本發(fā)明涉及一種比酶活和穩(wěn)定性提高的融合型腈水合酶，屬于基因工程領(lǐng)域。

背景技術(shù)：
腈水合酶(Nitrilehydratase，簡(jiǎn)稱(chēng)NHase，EC4.2.1.84)，是一類(lèi)可以催化腈類(lèi)物質(zhì)通過(guò)水合作用反應(yīng)轉(zhuǎn)化為高附加值的酰胺類(lèi)化合物的金屬酶。腈水合酶的結(jié)構(gòu)編碼基因包括一個(gè)α亞基、一個(gè)β亞基和一個(gè)調(diào)控亞基三個(gè)基因。根據(jù)活性中心螯合的金屬離子的不同，腈水合酶一般可以分為鈷型腈水合酶(Co-NHase)和鐵型腈水合酶(Fe-NHase)。腈水合酶在工業(yè)生產(chǎn)上已經(jīng)被廣泛應(yīng)用，其中用這種酶所生產(chǎn)的丙烯酰胺已近百萬(wàn)噸，占整個(gè)丙烯酰胺產(chǎn)量的三分之一。生物技術(shù)相對(duì)于傳統(tǒng)的化學(xué)合成法有著成本低、能耗少、少污染的優(yōu)勢(shì)。然而，在工業(yè)生產(chǎn)中，大部分具有高酶活的工業(yè)腈水合酶都存在著穩(wěn)定性差的缺點(diǎn)。例如，來(lái)源于PseudomonaschlororaphilsB23和Rhodococcussp.N-774的腈水合酶在20℃的條件下保持穩(wěn)定，而來(lái)源于第三代腈水合酶工業(yè)生產(chǎn)用菌RhodococcusrhodochrousJ1的腈水合酶也僅僅在10～30℃的條件下穩(wěn)定。而且由于腈類(lèi)水合反應(yīng)是一個(gè)放熱的過(guò)程，所以生產(chǎn)過(guò)程中必須通過(guò)降溫來(lái)保持酶活的發(fā)揮，因此導(dǎo)致了大量的能耗，提高了生產(chǎn)成本。在工業(yè)生產(chǎn)過(guò)程中，除了要提高腈水合酶的熱穩(wěn)定性，提高腈水合酶對(duì)高濃度產(chǎn)物酰胺的耐受性也是很有必要的。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
為了解決上述問(wèn)題，本發(fā)明提供一種提高腈水合酶穩(wěn)定性和耐受性的分子改造方法。由于原始腈水合酶的亞基是分離的，在高溫條件下可能會(huì)解聚，從而終止酶活。通過(guò)分子手段在基因水平上以共價(jià)鍵的方式融合兩個(gè)亞基，消除了亞基解聚的可能性。從而使得融合型腈水合酶的穩(wěn)定性提高，更適用于工業(yè)生產(chǎn)。該策略具有廣泛的通用性，對(duì)不同來(lái)源的亞基分離的腈水合酶均適用。本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種比酶活和穩(wěn)定性提高的融合型腈水合酶。所述腈水合酶融合表達(dá)了β亞基和α亞基并同時(shí)表達(dá)調(diào)控亞基，或者融合表達(dá)β亞基、α亞基和調(diào)控亞基。所述腈水合酶，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，其基因順序按照β亞基、α亞基、調(diào)控亞基這樣的順序。所述腈水合酶，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，是從來(lái)源于惡臭假單胞菌(PseudomonasputidaNRRL-18668)的序列為SEQIDNO.1所示的腈水合酶改造得到的。其α亞基、β亞基、調(diào)控亞基的氨基酸序列與惡臭假單胞菌的相同。所述腈水合酶，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，其β亞基的氨基酸序列是SEQIDNO.2，α亞基的氨基酸序列是SEQIDNO.3，調(diào)控亞基的氨基酸序列是SEQIDNO.4。所述β亞基和α亞基的基因之間通過(guò)核苷酸序列為SEQIDNO.5所示的linker連接。所述腈水合酶，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，其核苷酸序列是SEQIDNO.6或SEQIDNO.7所示的序列。本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供含有所述腈水合酶的質(zhì)粒載體。本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供表達(dá)所述腈水合酶的基因工程菌。所述基因工程菌，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，是大腸桿菌。