本發(fā)明屬于植物生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及植物隱性核雄性不育基因的克隆，及其雄性不育系的繁殖方法和在雜交育種中的應(yīng)用，更具體地涉及一個隱性核雄性不育基因及其啟動子的克隆，及其在雜交育種中的應(yīng)用。

技術(shù)背景

雜種優(yōu)勢是生物界的普遍現(xiàn)象，雜交種育種是選育新品種的主要途徑，是近代育種工作最重要方法。與水稻、玉米、高粱等相比，小麥雜種優(yōu)勢利用的研究相對滯后，近十年來其平均產(chǎn)量的增長也趨于停滯、甚至出現(xiàn)連續(xù)多年下滑的局面。小麥?zhǔn)亲曰ㄊ诜圩魑?，小麥雜種優(yōu)勢利用的核心問題是高效生產(chǎn)小麥雜交種的技術(shù)體系，國內(nèi)外大量科學(xué)家為此已做出巨大的努力，并取得一系列重要成果。綜合近50年來的研究進(jìn)展，小麥雜種優(yōu)勢利用研究主要集中于：核質(zhì)互作雄性不育的利用(“三系法”)、化學(xué)殺雄技術(shù)的利用(“化殺法”)和光溫敏核雄性不育的利用(“兩系法”)。三系法由于不育系難以繁殖、恢復(fù)源較窄、細(xì)胞質(zhì)副效應(yīng)等原因，未能在生產(chǎn)上大面積應(yīng)用?；瘹⒎ū荛_了恢復(fù)與保持間的相互關(guān)系，曾被認(rèn)為是一種很有希望的小麥雜交制種新技術(shù)，但由于其在制種過程中穩(wěn)定性差、制種成本高及環(huán)境污染等多方面原因，在實際生產(chǎn)上也難以推廣利用。基于光溫敏的兩系法雖然具有制種成本低、恢復(fù)源廣泛，較易獲得優(yōu)勢組合等優(yōu)點，但也面臨著兩大關(guān)鍵問題——環(huán)境因素的不穩(wěn)定性對不育系育性的影響和利用光溫敏特性所選育的小麥不育系十分有限。

隱性核雄性不育突變體用于作物雜種優(yōu)勢利用，其不育性具有易被恢復(fù)而不易被保持的特性。與細(xì)胞質(zhì)雄性不育雜交小麥體系相比，隱性核雄性不育突變體用于雜交小麥開發(fā)具有以下優(yōu)點：1)不存在外源細(xì)胞質(zhì)的負(fù)面影響，雜種f1優(yōu)勢強；2)父本系對雜種f1的育性恢復(fù)度高；3)不育系、保持系、父本系的育種親本材料選擇不受特定恢/保關(guān)系的限制，選材范圍極廣、種質(zhì)資源利用率高，有利于選育高配合力的雜交種。但是，按照常規(guī)方法無法實現(xiàn)純合核不育系種子的大量有效生產(chǎn)。因此，針對小麥雜種優(yōu)勢利用的現(xiàn)狀，建立高效小麥雄性不育繁育新體系，是雜交小麥獲得成功應(yīng)用的最關(guān)鍵因素之一。

小麥顯性核雄性不育系由于其自身的遺傳特點，既找不到完全的恢復(fù)系，也找不到完全的保持系，比如1972年在我國發(fā)現(xiàn)的太谷核不育系(即ms2)，因此只適用于常規(guī)育種輪回選擇和回交育種手段，不能用作雜交小麥育種的親本。而隱性核雄性不育材料與任何正常材料雜交，f1代均可育，任何育性正常的材料都是其恢復(fù)系，只要解決核不育性的標(biāo)識和有效保持的問題，就能應(yīng)用于新一代小麥雜交育種技術(shù)。

小麥基因組巨大(17gb)，約是人類的5倍，水稻的40倍，擬南芥的100倍；組成極其復(fù)雜，由a、b、d三個具有部分同源關(guān)系的染色體組組成，每個染色體組由7對染色體構(gòu)成，共有21對染色體，是典型的異源六倍體(zhangzb,etal.,2002)，并且約75％是簡單重復(fù)序列(rachelb,etal.,2012；iwgsc,2014)。近年來，雖然小麥及其近緣種的基因組測序工作取得了很大進(jìn)展，但截至目前，仍然沒有完整的參考基因組序列公布(vogeljp,etal.,2010；theinternationalbarleygenomesequencingconsortium,2012；rachelb,etal.,2012；linghq,etal.,2013；jiaj,etal.,2013；iwgsc,2014)。如此復(fù)雜的基因組使得小麥功能基因的研究工作異常困難，目前為止國際范圍內(nèi)小麥突變體成功克隆基因的例子只有寥寥幾個。

本發(fā)明通過流式細(xì)胞術(shù)和高通量測序的方法，成功克隆了育性恢復(fù)基因frg1，該基因可以完全恢復(fù)蘭州核雄性不育突變體或其等位突變體的雄性育性，為構(gòu)建新型小麥雜交育種技術(shù)體系奠定了基礎(chǔ)。同時，為解決小麥現(xiàn)有的“三系”和兩系”雜交技術(shù)所存在不育系育性不穩(wěn)定、雜交品種資源受局限、制種技術(shù)復(fù)雜、制種成本高等技術(shù)瓶頸問題，提供了更多的可能性。本發(fā)明所提供的基因及不育系的繁殖和保持方法，對小麥雜交育種工作具有重要的意義和應(yīng)用價值。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本文提到的所有參考文獻(xiàn)都通過引用并入本文。

除非有相反指明，本文所用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語都具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常所理解的相同的含義。除非有相反指明，本文所使用的或提到的技術(shù)是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)。材料、方法和例子僅作闡述用，而非加以限制。

本發(fā)明提供了一個育性恢復(fù)基因frg1(fertilityrestorationgene1)，所述育性恢復(fù)基因的核苷酸序列選自下列組的序列之一：

