本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種同時(shí)表達(dá)n個(gè)蛋白或蛋白亞基的方法及其專用系統(tǒng)。

背景技術(shù)：

桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)(baculovirusexpressionsystem，bves)是在昆蟲(chóng)細(xì)胞中高效表達(dá)外源蛋白質(zhì)的用力工具，具有安全性好、表達(dá)水平高、可進(jìn)行翻譯后加工等優(yōu)點(diǎn)。由于桿狀病毒的基因組龐大，外源基因的克隆不能通過(guò)酶切連接的方法直接插入，所以人們對(duì)桿狀病毒基因組進(jìn)行改造，并構(gòu)建與之相匹配的轉(zhuǎn)移載體，使兩者重組為能夠感染昆蟲(chóng)細(xì)胞的含外源基因的重組桿狀病毒。在目前廣泛使用的bactobac系統(tǒng)中，桿狀病毒穿梭載體(bacmid)既可以在大腸桿菌中復(fù)制，又可以感染鱗翅目昆蟲(chóng)細(xì)胞，其在大腸桿菌中可以與含外源基因的匹配轉(zhuǎn)移載體發(fā)生tn7位點(diǎn)特異性重組。重組得到的桿狀病毒穿梭載體能在大腸桿菌中高效復(fù)制，被提純后可用于轉(zhuǎn)染昆蟲(chóng)細(xì)胞。

桿狀病毒基因組容量大，可以在轉(zhuǎn)移載體上插入多個(gè)開(kāi)放閱讀框(orf，openreadingframe)，繼而使得到的重組桿狀病毒穿梭載體在昆蟲(chóng)細(xì)胞中同時(shí)表達(dá)多個(gè)蛋白質(zhì)。這也是目前在昆蟲(chóng)細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)多種蛋白質(zhì)共表達(dá)的通用思路。

質(zhì)粒pfastbac-dual含有兩個(gè)頭對(duì)頭放置的開(kāi)放閱讀框(orf，openreadingframe)，一個(gè)orf以p10啟動(dòng)子起始，hsvtkpolyadenylation信號(hào)序列終止；另一個(gè)orf以polyhedrin啟動(dòng)子起始，sv40polyadenylation信號(hào)序列終止。質(zhì)粒pfastbac-dual可以作為轉(zhuǎn)移載體，但只能同時(shí)表達(dá)兩種蛋白質(zhì)，若要表達(dá)兩種以上的蛋白質(zhì)，則需要另構(gòu)建其它轉(zhuǎn)移載體。例如要表達(dá)由四種不同亞基構(gòu)成的蛋白質(zhì)復(fù)合物，需要經(jīng)過(guò)如下步驟：(1)構(gòu)建重組質(zhì)粒pfastbac-dual-a-b(含a基因和b基因的質(zhì)粒pfastbac-dual)和重組質(zhì)粒pfastbac-dual-c-d(含c基因和d基因的質(zhì)粒pfastbac-dual)；(2)將步驟(1)構(gòu)建的重組質(zhì)粒分別與bacmid進(jìn)行重組，得到兩種重組bacmid；(3)將步驟(2)得到的兩種重組bacmid分別轉(zhuǎn)染昆蟲(chóng)細(xì)胞，得到兩種病毒。(4)用步驟(3)得到的兩種病毒同時(shí)感染昆蟲(chóng)細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)四種亞基的共表達(dá)。這種多病毒共感染方法的蛋白表達(dá)量通常要低于單一病毒感染細(xì)胞的蛋白表達(dá)量。

近幾年流行的multibac系統(tǒng)考慮到這一點(diǎn)，只用一種重組bacmid感染細(xì)胞，進(jìn)行蛋白質(zhì)復(fù)合體的表達(dá)。該系統(tǒng)的表達(dá)思路也是一個(gè)orf表達(dá)一種蛋白質(zhì)。通過(guò)受體質(zhì)粒與供體質(zhì)粒上loxp位點(diǎn)介導(dǎo)的重組，實(shí)現(xiàn)質(zhì)粒的融合，將不同來(lái)源的orf整合到一個(gè)轉(zhuǎn)移載體上，然后與bacmid重組，實(shí)現(xiàn)多種蛋白質(zhì)的共表達(dá)。這種方法的局限性為要構(gòu)建多種含目的基因的供體質(zhì)粒與受體質(zhì)粒，供體質(zhì)粒與受體質(zhì)粒要經(jīng)過(guò)多次整合與篩選，才能得到最終用于表達(dá)的轉(zhuǎn)移載體，耗時(shí)耗力。

上述兩種方法除了分子克隆操作繁瑣外，還含有以下幾種缺陷：一是在表達(dá)過(guò)程中無(wú)法控制各個(gè)亞基的拷貝數(shù)，最終無(wú)法純化到性質(zhì)較為均一的蛋白質(zhì)復(fù)合體；二是在病毒感染過(guò)程中無(wú)法判斷目的蛋白是否表達(dá)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是如何同時(shí)表達(dá)n個(gè)蛋白或蛋白亞基。

