本發(fā)明屬生物制藥領域，涉及bk通道蛋白在制備成骨細胞干預藥物中的用途，尤其是bk通道蛋白在制備成骨細胞增殖分化異常干預藥物中的用途。

背景技術：

現(xiàn)有技術公開了bk通道蛋白大電導鈣激活鉀通道(bk)，又名maxik/kca1.1通道，由kcnma1基因編碼并在大多數(shù)細胞和組織中廣泛表達；bk通道蛋白的獨特之處在于它可以通過膜電壓和局部細胞內鈣來調節(jié)。關于bk通道蛋白在興奮性細胞中的研究已有很多，而其在非興奮性組織如骨細胞、腫瘤細胞和免疫細胞中的作用鮮有報道。bk通道存在于人骨肉瘤細胞(mg-63、saos-2和g292細胞)和成骨前體細胞(c1細胞)。有研究表明，非特異性鉀抑制劑四乙胺(tea)在低濃度下會增加細胞數(shù)量而在高濃度下會減少細胞數(shù)量；更重要的是，bk基因敲除的小鼠呈現(xiàn)骨質疏松，長骨密度減少，小梁孔隙增大，這表明了在骨細胞中bk通道的重要作用。然而，成骨細胞中bk通道的作用尚不清楚。雖然zhang發(fā)現(xiàn)了骨髓間充質干細胞中由shrna敲除kcnma1基因會抑制細胞增殖與成骨，但是rna干擾介導的敲除是不完整的，只減弱基因功能。理想的基因分析方法是通過遺傳密碼(敲除)的改變來徹底消除基因功能。

zfn(鋅指核酸酶)的出現(xiàn)，talen(轉錄激活因子樣效應物核酸酶)和規(guī)律成簇間隔短回文重復(crispr)-casenzymes技術近年來在真核細胞和實驗動物的目標基因組修飾中廣泛應用，tale在植物病原菌xanthomonassp中被發(fā)現(xiàn)，talen由tale蛋白及foki核酸酶融合構建而成。tale蛋白有重復可變的雙氨基酸殘基(rvd)，這決定了核苷酸結合的特異性(ni＝a，hd＝c，ng＝t，nn＝g或a)；通過組裝不同的tale模塊，研究人員可以針對任何核苷酸序列和控制內源性基因的表達。此外，foki核酸酶結構域融合c-末端兩對合成tales可以提供有效的dna序列特異性核酸內切酶活性。正常情況下，可識別目標區(qū)域左右兩臂的兩個talen形成一個功能性foki二聚體，并導致目標區(qū)域內的dna雙鏈斷裂(dsb)，引起非同源末端連接修復或同源重組 修復，從而導致核苷酸的不匹配，插入，或缺失，和功能性基因敲除的引入。

基于現(xiàn)有技術有關成骨細胞在骨形成和骨相關疾病的潛在作用研究的基礎，本申請的發(fā)明人擬提供在成骨細胞中的bk通道蛋白的的作用，尤其涉及bk通道蛋白在用于制備成骨細胞增殖分化異常干預藥物中的用途。

與本發(fā)明有關的現(xiàn)有技術有：

1.bentzen,b.h.,olesen,s.p.,ronn,l.c.andgrunnet,m.(2014)bkchannelactivatorsandtheirtherapeuticperspectives.frontiersinphysiology5,389.

2.chen,j.,zhang,w.,lin,j.,wang,f.,wu,m.,chen,c.,zheng,y.,peng,x.,li,j.andyuan,z.(2014)anefficientantiviralstrategyfortargetinghepatitisbvirusgenomeusingtranscriptionactivator-likeeffectornucleases.moleculartherapy:thejournaloftheamericansocietyofgenetherapy22,303-311.

3.ding,q.,lee,y.k.,schaefer,e.a.,peters,d.t.,veres,a.,kim,k.,kuperwasser,n.,motola,d.l.,meissner,t.b.,hendriks,w.t.,etal.(2013)atalengenome-editingsystemforgeneratinghumanstemcell-baseddiseasemodels.cellstemcell12,238-251.

4.zhang,y.y.,yue,j.,che,h.,sun,h.y.,tse,h.f.andli,g.r.(2014)bkcaandheag1channelsregulatecellproliferationanddifferentiationinhumanbonemarrow-derivedmesenchymalstemcells.journalofcellularphysiology229,202-212.