(a)如seqidno：1或2所示的核苷酸序列；

(b)其編碼氨基酸序列如seqidno：3所示的核苷酸序列；

(c)在嚴(yán)謹(jǐn)條件下能夠與(a)或(b)中所述序列的dna雜交的dna序列；或

(d)與(a)-(c)所述序列有至少80％(優(yōu)選為至少85％)序列相似性，且具有育性恢復(fù)功能的dna序列；或

(e)與(a)-(d)之任一所述序列互補的dna序列。

本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該知曉，本發(fā)明所述的育性恢復(fù)基因還包括與frg1基因的核苷酸序列或蛋白序列高度同源，并且具有同樣的育性調(diào)控或恢復(fù)功能的同源基因序列。所述高度同源且具有育性調(diào)控功能的的同源基因包括在嚴(yán)謹(jǐn)條件下能夠與具有seqidno：1或2所示序列的dna雜交的dna序列?；蚴瞧渚幋a的氨基酸序列與seqidno:3所示的蛋白氨基酸序列具有85％以上相似性的核苷酸序列。本文中使用的“嚴(yán)謹(jǐn)條件”是公知的，包括諸如在含400mmnacl、40mmpipes(ph6.4)和1mmedta的雜交液中于53℃-60℃雜交12-16小時，然后在62℃-68℃下用含0.5×ssc、和0.1％sds的洗滌液洗滌15-60分鐘。

上述同源基因還包括與seqidno：1或2所示序列的全長有至少80％、85％、90％、95％、98％、或99％序列相似性，且具有育性調(diào)控功能的dna序列，可以從任何植物中分離獲得。其中，序列相似性的百分比可以通過公知的生物信息學(xué)算法來獲得，包括myers和miller算法、needleman-wunsch全局比對法、smith-waterman局部比對法、pearson和lipman相似性搜索法、karlin和altschul的算法。這對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是公知的。

本發(fā)明還提供了一種表達(dá)盒，所述表達(dá)盒含有本發(fā)明所公開的育性恢復(fù)基因的dna序列，所述育性恢復(fù)基因的核苷酸序列選自下列組的序列之一：

(a)如seqidno：1或2所示的核苷酸序列；

(b)其編碼氨基酸序列如seqidno：3所示的核苷酸序列；

(c)在嚴(yán)謹(jǐn)條件下能夠與(a)或(b)中所述序列的dna雜交的dna序列；或

(d)與(a)-(c)所述序列有至少80％(優(yōu)選為至少85％)序列相似性，且具有育性恢復(fù)功能的dna序列；或

(e)與(a)-(d)之任一所述序列互補的dna序列。

具體地，上述表達(dá)盒中的育性恢復(fù)基因還可操作性的連有一個可驅(qū)動其表達(dá)的啟動子，所述啟動子包括但不限于組成型表達(dá)啟動子、誘導(dǎo)型啟動子、組織特異表達(dá)啟動子、或時空特異表達(dá)啟動子。更具體地，所述啟動子是一個花粉特異表達(dá)啟動子。優(yōu)選地，所述花粉特異表達(dá)啟動子的核苷酸序列如seqidno:4所示。

本發(fā)明上述表達(dá)盒，還進(jìn)一步的包含一個花粉失活基因，所述花粉失活基因可以干擾植株中含有該花粉失活基因的雄性配子的功能或形成。所述花粉失活基因包括但不限于barnase基因、淀粉酶基因、dam甲基化酶等。更具體的，所述花粉失活基因是玉米a淀粉酶基因，優(yōu)選其核苷酸序列如seqidno:6所示。

本發(fā)明上述表達(dá)盒，還進(jìn)一步的包含一個篩選基因，所述篩選基因可以用于將含有該表達(dá)盒的植株、植物組織細(xì)胞或載體篩選出來。所述篩選基因包括但不限于抗生素抗性基因、或是抗除草劑基因、或是熒光蛋白基因等。具體地，所述篩選基因包括但不限于：氯霉素抗性基因、潮霉素抗性基因、鏈霉素抗性基因、奇霉素抗性基因、磺胺類抗性基因、草甘磷抗性基因、草丁膦抗性基因、bar基因、紅色熒光基因dsred、mcherry基因、青色熒光蛋白基因、黃色熒光蛋白基因、熒光素酶基因、綠色熒光蛋白基因等。

本發(fā)明還公開了一種植物育性調(diào)控的方法，所述方法通過將育性恢復(fù)基因轉(zhuǎn)入到蘭州核雄性不育突變體(周寬基等，1996)或其等位突變體中，使蘭州核雄性不育突變體或其等位突變體的雄性育性恢復(fù)，其中所述的育性恢復(fù)基因的核苷酸序列選自下列組的序列之一：

(a)如seqidno：1或2所示的核苷酸序列；

(b)其編碼氨基酸序列如seqidno：3所示的核苷酸序列；

(c)在嚴(yán)謹(jǐn)條件下能夠與(a)或(b)中所述序列的dna雜交的dna序列；或

(d)與(a)-(c)所述序列有至少80％(優(yōu)選為至少85％)序列相似性，且具有育性恢復(fù)功能的dna序列；或

(e)與(a)-(d)之任一所述序列互補的dna序列。

本發(fā)明中所述的蘭州核雄性不育突變體，又稱為蘭州核不育或蘭州核不育系或蘭州核不育突變體。

本發(fā)明還公開了一種雄性不育系的保持方法，所述方法以蘭州核雄性不育突變體或其等位突變體為轉(zhuǎn)化受體材料，將緊密連鎖的3個目標(biāo)基因轉(zhuǎn)化至該不育突變體受體植株中。所述3個目標(biāo)基因分別是育性恢復(fù)基因frg1、花粉失活基因和篩選標(biāo)記基因。其中，育性恢復(fù)基因frg1可使不育的轉(zhuǎn)化受體育性恢復(fù)，花粉失活基因可使含有轉(zhuǎn)化的外源基因的花粉失活，即失去授精能力，篩選基因可以用于轉(zhuǎn)基因種子或組織和非轉(zhuǎn)基因種子或組織的分揀，分揀出的非轉(zhuǎn)基因種子用作不育系生產(chǎn)雜交種，轉(zhuǎn)基因種子用作保持系來源源不斷地、穩(wěn)定地生產(chǎn)不育系。