為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明首先提供了一種同時(shí)表達(dá)n個(gè)目的物的系統(tǒng)，所述目的物 為蛋白或蛋白亞基或蛋白片段或多肽或多肽片段。

本發(fā)明所提供的一種同時(shí)表達(dá)n個(gè)目的物的系統(tǒng)，包含dna甲和dna乙；

所述dna甲依次包括如下元件：?jiǎn)?dòng)子甲、融合基因甲、終止序列甲；所述融合基因甲中含有片段ⅰ；所述片段ⅰ包括m1個(gè)區(qū)段，每個(gè)區(qū)段編碼一個(gè)所述目的物，每相鄰兩個(gè)區(qū)段之間具有一個(gè)特異區(qū)；所述特異區(qū)編碼蛋白酶的酶切識(shí)別序列；

所述dna乙依次包括如下元件：?jiǎn)?dòng)子乙、融合基因乙、終止序列乙；所述融合基因乙中含有片段ⅱ；所述片段ⅱ包括m2個(gè)區(qū)段，每個(gè)區(qū)段編碼一個(gè)所述目的物，每相鄰兩個(gè)區(qū)段之間具有一個(gè)所述特異區(qū)；融合基因乙中還含有編碼所述蛋白酶的區(qū)段；所述編碼所述蛋白酶的區(qū)段與所述片段ⅱ之間具有一個(gè)所述特異區(qū)；

所述目的物為蛋白或蛋白亞基或蛋白片段或多肽或多肽片段；

m1為2以上的自然數(shù)；m2為2以上的自然數(shù)；m1+m2＝n。

所述融合基因甲整體形成一個(gè)完整的開(kāi)放閱讀框，5’末端為起始密碼子，3’末端為終止密碼子。

所述融合基因乙整體形成一個(gè)完整的開(kāi)放閱讀框，5’末端為起始密碼子，3’末端為終止密碼子。

所述dna甲和所述dna乙可分別存在，也可以存在于同一個(gè)dna分子中。

所述dna甲和所述dna乙可分別存在于不同的表達(dá)載體，也可存在于同一個(gè)表達(dá)載體。

上述系統(tǒng)中，所述融合基因甲中還可含有一個(gè)編碼熒光蛋白甲的區(qū)段，所述編碼熒光蛋白甲的區(qū)段與所述片段ⅰ之間具有一個(gè)以上所述特異區(qū)。

上述系統(tǒng)中，所述融合基因乙中還可含有一個(gè)編碼熒光蛋白乙的區(qū)段，所述編碼熒光蛋白乙的區(qū)段與所述片段ⅱ之間具有一個(gè)所述特異區(qū)。

