本發(fā)明涉及多肽及其用途，具體而言，本發(fā)明涉及一類可用于預(yù)防和/或治療阿爾茨海默病的β片層阻斷肽，以及所述多肽用于預(yù)防和/或治療阿爾茨海默病的用途。

背景技術(shù)：
阿爾茨海默?。ˋlzheimer’sdisease,AD）又稱老年性癡呆，是一種神經(jīng)退行性疾病。隨著人口老齡化進(jìn)程的加快，老年性疾病已成為一個(gè)明顯影響人類健康的突出問(wèn)題。老年性癡呆和惡性腫瘤、心腦血管意外，并列為導(dǎo)致老年人死亡的三大疾病，世界衛(wèi)生組織已將AD列入21世紀(jì)五大重點(diǎn)疾病之一。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究證明，阿爾茨海默病病理學(xué)改變的主要特征為：神經(jīng)細(xì)胞之間形成大量由β-淀粉樣肽（β-amyloidpeptide，Aβ）沉積形成的老年斑（senileplaque,SP）、神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)元纖維纏結(jié)（neurofibrillarytangle,NT）和神經(jīng)元大量丟失。目前對(duì)AD發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識(shí)以淀粉樣蛋白學(xué)說(shuō)占主導(dǎo)地位。該學(xué)說(shuō)認(rèn)為：Aβ的病理性折疊和寡聚物的形成啟動(dòng)了AD的發(fā)病過(guò)程，如氧自由基形成、氧化應(yīng)激、細(xì)胞內(nèi)鈣離子穩(wěn)態(tài)破壞、蛋白激酶激活、tau蛋白過(guò)度磷酸化、誘導(dǎo)凋亡、慢性炎癥、補(bǔ)體激活、影響線粒體功能，導(dǎo)致能量代謝障礙等病理生理變化，最終造成神經(jīng)細(xì)胞的死亡，引起AD患者記憶喪失、認(rèn)知能力減退、行為異常等一系列臨床癥狀。眾多證據(jù)表明Aβ的神經(jīng)毒性作用是多種因素導(dǎo)致的AD發(fā)病的共同通路，而Aβ的神經(jīng)毒性與其聚集有關(guān)。在Aβ二級(jí)結(jié)構(gòu)中，β-折疊的形成是聚集必需的，富含β折疊的結(jié)構(gòu)能夠更快地促進(jìn)Aβ聚集，而β折疊的形成與Aβ肽鏈中的疏水片段有關(guān)。在一定條件下，富含β折疊的結(jié)構(gòu)疏水區(qū)暴露，會(huì)促使Aβ聚集，形成低聚物，最終成為不可溶性物質(zhì)在神經(jīng)元間隙沉積，產(chǎn)生神經(jīng)毒性并引起腦內(nèi)膠質(zhì)細(xì)胞活性增高，產(chǎn)生炎性介質(zhì)和補(bǔ)體，共同形成淀粉樣斑塊。研究發(fā)現(xiàn)可溶性Aβ成分的水平比斑塊沉積的密度與認(rèn)知損傷嚴(yán)重程度的關(guān)系更密切，不同的可溶性Aβ的寡聚物如Aβ寡聚物、ADDLS和Aβ纖維可能通過(guò)不同的神經(jīng)毒性機(jī)制影響神經(jīng)功能和神經(jīng)生存能力（DeshpandeA,MinaE,GlabeC.DifferentConformationsofAβInduceNeurotoxicitybyDistinctMechanismsinHumanCorticalNeurons[J].JNeurosci,2006,26(22):6011-6018）。Aβ是老年斑的主要成分，是淀粉樣前體蛋白（amyloidprecursorprotein,APP）經(jīng)β、γ分泌酶水解的代謝產(chǎn)物。由于酶切位點(diǎn)的不同產(chǎn)生Aβ1-40或Aβ1-42，Aβ1-42比Aβ1-40具有更大的神經(jīng)毒性并且更疏水，更易形成寡聚物并進(jìn)一步聚集，在AD病理過(guò)程中起關(guān)鍵作用。Aβ1-42肽的一級(jí)結(jié)構(gòu)如下所示（SEQIDNO:3）:Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln-151015Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-16202530Ile-Ile-Gly-Leu-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val-Ile-Ala31354042Aβ1-42C端的10個(gè)氨基酸殘基33-42及17-21位的氨基酸殘基具有高度的疏水性，構(gòu)成了Aβ1-42疏水區(qū)；28-42位氨基酸殘基形成β折疊構(gòu)象的可能性較大，而9-21位的氨基酸殘基也可能形成β折疊構(gòu)象。β折疊構(gòu)象有利于Aβ1-42肽的聚集，而Aβ肽的聚集又是由于其疏水區(qū)的相互作用。