在本發(fā)明中，所述蘭州核雄性不育突變體或其等位突變體也可以稱為不育系或雄性不育系或蘭州核雄性不育系、或等位不育系。

上述雄性不育系的保持方法中，所述的花粉失活基因包括但不限于barnase基因、淀粉酶基因、dam甲基化酶等。更具體的，所述花粉失活基因是玉米a淀粉酶基因zm-aa，優(yōu)選其核苷酸序列如seqidno:6所示。所述花粉失活基因與偏好于雄性配子表達(dá)的啟動子相連。更具體地，所述偏好于雄性配子表達(dá)的啟動子包括但不限于pg47啟動子、zm13啟動子等。所述篩選基因可以用于將含有該表達(dá)盒的植株或載體篩選出來。所述篩選基因包括但不限于抗生素抗性基因、或是抗除草劑基因、或是熒光蛋白基因等。具體地，所述篩選基因包括但不限于：氯霉素抗性基因、潮霉素抗性基因、鏈霉素抗性基因、奇霉素抗性基因、磺胺類抗性基因、草甘磷抗性基因、草丁膦抗性基因、bar基因、紅色熒光基因dsred、mcherry基因、青色熒光蛋白基因、黃色熒光蛋白基因、熒光素酶基因、綠色熒光蛋白基因等。

更具體地，本發(fā)明還公開了一種雄性不育系的繁殖方法，所述方法包括以下步驟：

(a)向蘭州核雄性不育系或其等位不育系中轉(zhuǎn)入下述載體，以獲得含有下述載體的保持系，所述載體包含：育性恢復(fù)基因frg1，所述育性恢復(fù)基因frg1可以恢復(fù)蘭州核雄性不育系或其等位不育系的雄性生育力；和花粉失活基因，所述花粉失活基因表達(dá)時，會干擾植株中含有該花粉失活基因的雄性配子的功能或形成，從而使得所述植株中產(chǎn)生的具有活性的雄性配子都是不含所述載體的；和篩選基因，所述篩選基因可以用于轉(zhuǎn)基因種子或組織和非轉(zhuǎn)基因種子或組織的分揀。

(b)將轉(zhuǎn)入上述載體后形成的保持系植株自交，同時產(chǎn)生不含載體的蘭州核雄性不育系或其等位不育系種子和含載體的保持系種子；或是將保持系植株的花粉趕到蘭州核雄性不育系或其等位不育系植株上，使蘭州核雄性不育系或其等位不育系授粉繁殖出蘭州核雄性不育系或其等位不育系種子。

上述雄性不育系的繁殖方法中，所述的花粉失活基因包括但不限于barnase基因、淀粉酶基因、dam甲基化酶等。更具體的，所述花粉失活基因是玉米a淀粉酶基因zm-aa，優(yōu)選其核苷酸序列如seqidno:6所示。所述花粉失活基因與偏好于雄性配子表達(dá)的啟動子相連。更具體地，所述偏好于雄性配子表達(dá)的啟動子包括但不限于pg47啟動子、zm13啟動子等。所述篩選基因可以用于將含有該表達(dá)盒的植株或載體篩選出來。所述篩選基因包括但不限于抗生素抗性基因、或是抗除草劑基因、或是熒光蛋白基因等。具體地，所述篩選基因包括但不限于：氯霉素抗性基因、潮霉素抗性基因、鏈霉素抗性基因、奇霉素抗性基因、磺胺類抗性基因、草甘磷抗性基因、草丁膦抗性基因、bar基因、紅色熒光基因dsred、mcherry基因、青色熒光蛋白基因、黃色熒光蛋白基因、熒光素酶基因、綠色熒光蛋白基因等。

本發(fā)明還公開了一種保持系的生產(chǎn)方法，所述方法包括以下步驟:

(a)向蘭州核雄性不育系或其等位不育系中轉(zhuǎn)入下述載體，即獲得了蘭州核雄性不育系或其等位不育系的保持系，所述載體包含：育性恢復(fù)基因frg1，所述育性恢復(fù)基因frg1可以恢復(fù)蘭州核雄性不育系或其等位不育系的雄性生育力；和花粉失活基因，所述花粉失活基因表達(dá)時，會干擾植株中含有該花粉失活基因的雄性配子的功能或形成，從而使得所述植株中產(chǎn)生的可育雄性配子都是不含所述載體的；和篩選基因，所述篩選基因可以用于轉(zhuǎn)基因種子和非轉(zhuǎn)基因種子的分揀。

上述保持系的生產(chǎn)方法中，所述的花粉失活基因包括但不限于barnase基因、淀粉酶基因、dam甲基化酶等。更具體的，所述花粉失活基因是玉米a淀粉酶基因zm-aa，優(yōu)選其核苷酸序列如seqidno:6所示。所述花粉失活基因與偏好于雄性配子表達(dá)的啟動子相連。更具體地，所述偏好于雄性配子表達(dá)的啟動子包括但不限于pg47啟動子、zm13啟動子等。所述篩選基因可以用于將含有該表達(dá)盒的植株或載體篩選出來。所述篩選基因包括但不限于抗生素抗性基因、或是抗除草劑基因、或是熒光蛋白基因等。具體地，所述篩選基因包括但不限于：氯霉素抗性基因、潮霉素抗性基因、鏈霉素抗性基因、奇霉素抗性基因、磺胺類抗性基因、草甘磷抗性基因、草丁膦抗性基因、bar基因、紅色熒光基因dsred、mcherry基因、青色熒光蛋白基因、黃色熒光蛋白基因、熒光素酶基因、綠色熒光蛋白基因等。

本發(fā)明還公開了一種保持系的繁殖方法，所述方法包括以下步驟：

(a)向蘭州核雄性不育系或其等位不育系中轉(zhuǎn)入下述載體，即獲得了蘭州核雄性不育系或其等位不育系的保持系，所述載體包含：育性恢復(fù)基因frg1，所述育性恢復(fù)基因frg1可以恢復(fù)蘭州核雄性不育系或其等位不育系的雄性生育力；和花粉失活基因，所述花粉失活基因表達(dá)時，會干擾植株中含有該花粉失活基因的雄性配子的功能或形成，從而使得所述植株中產(chǎn)生的可育雄性配子都是不含所述載體的；和篩選基因，所述篩選基因可以用于轉(zhuǎn)基因種子和非轉(zhuǎn)基因種子的分揀；和