上述系統(tǒng)中，所述融合基因甲依次可包括：所述片段ⅰ、所述編碼熒光蛋白甲的區(qū)段。

上述系統(tǒng)中，所述融合基因乙依次可包括：所述編碼所述蛋白酶的區(qū)段、所述片段ⅱ、所述編碼熒光蛋白乙的區(qū)段。

所述編碼所述蛋白酶的區(qū)段可位于所述片段ⅱ的上游。

上述系統(tǒng)中，所述啟動(dòng)子甲可為p10啟動(dòng)子或p6.9啟動(dòng)子。

上述系統(tǒng)中，所述啟動(dòng)子乙可為p10啟動(dòng)子或p6.9啟動(dòng)子。

上述系統(tǒng)中，所述終止序列甲可為hsvtkpolyadenylation信號(hào)序列或sv40polyadenylation信號(hào)序列。

上述系統(tǒng)中，所述終止序列乙可為hsvtkpolyadenylation信號(hào)序列或sv40polyadenylation信號(hào)序列。

上述系統(tǒng)中，所述編碼熒光蛋白甲的區(qū)段可為編碼綠色熒光蛋白的基因或編碼紅色熒光蛋白的基因。

上述系統(tǒng)中，所述編碼熒光蛋白乙的區(qū)段可為編碼綠色熒光蛋白的基因或編碼紅色熒光蛋白的基因。

上述系統(tǒng)中，所述p10啟動(dòng)子的反向互補(bǔ)序列如序列表中序列2自5'末端起第7820至7929位所示。

上述系統(tǒng)中，所述p6.9啟動(dòng)子的核苷酸序列如序列表中序列2自5'末端起第7953至8047位所示。

上述系統(tǒng)中，所述編碼綠色熒光蛋白的基因如序列表中序列1自5'末端起第778至1497 位所示。

上述系統(tǒng)中，所述編碼紅色熒光蛋白的基因的反向互補(bǔ)序列如序列表中序列1自5'末端起第9至719位所示。

上述系統(tǒng)中，所述目的物中不具有所述蛋白酶的酶切識(shí)別序列。

所述蛋白酶具體可為tev蛋白酶。

上述系統(tǒng)中，所述tev蛋白酶的編碼基因如序列表中序列2自5'端起8051至8821位所示。

上述系統(tǒng)中，所述tev蛋白酶的酶切識(shí)別序列如序列表中序列2自5'末端起第16304至16324位所示。

上述系統(tǒng)中，所述dna甲和所述dna乙，可同向表達(dá)，也可反向表達(dá)。

上述系統(tǒng)中，所述融合基因甲的核苷酸序列的反向互補(bǔ)序列如序列表中序列2自5'末端起第1至第7812位所示。

上述系統(tǒng)中，所述融合基因乙的核苷酸序列如序列表中序列2自5'末端起第8051至第10324位所示。

上述系統(tǒng)中，所述dna甲的核苷酸序列的反向互補(bǔ)序列如序列表中序列3自5'末端起第3992至第12927位所示。

上述系統(tǒng)中，所述dna乙的核苷酸序列如序列表中序列3自5'末端起第12951至第22314位所示。

上述任一所述系統(tǒng)可為同時(shí)表達(dá)alpha亞基、beta亞基、beta’亞基、gamma亞基、delta亞基、epsilon亞基和zeta亞基的系統(tǒng)；所述alpha亞基、所述beta亞基、所述beta’亞基、所述gamma亞基、所述delta亞基、所述epsilon亞基和所述zeta亞基可組成人源copi復(fù)合體。

為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明還提供了一種轉(zhuǎn)移載體。本發(fā)明所提供的轉(zhuǎn)移載體可為將上述任一所述dna甲和上述任一所述dna乙分別插入骨架載體的多克隆位點(diǎn)，得到的重組載體。

所述轉(zhuǎn)移載體的制備方法具體如下：

(1)將質(zhì)粒pfastbac-dual的限制性內(nèi)切酶kpnⅰ識(shí)別序列和限制性內(nèi)切酶hindⅲ識(shí)別序列間的dna小片段替換為核苷酸序列是序列表的序列1所示的dna分子，得到重組質(zhì)粒；

(2)將步驟(1)得到的重組質(zhì)粒的限制性內(nèi)切酶xbaⅰ識(shí)別序列和切刻內(nèi)切酶nb.bbvcⅰ識(shí)別序列間的dna小片段替換為核苷酸序列是序列表的序列2所示的dna分子，得到轉(zhuǎn)移載體。

所述轉(zhuǎn)移載體具體可為重組質(zhì)粒pfbd-mceg-copi。重組質(zhì)粒pfbd-mceg-copi的核苷酸序列如序列表中序列3所示。

上述任一所述同時(shí)表達(dá)n個(gè)目的物的系統(tǒng)或所述轉(zhuǎn)移載體在表達(dá)n個(gè)目的物中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍；所述目的物為蛋白或蛋白亞基或蛋白片段或多肽或多肽片段；n為2以上的自然數(shù)。

為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明還提供了一種同時(shí)表達(dá)n個(gè)目的物的方法。

本發(fā)明所提供的同時(shí)表達(dá)n個(gè)目的物的方法，包括如下步驟：將上述任一所述轉(zhuǎn)移載體轉(zhuǎn)化受體菌并培養(yǎng)，獲得重組桿狀病毒穿梭載體；將所述重組桿狀病毒穿梭載體轉(zhuǎn)染昆蟲(chóng)細(xì)胞，繼而表達(dá)的n個(gè)目的物；

所述目的物為蛋白或蛋白亞基或蛋白片段或多肽或多肽片段；n為2以上的自然數(shù)。

上述方法中，所述受體菌為含有桿狀病毒穿梭載體的受體菌。

本發(fā)明中，所述蛋白酶的種類可為一種或多種。

實(shí)驗(yàn)證明，將編碼人源copi復(fù)合體的各個(gè)亞基的基因插入重組質(zhì)粒pfbd-mceg-copi，轉(zhuǎn)化受體菌，獲得重組桿狀病毒穿梭載體；將所述重組桿狀病毒穿梭載體轉(zhuǎn)染昆蟲(chóng)細(xì)胞，即為獲得有活性的人源copi復(fù)合體。因此，利用本發(fā)明提供的同時(shí)表達(dá)n個(gè)目的物的系統(tǒng)可以同時(shí)表達(dá)多個(gè)蛋白或蛋白亞基或多肽或多肽片段。本發(fā)明所提供的同時(shí)表達(dá)n個(gè)目的物的系統(tǒng)具有如下優(yōu)點(diǎn)：一是在表達(dá)過(guò)程中可控制各個(gè)蛋白亞基的拷貝數(shù)，可純化到性質(zhì)較為均一的蛋白質(zhì)復(fù)合體；二是在病毒感染過(guò)程中可判斷目的蛋白是否表達(dá)；三是省時(shí)省力。本發(fā)明提供的同時(shí)表達(dá)n個(gè)目的物的系統(tǒng)在同時(shí)表達(dá)多個(gè)蛋白或蛋白亞基或多肽或多肽片段中具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