MQLiao等應(yīng)用分光鏡和細(xì)胞技術(shù)發(fā)現(xiàn)Aβ肽鏈中疏水的17－21，25－35片段及C端41－42是主要的致聚集和神經(jīng)毒性的區(qū)域（LiaoMQ,TzengYJ,ChangLY,etal.Thecorrelationbetweenneurotoxicity,aggregativeabilityandsecondarystructurestudiedbysequencetruncatedAbetapeptides[J].FEBSLett,2007,581(6):1161-1165）。目前針對(duì)Aβ的藥物的研究目標(biāo)是減少Aβ的生成，增加Aβ清除、預(yù)防或逆轉(zhuǎn)Aβ聚集和抑制Aβ的毒性等。美國(guó)華盛頓大學(xué)醫(yī)學(xué)院的研究人員發(fā)現(xiàn)，在清除阿爾茨海默病小鼠腦內(nèi)的淀粉蛋白斑塊后，小鼠的腦細(xì)胞開(kāi)始奇跡般地恢復(fù)功能。表明針對(duì)Aβ的藥物有著令人鼓舞的前景。在各種針對(duì)Aβ的藥物中，β片層阻斷劑越來(lái)越為人關(guān)注。中國(guó)專利CN101531703A公開(kāi)了幾種多肽，其能與Aβ1-42特異結(jié)合、穩(wěn)定其正常空間結(jié)構(gòu)、抑制其形成β片層、阻止可溶性β淀粉樣蛋白寡聚體和β淀粉樣蛋白斑塊形成、且對(duì)Aβ纖維具有分解作用，所述多肽被稱為β片層阻斷肽。經(jīng)過(guò)對(duì)比發(fā)現(xiàn)，其中序列為His-Lys-Gln-Leu-Pro-Phe-Phe-Glu-Glu-Asp（H102）（SEQIDNO:2）的多肽其對(duì)Aβ聚集的抑制作用（抑制率27.84%）最強(qiáng)。本領(lǐng)域目前需要能更好地針對(duì)Aβ聚集過(guò)程中β折疊這一必需環(huán)節(jié)設(shè)計(jì)的新的活性藥劑，所述藥劑能夠與β-淀粉樣蛋白單體（Aβ1-42）特異結(jié)合，阻止β折疊形成進(jìn)而抑制Aβ肽的聚集，減少腦內(nèi)Aβ可溶性寡聚體、Aβ纖維及老年斑的形成，加速Aβ肽的降解與清除，從而可用于AD的預(yù)防和/或治療。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種能更好地針對(duì)Aβ聚集過(guò)程中β折疊這一必需環(huán)節(jié)設(shè)計(jì)的多肽，所述多肽能夠與β-淀粉樣蛋白單體（Aβ1-42）特異結(jié)合，阻止β折疊形成進(jìn)而抑制Aβ肽的聚集，減少腦內(nèi)Aβ可溶性寡聚體、Aβ纖維及老年斑的形成，加速Aβ肽的降解與清除，從而可用于AD的預(yù)防和/或治療。本發(fā)明的發(fā)明人意外地發(fā)現(xiàn)，具有如下氨基酸序列的多肽HPYD能夠?qū)崿F(xiàn)上述目的：His-Lys-Gln-Leu-Pro-Phe-Tyr-Glu-Glu-Asp（SEQIDNO:1）。因此，在本發(fā)明的第一方面，提供了包括上述氨基酸序列的多肽。由于上述的多肽能與β淀粉樣蛋白單體（Aβ1-42）特異結(jié)合、穩(wěn)定其正?？臻g結(jié)構(gòu)、抑制其形成β片層、阻止可溶性β淀粉樣蛋白寡聚體和β淀粉樣蛋白斑塊形成、且對(duì)Aβ纖維具有分解作用，因此可以用于阿爾茨海默病的預(yù)防和/或治療。因此，在本發(fā)明的第二方面，提供了本發(fā)明的多肽在制備用于預(yù)防和/或治療阿爾茨海默病的藥物中的用途。在本發(fā)明的第三方面，提供了一種藥物組合物，所述藥物組合物中包括本發(fā)明的多肽和可藥用的載體。在本發(fā)明的第四方面，提供了一種預(yù)防和/或治療受試者的阿爾茨海默病的方法，所述方法包括給予所述受試者有效量的本發(fā)明的多肽。附圖說(shuō)明圖1顯示了制備本發(fā)明多肽的方法的步驟和所制備產(chǎn)品的檢測(cè)結(jié)果。圖1A顯示了用于合成和純化本發(fā)明多肽HPYD的主要步驟；圖1B顯示了HPYD的色譜分析結(jié)果；圖1C顯示了HPYD的質(zhì)譜檢測(cè)結(jié)果。圖2顯示了Aβ老化組及HPYD干預(yù)后其FT-IR光譜。其中a為Aβ溶液孵育30分鐘后的FT-IR光譜；b為Aβ溶液孵育72小時(shí)后的FT-IR光譜；c為H102與Aβ溶液共同孵育72小時(shí)后的FT-IR光譜；d為HPYD與Aβ溶液共同孵育72小時(shí)后的FT-IR光譜。圖3顯示了HPYD抑制Aβ聚集的電鏡觀察結(jié)果。其中，圖A為將Aβ1-42單獨(dú)孵育5天的電鏡結(jié)果，放大倍數(shù)57000倍；圖B為將H102與Aβ1-42共同孵育5天的電鏡結(jié)果，放大倍數(shù)57000倍；圖C為將HPYD與Aβ1-42共同孵育5天的電鏡結(jié)果，放大倍數(shù)57000倍。