本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及一種檢測(cè)kras基因4號(hào)外顯子117號(hào)和146號(hào)密碼子突變的引物對(duì)、試劑盒及方法。
背景技術(shù)：
：kras基因是一種原癌基因，長(zhǎng)約35kb，位于12號(hào)染色體，是ras基因家族成員之一，編碼kras蛋白。它是egfr信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路一個(gè)重要的下游調(diào)控基因，kras基因發(fā)生突變時(shí)無(wú)需egfr接受信號(hào)，能夠自動(dòng)活化該通路并啟動(dòng)下游的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)紊亂，細(xì)胞增殖失控。隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的快速發(fā)展，分子靶向藥物的個(gè)體化治療得到廣泛應(yīng)用。2008年，美國(guó)國(guó)家癌癥綜合治療聯(lián)盟(nccn)在《結(jié)直腸癌臨床實(shí)踐指南》中首次提出egfr靶向藥物療效與kras基因狀態(tài)密切相關(guān)。2011年，nccn在《結(jié)直腸癌臨床實(shí)踐指南》(v3.2011)明確指出：(1)所有轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者都應(yīng)檢測(cè)kras基因狀態(tài)；(2)只有kras基因野生型患者才建議接受egfr抑制劑(如西妥昔單抗和帕尼單抗)的治療。2015年，nccn對(duì)《結(jié)直腸癌臨床實(shí)踐指南》(v2.2015)做了更新：檢測(cè)kras基因狀態(tài)，包括kras外顯子2和外顯子3，4以及nras基因的外顯子2，3和4，此外，還需檢測(cè)braf基因狀態(tài)，無(wú)論是否有kras突變。kras基因的4號(hào)外顯子117號(hào)和146號(hào)作為熱點(diǎn)突變位點(diǎn)，越來(lái)越多臨床實(shí)驗(yàn)室開始開展該項(xiàng)目檢測(cè)。目前較常用的方法包括：測(cè)序法、基于探針的熒光定量pcr法等。測(cè)序法因?yàn)榭梢宰x出dna每個(gè)堿基的變化，目前被認(rèn)為是 檢測(cè)基因突變的金標(biāo)準(zhǔn)方法，但因?yàn)殪`敏度低，測(cè)序步驟繁瑣、耗時(shí)長(zhǎng)，對(duì)設(shè)備和操作人員的要求較高，不易于形成標(biāo)準(zhǔn)化操作的分子診斷產(chǎn)品?；谔结樀臒晒舛縫cr法檢測(cè)基因突變是通過(guò)已知的特異性探針實(shí)現(xiàn)的，該方法靈敏度高、特異性好，目前已有基于該方法的檢測(cè)kras基因突變的商品化試劑盒，但該方法針對(duì)于kras基因4號(hào)外顯子117號(hào)和146號(hào)密碼子上發(fā)生的稀有突變類型，則檢測(cè)不出來(lái)，且檢測(cè)試劑成本高。因此，有必要提供一種改進(jìn)的方法以實(shí)現(xiàn)kras基因的4號(hào)外顯子117號(hào)和146號(hào)密碼子突變狀態(tài)的快速、準(zhǔn)確且廉價(jià)的檢測(cè)方法。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：基于此，為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，本發(fā)明提供了一種針對(duì)檢測(cè)kras基因的4號(hào)外顯子117號(hào)和146號(hào)密碼子突變的引物對(duì)、試劑盒及hrm檢測(cè)方法。為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采取了以下技術(shù)方案：一種檢測(cè)kras基因4號(hào)外顯子密碼子突變的引物對(duì)，所述引物對(duì)為：針對(duì)117號(hào)密碼子突變檢測(cè)的seqidno:1和seqidno:2，和/或針對(duì)146號(hào)密碼子突變檢測(cè)的seqidno:3和seqidno:4。