一種基于糖碳苷的水溶性熒光探針、合成與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種基于糖碳苷的新型水溶性熒光探針及其制備方法和用途，具體的 說(shuō)，涉及一種具有二乙氨基苯甲醛結(jié)構(gòu)的糖碳苷類(lèi)熒光探針化合物的合成及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 目前有關(guān)基于糖的熒光探針大多通過(guò)糖分子與熒光化合物（如羅丹明，香豆素） 通過(guò)糖苷鍵結(jié)合后得到，從而對(duì)不同熒光化合物進(jìn)行改性，但以糖碳苷的熒光探針的研究 很少。碳苷由于其對(duì)于天然〇-和N-苷而言，具有著較好的化學(xué)和生物學(xué)穩(wěn)定性，即耐酸堿 性和對(duì)糖苷酶的穩(wěn)定性，吸引著國(guó)內(nèi)外廣大學(xué)者的關(guān)注。
[0003] 在蛋白質(zhì)中，巰基部分是與酶活性有關(guān)的最具有反應(yīng)活性的官能團(tuán)，因此對(duì)于巰 基化合物的檢測(cè)顯得尤為重要。目前由于檢測(cè)巰基主要是通過(guò)比色，電化學(xué)，質(zhì)譜等方法， 但這些方法操作繁瑣，對(duì)檢測(cè)物的純度要求高，靈敏度低。因此，熒光檢測(cè)手段因其具有高 靈敏性，操作簡(jiǎn)便的優(yōu)異特性而逐漸成為有關(guān)-SH化合物檢測(cè)的重點(diǎn)。特別是在蛋白質(zhì)檢 測(cè)中，熒光探針可以增強(qiáng)檢測(cè)的靈敏度，對(duì)蛋白含量的測(cè)定，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的研究具有重要的 意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 發(fā)明人的目的是提供一種基于糖碳苷的水溶性熒光探針的合成及其制備方法。
[0005] 本發(fā)明的另一目的是將這一種熒光探針應(yīng)用于巰基陰離子檢測(cè)，酸堿度分析，蛋 白質(zhì)標(biāo)記方面。
[0006] 實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的技術(shù)解決方案是：一種基于糖碳苷的水溶性熒光探針，所述熒光探 針具有如下結(jié)構(gòu)：
[0007]
[0008] -種基于糖碳苷的水溶性熒光探針的合成，包括如下步驟：
[0009] (1)將3-乙?；?5-C-(2, 3-二羥基-1,4-脫水-D-赤型呋喃糖基）-2-甲基呋喃 和4-N，N-二乙胺基苯甲醛溶解在乙醇溶劑中，并向反應(yīng)器中加入催化劑氫氧化鈉水溶液， 室溫?cái)嚢璺磻?yīng)，TLC板跟蹤反應(yīng)至原料消失；
[0010] ⑵除去溶劑，硅膠柱提純，得紅褐色粘稠狀目標(biāo)產(chǎn)物。
[0011] 步驟⑴中所述的3-乙?；?5-C-(2,3-二羥基-1，4-脫水-D-赤型呋喃糖 基）-2-甲基呋喃、4-N，N-二乙胺基苯甲醛和催化劑氫氧化鈉水溶液（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10% ) 的摩爾比為1:1. 5:1. 25,室溫?cái)嚢璺磻?yīng)時(shí)間為6h。
[0012] -種基于糖碳苷的水溶性熒光探針的應(yīng)用，將上述制備的熒光探針用于酸堿度分 析、巰基陰離子檢測(cè)和蛋白質(zhì)標(biāo)記中。
[0013] 本發(fā)明的原理是：
[0014] 本發(fā)明將該熒光探針?lè)譃槿齻€(gè)部分：結(jié)合部位，通過(guò)糖基化作用，增強(qiáng)該熒光化合 物親水性和生物相容性；信號(hào)開(kāi)關(guān)，該區(qū)域類(lèi)似于熒光傳遞部分的橋梁，可以被親核試劑進(jìn) 攻，破壞共輒體系，使得熒光消失；增色基團(tuán)，通過(guò)增加該區(qū)域的給電子性，可以增強(qiáng)化合物 整體的熒光和紫外吸收強(qiáng)度，提高該化合物在應(yīng)用時(shí)的靈敏度，增強(qiáng)該化合物針對(duì)多領(lǐng)域 熒光檢測(cè)的應(yīng)用價(jià)值和可行性。