(b)將轉(zhuǎn)入上述載體后形成的保持系植株自交，即按1:1的比例繁殖獲得了不含載體的蘭州核雄性不育系或其等位不育系種子和含載體的保持系種子。

本發(fā)明還公開了一種種子的生產(chǎn)方法，所述方法包括：

(a)向蘭州核雄性不育系或其等位不育系中引入下述載體，獲得蘭州核雄性不育系或其等位不育系的保持系，所述載體包含：育性恢復(fù)基因frg1，所述育性恢復(fù)基因frg1可以恢復(fù)蘭州核雄性不育系或其等位不育系的雄性生育力；和花粉失活基因，所述花粉失活基因表達(dá)時，會干擾植株中含有該花粉失活基因的雄性配子的功能或形成，從而使得所述植株中產(chǎn)生的可育雄性配子都是不含所述載體的。

(b)將轉(zhuǎn)入上述載體后的保持系植株自交；和

(c)自交后即獲得含有所述載體的保持系種子和不含載體的蘭州核雄性不育系或其等位不育系種子。

本發(fā)明上述的雄性不育系的繁殖或保持方法、保持系的生產(chǎn)方法或繁殖方法、種子的生產(chǎn)方法等中，其中步驟(a)也可以是向普通的植株中引入含有育性恢復(fù)基因frg1、花粉失活基因和篩選基因的載體，獲得含有所述載體的轉(zhuǎn)基因植株后，再與蘭州核雄性不育系或其等位不育系雜交，經(jīng)過定向選育，獲得背景為蘭州核雄性不育系或其等位不育系、并且含有所述載體的保持系植株。

本發(fā)明上述的雄性不育系的繁殖方法或保持方法、保持系的生產(chǎn)方法或繁殖方法、種子的生產(chǎn)方法等中，其中所述的育性恢復(fù)基因的核苷酸序列選自下列組的序列之一：

(a)如seqidno：1或2所示的核苷酸序列；

(b)其編碼氨基酸序列如seqidno：3所示的核苷酸序列；

(c)在嚴(yán)謹(jǐn)條件下能夠與(a)或(b)中所述序列的dna雜交的dna序列；或

(d)與(a)-(c)所述序列有至少80％(優(yōu)選為至少85％)序列相似性，且具有育性恢復(fù)功能的dna序列；或

(e)與(a)-(d)之任一所述序列互補的dna序列。

上述育性恢復(fù)基因frg1還可操作性的連有一個花粉特異表達(dá)的啟動子，可以驅(qū)動frg1基因在植物花粉中的表達(dá)。所述花粉特異表達(dá)的啟動子選自由ms26、np1、msp1、pair1、pair2、zep1、mell、pss1、tdr、udt1、gamyb4、ptc1、api5、wda1、cyp704b2、ms26、ms22、dpw、mads3、osc6、rip1、csa、aid1、5126或ms45等育性調(diào)控基因的啟動子構(gòu)成的組之一。更具體的，所述花粉特異表達(dá)啟動子的核苷酸序列如seqidno:4所示。上述育性恢復(fù)基因frg1還可操作性的連有一個終止子，所述終止子可以是已經(jīng)公開的任一個基因的終止子，具體地，其中一個終止子的核苷酸序列如seqidno:5所示。本發(fā)明上述的雄性不育系的繁殖或保持方法、保持系的生產(chǎn)方法或繁殖方法、種子的生產(chǎn)方法等中，所述的花粉失活基因包括但不限于barnase基因、淀粉酶基因、dam甲基化酶等。更具體的，所述花粉失活基因是玉米a淀粉酶基因zm-aa，優(yōu)選其核苷酸序列如seqidno:6所示。所述花粉失活基因與偏好于雄性配子表達(dá)的啟動子相連。更具體地，所述偏好于雄性配子表達(dá)的啟動子包括但不限于pg47啟動子、zm13啟動子等。

本發(fā)明上述的雄性不育系的繁殖或保持方法、保持系的生產(chǎn)方法或繁殖方法、種子的生產(chǎn)方法等中，其中所述的篩選基因包括但不限于抗生素抗性基因、除草劑抗性基因或熒光基因。具體地，所述篩選基因包括但不限于：氯霉素抗性基因、潮霉素抗性基因、鏈霉素抗性基因、奇霉素抗性基因、磺胺類抗性基因、草甘磷抗性基因、草丁膦抗性基因、bar基因、紅色熒光基因dsred、mcherry基因、青色熒光蛋白基因、黃色熒光蛋白基因、熒光素酶基因、綠色熒光蛋白基因等。

本發(fā)明還提供了一種花粉特異表達(dá)啟動子，其核苷酸序列如seqidno:4所示。將seqidno:4與報告基因gus相連，構(gòu)建載體轉(zhuǎn)化水稻和小麥，檢測分析轉(zhuǎn)基因植株中的gus表達(dá)活性和表達(dá)模式，通過對轉(zhuǎn)基因植株的根、莖、葉和花進(jìn)行g(shù)us染色分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)本發(fā)明所提供的啟動子驅(qū)動gus基因在植物花粉中表達(dá)。說明本發(fā)明所提供的seqidno:4是一個花粉特異性表達(dá)的啟動子。

本發(fā)明所提供的植物花粉特異表達(dá)啟動子，含有序列表中如seqidno:4所示的核苷酸序列，或包含與seqidno:4中所列核苷酸序列具有90％以上相似性的核苷酸序列，或包含來源于seqidno:4序列上的500個及500以上連續(xù)的核苷酸片段，并且可以驅(qū)動與該啟動子操作性連接的核苷酸序列在植物花粉中的表達(dá)。含有上述序列的表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系以及宿主菌等均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。擴(kuò)增本發(fā)明所公開的seqidno:4啟動子的任一核苷酸片段的引物對也在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