本發(fā)明還提供了一種檢測(cè)kras基因4號(hào)外顯子密碼子突變的試劑盒，所述試劑盒包括針對(duì)117號(hào)密碼子突變檢測(cè)的如seqidno:1和seqidno:2所示的引物對(duì)、和/或針對(duì)146號(hào)密碼子突變檢測(cè)如seqidno:3和seqidno:4所示的引物對(duì)。在其中一些實(shí)施例中，所述檢測(cè)試劑盒還包括飽和熒光染料。在其中一些實(shí)施例中，所述飽和熒光染料為evagreen。在其中一些實(shí)施例中，所述檢測(cè)試劑盒還包括buffer、dntp和taq酶。本發(fā)明還提供了一種檢測(cè)kras基因4號(hào)外顯子密碼子突變的反應(yīng)體系，所述反應(yīng)體系包括針對(duì)117號(hào)密碼子突變檢測(cè)的如seqidno:1和seqidno:2所示的引物對(duì)、和/或針對(duì)146號(hào)密碼子突變檢測(cè)的如seqidno:3和seqidno:4所示的引物對(duì)。在其中一些實(shí)施例中，所述反應(yīng)體系還包括evagreen、dntp和taq酶。在其中一些實(shí)施例中，針對(duì)117號(hào)密碼子突變檢測(cè)的反應(yīng)體系為：dna模板1-5μl、10×buffer2-2.5μl、dntp2-2.5μl、evagreen1-1.25μl、mg2+0.8-1.5μl、seqidno:1引物0.6-1μl、seqidno:2引物0.6-1μl、taq酶0.25-0.4μl、無(wú)酶水加至20-25μl；針對(duì)146號(hào)密碼子突變檢測(cè)的反應(yīng)體系為：dna模板1-5μl、10×buffer2-2.5μl、dntp2-2.5μl、evagreen1-1.25μl、mg2+0.8-1.5μl、seqidno:3引物0.6-1μl、seqidno:4引物0.6-1μl、taq酶0.25-0.4μl、無(wú)酶水加至20-25μl。本發(fā)明還提供了一種檢測(cè)kras基因4號(hào)外顯子密碼子突變的方法，包括以下步驟：(1)、以待檢測(cè)樣品的dna作為模板，采用針對(duì)117號(hào)密碼子突變檢測(cè)的如seqidno:1和seqidno:2所示的引物對(duì)、和/或針對(duì)146號(hào)密碼子突變檢測(cè)的如seqidno:3和seqidno:4所示的引物對(duì)分別進(jìn)行熒光定量pcr反應(yīng)及hrm分析，收集熒光信號(hào)；(2)、判讀待檢測(cè)樣品的熔解曲線，若待檢測(cè)樣品的針對(duì)117號(hào)密碼子突變的熔解曲線中顯示出兩個(gè)及以上的熔解峰，則表示該患者的117號(hào)密碼子存在突變，如只顯示一個(gè)熔解峰，則表示該患者的117號(hào)密碼子為野生型。同理，若待檢測(cè)樣品的針對(duì)146號(hào)密碼子突變的熔解曲線中顯示出兩個(gè)及以上的熔解 峰，則表示該患者的146號(hào)密碼子存在突變，如只顯示一個(gè)熔解峰，則表示該患者的146號(hào)密碼子為野生型。在其中一些實(shí)施例中，步驟(1)針對(duì)117號(hào)密碼子突變檢測(cè)的熒光定量pcr的反應(yīng)體系為：dna模板1-5μl、10×buffer2-2.5μl、dntp2-2.5μl、evagreen1-1.25μl、mg2+0.8-1.5μl、seqidno:1引物0.6-1μl、seqidno:2引物0.6-1μl、taq酶0.25-0.4μl、無(wú)酶水加至20-25μl；針對(duì)146號(hào)密碼子突變檢測(cè)的熒光定量pcr的反應(yīng)體系為：dna模板1-5μl、10×buffer2-2.5μl、dntp2-2.5μl、evagreen1-1.25μl、mg2+0.8-1.5μl、seqidno:3引物0.6-1μl、seqidno:4引物0.6-1μl、taq酶0.25-0.4μl、無(wú)酶水加至20-25μl。在其中一些實(shí)施例中，步驟(1)所述熒光定量pcr的反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃5min→95℃10s、62℃15s、72℃25s，40cycles→95℃1min→40℃1min→熔解溫度72-83℃，溫度每升高1℃，獲取15次熒光信號(hào)→40℃10s。在其中一些實(shí)施例中，步驟(1)所述模板的濃度為50-100ng/μl。