圖4顯示了HPYD對(duì)APP/PSI雙轉(zhuǎn)基因小鼠大腦皮層及海馬CA1區(qū)Aβ表達(dá)的影響結(jié)果。其中，A1為正常對(duì)照組的海馬CA1區(qū)Aβ表達(dá)；A2為模型組的海馬CA1區(qū)Aβ表達(dá)；A3為給藥組的海馬CA1區(qū)Aβ表達(dá)；B1為正常對(duì)照組的大腦皮層Aβ表達(dá)；B2為模型組的大腦皮層Aβ表達(dá)；B3為給藥組的大腦皮層Aβ表達(dá)。圖5顯示了HPYD對(duì)APP/PSI雙轉(zhuǎn)基因小鼠大腦皮層及海馬CA1區(qū)APP表達(dá)的影響結(jié)果。其中，A1為正常對(duì)照組的海馬CA1區(qū)APP表達(dá)；A2為模型組的海馬CA1區(qū)APP表達(dá)；A3為給藥組的海馬CA1區(qū)APP表達(dá)；B1為正常對(duì)照組的大腦皮層APP表達(dá)；B2為模型組的大腦皮層APP表達(dá)；B3為給藥組的大腦皮層APP表達(dá)。圖6顯示了在定位航行實(shí)驗(yàn)中各組小鼠每天平均逃避潛伏期。圖7顯示了在空間探索實(shí)驗(yàn)中各組小鼠跨越隱性平臺(tái)的次數(shù)比較結(jié)果。圖8顯示了在空間探索實(shí)驗(yàn)中各組小鼠入水朝向角的比較結(jié)果。具體實(shí)施方式在本文中公開(kāi)了一系列多肽的氨基酸序列，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠理解的是，在以三字母的氨基酸殘基表示某一序列時(shí)，該序列從左至右表示的是該多肽從N端（氨基端）至C端（羧基端）的序列。例如當(dāng)使用“His-Lys-Gln-Leu-Pro-Phe-Tyr-Glu-Glu-Asp”表示某一多肽的序列時(shí)，意為該多肽的序列為“N端-His-Lys-Gln-Leu-Pro-Phe-Tyr-Glu-Glu-Asp-C端”。在本發(fā)明的第一方面，提供了包括下述氨基酸序列的多肽：His-Lys-Gln-Leu-Pro-Phe-Tyr-Glu-Glu-Asp本發(fā)明的多肽可以包括上述氨基酸序列、基本上由上述氨基酸序列組成或者由上述氨基酸序列組成。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，提供了一種由如下序列組成的多肽，所述多肽在本發(fā)明中被命名為HPYD：HPYD:His-Lys-Gln-Leu-Pro-Phe-Tyr-Glu-Glu-Asp。顯而易見(jiàn)的是，可以對(duì)本發(fā)明的多肽進(jìn)行各種修飾。所述的修飾包括但不限于：脯氨酸和賴氨酸的羥基化，賴氨酸、組氨酸側(cè)鏈的o-氨基基團(tuán)的甲基化，N端氨基的乙酰化以及在某些情況下C端羧基的酰胺化。應(yīng)該理解的是，在獲知本發(fā)明多肽的氨基酸序列之后，上述各種修飾形式對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見(jiàn)的，并且含有這些修飾的包括所公開(kāi)氨基酸序列的多肽也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。上述的本發(fā)明多肽能夠作為β片層阻斷肽，其能夠與β淀粉樣蛋白單體（Aβ1-42）特異結(jié)合、穩(wěn)定其正常空間結(jié)構(gòu)、抑制其形成β片層、阻止可溶性β淀粉樣蛋白寡聚體和β淀粉樣蛋白斑塊形成、且對(duì)Aβ纖維具有分解作用，因此可以用作預(yù)防和/或治療阿爾茨海默病的藥物。所以，在本發(fā)明的另一方面，提供了本發(fā)明的多肽在制備預(yù)防和/或治療阿爾茨海默病的藥物中的用途。本文中所使用的“預(yù)防”指的是減少受試者患上病癥的風(fēng)險(xiǎn)或者延遲患者患病或者癥狀出現(xiàn)的時(shí)間。本文中所使用的“治療”并不是指完全治愈，它是指減輕了潛在疾病的癥狀和/或減少了導(dǎo)致癥狀的一種或多種潛在的細(xì)胞、生理或生物化學(xué)病因或機(jī)理。應(yīng)理解本文所使用的減輕是相對(duì)于疾病狀況而言的，包括疾病的分子狀況，而不僅僅是疾病的生理狀況。本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，所述藥物組合物中包括一種或多種本發(fā)明的多肽和可藥用的載體?！翱伤幱玫妮d體”是指在生物學(xué)上或其他方面不會(huì)具有不良作用的物質(zhì)，即可以將所述物質(zhì)與本發(fā)明的多肽一同給予受試者，同時(shí)不會(huì)引起任何不良的生物學(xué)影響或以有害的方式與含有它的藥物組合物的任何其他組分相互作用。