本發(fā)明所述的“啟動子”是指一種dna調(diào)控區(qū)域，其通常包含能指導(dǎo)rna聚合酶ii在特定編碼序列的合適轉(zhuǎn)錄起始位點起始rna合成的tata盒。啟動子還可包含其它識別序列，這些識別序列通常位于tata盒的上游或5’端，通常被稱為上游啟動子元件，起調(diào)控轉(zhuǎn)錄效率的作用。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該知曉，雖然已經(jīng)鑒定了針對本發(fā)明公開的啟動子區(qū)域的核苷酸序列，但是分離和鑒定處于本發(fā)明鑒定的特定啟動子區(qū)域的tata盒上游區(qū)域的其它調(diào)控元件也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。因此，本文公開的啟動子區(qū)域通常被進(jìn)一步界定為包含上游調(diào)控元件，例如用于調(diào)控編碼序列的組織表達(dá)性和時間表達(dá)功能的那些元件、增強子等。以相同的方式，可以鑒定、分離出使得能在目標(biāo)組織(例如雄性組織)中進(jìn)行表達(dá)的啟動子元件，將其與其它核心啟動子一起使用，以驗證雄性組織優(yōu)先的表達(dá)。核心啟動子指起始轉(zhuǎn)錄所需的最小限度的序列，例如被稱為tata盒的序列，這是編碼蛋白質(zhì)的基因的啟動子通常都具有的。因此，可選地，frg1基因的上游啟動子可與其自身的或來自其它來源的核心啟動子關(guān)聯(lián)使用。

核心啟動子可以是任何一種已知的核心啟動子，例如花椰菜花葉病毒35s或19s啟動子(美國專利no.5,352,605)、泛素啟動子(美國專利no.5,510,474)、in2核心啟動子(美國專利no.5,364,780)或玄參花葉病毒啟動子。

所述基因啟動子的功能可以通過以下方法進(jìn)行分析：將啟動子序列與報告基因可操作性連接，形成可轉(zhuǎn)化的載體，再將該載體轉(zhuǎn)入植株中，在獲得轉(zhuǎn)基因后代中，通過觀察報告基因在植物各個組織器官中的表達(dá)情況來確認(rèn)其表達(dá)特性；或者將上述載體亞克隆進(jìn)用于瞬時表達(dá)實驗的表達(dá)載體，通過瞬時表達(dá)實驗來檢測啟動子或其調(diào)控區(qū)的功能。

用來測試啟動子或調(diào)控區(qū)域功能的適當(dāng)表達(dá)載體的選擇將取決于宿主和將該表達(dá)載體引入宿主的方法，這類方法是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的。對于真核生物，在載體中的區(qū)域包括控制轉(zhuǎn)錄起始和控制加工的區(qū)域。這些區(qū)域被可操作地連接到報告基因，所述報告基因包括yfp、uida、gus基因或熒光素酶。包含位于基因組片段中的推定調(diào)控區(qū)的表達(dá)載體可以被引入完整的組織，例如階段性花粉，或引入愈傷組織，以進(jìn)行功能驗證。

此外，本發(fā)明的啟動子還可與并非frg1基因的核苷酸序列相連，以表達(dá)其它異源核苷酸序列。本發(fā)明的啟動子核苷酸序列及其片段和變體可與異源核苷酸序列一起組裝在一個表達(dá)盒中，用于在目的植株中表達(dá)，更具體地，在該植株的雄性器官中表達(dá)。所述表達(dá)盒有合適的限制性酶切位點，用于插入所述啟動子和異源核苷酸序列。這些表達(dá)盒可用于對任何植株進(jìn)行遺傳操作，以獲得想要的相應(yīng)表型。

本發(fā)明所公開的花粉特異表達(dá)啟動子，可用于驅(qū)動下列異源核苷酸序列的表達(dá)，以使轉(zhuǎn)化的植株獲得雄性不育的表型，所述異源核苷酸序列可編碼促使碳水化合物降解的酶或修飾酶、淀粉酶、脫支酶和果膠酶，更具體的如barnase基因、玉米a淀粉酶基因、生長素基因、rotb、細(xì)胞毒素基因、白喉毒素、dam甲基化酶，或是顯性的雄性不育基因。

在某些實施方式中，本發(fā)明中所提到的可操作性地連接在本發(fā)明啟動子下游的核苷酸序列，其中所述的“核苷酸序列”可以是操作性連接于本文所公開的啟動子之后的結(jié)構(gòu)基因、調(diào)節(jié)基因、結(jié)構(gòu)基因的反義基因、調(diào)節(jié)基因的反義基因或者能夠干擾內(nèi)源基因表達(dá)的小rna。

本發(fā)明還提供了一個轉(zhuǎn)錄終止子序列，所述轉(zhuǎn)錄終止子的核苷酸序列如seqidno:5所示，具有終止基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的功能。

本發(fā)明還提供了一種表達(dá)盒、載體或工程菌株，所述表達(dá)盒、載體或工程菌株中包含了本發(fā)明所提供的花粉特異表達(dá)啟動子seqidno:4。具體地，可以將本發(fā)明所提供的育性恢復(fù)基因frg1的核苷酸序列構(gòu)建到本發(fā)明所提供的啟動子seqidno:4的下游，從而驅(qū)動該育性基因在轉(zhuǎn)化受體植株中的表達(dá)。

本發(fā)明的所提供的花粉特異表達(dá)啟動子可用于外源基因在花粉中的特異性表達(dá)，從而避免該外源基因在植物其他組織中持續(xù)表達(dá)所帶來的不利影響，還可以用于植物花粉生長發(fā)育相關(guān)基因的功能分析和鑒定；可用于雄性不育系和保持系的創(chuàng)建；并可應(yīng)用于花粉敗育實驗中，從而避免由植物轉(zhuǎn)基因漂移或花粉逃逸所帶來的生物安全問題，對植物雄性不育系和保持系的創(chuàng)造具有重要意義。

本發(fā)明所提供的frg1基因的核苷酸序列和啟動子序列或表達(dá)盒可被插入載體、質(zhì)粒、酵母人工染色體、細(xì)菌人工染色體或其他適合轉(zhuǎn)化進(jìn)宿主細(xì)胞中的任何載體中。優(yōu)選的宿主細(xì)胞是細(xì)菌細(xì)胞，尤其是用于克隆或儲存多核苷酸、或用于轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的細(xì)菌細(xì)胞，例如大腸桿菌、根瘤土壤桿菌和毛根土壤桿菌。當(dāng)宿主細(xì)胞是植物細(xì)胞時，表達(dá)盒或載體可插入至被轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞的基因組中。插入可以是定位的或隨機的插入。