附圖說(shuō)明

圖1為重組質(zhì)粒pfbd-mceg的圖譜。

圖2為人源copi復(fù)合體各亞基的位置示意圖。

圖3為重組質(zhì)粒pfbd-mceg-copi的圖譜。

圖4為實(shí)施例2步驟二的熒光顯微鏡觀察結(jié)果。

圖5為copi復(fù)合體的sds-page。

圖6為實(shí)施例2步驟三的copi復(fù)合體的生物學(xué)活性檢測(cè)結(jié)果。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的詳細(xì)描述，給出的實(shí)施例僅為了闡明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的范圍。

下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。

下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。

以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。

kpnⅰ-hf、hindⅲ-hf和cip為neb公司產(chǎn)品。膠回收試劑盒為genstar公司產(chǎn)品。dnaligationkit為takara公司產(chǎn)品。質(zhì)粒pfastbac-dual和dh10bac感受態(tài)細(xì)胞均為invitrogen公司產(chǎn)品。質(zhì)粒pmcherry-n1和質(zhì)粒pegfp-n1均為clontech公司產(chǎn)品。sf9細(xì)胞、cellfectinii、sf-900^tmiisfm培養(yǎng)基和grace’sinsectcellculturemedium，unsupplemented均為invitrogen公司產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號(hào)分別為b82501、10362100、10902096和11595030。monoq5/50gl陰離子交換柱為ge公司產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號(hào)為17-5166-01。gtpγs為sigma-alorich公司產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號(hào)為g8634。1,2-二-(9z-十八碳烯酰基)-sn-甘油-3-磷酸膽堿(dopc)、1,2-二-(9z-十八碳烯酰基)-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(dope)、1,2-二-十八碳烷?；?sn-甘油-3-磷酸膽堿(dspc)、phosphoinositides(pips)和sphingolipid(在下文中簡(jiǎn)稱sm)和膽固醇為avanti公司的產(chǎn)品。nzcym培養(yǎng)基和肉豆蔻酸鈉為sigma公司產(chǎn)品，貨號(hào)分別n3643m8005和m8005。

裂解緩沖液：含100mmnacl、10％甘油和1mmdtt的ph8.0、50mmtris-cl緩沖液。

洗脫緩沖液：含100mmnacl、10％甘油、1mmdtt和5mm脫硫生物素的ph8.0、50mmtris-cl緩沖液。

低鹽buffer：含100mmnacl和10％甘油的ph8.0、20mmbicine緩沖液。

高鹽buffer：含1mnacl和10％甘油的ph8.0、20mmbicine緩沖液。

buffera：含1mmedta、0.2mmgdp和1mmdtt的ph8.0、20mmtris緩沖液。

bufferb：含1mmmgcl2、5μmgdp和1mmdtt的ph8.0、20mmtris緩沖液。

bufferc：含1mnacl的bufferb。

bufferd：含1mmmgcl2、5μmgdp和1mmdtt的ph5.7、10mmmes緩沖液。

buffere：含0.5mnacl的bufferd。

bufferf:含2.5mmmg(oac)2、0.2m蔗糖、25mmkcl的ph7.2、20mmhepes緩沖液。

質(zhì)粒pet11d-arf1記載在如下文獻(xiàn)中：mannevillejb，casellajf，etal.copicoatassemblyoccursonliquid-disordereddomainsandtheassociatedmembranedeformationsarelimitedbymembranetension.procnatlacadsciusa.2008nov4；105(44)：16946-51.

質(zhì)粒pbb131-nmt記載在如下文獻(xiàn)中：duroniorj，jackson-machelskie，heuckerothro，etal.proteinn-myristoylationinescherichiacoli:reconstitutionofaeukaryoticproteinmodificationinbacteria.procnatlacadsciusa.1990feb；87(4):1506-10.

實(shí)施例1、重組質(zhì)粒pfbd-mceg的構(gòu)建

構(gòu)建重組質(zhì)粒pfbd-mceg的步驟如下：

1、引物合成

表1.tail-pcr擴(kuò)增引物

人工合成表1中所示的引物。

2、第一輪pcr反應(yīng)

(1)以質(zhì)粒pmcherry-n1為模板，以步驟1合成的mcherry-f和mcherry-mut-r為引物，進(jìn)行pcr擴(kuò)增，獲得pcr擴(kuò)增產(chǎn)物mcherry-l。

反應(yīng)程序?yàn)椋?8℃2min；98℃15s，57℃15s，72℃1min40s，共30個(gè)循環(huán)；72℃10min。

(2)以質(zhì)粒pmcherry-n1為模板，以步驟1合成的mcherry-mut-f和mcherry-r1為引物，進(jìn)行pcr擴(kuò)增，獲得pcr擴(kuò)增產(chǎn)物mcherry-r。

反應(yīng)程序?yàn)椋?8℃2min；98℃15s，57℃15s，72℃1min40s，共30個(gè)循環(huán)；72℃10min。

(3)以質(zhì)粒pegfp-n1為模板，以步驟1合成的egfp-f和egfp-r為引物，進(jìn)行pcr擴(kuò)增，獲得pcr擴(kuò)增產(chǎn)物egfp。

反應(yīng)程序?yàn)椋?8℃2min；98℃15s，57℃15s，72℃1min40s，共30個(gè)循環(huán)；72℃10min。

3、第二輪pcr反應(yīng)