顯然應(yīng)當(dāng)選擇可使活性成分的任何降解降到最低并且使受試者體內(nèi)的任何不良副作用減到最小的載體，這是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。本發(fā)明的藥物組合物通常包括至少一種本發(fā)明的多肽和一種或多種可藥用的載體。合適的載體包括但不限于：抗氧化劑、防腐劑、著色劑、調(diào)味劑和稀釋劑、乳化劑、懸浮劑、溶劑、填充劑、增量劑、緩沖劑、載體、沖淡劑、賦形劑和/或藥用佐劑。例如，合適的載體可為生理鹽水溶液、檸檬酸鹽緩沖液或人工CSF，以及可能添加常用于腸胃外給藥組合物的其他物質(zhì)。中性緩沖鹽溶液或與血清清蛋白混合的鹽溶液也是示例性的載體。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地確定可用于本發(fā)明組合物和劑型的多種緩沖劑。典型的緩沖劑包括但不限于可藥用的弱酸、弱堿或它們的混合。優(yōu)選地，緩沖組分為水溶性物質(zhì)，例如磷酸、酒石酸、乳酸、琥珀酸、檸檬酸、乙酸、抗壞血酸、天冬氨酸、谷氨酸，以及它們的鹽。載體中的基本溶劑在性質(zhì)上可以為水性的或非水性的。另外載體可以含有用于改善或維持制劑pH、滲透性、粘度、澄清度、顏色、無(wú)菌度、穩(wěn)定性、溶出速度或氣味的其他可藥用賦形劑。本發(fā)明的藥物組合物還可以含有其他可藥用的用于改善或維持本發(fā)明多肽的釋放速率的載體。這類載體為配制緩釋制劑的技術(shù)人員已知的物質(zhì)。當(dāng)本發(fā)明的藥物組合物被配制成以后，可在無(wú)菌管中以溶液、懸液、凝膠、乳劑、固體或者脫水或凍干粉末的形式儲(chǔ)存。這些制劑也可以以即用形式、以用前需要重配的凍干粉形式或以用前需要稀釋的液體形式儲(chǔ)存。優(yōu)選地，本發(fā)明的藥物組合物以單次使用的無(wú)菌管裝形式提供，并在用前一直在2-8℃儲(chǔ)存。在即將給藥前，可將本發(fā)明的藥物組合物用合適的無(wú)菌的例如任何上述的檸檬酸鹽緩沖液恰當(dāng)?shù)叵♂尅１景l(fā)明還提供了一種預(yù)防和/或治療受試者的阿爾茨海默病的方法，所述方法包括給予所述受試者有效量的本發(fā)明的多肽。術(shù)語(yǔ)“有效量”意為所使用的化合物的量足以防止疾病的發(fā)病或癥狀的出現(xiàn)，或者改善疾病或病癥的一種或多種病因或癥狀。所述改善只需減輕或改變而并不必須消除。對(duì)于本發(fā)明多肽而言，其預(yù)防和/或治療有效量應(yīng)根據(jù)所針對(duì)的個(gè)體以及所用的多肽而變化。所用的多肽的預(yù)防和/或治療有效量也應(yīng)根據(jù)個(gè)體的年齡、身材、體重、狀況等而變化。針對(duì)具體受試者，確定本發(fā)明多肽的預(yù)防和/或治療有效量是在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍之內(nèi)的。將本發(fā)明的多肽或本發(fā)明的預(yù)防和/或治療方法應(yīng)用于阿爾茨海默病受試者時(shí)，具有顯著抑制受試者腦組織內(nèi)Aβ聚集，減少淀粉樣斑塊的數(shù)量和面積，改善阿爾茨海默病癥狀的效果。例如可以提高活動(dòng)力和注意力并減少反應(yīng)時(shí)間，可以改善發(fā)音、面部表情、體態(tài)、嗅覺(jué)、性欲、性功能和情緒狀況并使精神狀態(tài)愉快。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，可以適當(dāng)?shù)貙?duì)例如阿爾茨海默病患者給予本發(fā)明的多肽作為認(rèn)知增進(jìn)劑，從而提高特別是被癡呆損害的學(xué)習(xí)能力或者抑制認(rèn)知衰退和/或癡呆。本發(fā)明的多肽的制備本發(fā)明的多肽可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何制備多肽的方法來(lái)制備。可以使用化學(xué)合成法合成本發(fā)明的多肽。多肽的合成可以在溶液中進(jìn)行，也可以使用固相合成法。多肽的固相合成方法包括Fmoc固相合成法和tBoc固相合成法。人工合成多肽的方法一般從C端（羧基端）向N端（氨基端）合成。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，采用Fmoc固相合成法合成本發(fā)明的多肽，并通過(guò)HPLC進(jìn)行純化。圖1顯示了在這個(gè)實(shí)施方案中合成和純化本發(fā)明的多肽HPYD的主要步驟和所制備多肽的檢測(cè)結(jié)果。在這個(gè)實(shí)施方案中，使用多肽固態(tài)合成儀在合成柱上合成多肽，從而大大減輕了產(chǎn)品提純的難度。