加入271μL的DNA提取混合液，271μL核裂解液和108μL十二烷基肌氨酸鈉，混勻后置于65℃的培養(yǎng)箱45min；加入600μL的氯仿-異戊醇(24∶1)，輕輕翻轉(zhuǎn)，使兩者混合均勻，放入離心機(jī)中10000rpm離心6min；吸取上清夜，轉(zhuǎn)入新離心管，加入600μL預(yù)冷異丙醇，輕輕搖勻，12000rpm離心10min，棄上清液；加入200μL的70％乙醇，漂洗2次，將試管置于室溫下晾干；加入200μLT1/10E溶液，使DNA溶解，置于-20℃保存；3)InDel分子標(biāo)記引物ty5-17的分析：A.極抗極感單株的選取通過對F2群體進(jìn)行煙粉虱接種，鑒定單株對番茄黃化曲葉病的抗性，根據(jù)發(fā)病的嚴(yán)重程度進(jìn)行分級(jí)；選取無發(fā)病癥狀，病級(jí)記錄為0的5個(gè)任意單株作為極抗病單株；選取植株矮化，生長受到嚴(yán)重抑制，葉片黃化卷曲嚴(yán)重，病級(jí)記錄為4的5個(gè)任意單株作為極感病單株；B.InDel連鎖標(biāo)記的分析在番茄4號(hào)染色體SlNAC1附近選取新的InDEL位點(diǎn)進(jìn)行分析，確定分子標(biāo)記引物ty5-17與ty-5基因具有連鎖關(guān)系，利用ty5-17標(biāo)記引物進(jìn)行標(biāo)記，標(biāo)記方法中PCR反應(yīng)體系為：模板DNA10ng/μL1μL；4pmmol/L子標(biāo)記引物ty5-171.0μL；10×PCRBuffer1.0μL；25mmol/LMgCl21.0μL；10mmol/LdNTPs0.25μL；5U/μLrTaqDNAPolymerase0.1μL；ddH2O5.65μL；PCR反應(yīng)擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5min；每個(gè)循環(huán)94℃變性30s，48℃退火30s，72℃延伸30s，共38個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸7min。PCR產(chǎn)物在6％的非變性聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行分離鑒定，銀染顯色，然后在可見投射儀上觀察、記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果；3)鑒定結(jié)果通過對244株F2單株進(jìn)行抗性鑒定，將病情≤2的記為抗病植株，病情≥3的記為感病植株，抗病植株共計(jì)59株，感病植株共計(jì)185株，符合3∶1的分離比例(χ2＝0.09)，ty-5為單隱性遺傳；分子標(biāo)記引物ty5-17在抗病親本AVTO1227、感病親本moneymaker以及極抗和極感單株間進(jìn)行擴(kuò)增，AVTO1227和所有的極抗單株均只擴(kuò)增出大小為172bp的條帶；moneymaker擴(kuò)增出187bp的條帶；5個(gè)極感單株中4株擴(kuò)增出大小為187bp的條帶，1株擴(kuò)增出172和187大小的雜合帶型，結(jié)果參見圖1，其中M：100bpMarker；P1：抗病親本AVTO1227；P2：感病親本moneymaker；1-5：F2極抗病單株；6-10：F2極感病單株。對兩個(gè)親本擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序分析，證實(shí)15bp的核苷酸片段插入到moneymaker材料，導(dǎo)致多態(tài)性的產(chǎn)生，插入的15個(gè)堿基為5’-ATAAGTACGTATTGG-3’。InDel標(biāo)記ty5-17在抗病親本AVTO1227、感病親本moneymaker以及任意37株F2單株間進(jìn)行擴(kuò)增，鑒定為抗病的單株均只擴(kuò)增出大小為172bp的條帶；鑒定為感病的單株擴(kuò)增出大小為172bp的條帶，或172和187大小的雜合帶型。表型和基因型完全吻合。結(jié)果參見圖2，其中M：100bpmarker；P1：抗病親本AVTO1227；P2：感病親本moneymaker；F2單株；由moneymaker×AVTO1227的F1自交獲得的任意37株F2單株。InDel分子標(biāo)記引物ty5-17進(jìn)一步應(yīng)用于對番茄材料和品種組合的鑒定。從圖3可見，其中，M：100bpmarker；P1：抗病親本AVTO1227；P2：感病親本moneymaker；1∶1106-7-0；2∶9210；3∶9320；4：FJ-1；5：CLN2026D；6：CLN2777A；7：金陵美玉；8：金陵寶玉9：蘇粉11號(hào)；10：蘇粉14號(hào)；11：moneymaker×AVTO1227。所有不合有ty-5基因的番茄材料或品種，均只擴(kuò)增到單一的187bp大小的條帶；AVTO1227與moneymaker的F1雜交種擴(kuò)增出172和187大小的雜合帶型。由此說明，分子標(biāo)記引物ty5-17可以應(yīng)用于ty-5基因的分子標(biāo)記輔助育種中。不同品種的番茄是否含有ty-5基因檢測結(jié)果見表1。表1：番茄材料及品種組合材料名稱抗病基因型AVTO1227ty-5/ty-5moneymaker無1106-7-0Ty-3/Ty-39210無9320無FJ-1無CLN2026Dty-2/ty-2CLN2777ATy-2/Ty-2金陵美玉無金陵寶玉無蘇粉11號(hào)Ty-3/ty-3蘇粉14號(hào)Ty-3/ty-3moneymaker×AVTO1227Ty-5/ty-5上述實(shí)施方式僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，不能以此來限定本發(fā)明保護(hù)的范圍，本領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明的基礎(chǔ)上所做的任何非實(shí)質(zhì)性的變化及替換均屬于本發(fā)明所要求保護(hù)的范圍。