(1)將步驟2中(1)獲得的pcr擴(kuò)增產(chǎn)物mcherry-l和步驟2中(2)獲得的pcr擴(kuò)增產(chǎn)物 mcherry-r等摩爾比混合，得到混合液甲。

(2)以混合液甲為模板，以步驟1合成的mcherry-f和mcherry-r2為引物，進(jìn)行pcr擴(kuò)增，獲得pcr擴(kuò)增產(chǎn)物mcherry-mut。

反應(yīng)程序?yàn)椋?8℃2min；98℃15s，57℃15s，72℃1min40s，共30個(gè)循環(huán)；72℃10min。

4、第三輪pcr反應(yīng)

(1)將步驟3中獲得的pcr擴(kuò)增產(chǎn)物mcherry-mut和步驟2中(3)獲得的pcr擴(kuò)增產(chǎn)物egfp等摩爾比混合，得到混合液乙。

(2)以混合液乙為模板，以步驟1合成的mcherry-f和egfp-r為引物，進(jìn)行pcr擴(kuò)增，獲得pcr擴(kuò)增產(chǎn)物mcherry-egfp。

反應(yīng)程序?yàn)椋?8℃2min；98℃15s，57℃15s，72℃1min40s，共30個(gè)循環(huán)；72℃10min。

5、用限制性內(nèi)切酶kpnⅰ-hf和hindⅲ-hf酶切pcr擴(kuò)增產(chǎn)物mcherry-egfp，然后利用膠回收試劑盒回收酶切產(chǎn)物。

6、用限制性內(nèi)切酶kpnⅰ-hf和hindⅲ-hf酶切質(zhì)粒pfastbac-dual；然后加入cip，37℃處理1h；最后利用膠回收試劑盒回收約4.8kb的載體骨架。

7、將酶切產(chǎn)物與載體骨架通過(guò)dnaligationkit連接，得到重組質(zhì)粒pfbd-mceg。重組質(zhì)粒pfbd-mceg的圖譜見(jiàn)圖1。

根據(jù)測(cè)序結(jié)果，對(duì)重組質(zhì)粒pfbd-mceg進(jìn)行結(jié)構(gòu)描述如下：將質(zhì)粒pfastbac-dual的限制性內(nèi)切酶kpnⅰ和hindⅲ的識(shí)別序列間的dna小片段替換為核苷酸序列是序列表的序列1所示的dna分子，得到重組質(zhì)粒pfbd-mceg。序列表中的序列1自5’末端起，第9至719位為mcherry蛋白的編碼基因的反向互補(bǔ)序列，第722至728位為切刻內(nèi)切酶nb.bbvcⅰ的識(shí)別序列的反向互補(bǔ)序列，第740至745位為限制性內(nèi)切酶xbaⅰ的識(shí)別序列，第746至751位為限制性內(nèi)切酶bamhⅰ的識(shí)別序列，第752至757位為限制性內(nèi)切酶xbaⅰ識(shí)別位點(diǎn)，第757至762位為限制性內(nèi)切酶ageⅰ識(shí)別位點(diǎn)，第769至775位為切刻內(nèi)切酶nb.bbvcⅰ識(shí)別序列；第778至1497位為egfp蛋白的編碼基因。

實(shí)施例2、利用實(shí)施例構(gòu)建的重組質(zhì)粒pfbd-mceg在昆蟲(chóng)細(xì)胞中表達(dá)人源copi復(fù)合體

人源copi復(fù)合體由7種單拷貝亞基組成，7種單拷貝亞基分別為alpha亞基、beta亞基、beta’亞基、gamma亞基、delta亞基、epsilon亞基和zeta亞基，其總分子量高達(dá)558kda。人源copi復(fù)合體以下簡(jiǎn)稱copi復(fù)合體。

一、構(gòu)建重組質(zhì)粒pfbd-mceg-copi

構(gòu)建重組質(zhì)粒pfbd-mceg-copi的方法有兩種：

第一種方法是按照如下步驟構(gòu)建：(1)用限制性內(nèi)切酶xbaⅰ和切刻內(nèi)切酶nb.bbvcⅰ雙酶切實(shí)施例1構(gòu)建的重組質(zhì)粒pfbd-mceg，回收約6300bp的線性化質(zhì)粒。(2)完成步驟(1)后，將線性化質(zhì)粒和序列表中的序列2所示的雙鏈dna分子按照gibsonassembly的方法(gibsondg，youngl，chuangry，venterjc，hutchisonca3rd，smithho.enzymaticassemblyofdnamoleculesuptoseveralhundredkilobases.natmethods.2009may；6(5):343-5.)進(jìn)行單段重組或多段重組，得到重組質(zhì)粒pfbd-mceg-copi。重組質(zhì)粒pfbd-mceg-copi的序列如序列表中的序列3所示。

第二種方法是將重組質(zhì)粒pfbd-mceg和序列表中序列3所示的核苷酸序列提供給基因公司，由基因公司完成重組質(zhì)粒pfbd-mceg-copi的構(gòu)建。