為了防止副反應(yīng)的發(fā)生，合成柱和添加氨基酸的側(cè)鏈?zhǔn)潜槐Ｗo(hù)的。羧基端是游離的，并且在反應(yīng)之前必須活化。本發(fā)明的多肽在采用Fmoc法合成和采用制備高效液相（HPLC）柱純化后，可以使用質(zhì)譜（MS）分析來(lái)鑒定。應(yīng)當(dāng)理解的是，所有本發(fā)明的多肽均可用與上述實(shí)施方案類似的合成方法來(lái)制備、純化和鑒定。也可以通過(guò)重組基因工程的方法生產(chǎn)本發(fā)明的多肽。簡(jiǎn)而言之，可以合成編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸，然后將其用本領(lǐng)域已知的方法轉(zhuǎn)化至合適的宿主細(xì)胞中并使其被表達(dá)，對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行純化或處理即可得到本發(fā)明的多肽。實(shí)施例下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。以下實(shí)施例是為了使本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能夠更好地理解本發(fā)明，這僅僅出于示例性目的，并非意在限制本發(fā)明的范圍。已經(jīng)努力確保有關(guān)數(shù)字(如數(shù)量、溫度等)的準(zhǔn)確性，但應(yīng)該考慮到會(huì)存在一些誤差和偏差。除非另有說(shuō)明，份數(shù)為重量份數(shù)，溫度以℃為單位或者為環(huán)境溫度，壓力接近或等于大氣壓。實(shí)施例1：HPYD的制備在本實(shí)施例中，使用Fmoc/tBu固相合成法合成了本發(fā)明的多肽HPYD，所述多肽的序列為:His-Lys-Gln-Leu-Pro-Phe-Tyr-Glu-Glu-Asp（SEQIDNO:1）本實(shí)施例的多肽合成方法中所用的原料為Fmoc-Asp(OtBu)-CTC樹(shù)脂、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Gln(trt)-OH和Fmoc-Lys(Boc)-OH。HPYD合成和純化方法的主要步驟如圖1A所示。圖1A所示的實(shí)驗(yàn)方案中所用的TFA試劑為T(mén)FA:CH2Cl2(v/v)=2:98。將制備得到的肽粗產(chǎn)品通過(guò)HPLC純化，使最后獲得的肽的純度大于95%，HPLC的結(jié)果示于圖1B。將通過(guò)上述方法制備和純化的多肽HPYD使用質(zhì)譜分析鑒定并測(cè)序，質(zhì)譜分析的結(jié)果示于圖1C。鑒定和測(cè)序的結(jié)果顯示，用上述方法制備的多肽序列和分子量與預(yù)期相符。實(shí)施例2：HPYD對(duì)Aβ1-42聚集和纖維形成的抑制作用1材料與方法1.1藥品與試劑Aβ1-42（純度＞98%）、硫磺素T（ThioflavinT,ThT）、PBS緩沖粉末均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；β片層阻斷肽H102、HPYD采用實(shí)施例1所述方法合成，高效液相色譜法（highperformanceliquidchromatography,HPLC）純化，經(jīng)質(zhì)譜儀（massspectrometer,MS）分析鑒定純度均＞95%。1.2ThT熒光分光法分析HPYD抑制Aβ聚集作用ThT熒光強(qiáng)度可以反映Aβ的聚集程度。將Aβ1-42凍干粉用pH7.4的PBS磷酸鹽緩沖溶液50mmol/L配制成濃度為22.15μmol/L的溶液，H102及HPYD分別用同樣PBS液配制成濃度為88.60μmol/L的溶液。實(shí)驗(yàn)中將Aβ1-42與H102及HPYD分別等體積混合，終濃度分別為11.07μmol/L和44.3μmol/L。將上述兩組溶液在37℃孵育24h后，每組取10μL與3.0μmol/L的ThTPBS液990μL迅速混勻，用VARIANPTC-Au00-01058熒光分光光度儀在激發(fā)波長(zhǎng)453nm、發(fā)射波長(zhǎng)478-486nm測(cè)定其ThT熒光強(qiáng)度。1.3FT-IR光譜法觀察HPYD對(duì)Aβ1-42聚集的抑制作用采用1.2的方法配制22.15μmol/LAβ1-42的PBS磷酸緩沖溶液四份，將其中兩份溶液分別加等體積的PBS磷酸緩沖溶液在37℃下單獨(dú)孵育30min（30min老化組）和72h（72h老化組）；其余兩份溶液分別加入等體積的H102（88.60μmol/L）及HPYD（88.60μmol/L）在37℃下共同孵育72h，將孵育后各樣品真空冷凍干燥處理。