5.zhaowang,j.l.,huanghuang,ganchengwang,mingjunjiang,shenyiyin,changhongsun,,hanshuozhang,fengfengzhuang,jianzhongjeffxi(2012)anintegratedchipforthehigh-throughputsynthesisoftranscriptionactivator-likeeffectors.angewcheminted51,,8505-8508.。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供bk通道蛋白在制備成骨細胞干預藥物中的用途，尤其是bk通道蛋白在制備成骨細胞增殖分化異常干預藥物中的用途。

基于bk參與若干重要的生理功能，如神經興奮組織、心臟和肌肉，而在骨組織中，成骨細胞bk通道報道鮮見。本發(fā)明建立了大電導鈣激活鉀通道(又稱bk通道蛋白或bk通道)敲除和成骨細胞表型與降低成骨細胞的功能的聯(lián)系模型，利用該模型模擬成骨細胞的病理狀態(tài)以及進行成骨細胞在骨相關疾病中功能的研究；使用轉錄激活因子樣 效應核酸酶(talen)技術對大鼠ros17/2.8成骨細胞bk通道進行敲除，并檢測bk敲除細胞系額增殖礦化，觀察成骨細胞bk通道的作用，實驗結果顯示，bk敲除克隆后增殖和礦化明顯下降，成骨細胞分化標志基因的總體表達明顯低于野生型成骨細胞。

本發(fā)明設計了在大鼠成骨細胞ros17/28上kcnma1(nm_031828)基因靶向的talens，并成功地建立了bk敲除細胞系；該敲除細胞系呈現(xiàn)了與野生型細胞相比較低的增殖和分化能力，結果表明，bk通道是調節(jié)成骨細胞增殖與骨相關疾病的治療的重要靶點，所述的bk通道可用于制備成骨細胞干預藥物，尤其可用于制備成骨細胞增殖分化異常干預藥物。

本發(fā)明中，bk敲除細胞可作為成骨細胞功能研究的工具。

本發(fā)明中，進行了包括以下步驟的實驗：

(1)細胞培養(yǎng)與試劑；

(2)talens的設計和構建；

(3)pcr擴增與dna序列分析序列；

(4)基因敲除克隆的建立；

(5)mrna表達的分析；

(6)免疫熒光染色；

(7)礦化；

(8)茜素紅s染色；

(9)cck8測定；

(10)統(tǒng)計分析。

實驗結果顯示：

(1)bk敲除克隆在ros17/2.8細胞系的構建

為了在ros17/2.8細胞建立bk基因克隆，本申請實驗中將talens轉入ros17/2.8并加入嘌呤霉素進行藥篩，剩余的細胞被稀釋成單細胞培養(yǎng)，在96孔板生長成單克隆；kcnma1基因敲除克隆用免疫熒光顯微鏡和dna序列進行篩選；基因測序顯示在靶點位置之間和之后有重疊峰出現(xiàn)，表明talen靶向成功；免疫熒光分析顯示bk蛋白在所有克隆完全消失；

(2)bk基因敲除對ros17/28細胞增殖分化的影響

采用cck-8細胞增殖實驗研究kcnma1基因敲除對ros17/2.8細胞增殖的影響， 結果顯示，ko細胞群增殖率明顯低于野生型細胞群(如圖1所示)；

通過比較野生型和基因克隆礦化結節(jié)形成研究成骨細胞的分化，結果表明(如圖2所示)ros17/2.8細胞bk敲除后的礦化能力顯著下降；繼續(xù)進行成骨轉錄因子和成骨細胞分化的標記的表達實驗，包括runx2的表達骨鈣素(ocn)、骨橋蛋白(opn)，運用實時熒光定量rt-pcr方法分析在ros17/2.8細胞kcnma1基因敲除，結果顯示，runx2的mrna的表達，ocn和opn與野生型相比顯著減少，表明成骨細胞的分化能力下降。

實驗結果表明，bk通道可作為調節(jié)成骨細胞增殖與骨相關疾病的治療的重要靶點，所述的bk通道可用于制備成骨細胞干預藥物，尤其可用于制備成骨細胞增殖分化異常干預藥物。

附圖說明

圖1：ros17/2.8細胞系bk敲除克隆的建立，其中，

a)脫氧核糖核酸序列圖，重疊峰顯示在靶點位置之間和之后；

b)免疫熒光染色，野生型(wt)和kcnma1基因(ko)的bk敲除克隆，刻度尺＝5μ。

圖2:kcnma1基因對成骨細胞分化的影響，其中，

a)在kcnma1基因敲除細胞和野生型細胞礦化結節(jié)形成，細胞在培養(yǎng)10天之后，礦化茜素紅s染色；

b)在kcnma1基因敲除細胞和野生型細胞的成骨細胞標志物mrna的表達，成骨轉錄因子mrna的表達(runx2)、成骨細胞標志物(骨鈣素(ocn)、骨橋蛋白(opn))的實時rt-pcr分析，平均±標準差，n＝3，p＜0.05。

具體實施方式

實施例1

1、材料和方法

(1)細胞培養(yǎng)與試劑

ros17/2.8細胞(johnshopkins)，細胞在ham’sf-12營養(yǎng)混合物培養(yǎng)基(sigmaadrich) 中培養(yǎng)，其中含有碳酸氫鈉，輔以10％胎牛e血清(fbs、gibco)處于5％的二氧化碳和95％的空氣的培養(yǎng)箱中，每兩天傳代培養(yǎng)，在密度達到90％時，細胞用胰蛋白酶-edta消化并接種于6孔培養(yǎng)板；