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：1、本發(fā)明的發(fā)明人經(jīng)過(guò)多次探索發(fā)現(xiàn)，采用本發(fā)明的試劑盒進(jìn)行kras基因4號(hào)外顯子117和146號(hào)密碼子hrm法檢測(cè)，可檢測(cè)出低至5％的突變分子，可以檢測(cè)kras基因4號(hào)外顯子117和146號(hào)密碼子上的所有突變類型，不受突變堿基位點(diǎn)與類型局限；與sanger測(cè)序法(金標(biāo)準(zhǔn)方法)結(jié)果相比，結(jié)果一致率為99.84％(657/658)；唯一1例不符的樣品經(jīng)廈門艾德kras基因19種突變檢測(cè)試劑盒檢測(cè)，其結(jié)果與本發(fā)明方法的結(jié)果相符。說(shuō)明該例標(biāo)本實(shí)際上是屬于低豐度突變，金標(biāo)準(zhǔn)sanger測(cè)序法由于檢測(cè)靈敏度低不能檢出，而本發(fā)明的靈敏度高，針對(duì)低豐度突變的樣品也可檢出。另有1例樣品的dna質(zhì)量差，測(cè)序法無(wú)法獲得檢測(cè)結(jié)果，但利用本發(fā)明方法，可以獲得檢測(cè)結(jié)果，并與廈門 艾德kras基因19種突變檢測(cè)試劑盒檢測(cè)結(jié)果一致。說(shuō)明本發(fā)明方法對(duì)樣本dna的質(zhì)量要求低，適用性廣。同時(shí)，本發(fā)明方法對(duì)設(shè)備的要求也大大降低，無(wú)需使用測(cè)序儀，只需一臺(tái)帶有hrm功能的熒光定量pcr儀即可，適用范圍更廣，儀器成本更低；2、本發(fā)明的檢測(cè)方法操作程序大大簡(jiǎn)化，全程閉管操作，避免交叉污染，易形成標(biāo)準(zhǔn)化操作的體外診斷試劑產(chǎn)品，且檢測(cè)時(shí)間和試劑成本大大降低，60-90分鐘內(nèi)即可完成檢測(cè)。附圖說(shuō)明圖1為樣本中含有kras基因4號(hào)外顯子117號(hào)密碼子aaa>aat突變的hrm分析圖；圖2為樣本中不含kras基因4號(hào)外顯子117號(hào)密碼子aaa>aat突變的hrm分析圖；圖3為樣本中含有kras基因4號(hào)外顯子146號(hào)密碼子gca>cca突變的hrm分析圖；圖4為樣本中不含kras基因4號(hào)外顯子146號(hào)密碼子gca>cca突變的hrm分析圖；圖5為不同突變比例的kras基因4號(hào)外顯子117號(hào)k117n(aaa>aac)突變標(biāo)準(zhǔn)品1的hrm分析圖；其中，a為25％突變標(biāo)準(zhǔn)品1，b為10％突變標(biāo)準(zhǔn)品1，c為5％突變標(biāo)準(zhǔn)品1，d為0％突變標(biāo)準(zhǔn)品1；圖6為不同突變比例的kras基因4號(hào)外顯子146號(hào)a146v(gca>gta)突變標(biāo)準(zhǔn)品2的hrm分析圖；其中，a為25％突變標(biāo)準(zhǔn)品2，b為10％突變標(biāo)準(zhǔn)品2，c為5％突變標(biāo)準(zhǔn)品2，d為0％突變標(biāo)準(zhǔn)品2；圖7為采用不同引物，使用本發(fā)明所述hrm檢測(cè)方法檢測(cè)kras基因4號(hào)外顯子117號(hào)密碼子突變的擴(kuò)增曲線，其中，使用引物對(duì)1擴(kuò)增效果良好，可以正確分辨出突變型樣品；使用引物對(duì)3、4無(wú)法檢測(cè)突變型標(biāo)本；使用引物對(duì)5、6效果差；圖8為采用不同引物，使用本發(fā)明所述hrm檢測(cè)方法檢測(cè)kras基因4號(hào)外顯子146號(hào)密碼子突變的擴(kuò)增曲線，其中，使用引物對(duì)2擴(kuò)增效果良好，可以正確分辨出突變型樣品；使用引物對(duì)7、8無(wú)法檢測(cè)突變型標(biāo)本；使用引物對(duì)9、10效果差。具體實(shí)施方式以下通過(guò)具體的實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案，具體實(shí)施例不代表對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限制。其他人根據(jù)本發(fā)明理念所做出的一些非本質(zhì)的修改和調(diào)整仍屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。以下實(shí)施例中的步驟除了特殊說(shuō)明外，均為本領(lǐng)域常規(guī)操作步驟，以下實(shí)施例中所使用的原料，均來(lái)源于市售。