[0015]
[0016] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，其顯著優(yōu)點(diǎn)：（1)該熒光化合物有著良好的水溶性。（2) 該熒光化合物在質(zhì)子溶劑中熒光消失或者減弱，在非質(zhì)子溶劑中熒光增強(qiáng)。（3)該熒光化合 物對(duì)蛋白質(zhì)有著較強(qiáng)的附著能力，和蛋白結(jié)合后發(fā)出綠色熒光。（4)該熒光化合物的應(yīng)用范 圍較寬，可以用于陰離子檢測(cè)，酸堿度分析，蛋白質(zhì)標(biāo)記等領(lǐng)域。
【附圖說(shuō)明】
[0017] 圖1基于碳苷糖的熒光探針系列化合物2在不同溶劑下的紫外光譜圖。
[0018] 圖2基于碳苷糖的熒光探針系列化合物2在不同溶劑下的熒光光譜圖。
[0019] 圖3基于碳苷糖的熒光探針系列化合物2的熒光光譜濃度變化圖。
[0020] 圖4基于碳苷糖的熒光探針系列化合物2的陰離子檢測(cè)分析圖。
[0021] 圖5為陰離子檢測(cè)中，相對(duì)熒光探針2,加入不同陰離子后的熒光降低和熒光增強(qiáng) 的百分比。
[0022] 圖6基于碳苷糖的熒光探針系列化合物2的酸堿性檢測(cè)分析圖。
[0023] 圖7基于碳苷糖的熒光探針系列化合物2與BSA蛋白結(jié)合濃度與熒光強(qiáng)度檢測(cè)分 析圖。
[0024] 圖8基于碳苷糖的熒光探針系列化合物2與BSA蛋白結(jié)合濃度與熒光強(qiáng)度關(guān)系 圖。
[0025]
【具體實(shí)施方式】
[0026] 以下提供本發(fā)明一種基于糖碳苷的熒光化合物的合成及其在酸堿度分析，巰基化 合物檢測(cè)，蛋白質(zhì)標(biāo)記方面的應(yīng)用測(cè)試。
[0027] 本發(fā)明化合物的合成路線如下，首先葡萄糖經(jīng)過(guò)Lewis酸催化與乙酰丙酮縮合得 到化合物1，然后與芳香醛反應(yīng)，得到化合物2,其兩步產(chǎn)率可達(dá)55%。
[0028]
[0029] 實(shí)施例丄
[0030] 化合物2的制備
[0031]
[0032] 將 0· 226g (lmmol)的 3-乙?；?5-C- (2, 3-二羥基-1，4-脫水-D-赤型呋喃 糖基）-2_甲基呋喃1(其中，3-乙?；?5-C-(2,3-二羥基-1，4-脫水-D-赤型呋喃糖 基）-2-甲基呋喃的制備參見(jiàn)文獻(xiàn)：項(xiàng)燕飛，方志杰，李龍霞，C 〇C12 · 6H20、A1C13 · 6H20在 水相催化合成C-吡咯糖苷，化學(xué)研究與應(yīng)用，2013, 25 (10) : 1426-1429.)溶于4mL乙醇 中，向反應(yīng)體系中移液加入4-N，N-二乙胺基苯甲醛0. 266g(l. 5mmol)和10% NaOH水溶液 0. 15mL，室溫下攪拌8h，用TLC進(jìn)行跟蹤，反應(yīng)結(jié)束后，減壓蒸餾除去溶劑，并用15mL乙酸 乙酯萃取，飽和NaCl溶液20mL洗滌三遍，無(wú)水硫酸鈉干燥有機(jī)層，過(guò)濾，減壓蒸餾得粗產(chǎn) 品，硅膠柱層析分離提純（石油醚：乙酸乙酯=3:1)，得到深紅色漿狀液體0. 343g，產(chǎn)率在 89%〇
[0033] NMR (50 0MHz, CDCl3) 57.62(d,J = 15.4Hz,lH),7.42(d,J = 8. 6Hz, 2H), 6. 90 (d, J = 15. 4Hz, 1H), 6. 70 (s, 1H), 6. 56 (t, J = 9. 1Hz, 2H), 4. 70 (d, J =5. 9Hz, 1H) , 4. 35 (d, J = 15. 7Hz, 3H) , 4. 27 - 4. 1 3 (m, 2H) , 3. 88 (d, J = 10. 0Hz, 1H), 3. 34 (dd, J = 13. 9, 6. 9Hz, 5H), 2. 54 (s, 3H), 1. 13 (t, J = 7. 0Hz, 6H).