本發(fā)明采用第二種方法構(gòu)建重組質(zhì)粒pfbd-mceg-copi，完成構(gòu)建的基因公司為蘇州金唯 智生物科技有限公司。重組質(zhì)粒pfbd-mceg-copi的圖譜見(jiàn)圖3。

根據(jù)測(cè)序結(jié)果，重組質(zhì)粒pfbd-mceg-copi的核苷酸序列如序列表中序列3所示。重組質(zhì)粒pfbd-mceg-copi含有序列表中的序列2所示的雙鏈dna分子，序列表中的序列2自5’末端起，第1至21位為tev酶剪切位點(diǎn)(tevcleavagesite，tcs)識(shí)別序列的反向互補(bǔ)序列，第22至552位為zeta亞基的編碼基因(又稱zeta基因)的反向互補(bǔ)序列，第553至582位為myc標(biāo)簽的編碼基因的反向互補(bǔ)序列，第583至603位為tcs識(shí)別序列的反向互補(bǔ)序列，第604至2136位為delta亞基的編碼基因(又稱delta基因)的反向互補(bǔ)序列，第2137至2160位為flag標(biāo)簽的編碼基因的反向互補(bǔ)序列，第2161至2181位為tcs識(shí)別序列的反向互補(bǔ)序列，第2182至4803位為gamma亞基的編碼基因(又稱gamma基因)的核苷酸序列，第4804至4827位為flag標(biāo)簽的編碼基因的核苷酸序列，第4828至4848位為tcs識(shí)別序列的反向互補(bǔ)序列，第4849至7707位為beta亞基的編碼基因(又稱beta基因)的反向互補(bǔ)序列，第7708至7812位為twin-streptag的編碼基因(又稱twin-strep基因)的反向互補(bǔ)序列，第7820至7929位為p10啟動(dòng)子的反向互補(bǔ)序列，第7953至8047位為p6.9啟動(dòng)子的核苷酸序列，第8051至8821位為tev酶的編碼基因(又稱tev基因)的核苷酸序列，第8822至8842位為tcs的識(shí)別序列，第8843至8866位為flag標(biāo)簽的編碼基因的核苷酸序列，第8867至12565位為alpha亞基的編碼基因(又稱alpha基因)的核苷酸序列，第12566至12586位為tcs的識(shí)別序列，第12587至12616位為myc標(biāo)簽的編碼基因的核苷酸序列，第12617至15334位為beta’亞基的編碼基因(又稱beta’基因)的核苷酸序列，第15335至15355位為tcs的識(shí)別序列，第15356至15379位為flag標(biāo)簽的編碼基因(又稱flag基因)的核苷酸序列，第15380至16303位為epsilon亞基的編碼基因(又稱epsilon基因)的核苷酸序列，第16304至16324位為tcs的識(shí)別序列。alpha亞基、beta亞基、beta’亞基、gamma亞基、delta亞基、epsilon亞基和zeta亞基的位置示意圖如圖2所示。

二、在昆蟲(chóng)細(xì)胞中表達(dá)人源copi復(fù)合體

參考invitrogen公司的“baculovirusexpressionsystem”的操作手冊(cè)，在昆蟲(chóng)細(xì)胞中表達(dá)人源copi復(fù)合體(下文簡(jiǎn)稱copi復(fù)合體)。具體步驟如下：

1、將重組質(zhì)粒pfbd-mceg-copi轉(zhuǎn)化dh10bac感受態(tài)細(xì)胞，得到重組菌落。

2、完成步驟1后，提取重組菌落的重組bacmiddna。

3、用grace’sinsectcellculturemedium，unsupplemented稀釋處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的sf9細(xì)胞，得到稀釋液，稀釋液中sf9細(xì)胞的密度為5.0×10⁵個(gè)/ml。

4、向直徑為35mm的平皿中加入2ml步驟3得到的稀釋液，28℃、培養(yǎng)4h。

5、向溶液b中加入溶液a，混勻，室溫放置25min，得到混合物；其中溶液a的制備方法為向100μlgrace’sinsectcellculturemedium，unsupplemented加入2.5μg步驟2提取的重組bacmiddna；溶液b的制備方法為取100μlgrace’sinsectcellculturemedium，unsupplemented加入8μlcellfectinii。

6、完成步驟4后，取所述平皿，逐滴加入步驟5得到的混合物，然后28℃、培養(yǎng)4h；棄上清，加入2mlsf-900^tmiisfm培養(yǎng)基，28℃靜置培養(yǎng)144h。

完成步驟6后，取所述平皿，用nikonts100倒置熒光顯微鏡觀察。結(jié)果見(jiàn)圖4(左圖為egfp的熒光(使用nikonb-2a熒光模塊觀察，激發(fā)波長(zhǎng)范圍450～490nm)，右圖為mcherry的熒光(使用nikon-2a熒光模塊觀察，激發(fā)波長(zhǎng)范圍510～560nm)。結(jié)果表明，用熒光顯微鏡可以觀察到紅光和綠光。因此，alpha亞基、beta亞基、beta’亞基、gamma亞基、delta亞基、epsilon亞基和zeta亞基均可以正常表達(dá)。