實(shí)施例1腸癌腫瘤組織樣品kras的4號(hào)外顯子117號(hào)和146號(hào)密碼子的突變檢測(cè)1、引物本發(fā)明的一種檢測(cè)腸癌腫瘤組織樣品kras的4號(hào)外顯子117號(hào)密碼子aaa>aat的突變的引物，具有seqidno.1和seqidno.2的堿基序列。上游引物seqidno.1:aggactctgaagatgtacctat下游引物seqidno.2:aggactctgaagatgtacctat一種檢測(cè)腸癌腫瘤組織樣品kras的4號(hào)外顯子146號(hào)密碼子gca>cca 的突變的引物，具有seqidno.3和seqidno.4的堿基序列。上游引物seqidno.3:cacaaaacaggctcagga下游引物seqidno.4:cagtgttacttacctgtcttgtc2、反應(yīng)體系使用blendtaqplus酶(toyobo，catno.btq-201)分別配制如下反應(yīng)體系：名稱用量(μl)10×buffer2dntp2evagreen1mg2+0.8seqidno:1引物0.6seqidno:2引物0.6taq酶0.25無(wú)酶水11.75dna模板13、檢測(cè)方法(1)、樣品來(lái)源及基因組dna提?。核心c癌患者腫瘤樣品均來(lái)自中山大學(xué)附屬第六醫(yī)院病理科，收集組織，使用美基石蠟樣品提取試劑盒對(duì)基因組dna進(jìn)行提取。dna模板濃度分別調(diào)整至50-100ng/ul。在上述兩個(gè)反應(yīng)體系中分別加入1ul的dna模板。渦旋混勻后，分別使用羅氏lightcycler480實(shí)時(shí)熒光定量pcr儀進(jìn)行檢測(cè)，程序如下：95℃5min→(95℃10s→62℃15s→72℃25s)40cycles(設(shè)置在72℃收集熒光信號(hào))→95℃1min→40℃1min→熔解溫度(72-83℃)，溫度每升高1℃，獲取15次熒光信號(hào)→40℃10s。(2)、判讀待測(cè)標(biāo)本的熔解曲線，以確定kras基因4號(hào)外顯子的117號(hào)和146號(hào)密碼子是否存在突變。若樣品kras基因4號(hào)外顯子的117號(hào)密碼子存在aaa>aat突變，則待測(cè)樣品熔解曲線顯示出兩個(gè)及以上的熔解峰，共檢測(cè)100例樣品，與sanger測(cè)序法進(jìn)行結(jié)果比較，兩種方法結(jié)果100％相符。若樣品kras基因4號(hào)外顯子的146號(hào)密碼子存在gca>cca突變，則待測(cè)樣品熔解曲線顯示出兩個(gè)及以上的熔解峰，共檢測(cè)100例樣品，與sanger測(cè)序法進(jìn)行結(jié)果比較，兩種方法結(jié)果100％相符。圖1為樣本中含有kras基因4號(hào)外顯子117號(hào)密碼子aaa>aat突變的hrm分析圖；圖2為樣本中不含kras基因4號(hào)外顯子117號(hào)密碼子aaa>aat突變的hrm分析圖。圖3為樣本中含有kras基因4號(hào)外顯子146號(hào)密碼子gca>cca突變的hrm分析圖；圖4為樣本中不含kras基因4號(hào)外顯子146號(hào)密碼子gca>cca突變的hrm分析圖。實(shí)施例2檢測(cè)kras的4號(hào)外顯子117號(hào)和146號(hào)密碼子的突變的試劑盒本實(shí)施例的檢測(cè)試劑盒包括以下試劑1和試劑2，分別包括如下組分：名稱用量(μl)10×buffer2dntp2evagreen1mg2+0.8seqidno:1引物0.6seqidno:2引物0.6taq酶0.25無(wú)酶水11.75dna模板1名稱用量(μl)10×buffer2dntp2evagreen1mg2+0.8seqidno:3引物0.6seqidno:4引物0.6taq酶0.25無(wú)酶水11.75dna模板1試驗(yàn)例1本發(fā)明方法的靈敏度驗(yàn)證靈敏度驗(yàn)證采取了以下方法：1、使用kras基因4號(hào)外顯子117號(hào)k117n(aaa>aac)突變標(biāo)準(zhǔn)品1和146號(hào)a146v(gca>gta)突變標(biāo)準(zhǔn)品2，分別與野生型標(biāo)準(zhǔn)品配制成以下幾種不同突變比例的標(biāo)準(zhǔn)品1和2：25％突變、10％突變、5％突變、0％突變，具體配制方法參考本
技術(shù)領(lǐng)域：