本發(fā)明所述的將核苷酸序列、載體或表達(dá)盒轉(zhuǎn)入植株或引入植株或?qū)χ仓赀M(jìn)行轉(zhuǎn)化，均指通過常規(guī)的轉(zhuǎn)基因方法，將核苷酸序列、載體或表達(dá)盒轉(zhuǎn)入到受體細(xì)胞或受體植株中。植物生物技術(shù)領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何轉(zhuǎn)基因方法均可被用于將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化進(jìn)植物細(xì)胞中，以產(chǎn)生本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物。轉(zhuǎn)化方法可包括直接和間接的轉(zhuǎn)化方法。合適的直接方法包括聚乙二醇誘導(dǎo)的dna攝入、脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、使用基因槍導(dǎo)入、電穿孔、以及顯微注射。所述轉(zhuǎn)化方法也包括農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物轉(zhuǎn)化方法等。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下的有益效果：本發(fā)明提供了一種育性恢復(fù)基因frg1及其啟動子，及將該基因用于蘭州核雄性不育系或其等位不育系的繁殖和保持的方法。本發(fā)明所提供的育性恢復(fù)基因，小麥隱性核雄性不育系的育性保持和不育系的繁殖，對小麥的雜交育種生產(chǎn)來說，具有重大的生產(chǎn)推廣價值和應(yīng)用價值，本發(fā)明提供的育性恢復(fù)基因解決了蘭州核雄性不育系或其等位不育系的繁殖和保持問題，對于突破并改良現(xiàn)有的“三系”和“兩系”雜交技術(shù)具有重要意義。

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附圖說明

圖1是4ags-ms雙端體異附加系的gish分析。以長穗偃麥草基因組dna為探針進(jìn)行雜交，紅色熒光信號為4ags染色體；染色體用dapi染色呈深藍(lán)色。

圖2是中國春與4ags-ms雙端體異附加系的流式核型圖。上圖為中國春材料，下圖為4ags-ms雙端體異附加系。橫坐標(biāo)為相對熒光強度，縱坐標(biāo)為染色體數(shù)目。ⅰ、ⅱ、ⅲ和3b標(biāo)記不同大小小麥染色體組群。4ags標(biāo)記來自成穗偃麥草的4ag染色體。

圖3是親本材料表達(dá)值高于蘭州核不育材料的基因的百分比在chr4b分布情況。

具體實施方式

下面對本發(fā)明的實施例作詳細(xì)說明，本實施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實施，給出了詳細(xì)的實施方式和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實施例。

實施例1、4ags-ms雙端體異附加系的選育

蘭州核雄性不育突變體是在春小麥品種間雜交組合的雜種f4代群體中發(fā)現(xiàn)的。將其與包括中國春在內(nèi)的9個小麥品系雜交，f1代自交，觀察f2代不育株與可育株的分離比，均符合1：3的比例，表明小麥蘭州核雄性不育突變體是典型的單基因控制的隱性突變(周寬基等，1996)。

藍(lán)粒二體異附加系是在小麥基因組中附加了兩條長穗偃麥草4ag染色體的小麥品系，籽粒為藍(lán)色是由于附加的4ag染色體含有藍(lán)?；騜a。將藍(lán)粒二體異附加系小麥的花粉授予蘭州核雄性不育突變體，獲得淺藍(lán)粒雜種種子，f1植株能正常結(jié)實。經(jīng)過有目標(biāo)的選育獲得了遺傳背景為蘭州核不育純合突變體并附加了一條長穗偃麥草的4ag染色體的株系，命名為4ag-ms單體異附加系。該株系籽粒為藍(lán)色的、自交可育,表明雜交進(jìn)入蘭州核雄性不育突變體的長穗偃麥草4ag染色體中含有育性恢復(fù)基因。

由于4ag-ms單體異附加系中只存在一條4ag染色體，因此其自交獲得的種子存在藍(lán)粒(4ag⁺)和白粒(4ag^-)的分離，其中藍(lán)粒的植株可育，白粒的植株不育。經(jīng)過對4ag-ms單體異附加系的多代自交選育，獲得了一個籽粒為白粒、植株為可育的株系。gish分析顯示(圖1)，該材料中的4ag染色體發(fā)生斷裂，導(dǎo)致大部分4ag染色體丟失，只留下一小部分保留在小麥染色體組中，因此將該株系命名為4ags-ms雙端體異附加系。

4ags-ms雙端體異附加系中4ags染色體的長度比小麥所有染色體都顯著短，測量后估計其大小約為最長小麥染色體的1/4，大概250mb左右。由于4ags-ms雙端體異附加系材料表現(xiàn)為白粒、可育，表明丟失的4ag染色體含有藍(lán)?；騜a，保留的4ag含有育性恢復(fù)基因fertilityrestorationgene1(frg1)。

實施例2、利用流式細(xì)胞術(shù)分離4ag染色體

采用雙阻斷法對根尖細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞周期同步化處理，再經(jīng)過甲醛固定、機械勻漿和dapi染色等步驟后，上流式細(xì)胞儀。

首先進(jìn)行流式核型分析以確認(rèn)需要分離的染色體大小，以4ags-ms雙端體異附加系為實驗組，中國春為對照。小麥染色體根據(jù)其大小差異，核型圖通常形成4個獨立的峰(vranaetal.,2000)：ⅰ峰包含1d、4d、6d和7d共4條染色體；ⅱ峰包含1a、3a、6a、2d、3d和5d共6條染色體；ⅲ峰包含2a、4a、5a、7a、1b、2b、4b、5b、6b和7b共10條染色體；3b最大，獨立成峰。對比中國春的核型圖，可見4ags-ms雙端體異附加系材料中除了標(biāo)準(zhǔn)核型圖外，多出一個明顯小的峰，根據(jù)相對熒光強度測算其大小在250mb左右，這個峰就是要分離的目標(biāo)染色體(圖2)。

經(jīng)過多次試驗，我們合計分離了200萬條4ag染色體。以長穗偃麥草基因組dna為探針通過gish分析鑒定分離染色體的純度為88％。

實施例3、4ag染色體的高通量測序和序列拼接

通過流式細(xì)胞儀分離出來的染色體是高度濃縮狀態(tài)的染色質(zhì)，不能直接應(yīng)用于高通量測序，必須通過蛋白酶k消化處理將dna從染色體中分離出來。220萬條4es染色體共純化獲得約500ngdna，完整性好。