本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供一種所述基因工程菌的構(gòu)建方法。所述方法，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，是將SEQIDNO.6或SEQIDNO.7所示的核苷酸序列克隆到表達(dá)載體pET-28a中，然后轉(zhuǎn)化到EscherichiacoliBL21中，即得到基因工程菌。本發(fā)明的第五個(gè)目的是提供一種利用所述基因工程菌發(fā)酵生產(chǎn)腈水合酶的方法，其特征在于，所述方法是：將重組大腸桿菌接種于含有16g/L胰蛋白胨、10g/L酵母提取物、5g/LNaCl的培養(yǎng)基中，于37℃培養(yǎng)至OD600＝0.8，然后加入IPTG和CoCl2·6H2O進(jìn)行誘導(dǎo)，誘導(dǎo)溫度為24℃，誘導(dǎo)16h。本發(fā)明的第六個(gè)目的是提供一種提高腈水合酶比酶活和熱穩(wěn)定性的方法。所述方法是融合表達(dá)腈水合酶的β亞基和α亞基并同時(shí)表達(dá)調(diào)控亞基，或者融合表達(dá)β亞基、α亞基和調(diào)控亞基。所述方法，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，是按照β亞基、α亞基、調(diào)控亞基的基因順序表達(dá)腈水合酶，β亞基、α亞基通過(guò)序列如SEQIDNO.5所示的linker連接。本發(fā)明還要求保護(hù)所述腈水合酶的應(yīng)用，尤其是在丙烯酰胺生產(chǎn)方面的應(yīng)用。本發(fā)明的有益效果：(1)本發(fā)明的酶，相對(duì)于野生酶，其比酶活提高、熱穩(wěn)定性增強(qiáng)、對(duì)產(chǎn)物的耐受性提高，可以克服現(xiàn)有的腈水合酶熱穩(wěn)定性不高、底物耐受性不足的問(wèn)題；(2)本發(fā)明的基于亞基融合的提高比酶活和熱穩(wěn)定性的方法，利用亞基融合策略將B和A基因用連接肽linker1融合為一個(gè)單獨(dú)的肽段，并在BA基因下游共表達(dá)調(diào)控蛋白P14K基因，避免了在高溫條件下可能會(huì)亞基解聚，提高了融合型腈水合酶的穩(wěn)定性；同時(shí)為了避免P14K降解，還可以在BA融合的基礎(chǔ)上將P14K基因融合在A基因下游。附圖說(shuō)明圖1：野生型腈水合酶和融合型腈水合酶在大腸桿菌中的表達(dá)電泳圖；其中泳道1為marker，泳道2為wild-typeNHase，泳道3為NHase-(BA)，泳道4為NHase-(BA)P14K，泳道5為NHase-(BAP14K)；圖2：野生型腈水合酶和融合型腈水合酶在50℃處理時(shí)的半衰期；圖3：野生型腈水合酶和融合型腈水合酶的產(chǎn)物耐受性；圖4：野生型腈水合酶和融合型腈水合酶的最適pH。具體實(shí)施方式2YT培養(yǎng)基：蛋白胨16g/L，酵母浸膏10g/L，NaCl5g/L腈水合酶反應(yīng)體系：底物為500μl200mM的煙腈，加入10μl適宜濃度的純酶反應(yīng)10min后用500μl乙腈終止反應(yīng)，并離心去除沉淀，取上清過(guò)0.22μm的膜后作為液相測(cè)定的樣品。腈水合酶HPLC檢測(cè)：流動(dòng)相水乙腈緩沖液；檢測(cè)波長(zhǎng)215nm；色譜柱為C18柱。實(shí)施例1：表達(dá)野生型腈水合酶BAP14K的重組菌的構(gòu)建構(gòu)建方法如下：(1)根據(jù)NCBI公開(kāi)的惡臭假單胞菌的腈水合酶序列設(shè)計(jì)上游及下游引物，通過(guò)PCR得到原始腈水合酶基因ABP14K，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。惡臭假單胞菌來(lái)源的腈水合酶的β亞基的氨基酸序列如SEQIDNO.2，α亞基的氨基酸序列如SEQIDNO.3，調(diào)控亞基的氨基酸序列如SEQIDNO.4所示。(2)利用限制性?xún)?nèi)切酶NdeI和HindIII同時(shí)處理擴(kuò)增得到的腈水合酶基因和pET-24a質(zhì)粒，并連接兩酶切產(chǎn)物得到含有原始腈水合酶基因的表達(dá)載體，得到pET-24a-ABP14K。(3)以B-up和B-down(BA)，A-up(BA)和A-down(AP)，P14K-up(AP)和P-down為引物，pET24a-ABP14K質(zhì)粒為模板，進(jìn)行重疊PCR擴(kuò)增。