取出冷凍干燥處理后的H1023.5μg、HPYD3.7μg分別與無(wú)水溴化鉀(120～180mg)充分混合，壓片機(jī)加壓5min形成溴化鉀壓片，用Nico1etMagna760FT-IR儀對(duì)其進(jìn)行測(cè)量和分析，分辨率為4cm-1光譜觀察范圍為3500～400cm-1。采用Origin8.0軟件對(duì)1700～1600cm-1的酰胺I譜帶譜進(jìn)行分析。由于樣品成分的復(fù)雜性及酰胺I帶附近的振動(dòng)峰對(duì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響，擴(kuò)大擬合范圍到1750～1550cm-1。1.4HPYD抑制Aβ聚集的電鏡觀察采用1.2的方法配制Aβ1-42的PBS磷酸緩沖溶液(11.07μmol/L20μl)，將該溶液在37℃下單獨(dú)孵育5d。同時(shí)，Aβ1-42(22.15μmol/L,10μl)分別與H102及HPYD(88.61μmol/L，10μl)在相同條件下共同孵育5d。取每組樣本各5μl，滴于含碳支持膜300目去離子銅網(wǎng)上，室溫靜置15min。2%醋酸雙氧鈾避光負(fù)染2min。干燥后透射電鏡觀察。上述研究均以Aβ1-42作為陰性對(duì)照，以H102為陽(yáng)性對(duì)照。2.實(shí)驗(yàn)結(jié)果2.1ThT熒光法分析藥物對(duì)Aβ1-42聚集和纖維形成的影響Aβ1-42在PBS溶液中能形成非常高的熒光強(qiáng)度，表明Aβ1-42能自我聚集和形成Aβ纖維。以老化組（Aβ1-42凍干粉用pH7.4的PBS磷酸鹽緩沖溶液50mmol/L配制成濃度為11.07μmol/L溶液，將該溶液在37℃下孵育24小時(shí)，即為老化組）去本底熒光強(qiáng)度為100%，計(jì)算各組藥物對(duì)Aβ1-42抑制率(%)。結(jié)果如表1所示，HPYD對(duì)Aβ1-42的抑制率比H102高。表1HPYD對(duì)Aβ1-42聚集的抑制作用與Aβ1-42組比較，經(jīng)F檢驗(yàn)：*P＜0.05抑制率=(1-β片層阻斷肽的相對(duì)熒光強(qiáng)度/Aβ1-42的相對(duì)熒光強(qiáng)度)x100%2.2FT-IR光譜法觀察HPYD對(duì)Aβ1-42聚集的抑制作用Aβ1-42的二級(jí)結(jié)構(gòu)成分主要包括自由卷曲、α-螺旋、β-折疊片(伸展結(jié)構(gòu))和β-轉(zhuǎn)角。圖2顯示，在代表β-折疊片的波數(shù)（1640～1620cm-1）中，各組曲線的最大負(fù)峰皆位于1624cm-1附近，其中，HPYD組的透過(guò)率明顯高于老化組（尤以72h老化組的透過(guò)率為最低）。HPYD組中的β-折疊片含量最低；β-折疊片的含量隨孵育時(shí)間的延長(zhǎng)而升高；HPYD組與H102組在代表其二級(jí)結(jié)構(gòu)各波數(shù)中的透過(guò)率明顯高于Aβ單獨(dú)孵育72h組。2.3HPYD抑制Aβ聚集的電鏡觀察HPYD抑制Aβ聚集的電鏡觀察見(jiàn)圖3。A：Aβ1-42單獨(dú)孵育5d，出現(xiàn)大量Aβ纖維，呈芒刺式晶狀聚集，有分枝，且大片交織成深染、密集的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，其間夾雜著少量呈聚集狀態(tài)的無(wú)定形結(jié)構(gòu)；B：H102與Aβ1-42共同孵育5d，Aβ纖維減少明顯，呈芒刺式晶狀聚集，有分枝，交織成網(wǎng)狀，其間可見(jiàn)呈聚集狀態(tài)的無(wú)定形結(jié)構(gòu)；C：HPYD與Aβ1-42共同孵育5d，Aβ纖維形成明顯減少且直徑變細(xì)，染色變淺，交織成網(wǎng)狀，其間夾雜著極少量呈聚集狀態(tài)的無(wú)定形結(jié)構(gòu)。電鏡的結(jié)果顯示HPYD抗Aβ聚集作用比H102更強(qiáng)。結(jié)論HPYD可抑制Aβ的聚集和纖維形成。實(shí)施例3.HPYD對(duì)APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)Aβ和APP表達(dá)的影響1材料與方法1.1動(dòng)物APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠14只隨機(jī)分為模型組和給藥組，同月齡同背景的C57BL/6J小鼠7只設(shè)為正常對(duì)照組。均購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)試驗(yàn)動(dòng)物研究中心。采用鼻腔給藥方法，給藥組用自制給藥器給予33mg/ml的HPYD生理鹽水溶液5μl/d，正常對(duì)照組和模型組鼻腔給予等體積生理鹽水。