的常規(guī)方法。2、配制檢測(cè)試劑1和2，即實(shí)施例1中的兩個(gè)反應(yīng)體系；3、取步驟1所配制的不同突變比例的標(biāo)準(zhǔn)品1、2各1ul，分別加入步驟2中檢測(cè)試劑1和檢測(cè)試劑2，將檢測(cè)試劑放入羅氏lightcycler480實(shí)時(shí)熒光定量pcr儀中進(jìn)行檢測(cè)；4、pcr和hrm程序：95℃5min→(95℃10s→62℃15s→72℃25s)40cycles(設(shè)置在72℃收集熒光信號(hào))→95℃1min→40℃1min→熔解溫度(72-83℃)，溫度每升高1℃，獲取15次熒光信號(hào)→40℃10s。5、hrm結(jié)果分析：若樣品kras基因4號(hào)外顯子的117號(hào)密碼子存在突變，則檢測(cè)試劑1的待測(cè)樣品熔解曲線顯示出兩個(gè)及以上的熔解峰；若樣品kras基因4號(hào)外顯子的146號(hào)密碼子存在突變，則檢測(cè)試劑2的待測(cè)樣品熔解曲線顯示出兩個(gè)及以上的熔解峰。結(jié)果如圖5和圖6所示。圖5為不同突變比例的kras基因4號(hào)外顯子117號(hào)k117n(aaa>aac)突變標(biāo)準(zhǔn)品1的hrm分析圖，由圖5可看出，使用本發(fā)明的檢測(cè)試劑1及檢測(cè)方法確保能檢出5％的突變。圖6為不同突變比例的kras基因4號(hào)外顯子146號(hào)a146v(gca>gta)突變標(biāo)準(zhǔn)品2的hrm分析圖，由圖6可看出，使用本發(fā)明的檢測(cè)試劑2及檢測(cè)方法確保能檢出5％的突變。試驗(yàn)例2本發(fā)明方法與sanger測(cè)序法和廈門艾德kras基因19種突變檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)結(jié)果比較659例臨床樣品均來(lái)自中山大學(xué)附屬第六醫(yī)院病理科，其中結(jié)腸癌320例，直腸癌277，胃癌55例，肛管癌7例。分別采取本發(fā)明實(shí)施例1或2方法、sanger測(cè)序法和廈門艾德kras基因19種突變檢測(cè)試劑盒對(duì)這659例樣品進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果如表1所示。表1三種方法的檢測(cè)結(jié)果比較由表1結(jié)果可知，共有658例樣本同時(shí)具有本發(fā)明所述方法與金標(biāo)準(zhǔn)sanger測(cè)序法的結(jié)果，本發(fā)明方法的特異性為99.84％，敏感性為100％，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為94.44％。唯一1例結(jié)果不相符的樣品，經(jīng)廈門艾德kras基因19種突變檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)后，其結(jié)果均與本發(fā)明所述方法一致，說(shuō)明該例標(biāo)本實(shí)際上是屬于低豐度突變，金標(biāo)準(zhǔn)sanger測(cè)序法由于檢測(cè)靈敏度低不能檢出，而本發(fā)明的靈敏度高，針對(duì)低豐度突變的樣品也可檢出。另有1例樣品由于dna質(zhì)量差，用sanger測(cè)序法無(wú)法檢測(cè)，而本發(fā)明方法可以對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果為野生型。經(jīng)廈門艾德kras基因19種突變檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)后，其結(jié)果均與本發(fā)明所述方法一致，說(shuō)明本發(fā)明方法對(duì)樣本dna的質(zhì)量要求低，適用性廣。試驗(yàn)例3采用不同引物對(duì)kras基因4號(hào)外顯子的突變檢測(cè)的結(jié)果對(duì)比發(fā)明人摸索了多組引物對(duì)，研究hrm法(實(shí)施例1和2的方法)對(duì)檢測(cè)上述kras基因4號(hào)外顯子基因突變的實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。以下表2為kras的4號(hào)外顯子117號(hào)密碼子采用多組示例性引物使用檢測(cè)試劑1以實(shí)施例1方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)所得結(jié)果。