以100ng4es基因組為模板，用qiagenrepl1-gsinglecellkit進(jìn)行基因擴(kuò)增，合計獲得30μg擴(kuò)增產(chǎn)物。將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切、克隆、測序，31個克隆中無來自大腸桿菌及人類污染，有1個克隆能夠與小麥基因組序列完全匹配，余下克隆推測很可能來自長穗偃麥草4ag，比例為97％。

考慮到小麥族物種基因組都有重復(fù)序列比例高、拼接困難的特點(小麥中重復(fù)序列比例約為80％)，因此我們采取了二代和三代測序相結(jié)合的策略。二代測序構(gòu)建不同的插入片段庫，分別為300bp、500bp、2kb和4kb種片段，雙向2×125bp測序，測序量分別為20gb、14gb、6gb和6gb，合計測序46gb，數(shù)據(jù)量覆蓋該條染色體184倍。三代測序構(gòu)建10kb插入片段庫，獲取5～10kb讀長，有效幫助整條染色體序列的拼接。

利用上述數(shù)據(jù)，首先通過platanus組裝二代測序數(shù)據(jù)，獲得了大小為212mb、n50為30kb的參考基因組序列。在此基礎(chǔ)上利用sspacelr添加三代數(shù)據(jù)進(jìn)行g(shù)apfilling，最終獲得總大小為234m，n50為48k，scaffold數(shù)目為17302條的參考基因組(表1)。

表1、4ag參考基因組的拼接

實施例4、4ags-ms雙端體異附加系的轉(zhuǎn)錄組測序

取4ags-ms雙端體異附加系的單核期花藥進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，同時以蘭州核不育突變體和相應(yīng)親本作為對照。illuminahi-seq2000雙向2×100bp測序，每個樣品各測約12g有效數(shù)據(jù)。對數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制，分別是：去除接頭序列和切除5’端前14bp序列、切除序列兩端質(zhì)量值的堿基、去除序列長度小于50bp的測序序列以及去除來自于人類、大腸桿菌、小麥線粒體和葉綠體基因組、禾本科核糖體rrna的污染，最后得到干凈的測序數(shù)據(jù)。

實施例5、利用轉(zhuǎn)錄組和共線性獲得候選基因

利用4ags-ms雙端體異附加系轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)比對到17302條4agsscaffold上，并控制比對參數(shù)為100％一致性，得到2150個基因。也就是說4ags-ms雙端體異附加系中4ags染色體上有2150個基因在單核期花藥中表達(dá)。

由于流式細(xì)胞術(shù)分離4ags染色體純度為88％，因此組裝的4agsscaffold中會有少量來自小麥基因組的污染，根據(jù)要尋找的fertilityrestoregene1(frg1)基因位于4ags染色體上，只在4ags-ms雙端體異附加系中表達(dá)，在對照材料蘭州核不育突變體和相應(yīng)親本中均不表達(dá)的原則，去除在蘭州核不育材料和/或相應(yīng)親本中也有表達(dá)的基因。由于表達(dá)偏高的有可能是重復(fù)序列、表達(dá)偏低的可信度差，因此去除4ags-ms雙端體異附加系表達(dá)列表中10％與90％分位數(shù)的表達(dá)值以外的基因。經(jīng)過上述兩步篩選，候選基因從2150減少到374個基因。比對參數(shù)為100％一致性。

以iwgsc發(fā)布的小麥序列作為參考基因組，使用序列比對工具tophat2將蘭州核不育材料和相應(yīng)親本的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分別比對到參考基因組上，最大允許2個錯配，比對后統(tǒng)計每個locus中分別來自2個樣品的reads數(shù)目，轉(zhuǎn)換成rpkm，計算每個locus代表的基因在2個樣品中的表達(dá)豐度差異，fdr值小于0.001的即被認(rèn)定為具有顯著性差異。結(jié)果顯示親本與蘭州核不育突變體之間的差異顯著：將每半條染色體均分成100份，計算每一份內(nèi)所有基因中，在親本中表達(dá)值顯著高于蘭州核不育材料的基因所占比例。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，4b短臂遠(yuǎn)端2-7％區(qū)間內(nèi)，幾乎所有基因在親本材料中均顯著高表達(dá)，這一值顯著高于整條染色體上24％的水平(圖3)。由此我們推斷，蘭州核不育突變體是由于4bs染色體遠(yuǎn)端約2-7％缺失所導(dǎo)致。

由于長穗偃麥草的4ags染色體與小麥4bs染色體存在一定共線性，將374個基因全長(exon+intron)比對到tgac-4bs參考基因組上，有且僅有189個基因在4bs中有同源基因。比對工具為blastn，比對參數(shù)為blastn默認(rèn)參數(shù)。其中2-7％區(qū)段內(nèi)共有8個基因，這8個基因就是長穗偃麥草fertilityrestoregene(frg1)的候選基因。

這8個候選基因進(jìn)行功能注釋及在4ags-ms雙端體異附加系及對照材料中的表達(dá)豐度信息見下表2。

表2、候選基因表達(dá)信息和功能注釋

實施例6、轉(zhuǎn)基因互補

將8個候選基因的基因組dna序列構(gòu)建到pahc20載體上，利用基因槍法，轉(zhuǎn)化4ag-ms單體異附加系植株幼胚。對t0代轉(zhuǎn)基因植株中，不帶有4ag染色體的植株(即蘭州核不育純合突變背景)進(jìn)行花粉育性觀察，結(jié)果只有連有基因id為cuff.199的基因組dna序列的載體能夠恢復(fù)蘭州核不育突變體雄性不育的表型，詳細(xì)結(jié)果見下表3。因此，基因id為cuff.199所對應(yīng)的基因為長穗偃麥草中的育性恢復(fù)基因(fertilityrestorationgene1，frg1)，其基因組dna序列如seqidno:1所示，cds序列如seqidno:2所示，蛋白序列如seqidno:3所示，啟動子序列如seqidno:4所示，終止子序列如seqidno:5所示。

表3、候選基因轉(zhuǎn)基因t0代植株花粉育性觀察

實施例6.frg1基因啟動子表達(dá)載體的構(gòu)建和功能分析

以4ags-ms雙端體異附加系dna為模板，擴(kuò)增frg1基因啟動子2265bp，序列如seqidno:4所示，擴(kuò)增產(chǎn)物通過in-fusion方法連入pahc20-gus載體，獲得pahc20-pfrg1-gus表達(dá)載體。