給藥30d后進(jìn)行檢測(cè)。1.2藥品與試劑：Aβ1-42抗體購(gòu)自Chemicon公司；APP抗體、即用型SABC免疫組化染色試劑盒、DAB顯色試劑盒、0.1%多聚賴氨酸購(gòu)自武漢博士德公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。1.3免疫組化染色：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物行Morris水迷宮測(cè)定小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力之后，采用0.1kg/L水合氯醛4ml/kg腹腔注射麻醉。經(jīng)左心室迅速插管，同時(shí)剪開(kāi)右心房，快速灌注0.01MPBS緩沖液，待肝臟變白后，迅速冰浴上取腦，放入4%多聚甲醛溶液中固定24h以上。待腦組織下沉后，行蠟塊包埋。行小鼠腦矢狀切面切片，待海馬CA1區(qū)出現(xiàn)后連續(xù)切片，切片厚度5μm。免疫組化染色：（1）組織切片常規(guī)脫蠟至水（2）3%H2O2室溫孵育10min，以消除內(nèi)源酶活性。（3）檸檬酸緩沖液微波沸騰進(jìn)行抗原修復(fù)，5min×2次，取出冷卻至室溫。（4）分別加入稀釋好的一抗：Aβ（1:100）、APP（1:100），滴加量為能夠覆蓋組織即可，4℃冰箱過(guò)夜。（5）根據(jù)一抗來(lái)源分別滴加相應(yīng)生物素標(biāo)記的羊抗鼠和羊抗兔通用二抗，滴加量為能夠覆蓋組織即可，37℃孵育20min。（6）滴加SABC液，滴加量為能夠覆蓋組織即可，37℃孵育20min。（7）DAB顯色劑顯色，鏡下控制染色程度，去離子水終止顯色反應(yīng)后充分沖洗。（8）梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片，于顯微鏡下觀察。陰性對(duì)照用0.01MPBS溶液替代一抗，其余步驟相同。1.4數(shù)據(jù)處理：所得數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS16.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2.結(jié)果2.1Aβ免疫組化染色Aβ免疫組化染色結(jié)果顯示正常對(duì)照組海馬CA1區(qū)及皮層神經(jīng)元胞漿著色成陰性或弱陽(yáng)性，陽(yáng)性細(xì)胞率（陽(yáng)性細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的比例）較低，模型組較正常對(duì)照組陽(yáng)性細(xì)胞增多，陽(yáng)性細(xì)胞率增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），胞漿著色明顯加深，Aβ表達(dá)增強(qiáng)。給藥組與模型組相比，胞漿著色較淺，陽(yáng)性細(xì)胞率較低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），Aβ表達(dá)較弱。給藥組與正常組相比，兩者無(wú)顯著性差異（（P>0.05））。見(jiàn)表2，圖4。表2各組小鼠皮層及海馬CA1區(qū)Aβ活性比較（n=7,與正常組相比，##P<0.01；與模型組相比，＊＊P<0.012.2APP免疫組化染色APP免疫組化染色結(jié)果顯示正常對(duì)照組海馬CA1區(qū)及皮層神經(jīng)元胞漿著色成陰性或弱陽(yáng)性，陽(yáng)性細(xì)胞率較低，模型組較正常對(duì)照組陽(yáng)性細(xì)胞增多，陽(yáng)性細(xì)胞率增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），胞漿著色明顯加深，APP表達(dá)增強(qiáng)。給藥組與模型組相比，胞漿著色較淺，陽(yáng)性細(xì)胞率較低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），APP表達(dá)較弱。給藥組與正常組相比，兩者無(wú)顯著性差異（P>0.05）。見(jiàn)表3，圖5。表3各組小鼠皮層及海馬CA1區(qū)APP活性比較（n=7,與正常組相比，##P<0.01；與模型組相比，＊＊P<0.013結(jié)論HPYD經(jīng)鼻腔給藥入腦，可降低腦內(nèi)APP及Aβ蛋白的表達(dá)。實(shí)施例4.HPYD對(duì)APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠行為學(xué)影響1材料與方法1.1動(dòng)物APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠14只隨機(jī)分為模型組和給藥組各7只，同月齡同背景的C57BL/6J小鼠7只設(shè)為正常對(duì)照組。