7、完成步驟6后，取上清，獲得p1代病毒液。

8、完成步驟7后，取p1代病毒液200μl，接種于裝有180ml、sf9細(xì)胞濃度為2.0×10⁶個(gè)/ml的昆蟲(chóng)細(xì)胞培養(yǎng)基的2l三角搖瓶中，28℃、150rpm培養(yǎng)96h。然后4℃、2000g離心5min，取上清液，獲得p2代病毒液。

9、取10mlp2代病毒液，接種于裝有500ml、sf9細(xì)胞濃度為2.0×10⁶個(gè)/ml的昆蟲(chóng)細(xì)胞培養(yǎng)基的2l三角搖瓶中，28℃、150rpm培養(yǎng)72h。然后4℃、2000g離心5min，收集沉淀，即為感染細(xì)胞。

10、完成步驟9后，取所述感染細(xì)胞，先用裂解緩沖液重懸，使用dounce勻漿器勻漿40次(整個(gè)勻漿過(guò)程中，細(xì)胞一直處于冰浴中)得到細(xì)胞裂解液；然后4℃、15000rpm離心40min，收集上清液。

11、完成步驟10后，將收集的上清液上樣至strep自裝柱(strep親和介質(zhì)為iba公司產(chǎn)品)，先用50個(gè)柱體積的裂解緩沖液洗脫以去除雜蛋白，再用10個(gè)柱體積的洗脫緩沖液洗脫，收集過(guò)柱后的洗脫液。

12、完成步驟11后，將收集的過(guò)柱后的洗脫液上樣至monoq5/50gl陰離子交換柱，然后用洗脫液進(jìn)行洗脫，bio-radngc層析儀進(jìn)行檢測(cè)。洗脫液由低鹽buffer和高鹽buffer組成，流速為1ml/min。梯度洗脫程序：洗脫液中高鹽buffer的體積百分含量由0％勻速增至1000％，低鹽buffer的體積百分含量由100％勻速降至0％，線性梯度洗脫20個(gè)柱體積。檢測(cè)波長(zhǎng)為280nm。收集并合并洗脫峰。得到的溶液即為copi復(fù)合體溶液。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖5。結(jié)果表明，經(jīng)過(guò)上述步驟可獲得純度在95％以上的copi復(fù)合體，每升昆蟲(chóng)細(xì)胞中可以純化得到1.5mgcopi復(fù)合體。

三、在昆蟲(chóng)細(xì)胞中表達(dá)copi復(fù)合體的生物學(xué)活性檢測(cè)

1、myr-arf1蛋白的表達(dá)和純化

(1)myr-arf1蛋白的表達(dá)

將質(zhì)粒pet11d-arf1和質(zhì)粒pbb131-nmt導(dǎo)入大腸桿菌bl21(de3)，得到重組大腸桿菌，將該重組大腸桿菌的單克隆接種于25ml含50μg/ml卡那霉素和50μg/ml氨芐青霉素的nzcym培養(yǎng)基中，37℃、200rpm振蕩培養(yǎng)至od600值為0.8，得到培養(yǎng)菌液1；取5ml培養(yǎng)菌液1，以1:180(體積比)接種至nzcym培養(yǎng)基中，37℃、180rpm振蕩培養(yǎng)至od600值為0.4，得到培養(yǎng)菌液2；向培養(yǎng)菌液2中加入肉豆蔻酸鈉水溶液(使肉豆蔻酸鈉在培養(yǎng)體系中的濃度為50μm)，37℃、180rpm振蕩培養(yǎng)至od600值為0.8，得到培養(yǎng)菌液3；向培養(yǎng)菌液3中加入iptg(使其在培養(yǎng)體系中的濃度為1mm)，37℃誘導(dǎo)4h，離心收集菌體。

(2)myr-arf1蛋白的純化

①取步驟(1)收集到的菌體，置于冰上超聲破碎(功率300w，工作時(shí)間8s，間歇5s，總破碎時(shí)間10min)，得到菌體破碎液。

②將菌體破碎液4℃、100000g離心20min，得到上清液1；將上清液14℃、100000g離心60min，得到上清液2。

③將上清液2置于冰上，邊攪拌邊按照35％飽和度緩緩加入硫酸銨粉末(加入總時(shí)間控制在45min內(nèi)，加入硫酸銨的作用為富集修飾過(guò)的arf1蛋白)，然后繼續(xù)在冰上攪拌1h，得到混合體系。

④將混合體系4℃、8000g離心25min，棄上清，沉淀用buffera懸浮，得到懸浮液；然后將懸浮液4℃、10000rpm離心40min，得到上清液3。

⑤將上清液3上樣至bufferb平衡的hitrapdesalting層析脫鹽柱(ge公司產(chǎn)品)上，用bufferb進(jìn)行洗脫，得到脫鹽后溶液；將脫鹽后溶液上樣至bufferb平衡的hitrapdeaeff層析柱(ge公司產(chǎn)品)上，用混合液(由bufferc和bufferb組成，體積比為1:19)洗脫目的蛋白，根據(jù)sds-page考染檢測(cè)結(jié)果，將只含有修飾過(guò)的arf1蛋白的洗脫液用截留值為3kda的縮濾管濃縮，得到濃縮液。