首先以B-up和B-down(BA)擴(kuò)增得到基因B，以A-up(BA)和A-down(AP)為引物擴(kuò)增得到基因A，以P14K-up(AP)和P-down為引物擴(kuò)增得到基因P，再取等量的基因B、A和P，以B-up和P-down為引物PCR擴(kuò)增得到全長(zhǎng)的基因BAP14K，得到野生型腈水合酶表達(dá)質(zhì)粒pET-24a-BAP14K，表達(dá)出的腈水合酶定義為wild-typeNHase。(4)將上一步得到的質(zhì)粒pET-24a-BAP14K轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達(dá)宿主BL21(DE3))，驗(yàn)證篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，即得到表達(dá)野生型腈水合酶BAP14K的重組菌。表1為本發(fā)明用到的引物。表1本發(fā)明中用到的引物注：限制性酶切位點(diǎn)用斜體和粗體標(biāo)出；重疊序列部分用下劃線標(biāo)出。實(shí)施例2：融合表達(dá)β亞基、α亞基的NHase-(BA)P14K的重組菌的構(gòu)建構(gòu)建方法如下：(1)基于野生型腈水合酶pET-24a-BAP14K，設(shè)計(jì)引物L(fēng)inker1-up和Linker1-down，并用全質(zhì)粒擴(kuò)增方法連接B和A基因，鏈接肽為linker1(序列如SEQIDNO.5所示)，得到pET-24a-(BA)P14K，設(shè)計(jì)上游及下游引物B-NdeI-up和P-HindIII-down，通過(guò)PCR得到(BA)P14K基因，再利用限制性?xún)?nèi)切酶NdeI和HindIII同時(shí)處理擴(kuò)增得到的腈水合酶基因和pET-28a質(zhì)粒，并連接兩酶切產(chǎn)物得到含有亞基融合型腈水合酶基因(序列為SEQIDNO.6所示)的表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-(BA)P14K，表達(dá)出的腈水合酶定義為NHase-(BA)P14K。(2)將上一步得到的質(zhì)粒pET-28a-(BA)P14K轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達(dá)宿主BL21(DE3))，驗(yàn)證篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，即得到融合表達(dá)β亞基、α亞基的NHase-(BA)P14K的重組菌。實(shí)施例3：融合表達(dá)β亞基、α亞基、調(diào)控亞基的NHase-(BA)P14K的重組菌的構(gòu)建構(gòu)建方法如下：(1)以pET-28a-(BA)P14K為模板，設(shè)計(jì)引物L(fēng)inker2-up和Linker2-down，并用全質(zhì)粒擴(kuò)增方法連接A和P14K亞基基因，鏈接肽為linker2，得到含有亞基融合型腈水合酶基因(序列為SEQIDNO.7所示)的表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-(BAP14K)，表達(dá)出的腈水合酶定義為NHase-(BAP14K)。(2)將成功構(gòu)建的pET-28a-(BAP14K)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達(dá)宿主(EscherichiacoliBL21(DE3))，驗(yàn)證篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，即得到融合表達(dá)β亞基、α亞基、調(diào)控亞基的NHase-(BAP14K)的重組菌。實(shí)施例4：腈水合酶的表達(dá)及酶學(xué)性質(zhì)分析本實(shí)施例是用實(shí)施例1-3得到的重組菌進(jìn)行腈水合酶的表達(dá)。重組大腸桿菌首先在10ml的2YT液體培養(yǎng)基(卡那霉素終濃度為50μg/ml)中活化培養(yǎng)，溫度為37℃，然后以1％的接種量轉(zhuǎn)接至500ml的2YT液體培養(yǎng)基中，待OD600達(dá)到0.8時(shí)，加入IPTG(終濃度為0.4mM)誘導(dǎo)，并加入鈷離子(終濃度為0.05g/l)以獲得成熟酶，然后在24℃培養(yǎng)16小時(shí)。收集成熟的大腸桿菌，用SDS-PAGE檢測(cè)表達(dá)量。SDS-PAGE結(jié)果顯示，本發(fā)明構(gòu)建的野生型及融合型腈水合酶均可以在大腸桿菌中大量表達(dá)，如圖1。