實(shí)驗(yàn)證明，引物的最終選擇關(guān)乎方法的可行性。表2采用5對(duì)引物對(duì)和峰型、判讀結(jié)果比較注：上表采用hrm檢測(cè)法，其pcr程序總共設(shè)置40個(gè)循環(huán)。樣品擴(kuò)增ct值<25為佳，若樣品擴(kuò)增ct值不在該范圍內(nèi)，則判讀為該次pcr反應(yīng)擴(kuò)增效果不好或無(wú)法擴(kuò)增，最后有可能會(huì)影響擴(kuò)增產(chǎn)物的量和后續(xù)的hrm分析。結(jié)果顯示，樣品1使用sanger測(cè)序法判讀為突變型，而表2內(nèi)的5對(duì)引物采用本發(fā)明所述方法和檢測(cè)試劑1檢測(cè)。發(fā)現(xiàn)只有seqidno:1、seqidno:2所示引物(即上列表2中引物對(duì)1)可以準(zhǔn)確檢測(cè)出樣品1為突變型，其余4對(duì)引物(即上列表中引物對(duì)3-6)均無(wú)法準(zhǔn)確判讀。以下表3為kras的4號(hào)外顯子146號(hào)密碼子采用多組示例性引物使用檢測(cè)試劑2以實(shí)施例1方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)所得結(jié)果。實(shí)驗(yàn)證明，引物的最終選擇關(guān)乎方法的可行性。表3采用5對(duì)引物對(duì)和峰型、判讀結(jié)果比較注：上表采用hrm檢測(cè)法，其pcr程序總共設(shè)置40個(gè)循環(huán)。樣品擴(kuò)增ct值<25為佳，若樣品擴(kuò)增ct值不在該范圍內(nèi)，則判讀為該次pcr反應(yīng)擴(kuò)增效果不好或無(wú)法擴(kuò)增，最后有可能會(huì)影響擴(kuò)增產(chǎn)物的量和后續(xù)的hrm分析。結(jié)果顯示，樣品2使用sanger測(cè)序法判讀為突變型，而表3內(nèi)的5對(duì)引物采用本發(fā)明所述hrm法和檢測(cè)試劑1檢測(cè)。發(fā)現(xiàn)只有seqidno:1、seqidno:2所示引物(即上列表4中引物對(duì)2)可以準(zhǔn)確檢測(cè)出樣品2為突變型，其余4對(duì)引物(即上列表中引物對(duì)7-10)均無(wú)法準(zhǔn)確判讀。試驗(yàn)例4本發(fā)明檢測(cè)方法與sanger測(cè)序法時(shí)間及成本對(duì)比計(jì)算方法：針對(duì)試驗(yàn)例2中使用兩種方法均有檢測(cè)結(jié)果的657對(duì)待測(cè)標(biāo)本進(jìn)行核算，結(jié)果如表4所示。表4.本發(fā)明方法與sanger測(cè)序法試劑盒的檢測(cè)時(shí)間和成本的比較本發(fā)明hrm法sanger測(cè)序法實(shí)驗(yàn)花費(fèi)時(shí)間估算1.5小時(shí)/標(biāo)本10.5小時(shí)/標(biāo)本實(shí)驗(yàn)成本估算7元/標(biāo)本35元/標(biāo)本由結(jié)果可知，使用本發(fā)明hrm檢測(cè)方法對(duì)kras的4號(hào)外顯子117和146位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)標(biāo)本的檢測(cè)時(shí)間比sanger測(cè)序法縮短了85.71％，同時(shí)每個(gè)標(biāo)本的檢測(cè)成本降低了80％。使用本發(fā)明所述hrm方法針對(duì)kras的4號(hào)外顯子117和146位點(diǎn)的檢測(cè)，可以大大節(jié)約檢測(cè)時(shí)間和成本，更好的服務(wù)臨床病人。以上所述實(shí)施例僅表達(dá)了本發(fā)明的幾種實(shí)施方式，其描述較為具體和詳細(xì)，但并不能因此而理解為對(duì)發(fā)明專利范圍的限制。應(yīng)當(dāng)指出的是，對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)，這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。因此，本發(fā)明專利的保護(hù)范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準(zhǔn)。當(dāng)前第1頁(yè)12