[0034] 13C NMR(CDC13) : δ 186. 5, 159. 0, 149. 9, 149. 7, 145. 1，130. 9, 122. 7, 121. 3, 117. 6 ,111. 2, 109. 3, 76. 9, 74. 7, 73. 1, 71. 0, 44. 4, 14. 6, 12. 5.
[0035] ESI-MS m/z: 386. 1 (M+H) +·
[0036] 實(shí)施例2
[0037] 不同溶劑對(duì)該熒光探針的紫外和熒光光譜的影響。
[0038] 溶劑的不同，會(huì)對(duì)熒光探針的熒光強(qiáng)度和最大吸收波長(zhǎng)有一定的影響。圖1和圖2 則給出碳苷糖的熒光探針2在不同溶劑下的紫外和熒光光譜的性質(zhì)變化。從圖1中可以看 出，該化合物紫外最大吸收波長(zhǎng)變化不大，圖2中熒光最大吸收波長(zhǎng)的變化較為明顯，通過(guò) 計(jì)算得到該熒光探針2的stokes位移，與其他熒光探針相比（大多數(shù)熒光物質(zhì)stokes位 移在50-70nm之間），該熒光化合物具有著較大的stokes位移（86nm，溶劑為乙腈）。該化 合物對(duì)在DMF，CH 3CN等極性非質(zhì)子溶劑中熒光吸收較強(qiáng)，而在極性質(zhì)子溶劑中，熒光基本淬 滅。
[0039] 實(shí)施例3
[0040] 糖碳苷的熒光探針化合物2的熒光強(qiáng)度和濃度變化關(guān)系。
[0041] 圖3給出碳苷糖的熒光探針系列化合物2的熒光強(qiáng)度和濃度變化曲線圖，從圖譜 中可以得到，化合物2在乙腈溶劑中，當(dāng)濃度達(dá)到4X 10 5時(shí)，其熒光強(qiáng)度最高，當(dāng)濃度繼續(xù) 增大時(shí)，熒光逐漸開(kāi)始減弱。
[0042] 實(shí)施例4
[0043] 糖碳苷的熒光探針化合物2對(duì)巰基陰離子的檢測(cè)。
[0044] 通過(guò)篩選常見(jiàn)的陰離子，可以得到適應(yīng)于該基于碳苷糖熒光探針體系檢測(cè)的陰離 子。圖4給出了碳苷糖的熒光探針化合物2的陰離子檢測(cè)分析圖，測(cè)試選用了 Cl，N02， H2P04，HS03，I，F(xiàn)，-SH離子和基團(tuán)，從圖5中可以得出該化合物對(duì)巰基具有較高的敏感度。 當(dāng)化合物與巰基化合物結(jié)合時(shí)，化合物的熒光消失。
[0045] 實(shí)施例5
[0046] 糖碳苷的熒光探針對(duì)酸堿度檢測(cè)。
[0047] 由于熒光探針的檢測(cè)與環(huán)境的酸堿性密切相關(guān)，圖6則給出碳苷糖的熒光探針化 合物2的酸堿度檢測(cè)情況，從圖中可以得到，酸性條件下體系熒光消失，堿性條件熒光保 持。
[0048] 實(shí)施例6
[0049] 糖碳苷的熒光探針對(duì)蛋白質(zhì)標(biāo)記。
[0050] 此外，為了分析該熒光探針對(duì)蛋白質(zhì)的標(biāo)記情況，圖7和圖8給出了化合物2與 BSA蛋白結(jié)合濃度與熒光強(qiáng)度檢測(cè)分析圖，以4x10 4mol/L的化合物2為基準(zhǔn)物，進(jìn)行試驗(yàn)。 配置濃度分別為 〇. 1，〇. 2,0. 4,0. 6,0. 8, 1.0, 1.2, 1.4, 1.6, 1.8,2. Omg/mL 的濃度進(jìn)行分 析，發(fā)現(xiàn)當(dāng)濃度達(dá)到1. 