其中泳道3為僅融合表達(dá)了β亞基和α亞基、不表達(dá)調(diào)控亞基的重組菌。(1)酶活力的比較：腈水合酶活力的測(cè)定：將表達(dá)正常的大腸桿菌大量培養(yǎng)，離心收集成熟的細(xì)胞，用0.01M的磷酸鹽緩沖液(pH7.5)重懸，反復(fù)離心重懸兩次后，用超聲波破碎法破碎細(xì)胞，離心得到上清，然后進(jìn)行純化，得到純化的酶測(cè)定酶濃度，稀釋到合適的酶濃度用HPLC檢測(cè)酶活。結(jié)果顯示，與野生型腈水合酶wild-typeNHase相比，融合型腈水合酶NHase-(BA)P14K的比酶活499.2U/mg，NHase-(BAP14K)的比酶活為452.5U/mg，相比野生型腈水合酶wild-typeNHase的324.8U/mg，分別提高了53.7％、39.3％。此外，圖1中泳道3的酶，酶活僅為69.1U/mg。同時(shí)，還比較了wild-typeNHase、NHase-(BA)與NHase-(BA)P14K的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)。結(jié)果顯示，NHase-(BA)P14K和NHase-(BAP14K)的催化常數(shù)Kcat大約為wild-typeNHase的2倍，表明NHase-(BA)P14K和NHase-(BAP14K)比wild-typeNHase可以進(jìn)行更快的催化反應(yīng)。此外，NHase-(BA)P14K的kcat/Km值約為wild-typeNHase的1.5倍，表明NHase-(BA)P14K具有更高的催化效率。(2)酶的熱穩(wěn)定性比較：比較方法：首先將酶溶液加入空的EP管中，置于50℃金屬浴中處理，處理一定時(shí)間置于冰上，然后再置于25℃金屬浴中加入200mM煙腈底物進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)十分鐘后加入色譜純乙腈終止反應(yīng)。熱穩(wěn)定性結(jié)果如圖2所示。在50℃溫浴處理時(shí)，NHase-(BA)P14K的半衰期(26min)是wild-typeNHase(9min)的3倍左右，而NHase-(BAP14K)(18min)的半衰期為wild-typeNHase的2倍左右。(3)腈水合酶產(chǎn)物耐受性比較比較方法：反應(yīng)體系內(nèi)有20mM底物煙腈，并加入或不加0.5M產(chǎn)物煙酰胺，柱狀圖為反應(yīng)十分鐘時(shí)檢測(cè)到的底物減少量。計(jì)算同一種酶在含有產(chǎn)物的反應(yīng)體系中的底物減少量占不含產(chǎn)物的反應(yīng)體系中的底物減少量的比率，來(lái)比較不同酶的產(chǎn)物耐受性。結(jié)果如圖3所示。對(duì)于產(chǎn)物耐受性，在含有產(chǎn)物煙酰胺的反應(yīng)體系中，與wild-typeNHase相比，NHase-(BA)P14K和NHase-(BAP14K)的底物消耗量分別提高了26％、18％。在不含有煙酰胺的反應(yīng)體系中，與wild-typeNHase相比，NHase-(BA)P14K和NHase-(BAP14K)的底物消耗量分別提高了23％、15％。而對(duì)于酶自身，wild-typeNHase的底物減少比率(含有產(chǎn)物的反應(yīng)體系中的底物減少量占不含產(chǎn)物的反應(yīng)體系中的底物減少量的比率)為0.8，NHase-(BA)P14K和NHase-(BAP14K)的分別為0.86和0.83，NHase-(BA)P14K和NHase-(BAP14K)的比率均比wild-typeNHase高，表明融合型腈水合酶具有更高的產(chǎn)物耐受性。(4)酶的最適pH值比較比較了wild-typeNHase、NHase-(BA)P14K和NHase-(BAP14K)在不同pH條件下的酶活，將各自在最適pH下的酶活定義為1(即100％)，結(jié)果如圖4所示。結(jié)果顯示，這3個(gè)酶的最適pH都在7.5左右。以上數(shù)據(jù)表明，通過(guò)融合表達(dá)β亞基和α亞基并同時(shí)表達(dá)調(diào)控亞基，或者融合表達(dá)β亞基、α亞基和調(diào)控亞基，能夠顯著提高腈水合酶的酶活力、熱穩(wěn)定性和產(chǎn)物耐受性。雖然本發(fā)明已以較佳實(shí)施例公開(kāi)如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動(dòng)與修飾，因此本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)該以權(quán)利要求書(shū)所界定的為準(zhǔn)。