大鼠抗bk多克隆抗體(ap107)均alomone，e.z.n.a.plasmidminikit購自yeasen生物(上海)；基因組dna提取試劑盒購自tiangen生物(上海)；

(2)talens的設計和構建

talen按由sidansai生物技術運用fasttaletm組裝的試劑盒的詳細說明構建(sidansai，中國)，kcnma1靶向的talen左臂和右臂在網(wǎng)站(https://tale-nt.cac.cornell.edu/)設計，聚合酶鏈式反應(pcr)擴增進行聚集talen，選取各臂的12個克隆并用e.z.n.a.plasmidminikit提取talen質粒，純化的質粒用psti和bamhi酶切并由sangonbiotech測序(上海)；

(3)pcr擴增與dna序列分析序列

基因組dna提取試劑盒提取基因組dna，進行pcr擴增，

正向引物為5’-atatccacgcgaaccatctcagcct-3’，

反向引物5’-ggccgtagccaccaataaccctaca-3’，

pcr擴增在cfx96-pcr儀(bio-rad實驗室hercules，ca)運行，95℃下，初始激活為30秒，42次循環(huán)變性(95°，5秒)，退火(60℃，34秒)，延伸(72℃，30秒)；pcr產物由sangonbiotech(上海)分析；

(4)建立基因敲除克隆

為了構建bk敲除克隆，將talen質粒轉染至ros17/2.8細胞上，然后從轉染后的第二天起用4μg/ml嘌呤霉素給藥3天，藥篩后其余的克隆細胞恢復成長1周，形成單個的細胞克隆團；細胞克隆團通過免疫熒光染色和dna序列分析篩選建立kcnma1基因敲除的細胞系；

(5)免疫熒光染色

bk敲除克隆和野生型細胞均接種在細胞皿中，70％匯合程度時，細胞用4％多聚甲醛固定15分鐘，pbs沖洗后，細胞yong0.1％的tritonx-100透析10分鐘，3％牛血清白蛋白(bsa)室溫p封閉1小時，bk蛋白抗體(1:200，abcam，英國)4℃徹夜培養(yǎng)，熒光二抗alexafluor647抗體(jacksonimmunoresearch，美國)室溫條件下孵育1小時，使用leicatcssp5共聚焦系統(tǒng)聚焦顯微鏡(leica，wetzlar，德國)捕捉圖像；

(6)礦化

ros17/2.8細胞接種于48孔板。密度達到90％左右后，將β-甘油磷酸鈉(10mm)和l-抗壞血酸磷酸酯(50μg/ml)添加到培養(yǎng)基中作為礦化培養(yǎng)基，礦化培養(yǎng)基每三天更換一次，10天后，細胞用pbs洗兩次準備茜素紅染色；

(7)茜素紅s染色μ

細胞用4％多聚甲醛處理，室溫下固定10min，再用pbs輕柔地洗滌三次，每皿添加500μl0.1％茜素紅s(yeasen，上海)室溫染色15min；染料吸除后，細胞用蒸餾水500μl洗三次并振蕩5min；

(8)cck8測定

bk基因敲除細胞接種于濃度為2000細胞/孔板的96孔板，在接種之后第2，3，4，5，7和9天，加入10μlcck8溶液，37℃培養(yǎng)2小時，用酶標儀(tecaninfinitem200pro，瑞士)波長450nm處測定吸光度；

bk敲除克隆在ros17/2.8細胞系的構建結果顯示，為了在ros17/2.8細胞建立bk基因克隆，將talens轉入ros17/2.8并加入嘌呤霉素進行藥篩，剩余的細胞被稀釋成單細胞培養(yǎng)，在96孔板生長成單克??；kcnma1基因敲除克隆用免疫熒光顯微鏡和dna序列進行篩選，基因測序顯示在靶點位置之間和之后有重疊峰出現(xiàn)，表明talen靶向成功；免疫熒光分析顯示bk蛋白在所有克隆完全消失；

bk基因敲除對ros17/28細胞增殖分化的影響結果顯示，采用cck-8細胞增殖實驗證實kcnma1基因敲除對ros17/2.8細胞增殖有影響，ko細胞群增殖率明顯低于野生型細胞群(如圖1所示)；通過比較野生型和基因克隆礦化結節(jié)形成研究成骨細胞的分化，結果如圖2所示，ros17/2.8細胞bk敲除后的礦化能力顯著下降；進一步研究成骨轉錄因子和成骨細胞分化的標記的表達，包括runx2的表達骨鈣素(ocn)、骨橋蛋白(opn)，運用實時熒光定量rt-pcr方法分析在ros17/2.8細胞kcnma1基因敲除，結果顯示，runx2的mrna的表達，ocn和opn與野生型相比顯著減少，表明成骨細胞的分化能力下降。