⑥將濃縮液上樣至bufferb平衡的hitrapdesalting層析脫鹽柱中，用bufferb進(jìn)行洗脫，得到脫鹽后的濃縮液。

⑦將脫鹽后的濃縮液上樣至bufferd平衡好的monos5/50gl陽(yáng)離子交換層析柱(ge公司產(chǎn)品)上，然后用20ml洗脫液進(jìn)行洗脫。洗脫液由buffere和水組成。梯度洗脫程序：洗脫液中buffere的體積百分含量由0％勻速增至100％，水的體積百分含量由100％勻速降至0％。根據(jù)sds-page考染檢測(cè)結(jié)果收集只含有修飾過(guò)的arf1蛋白的洗脫液，然后用截留值為3kda的縮濾管濃縮，得到濃度為10mg/ml的myr-arf1蛋白溶液。分裝后-80℃保存。

2、脂質(zhì)體的制備

將快速凍融法和extrusion方法結(jié)合使用制備脂質(zhì)體，具體步驟如下：

(1)將dopc、dope、dops、sm和pips溶解于氯仿中，得到混合液甲，混合液甲中dopc、dope、dops、sm和pips的濃度均為10mg/ml。

(2)將膽固醇溶解于60℃的甲醇中，得到混合液乙，混合液乙中膽固醇的濃度為5mg/ml。

(3)將混合液甲和混合液乙按照不同的比例混合，用氮?dú)庑⌒拇蹈?，在真空腔體內(nèi)抽氣3h以上，保證有機(jī)溶劑全部除去，得到脂質(zhì)混合物。

(4)完成步驟(3)后，將脂質(zhì)混合物用bufferf重懸，37℃渦旋震蕩孵育30min。

(5)完成步驟(4)后，將脂質(zhì)混合物用液氮快速冷凍1min，37℃水浴融化1min，如此反復(fù)凍融5次，以減少多室脂質(zhì)體。最后將extruder(avanti公司產(chǎn)品)裝配上0.2μm的濾膜在室溫下反復(fù)擠壓脂質(zhì)混合物21次，即為制備的脂質(zhì)體。

3、制備copi活性檢測(cè)體系

對(duì)照組i的檢測(cè)體系包括步驟2制備的脂質(zhì)體。

對(duì)照組ii的檢測(cè)體系包括步驟2制備的脂質(zhì)體、步驟1制備的myr-arf1蛋白溶液和gtpγs。

對(duì)照組iii的檢測(cè)體系包括步驟2制備的脂質(zhì)體、步驟二制備的copi復(fù)合體和gtpγs。

對(duì)照組iv的檢測(cè)體系包括步驟2制備的脂質(zhì)體、步驟1制備的myr-arf1蛋白溶液和步驟二制備的copi復(fù)合體。

檢測(cè)組的檢測(cè)體系包括步驟2制備的脂質(zhì)體、步驟1制備的myr-arf1蛋白溶液、步驟二制備的copi復(fù)合體和gtpγs。

上述各檢測(cè)體系的體積均為250μl，反應(yīng)環(huán)境為bufferf。

上述各組的檢測(cè)體系中，myr-arf1蛋白的濃度為0.1mg/ml，gtpγs的濃度為25μm，脂質(zhì)體的濃度為1.5mg/ml，copi復(fù)合體的濃度為0.1mg/ml。

4、完成步驟3后，將各檢測(cè)體系均37℃孵育30min。

5、完成步驟4后，向beckman344090離心管底部依次加入10μl含45％(質(zhì)量體積比)蔗糖的bufferf、50μl的含37.5％(質(zhì)量體積比)蔗糖的bufferf，然后用beckman超速離心機(jī)的mls-50轉(zhuǎn)子和適配器356860，以100000g離心50min，吸取兩層蔗糖間的10μl液相作為樣品。

6、完成步驟5后，各取樣品5μl，加到經(jīng)過(guò)輝光放電處理的、碳包被的電鏡載網(wǎng) (lifetrust公司產(chǎn)品)上，用超純水漂洗后，然后加入濃度為2％(質(zhì)量體積比)的醋酸鈾水溶液,室溫染色1分鐘。用200kv的feitalos場(chǎng)發(fā)射電鏡觀察載網(wǎng)上的樣品。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖6(i為對(duì)照組i，ii為對(duì)照組ii，iii為對(duì)照組iii，iv為對(duì)照組iv，v為檢測(cè)組，標(biāo)尺為200nm，白色虛線方框?yàn)橹亟M小泡)。結(jié)果表明，僅有檢測(cè)組中產(chǎn)生重組小泡。因此，步驟二制備的copi復(fù)合體是有生物活性的。