6mg/mL時(shí)，其熒光強(qiáng)度達(dá)到最高值，當(dāng)繼續(xù)提高BSA濃度時(shí)，熒光強(qiáng) 度基本不變。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種基于糖碳苷的水溶性熒光探針，其特征在于，所述熒光探針具有如下結(jié)構(gòu)：2. 如權(quán)利要求1所述的基于糖碳苷的水溶性熒光探針的合成，其特征在于，包括如下 步驟： (1) 將3-乙?；?5-C-(2, 3-二羥基-1，4-脫水-D-赤型呋喃糖基）-2-甲基呋喃和 4-N，N-二乙胺基苯甲醛溶解在乙醇溶劑中，并向反應(yīng)器中加入催化劑氫氧化鈉水溶液，室 溫?cái)嚢璺磻?yīng)，TLC板跟蹤反應(yīng)至原料消失； (2) 除去溶劑，硅膠柱提純，得紅褐色粘稠狀目標(biāo)產(chǎn)物。3. 如權(quán)利要求2所述的基于糖碳苷的水溶性熒光探針的合成，其特征在于，步驟（1) 中所述的3-乙?；?5-C- (2, 3-二羥基-1，4-脫水-D-赤型呋喃糖基）-2-甲基呋喃、 4-N，N-二乙胺基苯甲醛和催化劑氫氧化鈉的摩爾比為1:1. 5:1. 25。4. 如權(quán)利要求2所述的基于糖碳苷的水溶性熒光探針的合成，其特征在于，步驟（1)中 所述的室溫?cái)嚢璺磻?yīng)時(shí)間為6h。5. 如權(quán)利要求2所述的基于糖碳苷的水溶性熒光探針的合成，其特征在于，步驟（1)中 所述的氫氧化鈉水溶液的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%。6. 如權(quán)利要求1-5任一所述的基于糖碳苷的水溶性熒光探針的應(yīng)用，其特征在于，將 熒光探針用于酸堿度分析、巰基陰離子檢測(cè)和蛋白質(zhì)標(biāo)記中。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種基于糖碳苷的水溶性熒光探針化合物、合成及其應(yīng)用。所述的熒光探針經(jīng)過(guò)兩步反應(yīng)得到，具有反應(yīng)原料廉價(jià)易得，反應(yīng)步驟少，產(chǎn)率高等特點(diǎn)。本發(fā)明揭示了所述基于糖碳苷熒光探針的多種用途，包括：1.酸堿度分析，由于該熒光探針在酸條件下無(wú)熒光，堿條件下熒光保持，利用其酸堿開(kāi)關(guān)的特性，對(duì)酸堿度進(jìn)行分析；2.巰基陰離子檢測(cè)，利用α,β-不飽和酮的特性(即提供親電中心的性質(zhì))，可選擇性的對(duì)巰基進(jìn)行檢測(cè)；3.蛋白質(zhì)標(biāo)記，利用該熒光化合物在質(zhì)子溶劑中有較弱或者無(wú)熒光，但向該化合物的水溶液中加入蛋白后熒光產(chǎn)生的這一特性，用于對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行標(biāo)記，并增強(qiáng)蛋白質(zhì)檢測(cè)的靈敏度。
【IPC分類(lèi)】C07D307/46, C07K1/13, G01N21/64, C09K11/06
【公開(kāi)號(hào)】CN105602547
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201410599185
【發(fā)明人】方志杰, 張濤, 顧小敏, 盧慶光
【申請(qǐng)人】南京理工大學(xué)
【公開(kāi)日】2016年5月25日
【申請(qǐng)日】2014年10月30日