利用基因槍法將pahc20-pfrg1-gus質(zhì)粒轉(zhuǎn)化小麥幼胚，獲得16株轉(zhuǎn)基因陽性植株。對轉(zhuǎn)基因陽性植株的根、莖、葉和不同發(fā)育時期的花進(jìn)行g(shù)us染色分析，發(fā)現(xiàn)frg1基因啟動子能驅(qū)動gus在小麥花粉中特異表達(dá)，說明frg1基因啟動子為花粉特異表達(dá)型啟動子。

實施例7.frg1基因在新一代小麥雜交育種技術(shù)中的應(yīng)用

frg1基因可以用于新一代雜交育種技術(shù)，該技術(shù)的核心思想是：以小麥隱性核雄性不育突變體為轉(zhuǎn)化受體材料，通過將緊密連鎖的3個目標(biāo)基因轉(zhuǎn)化至不育突變體中，其中，育性恢復(fù)基因可使轉(zhuǎn)化受體育性恢復(fù)，花粉失活基因可使含有外源基因的花粉失活，即失去授精能力，種子標(biāo)記基因可以用于轉(zhuǎn)基因種子和非轉(zhuǎn)基因種子的分揀，分揀出的非轉(zhuǎn)基因種子即為不育系，而轉(zhuǎn)基因種子用作保持系。也可以通過用保持系給不育系授粉雜交，可以在不育系上結(jié)實，由此繁殖不育系。而保持系通過自交可以源源不斷地得以繁殖。由于該技術(shù)利用生物技術(shù)生產(chǎn)非轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品，解決了小麥雜交制種過程中面臨的瓶頸問題，即三系法資源利用率低而兩系法中不育系育性不穩(wěn)定的問題。

本發(fā)明上述的雜交育種技術(shù)適用于蘭州核雄性不育突變體及其等位突變體的繁殖和保持。根據(jù)以上原理，發(fā)明人首先分別對表達(dá)載體內(nèi)的zmbt1-zmaa、frg1和mcherryw三個表達(dá)盒單獨進(jìn)行了小麥轉(zhuǎn)化，并進(jìn)一步對各個表達(dá)盒的功能進(jìn)行了驗證。結(jié)果表明各個表達(dá)盒單獨轉(zhuǎn)化小麥時，都能夠工作良好，達(dá)到預(yù)期的設(shè)計效果。

進(jìn)一步,發(fā)明人通過裝配下述dna元件，構(gòu)建了pahc20-frg1-aa-mcherryw載體：

1)以pahc20載體為基礎(chǔ)；

2)frg1基因表達(dá)盒，目標(biāo)基因frg1及其啟動子和終止子均來自長穗偃麥草，其中frg1基因的啟動子序列如seqidno：4所示，其終止子序列如seqidno：5所示，frg1基因的基因組dna序列如seqidno：1所示，其核苷酸序列編碼的蛋白氨基酸序列如seqidno：3所示；

3)基因表達(dá)盒pg47：zmbt1-zmaa-in2-1，目標(biāo)基因為zmaa，轉(zhuǎn)運肽為zmbt1，zmbt1-zmaa(其核苷酸序列如seqidno：6所示)的開放讀碼框連接于啟動子pg47(其核苷酸序列如seqidno：7所示)的下游、終止子in2-1(其核苷酸序列如seqidno：8所示)的上游。

4)基因表達(dá)盒camv35s增強子-ltp2：mcherryw-pinii，mcherryw基因(seqidno：9)的開放讀碼框連接于camv35s增強子-ltp2啟動子(seqidno：10)和pinii終止子(seqidno：11)之間，重組成mcherryw的基因表達(dá)盒(camv35s增強子-ltp2：mcherryw-pinii)；

小麥轉(zhuǎn)化：利用基因槍法將質(zhì)粒pahc20-frg1-aa-mcherryw轉(zhuǎn)化4ag-ms單體異附加系植株幼胚，經(jīng)過篩選、分化、壯苗生根、pcr鑒定等過程，得到基因型為蘭州核不育位點純合突變、無長穗偃麥草4ag染色體、且轉(zhuǎn)基因為單拷貝的轉(zhuǎn)基因陽性植株。

轉(zhuǎn)基因小麥植株的花粉育性檢測：對上述植株進(jìn)行花粉活性檢測。具體做法為：對轉(zhuǎn)基因植株和非轉(zhuǎn)基因植株各取一朵花，每朵花取1個花藥，置于載玻片中央，滴加一滴1％的i2-ki溶液，用鑷子和解剖針釋放花粉后，蓋上蓋玻片，在顯微鏡下觀察、計數(shù)不育花粉數(shù)和花粉總數(shù)，可以著色為深藍(lán)色的為可育花粉，而不能夠著色的為不育花粉。結(jié)果顯示，在非轉(zhuǎn)基因植株中，不育花粉的比例小于2％，而多個轉(zhuǎn)基因植株中不育花粉的比例為50％左右，表明本發(fā)明所提供的載體能夠達(dá)到預(yù)期的花粉失活功能。

轉(zhuǎn)基因小麥植株的熒光種子與非熒光種子分離分析：對植株所結(jié)t1代種子進(jìn)行熒光分離比例調(diào)查，結(jié)果表明這些種子均顯示1:1分離比，即攜帶外源基因的熒光種子和不攜帶外源基因的非熒光種子表現(xiàn)為1:1分離，表明本發(fā)明所提供的載體各元件作為整體表達(dá)良好，可以實現(xiàn)創(chuàng)制和繁殖不育系的目的；其中，frg1基因可以恢復(fù)雄性不育突變體受體的育性zmbt1-zmaa基因和mcherryw基因的表達(dá)可以分別實現(xiàn)預(yù)期的花粉失活功能和種子熒光標(biāo)記功能。

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gcggcggccgcgttcgggccgcagccgggggcgccgtgcgagcccacgctgctggcgacg120

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<213>長穗偃麥草（elytrigiaelongata）

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<213>長穗偃麥草（elytrigiaelongata）

<400>4

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<213>玉米（zeamays）

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<210>11

<211>310

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<213>馬鈴薯（solanumtuberosum）

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