采用鼻腔給藥方法，給藥組用自制給藥器給予33mg/ml的HPYD生理鹽水溶液5μl/d，正常對(duì)照組和模型組鼻腔給予等體積生理鹽水。給藥30d后進(jìn)行檢測(cè)。1.2Morris水迷宮測(cè)試（1）定位航行：置平臺(tái)于水迷宮第三象限中環(huán)內(nèi)，每日相同時(shí)段每只小鼠游泳2次（90s/次），歷時(shí)5d。記錄小鼠尋找并爬上平臺(tái)所需時(shí)間即逃避潛伏期。如果小鼠在90s內(nèi)未找到平臺(tái)，則將其引至平臺(tái)停留20s，逃避潛伏期記為90s。（2）空間探索：第6日撤去平臺(tái)，相同時(shí)段，任選一個(gè)入水點(diǎn)將小鼠放入水中，每只小鼠游泳1次（90s/次）。記錄小鼠在90s內(nèi)游泳軌跡、跨越隱性平臺(tái)的次數(shù)及入水后游泳初始角度等指標(biāo)測(cè)試小鼠的記憶能力。1.3數(shù)據(jù)處理所得數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS16.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，利用單因素方差分析，兩兩比較，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果2.1定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)果與正常對(duì)照組小鼠相比，模型組逃避潛伏期明顯延長(zhǎng)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。給藥組與模型組比較，逃避潛伏期時(shí)間呈下降趨勢(shì)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。給藥組與對(duì)照組的逃避潛伏期時(shí)間隨著實(shí)驗(yàn)次數(shù)的增加在總體上均呈下降趨勢(shì)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表4，圖6。表4各組小鼠每天平均逃避潛伏期變化（s,n=7,與正常組相比，##P<0.01；與模型組相比，**P<0.012.2空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果各組小鼠跨越隱性平臺(tái)的次數(shù)及朝向角的比較模型組與正常對(duì)照組相比小鼠跨越隱性平臺(tái)的次數(shù)明顯減少、朝向角（小鼠入水時(shí)游向與入水點(diǎn)跟平臺(tái)連線的夾角）明顯增大，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。給藥組與模型組比較小鼠跨越隱性平臺(tái)的次數(shù)增多、朝向角較小，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。給藥組與正常對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹥0.05）。見(jiàn)表5，圖7、8。表5各組小鼠空間探索實(shí)驗(yàn)中穿越隱性平臺(tái)的次數(shù)及初始角比較(n=7,與正常組相比，##P<0.01；與模型組相比，＊＊P<0.01結(jié)論HPYD鼻腔給藥后經(jīng)嗅路入腦，可以顯著提高AD模型小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。在本申請(qǐng)中，引用了多種出版物。所提及的出版物通過(guò)引用的方式全文納入本說(shuō)明書(shū)中，以便更加詳盡的敘述本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的情況。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見(jiàn)的是，只要不背離本發(fā)明的范圍和精神，可對(duì)本發(fā)明進(jìn)行各種修改和變動(dòng)。通過(guò)考慮本發(fā)明在此所公開(kāi)的說(shuō)明書(shū)和實(shí)例，本發(fā)明的其他實(shí)施方案對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的。本說(shuō)明書(shū)和實(shí)施例僅作示例性用途，本發(fā)明真正的范圍和精神在所附的權(quán)利要求書(shū)中說(shuō)明。